TW201305187A - 利用模擬移動床層析法純化抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於層析純化抗體(如：單株抗體)之組合物及方法，其係利用經改良之模擬移動床分離策略，及於特定實施例中，利用拉曼光譜法。

Description

利用模擬移動床層析法純化抗體
本發明係關於一種層析純化抗體(如：單株抗體(mAb))之組合物及方法，其係採用經改良之模擬移動床(SMB)分離策略及，於特定實施例中，採用拉曼光譜法。
本申請案主張於2011年9月20日申請之U.S.S.N. 61/384,620之申請日優先權，該案係以引用全文之方式併入本文。
蛋白質純化策略常採用一或多個層析分離步驟，以將宿主細胞蛋白(HCP)自最終純化蛋白製劑中排除。此等層析分離步驟傳統上係以「分批模式」進行，其中在填充特定層析支撐物之單一管柱上依序進行平衡、上料、清洗、溶離及隨後再生。由於分批模式層析法依賴於將管柱僅上料至管柱之動態容量而非將管柱上料至其飽和容量，故每次上料及分離偱環僅利用管柱實際結合容量中之30%至50%。因此，分批模式分離法需使用比在飽和容量下操作管柱時高2至3倍體積的管柱。由於僅利用管柱實際結合容量中之30%至50%，故分批模式層析法涉及使用顯然更大量之層析分離支撐物，且延長完成各次上料及分離偱環所需之時間，進而大大增加蛋白質純化相關之成本。此外，使用比在飽和下操作時所需體積高2至3倍的體積之管柱將導致在單次分離偱環中用於平衡、清洗及溶離之緩衝劑用量顯著增加，進而產生額外成本，且不具時間效益。
鑒於以上論述，在相關技藝中需要一種經改良之方法，以更高效率純化蛋白質，包括醫療性抗體。本發明藉由將經改良之模擬移動床分離策略應用於蛋白質純化法，來解決此需求。
於特定實施例中，本發明係關於自包含標的蛋白質及至少一種HCP之樣品混合物製造已減少宿主細胞蛋白質(HCP)之標的蛋白質製劑之方法。於特定實施例中，本發明之方法包含使含標的蛋白質之樣品混合物接觸層析樹脂，以將該樹脂上料至其飽和結合容量之約50%至100%，包括大於約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%及大於約90%，及收集層析樣品，其中該層析樣品包含已減少該HCP之標的蛋白質製劑。於某些此等實施例中中，採用拉曼光譜法追蹤及/或測定製造此等已減少HCP之標的蛋白質製劑時所涉及一種或多種多組分混合物中之組成。
本發明某些實施例係關於一種已減少HCP之標的蛋白質製劑之製法，其包括使含標的蛋白質及樣品混合物接觸層析樹脂，以將該樹脂上料至其飽和結合容量之約50%至100%，包括大於約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%及大於約90%，及收集層析樣品(其中該層析樣品包含該已減少HCP之標的蛋白質製劑)，且該層析樹脂係選自由親和層析樹脂、離子交換層析樹脂及疏水相互作用層析樹脂所組成群中。某些此等實施例中，採用拉曼光譜法追蹤及/或測定在製造此等已減少HCP之標的蛋白質製劑時所涉及一種或多種多組分混合物中之組成。
本發明某些實施例係關於一種已減少HCP之標的蛋白質製劑之製法，其包括使含標的蛋白質之樣品混合物接觸層析樹脂，以將該樹脂上料至其飽和結合容量之約50%至100%，包括大於約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%及大於約90%，及收集層析樣品(其中該層析樣品包含該已減少HCP之標的蛋白質製劑)，及該標的蛋白質係選自由以下物質組成之群：酶、肽激素、多株抗體、人類單株抗體、人化單株抗體、嵌合型單株抗體、單鏈抗體、Fab抗體片段、F(ab')2抗體片段、Fd抗體片段、Fv抗體片段、單離之CDR、雙功能抗體、DVD及免疫黏附素。某些此等實施例中，採用拉曼光譜法追蹤及/或測定在製造此等已減少HCP之標的蛋白質製劑時所涉及一種或多種多組分混合物中之組成。
本發明某些實施例係關於一種已減少HCP之標的蛋白質製劑之製法，其包括使含標的蛋白質之樣品混合物接觸層析樹脂，以將該樹脂上料至其飽和結合容量之約50%至100%，包括大於約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%及大於約90%，及收集層析樣品(其中該層析樣品包含該已減少HCP之標的蛋白質製劑)，及將該層析樹脂填充至由流體導管分隔之一系列流體連接管柱中，其中流體連接管柱之數量係選自由以下數值組成之群：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12個獨立管柱。於某些此等實施例中，採用拉曼光譜法追蹤及/或測定在製造此等已減少HCP之標的蛋白質製劑時所涉及一種或多種多組分混合物中之組成。
本發明某些實施例係關於一種已減少HCP之標的蛋白質製劑之製法，其包括使含標的蛋白質之樣品混合物接觸層析樹脂，以將該樹脂上料至其飽和結合容量之約50%至100%，包括大於約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%及大於約90%，並收集層析樣品(其中該層析樣品包含該已減少HCP之標的蛋白質製劑)，及將該層析樹脂填充至由流體導管分隔之一系列至少2個流體連接管柱中，其中該等管柱係藉由容許導入緩衝劑(如平衡、清洗及溶離緩衝劑)及取出溶離液之流體導管分隔。於某些此等實施例中，採用拉曼光譜法追蹤及/或測定在製造此等已減少HCP之標的蛋白質製劑時所涉及一種或多種多組分混合物中之組成。
本發明某些實施例係關於一種已減少HCP之標的蛋白質製劑之製法，其包括使含標的蛋白質之樣品混合物接觸層析樹脂，以將該樹脂上料至其飽和結合容量之約50%至100%，包括大於約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%及大於約90%，並收集層析樣品(其中該層析樣品包含該已減少HCP之標的蛋白質製劑)，且由該樣品混合物接觸層析樹脂，以獲得選自約0.5至約12分鐘範圍內之滯留時間，於一項實施例中，該滯留時間可選自由以下數值組成之群：至多約0.5，至多約1、至多約2、至多約3、至多約4、至多約5、至多約6、至多約7、至多約8、至多約9、至多約10、至多約11及至多約12分鐘。於某些此等實施例中，採用拉曼光譜法追蹤及/或測定在製造此等已減少HCP之標的蛋白質製劑時所涉及一種或多種多組分混合物中之組成。
本發明某些實施例係關於製造已減少HCP之標的蛋白質製劑，其包括使含標的蛋白質之樣品混合物接觸層析樹脂，以將該樹脂上料至其飽和結合容量之約50%至100%，包括大於約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%及大於約90%，並收集層析樣品(其中該層析樣品包含該已減少HCP之標的蛋白質製劑)，且該方法進一步包括以下步驟：平衡該層析樹脂，然後與樣品混合物接觸，及在與該樣品混合物接觸後清洗該層析樹脂，其中平衡緩衝劑與清洗緩衝劑係相同緩衝劑。於某些此等實施例中，採用拉曼光譜法追蹤及/或測定在製造此等已減少HCP之標的蛋白質製劑時所涉及一種或多種多組分混合物中之組成。
本發明某些實施例係關於一種已減少HCP之標的蛋白質製劑之製法，其包括使含標的蛋白質之樣品混合物接觸層析樹脂，以將該樹脂上料至其飽和結合容量之約50%至100%，包括大於約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%及大於約90%，並收集層析樣品(其中該層析樣品包含該已減少HCP之標的蛋白質製劑)，且該方法進一步包括層析樹脂之清洗及再生步驟，其中此等步驟可經計算及程式化，以維持使樣品接觸層析樹脂之步驟佔製程時間之約20%至約80%，於一項特定實施例中，該接觸時間佔約50%。於某些此等實施例中，採用拉曼光譜法追蹤及/或測定在製造此等已減少HCP之標的蛋白質製劑時所涉及一種或多種多組分混合物中之組成。
本發明係關於一種採用經改良之模擬移動床分離策略來層析純化抗體(如單株抗體)之組合物及方法。為簡明起見且不在限制下，將此實施方式分為以下子部分：
5.1　定義；
5.2　抗體產生；
5.3　抗體製造；
5.4　抗體純化；
5.5　示例性純化策略；及
5.6　拉曼光譜。
5.1.　定義
術語「抗體」包括由四條多肽鏈組成之免疫球蛋白，其中兩條重(H)鏈與兩條輕(L)鏈係藉由二硫鍵互連。各重鏈係由一重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)與一重鏈恒定區(CH)組成。重鏈恒定區係由三個功能部位CH1、CH2及CH3組成。各輕鏈係由一輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)與一輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區係由一功能部位CL組成。VH及VL區可進一步細分為以稱為架構區(FR)之較保守之區分隔之高可變區(稱為互補決定區(CDR))。各VH及VL係由三個CDR及四個FR組成，該等CDR及FR係依如下順序自胺基末端排列至羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
術語抗體之「抗原結合部分」(或「抗體部分」)包括抗體中保留特異結合至抗原之能力的片段。已發現抗體之抗原結合功能可藉由全長度抗體之片段實施。涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內之結合片段之實例包括(i) Fab片段，係包含VL、VH、CL及CH1功能部位之單價片段，(ii) F(ab')2片段，係包含由鉸鏈區之二硫鍵連接之兩個Fab片段之二價片段，(iii)包含VH及CH1功能部位之Fd片段，(iv)包含抗體單臂之VL與VH功能部位之Fv片段，(v)包含VH功能部位之dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341: 544-546，該案之全文教義係以引用之方式併入本文)，及(vi)經單離之互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段之兩個功能部位VL與VH係由分開之基因編碼，然而其等可利用重組方法，藉由可使其等形成蛋白質單鏈以使VL與VH區配對形成單價分子之合成連接子連結，參見，例如，Bird等人(1988) Science 242:423-426；及Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883，該等案之全文教義係以引用方式併入本文。此等單鏈抗體亦將涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，如雙功能抗體。雙功能抗體係二價雙特異性抗體，其中VH與VL功能部位表現於多肽單鏈上，但利用因過短而無法令同一鏈上兩個功能部位之間進行配對之連接子強制該等功能部位與另一鏈之互補功能部位配對，並建立兩個抗原結合位點(參見，例如，Holliger,P.等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak,R. J.等人(1994) Structure 2:1121-1123，該等文獻之全文教義係以引用之方式併入本文)。而且，抗體或其抗原結合部分可係藉由抗體或抗體部分與一或多個其他蛋白質或肽之共價或非共價締合所形成更大型免疫黏附素中之一部分。此等免疫黏附素之實例包括使用鏈黴抗生物素核區製造四聚scFv分子(Kipriyanov,S. M.等人(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101，該案之全文教義係以引用之方式併入本文)及使用半胱胺酸殘基、標記物肽及C-末端聚組胺酸標籤製造二價生物素化scFv分子(Kipriyanov. S. M.等人(1994)Mol. Immunol. 31:1047-1058，該案之全文教義係以引用之方式併入本文)。諸如Fab及F(ab')2片段之抗體部分可由完整抗體利用習知技術(如完整抗體分別經木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消解)製備。此外，抗體、抗體部分及免疫黏附素可利用如本文所描述之標準重組DNA技術獲得。於一態樣中，抗原結合部分係完全功能部位或一對完全功能部位。
