TW201343623A - 使氧化還原輔因子經酶催化再生之方法 - Google Patents
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Abstract
一種使氧化還原輔因子NAD+/NADH及NADP+/NADPH在一鍋反應(one-pot reaction)中經酶催化再生之方法,其中由於至少兩個其他經酶催化之氧化還原反應在相同反應批次(產物形成反應)中進行,該兩種氧化還原輔因子之一係以其還原形式積聚,且另一者係分別地以其氧化形式積聚,該方法之特徵在於:a)在經還原之輔因子再被轉化為其原始之氧化形式的再生反應中,氧或通式R1C(O)COOH之化合物被還原,及b)在經氧化之輔因子再被轉化為其原始之還原形式的再生反應中,通式R2CH(OH)R3之化合物被氧化,該等化合物中之R1、R2和R3具有不同意義。
Description
本發明關於用於將氧化還原輔因子NAD+/NADH及NADP+/NADPH在一鍋反應(one-pot reaction)中經酶催化再生之方法,其中由於至少兩個其他經酶催化之氧化還原反應在相同反應批次(即產物形成反應)中進行,該兩種氧化還原輔因子之一係以其還原形式積聚,且另一者係分別地以其氧化形式積聚。
酶催化之氧化還原反應係用於工業操作中,例如用於製造手性醇、α-胺基酸及α-羥基酸。大部分工業氧化還原反應中所採用的酶係使用諸如NADH或NADPH之輔因子。在經酶催化之氧化還原反應之中,其中氧化還原輔因子係藉由原位輔因子再生系統恢復的反應特別重要。其原因為在此反應中僅使用催化量的昂貴輔因子(NAD(P)+/NAD(P)H)是可行的。合適之脫氫酶及其他酶之可利用性導致發展出各種輔因子再生系統。
迄今所描述之再生系統可被歸類為:酶聯、受質聯、
活體內(在存活有機體中之天然輔因子再生系統)、光化學、化學或電-酶催化性。此處所描述之方法係關於酶聯再生系統。酶聯系統之優點為高選擇性、製造各種產物之適用性及輔因子之高復用率(總周轉數,TTN)。
在90年代中期,第一次採用規模為噸之使用酶聯輔因子再生系統的工業方法。在該方法中係使用來自博伊丁氏假絲酵母(Candida boidinii)之甲酸脫氫酶。而已知之工業方法通常使用一種氧化還原酶來合成產物,並使用另一種酶來再生輔因子。
其中涉及形成產物及二種用於再生輔因子之酶系統(同時或依次)的二或多個經酶催化之氧化還原反應係在一個反應批次中進行,而不需分離出中間產物的方法必須與之區分。最近,這類經酶催化之級聯反應-此處稱為一鍋反應(one-pot reaction)-已引起重大關注,因為其可有效地降低營運成本、操作時間及環境影響。此外,經酶催化之氧化還原級聯反應可促進不容易藉由常規化學方法實現的轉化。
然而,在一鍋反應中同時執行幾個反應(氧化和還原反應),並進行輔因子再生是種挑戰,因為個別轉化通常需要高度分岐之反應條件。到目前為止,已執行之包含氧化和還原反應與相關聯之輔因子再生系統的單一容器試驗僅非常少數。
文獻Advanced Synth. Catal., 2008, Volume 351, Issue 9, p. 1303-1311中已描述使用7α-羥基類固醇脫氫酶
(HSDH)、7β-HSDH和12α-HSDH的一鍋反應實驗。該方法中係在膽酸的位置7和12處進行氧化反應(區域選擇性和立體選擇性二者),然後在位置7處進行區域選擇性和立體選擇性還原。該方法中係使用乳酸脫氫酶(NAD+-依賴型)及葡萄糖脫氫酶(NADP+-依賴型)來作為輔因子再生系統。使用丙酮酸和葡萄糖作為輔受質。雖然此方法最初係針對真正的一鍋反應,但結束時氧化和還原反應係分開進行。這樣做時,氧化和還原步驟之分割係在所謂的“茶袋”反應器或在膜反應器中發生。為了避免因NADPH-葡萄糖脫氫酶之低輔因子選擇性而產生副產物,該分割是必要的。然而,在一鍋反應中,葡萄糖脫氫酶-NADP+亦部分轉化成NAD+,這阻礙了氧化反應。在該描述之方法中,僅使用12.5mM(~0,5%)之受質膽酸,這使得從生態的角度來看,該方法不令人感興趣。
再者,文獻J. Am. Chem. Soc., 2008, Volume 130, p. 13969-13972中已描述使用單一容器系統,經由作為中間產物之前手性酮來將二級醇之外消旋物去外消旋化的嘗試。將二級醇去外消旋化可經由兩種具有不同輔因子特異性的醇脫氫酶(S-和R-特異性)達成。在該系統中,NADP係藉由NADPH氧化酶製造過氧化氫再生,而NADH係藉由甲酸脫氫酶再生。甲酸和氧係作為輔受質(cosubstrates)。在該系統中係使用4種酶,但不區分氧化和還原步驟。該方法之缺點為使用非常低之0.2-0.5%的受質濃度,這並不適合工業用途。
另一種單一容器系統已描述於WO 2009/121785 A2中。該方法中係將光學活性二級醇之立體異構物氧化成酮,然後再還原成對應之光對映體,其中係使用具有相反的立體選擇性和兩種不同的輔因子特異性之醇脫氫酶。該輔因子係藉由所謂的“氫負離子轉移系統”,僅使用一種額外的酶再生。為了再生輔因子,使用各種酶,諸如甲酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、乳酸脫氫酶。該方法之缺點為使用低濃度之受質。
而已知之涉及輔因子再生系統的經酶催化之單一容器方法的缺點為受質之濃度非常低,這對工業方法而言不夠有效。
