CN105229007B - 2‑((4‑氨基‑3‑(3‑氟‑5‑羟基苯基)‑1h‑吡唑并[3,4‑d]嘧啶‑1‑基)甲基)‑3‑(2‑(三氟甲基)苄基)喹唑啉‑4(3h)‑酮衍生物和其作为磷酸肌醇3‑激酶抑制剂的用途 - Google Patents

2‑((4‑氨基‑3‑(3‑氟‑5‑羟基苯基)‑1h‑吡唑并[3,4‑d]嘧啶‑1‑基)甲基)‑3‑(2‑(三氟甲基)苄基)喹唑啉‑4(3h)‑酮衍生物和其作为磷酸肌醇3‑激酶抑制剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明尤其涉及式(I)化合物，涉及包含所述化合物的组合物，涉及所述化合物以及所述化合物的组合物在治疗、例如治疗炎性疾病、特别是呼吸道炎性疾病中的用途。本发明也延伸至制备所述化合物的方法。

Description

2-((4-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-D]嘧啶- 1-基)甲基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮衍生物 和其作为磷酸肌醇3-激酶抑制剂的用途
发明领域
本发明涉及抑制磷酸肌醇3-激酶(PI3激酶，PI3K)的化合物。具体而言，本公开内容涉及抑制PI3K δ亚型和(另外)其γ亚型的化合物，涉及所述化合物在治疗中的用途，包括在药物组合中的用途，尤其在治疗炎性疾病中的用途，所述炎性疾病包括肺部炎性疾病，诸如COPD和哮喘。本发明还延伸至制备所述化合物的方法和包含所述化合物的药物组合物。
发明背景
脂质激酶催化脂质磷酸化，产生参与调节各种各样生理过程(包括细胞迁移和粘附)的种类。PI3激酶(PI3K)是膜相关蛋白，属于催化本身与细胞膜相关的脂质磷酸化的酶类。PI3K δ同工酶是负责产生各种3′-磷酸化磷酸肌醇的I型PI3K激酶的四种同工酶之一，其介导细胞信号转导并涉及炎症、生长因子信号转导、恶性转化和免疫[参见Rameh, L. E.和Cantley的综述, L. C. J. Biol. Chem., 1999, 274:8347-8350.]。
PI3K参与控制炎症已经在使用诸如LY-294002和渥曼青霉素(Wortmannin)的泛活性(pan-active) PI3K抑制剂的若干模型中得以证实[Ito, K.等人, J Pharmacol. Exp. Ther., 2007, 321:1-8.]。最近已采用选择性PI3K抑制剂或在如下所述的缺乏特定的同工酶的敲除小鼠进行了研究。这些研究已经证明受PI3K酶控制的途径在炎症中的作用。发现PI3K δ选择性抑制剂IC-87114抑制气道高反应性、IgE释放、促炎细胞因子表达、炎性细胞积聚到肺部以及卵清蛋白敏化的、卵清蛋白攻击的小鼠中的血管通透性[Lee, K. S.等人,J. Allergy Clin. Immunol., 2006, 118:403-409和Lee, K. S.等人, FASEB J., 2006,20:455-65.]。另外，IC-87114降低由IgE刺激的嗜中性粒细胞在小鼠肺中的积聚和嗜中性粒细胞功能[Sadhu, C.等人,Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 308:764-9]。
PI3K δ同工酶由胰岛素和其他生长因子以及由G蛋白偶联蛋白信号转导和炎性细胞因子活化。此外，采用敲除小鼠的研究揭示：PI3K γ的活化在哮喘发病机理中可能是重要的。例如，鼠肥大细胞应答在体外和体内因需要功能性PI3K γ的自分泌信号而加剧。当经受被动全身性过敏反应攻击时，缺乏PI3K γ的小鼠当不显示水肿[Wymann M.P.等人,Biochem. Soc. Trans., 2003, 31:275-80.]。因此PI3K γ延迟经由各种G蛋白偶联受体(GPCR)的炎性信号，尤其是通过控制肥大细胞功能而延迟所述炎性信号。还报道，与野生型动物相比，嗜酸性粒细胞在卵清蛋白敏化和攻击的小鼠中的积聚在这些PI3K γ缺乏小鼠中受到抑制[Lim D.H.等人, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 2009, 296(2):L210-L219]。最后，用PI3K γ抑制剂治疗减轻肺切片中IL-13增大的气道收缩性[Jiang H.等人, J. Pharmacol. Exp. Ther.,2012, 342(2):305-11]。
最近，据报道，当通过雾化施用时，PI3K双重δ/γ抑制剂TG100-115在鼠模型中抑制肺嗜酸性粒细胞并降低白介素-13水平、粘蛋白积聚和气道高反应性。同一作者还报道：所述化合物能够抑制由LPS或香烟烟雾诱导的肺嗜中性粒细胞[Doukas, J.等人, J Pharmacol. Exp. Ther., 2009,328:758-765.]。据报道，与PI3K δ选择性抑制剂相比，PI3K δ和γ的其他小分子抑制剂产生对LPS诱导的TNFα产生和T细胞活化的优良的抑制作用[Williams O.等人, Chem Biol., 2010, 17(2):123-34.]。
由于PI3K δ同工酶还被氧化应激活化，因此它有可能在其中涉及高水平的氧化应激的那些疾病中作为治疗干涉的靶标而有重要意义。PI3K信号转导途径的下游介质包括Akt (丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)以及雷帕霉素的哺乳动物靶标—酶mTOR。最近的研究工作提示，PI3K δ的活化导致Akt磷酸化，能够在另外的皮质类固醇敏感性细胞中诱导皮质类固醇抗性[To, Y.等人,Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2010, 182:897-904.]。这些观察结果已经得出下述假说：该信号转导级联可能是负责在患有COPD的患者以及吸烟的哮喘患者的肺部中观察到的炎症的皮质类固醇敏感性(从而使肺经受增加的氧化应激)的一种机制。实际上，已有提示：用于治疗COPD和哮喘的化合物茶碱通过涉及与受PI3激酶δ控制的途径相互作用的机制，逆转类固醇不敏感性[To, Y.等人,Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2010, 182:897-904.]。
目前，哮喘和COPD的治疗主要是吸入治疗，根据临床适当判断，使用皮质类固醇、毒蕈碱拮抗剂和β2激动剂的组合。解决COPD和哮喘中未满足的医学需求的一个途径是鉴定新的吸入性药物，其当用作单一疗法或与来自这三个药理学类别的一种或多种药物组合时具有提供显著益处的潜力。因此，仍然需要鉴别和开发具有在哮喘、COPD和其他炎性疾病中提供增强治疗功效的潜力的同工酶选择性PI3K抑制剂。
WO 2012/052753公开了6-(2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N,N-双(2-甲氧基乙基)己-5-炔酰胺，其在本文中称为现有技术化合物A。
WO 2011/048111公开了某些3-苄基-5-炔基-喹唑啉-4(3H)-酮。其中公开的一个化合物实例是2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氟苄基)-5-(3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮，其在本文中称为实施例50。
这些现有技术化合物中没有一个具有本文所述的式(I)化合物的同样的有益概况。
发明概述
按照本发明，提供式(I)化合物：
或其药学上可接受的盐，包括其所有立体异构体、互变异构体及同位素衍生物。
在本发明的另一方面，提供呈固体晶体形式的式(I)化合物。
在本发明的再一方面，提供呈其2型结晶多晶型物的形式的式(I)化合物(在本文中有时被称为“2型结晶多晶型物”)。
在本发明的再一方面，提供呈其3型结晶多晶型物的形式的式(I)化合物(在本文中有时被称为“3型结晶多晶型物”)。
下文提供了现有技术化合物化合物A和实施例50与本公开的化合物的体外概况的比较(参见实验部分中的表5)。本发明化合物是特别有效的双重PI3K δ/γ同工酶抑制剂，这是赋予其相对于先前公开的化合物而言不同而有益的治疗概况的药理学特征。由式(I)化合物在作为预示肺部炎症的治疗功效和临床益处的动物模型中的体内概况来看，本发明的这一方面尤其明显(参见实验部分的表8-12)。
在一个实施方案中，当在测量实验物质抑制多聚IC诱导的嗜中性粒细胞流入小鼠肺部的体内测定中进行比较时，本公开的化合物相对于现有技术化合物具有改进的抑制活性。所显示的改进可以是本领域先前公开的已知化合物的1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍(或更高)。
在体内多聚IC测定中的活性被认为指示本发明化合物抑制患有哮喘或COPD的患者中病毒诱导性恶化的潜力。认为病毒感染通过使患者肺部的炎症恶化和通过产生类固醇抗性表型而诱导疾病恶化。多聚IC刺激病毒促炎的机制之一。
本文所述化合物的药物样特性，包括其固有的物理和化学稳定性、溶解性概况、尤其是其特有的生物活性，使得所述化合物特别适合用作药剂，尤其适合用于治疗炎性介导的疾病。
附图简述
图1a：为柱状图，表示用化合物(I)或化合物A治疗对多聚I:C诱导的嗜中性粒细胞在小鼠气道中积聚的影响。
图1b：显示化合物(I)相对于化合物A对多聚I:C诱导的嗜中性粒细胞在小鼠气道中积聚的抑制效力的比较。
图2a：为柱状图，表示用化合物(I)或化合物A治疗对香烟烟雾诱导的巨噬细胞在鼠BALF中积聚的影响。
图2b：为柱状图，表示用化合物(I)或化合物A治疗对香烟烟雾诱导的嗜中性粒细胞在鼠BALF中积聚的影响。
图3：为X射线粉末衍射(XRPD)图，由1型结晶多晶型物样品获得(参见实施例2)。
图4：显示1型结晶多晶型物样品的热比重分析(TGA) (上图)和差示扫描量热分析(DSC) (下图)(参见实施例2)。
图5：为XRPD图，由2型结晶多晶型物样品获得(参见实施例4)。
图6：显示2型结晶多晶型物样品的TGA分析(参见实施例4)。
图7：显示2型结晶多晶型物样品的DSC分析(参见实施例4)。
图8：为2型结晶多晶型物样品的DVS等温图(参见实施例4)。
图9：为2型结晶多晶型物样品的质量图的DVS变化(参见实施例4)。
图10：显示对2型结晶多晶型物样品的DVS分析之前(下图)和之后(上图)获得的XRPD图(参见实施例4)。
图11：显示2型结晶多晶型物样品的XRPD图，其获自贮存之前(下图)以及在25℃ /96% RH (中图)和40℃ / 75% RH (上图)贮存1周之后(参见实施例4)。
图12：为XRPD图，由3型结晶多晶型物样品获得(参见实施例8)。
图13：显示3型结晶多晶型物样品的TGA (上图)和DSC (下图)分析(参见实施例8)。
图14：为对3型结晶多晶型物样品的GVS分析(参见实施例8)。
图15：显示XRPD图，在对3型结晶多晶型物样品进行GVS分析之前(下图)和之后(上图)获得(参见实施例8)。
图16：显示3型结晶多晶型物样品在贮存之前(下图)以及在25℃ / 96% RH (中图)和40℃ / 75% RH (上图)贮存1周之后的XRPD图(参见实施例8)。
图17：显示由7型(上图)、6型、5型、4型、3型、2型和1型(下图)样品获得的XRPD图的覆盖图(参见实施例9-12)。
发明详述
本文所用的术语抑制剂意指在体外酶测定中降低(例如至少10%、20%、30%、40%、50%或更多)或消除靶蛋白(例如PI3K δ同工酶)的生物活性的化合物。
本文所用的术语δ/γ抑制剂意指这样的事实，即所述化合物在一定程度上抑制这两种同工酶的抑制活性，尽管不必以同等程度抑制。
本公开的化合物在基于细胞的筛选***中有活性，从而证明它具有透过细胞的适当特性，并能发挥细胞内药理学作用(参见实验部分的表6和表7)。
本公开的化合物具有对于药物而言治疗相关的和合乎要求的药学特性，例如理化性质，包括足够的化学和光稳定性、合适的溶解性概况和有效的活性。
在一个实施方案中，提供本发明化合物的药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，提供本发明化合物的药学上可接受的酸加成盐。
上文所述的药学上可接受的酸加成盐意指包括式(I)化合物能够形成的治疗活性的、无毒的酸加成盐。这些药学上可接受的酸加成盐可以方便通过用这种合适酸的实例处理式(I)化合物的游离碱形式而获得。合适酸的实例包括例如：无机酸，如盐酸、氢溴酸以及硫酸、磷酸等；或有机酸，诸如例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、环拉酸、水杨酸、对氨基水杨酸、巴莫酸等。合适酸的其他实例是苯磺酸。
式(I)化合物的盐的实例包括所有药学上可接受的盐，例如但不限于：无机酸的酸加成盐，如HCl和HBr盐；和有机酸的加成盐，如甲磺酸盐。其他实例包括硫酸盐和磷酸盐。
在另一实施方案中，通过使式(I)化合物与合适的碱反应，提供本发明化合物的药学上可接受的盐。合适碱的实例包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化钙、L-精氨酸、胆碱和L-赖氨酸。
在一个实施方案中，提供作为游离碱的2-((4-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮。
本发明还延伸至本文公开的化合物的溶剂化物。溶剂化物的实例包括水合物。
本公开的化合物包括其中所指定的原子为天然存在或非天然存在的同位素的化合物。在一个实施方案中，所述同位素为稳定的同位素。因此，本公开的化合物包括，例如含有取代氢原子的一个或多个氘原子等的化合物。
