TW201304797A - 抗新型流行性感冒病毒劑 - Google Patents

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Abstract

一種抗新型流行性感冒病毒劑，其特徵係以使用50%乙醇水萃取光皮木瓜，並藉由將其萃取液進行管柱區分以精製而得之萃取物作為有效成分。

Description

抗新型流行性感冒病毒劑
本發明係關於以具有新型流行性感冒病毒之感染抑制作用之來自植物的萃取物作為有效成分之抗新型流行性感冒病毒劑、新型流行性感冒病毒紅血球凝集之抑制劑、新型流行性感冒病毒對細胞之吸附抑制劑。
幾乎毎年引起流行性感冒之流行的流行性感冒病毒係具有直徑1萬分之1公釐左右之外膜的RNA病毒。由其抗原性的不同係分類成A、B、C之3型，可見流行蔓延的係A型、B型。該等病毒粒子表面，係有紅血球凝集素(HA)與神經胺糖酸酶(NA)之2種糖蛋白呈棘狀突出，內部存在有分段為8條的基因RNA。於病毒表面之HA與NA會在同一亞型內頻繁地引起突變，幾乎毎年會出現新的抗原變異株。
由咳嗽之飛沫噴出之流行性感冒病毒會由人的鼻子或嘴巴侵入，藉由病毒表層之棘狀糖蛋白質HA而吸附於上呼吸道之黏膜上皮細胞，對細胞侵入後開始增殖。藉由近年的研究，病毒的感染機制已臻明確。病毒係結合於存在於人類標的細胞表層之糖鏈所構成的受體，被攝入內體(endosome)，藉由病毒膜與內體膜之融合而侵入細胞內，經過脫殼/轉移，會發生病毒基因之表現與複製，最後藉由從宿主細胞膜出芽，形成後代病毒粒子而增殖。
由流行性感冒病毒之感染，於數天會出現突然發燒、頭痛、關節痛、全身倦怠感等症狀，在其前後會出現咳嗽或喉嚨痛、鼻水、鼻塞等呼吸器症狀。與所謂的感冒不同地，其特徵為感染力強，在短期間會引起爆發性的流行。又，流行性感冒病毒之HA蛋白質的構造每年會反覆突變，由過去的感染所產生的抗體並無很大之作用，此亦為感染蔓延的要因。
為了抑制流行性感冒病毒之感染，考慮了對上皮細胞之吸附的阻礙、對細胞之侵入的阻礙、基因轉錄/複製之抑制、蛋白質之合成阻礙、由細胞放出之抑制等，分別成為抗病毒藥之標靶。至今為止，開發出了阿曼他丁(amantadine)、金剛乙胺(rimantadine)、瑞樂沙(zanamivir)等抗病毒藥，但報告了有過敏症、神經精神症狀、消化器系症狀、自律神經系症狀等副作用，關於其應用需要注意。
又，從流行性感冒病毒係於呼吸道黏膜上皮感染、增殖，或其當年之流行型無法正確預測來看，藉由疫苗接種來抑制感染亦為困難。目前最有效的預防策略被認為是頻繁的漱口、與避免喉嚨乾燥、充分的營養與休息等。期望感染抑制效果高、且無安全性問題，可於日常生活中利用的抗流行性感冒病毒劑之開發。
近年來，作為來自天然物之抗流行性感冒材料，報告有茶或紅茶之多酚成分(非專利文獻1及2)、藉由使用人之試驗明確知道紅茶的漱口實際上會抑制病毒感染(非專 利文獻3)。又，亦報告了來自黃苓根之類黃酮成分，藉由病毒之唾液酸酶阻礙活性而會顯示流行性感冒感染抑制效果(非專利文獻4)。進一步地，中藥製劑之桂枝二越婢一湯(專利文獻1)、黑醋栗萃取物(專利文獻2)、馬鈴薯花青素色素(專利文獻3)、番石榴葉萃取物(專利文獻4)、羅布麻萃取物(專利文獻5)、橄欖葉萃取物(專利文獻7)等的抗病毒效果亦有被報告。
又，薔薇科植物中，以其花蕾或花瓣之萃取物作為有效成分之抗流行性感冒劑亦被揭示(專利文獻6)，有報告光皮木瓜之萃取物(專利文獻8)、光皮木瓜之管柱區分物(專利文獻9、非專利文獻5)之抗流行性感冒病毒效果、溶斑試驗法之光皮木瓜區分物對新型流行性感冒病毒之感染抑制效果(非專利文獻6)、進而，光皮木瓜萃取物會抑制流行性感冒病毒所導致之紅血球凝集(非專利文獻7)。
光皮木瓜(Chaenomeles sinensis)係中國原產的落葉性喬木，果實部分係做成光皮木瓜酒或砂糖漬、糖漿等而食用。該果實稱為木瓜果，係作為以去痰、鎮咳、鎮痛等為藥效之中藥而被處方。進行光皮木瓜果實中藥效成分之鑑定，報告有齊墩果酸(oleanolic acid)等三萜類作為對咽頭炎原因菌之溶血性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的抗菌性成分，報告有高分子多酚類作為抗發炎成分。本發明者等人，報告了光皮木瓜果實中之高分子多酚類對季節性流行性感冒病毒之紅血球凝集抑制效果與感染抑制效果(專利文獻9)。