相反地,現已知許多其中使用輔因子再生系統之個別的經酶催化之氧化還原反應。該實驗之描述中係使用整個微生物、細胞裂解物或分離的酶並同時進行NAD(P)H或NAD(P)+再生。已知之用於個別氧化還原反應的經酶催化之輔因子再生系統包含,例如用於NADH之甲酸脫氫酶(使用甲酸作為輔受質)、用於NADH之來自假單胞菌屬的醇脫氫酶(使用2-丙醇作為輔受質)、用於NADH和NADPH之氫化酶(使用H2作為輔受質)、用於NADPH之來自腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(使用葡萄糖-6-磷酸作為輔受質)、用於NADH和NADPH之葡萄糖脫氫酶(使用葡萄糖作為輔助受質)、用於NADH之NADH氧化酶(使用O2作為輔受質)及用於NADH之亞磷酸脫氫酶(使用亞磷酸作為輔
受質)。
這類個別氧化還原反應之用途的一種實例為從適當之前手性酮基化合物製造手性羥基化合物。該方法中,輔因子係藉由額外的酶再生。這些方法的共通之處在於其構成分離的還原反應及再生NAD(P)H(參見,例如EP 1 152 054)。
EP 1 731 618;WO 2007/118644;Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011 Volume 90 p.127-135中已有關於使用羥基類固醇脫氫酶加輔因子再生系統之酶催化方法的描述,此方法係在較高之受質濃度(約>1%)下進行。該方法中,輔因子NAD(P)H或NAD(P)係藉由不同的酶再生,諸如,例如乳酸脫氫酶(使用丙酮酸作為輔受質)、來自布氏熱厭氧菌(T.brockii)之醇脫氫酶(使用異丙醇作為輔受質)、來自短乳桿菌(L.brevis)、小乳桿菌(L.minor)、肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、嗜熱厭氧菌乙醇菌(T.ethanolicus)、拜氏梭狀芽孢桿菌(Clostridium beijerinckii)之醇脫氫酶。然而,這些已知之方法僅與用於氧化羥基化合物或還原側氧基化合物之分離的單一反應有關。
Can.J.Chem.Eng.1992,Volume 70,p.306-312中已有關於使用蘋果酸脫氫酶(“蘋果酸酶”)之用於NADH的輔因子再生系統的描述。在該刊物中,此系統係用於藉由丙胺酸脫氫酶將丙酮酸進行還原性胺化。在輔因子再生期間出現之丙酮酸隨後被用於產物形成反應中。
在WO 2004/022764中同樣描述藉由蘋果酸脫氫酶再生NADH。與先前描述之刊物不同,在蘋果酸之氧化脫羧期間出現的丙酮酸並未被進一步使用。
FEBS J.,2005,Volume 272,p.3816-3827中已描述其中涉及輔因子再生系統之經酶催化的D-木糖還原成木糖醇的實例。來自假單胞菌之NADPH依賴性亞磷酸脫氫酶的突變體被用來作為輔因子再生反應之酶。此亦為用於形成產物之單一反應。
Organic Letters,2003,Volume 5,p.3649-3650;US 7,163,815;Biochem.Eng.J.,2008,Volume 39(2)p.319-327;EP 1 285 962中已描述經酶催化之製造富含手性對映體的有機化合物(例如醇或胺基酸)之進一步實例。在該系統中係使用來自短乳桿菌或舊金山乳桿菌(Lactobacillus sanfranciscensis)之NAD(P)H依賴性氧化酶作為輔因子再生反應之酶。同樣地,該試驗構成用於形成產物之單一反應。
WO 2011/000693中描述17β-羥基類固醇脫氫酶和能夠在4-雄甾烯-3,17二酮之位置17處執行氧化還原反應的方法。同樣地,此為單獨之還原反應。上文中提及之個別進行的氧化或還原反應缺乏一鍋反應之優點,諸如,例如由節省時間和材料造成之成本效益,以及因為酶催化之級聯反應所造成的較佳更換率。
本發明之目的係提供用於再生氧化還原輔因子NAD+/NADH和/或,例如NADP+/NADPH的方法,以藉此以經濟方式在一個反應批次中進行二或更多個經酶催化的氧化還原反應。
根據本發明,該目的係以開始時提及之那類方法實現,其中係提供在一鍋反應中經酶催化再生氧化還原輔因子NAD+/NADH和/或,例如NADP+/NADPH之方法,其中由於至少兩個其他經酶催化之氧化還原反應在相同反應批次(產物形成反應)中進行,該兩種氧化還原輔因子之一係以其還原形式積聚,且另一者係分別地以其氧化形式積聚,該方法之特徵在於:
a)在經還原之輔因子再被轉化為其原始之氧化形式的再生反應中,氧或通式I之化合物被還原,
其中R1代表直鏈或支鏈(C1-C4)烷基或(C1-C4)羧基烷基,及b)在經氧化之輔因子再被轉化為其原始之還原形式的再生反應中,(C4-C8)環烷醇或通式Ⅱ之化合物被氧化,
其中R2和R3獨立選自下列群組:H、(C1-C6)烷基(其中烷基為直鏈或支鏈)、(C1-C6)烯基(其中烯基為直鏈或支鏈且包含一至三個雙鍵)、芳基(尤其是C6-C12芳基)、羧基及(C1-C4)羧基烷基,尤其是亦選自環烷基,例如C3-C8環烷基。
根據本發明所提供之方法在本文中亦稱為根據本發明的方法釶(本發明的方法)。
於另一觀點中,本發明提供根據本發明之用於經酶催化氧化還原輔因子NAD+/NADH和/或,例如NADP+/NADPH再生之方法,其中由於至少兩個其他經酶催化之氧化還原反應在相同反應批次(=產物形成反應)中進行,該兩種氧化還原輔因子之一係以其還原形式積聚,且另一者係分別地以其氧化形式積聚,該方法之特徵在於:a)在該經氧化之輔因子再生期間,通式I之化合物被還原,
其中R1代表經取代或未經取代之C1-C4烷基,及b)在該經還原之輔因子再生期間,通式Ⅱ之化合物被氧化,
其中R2和R3彼此獨立地選自下列群組:
1)-H,2)-(C1-C6)烷基,其中烷基為直鏈或支鏈,3)-(C1-C6)烯基,其中烯基為直鏈或支鏈且選擇性地包含達三個雙鍵,4)-環烷基,尤其是C3-C8環烷基,5)-芳基,尤其是C6-C12芳基,6)-(C1-C4)羧基烷基,若該通式I之化合物為丙酮酸,亦選擇性地為羧基。