本公开也延伸至本文所限定化合物的所有多晶形式。
式(I)化合物可以通过包括以下步骤的方法方便地制备：
使式(II)化合物：
或其受保护的衍生物(其中LG1表示离去基团如卤代基，特别是溴代基)，与式(III)化合物：
在合适的催化剂和有机碱的存在下并在极性非质子溶剂中在惰性气氛下反应。合适的催化剂包括碘化亚酮存在下的钯催化剂，如双(三苯基膦)二氯化钯(II)。用于该转化的合适极性非质子溶剂是DMF，合适的惰性气氛是氮气。
对于其中式(II)化合物为受保护衍生物的合成方法而言，正如本领域众所周知和实践的，通过合适的脱保护步骤来显示式(I)化合物。例如，当用甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基)保护式(I)化合物中存在的酚时，通过在极性非质子溶剂如DMF存在下用诸如四丁基氟化铵的试剂处理，可以实施脱保护步骤。该反应可以在降低的温度如于0℃下进行。
式(II)化合物可以通过使式(IV)化合物：
或其受保护的衍生物(其中LG1为如上文对于式(II)化合物所限定的离去基团且LG2也为离去基团如卤代基，例如卤素原子，适宜为氯)，与式(V)化合物：
或其受保护的衍生物，在碱存在下并在极性非质子溶剂中反应而制得。
用于该转化的合适碱包括碳酸钾，合适的极性非质子溶剂为DMF。
合成方法包括被视为有利于在偶联步骤中保护式(VII)化合物的酚羟基的方法，且合适的受保护的衍生物包括叔丁基二甲基甲硅烷基醚和叔丁基醚。
或者，式(II)化合物可以通过如下步骤制得：使式(VI)化合物：
或其受保护的衍生物(其中LG1为如上文对于式(II)化合物所限定，且LG3表示离去基团如卤代基，特别是碘代基)，与式(VII)化合物：
或其受保护的衍生物，在适宜的贵金属催化剂、无机碱存在下并在极性质子溶剂中在惰性气氛下反应；随后，如合适进行脱保护。
适宜的催化剂为四(三苯基膦)钯(0)。
适宜的无机碱为碳酸钠，适宜的极性质子溶剂为乙醇。
该反应可以在升高的温度如85℃下长时间进行，例如3天，然后冷却至RT。
保护基可能有利于在上述一个或多个反应序列中遮蔽化学敏感基团，以确保所述过程中的一个或多个是有效的。因此，如有需要或必要，中间体化合物可以利用常规保护基加以保护。保护基及其脱除的手段描述于“Protective Groups in Organic Synthesis”,Theodora W. Greene和Peter G.M. Wuts, John Wiley & Sons Inc出版; 4th Rev Ed.,2006, ISBN-10: 0471697540。
作为本发明的一个方面，要求保护新的中间体。
有利的是，本发明的化合物(I)并不显示出旋转对映异构现象。
按照本公开实施例2制备的化合物(I)作为1型结晶多晶型物制得。所述1型结晶多晶型物的特征为基本如图3所示的XRPD图。
发现1型结晶多晶型物样品的热行为是复杂的。如实施例2中所论述且如图4 (下图)所示的DSC分析所说明的，1型结晶多晶型物的样品在加热时经历了多个事件，最终转变为不同的结晶多晶型物，后者在本文中被称为2型结晶多晶型物。
发现2型结晶多晶型物是无水的，于约190℃(最大峰值)下融化分解。对大多数溶剂而言，对1型结晶多晶型物进行制浆实验导致形成2型结晶多晶型物，尽管通过将1型结晶多晶型物在二氯甲烷中制浆获得了在本文被称为3型结晶多晶型物的无水结晶多晶型物。发现3型结晶多晶型物是无水的，于约186℃ (最大峰值，参见实施例8)下融化分解。通过用THF、1,4-二噁烷、10%水/乙腈或10%水/丙酮将1型结晶多晶型物或无定形的化合物(I)制浆，还获得了化合物(I)的多种假多晶型物(4、5、6和7型假多晶型物) (参见实施例9-12)。
在化合物(I)的7种不同的多晶和假多晶形式中，2型和3型结晶多晶型物具有最具前景的固态特性，2型结晶多晶型物因熔点更高而最为有利。
用2型和3型结晶多晶型物在各种溶剂中的50/50混合物在各种温度下进行竞争性浆实验(参见实施例13)。所有实验都得到2型结晶多晶型物，证实这是热力学上更稳定的形式。考虑到理想的是最大限度地减小在化合物贮存和含所述化合物的药物产品生产期间或在这种产品生产后的使用期限期间多晶形式互相转化的风险，2型结晶多晶型物相对于3型结晶多晶型物和化合物(I)的其他多晶形式具有优势。
适宜的是，2型结晶多晶型物通过使化合物(I)在1-丙醇中结晶而制得。采用1-丙醇的示例性程序描述于实施例3，接种或不接种。
2型结晶多晶型物也可以通过将1型结晶多晶型物在甲醇、乙醇、2-丙醇、1-丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲苯、乙酸异丙酯、TBME、2-丁酮、DMSO、***、MIBK、庚烷、硝基甲烷、10%水/乙醇、10%水/乙腈或10%水/2-丙醇中制浆而制得。
或者，2型结晶多晶型物可以通过将无定形化合物(I)在甲醇、乙醇、2-丙醇、1-丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲苯、乙酸异丙酯、TBME、2-丁酮、DMSO、***、MIBK、硝基甲烷、10%水/乙醇或10%水/2-丙醇中制浆而制得。
发明人的实验已表明：将无定形化合物(I)在二氯甲烷中制浆，导致形成3型结晶多晶型物。因此，在意欲形成2型结晶多晶型物的结晶条件下，应当避免使用二氯甲烷。
发明人的实验已表明：将无定形化合物(I)或1型结晶多晶型物在THF中制浆，导致形成4型假多晶型物。因此，在意欲形成2型结晶多晶型物的结晶条件下，应当避免使用THF。
发明人的实验已表明：将无定形化合物(I)或1型结晶多晶型物在1,4-二噁烷中制浆，导致形成5型假多晶型物。因此，在意欲形成2型结晶多晶型物的结晶条件下，应当避免使用1,4-二噁烷。
发明人的实验已表明：将无定形化合物(I)在10%水/乙腈中制浆，导致形成6型假多晶型物。因此，在意欲由无定形化合物(I)形成2型结晶多晶型物的结晶条件下，应当避免使用10%水/乙腈。
发明人的实验已表明：将无定形化合物(I)在10%水/丙酮中制浆，导致形成7型假多晶型物。因此，在意欲由无定形化合物(I)形成2型结晶多晶型物的结晶条件下，应当避免使用10%水/丙酮。
2型结晶多晶型物的特征为基本如图5所示的XRPD图。该图在以下位置有主要峰：8.2、9.0、9.2、9.7、12.2、14.1、14.3、15.0、16.4、18.0、18.5、19.0、19.6、21.8、22.3、22.5、24.3、24.5、24.8、25.1和25.8 (± 0.2度, 2-θ值)。典型的是在所得的XRPD图中可观察到这些峰中的至少3个(例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或全部21个)。位于9.7、12.2、14.1和14.3的峰尤其对于2型结晶多晶型物是特征性的，因此典型的是，在XRPD图中可观察到至少峰中的至少1个(例如1个、2个、3个或全部4个)。
3型结晶多晶型物的特征为基本如图12所示的XRPD图。
4型假多晶型物的特征为基本如图17所示的XRPD图。
5型假多晶型物的特征为基本如图17所示的XRPD图。
6型假多晶型物的特征为基本如图17所示的XRPD图。
7型假多晶型物的特征为基本如图17所示的XRPD图。
一方面，所述化合物可用于治疗例如COPD和/或哮喘。
迄今开发的PI3K化合物通常意欲用于口服。通常，这一策略涉及优化化合物的药代动力学概况，以达到足够的作用时间。这样，在剂量之间建立和维持足够高的药物浓度，以提供连续的临床益处。这一途径的不可避免且常常不想要的结果就是：非靶机体组织(尤其是肝脏和肠道)可能暴露于药理活性浓度的药物。
另一策略是设计其中将药物直接给予发炎器官(例如局部治疗)的治疗方案。尽管这一途径并不适合于治疗所有慢性炎性病症，但它广泛用于治疗肺病(哮喘、COPD、囊性纤维化)、皮肤损害(特应性皮炎和银屑病)、鼻腔疾病(过敏性鼻炎)、眼病(过敏性结膜炎)和胃肠道疾病(溃疡性结肠炎)。
在局部治疗中，所需的功效有时可以通过确保所述药物具有持久的作用时间并主要保留在靶器官从而最大限度减小***毒性的风险来达到。或者，可以使用产生活性药物“储库”的合适制剂，所述活性药物随后可获得以维持所需作用。第一种途径举例而言使用抗胆碱能药物噻托溴铵(Spiriva HandiHaler®)，其局部施用于肺部，作为COPD的疗法。这种化合物对其靶受体具有异常高的亲和力，导致非常低的解离速率和随之而来的持久的作用时间。
按照本公开的一个方面，提供式(I)化合物或含其的药物制剂作为PI3激酶抑制剂的用途，例如局部施用于肺部。
因此，在一个实施方案中，本公开的化合物意欲通过局部施用于肺部使用，以使对患者的治疗益处最大化，同时使不想要的***作用的可能性最小化。因此，有益的是，式(I)化合物一旦到达全身循环则被快速代谢，并且回转的产物的活性低于母体分子。
式(I)化合物的首过代谢的可能主要产物是相应的醇--化合物(Ia)，后者可能因O-脱甲基作用而产生，这是作为这种化学型结构的共同特征的代谢过程。作为呈α和β亚型的PI3K抑制剂，这种可能的代谢产物的活性显著低于式(I)化合物(参见实验部分的表6)。
因此，在一个方面，提供式(Ia)化合物或其药学上可接受的盐，包括其所有立体异构体、互变异构体及同位素衍生物。
在本公开的一个方面，本发明的化合物特别施用于局部递送，例如局部递送至肺部，尤其适合用于治疗COPD。
因此，在一个方面，提供本发明化合物通过吸入即通过局部施用于肺部用于治疗COPD和/或哮喘、尤其是COPD或重症哮喘的用途。有益的是，施用于肺部提供化合物被释放同时使对患者的副作用最小化的有益作用。
在一个实施方案中，所述化合物适合用于致敏患者以便用皮质类固醇治疗。
此外，本发明提供包含按照本公开化合物的药物组合物，所述化合物任选与一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体组合。
稀释剂和载体可以包括适用于胃肠外、口服、局部、粘膜和直肠施用的稀释剂和载体，并且根据施用途径可以所有不同。
在一个实施方案中，可以制备例如：用于胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内或关节周施用的组合物，特别是液体溶液或混悬液形式的组合物；用于口服的组合物，特别是片剂或胶囊剂形式的组合物；用于局部施用(例如肺部或鼻内施用)的组合物，特别是散剂、滴鼻剂或气雾剂形式和经皮施用的组合物；用于粘膜施用(例如施用于含服、舌下或***粘膜)的组合物和用于直肠施用的组合物(例如栓剂形式)。在另一实施方案中，可以制备口服用组合物，其呈液体溶液或混悬剂形式；局部施用的组合物，其呈液体溶液、液体混悬剂、包含溶液或混悬剂的滴鼻剂、或加压或非加压的气雾剂的形式。
所述组合物可以方便地以单位剂型施用，可以通过制药领域众所周知的任一方法来制备，所述方法例如描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版, MackPublishing Company, Easton, PA., (1985)。所述组合物也可以方便地以多单位剂型施用。
胃肠外施用的制剂可以含有作为赋形剂的无菌水或盐水、亚烷基二醇如丙二醇、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等等。
用于鼻腔施用的制剂可以是固体，可以含有赋形剂，例如乳糖或葡聚糖，或者可以是以滴鼻剂或计量喷雾剂的形式使用的含水或油性溶液。用于鼻腔施用的制剂也可以呈含水混悬剂形式。对于含服施用，典型的赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶凝淀粉等等。
适用于口服的组合物可以包含一种或多种生理上相容的载体和/或赋形剂，可以呈固体或液体形式。片剂或胶囊剂可以用以下成分制备：粘合剂，例如糖浆、***树胶、明胶、山梨醇、西黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅；和表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠。液体组合物可以含有常规的添加剂，例如悬浮剂，如山梨醇糖浆、甲基纤维素、糖浆、明胶、羧甲基纤维素或食用油脂；乳化剂，例如卵磷脂或***树胶；植物油，例如杏仁油、椰子油、鱼肝油或花生油；防腐剂，例如丁基化羟基苯甲醚(BHA)和丁基化羟基甲苯(BHT)。液体组合物可以包封于例如明胶中，以提供单位剂型。
固体口服剂型包括片剂、两件套硬壳胶囊和软弹性明胶(SEG)胶囊。这种两件套硬壳胶囊可以由例如明胶或羟丙甲基纤维素(HPMC)制备。
干壳制剂通常包含约40%-60%浓度的明胶、约20%-30%浓度的增塑剂(例如甘油、山梨醇或丙二醇)和约30%-40%浓度的水。其他材料例如防腐剂、染料、遮光剂和矫味剂也可以存在。液体填充材料包含已经溶解、增溶或分散(用悬浮剂如蜂蜡、氢化蓖麻油或聚乙二醇4000)的固体药物或者在溶媒或溶媒组合(例如矿物油、植物油、甘油三酯、二醇、多元醇和表面活性剂)中的液体药物。
适宜的，将式(I)化合物局部施用于肺部。因此，在一个实施方案中，提供包含本公开化合物的药物组合物，所述化合物任选与一种或多种局部可接受的稀释剂或载体组合。
