JP6010030B2 - 疑似移動床クロマトグラフィーを使用する抗体の精製 - Google Patents
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Description
本発明は、改善された疑似移動床(「SMB」)分離ストラテジー、及び特定の実施形態においてはラマン分光法を使用する、抗体、例えばモノクローナル抗体(「mAbs」)のクロマトグラフィー精製のための組成物及び方法に関する。
タンパク質精製ストラテジーは、最終精製タンパク質調製物から宿主細胞タンパク質(「HCP」)を排除するために、1つ又は複数のクロマトグラフィー分離ステップを一般的に使用する。このようなクロマトグラフィー分離ステップは、伝統的に、「バッチモード」で実施されており、これは、特定のクロマトグラフィー支持体を充填した単一カラムが、逐次的に、平衡化され、ローディングされ、洗浄され、溶離され、次いで再生される。バッチモードクロマトグラフィーは、カラムをこの飽和容量までローディングするのではなくカラムの動的容量までしかローディングしないことに依存しており、ローディング及び分離の各サイクルは、カラムの実際の結合容量のわずか30%から50%の使用しかしていない。従って、バッチモード分離は、カラムがこれらの飽和容量で操作された場合に必要とされるであろうよりも2倍から3倍の容量を有するカラムの使用を必要とする。従って、カラムの実際の結合容量の30%−50%しか利用しないことによって、バッチモードクロマトグラフィーは、著しく大量のクロマトグラフィー分離支持体の使用を必要とし、ローディング及び分離の各サイクルを完了するために必要な時間を延ばし、これは、タンパク質精製に関連するコストを実質的に増加させる。さらに、分離が飽和容量で実施された場合に必要であろうよりも2から3倍の容量を有するカラムの使用は、単一の分離サイクルに使用される平衡化緩衝液、洗浄緩衝液及び溶離緩衝液の量の著しい増加をもたらし、追加のコスト及び時間非効率をもたらす。
特定の実施形態において、本発明は、宿主細胞タンパク質(HCP)を減少させた目標タンパク質調製物を、目標タンパク質及び少なくとも1種のHCPを含む試料混合物から生成する方法を対象とする。特定の実施形態において、本発明の方法は、樹脂が、この飽和結合容量の約50%超、約60%超、約70%超、約80%超及び約90%超を含む約50%−100%までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含み、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記HCPを減少させた目標タンパク質調製物を含む。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる1種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び/又は決定するために使用される。
本発明は、改善された疑似移動床分離ストラテジーを使用する抗体、例えばモノクローナル抗体などのクロマトグラフィー精製のための組成物及び方法に関する。明確にするためにまた限定するものでなく、この詳細な説明は、以下の下位部分に分けられる。
5.1.定義;
5.2.抗体の作製;
5.3.抗体の生成;
5.4.抗体の精製;
5.5.例示的精製ストラテジー;及び
5.6.ラマン分光法
用語「抗体」には、ジスルフィド結合によって相互連結された4本のポリペプチド鎖、2本の重(H)鎖及び2本の軽(L)鎖からなる免疫グロブリン分子が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書でHCVR又はVHと短縮される)及び重鎖定常領域(CH)からなる。重鎖定常領域は、3種のドメイン、CH1、CH2及びCH3からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書でLCVR又はVLと短縮される)及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、1種のドメイン、CLからなる。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存されている領域がちりばめられている相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに再分割することができる。各VH及びVLは、次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された3種のCDR及び4種のFRからなる。