於進一步之觀點中,於根據本發明之方法中,R2和R3彼此獨立地選自下列群組:H、(C1-C6)烷基(其中烷基為直鏈或支鏈)、(C1-C6)烯基(其中烯基為直鏈或支鏈且包含一至三個雙鍵)、芳基(尤其是C6-C12芳基)、羧基及(C1-C4)羧基烷基。
相較於先前技藝,根據本發明之方法能顯著改良其中同時經酶催化地氧化和還原該化合物之方法,因為該方法能在一個反應批次中運行所需之氧化和還原反應,以及用於輔因子再生之相關聯的反應,並同時使用明顯高於先前技藝所使用之受質濃度。
於根據本發明的方法中係使用輔因子NADH和/或NADPH。其中,NAD+代表煙醯胺腺嘌呤二核苷酸之氧化形式,且NADH代表還原形式,而NADP+代表磷酸煙醯胺腺嘌呤二核苷酸之氧化形式,而NADPH代表還原形式。
非為輔因子再生反應之一部分,且在根據本發明之方
法中參與形成產物之經酶催化的氧化還原反應在此稱為“氧化反應”及“還原反應”。“氧化反應”及“還原反應”摘要於術語“產物形成反應”中。於各情況中,在根據本發明之方法中的用於形成產物之反應包含至少一種氧化反應及至少一種還原反應。
若使用NAD+作為氧化反應之輔因子,則NADPH為還原反應之輔因子。若使用NADP+作為氧化反應之輔因子,則NADH為還原反應之輔因子。
在根據本發明之方法中,氧化反應和還原反應可以按時間先後並行進行或按時間先後連續進行,較佳為在相同之反應批次中按時間先後並行進行。
用於形成產物之化合物在本文中稱為受質。在輔因子再生過程中反應之化合物在本文中稱為輔受質。
在根據本發明之方法中可使用一種受質及數種受質。這樣做時,還原和/或氧化反應可在同一受質(分子骨架)上發生,亦可在不同的受質上發生,較佳為在同一受質上發生。此外,於根據本發明之方法中,還原和/或氧化反應可在相同或不同的官能團上發生。
根據本發明之方法適合用於多個反應,例如經由氧化成對應之酮和隨後還原成相反之立體特異性羥基化合物來將立體異構型羥基化合物的結構反轉。
此文中,“一鍋反應”一詞係指其中有二或多種參與形成產物之經酶催化的氧化還原反應及二種用於再生輔因子之酶系統在一個反應批次中進行,但未分離出中間產物
之方法。
此處提及之酸或酸之鹽包含各自之未提及的術語。同樣地,此處提及之酸(尤其是膽汁酸)包括所有由其衍生之酯。此外,(部分)具有保護基之化合物係包含在提及之相關物質中。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於該氧化反應和還原反應係按時間先後並行進行。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於該氧化反應和還原反應二者係在相同的分子骨架上發生。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於使用丙酮酸(輔受質)作為式I化合物(2-含氧酸)以藉由乳酸脫氫酶經還原成乳酸,這意味著在該經還原之輔因子再被轉化為其原始之氧化形式的再生反應中,丙酮酸係藉由乳酸脫氫酶經還原成乳酸。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於使用2-丙醇(異丙醇,IPA)(輔受質)作為式Ⅱ化合物(二級醇),其係藉由醇脫氫酶氧化成丙酮,這意味著在該經氧化之輔因子再被轉化為其原始之還原形式的再生反應中,2-丙醇藉由醇脫氫酶經氧化成丙酮。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於使用氧,該氧係藉由NADH氧化酶而被還原。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於使用蘋果酸(輔受質)作為二級醇,其藉由草醯醋酸
脫羧化蘋果酸脫氫酶(“蘋果酸酶”)經氧化成丙酮酸和CO2,例如在該經氧化之輔因子再被轉化為其原始之還原形式的再生反應中,蘋果酸係藉由蘋果酸脫氫酶而經氧化成丙酮酸及CO2。
於此實施例中,該新生之丙酮酸係在不用來形成產物,但構成第二輔因子再生反應之進一步的氧化還原反應中反應。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於其係用於在相同的反應批次中對通式Ⅲ之化合物分別進行至少一種氧化反應及至少一種還原反應,
其中R4代表氫、甲基、羥基或側氧基,R5代表氫、羥基、側氧基或甲基,R6代表氫或羥基,R7代表氫、-COR13,其中R13為未經取代或經羥基取代之C1-C4烷基、或經取代(尤其是經羥基取代)或未經取代之C1-C4羧基烷基,或者R6和R7一起表示側氧基,R8代表氫、甲基、羥基或側氧基,R9代表氫、甲基、羥基或側氧基,
R10代表氫、甲基或鹵素,R11代表氫、甲基、羥基、側氧基或鹵素,且R12代表氫、羥基、側氧基或甲基,其中下列結構單元
代表苯環或包含6個碳原子及0、1或2個C-C雙鍵的環;其中在該參與形成產物之還原反應的反應批次中,該受質之濃度較佳為<5%(重量/體積)。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於發生式Ⅶ之脫氫表雄固酮(dehydroepiandrosterone)(DHEA)轉化
成式Ⅷ之睾酮(testosterone)的經酶催化之轉化反應。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於使用兩種相反立體特異性之羥化類固醇脫氫酶使式Ⅳ之3α,7α-二羥基-5β-膽烷酸(鵝去氧膽酸,CDC)經酶催
化差向異構化
藉由氧化反應轉化成式V之酮基石膽酸(KLC)