術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」可於本文中互換使用。相關技藝咸了解，此等術語係指可變性比抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈中其他胺基酸殘基更高(亦即高可變性)之胺基酸殘基之編號系統(Kabat等人(1971) Ann. NY Acad,Sci. 190:382-391及Kabat,E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242，該案之全文教義係以引用之方式併入本文)。就重鏈可變區而言，高可變區位於CDR1之胺基酸位置31至35，CDR2之胺基酸位置50至65及CDR3之胺基酸位置95至102之間。就輕鏈可變區而言，高可變區係位於CDR1之胺基酸位置24至34、CDR2之胺基酸位置50至56及CDR3之胺基酸位置89至97之間。
術語「人類抗體」包括具有對應人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恒定區之抗體，如Kabat等人所述(參見Kabat等人(1991) Sequence of proteins of Immunological Interest,第5版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。本發明之人類抗體可例如，在CDR及特定言之，在CDR3中包含並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由在體外之隨機或位置特異誘變或藉由體內突變導入之突變)。該等突變可利用選擇誘變方法導入。人類抗體可具有由胺基酸殘基(例如，並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之活性增強胺基酸殘基)替代之至少一個位置。人類抗體可具有至多20個由並非人類生殖系免疫球蛋白序列之一部分之胺基酸殘基替代之位置。於其他實施例中，替代至多10個、至多5個、至多3個或至多2個位置。於一實施例中，此等替代係於CDR區內。然而，如本文所使用之術語「人類抗體」不包括已將自另一哺乳動物物種(如小鼠)之生殖系獲得之CDR序列嫁接於人類架構序列上之抗體。
用語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、建立或單離之人類抗體，如利用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體、自重組之組合人類抗體集合庫單離之抗體、自接受人類免疫球蛋白基因轉殖之動物(例如，小鼠)中單離之抗體(參見，例如，Taylor,L. D.等人(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295，該案之全文教義係以引用之方式併入本文)或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、建立或單離之抗體。此等重組人類抗體具有自人類生殖系免疫球蛋白序列獲得之可變及恒定區(參見，Kabat,E. A.等人(1991),Sequence of proteins of Immunological Interest,第5版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。然而於某些實施例中，此等重組人類抗體係經由體外誘變(或，當使用接受人類Ig序列轉殖之動物之基因時，則為體內體細胞誘變)，及因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列雖然係衍生自人類生殖系VH及VL序列且與其有關，但仍可能非天然存在於人類抗體生殖系體內基因譜內。然而於某些實施例中，此等重組抗體係選擇誘變方法或反突變或兩者之結果。
「經單離抗體」包括實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體(例如，特異結合特定標靶之經單離抗體實質上不含特異結合非指定標靶之抗原的抗體)。特異結合特定人類標靶之經單離抗體可結合來自其他物種之相同標靶。此外，經單離抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
如本文所使用之術語「Koff」係指關於抗體自抗體/抗原複合物之解離性之離去速率常數。
如本文所使用之術語「Kd」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數。
用語「核酸分子」包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股，但於一態樣中，係雙股DNA。
如本文針對編碼抗體或抗體部分(例如，VH、VL、CDR3)之核酸(例如，彼等結合至特定標靶者且包括其核苷酸序列編碼該抗體或抗體部分之核酸分子)而使用之用語「經單離核酸分子」不含編碼會結合該特定標靶以外之抗原的抗體或抗體部分之其他核苷酸序列，該等其他序列可能天然側接人類基因組DNA中之核酸。用語「經單離核酸分子」亦將包括編碼二價雙特異抗體(如雙功能抗體)之序列，其中VH及VL區不含雙功能抗體序列以外之序列。
用語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)包括已接受重組表現載體導入其中之細胞。應理解，此等術語不僅意指特定個體細胞，且亦指此等細胞之子代。由於因突變或環境影響可在在繼代中產生特定修飾，故此等子代實際上可能不與親代細胞一致，但仍包含於如本文所使用之術語「宿主細胞」之範圍內。
如本文所使用之術語「約」意指在參考值之正負約10至20%內之範圍。於某些情況中，熟習本項技術者將瞭解，由於參考值之屬性，術語「約」可意指高於或低於該數值10至20%。
如本文所使用之術語「層析」係指用於將所關注之標的分子自分子混合物中分離之分析技術，且取決於混合物組分對固體相之選擇性吸附性。實例包括親和層析、離子交換層析、尺寸排除層析及疏水相互作用層析。
當用於混合物中受關注之標的分子時，「經純化」說明其相對濃度(標的物重量除以混合物中所有組分或溶離份重量)增加至少20%。於一系列實施例中，該相對濃度增加至少約40%、約50%、約60%、約75%、約100%、約150%或約200%。當所純化分離組分之相對濃度(所純化分離組分或溶離份之重量除以混合物中所有組分或溶離份之重量)降低至少約20%、約40%、約50%、約60%、約75%、約85%、約95%、約98%或約100%時，該受關注之標的分子亦可稱為經純化。於另一系列實施例中，將受關注之標的分子純化至至少約50%、約65%、約75%、約85%、約90%、約97%、約98%或約99%之相對濃度。於一實施例中，當受關注之標的分子自其他組分或溶離份「分離」時，將理解，於其他實施例中，該組分或溶離份係「純化」至本文所提供之程度。
5.2.　抗體產生
於本章節中所使用之術語「抗體」係指完整抗體或其抗原結合片段。
本發明之抗體可藉由各種不同的技術產生，包括對帶有所關注抗原之動物實施免疫法，接著使用習知單株抗體方法，例如，Kohler及Milstein(1975) Nature 256:495之標準體細胞雜交技術。雖然原則上常用體細胞雜交技術，然而亦可採用用於製造單株抗體之其他技術，例如，B淋巴細胞之病毒或致癌轉化法。
用於製備融合瘤之一常用動物系統係鼠科系統。融合瘤之製造係一種建立完整之製程。用於單離出融合用之免疫化脾細胞之免疫試驗計劃及技術係相關技藝已知。融合搭配物(例如，鼠科骨髓瘤細胞)及融合步驟亦已知。
抗體一般可係人類、嵌合型或人化抗體。本發明之嵌合或人化抗體可係基於如上所述製備之非人類單株抗體的序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可利用標準分子生物技術，自所關注之非人類融合瘤獲得，並進行工程改造，以含有非鼠科(例如，人類)免疫球蛋白序列。例如，為了建立嵌合抗體，可利用相關技藝已知之方法，將鼠科可變區連接至人類恒定區(參見，例如，Cabilly等人之美國專利案4,816,567)。為了建立人化抗體，可利用相關技藝已知方法，將鼠科CDR區嵌插至人類架構中(例如，參見Winter之美國專利案5,225,539及Queen等人之美國專利案5,530,101、5,585,089、5,693,762及6,180,370)。
於一項非限制性實施例中，本發明之抗體係人類單株抗體。此等人類單株抗體可利用帶有人類免疫系統部分而非小鼠系統之轉基因或轉染色體小鼠產生。此等轉基因或轉染色體小鼠包括在本文中稱為HuMAb Mouse(Medarex,Inc.)、KM Mouse(Medarex,Inc.)及XenoMouse(Amgen)之小鼠。
此外，表現人類免疫球蛋白基因之其他轉染色體動物系統可在相關技藝中獲得，且可用於產生本發明之抗體。例如，可使用帶有人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體之小鼠(稱為，TC小鼠)；此等小鼠描述於Tomizuka等人(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727。此外，帶有人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛已描述於相關技藝中(例如，Kuroiwa等人(2002) Nature Biotechnology 20:889-894及PCT申請案WO 2002/092812)且可用於產生本發明之抗體。