本節において使用される用語「抗体」は、完全抗体又はこの抗原結合フラグメントを意味する。
本発明の抗体を発現するために、部分又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするDNAを、遺伝子が、転写及び翻訳調節配列に操作可能に連結(operatively link)するように1種又は複数の発現ベクターに挿入する。(例えば、その全体の教示を、参照により本明細書に組み込む米国特許第6,914,128号を参照されたい。)これに関連して、用語「操作可能に連結された」は、抗体遺伝子を、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、該抗体遺伝子の転写及び翻訳を調整することのこれらの意図された機能に役立つようにベクターにライゲートすることを意味するよう意図されている。発現ベクター及び発現調節配列は、使用される発現宿主細胞に適合するよう選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ又はより一般的には、両方の遺伝子を同一の発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子を、標準の方法で発現ベクターに挿入する(例えば、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション又は制限部位が存在しない場合の平滑末端ライゲーション)。抗体又は抗体に関連する軽鎖又は重鎖配列の挿入の前に、発現ベクターが、抗体定常領域配列を既に有する場合がある。例えば、特定のVH及びVL配列を完全長抗体遺伝子に変換する一つのアプローチは、それぞれ、VHセグメントが、該ベクター内のCHセグメント(複数可)に操作可能に連結され、VLセグメントが、該ベクター内のCLセグメントに操作可能に連結されるように、重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター中にこれらを挿入することである。さらに又は別法として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム単位で連結するようにベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)であってよい。
5.4.1 抗体の精製全般
本発明は、抗体及び少なくとも1種のHCPを含む混合物から精製された(又は「HCPを減少させた」)抗体製剤を生成する方法を提供する。抗体が、上述された方法及び当技術分野における通常の方法を使用して生成される場合、本発明の精製プロセスは、分離ステップにおいて開始する。表1は、精製スキームの一実施形態を要約している。それだけには限らないが、イオン交換ステップの順序が逆転された変形を含む本スキームの変形が想定され、本発明の範囲に含まれる。
上に概要が記載されたとおり、抗体の精製は、一般的に、1つ又は複数のクロマトグラフィー分離ステップを組み込む。このようなクロマトグラフィー分離ステップは、伝統的に、バッチモードで実施されているが、このようなバッチモード分離は、精製プロセスに著しい非効率を持ち込む場合がある。例えば、バッチモードにおけるクロマトグラフィーカラムの使用は、カラムが、これらの動的容量だけローディングされることしか求めないので、バッチモードは、カラムがこれらの飽和容量までローディングされた場合と比べて2倍から3倍多くの樹脂の使用を必要とする。タンパク質クロマトグラフィー樹脂は、しばしば非常に高価であるため、この非効率は、全体コストを大きく増加させ得る。さらに、バッチカラムクロマトグラフィーにおける洗浄及び溶離プロセスは、かなりの流体体積を必要とし、これは、精製プロセスのコストを増加させるのみならず、このような分離を終えるために必要な時間をかなり増加させる。
特定の実施形態において、SMB分離プロセスは、一連のタンパク質Aカラムを使用する。一つの特定の限定されない例において、SMB分離プロセスは、4個のタンパク質Aカラムを使用する。特定の実施形態において、4個のタンパク質Aカラムは、1.6cmの直径及び5cmの高さを有し、MabSelectタンパク質A樹脂が充填されている。代わりの実施形態において、追加のカラム、例えば、5、6、7、8、9又は10個のカラムを使用することができ、カラムは、実質的により大きな直径及び高さのもので、最大約2、最大約3、最大約4、最大約5、最大約6、最大約7、最大約8、最大約9、最大約10、最大約11、最大約12、最大約13、最大約14、最大約15、最大約16、最大約17、最大約18、最大約19、最大約20、最大約25、最大約30、最大約40、最大約50、最大約60、最大約70、最大約80、最大約90、最大約100リットル又はこれより大きいローディングカラム体積となるものであってよい。