且隨後藉由還原反應轉化成式Ⅵ之3α,7β-二羥基-5β-膽烷酸(熊去氧膽酸,UDC)
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於其,例如使用3種立體特異性之羥化類固醇脫氫酶(其中2種具有相反的立體特異性)使式Ⅸ之3α,7α,12α-三羥基-5β-膽烷酸(膽烷酸)經酶催化差向異構化,
由:A)氧化反應以獲得式X之3α,7α-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸(12-側氧基-CDC)
其進一步經反應以獲得式XI之3α-羥基-7,12-二側氧基-5β-膽烷酸(12側氧基-KLC)
隨後經還原成式XⅡ之立體異構性羥基化合物3α,7β-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸(12-酮基-熊去氧膽烷酸)
或B)氧化反應以獲得式XⅢ之3α,12α-二羥基-7-側氧基-5β-膽烷酸,
隨後經酶催化之氧化反應以獲得式XI之3α-羥基-7,12-二側氧基-5β-膽烷酸(12側氧基-KLC),且再隨後經還原反應以獲得式XⅡ之立體異構性羥基化合物3α,7β-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸(12-酮基-熊去氧膽烷酸),或C)氧化反應以獲得式XⅢ之3α,12α-二羥基-7-側氧基-5β-膽烷酸,隨後經酶催化之還原反應以獲得式XⅣ之3α,7β,12α-三羥基-5β-膽烷酸,
且再隨後經氧化反應以獲得式XⅡ之立體異構性羥基化合物3α,7β-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸(12-酮基-熊去氧膽烷酸)。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於使用C5或C6糖作為受質,例如該方法為使C5或C6糖類異構化之方法。
於本發明之較佳實施例中,根據本發明之方法的特徵在於葡萄糖之異構化係經由將葡萄糖還原成山梨醇,隨後氧化成果糖來進行,例如該方法係經由將葡萄糖還原成山梨醇,接著氧化成果糖來進行。
較佳地,根據本發明之方法係在水性體系中進行,其中該用於氧化和還原反應中之部分受質以在懸浮液中之未溶解狀態和/或以第二液相之形式提供是可行的。
於一特定實施例中,根據本發明之方法的特徵在於該參與形成產物之氧化反應中所使用之受質在反應批次中的濃度為至少5%(重量/體積),更佳為7%(重量/體積)和高於7%,特佳為9%(重量/體積)和高於9%,例如5%(重量/體積)至20%(重量/體積),諸如5%(重量/體積)至15%(重量/體積),例如5%(重量/體積)至12%(重量/體積),諸如5%(重量/體積)至10%(重
量/體積)。
於特定之實施例中,根據本發明之方法的特徵在於該產物形成反應所達到之整體更替率為≧70%,尤其是≧90%,例如≧70%至100%,諸如≧70%至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
於根據本發明之方法中可在水性系統中添加緩衝劑。合適之緩衝劑為,例如pH值介於5至10之間的磷酸鉀、Tris-HCl和甘胺酸,較佳為6至9。此外,或者可將用於穩定酶的離子(諸如Mg2+)或其它添加劑(諸如甘油)添加到系統中。於根據本發明之方法中,所添加之輔因子NAD(P)+和NAD(P)H的濃度通常介於0.001mM和10mM之間,較佳為介於0.01mM和1mM之間。
根據所使用之酶,根據本發明之方法可在10℃至70℃的溫度範圍內進行,較佳為20℃至45℃。
據理解,羥基類固醇脫氫酶(HSDH)為催化類固醇骨架上之羥基氧化成對應之酮基,或相反地,酮基還原成對應之羥基的酶。
可用於羥基類固醇上之氧化還原反應的適當之羥基類固醇脫氫酶有,例如3α-HSDH、3β-HSDH、7α-HSDH、7β-HSDH或17β-HSDH。
具7α-HSDH活性之合適的酶可從,例如梭狀芽孢桿菌(不同梭狀芽孢桿菌(Clostridium absonum)、污泥梭狀芽孢桿菌(Clostridium sordelii))、大腸桿菌或脆弱
桿菌(Bacteroides fragilis)獲得。
具7β-HSDH活性之合適的酶可從例如瘤胃球菌屬(Ruminococcus sp.)或不同梭狀芽孢桿菌(Clostridium absonum)獲得。
合適之乳酸脫氫酶可從例如穴兔(Oryctolagus cuniculus)獲得。
合適之醇脫氫酶可從例如高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefir)獲得。
合適之木糖還原酶可從例如熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)獲得。
合適之山梨糖醇脫氫酶可從例如綿羊肝、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蘋果(Malus domestica)獲得。
合適之NADH氧化酶可從例如腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、變形鏈球菌(Streptococcus mutans)、胺基戊酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium aminovalericum)獲得。
於根據本發明之方法中,較佳地,該酶係以過度表達於大腸桿菌中之重組蛋白質形式使用,其中該對應之細胞裂解物宜不經任何進一步純化繼續使用。於前述情況中,酶單位1U對應於每分鐘反應1微莫耳受質所需的酶量。