但是，並無如本案發明專利所示之關於光皮木瓜的管柱區分物會抑制新型流行性感冒病毒所導致之紅血球凝集的效果、及新型流行性感冒病毒對細胞的吸附抑制效果的報告，其係藉由本願發明而初次解明。流行性感冒幾乎毎年反覆流行，有時會引起稱作大流行(pandemic)之世界性大流行。2009年3月，起於墨西哥而發生之H1N1新型病毒造成的流行性感冒亦為其中之一。此次，於光皮木瓜萃取物中觀察到了對新型流行性感冒病毒A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm之紅血球凝集抑制效果及感染抑制效果。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開平6-199680號公報
[專利文獻2]日本特開2000-212092公報
[專利文獻3]日本特開2001-316399公報
[專利文獻4]日本特開2000-273048公報
[專利文獻5]日本特開平11-71296號公報
[專利文獻6]日本特開2002-145790公報
[專利文獻7]日本特表2002-020305公報
[專利文獻8]日本特開2005-343836號公報
[專利文獻9]PCT/JP2010/005762說明書
[非專利文獻]
[非專利文獻1]感染症學雜誌，68(7)824-829(1994)
[非專利文獻2]感染症學雜誌，70(11)1190-1192(1996)
[非專利文獻3]感染症學雜誌，71(6)487-494(1997)
[非專利文獻4]Chem.Pharm.Bull.38(5)1329-1332(1990)
[非專利文獻5]Journal of Ethnopharmacology,118,108-112(2008)
[非專利文獻6]Foodnews、43(1)155-157(2009)
[非專利文獻7]J Agric.Food Chem.53,928-934
本發明之目的為使用日常可安心使用的安全性高之植物萃取物，提供新型流行性感冒病毒感染抑制劑、新型流行性感冒病毒導致之紅血球凝集的抑制劑、新型流行性感冒病毒對細胞吸附之抑制劑。
為了解決上述課題，本發明者等人著眼於無副作用且安全性高的光皮木瓜，發現了添加新型流行性感冒病毒之MDCK細胞中之光皮木瓜萃取物、亦即光皮木瓜果實中之富含多酚之區分(fraction)(CSD3)，對新型流行性感冒病毒A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm有感染性中和活性；及發現了屬光皮木瓜的部分之物(CSD3)對新型流行性感冒病毒有紅血球凝集抑制效果，而完成了本發明品。
亦即，本發明係一種新型流行性感冒病毒感染抑制 劑、新型流行性感冒病毒感染細胞中之紅血球凝集抑制劑、新型流行性感冒病毒對細胞之吸附抑制劑，其特徵係以光皮木瓜(Chaenomeles sinensis,Pseudocydonia sinensis)之萃取物作為有效成分。進一步地，本發明係一種具有抗新型流行性感冒病毒作用之飲食品，其係含有光皮木瓜萃取物。
本發明係以安全性高的光皮木瓜萃取物作為有效成分，且提供對新型流行性感冒病毒之強的流行性感冒病毒感染抑制劑、流行性感冒病毒感染細胞中之紅血球凝集抑制劑、新型流行性感冒病毒對細胞之吸附抑制劑者。又，本發明之有效成分之光皮木瓜萃取物其安全性高，故藉由吸附、含浸、添加於口罩、冷氣濾網、衣物、濕紙巾、噴液等，能夠作為新型流行性感冒病毒感染抑制用品而在日常生活中廣為利用。進一步地，亦可添加於口香糖、糖果、錠糖、飲料等飲食物，而作為具有抗新型流行性感冒病毒作用之飲食物而於日常利用、攝取。本發明品係有效於新型流行性感冒病毒之感染預防、或起因於新型流行性感冒病毒之疾病的治療。
本發明品原料的光皮木瓜中，較佳為使用該果實。