ラマン分光法は、物質への単色の入射光は、固有の様式で、反射、吸収又は散乱され、これは、放射を受ける特定の分子又はタンパク質によって決まるという原理に基づく。大部分のエネルギーは同じ波長で散乱されるが(Rayleigh散乱)、少量(例えば10−7)の放射が、いくらか異なる波長で散乱される(Stokes及びAntistokes散乱)。この散乱は、回転、振動及び電子準位遷移と関係がある。散乱光子の波長の変化は、化学的及び構造的な情報を提供する。
6.1.事例研究:mAb X
供給流れとしてmAb Xプロセス中間体及び親和性クロマトグラフィー樹脂として一般的なアガロースベースの親和性タンパク質Aクロマトグラフィー媒体を使用して、事例研究を実施した。合計8サイクルを4個のカラムを用いて実施した。カラムをそれぞれ飽和までローディングし、図4は得られたクロマトグラムを示している。偶数のUVピークは溶離を示し、奇数のUVピークはローディング直後の洗浄1を示している。
供給流れとしてmAb Yプロセス中間体及び親和性クロマトグラフィー樹脂として一般的なアガロースベースの親和性タンパク質Aクロマトグラフィー媒体を使用して、事例研究を実施した。合計8サイクルを4個のカラムを用いて実施した。カラムをそれぞれ飽和までローディングし、図6は得られたクロマトグラムを示している。偶数のUVピークは溶離を示し、奇数のUVピークはローディング直後の洗浄1を示している。
これらの緩衝液を全てのSMB運転のために使用した。
第2のSMB分離をmAb Xを使用して実施した。この分離において、mAb Xは、化学的に定義された培地に存在した。合計8サイクルを4個のカラムを用いて実施した。カラムは、それぞれ飽和までローディングした。次の緩衝液を全てのSMB運転のために使用した。
上記のタンパク質Aプロセスをパイロット規模に拡大し、mAb Z分離との関連で使用した。3個のカラム(各直径10cm×高さ8cm、785mL)にタンパク質Aクロマトグラフィー支持体を充填した。上記に概略が記された小規模の分離と同様に、カラムの切り替えは、手動で操作した。3個のカラムのみを用いて、ワークフローを図10に描いたとおり実施することができる。
アルギニン、クエン酸及びトレハロースの所定の混合物を含む製剤緩衝液を、水溶媒を用いて調製した。成分は0から100mMまで多様であった。
実施例6.5の方法を、4成分を含む製剤緩衝液に適用し、ここで、成分は、マンニトール、メチオニン、ヒスチジン及びTween(商標)(ポリソルベート80)であった。所定の混合物の測定したスペクトルを図14−16に示す。波数は、Far−IR領域からMid−IR領域の範囲に及ぶ。サファイアカバーによる制限のために、100−800cm−1の範囲を、この特定の例において無視してよく、較正は、800−1800cm−1で行う。
6.7 タンパク質を含む3成分製剤緩衝液の試験
実施例6.6の方法を、0から100mg/mlの範囲の濃度におけるタンパク質と共に3成分を含む製剤緩衝液に適用した。成分は、マンニトール、メチオニン、ヒスチジン及びD2E7(アダリムマブ)であった。所定の混合物の測定したスペクトルを図19−21に示す。
アダリムマブの溶液に添加剤を導入するために、図23に示された限外濾過/ダイアフィルトレーションプロセス(UF/DF)を確立する。フィードポンプ(100)は、接線流濾過薄膜を通る直交流を提供し、容器中のアダリムマブ含有溶液を薄膜に通す。ダイアフィルトレーション緩衝液(メチオニン、マンニトール及びヒスチジンを含む製剤緩衝液)を、薄膜の濾過速度に適合させるために容器にポンプで注入する(薄膜の透過水側を流れる液体)(110)。フィードタンクを出る供給流れ(120)は、ポンプ(130)によって薄膜モジュール(140)に向けられる。比較的より小さな分子サイズを有する水、緩衝液成分などを含む透過水流れ(150)は、薄膜モジュールを通過する。濃縮されたアダリムマブを含む濃縮水流れ(160)は、濃縮水バルブ(170)によって制御されて、再びフィードタンクに向けられる。