第1圖顯示出藉由使用2-丙醇和丙酮酸之輔因子再生系統,鵝去氧膽酸經由中間產物3α-羥基-7側氧基-5β-膽烷
酸被轉化成熊去氧膽酸之差向異構化反應圖解。
第2圖顯示出藉由使用蘋果酸和丙酮酸之輔因子再生系統,鵝去氧膽酸經由中間產物3α-羥基-7側氧基-5β-膽烷酸被轉化成熊去氧膽酸之差向異構化反應圖解。
第3圖顯示出藉由使用2-丙醇和氧之輔因子再生系統,鵝去氧膽酸經由中間產物3α-羥基-7側氧基-5β-膽烷酸被轉化成熊去氧膽酸之差向異構化反應圖解。
第4圖顯示出藉由使用2-丙醇和丙酮酸之輔因子再生系統,葡萄糖被轉化為果糖之差向異構化反應圖解。
第5圖顯示出藉由使用2-丙醇和氧之輔因子再生系統,葡萄糖被轉化為果糖之差向異構化反應圖解。
第6圖顯示出藉由使用2-丙醇和丙酮酸之輔因子再生系統,膽烷酸經由中間產物3α,7α-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸和3α-羥基-7,12-二側氧基-5β-膽烷酸被轉化為3α,7β-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸之差向異構化反應圖解。
第7圖顯示出藉由使用2-丙醇和氧之輔因子再生系統,膽烷酸經由中間產物3α,7α-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸和3α-羥基-7,12-二側氧基-5β-膽烷酸被轉化為3α,7β-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸之差向異構化反應圖解。
第8圖和第9圖顯示出藉由使用2-丙醇、丙酮酸和氧之輔因子再生系統,膽烷酸經由中間產物3α,7α-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸和3α-羥基-7,12-二側氧基-5β-膽烷酸被轉化為3α,7β-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸之差向異構
化反應圖解。
第10圖顯示出經由不同的中間產物和輔因子再生系統,膽烷酸被轉化為3α,7β-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸之可能的差向異構化反應圖解。在NAD+之再生系統中可替換使用乳酸脫氫酶(以丙酮酸作為受質)和NADH氧化酶(以氧作為受質)。在NADPH之再生系統中係使用醇脫氫酶(以異丙醇作為受質)。
第11圖顯示出藉由使用2-丙醇和2-戊醇(在每一種情況中均使用醇脫氫酶)以及丙酮酸(乳酸脫氫酶)和氧(NADH氧化酶)之輔因子再生系統,鵝去氧膽酸經由中間產物3α-羥基-7側氧基-5β-膽烷酸(7-酮基石膽酸=7K-LCA=KLC)被轉化成熊去氧膽酸之差向異構化反應圖解。
圖形中係使用下列縮寫:BsSDH 來自枯草芽孢桿菌之山梨醇脫氫酶
CA=3α,7α,12α-三羥基-5β-膽烷酸
7β-CA=3α,7β,12α-三羥基-5β-膽烷酸
Caoxo 胺基戊酸梭狀芽孢桿菌NADH氧化酶
CDC,CDCA 3α,7α-二羥基-5β-膽烷酸
CtXR 熱帶假絲酵母木糖還原酶
7α-HSDH 7α-羥基類固醇脫氫酶
7β-HSDH 7β-羥基類固醇脫氫酶
12α-HSDH=12α-羥基類固醇脫氫酶
KLC 3α-羥基-7-側氧基-5β-膽烷酸
7K-LCA=3α-羥基-7-側氧基-5β-膽烷酸
LacDH 乳酸脫氫酶NAD(H)-依賴性
LkADH 高加索酸奶乳桿菌醇脫氫酶NADP(H)-依賴性
Lmoxid=腸膜明串珠菌NADH-氧化酶
Ma1DH 大腸桿菌蘋果酸脫氫酶NADP(H)-依賴性
7oxo-CA=3α,12α-二羥基-7-側氧基-5β-膽烷酸
12oxo-CDC=3α,7α-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸
12oxo-KLC=3α-羥基-7,12-二側氧基-5β-膽烷酸
12oxo-UDC=3α,7β-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸
SISDH 綿羊肝山梨醇脫氫酶
SmOxo 變形鏈球菌NADH氧化酶
UDC.UDCA 3α,7β-二羥基-5β-膽烷酸
在下列實例中,所有的溫度數據係以攝氏溫度(℃)表示。使用下列縮寫:EtOAc 醋酸乙酯
h 小時
IPA 異丙醇(2-丙醇)
MeOH 甲醇
Rt 室溫
0.5毫升之反應物中含有50毫克鵝去氧膽酸、12U之來自大腸桿菌的重組7α-羥基類固醇脫氫酶、6U之來自扭鏈瘤胃球菌(Ruminococcus torques)的重組7β-羥基類固醇脫氫酶以及0.5mM NAD+和0.3mM NADPH。使用6U之重組乳酸脫氫酶和350mM之丙酮酸鈉以用於再生NAD+。使用6U之來自高加索酸奶乳桿菌的重組醇脫氫酶和最初為2.4%之IPA(重量/體積)以用於再生NADPH。在25℃之水性磷酸鉀緩衝液(100mM,pH值=7.8)中進行反應,並一邊持續搖動(850rpm)。持續使用開放系統以促進丙酮蒸發並使反應轉移朝向熊去氧膽酸。6小時後追加1.6%(重量/體積)之IPA劑量,16小時後追加2.4%(重量/體積)之IPA,24小時後追加3.9%(重量/體積)之IPA且40小時後追加0.8%(重量/體積)之IPA。此外,24小時後添加20微升之的4-甲基-2-戊醇。46小時後加入200微升之2-戊醇及1.6%(重量/體積)之IPA。48小時後,在反應混合物中之所有膽汁酸中的熊去氧膽酸的比例為約97%。