局部施用于肺部可以借助气雾剂制剂来达到。气雾剂制剂通常包含悬浮于或溶解于适宜气溶胶抛射剂如氯氟化碳(CFC)或氢氟化碳(HFC)中的活性成分。适宜的CFC抛射剂包括三氯一氟甲烷(抛射剂11)、二氯四氟甲烷(抛射剂114)和二氯二氟甲烷(抛射剂12)。适宜的HFC抛射剂包括四氟乙烷(HFC-134a)和七氟丙烷(HFC-227)。所述抛射剂通常占总吸入组合物重量的40%-99.5%，例如40%-90%。所述制剂可以含有赋形剂，其包括共溶剂(例如乙醇)和表面活性剂(例如卵磷脂、山梨聚糖三油酸酯等等)。其他可能的赋形剂包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等等。气雾剂制剂被包装于小罐中，借助计量阀(如由Bespak、Valois或3M供应的，或由Aptar, Coster或Vari供应的)，递送适宜的剂量。
局部施用于肺部也可以通过使用非加压制剂如水溶液或悬浮剂来实现。这些可以借助喷雾器，例如可以是手持式和便携式的、或家用或医院用(即非便携式的)的喷雾器来施用。所述制剂可以包含赋形剂，例如水、缓冲剂、张力调节剂、pH调节剂、表面活性剂和共溶剂。悬浮液体和气雾剂制剂(无论加压还是非加压)通常将含有细碎形式(例如D50为0.5-10 μm，例如约1-5 μm)的本发明化合物。粒径分布可以用D10、D50和D90值表示。粒径分布的D50中值被限定为将分布分为两半、以微米计的粒径。由激光衍射得出的测量值更为准确地描述为体积分布，因此用这种方法获得的D50值更有意义地被称为Dv50值(体积分布中值)。本文所用的Dv值是指使用激光衍射测量的粒径分布。同样，在激光衍射背景下使用的D10和D90值意指Dv10和Dv90值，分别指10%的分布位于D10值之下的粒径，和90%分布位于D90值之下的粒径。
局部施用于肺部也可以通过使用干粉制剂来实现。干粉制剂将含有细碎形式的本公开化合物，通常块均直径(MMAD)为1-10 µm或D50为0.5-10 μm，例如约1-5 μm。细碎形式的本发明化合物的粉末可以采用微粉化方法或类似的大小降低方法来制备。微粉化可以用气流粉碎机如Hosokawa Alpine生产的气流粉碎机来进行。所得的粒径分布可以采用激光衍射(例如用Malvern Mastersizer 2000S设备)来测量。所述制剂通常含有局部可接受的稀释剂，例如乳糖、葡糖糖或甘露醇(优选乳糖)，稀释剂的粒径相对大，例如块均直径(MMAD)为50 µm或更高，例如100 µm或更高，或者D50为40-150 µm。本文所用的术语“乳糖”是指含乳糖组分，包括α-乳糖一水合物、β-乳糖一水合物、无水α-乳糖、无水β-乳糖和无定形乳糖。乳糖组分可以通过微粉化、筛分、碾磨、压制、附聚或喷雾干燥来加工。也可以包括各种形式的市售形式的乳糖，例如Lactohale® (吸入级乳糖; DFE Pharma)、InhaLac®70 (用于干粉吸入器的筛分乳糖; Meggle)、Pharmatose® (DFE Pharma)和Respitose® (筛分的吸入级乳糖; DFE Pharma)制品。在一个实施方案中，所述乳糖组分选自α-乳糖一水合物、无水α-乳糖和无定形乳糖。优选所述乳糖为α-乳糖一水合物。
干粉制剂也可以含有其他赋形剂，例如硬脂酸钠、硬脂酸钙或硬脂酸镁。
干粉制剂通常采用干粉吸入器(DPI)装置来递送。干粉递送***的实例包括SPINHALER®、DISKHALER®、TURBOHALER®、DISKUS®、SKYEHALER®、ACCUHALER®和CLICKHALER®。干粉递送***的其他实例包括ECLIPSE、NEXT、ROTAHALER、HANDIHALER、AEROLISER、CYCLOHALER、BREEZHALER/NEOHALER、MONODOSE、FLOWCAPS、TWINCAPS、X-CAPS、TURBOSPIN、ELPENHALER、MIATHALER、TWISTHALER、NOVOLIZER、PRESSAIR、ELLIPTA、ORIEL干粉吸入器、MICRODOSE、PULVINAL、EASYHALER、ULTRAHALER、TAIFUN、PULMOJET、OMNIHALER、GYROHALER、TAPER、CONIX、XCELOVAIR和PROHALER。
在一个实施方案中，提供作为微粉化干粉制剂的本发明化合物，其例如含有适宜级别的乳糖，填充至装置诸如DISKUS中。适宜的，这种装置是多剂量装置，例如所述制剂填充于用于多单位剂量装置如DISKUS的泡罩(blister)中。
在一个实施方案中，提供作为微粉化干粉制剂的本发明化合物，其包含适当级别的乳糖和硬脂酸镁，填充于用于多剂量装置如DISKUS的泡罩中。适宜的，所述装置是多剂量装置。
在另一实施方案中，提供作为微粉化干粉制剂的本发明化合物，其例如包含适当级别的乳糖，填充于用于单剂量装置如AEROLISER的硬壳胶囊中。
在另一实施方案中，提供作为微粉化干粉制剂的本发明化合物，其包含适当级别的乳糖和硬脂酸镁，填充于用于单剂量装置如AEROLISER的硬壳胶囊中。
适用于干粉吸入器的化合物(I)的示例性组合物列于实施例15中。
按照本公开的化合物意欲具有治疗活性。在另一方面，本发明提供用作药物的本公开化合物。
按照本公开的化合物也可用于治疗呼吸道疾病，包括COPD (包括慢性支气管炎和肺气肿)、哮喘、小儿哮喘、囊性纤维化、结节病、特发性肺纤维化、过敏性鼻炎、鼻炎、鼻窦炎和任一上述疾病的病毒诱导性恶化、呼吸道病毒感染，尤其是哮喘、慢性支气管炎和COPD。
呼吸道病毒包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、SARS冠状病毒和腺病毒。呼吸道病毒的另一实例是鼻病毒。
当之前患者的病症已经变得皮质类固醇难治时，本公开的化合物也可以使患者的病症再敏化，以便用皮质类固醇治疗。
在本发明的一个实施方案中，本发明化合物的使用剂量等于适合用作单一治疗但与皮质类固醇联合施用。
在一个实施方案中，在患者先前已经变得皮质类固醇难治的情况下，将作为单一药剂为亚治疗的式(I)化合物与皮质类固醇联合施用，从而恢复患者对后者的反应性。
在一个实施方案中，在患者先前已经变得皮质类固醇难治的情况下，将一定剂量的式(I)化合物与若在无式(I)化合物存在的情况下为亚治疗的剂量的皮质类固醇联合施用，从而恢复患者对皮质类固醇的反应性。
或者，本公开的化合物可以表现出抗病毒活性，例如证明可用于治疗炎性疾病如哮喘和/或COPD的病毒性恶化。
本公开的化合物也可用于预防、治疗或缓解与流感病毒、鼻病毒和/或呼吸道合胞病毒相关的疾病或疾病的并发症。
在一个实施方案中，提供用于治疗或预防病毒感染或病毒感染诱导的炎性并发症的式(I)化合物。
按照本公开的式(I)化合物也预期可用于治疗可以通过表面或局部疗法治疗的某些病症，包括过敏性结膜炎、结膜炎、过敏性皮炎、接触性皮炎、银屑病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎或骨关节炎继发的关节发炎。
在一个实施方案中，当通过适宜途径施用时，式(I)化合物被认为可用于治疗丙型肝炎和/或HIV。适宜的施用途径可以包括口服、静脉注射或输注。
在一个实施方案中，将用于治疗丙型肝炎的式(I)化合物递送至进入肝脏前的血液中。
本公开的化合物也预期可用于治疗某些其他病症，包括类风湿性关节炎、胰腺炎、恶病质、肿瘤生长和转移的抑制，所述肿瘤包括非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌和恶性黑素瘤。
在一个实施方案中，本公开的化合物和含有所述化合物的药物制剂可用于治疗或预防癌症，特别是肺癌，所述化合物或组合物尤其通过局部施用于肺部。
因此，在另一方面，本发明提供用于治疗一种或多种上述病症的本文所述的化合物。
在另一方面，本发明提供本文所述的化合物在制备用于治疗一种或多种上述病症的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供治疗上述病症的方法，所述方法包括给受治疗者施用有效量的本公开化合物或其药物组合物。
本文所公开化合物也可以用于制备用于治疗一种或多种上述病症的药物。
词语“治疗”意欲包括预防和治疗性治疗。
本公开的化合物也可以与一种或多种其他活性成分联合施用，所述其他活性成分例如为适用于治疗上述疾病的活性成分。例如，用于治疗呼吸道疾病的可能的组合包括与皮质类固醇(例如布***(budesonide)、二丙酸倍氯米松(beclomethasonedipropionate)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、糠酸莫米松(mometasonefuroate)、糠酸氟替卡松(fluticasone furoate))、β激动剂(例如特布他林(terbutaline)、沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特罗(salmeterol)、福莫特罗(formoterol)、茚达特罗(indacaterol))、黄嘌呤(例如茶碱(theophylline))、毒蕈碱拮抗剂(例如异丙托铵(ipratropium))和/或p38 MAP激酶抑制剂的组合。适宜皮质类固醇的其他实例是环索奈德(ciclesonide)或氟尼缩松(flunisolide)。适宜的，β激动剂是β2激动剂。β2激动剂的其他实例是瑞普特罗(reproterol)、维兰特罗(vilanterol)、奥达特罗(olodaterol)、瑞普特罗(reproterol)和非诺特罗(fenoterol)。毒蕈碱拮抗剂的其他实例包括噻托铵(tiotropium)、umeclidinium、格隆铵(glycopyrronium)、aclidinium和daratropium，这些激动剂的任一种例如为溴化物盐。用于治疗呼吸道疾病的其他可能组合是本公开的化合物与磷酸二酯酶抑制剂。
在一个实施方案中，本公开的化合物与抗病毒药例如阿昔洛维(acyclovir)、奥司他韦(oseltamivir)、扎那米韦(zanamavir (Relenza®))或干扰素联合施用。
在一个实施方案中，所述活性成分的组合共同配制。
在一个实施方案中，本公开的化合物与皮质类固醇共同配制为吸入用制剂，例如用于CPOD或肺癌的维持疗法，包括后者的预防。
在一个实施方案中，将所述活性成分的组合简单地共同施用。
在一个实施方案中，提供组合产品，其包含：
(A)本公开的化合物；和
(B)其他活性成分，其例如选自皮质类固醇、β激动剂、黄嘌呤、毒蕈碱拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂和p38 MAP激酶抑制剂(例如选自皮质类固醇、β激动剂、黄嘌呤、毒蕈碱拮抗剂和p38 MAP激酶抑制剂)，
其中组分(A)和(B)各自与药学上可接受的稀释剂或载体混合配制。所述组合可以任选包含另外的相关赋形剂。适宜的，所述β激动剂是β2激动剂。
在一个实施方案中，提供按照权利要求1的式(I)化合物，其用作与一种或多种其他活性成分联合施用的药物，所述其他活性成分例如选自皮质类固醇、β激动剂、黄嘌呤、毒蕈碱拮抗剂和p38 MAP激酶抑制剂。适宜的，所述β激动剂是β2激动剂。
在一个实施方案中，本公开的化合物通过吸入施用，并且联合或分别地经口服或经吸入施用皮质类固醇。
在一个实施方案中，本公开的化合物通过吸入施用，并且联合或分别地经口服或经吸入施用β2激动剂。
实验部分
本文所用的缩写于下面(表1)限定。未限定的任何缩写意欲表达其通常接受的含义。
表1：缩写
通用方法
所有原材料和溶剂由商业来源获得，或者按照引用的文献制备。除非另有所指，否则所有反应均进行搅拌。有机溶液经无水硫酸镁常规干燥。
柱色谱在预包装的二氧化硅(230-400目, 40-63 µm)柱芯上用所示量进行。
分析方法
分析型LCMS
分析型LCMS用Waters Xselect CSH C18 3.5 µm柱(4.6 x 50 mm)进行，流速为2.5-4.5 mL min-1，用含有0.1% v/v甲酸的H2O-MeCN梯度洗脱4分钟。梯度形成：0-3.00min，从95% H2O-5% MeCN增至5% H2O-95% MeCN；3.00-3.01 min，保持在5% H2O-95% MeCN，流速增至4.5 mL min-1；3.01-3.50 min，保持在5% H2O-95% MeCN；3.50-3.60 min，恢复至95% H2O-5% MeCN，流速降至3.50 mL min-1；3.60-3.90 min，保持在95% H2O-5% MeCN；3.90-4.00 min，保持在95% H2O-5% MeCN，流速降至2.5 mL min-1。含有样品的流分经其于254 nm的UV吸光度探测。洗脱峰的质谱采用以混合阳离子和阴离子电喷雾模式运行的Agilent 6120四极质谱计进行测量。
1 H NMR波谱学
1H NMR谱用Bruker Avance III波普测定仪于400 MHz下获得，采用残留未氘化溶剂作为参照，除非另有所指，否则于DMSO-d6中运行。
X射线粉末衍射——方法1 (使用Brucker AXS C2 GADDS衍射计)
衍射图采用用于自动样品定位的Cu Kα辐射(40 kV, 40 mA)、自动化XYZ stage、自动样品定位的激光视频显微镜和HiStar 2维平面检测器进行采集。X射线光学***(optics)由与0.3 mm的针孔式准直仪偶联的单个Göbel多层反射镜(multilayer mirror)组成。光束发散即样品上的X射线束的有效尺寸为约4 mm。使用θ-θ连续扫描模式，样品-探测器距离为20 cm，得到有效2θ范围为3.2°-29.7°。通常，将样品暴露于X射线束120秒。数据采集用软件为用于XP/2004 4.1.43的GADDS，对数据进行分析并用Diffrac Plus EVAv13.0.0.2或v15.0.0.0呈现。使用所接受而不加研磨的粉末，制备在环境条件下运行的样品作为平板样本。约1-2 mg所述样品在载玻片上轻压，获得平面。用导热化合物将非环境条件下运行的样品固定在硅片上。然后以20℃/min将样品加热至适宜的温度，随后等温保持1分钟，然后开始采集数据。