可藉由篩選利用人類淋巴細胞所衍生mRNA製備之人類VL及VH cDNA所製得之重組組合抗體集合庫(例如，scFv噬菌體呈現集合庫)，來單離本發明之重組人類抗體。製備及篩選此等集合庫之方法係相關技藝已知。除了用於產生噬菌體呈現集合庫之市售套組(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfzAPTM噬菌體呈現套組，目錄號240612，該等案之全文教義係以引用之方式併入本文)外，特別適合用於產生及篩選抗體呈現集合庫之方法及試劑實例可參見，例如，Ladner等人，美國專利案5,223,409；Kang等人，PCT公開案WO 92/18619；Dower等人，PCT公開案WO 91/17271；Winter等人，PCT公開案WO 92/20791；Markland等人，PCT公開案WO 92/15679；Breitling等人，PCT公開案WO 93/01288；McCafferty等人，PCT公開案WO 92/01047；Garrard等人，PCT公開案WO 92/09690；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等人，(1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huse等人，(1989) Science 246:1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990) 348:552-554；Griffiths等人，(1993) EMBO J 12:725-734；Hawkins等人，(1992) J Mol Biol 226:889-896；Clackson等人，(1991) Nature 352:624-628；Gram等人，(1992) PNAS 89:3576-3580；Garrard等人，(1991) Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等人，(1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137；及Barbas等人，(1991) PNAS 88:7978-7982，該等案之全文教義係以引用之方式併入本文。
本揭示內容之人類單株抗體可利用已在其中重構人類免疫細胞之SCID小鼠製備，以使在免疫法時產生人類抗體反應。此等小鼠描述於，例如，Wilson等人之美國專利案5,476,996及5,698,767中。
於本發明之又一實施例中，可以改變抗體或其片段，其中該抗體之恒定區可經修飾，以相對於未經修飾之抗體減少至少一個由恒定區媒介之生物效應子功能。為了修飾本發明之抗體以使其展現降低之Fc受體結合性，可使抗體之免疫球蛋白恒定區區段在Fc受體(FcR)相互作用所需之特定區內發生突變(參見，例如，Canfield and Morrison(1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491；及Lund等人(1991)J. of Immunol. 147:2657-2662，該等案之全文教義係以引用之方式併入本文)。抗體之FcR結合能力降低亦可減少依賴FcR相互作用之其他效應子功能，如：調理作用及吞噬作用，及抗原依賴性細胞毒性。
5.3.　抗體製造
為了表現本發明之抗體，可將編碼部份或全長度輕鏈及重鏈之DNA嵌插至一或多種表現載體中，以使該等基因可操作性連接至轉錄及轉譯控制序列。(參見，例如，美國專利案6,914,128，該案之全文教義係以引用之方式併入本文)。就此而言，術語「可操作性連接」意指抗體基因拼接至載體中，以使在該載體中之轉錄及轉譯控制序列執行其調節抗體基因之轉錄及轉譯之預期功能。所選擇之表現載體及表現控制序列可與所使用之表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因嵌插至分開之載體中，或更一般而言，將兩個基因嵌插至同一表現載體中。抗體基因係藉由標準方法嵌插至表現載體中(例如，在抗體基因片段及載體之互補限制酶切位點進行拼接，或者，若沒有限制酶切位點，則進行鈍端拼接)。於嵌插抗體或抗體相關輕鏈或重鏈序列之前，表現載體可事先已帶有該抗體恒定區序列。例如，將特定VH及VL序列轉換成全長度抗體基因之一方法係將其等嵌插至已分別編碼重鏈恒定區及輕鏈恒定區之表現載體中，以使VH區段可操作性連接至該載體內之CH區段，及使VL區段可操作性連接至該載體內之CL區段。此外或或者，該重組表現載體可編碼促進宿主細胞分泌抗體鏈的信號肽。可將抗體鏈基因選殖至該載體中，以使信號肽在讀碼框內連接至抗體鏈基因之胺基末端。該信號肽可係免疫球蛋白信號肽或異源性信號肽(即，來自非免疫球蛋白之信號肽)。
除抗體鏈基因外，本發明之重組表現載體亦可帶有一或多個控制宿主細胞中抗體鏈基因表現之調節序列。術語「調節序列」意欲包括啟動子、增強子及控制抗體鏈基因轉錄及轉譯之其他表現控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。此等調節序列描述於，例如，Goeddel;Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)，該案之全文教義係以引用之方式併入本文。熟習本項技術者將瞭解，表現載體之設計(包括調節序列之選擇)可視諸如所選擇之待轉形宿主細胞、所需之蛋白質表現程度等等因素而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之適宜調節序列包括在哺乳動物細胞中主導高度蛋白質表現之病毒元件，如自以下病毒獲得之啟動子及/或增強子：巨大細胞病毒(CMV)(如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒。關於病毒調節元件及其序列之進一步描述，可參見，例如，Stinski之美國專利案5,168,062、Bell等人之美國專利案4,510,245及Schaffher等人之美國專利案4,968,615，該等專利案之全文教義係以引用之方式併入本文。
除抗體鏈基因及調節序列外，本發明之重組表現載體亦可帶有一或多種額外序列，如調節宿主細胞中之載體複製之序列(例如，複製之原點)及/或可選擇標記基因。該可選擇標記基因有助於選出其中已導入載體之宿主細胞(參見，例如，Axel等人之美國專利案4,399,216、4,634,665及5,179,017，該等專利案之全文教義係以引用之方式併入本文)。例如，一般而言，該可選擇標記基因可為其中已導入載體之宿主細胞中提供針對藥物(如G418、潮黴素及甲胺蝶啶)之抗性。適宜之可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於具有甲胺蝶啶選擇/擴增之dhfr-宿主細胞中)及neo基因(用於G418選擇)。
本發明之抗體或抗體部分可藉由在宿主細胞中重組表現免疫蛋白球輕鏈及重鏈基因而製得。為了表現重組抗體，以一或多種帶有編碼抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈之DNA片段之重組表現載體轉染宿主細胞，以於該宿主細胞中表現該輕鏈及重鏈，並分泌至培養宿主細胞之培養基中，然後可自該培養基回收。可利用標準重組DNA方法獲得抗體重鏈及輕鏈基因，將此等基因合併至重組表現載體中，及將該等載體導入宿主細胞中，如Sambrook、Fritsch及Maniatis(編者)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel等人(編者) Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989)及美國專利案4,816,397與6,914,128中所述之彼等宿主細胞，該等文獻之全文教義係以引用之方式併入本文。
為了表現輕鏈及重鏈，藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之變化形式意欲涵蓋常用於將外源DNA導入至原核或真核生物宿主細胞中之各種不同技術，例如，電穿孔法、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染法及類似者。雖然理論上可於原核或真核生物宿主細胞中表現本發明之抗體，然而，適合在真核生物細胞(如哺乳動物細胞)中表現抗體，因為此等真核生物細胞(特定言之哺乳動物細胞)比原核生物細胞更有可能裝配及分泌經適當摺疊且具免疫活性之抗體。已知抗體基因之原核生物細胞表現無法有效製造高產率活性抗體(Boss及Wood(1985) Immunology Today 6:12-13，該案之全文教義係以引用之方式併入本文)。
用於選殖或表現本文載體中之DNA之適宜宿主細胞係原核生物、酵母或上述高級真核生物細胞。用於此目的之適宜原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性微生物，例如，腸桿菌科，如大腸桿菌，例如，大腸桿菌(E. coli)、陰溝腸桿菌(Enterobacter)、梨火疫病菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)、沙門氏桿菌(Salmonella)，例如，鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌(Serratia)，例如，黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)及志賀氏菌(Shigella)，及諸如枯草桿菌(B. subtilis)及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)(例如，1989年4月12日公開之DD 266,710中所揭示之地衣芽孢桿菌41P)之芽孢桿菌、諸如綠膿桿菌(P. aeruginosa)之假單胞菌，及鏈黴菌屬。一種適宜之大腸桿菌選殖宿主係大腸桿菌294(ATCC 31,446)，然而，其他菌株，如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110(ATCC27,325)亦適宜。此等實例僅作說明而未加限制。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物亦適用為用於多肽之編碼載體之選殖或表現宿主。在較低等真核宿主微生物中，常採用釀酒酵母或一般烘焙酵母。然而，許多其他屬、種及菌株可廣泛取得且可用於本文中，如裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)；諸如(例如)乳酸克魯維酵母菌(K. lactis)、脆壁克魯維酵母菌(K. fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克海姆克魯維酵母(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦爾特克魯維酵母(K. waltii)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母菌(K. marxianus)之克魯維氏酵母菌(Kluyveromyces)宿主；耶氏酵母菌(yarrowia)(EP 402,226)；嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌屬(Candida)；里氏木黴菌(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)；諸如東方許旺酵母菌(Schwanniomyces occidentalis)之許旺酵母菌(Schwanniomyces)；及諸如例如，脈孢菌(Neurospora)、青黴菌(Penicillium)、彎頸黴菌(Tolypocladium)之絲狀真菌，及諸如構巢麯黴(A. nidulans)及黑麯黴(A. niger)之麴黴(Aspergillus)宿主。