由上述植物之粉碎物中得到本發明之萃取物的方法無 特殊限定，係添加水、甲醇、乙醇、正丙醇以及正丁醇等低級醇；醚；乙酸乙酯；丙酮；甘油；丙二醇等有機溶劑之1種或2種以上的混合溶劑，藉由習知所進行之萃取方法來萃取。但是，考慮到將本發明之抗流行性感冒病毒劑經口攝取時，就安全性方面來看，較佳為使用乙醇或其混合液來萃取。
萃取條件雖無特殊限制，但較佳為50~90℃、1~5小時左右。過濾萃取液，餾除萃取溶劑後，可使用於減壓下經濃縮或冷凍乾燥者。又亦可使用將該等萃取物藉由有機溶劑區分、層析法等而經區分精製者。
本發明品之利用形態並無特殊限制，可藉由於作為有效成分之例示的植物萃取物中添加溶劑、分散劑、製劑用載體、乳化劑、稀釋劑、安定劑等，而調製為散劑、錠劑、片劑(troche)、吸入劑、漱口藥、含漱劑、栓劑、注射劑等任意製劑，投予路徑可例示經口投予、呼吸道投予、靜脈內投予、直腸投予、皮下投予、皮內投予等。此時對成人的投予量以各萃取物10~2000mg/日，但不限制於此值。萃取物對各種製劑之萃取物添加量雖隨著該製劑形態不同而相異，但適合為以0.001重量%以上、較佳成為約0.01重量%以上的比例之方式來添加。
又，藉由將本發明吸附、含浸、添加於口罩、冷氣濾網、衣物、濕紙巾、噴液等，可提供能夠對流行性感冒預防做出貢獻的感染抑制用品。該等用途中之植物萃取物的吸附、添加量，雖依照該感染抑制用品的形態而相異，無 法一概規定，但適合以成為0.001~5重量%之比例的方式來添加。
又，本發明之安全性高，故能夠摻混於例如口香糖、糖果、錠糖、橡皮糖、巧克力、餅乾等甜點；冰淇淋、雪泥等冷甜點；飲料、湯、果醬等飲食物而於日常中利用。添加量雖隨其利用形態及萃取物之口味呈現性而相異，但適合以相對於飲食品為0.001~5重量%、較佳成為約0.01~1重量%之比例的方式來添加。
[實施例]
以下舉出實施例、試驗例來更具體地說明本發明，但本發明並不受該等所限定。
[實施例1] 細胞株及病毒之調製
細胞係使用Mardin-Darby canine kidney(MDCK)細胞，以含有10%胎牛血清之Eagle’s minimum essential medium(EMEM)來培養。流行性感冒病毒係使用A/Udorn/307/72(H3N2)及A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm。A/Udorn/307/72係接種於發育雞蛋(11日卵)絨膜尿囊腔內使其增殖，而依Temperature-Sensitive Mutants of Influenza A/Udorn/72(H3N2)Virus.Virology 117,45-61(1982)所記載之方法來精製。A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm株係接種於MDCK細胞，於二氧化碳氣體培養機 (37℃、5%CO2)內使其增殖2天。以5,000rpm離心5分鐘，以其上清液為病毒液。
[實施例2] 光皮木瓜中之活性成分精製
光皮木瓜(C.sinensis Koehne)之乾燥果實係由中國湖北省的市場獲得。將乾燥果實100g以50%乙醇(700ml)回流萃取1小時，過濾後，藉由使萃取液減壓濃縮及冷凍乾燥，得到光皮木瓜之50%乙醇萃取物(CSE50)(23g)。藉由水使CSE50混濁，藉由Diaion HP-20(三菱化學)層析法(管柱：8×15cm)以5階段的含水乙醇(0%、20%、40%、60%、100%乙醇)溶出，得到CSD1(水溶出部分：14.5g)、CSD2(20%乙醇溶出部分：3.2g)、CSD3(40%乙醇溶出部分：3.7g)、CSD4(60%乙醇溶出部分：161mg)、CSD5(100%乙醇溶出部分：161mg)之5個部分。各部分中之縮合型多酚係使用(-)-epicatechin為標準品，藉由香草醛-鹽酸法定量。
[實施例3] 各光皮木瓜區分物之多酚含有量及感染中和價的測定