X射线粉末衍射– 方法2 (使用Brucker AXS D8 advance衍射计)
衍射图采用Cu Kα辐射(40 kV, 40 mA)、θ-2θ测角仪和V4发散和接受狭缝、Ge单色仪和Lynxeye检测器进行采集。数据采集用软件为Diffrac Plus XRD Commander v2.6.1，对数据进行分析并用Diffrac Plus EVA v13.0.0.2或v15.0.0.0呈现。使用所接受的粉末，样品作为平板样本在环境条件下运行。将样品轻轻装入在经抛光的零背景(510)硅片中切割的凹处。分析期间将样品在其自身平面旋转。数据采集的细节为：角度范围：2 - 42 °2θ；步长：0.05 °2θ；采集时间：0.5 s/步。
X射线粉末衍射 – 方法3 (使用PANalytical (Philips) X’PertPRO MPD衍射计)
该仪器配备Cu LFF X射线管。将化合物散布在零背景样品架上。所用的仪器参数如下：发生器电压(generator voltage): 45 kV；发生器电流量(generator amperage):40 mA；几何学: Bragg-Brentano；样品台: 转台。测量条件如下：扫描模式：连续；扫描范围：3 - 50º 2θ；步长：0.02º/步；连续时间：30 sec/步；转台旋转时间(spinnerrevolution time)：1 sec；辐射类型：CuKα。入射光路参数如下：程序. 发散狭缝：15 mm；索拉狭缝：0.04 rad；光束罩(beam mask)：15 mm；防散射狭缝：1º；光束刀(beam knife)：+。衍射光路参数如下：长防散射罩：+；索拉狭缝: 0.04 rad；Ni滤波器：+；检测器：X’Celerator。
差示扫描量热法 – 方法1 (使用Mettler DSC 823e仪器)
Mettler DSC 823E配备有34位自动取样器。该仪器采用合格的铟根据能量和温度进行校准。通常，将销孔铝锅中的0.5-3 mg的各个样品以10℃/min从25℃加热至300℃。在样品上维持50 ml/min的氮气吹扫。仪器控制和数据分析软件是STARe v9.20。
差示扫描量热法 – 方法2 (使用TA-Instruments Q1000 MTDSC，其配备有RCS冷 却装置)
TA-Instruments的样品盘用适宜的盖子封闭，在配备有RCS冷却装置的TA-Instruments Q1000 MTDSC上记录DSC曲线。使用下述参数：初始温度：25℃；加热速率：10℃/min；最终温度：250℃。
热比重分析 – 方法1 (使用Mettler TGA/SDTA 851e仪器)
TGA数据在配备有34位自动取样器的Mettler TGA/SDTA 851e上收集。该仪器采用合格的铟进行温度校准。通常，将5 – 30 mg的各个样品加载到预称重的铝坩埚上，以10℃/min从环境温度加热至350℃。在样品上维持50 ml/min的氮气吹扫。仪器控制和数据分析软件是STARe v9.20。
热比重分析(TGA) – 方法2 (使用TA-Instruments Q500 TGA热解重量分析器)
TGA数据在TA-Instruments Q500 TGA热解重量分析器上收集。将所述化合物转移到铝样品盘中，然后使用下述参数进行分析：初始温度：室温；加热速率：20℃/min；分辨率：4；最终状态：350℃或<80[(w/w)%]。
重量分析蒸汽吸附(Gravimetric Vapour Sorption) (GVS)
使用由DVS Intrinsic控制软件v1.0.1.2(或v 1.0.1.3)控制的SMS DVSIntrinsic湿气吸附分析仪(moisture sorption analyzer)，获取吸附等温线。样品温度通过仪器控制维持在25℃。由总流速为200 ml/min的干燥氮气和湿氮气的混合流控制湿度。相对湿度由位于样品附近的经校准的Rotronic探针(动态范围1.0 – 100 %RH)来测量。随%RH 而变的样品重量改变(质量松弛(mass relaxation))恒定用微量天平(精确度±0.005mg)监测。通常，将5 – 20 mg样品在环境条件下置于去皮重的不锈钢篮网中。样品在40 %RH和25℃(通常的室内条件)下加载和卸载。湿气吸附等温线如下概述来完成(4次扫描，得到2个完整循环)。标准等温线在0 – 90 %RH范围内于25℃下以10 %RH的间隔来完成。数据分析在Microsoft Excel中用DVS Analysis Suite v6.2 (或6.1或6.0)进行。
表2：SMS DVS固有实验的方法参数
在完成等温线后回收样品，重新通过XRPD进行分析。
动态蒸汽吸收(Dynamic Vapour Sorption) (DVS)
将约20 mg所述化合物转移到SMS动态蒸汽吸附中，采用以下参数对25℃的大气湿度记录重量变化：干燥：干燥氮气下60 min；平衡：60 min；RH (%)测量点：循环1：5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5；循环2：10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、0。
实施例1 –化合物(I)和化合物(Ia)的制备
中间体A: 2-((4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮
在1小时内，向-1℃下搅拌的2-溴-6-(2-氯乙酰胺基)苯甲酸[King-Underwood等人, WO2011/048111] (50.0 g, 171 mmol)、(2-(三氟甲基)苯基)甲胺(29.4 mL, 205mmol)和三乙胺(34 mL, 430 mmol)在甲苯(1.2 L)中的混合物中，滴加三氯化磷(37 mL,430 mmol)在甲苯(100 mL)中的溶液，在此期间内部温度维持低于5℃。将反应混合物加热至回流2.5小时，然后所得的悬浮液在仍热时进行过滤。保留滤液，将收集的固体悬浮于新鲜甲苯(100 mL)中，在剧烈搅拌下加热至90℃。经过滤除去固体，合并含有粗产物的有机萃取液。
通过以同样规模在相同条件下重复该反应，制备第二批次该材料。将由这两个反应合并的滤液真空蒸发，残余物用IPA (2 x 400 mL)研磨。将如此获得的粗产物真空干燥，得到5-溴-2-(氯甲基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮，为灰白色固体(100 g,90%纯度, 经HPLC测定, 61%)；Rt 2.70 min；m/z 431/433 (M+H)+ (ES+)。
向如上所述获得的喹唑啉酮(100 g, 90%纯, 210 mmol)和3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(50.4 g, 193 mmol)于DMF (600 mL)的溶液中于RT下加入碳酸钾(80.0 g,580 mmol)，18 hr后将反应混合物倾入水(1.2 L)中。所得的沉淀经过滤收集，连续用水(500 mL)、EtOAc (600 mL)、最后用Et2O (400 mL)洗涤。所得的饼状物经真空干燥，得到标题化合物 - 中间体A，为灰白色固体(115 g, 89 %)；Rt 2.28 min, m/z 656/658 (M+H)+(ES+)。
中间体B: 2-((4-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮
中间体A (54.4 g, 83.0 mmol)、(3-氟-5-羟基苯基)硼酸(15.5 g, 99.0 mmol)和K3PO4 (19.1 g, 83.0 mmol)于1-丁醇(900 mL)的溶液于RT下用氮气鼓泡20 min。混合物用PPh3 (3.26 g, 12.4 mmol)和Pd2(dba)3 (1.90 g, 2.07 mmol)处理，用氮气再鼓泡10min，然后在氮气流下加热时至90℃。40 hr后将混合物冷却至70℃，并滴加水(250 mL)。将混合物冷却至50℃达3 hr，然后冷却至RT达3天，在此期间形成米黄色沉淀。固体经过滤收集，用1-丁醇(2 x 100 mL)和水(2 x 100 mL)洗涤，然后于40℃真空干燥，得到标题化合物- 中间体B,，为灰白色固体(35.2 g, 65%)；Rt 2.25 min, m/z 640/642 (M+H)+ (ES+)。
化合物(I): 2-((4-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮
中间体B (35.2g, 55.0 mmol)、3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔[King-Underwood等人, WO2011/048111] (17.4 g, 110 mmol)、PdCl2(PPh3)2 (3.86 g, 5.50mmol)和碘化亚铜(I)(1.05 g, 5.50 mmol)于Et2NH和DMF的混合物(4:1 v/v, 820 mL)中的溶液，于RT用氮气鼓泡10 min。将混合物加热至65℃达1.5 hr，然后冷却至RT。真空蒸发挥发物，让残余物在EtOAc (600 mL)和饱和NH4OAc水溶液(650 mL)之间分配。分离水层，用EtOAc (300 mL)萃取，合并的有机层真空蒸发，得到暗褐色粘性油状物。加入甲醇(200mL)，将混合物于RT搅拌16 hr。形成黄色沉淀，将其经过滤收集，用MeOH (100 mL)洗涤。所得固体以两个分开的批次通过快速柱色谱纯化(SiO2, 330 g, MeOH的DCM溶液, 0-6%, 梯度洗脱)。将经纯化的材料一起溶解于DCM/MeOH混合物(10:1 v/v)中，得到均相溶液，然后将其蒸发并真空干燥，得到标题化合物 - 化合物(I)，为灰白色固体(20.1 g, 51%)；Rt2.15 min, m/z 718 (M+H)+ (ES+)；1H NMR δ: 3.19 (3H, s), 3.35-3.38 (2H, 重叠m),3.44-3.49 (4H, 重叠m), 3.60-3.63 (2H, 重叠m), 4.37 (2H, s), 5.49 (2H, s),5.76 (2H, s), 6.42 (1H, d), 6.65 (1H, m), 6.73 (1H, m), 6.79 (1H, m), 7.15(1H, t), 7.28 (1H, t), 7.52 (1H, d), 7.65-7.69 (2H, 重叠m), 7.82 (1H, m),8.12 (1H, s), 10.15 (1H, s)。
化合物(Ia): 2-((4-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(3-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮
中间体B (190 mg, 0.297 mmol)、2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙醇[King-Underwood等人, WO2011/048111] (257 mg, 0.890 mmol)、PdCl2(PPh3)2 (208 mg, 0.297mmol)和碘化亚铜(I)(57 mg, 0.30 mmol)于Et2NH和DMF的混合物(4:1 v/v, 7.5 mL)中的悬浮液用N2脱气，然后加热至60℃达16 hr。将反应混合物冷却至RT，在硅胶上真空蒸发，并经快速柱色谱纯化(SiO2, 12 g, MeOH的DCM溶液, 0-5%, 梯度洗脱)，得到标题化合物 -化合物(Ia)，为淡棕黄色固体(30 mg, 14%)；Rt 1.88 min, m/z 704 (M+H)+ (ES+)；1H NMRδ: 3.36-3.50 (6H, 重叠m), 3.61-3.63 (2H, 重叠m), 4.37 (2H, s), 4.58 (1H, m),5.48 (2H, s), 5.76 (2H, s), 6.41 (1H, d), 6.64 (1H, m), 6.72 (1H, d), 6.78(1H, s), 7.14 (1H, t), 7.27 (1H, t), 7.52 (1H, d), 7.65-7.71 (2H, 重叠m),7.82 (1H, t), 8.13 (1H, s), 10.19 (1H, br s)。
基于结构相似化合物的分析(参见WO2011/048111)，认为化合物(I)非常不可能表现出旋转对映异构现象。因旋转对映异构现象引起的药物开发的额外复杂性和结果类似于分子异构的其他来源(诸如存在立体中心)所产生的复杂性和结果。这种特性赋予这类分子手性和外消旋混合物(除非拆分)两者；其组分可能具有不同的药理学和毒理学概况。这一特征可能显著增加这类分子下游开发的成本，因此化合物(I)不存在旋转对映异构现象是非常理想和有益的特性。
实施例2 – 作为1型结晶多晶型物的化合物(I)的制备
作为1型结晶多晶型物的化合物(I)由中间体B开始制备，中间体B可以如以下流程所概述制备：
下面叙述所述中间体的制备。
1-溴-3-(叔丁氧基)-5-氟苯