実施例6.5の方法を、2成分、トリス及びアセテート及びタンパク質、アダリムマブを含む製剤緩衝液に適用した。成分を、次の範囲:トリス50−160mM;アセテート30−130mM;及びアダリムマブ4−15g/Lで含んだ。
実施例6.5の方法を、成分、Tween(商標)及びタンパク質、アダリムマブを含む化学的に定義された細胞培養培地回収物に適用した。細胞培養培地を、細胞培養バッチから回収し、濾過し、タンパク質Aカラムにローディングした。タンパク質Aカラムの貫流を集め、次いで貯蔵及び試験の前に除菌濾過した。
2種の抗体(D2E7及びABT−874)を、非修飾タンパク質の光誘起架橋(PICUP)を使用して別々に集合させた。抗体を、0−4時間(図33及び34)、集合を起こす光源に曝露し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって集合体を定量化した。試料を、ラマン分光法によって測定し、スペクトルを、主成分分析(PCA)(図35及び36)及び部分的最小二乗解析PLS(図37A及び37B)を使用して模擬実験した。図35及び36は、集合した試料が明確な主成分の痕跡を有し、ラマン分光法を使用して集合体から分別することができることを示している。図37A及び37Bは、ラマン分光法の結果とSEC測定の間のいくらかの相関関係を示している。
Claims (9)
- 宿主細胞タンパク質(HCP)を減少させた目標タンパク質調製物を、目標タンパク質及び少なくとも1種のHCPを含む試料混合物から生成するための方法であって、前記方法は、
(a)前記試料混合物のラマン分光分析を実施するステップ;
(b)親和性クロマトグラフィー樹脂がこの飽和結合容量の約50%−100%までローディングされるように、前記試料混合物を該樹脂に接触させるステップ;
(c)クロマトグラフィー試料を回収するステップ;及び
(d)前記クロマトグラフィー試料のラマン分光分析を実施して、前記クロマトグラフィー試料がHCPを減少させた目標タンパク質調製物であることを確認するステップであって、該目標タンパク質が抗体又はその抗原結合部分であるステップ
を含む方法。 - 試料混合物を、イオン交換クロマトグラフィー樹脂及び疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される追加的なクロマトグラフィー樹脂にかける、請求項1に記載の方法。
- 目標タンパク質が、ポリクローナル抗体;ヒトモノクローナル抗体;ヒト化モノクローナル抗体;キメラモノクローナル抗体;一本鎖抗体;Fab抗体フラグメント;F(ab’) 2 抗体フラグメント;Fd抗体フラグメント;Fv抗体フラグメント;及びダイアボディーからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- クロマトグラフィー樹脂が、入口及び出口バルブを含む流体管により分離された一連の流体接続されたカラムに充填されており、ここで、流体接続されたカラムの数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12本のカラムからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 最長0.5、最長1、最長2、最長3、最長4、最長5、最長6、最長7、最長8、最長9、最長10、最長11及び最長12分からなる群から選択される滞留時間を得るように、試料混合物をクロマトグラフィー樹脂に接触させる、請求項1に記載の方法。
- 試料混合物との接触前にクロマトグラフィー樹脂を平衡化するステップ及び試料混合物との接触後にクロマトグラフィー樹脂を洗浄するステップをさらに含み、ここで、平衡化緩衝液及び洗浄緩衝液は同一の緩衝液である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)の後、及びステップ(c)の前に、クロマトグラフィー樹脂洗浄ステップ、溶離ステップ及び再生ステップをさらに含み、ここで、試料をクロマトグラフィー樹脂に接触させるステップが方法の時間の20%から80%であるように保つために、クロマトグラフィー樹脂洗浄ステップ、溶離ステップ及び再生ステップを計算及びプログラムすることができる、請求項1に記載の方法。
- 親和性クロマトグラフィー樹脂がタンパク質Aを含む、請求項1に記載の方法。
- 抗体又はその抗原結合部分がアダリムマブである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
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