各部分之感染中和價，係使用A/Udorn/307/72(H3N2)，藉由溶斑法測定。於0.1ml之病毒液(1,000PFU/ml)中添加等量之區分物10倍階段稀釋液，於室溫反應30分鐘，將100μl接種於MDCK細胞(6孔盤)，於室溫使其吸 附60分鐘。吸附後，添加含有0.6%洋菜糖(agarose)、1.5%明膠、2.5μg/ml胰蛋白酶之Leibovitz’s L-15培養基(Life Technologies Japan Ltd.)1.6ml添加以固化。於34℃培養3天後，計測所出現之溶斑數，求得50%感染中和濃度(IC50)。病毒及區分物之稀釋係使用TGS(25mM Tris、140mM氯化鈉、5mM氯化鉀、0.7mM磷酸鈉12水合物、5.6mM葡萄糖、pH7.4)。
如實施例2方式，使光皮木瓜之50%乙醇萃取物使用DiaionHP-20以5階段之含水乙醇溶出，將區分為CSD1~5之各部分對A/Udorn/307/72(H3N2)之50%感染中和IC50及多酚含量示於表1。CSD3部分具有最高之感染抑制效果(IC50=0.8μg/ml)。又，CSD3之多酚含量為53.8%，係最高。
因此，以後之實驗中係使用CSD3來評估對新型流行性感冒病毒A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm之抗病毒效果。
a；對A/Udorn/307/72之50%感染中和濃度
b；以表兒茶素換算、n=3、平均值±標準偏差
[實施例4] 對CSD3處理之新型流行性感冒病毒A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm的紅血球凝集減少試驗
紅血球凝集力價(HA價)之測定係使用96孔盤來進行。以磷酸緩衝生理食鹽水製作各濃度之CSD3處理病毒的2倍階段稀釋液系列(50μl)，添加0.5%(v/v)雞紅血球50μl，於4℃靜置1小時後，判定紅血球凝集之有無，以顯示凝集之最高稀釋的倒數作為各病毒液之HA價。藉由HA價減少試驗來評估光皮木瓜CSD3部分之對新型流行性感冒病毒A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm的紅血球凝集抑制效果。添加與0.1ml之病毒液(HA價：32)等量之CSD3液(0：控制組，0.1、2、10、50、500μg/ml)，於室溫反應60分鐘後，測定HA價。
遵照上述方法，藉由紅血球凝集力價減少試驗來評估 CSD3處理之A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm的紅血球凝集抑制效果。紅血球凝集試驗係基於病毒表面之血球凝集素(hemagglutinin)與紅血球之受體結合的反應，係為評估病毒之受體結合能力的試驗。50μg/ml以上之CSD3中，係觀察到CSD3本身之紅血球凝集作用，因此對A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm之紅血球凝集力價減少試驗，係使用25μg/ml以下之CSD3來進行。1μg/ml以下時病毒的HA價與無處理之病毒同樣為16，並無觀察到紅血球凝集力價之減少。5μg/ml之處理時為8，減少為1/2。25μg/ml時則減少至未達檢測界限(2)(圖1)。由以上結果，可觀察到光皮木瓜區分物之抑制新型流行性感冒所導致之紅血球凝集效果、新型流行性感冒病毒對細胞之吸附抑制效果。
[實施例5] 對新型流行性感冒病毒A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm之CSD3的感染力價減少試驗
藉由感染力價減少試驗來評估光皮木瓜CSD3部分對新型流行性感冒病毒A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm之感染性中和效果。於0.1 ml之病毒液(2×107PFU/ml、HA價：32)中添加等量之CSD3液(0：控制組、0.1、2、10、50、500μg/ml)，於室溫反應60分鐘，藉油溶斑法及Tissue Culture Infectious Dose 50%(TCID50)法來測定感染力價。
i)溶斑法之測定
製作各濃度之CSD3處理病毒的10倍階段稀釋液系列，將100μl接種於MDCK細胞(6孔盤)，以前述方法來計數溶斑。感染力價係以PFU(plaque forming units)/ml表示。
ii)TCID50法之測定