向冰冷的DMA (2.0 L)中分次加入叔丁醇钠(284 g, 3.89 mol)，然后滴加1-溴-3,5-二氟苯(298 mL, 2.59 mol)。加入完成后，将混合物温热至RT并搅拌72 hr。加入水(200 mL)并将得到的树胶状沉淀过滤。将上清液真空浓缩，残余物经真空蒸馏纯化。将所得油状物溶于***(1.0 L)，用水(6 x 250 mL)洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩，得到标题化合物，为无色油状物(220 g, 881 mmol, 34.0%): b.p. 84-86℃ (8 mbar)；1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 1.35 (9H, s), 6.64 (1H, dt), 6.92-6.96 (2H, 重叠m)。
(3-(叔丁氧基)-5-氟苯基)硼酸；2
向1-溴-3-(叔丁氧基)-5-氟苯(75.0 g, 304 mmol)于THF (1.0 L)的溶液中，于-78℃滴加正丁基锂(2.5 M的己烷溶液,150 mL, 337 mmol)。所得混合物于该温度下搅拌45min，然后滴加硼酸三异丙酯(105 mL, 455 mmol)。将混合物于该温度下搅拌1.5 hr，然后在1.5 hr内温热至-5℃。混合物用***(1.0 L)和1M HCl水溶液(450 mL)稀释，分离各层。水层再用***(2 x 250 mL)萃取。合并的有机萃取物经干燥(MgSO4)、过滤然后真空蒸发，得到淡黄色油状物。将油状物重新溶于异己烷(300 mL)中并再次浓缩，得到灰白色粘性固体。固体用异己烷(150 mL)研磨并过滤，得到白色粉末。将该材料在2M NaOH (600 mL)和***(600 mL)之间分配。收集水层，有机层再用NaOH (2 x 200 mL)萃取。显著量的材料不溶，将其过滤，用***洗涤(经LCMS证实为清洁的产物)。碱性水层在冰浴中冷却，用浓HCl (~130 mL)酸化至pH 1。水层用DCM (3 x 300 mL)萃取，将合并的有机层干燥(Na2SO4)、过滤并真空浓缩，得到浅褐色粉末。将其用异己烷(100 mL)研磨，得到额外的清洁产物。合并两个批料，得到标题化合物2，为灰白色粉末(17.2 g, 73.0 mmol, 24.1 %): Rt: 1.87 min。
2-(3-(叔丁氧基)-5-氟苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂戊环；3
二氯化钯(II)-1,1'-双(二苯基膦)二茂铁(6.81 g, 9.31 mmol)、乙酸钾(54.8g, 558 mmol)和4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-双(1,3,2-二氧杂硼杂戊环) (52.0g, 205 mmol)的混合物用氮气吹洗，并向其中加入1-溴-3-(叔丁氧基)-5-氟苯(46.0 g,186 mmol)于DMSO (528 mL)中的溶液。对所得混合物超声处理3分钟，脱气5分钟，然后在80℃加热23 hr。将反应混合物在***(500 mL)和水(500 mL)之间分配。水层再用***(3 x400 mL)萃取。合并的有机萃取液用盐水(300 mL)洗涤、干燥(MgSO4)、过滤并真空蒸发，得到暗褐色残余物。将该残余物溶于异己烷/EtOAc混合物中，通过二氧化硅短柱过滤并真空蒸发，得到淡褐色固体。将固体残余物预先吸附到二氧化硅上并经柱色谱纯化(SiO2,用0-4% EtOAc的异己烷溶液洗脱, 梯度洗脱)，得到标题化合物3，为白色固体(27.0 g, 87.0mmol, 46.8%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.31 (12H, s), 1.34 (9H, s), 6.78(1H, m), 7.17-7.20 (2H, 重叠m)。
2-((4-氨基-3-(3-(叔丁氧基)-5-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)- 5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮;1 (来自硼酸, 3)
中间体A (2 x 10.0 g, 14.9 mmol)、(3-(叔丁氧基)-5-氟苯基)硼酸3 (2 x3.17 g, 14.9 mmol)、十水碳酸钠(2 x 6.75 g, 23.6 mmol)和四三苯基膦合钯(2 x 0.52g, 0.45 mmol)于EtOH/水混合物(9:1, 2 x 500 mL)中的混合物用氮气脱气，超声处理10min，然后在氮气下于65℃搅拌18 hr。将反应混合物合并，真空去除溶剂，将残余物溶于10%MeOH的DCM溶液(500 mL)，用饱和乙酸铵溶液(400 mL)洗涤。水层再用10% MeOH的DCM溶液(2 x 400 mL)萃取。合并的有机萃取液经真空蒸发，将残余物预吸附至硅胶上，经快速柱色谱纯化(用0-40% EtOAc的DCM溶液, 梯度洗脱)，得到标题化合物1，为浅黄色固体(8.4 g,9.89 mmol, 32.4%): Rt 2.70 min, 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ: 1.37 (9H, s),5.50 (2H, s), 5.78 (2H, s), 6.49 (1H, d), 6.91 (1H, t), 6.95 (1H, dt), 7.04(1H, m), 7.15 (1H, t), 7.28 (1H, t), 7.54 (1H, d), 7.68-7.72 (2H, 重叠m),7.83 (1H, dd), 8.15 (1H, s)。该材料为约80%纯。
2-((4-氨基-3-(3-(叔丁氧基)-5-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)- 5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；1 (来自硼酸酯, 2)
中间体A (10.0 g, 14.9 mmol；按照实施例1所述制备)、2-(3-(叔丁氧基)-5-氟苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂戊环2 (6.59 g, 22.40 mmol) (3.17 g, 14.9mmol)、十水碳酸钠(26.75 g, 23.6 mmol)和四三苯基膦合钯(0.52 g, 0.45 mmol)于EtOH/水混合物(9:1, 500 mL)中的混合物用氮气脱气，超声处理10 min，然后于65℃在氮气下搅拌40 hr。真空去除溶剂，将残余物溶于10% MeOH的DCM溶液(250 mL)中，用饱和乙酸铵溶液(200 mL)洗涤。水层再用10% MeOH的DCM溶液(2 x 200 mL)萃取。将合并的有机萃取液真空蒸发，将残余物预吸附至硅胶上，经快速柱色谱纯化(用0-40% EtOAc的DCM溶液洗脱, 梯度洗脱)得到标题化合物，为浅黄色固体(4.5 g, 6.14 mmol, 41.1%): Rt 2.70min。
2-((4-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-溴- 3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮
向2-((4-氨基-3-(3-(叔丁氧基)-5-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮1 (13.0 g, 18.6 mmol)于DCM (150mL)的溶液中加入三氟乙酸(21.6 mL, 280 mmol)，将所得溶液搅拌2 hr。真空去除溶剂。将残余物溶于DCM溶液(200 mL)和饱和NaHCO3溶液(200 mL)中。水层再用10% MeOH的DCM溶液(2 x 100 mL)萃取，将合并的有机萃取液真空蒸发。将残余物预吸附至硅胶上，经快速柱色谱纯化，用0-3% MeOH的DCM溶液洗脱，得到标题化合物1b，为白色固体(7.60 g, 11.8mmol, 63.0%): m/z 640 (M+H)+ (ES+)；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 5.47 (2H, s),5.78 (2H, s), 6.43 (1H, d), 6.65 (1H,dt), 6.75 (1H, m), 6.79 (1H, t), 7.14(1H, t), 7.28 (1H, t), 7.53 (1H, d), 7.69-7.73 (2H, 重叠m), 7.85 (1H, m),8.13 (1H, s), 10.18 (1H, d)。
化合物(I): 2-((4-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基) 甲基)-5-(3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑 啉-4(3H)-酮，为1型结晶多晶型物
3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔(4.69 g, 29.7 mmol)、碘化亚铜(I)(226 mg, 1.19 mmol)、中间体B (7.6 g, 11.9 mmol)和双(三苯基膦)二氯化钯(II)(833mg, 1.19 mmol)于二乙胺(330 mL)中的混合物用氮气充分脱气，于60℃搅拌3 hr。再加入3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔(400 mg)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)(167 mg,0.24 mmol)和碘化亚铜(I)(0.45 g, 0.24 mmol)于二乙胺(30.0 mL)中的溶液，于60℃搅拌3 hr。加入一份额外的3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔7 (400 mg)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)(167 mg, 0.24 mmol)和碘化亚铜(I)(0.45 g, 0.24 mmol)，反应混合物在60℃再搅拌7 hr。真空去除溶剂，将残余物溶于10% MeOH的DCM溶液(200 mL)中，用乙酸铵水溶液(10wt%, 300 mL)洗涤。水层再用10% MeOH的DCM溶液(2 x 200 mL)萃取。将合并的有机层真空蒸发。残余物在MeOH (30.0 mL)中制浆过夜，然后过滤。将固体残余物预吸附至二氧化硅上，经柱色谱纯化(SiO2, 用0-5% MeOH的DCM溶液洗脱, 梯度洗脱)，得到化合物(I)，为黄褐色固体，呈1型结晶多晶型物形式(4.73 g, 6.52 mmol, 55.0%): m/z 718(M+H)+ (ES+)；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3.20 (3H, s), 3.35-3.39 (2H, 重叠m),3.43-3.50 (4H, 重叠m), 3.60-3.64 (2H, 重叠m), 4.38 (2H, s), 5.49 (2H, s),5.77 (2H, s), 6.42 (1H, d), 6.65 (1H,dt), 6.74 (1H, dq), 6.79 (1H, t), 7.15(1H, t), 7.28 (1H, t), 7.52 (1H, d), 7.65-7.72 (2H, 重叠m), 7.83 (1H, m),8.13 (1H, s), 10.19 (1H, s)。
该材料样品的XRPD分析用通用方法中的XRPD方法2进行。该材料是结晶，如所获得的XRPD图(图3)所示，但也含有某些无定形材料。
对样品1型结晶多晶型物的DSC分析(采用通用方法中的DSC方法1)示于图4 (下图)，其中可以看出该样品在加热时经历了多个事件。有广泛吸热，最大峰为102℃，然后放热，最大峰为141℃，随后是更急剧的吸热，最大峰为174℃。观察到在加热期间形成新的结晶多晶型物，后者发现是2型结晶多晶型物。对1型结晶多晶型物样品的TGA分析(用通用方法中的TGA方法1) (图4；上图)显示：从周围温度至75℃重量损失0.34%，可能因游离溶剂和/或吸湿水被蒸发所致。
实施例3 – 作为2型结晶多晶型物的化合物(I)的制备
方法1
2型结晶多晶型物可以如下通过从1-丙酮溶液中结晶来制得。向100 ml反应器中填装1.98 g化合物(I)和49.5 ml 1-丙醇 (25 L/kg)。将混合物搅拌并温热至95℃(于92℃下观察到溶液)。将溶液保持在95℃达30分钟，然后在10小时内冷却至23℃，于72℃下发生自发结晶。将异相混合物搅拌4小时，然后沉淀经过滤并用1-丙醇(2 mL)洗涤。产物于45℃真空干燥18小时，得到1.71 g 2型结晶多晶型物，收率为86.4%。
方法2
2型结晶多晶型物从1-丙醇溶液中结晶也可以如下通过接种2型结晶多晶型物的一个或多个晶体来促进。将1-丙醇(25.00 L/kg, 275.0 mL)加入化合物(I) (11.00 g)中。将混合物于25℃以350 rpm搅拌。然后将异相混合物在40分钟内温热至97℃(回流温度)，于97℃保持5分钟，然后在5分钟内冷却至96℃，然后于96℃保持1 hr。将均相的略微橙色的溶液在15分钟内冷却至85℃。然后将搅拌速度降至250 rpm，给溶液接种2型结晶多晶型物(0.01 kg种晶/ kg化合物(I)原材料, 0.11 g)。将混合物于85℃搅拌10分钟，然后采用非线性系数为2.3的立方冷却在8 h内冷却至22℃。将异相混合物于22℃搅拌10小时，然后过滤沉淀。产物用1-丙醇(1.00 L/kg, 8.84 g, 11.00 mL)洗涤，然后于45℃干燥(周末；72小时)，得到2型结晶多晶型物(9.5 g, 86.4 %)。