用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞係自多細胞生物獲得。無脊椎屬細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別出來自諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda(毛蟲))、埃及伊蚊(Aedes aegypti(蚊子))、白紋伊蚊(Aedes albopictus(蚊子))、果蠅(Drosophila melanogaster(果蠅))及家蠶(Bombyx mori)之宿主之許多桿狀病毒菌株及變體，及相應之受納昆蟲宿主細胞。已可公開獲得用於轉染之各種不同病毒菌株，例如，苜蓿丫紋夜蛾NPV之L-1變體及家蠶NPV之Bm-5菌株，且可將此等病毒用作本發明之病毒，尤其用於轉染草地夜蛾細胞之病毒。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及菸葉之植物細胞培養物亦可用作宿主。
用於表現本發明重組抗體之適宜哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(包括描述於Urlaub及Chasin，(1980) PNAS USA 77:4216-4220中之dhfr-CHO細胞，其使用(例如)Kaufman及Sharp(1982) Mol. Biol. 159: 601-621中所描述之DHFR可選擇標記物，該等文獻之全文教義係以引用之方式併入本文)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體導入至哺乳動物宿主細胞時，藉由培養該等宿主細胞充分長時間以容許抗體在宿主細胞中表現或將抗體分泌至宿主細胞生長之培養培養基中，來製造抗體。可使用之哺乳動物宿主細胞系之實例係經SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)轉化之猴腎CV1細胞系；人類胚腎細胞系(經次選殖至懸浮培養基中生長之293或293細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59(1977))；幼年倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))；小鼠塞特利氏細胞(TM4，Mather,Biol. Reprod. 23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅(Buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠***細胞(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝瘤細胞系(Hep G2)，該等文獻之全文教義係以引用之方式併入本文。
宿主細胞係藉由上述用於製造抗體之表現或選殖載體轉化而成，且培養於經改質以適宜誘導啟動子、選擇轉化體，或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中。
用於製造抗體之宿主細胞可培養於不同培養基中。市售培養基，如Ham's F10TM(Sigma)、Minimal Essential MediumTM((MEM)，Sigma)、RPMI-140(Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's MediumTM((DMEM)，Sigma)，均適用於培養該等宿主細胞。此外，亦可將描述於Ham等人，Meth. Enz. 58:44(1979)；Barnes等人，Anal. Biochem. 102:255(1980)；美國專利案4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469；WO 90/03430、WO 87/00195或美國專利案Re. 30,985中之培養基中的任一者用作該等宿主細胞之培養基，該等文獻之全文教義係以引用之方式併入本文。其中任一種培養基均可視需要補充激素及/或其他生長因子(如，胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(如，氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝劑(如，HEPES)、核苷(如，腺苷及胸苷)、抗體(如，健大黴素)、微量元素(定義為一般以微莫耳範圍之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可包含適宜濃度之為熟習本項技術者已知之任何其他必需補充物。諸如溫度、pH，等等之培養條件係一貫用於選擇表現宿主細胞時之彼等條件，且係為一般技術者知曉。
亦可將宿主細胞用於製造完整抗體之一部分，如Fab片段或scFv分子。應理解，關於以上步驟之變化係屬於本發明範圍之內。例如，於某些實施例中，宜轉染帶有編碼本發明抗體之輕鏈或重鏈(但非同時編碼兩者)之DNA的宿主細胞。亦可使用重組DNA技術以移除編碼抗原結合性不需要之輕鏈及重鏈中一或兩者之一些或所有DNA。自此等截短DNA分子表現之分子亦涵蓋於本發明之抗體內。此外，可藉由標準化學交聯方法，將本發明抗體與第二抗體交聯，來製造其中一條重鏈及一條輕鏈係本發明抗體，而另一條重鏈及輕鏈卻對該原始抗原以外之抗原具有特異性的雙功能抗體。
於用於本發明抗體或其抗原結合部分之重組表現之適宜系統中，藉由磷酸鈣媒介之轉染法，將編碼抗體重鏈及抗體輕鏈之重組表現載體導入至dhfr-CHO細胞中。於該重組表現載體內，抗體重鏈及輕鏈基因各自連接至CMV增強子/AdMLP啟動子調節元件，以驅動高度基因轉錄。該重組表現載體亦帶有DHFR基因，該基因容許利用甲胺喋呤選擇/擴增法來選擇已被該載體轉染之CHO細胞。所選擇之轉化體宿主細胞係經培養，以使抗體重鏈及輕鏈表現，並自培養基回收完整抗體。使用標準分子生物技術來製備重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉化體，培養宿主細胞，及自培養基回收抗體。
當利用重組技術時，可在細胞內、於胞質空間中製造抗體，或直接分泌至培養基中。於一態樣中，若第一步驟在細胞內製造抗體，則可藉由(例如)離心或超濾法移除顆粒碎片(宿主細胞或裂解細胞(例如，於均質化時產生者))。若抗體係分泌至培養基中之情況下，可先利用市售蛋白質濃縮過濾器，例如，AmiconTM或Millipore PelliconTM超濾單元濃縮來自此等表現系統之上清液。
於本發明方法之前，用於自細胞碎片中純化抗體之製程起初係依賴於抗體之表現位置。有些抗體可自細胞直接分泌至周圍生長培養基中；其他抗體則在細胞內製造。就後者抗體而言，純化方法之第一步驟一般涉及：藉由各種方法裂解細胞，包括機械剪切、滲透壓休克或酶處理。此等瓦解法將細胞之全部內容物釋放至均質液中，且亦產生因尺寸小而難以移除之次細胞碎片。此等物一般係藉由分級離心或藉由過濾移除。於分泌抗體之情況下，一般首先利用市售蛋白質濃縮過濾器，例如，AmiconTM或Millipore PelliconTM超濾單元濃縮來自此等表現細胞之上清液。若抗體係分泌至培養基中時，亦可例如：利用切向流過濾法，自細胞培養基中分離重組宿主細胞。可利用本發明之抗體純化方法，進一步自培養培養基回收抗體。
5.4.　抗體純化
5.4.1.　一般抗體純化法
本發明提供一種自包含抗體及至少一種HCP之混合物中製造經純化(或已減少HCP)之抗體製劑之方法。當利用上述方法及相關技藝中之習知方法製造抗體時，本發明之純化方法可從分離步驟開始。表1概述純化方案之一實施例。此方案之變化，包括(但不限於)倒置離子交換步驟之順序，均在本發明之範圍內。
一旦獲得包含抗體之澄清溶液或混合物，則利用不同純化技術之組合(包括親和性分離步驟、離子交換分離步驟及疏水相互作用分離步驟)將自細胞所產生其他蛋白質中分離抗體。該等分離步驟係基於蛋白質結合特性、電荷、疏水程度或尺寸來分離蛋白質混合物。於本發明之一態樣中，利用層析法，包括親和性、陽離子、陰離子及疏水相互作用層析法進行分離。此等技術可分別利用數種不同層析樹脂，以針對所涉及之特定蛋白來準確制定純化方案。各分離方法之本質係使蛋白質依不同速率移動通過管柱，隨著其等在管柱中進一步前行而不斷擴大物理性分離，或選擇性黏附至分離培養基，隨後藉由不同溶劑依差異性溶離。於一些情況中，當雜質特異黏附至管柱，而抗體不黏附(即，抗體以流過形式存在時)，則可自雜質中分離抗體。
如上所述，純化方案之準確制定法係依賴於待純化蛋白質之考量。於某些實施例中，採用本發明之分離步驟，自一或多種HCP中分離抗體。雖然本發明係關於一般蛋白質純化法，但其尤其適用於純化抗體。例如，可利用本文所述方法成功純化之抗體包括，但不限制於，人類IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgM抗體。於某些實施例中，本發明之純化策略不包括使用蛋白質A親和性層析法(例如，就IgG3之純化而言)，係因IgG3抗體無法高效結合至蛋白質A。容許專門制定純化方案之其他因素包括，但不限制於：Fc區之存在與否(例如，就相較於抗體之Fab片段之全長度抗體而言)，因為蛋白質A會結合至Fc區；用於產生所關注抗體之特定生殖系序列；及抗體之胺基酸組成(例如，抗體之主序列及分子之總電荷/疏水性)。具有一或多種共通特性之抗體可利用經制定以擷取彼等特性的優勢之純化策略來純化。
5.4.2.　模擬移動床層析
如上所述，抗體純化法一般合併一或多個層析分離步驟。雖然此等層析分離步驟傳統上係以分批模式實施，然而，此等分批模式分離法會顯著降低純化方法之效率。例如，由於使用呈分批模式之層析管柱要求該等管柱僅可依其等動態容量上料，故分批模式需使用相當於該管柱上料至其等飽和容量時之兩至三倍的樹脂。此低效率可極大幅增加總成本，係因蛋白質層析樹脂一般極其昂貴。此外，在分批管柱層析法中之清洗及溶離製程需要大量流體體積，此不僅增加純化方法之成本，且亦極大幅延長完成此等分離法所需之時間。
於某些實施例中，本發明係關於一或多種模擬移動床(SMB)層析分離法之用途。於某些實施例中，此等SMB分離係外加至或替代一或多種傳統分批模式分離法。由於SMB層析分離法涉及使用上料至接近其等飽和容量之管柱，故其所需層析樹脂之體積較小。此外，由於SMB分離法容許更有效進行清洗及溶離製程，故使用SMB分離法可以極大幅減少緩衝劑消耗量，並獲得更具時間效益之純化製程。