0.5毫升之反應物中含有50毫克鵝去氧膽酸、20U之來自大腸桿菌的重組7α-羥基類固醇脫氫酶、20U之來自扭鏈瘤胃球菌的重組7β-羥基類固醇脫氫酶以及1mM NAD+和1mM NADPH。使用10U之重組乳酸脫氫酶以用於再生NAD+,並使用16.5mM丙酮酸鈉以用於起始反應。使用20U之來自大腸桿菌的重組蘋果酸脫氫酶和320mM之蘋果酸鈉以用於再生NADPH。在25℃之水性磷酸鉀緩衝液(100mM,pH值=7.8)中進行反應,並一邊持續搖動(850rpm)。持續使用開放系統被,以令新產生之CO2逸散。16小時和40小時後追加20U之7α-HSDH和10U之蘋果酸脫氫酶。20小時、24小時、44小時和48小時後追加10U之7β-HSDH。此外,40小時後追加10U之蘋果酸脫氫酶。72小時後,在反應混合物中之所有膽汁酸中的熊去氧膽酸的比例為約90%。
0.5毫升之反應物中含有50毫克鵝去氧膽酸、12U之來自大腸桿菌的重組7α-羥基類固醇脫氫酶、7.5U之
來自扭鏈瘤胃球菌的重組7β-羥基類固醇脫氫酶以及1mM NAD+和1mM NADPH。使用20U之來自胺基戊酸梭狀芽孢桿菌的重組NADH氧化酶以用於再生NAD+。使用5U之來自高加索酸奶乳桿菌的重組醇脫氫酶和最初為2%之IPA(重量/體積)以用於再生NADPH。在25℃之水性磷酸鉀緩衝液(100mM,pH值=6)中進行反應,並一邊持續搖動(850rpm)。持續使用開放系統以促進丙酮蒸發並使反應轉移朝向熊去氧膽酸。18小時、22小時、26小時和41小時後追加2%之IPA劑量,並在41小時和48小時後追加5%之IPA。24小時後追加20U之NADH氧化酶,且41小時後追加7.5U之7β-羥基類固醇脫氫酶以及5U之醇脫氫酶。48小時後,在反應混合物中之所有膽汁酸中的熊去氧膽酸的比例為約95-98%。
完成如實例1至3中所描述之反應後,以EtOAc萃取反應混合物。隨後,藉由蒸發除去溶劑。將蒸發殘質溶解於甲醇:乙腈:磷酸鈉緩衝液的混合物(pH=3,0.78克/升(40:30:37))中並藉由HPLC監測鵝去氧膽酸被轉化成熊去氧膽酸。於前述情況中,使用逆相分離柱(ZORBAX®Eclipse® XDB C18,流量0.8毫升/分鐘)及光折射檢測器(RID),安捷倫(Agilent)1260 Infinity®(此二者均來自安捷倫科技公司)。
0.5毫升反應物中含有50毫克/毫升之葡萄糖和6U/毫升之來自熱帶假絲酵母的重組木糖還原酶(過度表達於大腸桿菌BL21(DE3)中)及0.1mM NADP+。添加7% IPA和來自高加索酸奶乳桿菌之重組醇脫氫酶(過度表達於大腸桿菌BL21(DE3)中)以再生輔因子。該酶係以細胞裂解物之形式使用。使反應在40℃和pH=9(50mM Tris鹽酸緩衝液)之開放系統中進行24小時,並一邊搖動(900rpm)。開放系統造成丙酮被移除,這驅動反應朝向形成山梨糖醇。在開放系統中,水和IPA亦被蒸發,因此在6小時和21小時後追加他們的劑量。於前述情況中,每次均需將總體積調整為0.5毫升並將IPA之濃度調整為7%(體積/體積)。24小時後,將反應容器在真空下溫育在60℃中,以使酶失活並蒸除有機溶劑。冷卻至室溫後,加入最終濃度為5U/毫升之來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的重組山梨醇脫氫酶(過度表達於大腸桿菌BL21(DE3)中)、最終濃度為1mM之氯化鋅和最終濃度為0.1mM之NAD+。使用5U/毫升(最終濃度)之來自兔子肌肉乳酸脫氫酶(Sigma Aldrich公司)和300mM丙酮酸以再生輔因子。以水將反應物補足為0.5毫
升。將反應在封閉系統中,於40℃下進一步進行24小時,並一邊搖動(900rpm)。D-葡萄糖轉化成D-果糖的轉化率可達到>90%。
0.5毫升反應物中含有50毫克/毫升之葡萄糖、6U/毫升之來自熱帶假絲酵母的重組木糖還原酶(過度表達於大腸桿菌BL21(DE3)中)及0.1mM NADP+。添加7%(體積/體積)IPA和來自高加索酸奶乳桿菌之重組醇脫氫酶(過度表達於大腸桿菌BL21(DE3)中)以再生輔因子。該酶係以細胞裂解物之形式使用。將反應於40℃和pH=8(50mM Tris鹽酸緩衝液)之開放系統中進行24小時並一邊搖動(900rpm)。開放系統造成丙酮被移除,這驅動反應朝向形成山梨糖醇。於開放系統中,水和IPA亦被蒸發,因此在6小時和21小時後追加他們的劑量。於前述情況中,每次均需將總體積調整為0.5毫升並將IPA之濃度調整為7%(體積/體積)。24小時後,將反應容器在真空下溫育在60℃中以使酶失活並蒸發IPA以及任何已形成之丙酮。冷卻至室溫後,加入最終濃度為5U/毫升之來自枯草芽孢桿菌的重組D-山梨醇脫氫酶(過度表達於大腸桿菌BL21(DE3)中)及最終濃度為1mM之氯
化鈣和最終濃度為0.1mM之NAD+和NADH的混合物。使用10U/毫升(最終濃度)之來自腸膜明串珠菌之NADH氧化酶(過度表達於大腸桿菌BL21(DE3)中)以再生輔因子。該酶係以細胞裂解物之形式使用。以水將反應物補足為0.5毫升。該反應係在開放系統中,於40℃下進一步進行24小時並一邊持續搖動(900rpm),以確保從空氣中供給足夠的氧氣給NADH氧化酶。因此,在6小時後和21小時後以水將體積填充至0.5毫升。D-葡萄糖轉化成D-果糖的轉化率可達到約98%。