方法3
2型结晶多晶型物可以通过将1型结晶多晶型物在甲醇、乙醇、2-丙醇、1-丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲苯、乙酸异丙酯、TBME、2-丁酮、DMSO、***、MIBK、庚烷、硝基甲烷、10%水/乙醇、10%水/乙腈或10%水/2-丙醇中制浆而制得。
方法4
2型结晶多晶型物可以通过将无定形化合物(I)在甲醇、乙醇、2-丙醇、1-丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲苯、乙酸异丙酯、TBME、2-丁酮、DMSO、***、MIBK、硝基甲烷、10%水/乙醇或10%水/2-丙醇中制浆而制得。
方法5
2型结晶多晶型物的放大制备如下所示：20 ml闪烁小瓶中称量200 mg 1型结晶多晶型物。加入50倍体积的甲醇，将样品在20℃和50℃之间以500 rpm恒定搅拌制浆24小时(各温度下4小时)。将所得的材料真空下过滤并于40℃真空炉中干燥过夜。
实施例4 – 作为2型结晶多晶型物的化合物(I)的表征
2型结晶多晶型物样品的XRPD分析用通用方法中的XRPD方法3进行。所获得的XRPD图示于图5。
2型结晶多晶型物样品的TGA分析用通用方法中的TGA方法2进行。所获得的数据示于图6，从中可明显看出：2型结晶多晶型物从155℃至200℃显示出重量损失± 0.5%。
2型结晶多晶型物样品的DSC分析用通用方法中的DSC方法2进行。所获得的数据示于图7，从中可明显看出：2型结晶多晶型物显示出于190.1℃(最大峰值)融化分解。
2型结晶多晶型物样品的DVS等温线图示于图8，质量图中的DVS变化示于图9。观察到2型结晶多晶型物从0% RH直至95% RH ± 0.4%逐渐吸水，水吸收是可逆的，表明2型是非吸湿性的。
2型结晶多晶型物样品的静态稳定性研究表明：就固体形式而言该样品对湿度稳定，因为在DVS分析后(参见图10)以及于25℃ / 96% RH和40℃ / 75% RH贮存1周(参见图11, 采用通用方法中的XRPD方法1)后，XRPD (采用通用方法中的XRPD方法3)没有显示变化。
实施例5 – 作为2型结晶多晶型物的微粉化化合物(I)的稳定性
微粉化2型结晶多晶型物采用5 cm气流粉碎机微粉化装置制备，以产生以下粒径分布：D10 = 1.14 μm；D50 = 1.94 μm和D90 = 3.39 μm (粒径分布采用激光衍射(MalvernMastersizer装置)测定)。
微粉化材料在时间0时和不同贮存条件之后通过TGA、XRPD和DSC进行分析。样品在以下条件下贮存：(i) RT / <5% RH下7周；(ii) RT / 56% RH下7周；(iii) RT / 75% RH下7周；(iv) 50℃下7周；和(v) 40℃ / 75% RH下7周。
表3中所示的数据表明：该样品在晶体学和热力学上是稳定的，因为在不同条件下没有观察到显著变化。
表3：2型结晶多晶型物(微粉化)的稳定性数据
* 达7周；REF = 结晶参比；~Ref = 等于参比
实施例6 – 无定形化合物(I)的制备
无定形化合物(I)通过将1型结晶多晶型物(采用实施例2的方法获得)加热至120℃而制得。
实施例7 – 作为3型结晶多晶型物的化合物(I)的制备
方法1
3型结晶多晶型物可以通过将无定形化合物(I)于二氯甲烷中制浆来制得。
方法2
3型结晶多晶型物的放大规模制备如下进行：将200 mg 1型结晶多晶型物加入到含有5倍体积二氯甲烷的4 ml小瓶中。将样品涡旋30秒。然后再加入5倍体积的DCM，将样品再涡旋30秒。将样品真空过滤并在真空炉中于25℃干燥一个周末。
实施例8 – 作为3型结晶多晶型物的化合物(I)的表征
3型结晶多晶型物样品的XRPD分析用通用方法中的XRPD方法2进行。XRPD图示于图12。
3型结晶多晶型物样品所获得的TGA和DSC数据(采用通用方法中的TGA方法1和DSC方法1)示于图13。3型结晶多晶型物于约186℃(最大峰值；DSC – 下图)融化分解。
3型结晶多晶型物样品所获得的GVS等温线示于图14，其中观察到在0-90% RH下有0.99%质量变化。
3型结晶多晶型物样品的静态稳定性研究表明：就固体形式而言该样品对湿度稳定，因为在GVS分析后(参见图15)以及于25℃/96% RH和40℃ / 75% RH贮存1周(参见图16,采用通用方法中的XRPD方法1)后，XRPD (采用通用方法中的XRPD方法2)没有显示变化。
实施例9 –作为4型假多晶型物的化合物(I)的制备
将1型结晶多晶型物形式的化合物(I) (20 mg)或无定形化合物(I) (20 mg)称量到HPLC小瓶中。然后于室温以增量加入THF，振摇1分钟。然后将样品于50℃振摇(500 rpm)15分钟，然后接着加入THF。这一过程继续直至加入80倍体积的THF，从而获得溶液。将溶液以0.1℃/min从50℃冷却至5℃，于5℃保持过夜。然后溶液经过蒸发，以获得固体。固体在真空下过滤、风干(真空下)2小时，然后用通用方法中的XRPD方法1进行XRPD分析。用无定形化合物(I)作为原材料获得的固体样品的XRPD图示于图17，对应于4型假多晶型物。
用1型结晶多晶型物作为原材料获得的固体样品在真空炉中于25℃干燥>48小时，然后再次进行XRPD分析。在这一延长的干燥期后，观察到4型结晶多晶型物转变为无定形化合物(I)。因此，4型假多晶型物是准稳态溶剂合物。
实施例10 – 作为5型假多晶型物的化合物(I)的制备
将1型结晶多晶型物形式的化合物(I) (20 mg)或无定形化合物(I) (20 mg)称量到HPLC小瓶中。然后于室温以增量加入1,4-二噁烷，振摇1分钟。然后将样品于50℃振摇(500 rpm)15分钟，然后接着加入1,4-二噁烷。这一过程继续直至加入80倍体积的1,4-二噁烷，从而获得溶液。将溶液以0.1℃/min从50℃冷却至5℃，于5℃保持过夜。然后溶液经过蒸发，以获得固体。固体在真空下过滤、风干(真空下)2小时，然后用通用方法中的XRPD方法1进行XRPD分析。用无定形化合物(I)作为原材料获得的固体样品的XRPD图示于图17，对应于5型假多晶型物。用1型结晶多晶型物作为原材料获得的固体样品在真空炉中于25℃干燥>48小时，然后再次进行XRPD分析。在这一延长的干燥期后，5型假多晶型物没有改变形式。进行进一步的表征以产生1H NMR、TGA和DSC数据(未显示)，表明5型假多晶型物在溶剂损失后转变回无定形化合物(I)。因此，5型假多晶型物是准稳态溶剂合物。
实施例11 – 作为6型假多晶型物的化合物(I)的制备
将无定形化合物(I) (20 mg)称量到HPLC小瓶中。然后于室温以增量加入10%水/乙腈，振摇1分钟。然后将样品于50℃振摇(500 rpm)15分钟，然后接着加入10%水/乙腈。这一过程继续直至加入80倍体积的10%水/乙腈。让所得的浆液在25℃和50℃之间成熟(每一温度4小时)，以500 rpm振摇2天。然后真空过滤固体，风干2天，并用通用方法中的XRPD方法1进行XRPD分析。该材料样品的XRPD图示于图17，对应于6型假多晶型物。在XRPD分析后，将该材料在真空炉中于40℃干燥过夜。在这一延长的干燥期后，观察到6型假多晶型物丧失溶剂，转变为2型结晶多晶型物。因此，6型假多晶型物是准稳态溶剂合物。
实施例12 – 作为7型假多晶型物的化合物(I)的制备
将无定形化合物(I) (20 mg)称量到HPLC小瓶中。然后于室温以增量加入10%水/丙酮，振摇1分钟。然后将样品于50℃振摇(500 rpm)15分钟，然后接着加入10%水/丙酮。这一过程继续直至加入80倍体积的10%水/丙酮。让所得的浆液在25℃和50℃之间成熟(每一温度4小时)，以500 rpm振摇2天。然后真空过滤固体，风干2天，并用通用方法中的XRPD方法1进行XRPD分析。该材料样品的XRPD图示于图17，对应于7型假多晶型物。在XRPD分析后，将该材料在真空炉中于40℃干燥过夜。在这一延长的干燥期后，观察到7型假多晶型物丧失溶剂，转变为2型结晶多晶型物。因此，7型假多晶型物是准稳态溶剂合物。
实施例13 – 2型和3型结晶多晶型物的热力学稳定性以及它们的相互转变
对2型和3型结晶多晶型物的50:50混合物进行竞争性浆实验。加入50倍体积的溶剂，在设定温度下搅拌(300 rpm)样品3天。然后将所有样品真空过滤并风干30分钟，然后进行XRPD分析。
浆实验的结果概述于下面表4中：
表4：竞争性浆实验
所有的竞争性浆实验皆产生2型，表明这是更稳定的热力学形式。
实施例14 – 体外和体内筛选方法学和结果
体外筛选
生物学测试：实验方法
酶抑制测定
PI3K酶在ATP和Mg2+离子存在下催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)磷酸化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)。PIP3产物可以通过时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)(HTRF®PI3K酶测定, Millipore)，通过从由铕标记的抗GST单克隆抗体、GST标记的普列克底物蛋白(Pleckstrin)同源(PH)结构域、生物素化PIP3和链亲和素-别藻蓝蛋白(allophycocyanin) (APC)组成的能量转移复合物置换生物素-PIP3来探测。复合物中的铕于330 nm激发，导致能量转移至APC和于665 nm发射荧光，尽管铕本身以其特征性波长620nm发射。由PI3K活性形成的PIP3产物从复合物中置换生物素-PIP3，导致能量转移损失(降低信号)。
以所需的终浓度将待测化合物加入到PIP2底物和重组PI3K酶(α、β或δ同工酶, 来自Millipore, 或者γ同工酶[p110γ + p101构建物], 来自United States Biological,Swampscott, MA)的混合物中，将混合物于RT温育2 hr。该温育期后，将ATP (10 μM)加入酶/化合物/PIP2底物混合物中，将所得的混合物于RT再温育30分钟。然后加入含有生物素化PIP3的终止溶液和含有GST标记的GRP1普列克底物蛋白同源(PH)结构域和荧光团的检测混合物，将混合物于RT温育15-18 hr，然后在荧光酶标仪(Synergy 4, BioTek UK,Bedfordshire, UK)中检测。
按照以下公式计算结果：APC信号(于665 nm发射)/铕信号(于620 nm发射) x104。相对于DMSO处理的对照，计算对每一反应的抑制百分率，然后由浓度反应曲线计算50%抑制浓度(IC50值)。
PI3K δ基于细胞测定
作为评价对刺激应答的PI3Kδ活化的手段，测量PI3Kδ信号转导下游产物蛋白Akt的磷酸化状态。
得自人白血病单核细胞淋巴细胞系的U937细胞，通过与PMA (100 ng/mL)孵育48-72 hr，分化为巨噬细胞型细胞。然后将细胞与受试化合物或溶媒预孵育2 hr，随后通过暴露于H2O2 (10 mM, 5-7 min)进行短暂刺激，通过用4%甲醛溶液替代培养基来终止反应。内源过氧化物活性和甲醛通过与淬灭缓冲液(0.1%叠氮化钠, 1% H2O2的PBS溶液，含有0.1%Triton X-100)孵育20 min来失活。细胞用缓冲液(含有0.1% Triton X-100的PBS)洗涤，与封闭溶液(1% BSA的PBS溶液)一起孵育1 hr，然后在用缓冲液再洗涤，并与抗pAkt抗体或抗pan-Akt抗体(皆来自Cell Signaling Technology)一起孵育过夜。用缓冲液(含有0.1%Triton X-100的PBS)洗涤后，细胞与HRP缀合的第二抗体(Dako)一起孵育，所得的信号使用TMB底物(底物试剂套装, 由R&D Systems, Inc.供应)经比色法检测(OD: 450 nm，参比波长为655 nm)。
该反应通过加入H2SO4溶液(100 μL)来终止。然后细胞用缓冲液(含有0.1% TritonX-100的PBS)洗涤，施加5%结晶紫溶液(100 μL) 30 min。在用缓冲液(含有0.1% Triton X-100的PBS)洗涤后，向各孔加入1% SDS (100 μL)，将板轻轻振摇1 hr，然后测量595 nm的吸光度(Varioskan® Flash, Thermo-Fisher Scientific)。通过将OD450-655除以OD595读数，将所测量的OD450-655读数对细胞数进行校正。pAkt信号与总Akt信号之比用来定量PI3K δ活化程度。相对于10 μg/mL标准对照(LY294002)，计算各孔的抑制百分率，10 μg/mL标准对照(LY294002)被设定为100%抑制，而单独的H2O2对照被设定为0%抑制。由通过受试化合物的连续稀释产生的浓度反应曲线计算IC50值。
PI3K γ基于细胞测定
作为评价对刺激应答的PI3K γ活化的手段，在用MCP-1刺激后测量PI3K γ信号转导下游产物蛋白Akt的磷酸化状态。
通过与PMA (100 ng/mL)孵育48-72 hr，将U937细胞分化为巨噬细胞型细胞。然后将细胞与受试化合物或溶媒预孵育2 hr，随后用MCP-1 (10 nM, 1 min)短暂刺激，通过用4%甲醛溶液替代培养基来终止反应。内源过氧化物活性和甲醛通过与淬灭缓冲液(0.1%叠氮化钠, 1% H2O2的PBS溶液，含有0.1% Triton X-100)孵育20 min来失活。细胞用缓冲液(含有0.1% Triton X-100的PBS)洗涤，与封闭溶液(1% BSA的PBS溶液)一起孵育1 hr，然后用缓冲液再洗涤，并与抗pAkt抗体或抗pan-Akt抗体(皆来自Cell Signaling Technology)一起孵育过夜。用缓冲液(含有0.1% Triton X-100的PBS)洗涤后，细胞与HRP缀合的第二抗体(Dako)一起孵育，所得的信号使用TMB底物(底物试剂套装, 由R&D Systems, Inc.供应)经比色法检测(OD: 450 nm，参比波长为655 nm)。