於某些實施例中，SMB系統包括以固相層析支撐物填充之一或多個模組。此等支撐物包括，但不限制於，親和性層析樹脂、離子交換層析樹脂及疏水相互作用層析樹脂。於某些實施例中，特定模組可包括一個或多個層析管柱，但其限制條件為該系統應包含至少兩個層析管柱。於某些實施例中，各模組之各種不同態樣，及於多模組系統中之各模組係彼此流體連通。於某些實施例中，係經由互連流體導管達成此等流體連通。於某些實施例中，此等導管係藉由閥或其他容許導入及/或取出流體之構件分隔。
本發明之某些實施例中，流體導管將SMB系統之上游及下游末端互連，形成可使流體混合物連續偱環通過之迴路。於某些點處，可導入流體流，及於其他點處可取出流出液流。於某些實施例中，可提供管與閥之歧管系統，以選擇性佈置進料材料之入口、溶離緩衝劑之入口、已解離組分之出口、及未締合(或較少締合)組分之出口。於某些實施例中，各入口及出口點係與獨立模組或管柱連通。例如，於某些實施例中，進料材料在指定點處進入系統，並以連續內部再偱環流動形式移動通過固相。這種移動性接觸即可達成層析分離進料材料之組分。於相當快速率下流動之未締合組分則自一未締合組分出口移除，如：藉由第一清洗流出液流來移除。在締合與未締合組分之各出口閥位置之間之入口閥處添加可使締合化合物自固相解離之緩衝劑。
於某些實施例中，將指定入口及出口閥位置在通往次一個固相床管柱之歧管上向下游移置一個位置。選擇其步進時間，以使閥指定與內部再偱環流動準確同步。於此等條件下，該系統最終達到穩態，其中特定產物特性會依預定間隔依序出現在各閥位置。此類系統模擬維持在單個位置中之閥，同時讓固相依恒定持續速率下圍繞再偱環迴路移動，於各閥處產生恒定品質產物。於某些實施例中，可採用另一種裝置，其中管柱係藉由手動或藉由機械迴轉料架物理式驅動，同時閥位置維持固定。
SMB分離方法隨著模組數量增加及閥位置升高來達到實際移動床之特性。於某些實施例中，模組之數量將為至多2、3、4、5、6、7、8、9或10個，而各模組包含一或多個單獨層析管柱。於某些實施例中，SMB系統包含4或8個層析管柱。
於某些實施例中，將模擬移動床方法用於親和性層析。於某些實施例中，層析材料可選擇性或特異性結合至所關注抗體。此等層析材料之非限制性實例包括：蛋白質A、蛋白質G、包含與所關注抗體結合之抗原之層析材料、及包含Fc結合蛋白質之層析材料。於特定具體實施例中，親和性層析步驟涉及使主要回收樣品通過包含適宜蛋白質A樹脂之管柱。蛋白質A樹脂可用於各種抗體同型物(特定言之IgG1、IgG2及IgG4)之親和性純化及單離。蛋白質A係一種細菌細胞壁蛋白質，其主要經由其Fc區結合至哺乳動物IgG。於其天然狀態中，蛋白質A具有5個IgG結合功能部位，及其他未知功能之功能部位。
於某些實施例中，將模擬移動床方法用於離子交換層析。離子交換分離法包括基於兩種物質之個別離子電荷差異分離該兩種物質之任何方法，且可採用陽離子交換材料或陰離子交換材料。
陽離子交換材料或陰離子交換材料之使用係視蛋白質之總電荷而定。因此，採用陰離子交換步驟，然後利用陽離子交換步驟，或先使用陽離子交換步驟，然後使用陰離子交換步驟均屬於本發明之範圍內。此外，僅採用陽離子交換步驟、僅採用陰離子交換步驟或兩者之任何連續組合均屬於本發明之範圍內。
亦可將離子交換層析用作離子交換分離技術。離子交換層析法係基於分子總電荷間差異分離分子。就抗體純化而言，該抗體需具有與連接至離子交換材料(例如，樹脂)之官能基相反之電荷，方可進行結合。例如，一般在緩衝劑pH低於pI時具有總正電荷之抗體將與含有帶負電荷之官能基之陽離子交換材料結合。
於離子交換層析中，溶質表面上之帶電部分係受到連接至層析基質之相反電荷吸引，但其限制條件為周圍緩衝劑之離子強度應較低。一般藉由提高緩衝劑之離子強度(即，導電率)以與溶質競爭離子交換基質之帶電荷位置，來達成溶離。改變pH及藉此改變溶質電荷係另一種達成溶質溶離之方法。導電率或pH之變化可呈梯度(梯度溶離)或分步(分步溶離)形式。
可將陰離子或陽離子取代基連接至材料上，以形成用於層析之陰離子或陽離子支撐物。陰離子交換取代基之非限制性實例包括二乙基胺基乙基(DEAE)、四級胺基乙基(QAE)及四級胺(Q)基團。陽離子取代基包括羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸根(P)及磺酸根(S)。諸如DE23TM、DE32TM、DE52TM、CM-23TM、CM-32TM及CM-52TM之纖維素離子交換樹脂可自英國Whatman Ltd.(Maidstone，Kent，U.K)獲得。亦已知基於SEPHADEX及與其交聯之離子交換劑。例如，DEAE-、QAE-、CM-及SP-SEPHADEX及DEAE-、Q-、CM-及S-SEPHAROSE及SEPHAROSE Fast Flow均係獲自Pharmacia AB。此外，DEAE及CM衍生之乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物(如TOYOPEARLTM DEAE-650S或M及TOYOPEARLTM CM-650S或M)係獲自Toso Haas Co.,Philadelphia,Pa。
離子交換步驟促進捕捉所關注抗體，同時減少諸如HCP之雜質。於某些態樣中，離子交換管柱係陽離子交換管柱。例如，但不限制於，用於此陽離子交換管柱之適宜樹脂係CM HyperDFTM樹脂。此等樹脂係獲自商品來源，如Pall Corporation。此陽離子交換步驟可在室溫或接近室溫下進行。
於某些實施例中，將模擬移動床方法用於疏水相互作用層析(HIC)中。離子交換層析法係依賴於抗體之電荷來單離，而疏水相互作用層析法則利用抗體之疏水性質。抗體上之疏水基團與管柱上之疏水基團相互作用。蛋白質之疏水性越高，則與管柱之相互作用越強。因此，HIC步驟可移除宿主細胞產生之雜質(例如，DNA及其他高及低分子量產物相關物質)。
疏水相互作用在高離子強度下最強，因此，此分離形式一般係於鹽沉澱法或離子交換步驟後實施。高鹽濃度有利於抗體與HIC管柱之吸附性，但實際濃度可視抗體屬性及所選擇之具體HIC配位體而在寬範圍內變化。各種不同離子可視離子增進疏水相互作用(鹽析作用)或破壞水結構(離液作用)及導致疏水相互作用減弱，而安排在所謂之疏溶劑系列中。依據漸增之鹽析效用，將陽離子分級為Ba++、Ca++、Mg++、Li+、Cs+、Na+、K+、Rb+、NH4+，而依漸增之離液作用，將陰離子分級為PO---、SO4--、CH3CO3、Cl-、Br-、NO3-、ClO4-、I-、SCN-。
一般而言，Na、K或NH4硫酸鹽有效增進HIC中之配位體-蛋白質相互作用。影響相互作用強度之鹽可依以下關係進行調配：(NH4)2SO4>Na2SO4>NaCl>NH4Cl>NaBr>NaSCN。一般而言，適用之鹽濃度為約0.75至約2 M之間之硫酸銨或約1至4 M之間之NaCl。
HIC管柱一般包含與疏水性配位體(例如，烷基或芳基)偶合之基質(例如，交聯瓊脂糖或合成共聚物材料)。適宜HIC管柱包含經苯基取代之瓊脂糖樹脂(例如，Phenyl SepharoseTM管柱)。可自市面購置許多種HIC管柱。其實例包括，但不限制於，具有低或高取代度之Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow管柱(Pharmacia LKB Biotechnology,AB，瑞典)；Phenyl SepharoseTM High Performance管柱(Pharmacia LKB Biotechnology,AB，瑞典)；Octyl SepharoseTM High Performance管柱(Pharmacia LKB Biotechnology,AB，瑞典)；FractogelTM EMD Propyl或FractogelTM EMD Phenyl管柱(E. Merck,德國)；Macro-PrepTM Mehyl或Macro-PrepTM t-Butyl Supports(Bio-Rad,California)；WP HI-Propyl(C3)TM管柱(J. T. Baker,New Jersey)；及ToyopearlTM醚、苯基或丁基管柱(TosoHaas,PA)。
5.5.　示例性純化策略
於某些實施例中，SMB分離方法採用一系列蛋白質A管柱。於特定非限制性實例中，SMB分離方法採用4個蛋白質A管柱。於具體實施例中，該4個蛋白質A管柱具有1.6 cm之直徑及5 cm之高度，且係以MabSelect蛋白質A樹脂填充。於其他實施例中，可採用額外的管柱，例如，5、6、7、8、9或10個管柱，且該等管柱可具有實質上更大直徑及高度，獲得至多約2公升、至多約3公升、至多約4公升、至多約5公升、至多約6公升、至多約7公升、至多約8公升、至多約9公升、至多約10公升、至多約11公升、至多約12公升、至多約13公升、至多約14公升、至多約15公升、至多約16公升、至多約17公升、至多約18公升、至多約19公升、至多約20公升、至多約25公升、至多約30公升、至多約40公升、至多約50公升、至多約60公升、至多約70公升、至多約80公升、至多約90公升、至多約100公升或以上之填充管柱體積。
於某些實施例中，用於特定SMB分離方案中之各蛋白質A管柱可藉由適宜緩衝劑平衡，然後進行樣品上料。適宜緩衝劑之非限制性實例係Tris緩衝劑，pH約7.2。適宜平衡條件之非限制性實例係350 mM Tris，pH約7.2。經過此平衡之後，可將樣品上料至管柱上。於管柱上料之後，可利用例如，平衡緩衝劑清洗該管柱一或多次。可在溶離該管柱之前先進行其他清洗法，包括採用不同緩衝劑之清洗法。例如，可利用一或多份管柱體積之pH約7.2之25 mM Tris清洗該管柱。於此清洗之後，可視需要接著利用平衡緩衝劑進行一或多次清洗。隨後可利用適宜溶離緩衝劑溶離蛋白質A管柱。適宜溶離緩衝劑之非限制性實例係pH約3.5之乙酸/NaCl緩衝劑。適宜條件係例如，0.1 M乙酸、pH約3.5。可利用熟習本項技術者熟知之技術追蹤流出液。例如，可追蹤OD280下之吸光度。可於開始偏移約0.5 AU時開始收集管柱流出液，直至在溶離峰之後緣處達約0.5 AU之讀數時為止。隨後製備所關注之溶離份，用於進一步處理。例如，可利用pH約10之Tris(例如，1.0 M)滴定所收集樣品至pH約5.0。視需要，此經滴定樣品可經過濾及進一步處理。
於某些實施例中，計算樣品上料過程，以達到特定標的物滯留時間。於具體實施例中，計算樣品上料過程，以達到約0.5至約12分鐘之標的物滯留時間，於某些實施例中，該標的物滯留時間係選自至多約0.5分鐘、至多約1分鐘、至多約2分鐘、至多約3分鐘、至多約4分鐘、至多約5分鐘、至多約6分鐘、至多約7分鐘、至多約8分鐘、至多約9分鐘或至多約10分鐘組成之群。於某些實施例中，標的物滯留時間係3分鐘。於某些實施例中，亦計算樣品上料過程，以達到管柱飽和結合容量之至多約50%、至多約60%、至多約70%、至多約80%、至多約90%或至多約100%。
於某些實施例中，SMB分離方法涉及用於導入平衡、上料、清洗、溶離、再生及儲存緩衝劑之特定流程。於某些實施例中，該流程係由三部分組成：第1輪、第2至(n-1)輪及最後一輪。此流程之非限制性實例如下：