將反應物在65℃下溫育10分鐘以使酶失活,隨後進行離心。然後,將上清液在0.2μM PVDF過濾器上過濾並藉由配體交換HPLC(安捷倫科技公司)進行分析。這樣做時,經由Showa Denko K.K.之鉛塔(Shodex®Sugar SP0810)以80℃,流速為0.5毫升/分鐘的水(VWR International GmbH公司,HPLC級)分離糖和多元醇。藉由光折射檢測器(RID,安捷倫1260 Infinity®,安捷倫科技公司)之協助進行檢測。使用安捷倫科技公司之線內過濾器及作為前置柱之陰離子交換柱(Shodex®Axpak-WAG)、逆相柱(Shodex®Asahipak®ODP-50 6E)和Showa Denko K.K.之糖前置柱(SUGAR SP-G)。
0.5毫升之反應物中含有25毫克之膽烷酸、12.5U之來自遲緩埃格特菌(Eggertella lenta)或球形賴胺酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sphaericus)之重組12α-羥基類固醇脫氫酶、16U之來自大腸桿菌的重組7α-羥基類固醇脫氫酶、6U之來自扭鏈瘤胃球菌的重組7β-羥基類固醇脫氫酶以及1mM NAD+和1mM NADPH。使用12.5U之來自穴兔的重組乳酸脫氫酶(肌肉異形體)和200mM之丙酮酸鈉以用於再生NAD+。使用5U之來自高加索酸奶乳桿菌的重組醇脫氫酶和最初為2%之IPA(重量/體積)以用於再生NADPH。在25℃之水性磷酸鉀緩衝液(100mM,pH值=7.8)中進行反應並一邊持續搖動(850rpm)。進一步使用開放系統以令丙酮蒸發並使反應轉移朝向3α,7β-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸。18小時和24小時後追加2%之IPA(重量/體積)劑量。48小時後,所使用之膽烷酸有61%被反應成3α,7α-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸。
0.5毫升之反應物中含有25毫克之膽烷酸、12.5U之來自遲緩埃格特菌或球形賴胺酸芽孢桿菌之重組12α-羥基類固醇脫氫酶、16U之來自大腸桿菌的重組7α-羥基類固醇脫氫酶、6U之來自扭鏈瘤胃球菌的重組7β-羥基類固醇脫氫酶以及1mM NAD+和1mM NADPH。使用5U之來自腸膜明串珠菌的重組NADH氧化酶及12.5U之來自穴兔的重組乳酸脫氫酶(肌肉異形體)和200mM之丙酮酸鈉以用於再生NAD+。使用5U之來自高加索酸奶乳桿菌的重組醇脫氫酶和最初為2%之IPA(重量/體積)以用於再生NADPH。在25℃之水性磷酸鉀緩衝液(100mM,pH值=7.8)中進行反應並一邊持續搖動(850rpm)。進一步使用開放系統以將丙酮蒸發並使反應轉移朝向3α,7β-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸。18小時和24小時後追加2%之IPA(重量/體積)劑量。48小時後所使用之膽烷酸有70%被反應成3α,7α-二羥基-12-側氧基-5β-膽烷酸。
0.5毫升之反應物中含有50毫克鵝去氧膽烷酸、12U
之來自大腸桿菌的重組7α-羥基類固醇脫氫酶、6U之來自扭鏈瘤胃球菌的重組7β-羥基類固醇脫氫酶以及0.5mM NAD+和0.3mM NADPH。使用6U之重組乳酸脫氫酶和350mM之丙酮酸鈉以用於再生NAD+。使用6U之來自高加索酸奶乳桿菌的重組醇脫氫酶和最初為2.4%之IPA(重量/體積)以用於再生NADPH。在25℃,帶有5mM MnCl2之水性磷酸鉀緩衝液(100mM,pH值=7.8)中進行反應並一邊持續搖動(850rpm)。進一步使用開放系統以將丙酮蒸發並使反應轉移朝向熊去氧膽烷酸。6小時後追加1.6%(重量/體積)之IPA劑量,16小時後追加2.4%(重量/體積)之IPA,且24小時後追加3.9%(重量/體積)之IPA。36小時後加入200微升之2-戊醇及3%(重量/體積)之IPA,48小時後追加100微升之2-戊醇及4%(重量/體積)之IPA。64小時後,在反應混合物中之所有膽汁酸中的熊去氧膽烷酸部分>99%。尤其是,鵝去氧膽烷酸的部分為約0.3%。於未加入氯化錳的對照反應物中,鵝去氧膽烷酸的部分為約2%且熊去氧膽烷酸的部分為約97.5%(從每組5次實驗獲得之平均值)。
0.5毫升之反應物中含有50毫克鵝去氧膽烷酸、12U之來自大腸桿菌的重組7α-羥基類固醇脫氫酶、6U之來自扭鏈瘤胃球菌的重組7β-羥基類固醇脫氫酶以及0.5mM NAD+和0.3mM NADPH。使用6U之重組乳酸脫氫酶和350mM之丙酮酸鈉以用於再生NAD+。此外,使用9U之來自腸膜明串珠菌的重組NADH氧化酶以及6U之來自胺基戊酸梭狀芽孢桿菌的重組NADH氧化酶以用於再生NAD+。使用6U之來自高加索酸奶乳桿菌的重組醇脫氫酶和最初為2.4%(重量/體積)之IPA以用於再生NADPH。在25℃之水性磷酸鉀緩衝液(100mM,pH值=7.8)中進行反應並一邊持續搖動(850rpm)。進一步使用開放系統以將丙酮蒸發並使反應轉移朝向熊去氧膽烷酸。6小時後追加1.6%(重量/體積)之IPA,16小時後追加2.4%(重量/體積)之IPA且24小時後追加3.9%(重量/體積)之IPA劑量。36小時後加入200微升之2-戊醇及3%(重量/體積)之IPA,48小時後追加100微升之2-戊醇及4%(重量/體積)之IPA劑量。64小時後,在反應混合物中之所有膽汁酸中的熊去氧膽烷酸部分>99%。尤其是,鵝去氧膽烷酸的部分約0.2%。於未加入NADH氧化酶的對照反應物中,鵝去氧膽烷酸的部分為約2%且熊去氧膽烷酸的部分為約97.5%(與實例11之對照反應物相同;從每組5次實驗獲得之平均值)。
藉由使用醇脫氫酶依賴性輔因子再生系統以及組合之乳酸脫氫酶和NADH氧化酶依賴性輔因子再生系統,將鵝去氧膽烷酸經由7α-羥基類固醇脫氫酶及7β-羥基類固醇脫氫酶差向異構化成熊去氧膽烷酸。2-戊醇和2-丙醇之加成作用