该反应通过加入H2SO4溶液(100 μL)来终止。然后细胞用缓冲液(含有0.1% TritonX-100的PBS)洗涤，施加5%结晶紫溶液(100 μL) 30 min。在用缓冲液(含有0.1% Triton X-100的PBS)洗涤后，向各孔加入1% SDS (100 μL)，将板轻轻振摇1 hr，然后测量595 nm的吸光度(Varioskan® Flash, Thermo-Fisher Scientific)。通过将OD450-655除以OD595读数，将所测量的OD450-655读数对细胞数进行校正。pAkt信号与总Akt信号之比用来定量PI3K γ活化程度。相对于10 μg/mL标准对照(LY294002)，计算各孔的抑制百分率，10 μg/mL标准对照(LY294002)被设定为100%抑制，而单独的MCP-1对照被设定为0%抑制。使用XL-Fit(idbs, Guildford, UK)，由受试化合物连续稀释液产生的浓度-反应曲线计算IC50值。
过氧化物阴离子产生测定
作为评价PI3Kδ依赖性细胞功能的手段，通过化学发光测定评估IFNγ引发的U937细胞中的过氧化物阴离子产生。将U937细胞(购自ATCC, Manassas, VA)在37℃维持在含有10% FCS的RPMI 1640 (Invitrogen Ltd., Paisley, UK)中。细胞以107细胞/mL的密度悬浮于40 mL 10% FCS RPMI 1640中，用20 µL 100 µg/mL IFNγ溶液(终浓度: 50 ng/mL)处理，于37℃, 5% CO2孵育4天。
将IFNγ引发的U937细胞以0.2 x 106细胞/孔接种于96孔板中，与受试化合物在饥饿培养基(0.5% FCS RPMI1640-无酚红)中预孵育2 hr。将来自酿酒酵母(Saccharomyses cerevisiae)的Zymosan A (10 mg) (来自Sigma-Aldlich)重悬于1 mL 150 mM NaCl，于100℃煮沸15 min。煮沸后，Zymosan粒子用1 mL PBS洗涤2次，与0.5 mL BioParticlesTM调理试剂(opsonized reagent) (Life technologies)于37℃孵育60 min。细胞用Zymosan粒子溶液(10 µL)、测定缓冲液(85 µL)、luminol (2.5 µL)和增强剂溶液(2.5 µL) (它们全都(与Zymosan分开)由过氧化物阴离子测定试剂盒(Superoxide Anion Assay Kit, #CS1000, Sigma-Aldrich Ltd, Poole, UK)供应)的混合物处理。指示释放的过氧化物阴离子的化学发光每15分钟通过比荧光测量(Varioskan® Flash, Thermo-FisherScientific)测量，直至60分钟。
孵育后60 min的数据用于分析。计算相对于10 μg/mL标准PI3Kδ抑制剂IC87114的各孔的抑制百分率，10 μg/mL IC87114被设定为100%抑制，而对照被设定为0%抑制。使用XL-Fit (idbs, Guildford, UK)，由受试化合物连续稀释液产生的浓度反应曲线计算相对IC50值。
PBMC中的Cytostim诱导的细胞因子产生
作为评价PI3Kδ依赖性细胞功能的手段，通过Luminex多元测定，评价PBMC中cytostim诱导的IL-4、IL-5、IL-13和IFNγ的产生。所有健康志愿者由Quintiles Limited(London, UK)招募，血液样品送至Respivert Ltd.。该项研究由当地伦理委员会批准，所有受试者皆提供了书面同意。
将PBMC悬浮液(200 µL；2 x 106细胞/mL)加入96孔板中。细胞用纯DMSO中的受试化合物或者作为溶媒的DMSO (2 μL)处理，于RT孵育1 hr。以1:50的比率加入Cytostim(Miltentyi Biotec, Surrey, UK)，细胞孵育20 hr (37℃；5% CO2)。将板以500 x g离心5分钟，收集上清液。通过Luminex，如下用高敏感性细胞因子磁珠试剂盒(#HSCYTMAG-60SK,Millipore, Watford, UK)测量所述4种分析物(IL-4、IL-5、IL-13和IFNγ)：将抗体磁珠复用，在4℃振摇下于96孔板中与标准、仅培养基或样品(50 μL)孵育过夜。使用磁板洗涤器，用试剂盒中的Millipore洗涤缓冲液洗涤2次后，在RT振摇下将磁珠与检测抗体(50 μL)孵育1 hr。在RT振摇下，加入试剂盒中提供的链亲和素-藻红蛋白溶液达30 min。洗涤后，将磁珠重悬于鞘液(sheath fluid) (150 μL)，立即进行分析。设定Luminex***以计数50个磁珠，针对标准曲线计算上清液中每种分析物的量。用XL-Fit (IDBS, Guildford, UK)，由浓度-抑制曲线计算IC50值。
向MCP1的趋化
作为评价PI3K γ依赖性细胞功能的手段，采用48孔趋化室评价THP1细胞向MCP-1的趋化。THP1细胞来自人白血病单核细胞淋巴细胞系(购自ATCC Manassas, VA)，将其于37℃维持在含有10% FCS的RPMI 1640 (Invitrogen Ltd., Paisley, UK)中。将细胞重悬于0.5% BSA / RPMI1640 (2 x 106细胞/mL)中，于37℃、5% CO2孵育10 min。然后，细胞悬液等份(500 µL)用纯DMSO中的化合物或者用作为溶媒的DMSO (2.5 µL)处理1hr (37℃, 5%CO2)。
制备含MCP1 (50 nM)的0.5% BSA/RPMI1640。将MCP1溶液(50 µL)加入48孔趋化室(AP48, NeuroProbe Inc., Gaithersburg, MD)的底板中的各孔。聚碳酸酯膜(8 µm)固定在底部室上，和然后将顶板固定在底部室和滤膜上。细胞悬液等份(50 µL)用化合物或溶媒处理，然后小心加入到上部室中，在顶部施加0.5% BSA RPMI1640 (50 µL)中。然后让所述室静止2 hr (37℃, 5% CO2)。然后小心去除膜，将来自底部室的样品(25 μL)转移至新的96孔板。
向各孔加入MTT (50 μL)于10% FCS无酚红RPMI1640中的溶液，将板孵育2 hr (37℃, 5% CO2)。向各孔加入纯DMSO (100 µL)，以萃取由MTT生成的甲，将板轻轻振摇1 hr，然后测量595 nm吸光度 (Varioskan® Flash, Thermo-Fisher Scientific)。将所述数值与选择性PI3Kγ抑制剂AS604850 (10 µg/mL)引起的抑制相比较，以计算相对抑制百分率。使用XL-Fit (idbs, Guildford, UK)，由浓度-抑制曲线确定相对EC50值。
CXCL8从得自COPD患者的嗜中性粒细胞释放
通过ELISA测定，评价处理对CXCL8从得自COPD患者的嗜中性粒细胞释放的影响。所有患者皆由Quintiles Limited (London, UK)招募，血液样品送至Respivert Ltd.。该项研究由当地伦理委员会批准，所有受试者皆提供了书面同意。将全血(30 mL)与ACD (5mL；包含: 250 ml无菌双蒸水中的7.36 g柠檬酸、14.71 g柠檬酸钠、9.91 g葡萄糖)和6%葡聚糖(15 mL；稀释于0.9% NaCl)轻轻混合，以去除红细胞。试管于RT孵育45 min，然后收集上清液(富含白细胞的部分)，留下红细胞。
该部分在低制动下离心(1200 rpm 10 min, 4℃)。抽取上清液，将沉淀重悬于冰冷的无菌双蒸水(10 mL)中，30秒后加入0.6 M KCl (4 mL)。细胞悬液用无菌PBS稀释(至终体积为50 mL)，然后以1500 rpm离心5 min。抽取上清液，沉淀重悬于PBS (2.5 mL)中，将来自同一供体的两个管合二为一。
用巴斯德吸管将该细胞悬液小心铺层于5 mL Ficoll-paqueTM premium (GEHealthcare Bio Science AB, Uppsala, 瑞典)顶部，然后离心(在低制动下1500 rpm 30min)。位于管底部的所分离的嗜中性粒细胞重悬于含有5% FCS的RPMI-1640培养基(Gibco,Paisley, UK)，以4x105细胞/孔的密度接种于96孔板中。将细胞在开始处理之前孵育30min (37℃；5% CO2)。
嗜中性粒细胞与受试化合物或与DMSO溶媒预孵育1 hr，然后用TNFα (10 ng/mL)刺激。TNFα刺激后3 hr收集无细胞上清液，使用DuoSet ELISA显色试剂盒(R&D systems,Abingdon, UK)，通过ELISA测量CXCL8。使用XL-Fit (IDBS, Guildford, UK)，由浓度-抑制曲线确定所报道的IC50值。
MTT测定
PMA-分化的U937细胞与受试化合物(10 µg/mL)或溶媒于5% FCS中预孵育4 hr或于10% FCS中预孵育24 hr。上清液用新的培养基(200 μL)替换，向各孔加入MTT贮液(10 μL, 5 mg/mL)。孵育1 hr后，去除培养基，向各孔加入200 μL DMSO，将板轻轻振摇1 hr，然后读出550 nm吸光度。计算各孔相对于溶媒(0.5% DMSO)-处理的细胞存活率降低百分率。
体内筛选：药效学和抗炎活性
小鼠体内LPS诱导的气道嗜中性粒细胞积聚
在相对于LPS处理开始的时间点T = -2 hr、-8 hr或-12 hr，通过气管内给药(给药体积为20 µL)，给非禁食BALB/c小鼠(6-8周龄)施用溶媒或受试化合物。制备0.5 mg/mLLPS溶液，用De Vibliss超声喷雾器(ultrasonic nebuliser) 2000 (30 min暴露期间7mL)雾化。在LPS攻击后8 hr，给气管插管，通过气管导管，通过灌注然后回抽PBS (1 mL)到肺部提取支气管肺泡灌洗液(BALF)。重复这一程序，以达到收率为约2 mL灌洗液。用血球计测量BALF样品中的细胞总数。通过于RT以1200 rpm离心2 min制备BALF样品的细胞离心器涂片(Cytospin smear)，用DiffQuik染色***(Dade Behring)染色，以进行差别细胞计数。用油浸显微镜对细胞进行计数。数据以每mL BALF的嗜中性粒细胞数(平均值 ± S.E.M)表示。
大鼠体内LPS诱导的气道嗜中性粒细胞积聚
在相对于LPS处理开始的时间点T = -2 hr、-8 hr或-12 hr，通过气管内给药(给药体积为100 µL)，给非禁食大鼠施用溶媒或受试化合物。LPS溶液(0.3 mg/mL)用DeVibliss超声喷雾器(ultrasonic nebuliser) 2000 (30 min暴露期间7 mL)雾化。在LPS攻击后8 hr，给气管插管，通过气管导管，通过灌注然后回抽PBS (1 mL)到肺部提取支气管肺泡灌洗液(BALF)。重复这一程序以提供约2 mL灌洗液。
用Countess自动化细胞计数器(Invitrogen)，测量BALF样品中的细胞总数。通过于RT以1200 rpm离心2 min制备BALF样品的细胞离心器涂片，用DiffQuik染色***(DadeBehring)染色，以进行差别细胞计数。用油浸显微镜对细胞进行计数。数据以每mL BALF的嗜中性粒细胞数(平均值 ± S.E.M)表示。
小鼠体内卵清蛋白诱导的气道嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞积聚
于第0天和第7天，BALB/c小鼠(6-8周龄)用OVA (10 µg/小鼠i.p.)免疫。为了在肺部诱导局部炎性反应，在第13-15天用雾化卵清蛋白溶液(10 mg/mL, 30 min暴露, DeVilibiss Ultraneb 2000)重复攻击小鼠。第17天，在最后一次OVA攻击前2 hr，每只动物通过气管内给药接受溶媒或受试化合物。8小时后给动物麻醉，然后进行气管切开术。通过灌注PBS (1 mL)至肺部然后将其抽回而获得BAL。重复这一程序，以得到约2 mL灌洗液。用血球计测量BALF样品中的细胞总数。通过于RT以200 rpm离心5 min制备BALF样品的细胞离心器涂片，用DiffQuik染色***(Dade Behring)染色，以进行差别细胞计数。用油浸显微镜对细胞进行计数。数据以每mL鼻腔灌洗液的差别细胞数(平均值 ± S.E.M)表示。
小鼠体内多聚-I:C诱导的细胞积聚
在麻醉(3%异氟烷)下给无特定病原体的A/J小鼠(雄性, 5周龄)鼻内施用多聚(I:C)-LMW (1 mg/mL, 40 μL) (InvivoGen, San Diego, CA, USA)，每日两次，施用3天。受试物质于每次多聚-I:C处理前2 hr进行鼻内施用(50 μL于10% DMSO/等渗盐水溶媒中)。最后一次多聚-I:C攻击后24 hr麻醉动物，给气管插管，通过将等渗盐水(100 mL/kg)灌注到肺部然后从肺部抽取获取支气管肺泡灌洗(BAL)。在相差显微镜下，用血球计测量BALF样品中的细胞总数。
肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞的比例使用抗小鼠MOMA2-FITC (巨噬细胞)或抗小鼠7/4-FITC (嗜中性粒细胞)，通过FACS分析进行测定。将细胞悬浮于PBS中，与抗MOMA2-FITC (2 µg/mL, 目录号SM065F, Acris Antibodies GmbH, Herford, Germany)或抗7/4-FITC (2 µg/mL, 目录号CL050F, Acris Antibodies GmbH, Herford, Germany)于30℃孵育30 min，然后用碘化丙啶(2 µg/mL)复染，以允许排除坏死细胞。细胞用PBS洗涤，转移至FACS管中。样品置于流式细胞仪(ALTRA II；Beckman Coulter Japan, Tokyo, Japan)中，做出具有log x轴的单参数FL2 [PMT2] (FITC)直方图，以阐明FITC相对密度。储存数据文件，以便随后用Kaluza分析软件(ver. 1.2)分析，从而计算各种细胞类型的比例。
香烟烟雾模型
采用用于小动物的香烟烟雾吸入实验***(Model SIS-CS；Sibata ScientificTechnology, Tokyo, Japan)，使A/J小鼠(雄性, 5周龄)暴露于香烟烟雾(4%香烟烟雾, 用压缩空气稀释)，每天暴露30 min，暴露11天。在最后一次香烟烟雾暴露后，受试物质每日施用1次，施用3天(鼻内给药剂量，含有35 μL在50% DMSO/等渗盐水中的溶液)。
最后一剂施用后12 hr麻醉动物，给气管插管，通过将PBS (100 mL/kg)灌注到肺部然后从肺部抽取进行支气管肺泡灌洗(BAL)。在相差显微镜下，用血球计测量BALF样品中的细胞总数。肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞的比例使用抗小鼠MOMA2-FITC (巨噬细胞)或抗小鼠7/4-FITC (嗜中性粒细胞)，通过FACS分析进行测定。
将细胞悬浮于PBS中，与抗MOMA2-FITC (2 µg/mL, 目录号SM065F, AcrisAntibodies GmbH, Herford, Germany)或抗7/4-FITC (2 µg/mL, 目录号CL050F, AcrisAntibodies GmbH, Herford, Germany)于30℃孵育30 min，也用碘化丙啶(2 µg/mL)复染，以允许排除坏死细胞。细胞用PBS洗涤，转移至FACS管中。样品置于流式细胞仪(ALTRA II；Beckman Coulter Japan, Tokyo, Japan)中，做出具有log x轴的单参数FL2 [PMT2](FITC)直方图，以阐明FITC相对密度。
储存数据文件，以便随后用Kaluza分析软件(ver. 1.2)分析，从而计算各种细胞类型的比例。BALF中的CXCL1(KC)、MCP1、TNFα、IL-17或骨桥蛋白水平用Quentikine®小鼠KC、MCP1、TNFα、IL-17或骨桥蛋白ELISA试剂盒(R&D systems, Inc., Minneapolis, MN,USA)测量。用OxiSelect® TBARS测定试剂盒(MDA Quantitation；Cell Biolabs Inc, SanDiego, CA, USA)测量丙二醛的存在情况。
体外和体内筛选结果概述
下面陈述采用上述方法测定的式(I)化合物的体外概况(表5、6和7)。在酶测定中，本发明化合物显示出对PI3K δ和γ同工酶两者的有效抑制，对PI3K α未显示抑制活性，对PI3K β仅显示出低抑制活性(表5)。
这些效果转变为对由过氧化氢或MCP-1刺激细胞诱导的Akt磷酸化的有效抑制。检测到与式(I)化合物一起孵育对细胞存活率没有影响(表6)。此外，发现用本文公开的式(I)化合物处理细胞，抑制U937细胞产生ROS和抑制cytostim攻击的PBMC产生细胞因子(表7)。
值得注意的是，式(I)化合物可能的代谢产物，即相应的醇 - 化合物(Ia)，对PI3Kδ和γ同工酶两者的抑制活性显著低于式(I)化合物(表6)。因此，对于U937细胞产生ROS和cytostim攻击的PBMC产生细胞因子而言，式(Ia)化合物是活性显著低于式(I)化合物的抑制剂(表7)。
表5：现有技术化合物与化合物(I)的PI3K同工酶抑制活性的比较。
1) WO 2012/052753中公开的现有技术化合物；2) WO 2011/048111中公开的现有技术化合物；NT未测试。
表6：化合物(I)和(Ia)对PI3K同工酶的抑制活性；对细胞中诱导的Akt磷酸化和对细胞存活率的抑制
a) 对诱导的Akt磷酸化的抑制；b) –ve指示于10 µg/mL下数值<30%抑制；ND：未进行
表7：式(I)和(Ia)化合物对U937细胞产生ROS和PBMC释放细胞因子的影响
a) ROS：反应性氧物质。
用化合物(I)治疗对小鼠和大鼠体内LPS诱导的气道嗜中性粒细胞的影响分别报道于表8和表9中。发现治疗对这两个物种的LPS诱导的嗜中性粒细胞皆产生剂量依赖性抑制。此外，发现治疗对细胞积聚的抑制效果显示出作用时间长。
表8：化合物(I)治疗对小鼠体内LPS诱导的气道嗜中性粒细胞的影响
N = 8只动物/组
表9：用化合物(I)治疗对大鼠体内LPS诱导的气道嗜中性粒细胞的影响。
N = 8只动物/组
用化合物(I)治疗对小鼠体内过敏原攻击诱导的气道嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的影响报道于表10中。发现用本文公开的化合物治疗小鼠对过敏原攻击后支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞积聚皆产生剂量依赖性抑制。
表10：用化合物(I)治疗对卵清蛋白敏化小鼠体内卵清蛋白诱导的气道嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的影响。
N = 8只动物/组
还研究了用化合物(I)或化合物A治疗对小鼠暴露于多聚-I:C后在BALF中巨噬细胞和嗜中性粒细胞积聚的影响。在该直接比较中，发现用化合物(I)或化合物A治疗对BALF中多聚-I:C诱导的巨噬细胞和嗜中性粒细胞积聚产生了剂量依赖性抑制(表11)。值得注意的是，化合物(I)显示出功效显著高于化合物A，并且以图显示了对于嗜中性粒细胞的这一数据(图1a和1b)。
表11：化合物(I)或化合物A治疗对小鼠气道中多聚-I:C诱导的细胞积聚的影响。
a) 细胞数的数据以平均值 ± SEM显示；N = 5只动物/组
表12：用化合物(I) ± 丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)治疗对鼠BALF中香烟烟雾(CS)诱导的细胞积聚的影响。
N = 5只动物/组；a) FP = 丙酸氟替卡松，剂量为50 μg/mL；b) 细胞数的数据以平均值 ± SEM显示。
也测定了用化合物(I)治疗对暴露于香烟烟雾后BALF中巨噬细胞和嗜中性粒细胞积聚影响(表12)。用于该项研究的香烟烟雾模型据报道是皮质类固醇难治***[To, Y.等人, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2010, 182:897-904；Medicherla, S.等人,J. Pharmacol. Exp. Ther.2008, 324:921-9]，数据揭示：如预期的，***(dexamethasone) (0.3-10 mg/kg, p.o.)无活性。用化合物(I)治疗对BALF嗜中性粒细胞以及对活化的肺泡巨噬细胞数的影响证明它作为单一疗法施用时具有抗炎活性。此外，当化合物(I)以作为单一疗法无任何显著影响的剂量与丙酸氟替卡松共同施用时，检测到抗炎活性的显著增强。在同时进行的一项研究中，评价了用化合物A治疗暴露于香烟烟雾的小鼠的影响。将这些数据与以上显示的化合物(I)数据比较，表明对于鼠BALF中香烟烟雾诱导的细胞积聚而言，化合物(I)是比化合物A更有效的抑制剂(图2a和2b)。
香烟烟雾暴露还提高支气管肺泡灌洗液中炎性生物标记CXCL1、MCP1、TNFα、IL17、骨桥蛋白和丙二醛的浓度。用化合物(I)治疗以剂依赖性方式降低各种生物标记的浓度。此外，用化合物(I)和丙酸氟替卡松联合治疗，与单独用化合物(I)治疗所达到的效果相比，显示出更大地降低生物标记的浓度(表13)。
表13：用化合物(I)±丙酸氟替卡松治疗对鼠BALF中生物标记的影响。
N = 5只动物/组；1) 相对于香烟的抑制百分率, 2): 丙酸氟替卡松(0.5 mg/mL)；3) 这些数据为µM值；是扣除空气对照值后的烟雾对照
概括而言，本发明化合物是PI3K δ和γ同工酶两者的有效抑制剂。体外概况转变为体内广谱抗炎表型。在这种环境下，本文公开的化合物对气道中多聚I:C诱导的细胞积聚的抑制作用是显著的。还尤其引人注目的是，与PI3K δ的选择性抑制剂不同，单独用本文公开的化合物(I)治疗，导致显著抑制香烟烟雾诱发的气道炎症，并且当它与皮质类固醇丙酸氟替卡松在单独用丙酸氟替卡松治疗无效果的条件下共同施用时，这些作用在较低剂量下发生。
实施例15 –包含化合物(I)的药物制剂
可以如下配制用于干粉吸入器的化合物(I)的组合物：
化合物(I)用适宜方法如气流粉碎机微粉化，达到D50值为约2 µm，然后与或不与硬脂酸镁混合进行配制。将混合物填充到通过干粉吸入器吸入用的单位剂量容器(例如胶囊、泡罩)。给出的制剂的实例含有0-1%硬脂酸镁，作为一个实例，填充重量为25 mg/剂，剂量强度范围为1-1000微克(mcg)/剂。也可以使用不同强度、不同量的硬脂酸镁和不同填充重量/剂。
表14：含有0%硬脂酸镁的制剂
表15：含有0.5%硬脂酸镁的制剂
表16：含有1%硬脂酸镁的制剂
在说明书和随后的权利要求书全文中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”及变体例如“含有”和“包括”应理解为意指包括所述的整数、步骤、整数组或步骤组，但不排除任何其他整数、步骤、整数组或步骤组。
本文引用的所有专利和专利申请通过引用以其整体并入本文。

Claims (18)

1.式(I)化合物
或其药学上可接受的盐，包括其所有互变异构体及同位素衍生物。
2.根据权利要求1的式(I)化合物，呈其3型结晶多晶型物的形式并具有图12所示的XRPD图。
3.一种药物组合物，其包含根据权利要求1或2的化合物与一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体的组合。
4.根据权利要求3的药物组合物，其进一步包含第二种或另外的活性成分。
5.一种组合产品，其包含：
(A) 根据权利要求1或2的式(I)化合物；和
(B) 另外的活性成分，
其中组分(A)和(B)各自与药学上可接受的稀释剂或载体混合配制。
6.根据权利要求4或5的组合产品，所述另外的活性成分选自皮质类固醇、β激动剂、黄嘌呤、毒蕈碱拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂和p38 MAP激酶抑制剂。
7.根据权利要求1或2的式(I)化合物或根据权利要求3或4的药物组合物或根据权利要求5或6的组合产品在制备用于治疗或预防病症的药物中的用途，所述病症选自：COPD、哮喘、囊性纤维化、结节病、特发性肺纤维化、鼻炎、鼻窦炎和任一上述病症的病毒诱导性恶化、呼吸道病毒感染及其并发症、结膜炎、过敏性皮炎、接触性皮炎、银屑病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎或骨关节炎继发的关节发炎、类风湿性关节炎、胰腺炎、恶病质、肿瘤生长和转移。
8.根据权利要求7的用途，其中所述COPD是慢性支气管炎和肺气肿。
9.根据权利要求7的用途，其中所述哮喘是小儿哮喘。
10.根据权利要求7的用途，其中所述鼻炎是过敏性鼻炎。
11.根据权利要求7的用途，其中所述结膜炎是过敏性结膜炎。
12.根据权利要求7的用途，其中所述肿瘤为非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌和恶性黑素瘤。
13.式(II)的中间体：
或其受保护衍生物，所述受保护衍生物是指其中酚被甲硅烷基保护，以及其中LG1表示离去基团。
14.制备根据权利要求1的式(I)化合物的方法，其包括：
使其中LG1表示离去基团的式(II)化合物
或其受保护衍生物，所述受保护衍生物是指其中酚被甲硅烷基保护，与式(III)化合物：
(III)
在适合提供式(I)化合物或其受保护衍生物的条件下反应，必要时，使受保护化合物脱保护，得到式(I)化合物。
15.制备根据权利要求2的式(I)化合物的方法，其包括：
使其中LG1表示离去基团的式(II)化合物
或其受保护衍生物，所述受保护衍生物是指其中酚被甲硅烷基保护，与式(III)化合物：
(III)
在适合提供式(I)化合物或其受保护衍生物的条件下反应，必要时，使受保护化合物脱保护，得到式(I)化合物，并且
将无定形化合物(I)在二氯甲烷中制浆，得到其3型结晶多晶型物。
16.式(Ia)化合物
或其药学上可接受的盐，包括其所有互变异构体及同位素衍生物。
17.式(I)化合物：
，
呈其2型结晶多晶型物的形式，具有基本如图5所示的XRPD图。
18.式(I)化合物：
，
呈其2型结晶多晶型物的形式，以0.2度，2-θ值表达，具有含有以下峰的XRPD图：在9.7、12.2、14.1和 14.3的峰，并且任选地包含一个或多个选自8.2、9.0、9.2、15.0、16.4、18.0、18.5、19.0、19.6、21.8、22.3、22.5、24.3、24.5、24.8、25.1和25.8的峰。
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