於某些實施例中，第一清洗步驟採用與平衡緩衝劑一致之緩衝劑。於某些實施例中，可將第一清洗步驟整合至樣品上料步驟中。於某些實施例中，可以計算清洗、溶離及再生步驟及流程化，以維持上料時間佔操作過程之約50%。
5.5.　拉曼光譜法
拉曼光譜法係基於在材料上之單色入射輻射會依特異方式經反射、吸收或散射之原理，其係視接收該輻射之特定分子或蛋白質而定。雖然大部份能量係於同一波長下散射(瑞利(Rayleigh)散射)，然而，少量(例如，10-7)係於有些不同波長下散射(斯托克(Stokes)及反斯托克散射)。此散射係與旋轉、振動及電子層級之變遷有關。由散射光子之波長變化提供化學及結構資訊。
於某些實施例中，拉曼光譜法可用於多組分混合物(如：彼等用於本文所述SMB技術中之混合物)，以提供組分之高特異性「指紋」。自混合物之拉曼光譜分析獲得之光譜指紋係各單獨組分之疊加。頻帶之相對強度係與特定組分之相對濃度相關。因此，於某些實施例中，可將拉曼光譜法用於定性及定量組分混合物之特徵。因此，於某些此等實施例中，拉曼光譜法可用於追蹤及/或測定在製造本發明之已減少HCP之標的蛋白質製劑時所涉及一種或多種多組分混合物中之組成。
拉曼光譜法可用於分析大部份樣品之特徵，包括具有極短信號定位時間之固體、液體、漿液、凝膠、膜、粉末及一些氣體。一般而言，無需專門製備技術即可直接自所關注之生物過程獲取樣品。此外，入射光及散射光可傳遞通過長距離，因此容許長程追蹤。此外，由於水僅提供弱拉曼散射，故可分析含水樣品之特徵，而不會受到來自水之明顯干擾。
可基於市售拉曼光譜分析儀分析本文中所描述之可應用方法及組合物。例如，可採用RamanRX2TM分析儀或由Kaiser Optical Systems,Inc.(Ann Arbor,MI)販售之其他分析儀。或者，由(例如)PerkinElmer(Waltham,MA)、Renishaw(Gloucestershire,UK)及Princeton Instruments(Trenton,NJ)販售之拉曼分析儀。關於市售拉曼光譜分析儀之技術細節及操作參數可自各廠商獲得。
可基於(例如)拉曼光譜分析儀及所採用之方法(例如，於提供UF/DF生物過程操作之實時追蹤之方法中)測定適宜曝露時間、樣品尺寸及取樣頻率。類似地，亦可基於分析儀及用於分析儀之方法測定適當探測器放置。例如，用於浸入式探針以提供恰當信號之樣品尺寸可為小於20 ml，或小於10 ml(例如，8 ml或更小)。提供恰當信號之曝露時間可為小於2分鐘，或小於1分鐘(例如，30秒)。
若需定量呈超過一種以隨pH變化之離子化形式存在之組分(例如，組胺酸)時，可在不同濃度下進行拉曼光譜校準，且/或在指定pH範圍內隨不同pH預測濃度，以使組分(例如，組胺酸)之測定不再隨pH變化。例如，可採用隨不同pH出現之組胺酸形式之校準模型來測量及定量呈各種離子化形式之組胺酸，以測定溶液性質。可進行信號處理，包括強度校正(例如，標準常態變量(SNV)及/或基線校正(例如，一階導數)。
可藉由測量代表性測試溶液之CCD飽和度，及確認其等在可接受儀器範圍(例如，40至80%)內，來測定曝露時間。
於一些實施例中，由特定組分(例如，諸如組胺酸之緩衝劑)採用pH控制或pH範圍建模。於一些實施例中，可藉由(例如)使用遮蓋物(例如，鋁箔)防止周圍入射光源干擾光譜，儘盡可能減小入射光。
例如，在使用不帶電荷物質濃縮蛋白質(如：抗體)之某些實施例中，該蛋白質佔據溶液之大部份體積，不含大量溶質。此導致不帶電荷物質之濃度淨下降。此作用稱為「體積排除」，其與蛋白質濃度成比例。
於特定實施例中，如涉及帶電荷組分分析法之彼等實施例，由於在較高濃度下，蛋白質電荷會顯著影響溶液中總帶電物質，故發生唐南(Donnan)效應。由於預期在膜之任一側均可能達成平衡，故電中性之要求導致在膜之滯留面上之帶正電物質(例如，緩衝劑物質)減少。此現象稱為唐南效應。
根據本發明某些實施例，採用RamanRX2TM分析儀。此分析儀，及其他市售拉曼分析儀提供追蹤多達四個同時涵蓋全光譜範圍之能力。於某些實施例中，採用標準NIR雷射激發光，以儘盡可能提高樣品相容性。例如，RamanRX2TM分析儀可採用可程式化之順序追蹤模式，及該裝置係與製程光學器件相容，保證可讓一種分析儀類型從發現期應用至製造期。可攜帶式裝置及纖維光學取樣界面容許該分析儀在多種地點上使用。
於本發明所揭示主題之某些實施例中，藉由拉曼光譜法分析含有預定量已知組分之至少一種多組分混合物標準物(即，多組分混合物標準物)之特徵，以獲得用於含未知組分及/或未知濃度之已知或未知組分的混合物之模型(例如，校準曲線)。較佳，針對建立模型之目的，藉由拉曼光譜法分析含有預定量已知組分之一系列多組分混合物標準物之特徵。
習此相關技藝之技術者即可測定用於含未知組分及/或未知濃度之已知或未知組分的混合物之模型之建立方法。例如，基於預期存在於多組分測試混合物中之主組分之部份最小平方迴歸分析法。而且，可採用獲自拉曼光譜法廠商之軟體程式來設計多組分混合物標準物，該標準物亦可用於發展用於多組分測試混合物之模型。
應理解，針對「提供含預定量已知組分之多組分混合物標準物」及「於多組分混合物標準物上進行拉曼光譜分析法」，及更一般而言，發展分析含未知組分或未知濃度組分之多組分混合物特徵之模型的論述包括平行分析(即，「現場」獲得之數據)及針對事先獲得或事先記錄多組分混合物標準物(即，含有已知濃度之已知組分之多組分混合物)之結果(例如：拉曼光譜指紋)之論述。例如，針對自廠商產品文獻獲得且為「提供含預定量已知組分之多組分混合物標準物」及「於多組分混合物標準物上進行拉曼光譜分析法」所涵蓋之拉曼光譜結果的論述。
本發明某些實施例採用拉曼光譜技術，分析用於生物過程操作(包括，但不限制於，SMB操作)中之組分(例如，多組分混合物)之特徵。例如，於特定實施例中，可使用拉曼光譜法分析趨於在SMB分離法中與生物活性物(例如，單株抗體)組合之調配物之特徵。此等調配物，有時稱為「調配緩衝劑」，一般係決定生物製劑中賦形劑濃度之多組分混合物。例如，此等調配物一般包含以下一或多種物質：pH緩衝劑(例如，檸檬酸鹽、Tris、乙酸鹽或組胺酸化合物)、表面活性劑(例如，聚山梨醇酯80)、糖或糖醇(例如，甘露醇)及/或胺基酸(例如，L-精胺酸或甲硫胺酸)。調配緩衝劑中之錯誤常導致不合格批次，進而亦導致大量損失。使用本文所揭示技術可降低或消除此等低效率事件。
於某些實施例中，可使用拉曼光譜技術來鑑定蛋白質聚結物，如，但不限制於，彼等於SMB操作期間形成之聚結物。例如，但不限制於，於某些實施例中，本發明之拉曼光譜技術可鑑定藥物及藥物產物樣品(包括，但不限制於，抗體藥物樣品及抗體藥物產物樣品)等蛋白質之聚結。
於某些實施例中，可使用拉曼光譜法測試及分析調配物在過濾操作(例如，超濾/透析過濾製程)，如：純化諸如單株抗體之生物活性劑之過濾操作，包括，但不限制於，與SMB操作之組合操作中出現之特徵。例如，但不限制於，可使用本發明之拉曼光譜技術獲得線上或離線獲得之樣品，以測定存在於單次讀數中之組分的身份及數量。於某些實施例中，除蛋白質濃度外，亦可測定賦形劑濃度。於某些此等實施例中，可分析在0至150 mg/ml範圍內之蛋白質濃度。
於某些實施例中，可使用拉曼光譜法追蹤、確認、測試及藉此控制生物過程操作，如但不限制於，與SMB操作組合進行之彼等操作。用於生物過程操作之單元操作(例如，層析、過濾、改變pH、藉由添加組分或稀釋溶液來改變組成)均可產生包含有機或無機組分及生物分子之混合物。因此，例如，藉由拉曼光譜法快速且準確地測量中間產物之組成之作法可改良及維持操作法及生物產物之一致性及品質。
於某些實施例中，藉由拉曼光譜法測量混合物中之單獨組分之組成可以於存在或不存在生物分子下準確製備此等混合物。例如，於某些實施例中，此測量法可用於製備在生物過程操作中大量使用之緩衝溶液，同時有利於改良製備之一致性或提供幾近實時之緩衝溶液製備。於某些實施例中，此舉將消除對用於製備、固持及遞送緩衝溶液之精細設備的需求。於某些實施例中，使用拉曼光譜法容許利用簡單儀器實時檢測緩衝調配物中之潛在誤差(例如，化學組分濃度、錯誤化學物質等)，依此測試及釋放緩衝溶液。可測試之調配物包括，但不限制於，無蛋白質之三組分調配物(緩衝劑+糖+胺基酸)、蛋白質與糖調配物、蛋白質與表面活性劑調配物，及蛋白質與緩衝劑調配物。
於某些實施例中，溶液組成之準確測量容許調整生物溶液，以獲得添加劑(陰離子、陽離子、疏水成份、溶劑等)之正確標的組成。目前，此等測量甚為繁瑣且需要不適用於進行實時應用之複雜分析方法。使用拉曼光譜法容許進行測量，並提供極高等級之文件保證，此符合常規工業之期望。
於某些定實施例中，本發明之技術有能力追蹤及控制藉由化學、物理或生物方式達成之蛋白質-蛋白質反應、蛋白質-小分子反應、及/或蛋白質修飾。於某些此等實施例中，利用拉曼光譜法追蹤反應物(呈其原始狀態之生物物質)及產物(呈其最終狀態之生物物質)及呈天然化學或生物性質之其他反應物/觸媒之獨有生物化學特徵。依此方式追蹤反應物及產物尤其可反饋控制反應條件及反應物量。於某些實施例中，亦可設計一個連續移除副產物及/或產物之系統，以最優化、改良或維持產物品質或此等系統之性能。
於某些實施例中，拉曼光譜法亦容許在層析操作(包括，但不限制於，SMB操作)中單離及純化生物產物。於某些此等實施例中，可基於所需產物品質或製程性能追蹤產物/產物變體/產物同型物或雜質之溶離及收集溶離流出液。於某些實施例中，亦可應用拉曼光譜法單離/富集在其他單元操作(如，但不限制於，過濾及非層析分離)中之溶離流出液。
於某些實施例中，拉曼光譜法可部署成非侵入式工具。例如，但不限制於，可採用不干擾信號之材料進行拉曼光譜測量。此舉可在需嚴格維持容納此等混合物之容器/槽的完整性之生物過程操作中提供另一獨有優勢。
於某些實施例中，拉曼光譜法可成為一種檢測含有其他組分之溶液中之「污染」之極有價值方式。於某些此等實施例中，檢測層析支撐物或其部分自一個純化步驟轉移至另一步驟之夾帶雜質。於某些實施例中，此夾帶雜質包括，但不限制於，自蛋白質A層析製程瀝出之蛋白質A。於某些此等實施例中，利用統計或光譜對比技術比對來自經污染溶液之拉曼光譜數據與預期光譜，若不同時，則可快速檢測此等溶液調配物中之誤差，然後才用於生物過程中。
於某些實施例中，如經由以下作為概念驗證之實例所證實，可利用拉曼光譜定量含有來自細胞培養物收集材料(包括，宿主細胞蛋白質、DNA、脂質等)之雜質的混合物中之抗體濃度。於此等實施例中，該方法可用於追蹤來自生物過程操作之含有未經純化混合物的流入液及流出液。其實例可包括，但不限制於，用於管柱、過濾器及非層析分離裝置(膨脹床、流化床、二相萃取，等)之上料及溶離操作。所提供之實例證實，當以基於限定化學成份之培養基之細胞培養過程製備澄清收穫溶液時，可於包含來自以該溶液上料之蛋白質A親和性層析管柱的未結合溶離份之基質中定量出0.1至1 g/l之抗體濃度。若將拉曼光譜法併入連線測定，則此測量法可直接追蹤及控制管柱上料，保證在代表動態結合容量或靜態(平衡)容量之預定結合容量下進行一致且最優之管柱上料。熟習本項技術者將瞭解，此等技術可應用於上述各其他操作。
於特定實施例中，拉曼光譜法可用於生物過程純化操作中之品質控制及/或反饋控制(例如，於醫療性抗體之純化製程中連線控制緩衝劑之稀釋)。於某些此等實施例中，可將拉曼光譜法用於涉及蛋白質共軛反應或其他化學反應(例如，液相Heck反應)之製程中的品質控制及/或反饋控制，如Anal. Chem.,77:1228-1236(2005)中所述，該案係以引用之方式併入本文。