50毫升之反應物中含有5克鵝去氧膽烷酸、24U/毫升之來自大腸桿菌的重組7α-羥基類固醇脫氫酶、12U/毫升之來自扭鏈瘤胃球菌的重組7β-羥基類固醇脫氫酶以及0.55mM NAD+和0.3mM NADPH。使用12U/毫升之重組乳酸脫氫酶和350mM之丙酮酸鈉以用於再生NAD+。此外,使用18U/毫升之來自腸膜明串珠菌的重組NADH氧化酶,以及12U/毫升之來自胺基戊酸梭狀芽孢桿菌的重組NADH氧化酶以用於再生NAD+。使用12U/毫升之來自高加索酸奶乳桿菌的重組醇脫氫酶和最初為1.5%(重量/體積)之IPA以用於再生NADPH。在25℃,帶有5mM MnCl2之水性磷酸鉀緩衝液(100mM,pH值=7.8)中進行反應。在3頸反應容器中以KPG-攪拌器在約100rpm下攪拌。藉由使空氣流(約400-600毫升/分鐘)通過反應容器來有效移除源自反應物之丙酮。由於2-丙醇亦被同時蒸發,必須額外添加,例如0.75毫升(1.5小時)、0.75毫升(3小時)、0.5毫升(4小時)、0.75毫升(6小時)、0.75毫升(8小時)、0.5毫升(11小時)、0.5毫升(14小時)、0.5毫升(17小時)、0.5毫升(21小時)、1毫升(23小時)、2.5毫升(25小時)、4毫升
(29小時)之劑量。約30小時後,加入20毫升之2-戊醇及2毫升之2-丙醇。經過46小時之總反應時間後,7-酮基石膽酸部分為約1%(相關於鵝去氧膽烷酸、熊去氧膽烷酸及7-酮基石膽酸之總和)。進一步加入2-丙醇:3毫升(46小時)、4毫升(52小時)、4毫升(54小時),以及額外之10毫升2-戊醇。經過72小時總反應時間後,7-酮基石膽酸的部分可降低至少於0.2%。熊去氧膽烷酸之部分>99%。
終止如實例8至12中所描述之反應後,存在於本試驗中之膽汁酸可經由如實例4中描述之方法分析。
Claims (15)
- 一種使氧化還原輔因子NAD+/NADH及/或尤其是NADP+/NADPH在一鍋反應(one-pot reaction)中經酶催化再生之方法,其中由於至少兩個其他經酶催化之氧化還原反應在相同反應批次(產物形成反應)中進行,該兩種氧化還原輔因子之一係以其還原形式積聚,且另一者係分別地以其氧化形式積聚,該方法之特徵在於:a)在經還原之輔因子再被轉化為其原始之氧化形式的再生反應中,氧或通式I之化合物被還原,
- 如申請專利範圍第1項之使氧化還原輔因子NAD+/NADH及/或尤其是NADP+/NADPH在一鍋反應中經酶催化再生之方法,其中由於至少兩個其他經酶催化之氧化還原反應在相同反應批次(產物形成反應)中進行,該兩種氧化還原輔因子之一係以其還原形式積聚,且另一者係分別地以其氧化形式積聚,其中:a)在該經氧化之輔因子再生期間,通式I之化合物被還原,
- 如申請專利範圍第2項之方法,其中R2和R3彼此獨立地選自下列群組:H、(C1-C6)烷基(其中烷基為直鏈或支鏈)、(C1-C6)烯基(其中烯基為直鏈或支鏈且包含一至三個雙鍵)、芳基(尤其是C6-C12芳基)、羧基及(C1-C4)羧基烷基。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中氧化反應和還原反應係在同一受質(分子骨架)上發生。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中氧化反應和還原反應同時進行。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中在該經氧化之輔因子再被轉化為其原始之還原形式的再生反應中,2-丙醇係藉由醇脫氫酶經氧化成丙酮。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中在該經還原之輔因子再被轉化為其原始之氧化形式的再生反應中,丙酮酸係藉由乳酸脫氫酶經還原成乳酸。
- 如申請專利範圍第7項之方法,其中在該經氧化之輔因子再被轉化為其原始之還原形式的再生反應中,蘋果酸係藉由蘋果酸脫氫酶經氧化成丙酮酸及CO2。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中該方法係用於在相同之反應批次中對通式Ⅲ之化合物分別進行至少一種氧化反應及至少一種還原反應,
- 如申請專利範圍第9項之方法,其中該方法係用於轉化式Ⅶ之脫氫表雄固酮(dehydroepiandrosterone) (DHEA)
- 如申請專利範圍第9項之方法,其中該方法使用兩種相反立體特異性之羥化類固醇脫氫酶使式Ⅳ之3α,7α-二羥基-5β-膽烷酸(鵝去氧膽酸)經酶催化差向異構化
- 如申請專利範圍第9項之方法,其中該方法使用3種立體特異性之羥化類固醇脫氫酶(其中2種具有相反的立體特異性)使式Ⅸ之3α,7α,12α-三羥基-5β-膽烷酸(膽烷酸)經酶催化差向異構化
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中該方法係用於使C5或C6糖異構化,尤其是經由還原成山梨醇且隨後氧化成果糖使葡萄糖異構化。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中在該反應批次中,該用於涉及形成產物之氧化反應中的受質之濃度為至少5%或高於5%(重量/體積),尤其是7%或高於7%(重量/體積),尤其是9%或高於9%(重量/體積)。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中該產物形成反應所達到之整體更替率為≧70%,尤其是≧90%。
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