6.實例
6.1.　案例研究：mAb X
本案例研究係使用mAb X製程中間產物作為進料流，及以常見的瓊脂糖型親和性蛋白質A層析培養基作為親和性層析樹脂。利用4個管柱共進行8次循環。將該等管柱各上料至飽和，並由圖4顯示所得之層析圖。偶數UV峰表示溶離，及奇數UV峰表示在上料後立即進行之清洗1。
所有SMB操作均採用以下緩衝劑：
下表出示mAb X之SMB純化流程。該流程有三個部分：第1輪、第2至(n-1)輪及最終一輪。上料2區塊係由飽和結合容量(SBC)試驗法(見下文)之曲線下面積(AUC)計算得到。應注意，以下分離製程係於比真實SBC減少20%下進行。第一分離製程係於1分鐘滯留時間下進行，及第二製程係於3分鐘滯留時間下進行。
圖8中之數據說明mAb X之飽和結合容量(SBC)試驗法。由Poros A HPLC分析法分析管柱之流通量，測定未結合於管柱上之產物量。至高達73 g/L之飽和結合容量之曲線下面積(AUC)表示可藉由SMB改良常見之40 g/L之結合量(動態結合量)。從飽和結合容量中減去AUC，計算第2輪至最後一輪之上料量(參見圖8)。
6.2.　案例研究mAb Y
本案例研究使用mAb Y製程中間產物作為進料流，及以常見瓊脂糖型親和性蛋白質A層析樹脂作為親和性層析樹脂。利用4個管柱共進行8次循環。將該等管柱各自上料至飽和，及由圖6顯示所得之層析圖。偶數UV峰表示溶離，及奇數UV峰表示在上料後立即進行清洗1。
所有SMB操作均採用此等緩衝劑：
下表出示mAb Y之SMB純化流程。該流程有三個部分：第1輪、第2至(n-1)輪及最後一輪。上料2區塊係由飽和結合容量(SBC)試驗法(見下文)之曲線下面積(AUC)計得。計算清洗1、清洗2及再生步驟，以維持上料時間佔該輪之50%，及計算上料步驟，以獲得3分鐘滯留時間。應注意，以下分離製程係在比真實SBC減少20%下進行。
圖8中之數據說明mAb Y之飽和結合容量(SBC)試驗法。由Poros A HPLC試驗法分析管柱之流通量，以測定未結合於管柱上之產物量。高達86 g/L之飽和結合容量的AUC說明SMB可改良常見之45 g/l之結合容量(動態結合容量)。從飽和結合容量減去此AUC，計算第2輪偱環至最後一輪偱環之上料量(參見圖9)。
6.3.　案例研究mAb X，雜質夾帶檢測法
利用mAb X進行實施第二次SMB分離。於此分離法中，mAb X係存在於限定化學成份之培養基中。利用4個管柱共進行8次偱環。將該等管柱各自上料至飽和。所有SMB操作均採用以下緩衝劑：
下表出示mAb X之SMB純化流程。該流程有三個部分：第1輪、第2至(n-1)輪及最後一輪。上料2區塊係由飽和結合容量(SBC)試驗法之曲線下面積(AUC)計算。應注意，以下分離製程係於比真實SBC減少20%下進行。第一分離製程係於1分鐘滯留時間下進行，及第二製程係於3分鐘滯留時間下進行。
此SMB分離法之總產率係85%。所進行之分析試驗包括用於測定mAb濃度之Poros A試驗，及用於在每次溶離操作後測定蛋白質A夾帶雜質含量之可瀝出蛋白質A之ELISA。後者說明第二循環(溶離操作5至8)之可瀝出蛋白質A高於第一偱環(溶離操作1至4)，表示出現一定程度的雜質夾帶排出效應。
6.4.　在小型模場下之案例研究mAb Z
將上述蛋白質A方法按比例調整至小型模場，及用於mAb Z分離法中。以蛋白質A層析支撐物填充三個管柱(各為10 cm直徑×8 cm高度，785 ml)。類似上述小規模分離法，手動操作管柱變換。僅藉由三個管柱，便可如圖10中所描述般實施工作流程。
酸化mAb Z細胞培養收穫物，以使細胞及細胞碎片沉澱。此等雜質之沉澱將改良後續離心之效率，並提高深度過濾器及膜過濾器之容量。收穫物澄清後，即可藉由一個簡單清洗步驟將樣品上料至蛋白質A管柱上，並簡化淨化步驟。在管柱前增加一個連線過濾器，以使其與碎片隔離，並在管柱前添加一個防氣閥，以使其與空氣隔絕。
將簡化之緩衝系統用於所有處理步驟中。平衡緩衝劑、所有清洗緩衝劑、溶離緩衝劑均僅包含兩種組分：Tris及乙酸。由於各組分已界定其含量，故可藉由各組分之莫耳濃度控制pH。因此，所有緩衝劑均沒有必要調整pH，進而在緩衝劑製備中節省大量時間。以下係用於小型模場製程中之緩衝劑。
於清洗期間將所有三個管柱接續連接，以節省清洗劑用量。將流速降低至200 cm/小時，以配合三個管柱中漸增之壓力降。
此方法之總產率係91%，證實可藉由酸化，接著離心/深度過濾來澄清mAb Z細胞培養收穫物，並藉由蛋白質A親和性層析捕捉，達成簡單之mAb捕捉方法。
6.5.　測試3-組分調配緩衝劑
使用水作為溶劑製備含有精胺酸、檸檬酸及海藻糖之預定混合物之調配緩衝劑。組分係於0至100 mM內變化。
利用RAMANRXN2TM分析儀獲得15 ml各混合物樣液之800至1700 cm-1範圍內的拉曼光譜(2個光譜/混合物)。以標準常態變量(SNV)強度標準化、經過15個點精細校正之一階導數(間隙)基線及具有平均強度值=0之平均值中心差異光譜設定光譜過濾參數。將此視為數據規度設定，而非光譜過濾器。利用曝露時間為30秒/樣品之浸入式探測器收集該光譜。
可使用主要組分方法(Principal Components Methodology)來建立模型。將PLS(對潛結構之部份最小平方投影法(Partial Least Squares projections to latent structures))模型應用於三種組分中之各者，以測定組分間相關性。此結果係將光譜強度(例如，1700至800 cm-1)轉換成濃度(ax1+bx2+...+zx900=濃度)之線性模型。用於校準本文所示結果之軟體係來自Thermo Galactic之GRAMS/AI V 7.02，內建有PLSplus/IQ。採用SIMCA P+建立許多圖形及實驗模型。藉由移除兩個樣品來交叉驗證該等樣品。進行數據分析，以迭代用於測試相關性及交叉驗證之步驟，直至組分之間相關性低於2%之誤差臨界值。藉由單一讀數即可準確定量緩衝劑組分(例如，在2%內)。
可利用隨機混合物設計(Random Mixture Design)獲得校準曲線。將以上建立之3組分模型用於預測關於精胺酸、檸檬酸及海藻糖隨機混合物之光譜(圖11)。將此等預測結果與實際光譜對比，以確認該模型具有±2%之預定容許限值。結果示於圖12及13中。獲得隨機混合物之獨立測量值，以確認該模型可用於進行測量。
6.6.　測試4-組分調配緩衝劑
將實例6.5之方法應用於含有4種組分之調配緩衝劑，其中該等組分係甘露醇、甲硫胺酸、組胺酸及TweenTM(聚山梨醇酯80)。所測得預定混合物之光譜示於圖14至16中。波數係介於Far-IR區至Mid-IR區之間。由於受到藍寶石涵蓋範圍之限制，可於此特定實施例中忽略100至800 cm-1之範圍，並在800至1800 cm-1間進行校正。
以與實例6.5中所獲得之3組分模型相同之方式獲得4組分緩衝系統之模型。將基於所獲得模型之預測值與隨機混合物之實際光譜對比，以確認該模型充分準確。結果示於圖17及18中。
6.7.　測試含有蛋白質之3組分調配緩衝劑
將實例6.6之方法應用於含有3種組分及濃度在0至100 mg/ml範圍內之蛋白質之調配緩衝劑。該等組分係甘露醇、甲硫胺酸、組胺酸及D2E7(阿達木單株抗體)。所測得之預定混合物之光譜示於圖19至21中。
以與實例6.6中所獲得之4組分模型相同之方式獲得含蛋白質之3組分緩衝系統之模型。將基於所獲得模型之預測值與隨機混合物之實際光譜對比，以確認該模型充分準確。結果示於圖22中。實際光譜相對於預測光譜之測定係數(R2)及交叉驗證值之標準誤差(SECV)示於以下表2中。
6.8.　阿達木單株抗體UF/DF製程
建立圖23中所示之超濾/透析過濾方法(UF/DF)，以將賦形劑加至阿達木單株抗體溶液中。由進料泵(100)提供通過切向流動過濾膜之交叉流動，使儲集器中含有阿達木單株抗體之溶液通過該膜。將透析過濾緩衝劑(調配緩衝劑，含有甲硫胺酸、甘露醇及組胺酸)泵壓至儲集器(110)中，以配合該膜(液體流過該膜之滲透面)之過濾速率。離開進料槽之進料流(120)經由泵(130)引導至膜模組(140)。使含有水、緩衝組分及具有相當小分子尺寸之類似物之通透物流(150)通過該膜模組。藉由滯留閥(170)控制，將含有濃縮阿達木單株抗體之滯留物流(160)引導返回至進料槽。
將與來自Kaiser Opticals之RamanRX2TM分析儀(190)相容之拉曼探測器(180)置於該進料槽內，定期提供分析槽中內容物之能力。利用校準檔案將所獲得之光譜轉換成組分濃度，並藉此追蹤透析過濾製程之進程。此外，可追蹤及視需要控制因蛋白質濃度增加(由唐南及電荷排斥效應所引起)而發生之賦形劑濃度變化。亦可採用RamanRX2TM分析儀以外之其他拉曼系統，定期於線上分析來自超濾/透析過濾製程之樣品，作為阿達木單株抗體純化製程之品質控制一部分。例如，來自拉曼分析之結果可用於評估透析過濾製程之完成及最終賦形劑濃度。
讓組胺酸、甘露醇及甲硫胺酸混合物通過UF/DF膜透析過濾。將拉曼探測器置於該滯留物儲集器中。依指定間隔讀取拉曼光譜，其中每次讀取時包括30秒曝露，重複10次(10次掃描)。圖24至25顯示透析過濾期間之濃度變化。正如預期般，單一組分之濃度在透析過濾期間增加到達平頂期。
圖24至25提供來自透析過濾製程之線上追蹤之結果。於圖24中，提供關於各種不同透析過濾時間之糖、緩衝劑及胺基酸濃度。如圖24及25中所示，胺基酸係甲硫胺酸，及將濃度(mM)繪製於y軸上，糖係甘露醇，及將重量/體積%繪製於y軸上，及緩衝劑係組胺酸，及將濃度(mM)沿y軸繪製。關於圖24至25中各繪製點之x軸係滯留時間，其中測量0至81分鐘內之濃度及繪製在x軸上。
隨後，讓含於水中之約40 mg/ml之阿達木單株抗體通過5千道爾頓UF/DF膜(0.1 sq. m)透析過濾至超過7份透析過濾體積之糖溶液中。將拉曼探測器置於該滯留物儲集器中。依指定間隔讀取拉曼光譜，其中每次讀取包括30秒曝露時間，重複10次(10次掃描)。隨後將蛋白質濃縮至140 g/L。
圖26提供得自用於UF/DF系統中並如上所述般測量之糖/蛋白質系統(甘露醇/阿達木單株抗體)之校準數據。圖26之校準曲線係用於測定圖27及28中之甘露醇及阿達木單株抗體濃度。圖27及28顯示透析過濾期間之糖濃度變化。右側之圖顯示透析過濾期間及後續超濾期間之蛋白質濃度。於圖27及28中，繪製糖濃度(%)相對於滯留體積(自0至6)之圖形，及繪製阿達木單株抗體濃度(g/L)相對於滯留體積(自0至6)之圖形。
正如預期，糖濃度在透析過濾期間增加，達到平頂期。蛋白質達到標的濃度。於圖27中，使用經校準至50 g/L之模型。圖28顯示利用藉由120 g/L蛋白質及糖混合物獲得之校準曲線計算得到之糖及蛋白質濃度。
讓含於水中之約20 mg/ml之阿達木單株抗體通過5千道爾頓UF/DF膜(0.1 sq. m)透析過濾至超過7份透析過濾體積之組胺酸溶液(50 mM)中。將拉曼探測器置於該滯留物儲集器中。依指定間隔讀取拉曼光譜，其中每次讀取包括30秒曝露，重複10次(10次掃描)。隨後將蛋白質濃縮至50 g/L。圖29提供自緩衝劑(組胺酸)/蛋白質(阿達木單株抗體)系統獲得之校準數據。此係針對至高50 g/L蛋白質之組胺酸/阿達木單株抗體混合物之校準模型。圖30針對緩衝劑/蛋白質系統中之低濃度緩衝劑及蛋白質提供透析過濾體積(0至6份透析過濾體積)相對於組胺酸濃度(nM)及阿達木單株抗體濃度(g/l)之圖形。
該等圖顯示在透析過濾期間之組胺酸濃度(nM)變化。右側之圖顯示透析過濾及隨後超濾期間之蛋白質濃度(g/l)。正如預期，糖濃度在透析過濾期間增加，達到平頂期。蛋白質達到標的濃度。於此圖(圖29)中，使用經校準至50 g/L之模型。於該圖中之濃度因模型限制而較預期低，隨後識別出此限制係與組胺酸離子化有關。該等模型顯示組胺酸之離子化狀態與實際總組胺酸濃度及溶液性質之相關性。
數據證實其追蹤含蛋白質及其他單一組分之低濃度及高濃度UF/DF操作法之能力。可每隔3分鐘讀取濃度，藉此追蹤實時(或接近實時)濃度。於該糖/蛋白質系統中，所有蛋白質濃度均可藉由糖獲得極高準確性。亦可實時(或接近實時)提供檢測及測量體積排除效應及唐南效應之能力。因此，可將拉曼光譜法用作測量蛋白質溶液中賦形劑濃度之工具，且亦提供測量除賦形劑濃度以外之蛋白質濃度的能力，以便控制過程。
6.9.　測試含有蛋白質之2組分調配緩衝劑。
將實例6.5之方法應用於含有2種組分(Tris與乙酸鹽)，及蛋白質(阿達木單株抗體)之調配緩衝劑。該等組分係依如下範圍納入：Tris 50至160 mM；乙酸鹽30至130 mM及阿達木單株抗體4至15 g/L。
可如實例6.5所述般獲得校準曲線。將以上建立之模型用於預測根據表3之濃度所製備樣品中含Tris、乙酸鹽及阿達木單株抗體之混合物之光譜：
將此等預測值與實際光譜對比，以確認該模型位於預定容忍限值內。結果示於圖31A至C中。
6.10.　測試含蛋白質之細胞培養收穫物
將實例6.5之方法應用於含有組分TweenTM及蛋白質阿達木單株抗體之限定化學成份之細胞培養基收穫物。自細胞培養物收穫細胞培養基，過濾，並上料至蛋白質A管柱上。集中蛋白質A管柱流出液，隨後無菌過濾，然後儲存及測試。
可採用此方法測定蛋白質A管柱之上料終點。可將經過濾之細胞培養收穫物施加至捕捉管柱(一般含蛋白質A)。用於追蹤管柱上料流出物之現有方法係採用A280吸光度。然而，培養收穫物含有會吸收280 nm光之許多成份。A280吸光度一般係飽和，令A280方法無法在管柱上料期間測量抗體貫流量。
拉曼分光光度計提供針對捕捉管柱上料輸出流(管柱流出液)中抗體之特定測量值。此測試法藉由將各種不同濃度之純化抗體API藥物(例如，阿達木單株抗體)加至集中之蛋白質A流出液中，模擬所提出之線上抗體測量。用於加料實驗之API樣品含有0.1% TweenTM。於直接加料實驗期間，TweenTM濃度係與抗體直接成比例變化，且可能在拉曼光譜校準期間誤會成抗體濃度。為了避免此現象，將TweenTM視為額外組分，並相對於抗體濃度獨立添加。因此該等組分係依如下範圍納入：TweenTM 0.1%至1.0%及阿達木單株抗體0.1至1.0 g/L。
可如實例6.5所述般獲得校準曲線。將以上建立之模型用於預測根據表4之濃度所製備樣品中含TweenTM與阿達木單株抗體之混合物之光譜：
將此等預測光譜與實際光譜對比，以確認該模型位於預定容忍限值內。結果示於圖32A至B中。
6.11.　抗體聚結物檢測法之測試
利用光誘發未改質蛋白質交聯(PICUP)，使兩種抗體(D2E7及ABT-874)分別聚結。將抗體曝露於聚結光源0至4小時(圖33及34)及藉由尺寸排除層析法(SEC)定量聚結物。樣品係藉由拉曼光譜法測量，並利用主組分分析法(PCA)(圖35及36)及部份最小平方分析法PLS(圖37A及37B)進行光譜建模。圖35及36顯示聚結樣品具有不同的主組分得分，且可利用拉曼光譜法，與聚結物區分。圖37A及37B顯示拉曼光譜法結果與SEC測量值之間之某些相關性。
各種不同公開案係經本文所引用，其等內容係以引用全文之方式併入本文。
100．．．進料泵
110．．．儲集器
120．．．進料流
130．．．進料泵
140．．．膜模組
150．．．通透物流
160．．．滯留物流
170．．．滯留閥
180．．．拉曼探測器
190．．．分析儀
圖1顯示習知層析流程圖相對於模擬移動床層析流程圖。
圖2顯示習知層析流程圖。
圖3顯示模擬移動床層析流程圖。
圖4顯示反映mAb X模擬移動床層析情況研究之結果之層析圖。
圖5顯示關於mAb X模擬移動床層析情況研究之產物回收及產物品質分析。
圖6顯示反映mAb Y模擬移動床層析情況研究之結果之層析圖。
圖7顯示關於mAb Y模擬移動床層析情況分析之產物回收及產物品質分析。
圖8顯示關於mAb X模擬移動床層析情況研究之mAb X%貫流分析。
圖9顯示關於mAb Y模擬移動床層析情況研究之mAb Y%貫流分析。
圖10顯示小型模場模擬移動床層析流程圖。
圖11顯示3組分(精胺酸/檸檬酸/海藻糖)緩衝系統之拉曼光譜，該系統包含胺基酸、pH緩衝物質及糖。此圖係利用Umetrics SIMCA P+ V12.0.1.0產生。X軸係數據點數值。各數據點係拉曼位移波數。其可與拉曼位移波數(cm-1)重新在在X軸上繪圖。數據始於波數1800(=Num 0)至800(=Num 1000)。拉曼光譜原始數據係以強度為單位(與掃描光子數量有關)。此圖顯示三種獨立組分(於水中)之平均中心光譜數據。光譜之平均值係0。其他值係與相對平均數之標準偏差有關。
圖12以隨機值顯示關於3組分緩衝系統(精胺酸/檸檬酸/海藻糖)之實際與預計濃度的對比。此圖係利用現有模型建立，以預測新溶液之濃度。x及y軸係濃度(mM)。
圖13依逐個組分分別顯示3組分緩衝系統(精胺酸/檸檬酸/海藻糖)之實際與預計濃度的對比。
圖14顯示4組分緩衝系統(甘露醇/甲硫胺酸/組胺酸/TweenTM)之純組分原始光譜。y軸係光強度，x軸係波數cm-1。
圖15顯示4組分緩衝系統(甘露醇/甲硫胺酸/組胺酸/TweenTM)之純組分原始光譜。y軸係光強度，x軸係波數cm-1。圖15係較圖14中所示光譜更為詳細之視圖，其中「指紋」區已被放大。
圖16顯示4組分緩衝系統(甘露醇/甲硫胺酸/組胺酸/TweenTM)之純組分SNV/DYDX/平均中心光譜。圖16中所示之數據係基於圖14至15中所示之相同數據在所有預處理後獲得：用於強度標準化之標準常態變量(SNV)、用於基線標準化之一階導數，及指定規度之平均中心。
圖17以隨機值顯示關於4組分緩衝系統(甘露醇/甲硫胺酸/組胺酸/TweenTM)之實際與預計濃度的對比。此圖係利用現有模型建立，以預測新溶液之濃度。
圖18依逐個組分分別顯示3組分緩衝系統(甘露醇/甲硫胺酸/組胺酸/TweenTM)之實際與預計濃度的對比。
圖19顯示關於含蛋白質之3組分緩衝系統(甘露醇/甲硫胺酸/組胺酸/阿達木單抗(adalimumab))之純組分原始光譜，其中原始光譜顯示拉曼強度。
圖20顯示關於含蛋白質之3組分緩衝系統(甘露醇/甲硫胺酸/組胺酸/阿達木單抗(adalimumab))之純組分原始光譜，其中詳細顯示指紋區(800至1700 cm-1)。
圖21顯示含蛋白質之3組分緩衝系統之純組分SNV/DYDX/平均中心。圖21中所示之數據係基於圖19至20中所示之數據在所有預處理後獲得：用於強度標準化之標準常態變量(SNV)、用於基線標準化之一階導數及指定規度之平均中心。
圖22依逐個組分分別顯示關於含有蛋白質之3組分緩衝系統之實際與預計濃度的對比。
圖23顯示以拉曼光譜法作為過程及/或品質控制之一部分時之阿達木單抗純化製程。
圖24顯示涉及緩衝劑、糖及胺基酸(甲硫胺酸/甘露醇/組胺酸)之三組分混合物之透析過濾方法的線上拉曼濃度預測。
圖25顯示涉及緩衝劑、糖及胺基酸(甲硫胺酸/甘露醇/組胺酸)之三組分混合物之重複透析過濾方法。納入額外數據點，以提高解析度。
圖26顯示糖(甘露醇)/蛋白質(阿達木單抗)溶液之拉曼校準。
圖27顯示透析過濾緩衝劑交換製程之線上拉曼濃度預測，其中抗體水溶液改由甘露醇溶液替代，以提供糖/蛋白質(甘露醇/阿達木單抗)溶液。由蛋白質濃度追蹤緩衝劑之交換過程。
圖28顯示圖27中所示實驗之重複，其中蛋白質濃度相延伸至180 g/L。
圖29顯示組胺酸及阿達木單抗溶液之拉曼校準。
圖30顯示透析過濾緩衝劑交換過程之線上拉曼濃度預測，其中蛋白質水溶液改以組胺酸溶液替代。由阿達木單抗濃度追蹤組胺酸之交換過程。
圖31A至C依逐個組分分別顯示關於含有蛋白質之2組分緩衝系統之實際與預計濃度的對比：A. Tris濃度；B.乙酸鹽濃度及C.阿達木單抗濃度。
圖32A至B依逐個組分分別顯示關於含有蛋白質之1組分緩衝系統之實際與預計濃度的對比：A. TweenTM濃度；及B.阿達木單抗濃度。
圖33顯示當利用光誘導未經改質之蛋白質交聯(PICUP)使兩種抗體(D2E7及ABT-874)分開聚結時所採用之條件。將該等抗體曝露於聚結光源下0至4小時。
圖34顯示圖33中提及之交聯之尺寸排除層析結果。
圖35顯示D2E7樣品之拉曼光譜及利用主組分分析建模之光譜，說明經聚結之樣品具有不同主組分得分，且可利用拉曼光譜與聚結物區分。
圖36顯示ABT-874樣品之拉曼光譜及利用主組分分析建模之光譜，說明經聚結之樣品具有不同主組分得分，且可利用拉曼光譜與聚結物區分。
圖37A至B顯示(A)D2E7樣品及(B)ABT-974樣品之拉曼光譜及利用部份最小平方分析建模之光譜，說明拉曼光譜結果與SEC測量之間之某些關係。
(無元件符號說明)

Claims (7)

  1. 一種自包含標的蛋白質及至少一種宿主細胞蛋白質(HCP)之樣品混合物製造已減少HCP之標的蛋白質製劑之方法，該方法包括：(a)由該樣品混合物進行拉曼光譜分析；(b)使該樣品混合物接觸層析樹脂，以將該樹脂上料至其飽和結合容量之約50%至100%；及(c)收集層析樣品；及(d)由該層析樣品進行拉曼光譜分析，以確認其係已減少HCP之標的蛋白質製劑。
  2. 如請求項1之方法，其中該層析樹脂係選自由親和性層析樹脂、離子交換層析樹脂及疏水相互作用層析樹脂組成之群。
  3. 如請求項1之方法，其中該標的蛋白質係選自由以下物質組成之群：酶、肽激素、多株抗體、人類單株抗體、人化單株抗體、嵌合型單株抗體、單鏈抗體、Fab抗體片段、F(ab')2抗體片段、Fd抗體片段、Fv抗體片段、單離之CDR、雙功能抗體及免疫黏附素。
  4. 如請求項1之方法，其中將該層析樹脂填充至一系列藉由包含入口閥及出口閥之流體導管分隔之流體連接管柱中，其中該等流體連接管柱之數量係選自由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12個管柱組成之群。
  5. 如請求項1之方法，其中使該樣品混合物接觸該層析樹脂，以獲得選自由以下所組成群中之滯留時間：至多約0.5分鐘、至多約1分鐘、至多約2分鐘、至多約3分鐘、至多約4分鐘、至多約5分鐘、至多約6分鐘、至多約7分鐘、至多約8分鐘、至多約9分鐘、至多約10分鐘、至多約11分鐘及至多約12分鐘。
  6. 如請求項1之方法，其進一步包括於使該層析樹脂與該樣品混合物接觸前平衡該層析樹脂，及於與該樣品混合物接觸後清洗該層析樹脂之步驟，其中平衡緩衝劑及清洗緩衝劑係相同緩衝劑。
  7. 如請求項1之方法，其進一步包括層析樹脂之清洗、溶離及再生步驟，其中此等步驟係經計算及流程化，以維持該樣品接觸該層析樹脂之步驟佔該方法之時間之約20%至約80%。
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