以含有2.5μg/ml胰蛋白酶之MEM來製作各濃度之CSD3處理病毒的10倍階段稀釋液系列，將200μl接種於MDCK細胞(24孔盤)，於二氧化碳氣體培養機，37℃培養3天。培養後，藉由上清液中之紅血球凝集活性的有無來判定感染，求得TCID50量。
遵照上述方法，藉由溶斑法之感染力價減少試驗來評估感染中和活性。未處理之病毒的感染力價為1.0×107PFU/ml。藉由CSD3處理，確認了與用量隨動(dependent)的感染抑制效果，1μg/ml時感染力價減少至約2/3、25μg/ml時感染力價減少至約1/60、250μg/ml時感染力價減少至約1/10,000(圖2)。但是，有許多極小的溶斑，難以正確的計測，因此藉由TCID50法之感染力價減少試驗來評估。
TCID50法之測定結果，1μg/ml之CSD3處理時感染力價被抑制至約1/3、5μg/ml時感染力價被抑制至約1/10、25μg/ml時感染力價被抑制至約1/100、250μg/ml時感染力價被抑制至1/3,000(圖2)。又，與TCID50之評估同時地進行於顯微鏡下之細胞病變效果(Cytopathic effect：CPE)觀察之TCID50評估後，結果係完全一致。
5μg/ml之CSD3處理時，紅血球凝集力價之減少係約1/2，但感染力價之減少係約1/10。感染力價之減少，係為紅血球凝集力價之減少的5倍，暗示了CSD3主要係抑制新型流行性感冒病毒A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm之吸附以後的病毒增殖過程。
由以上結果，使用光皮木瓜中之活性部分CSD3，評估對新型流行性感冒病毒A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm之紅血球凝集抑制活性及感染性中和活性後，明確得知以5μg/ml之CSD3處理後之病毒，紅血球凝集力價減少至約1/2、感染性減少至約1/10。250μg/ml之處理時，感染力價減少至1/3,000。此等結果顯示光皮木瓜中之抗流行性感冒病毒活性成分，亦對H1N1新型流行性感冒病毒有效。進一步地，由感染性減少的幅度為紅血球凝集力價之減少幅度以上，暗示了病毒吸附階段以後的抑制作用存在。
使用實施例1中調製之光皮木瓜萃取物，調製漱口藥、吸入劑、片劑、噴液、口香糖、糖果、錠糖、飲料、粉末劑、錠劑、含漱劑、橡皮糖、巧克力、餅乾、冰、雪泥、湯、果醬、濕紙巾、口罩。以下作為實施例顯示其處方。
[實施例6] 漱口藥之處方
[實施例7] 吸入劑之處方
[實施例8] 片劑之處方
[實施例9] 噴液之處方
[實施例10] 口香糖之處方
[實施例11] 糖果之處方
[實施例12] 錠糖之處方
[實施例13] 飲料之處方
100.00重量%
[實施例14] 粉末劑之處方
[實施例15] 錠劑之處方
[實施例16] 含漱劑之處方
[實施例17] 橡皮糖之處方
[產業上之可利用性]
本發明藉由吸附、含浸、添加於口罩、冷氣濾網、衣物、濕紙巾、噴液等，可作為新型流行性感冒病毒感染抑制用品而在日常生活中廣泛地利用。進一步地，亦能夠添加於各種飲食物，而作為具有抗新型流行性感冒病毒作用之飲食物而在日常中利用、攝取。本發明品係有效於新型流行性感冒病毒之感染預防、或起因於新型流行性感冒病毒之疾病的治療。亦即，可期待作為感染預防材料，作為新產品開發之材料的應用。
[圖1]顯示光皮木瓜萃取物CSD3之紅血球凝集抑制效果的圖。
[圖2]顯示光皮木瓜萃取物CSD3之A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm感染性中和活性(溶斑法)的圖。
[圖3]顯示光皮木瓜萃取物CSD3之A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm感染性中和活性(TCID50法)的圖。

Claims (5)

  1. 一種抗新型流行性感冒病毒劑，其特徵係以光皮木瓜(Chaenomeles sinensis,Pseudocydonia sinensis)之萃取物作為有效成分。
  2. 一種抗新型流行性感冒病毒劑，其特徵係以使用50%乙醇水萃取光皮木瓜，並藉由將其萃取液進行管柱區分以精製而得之萃取物作為有效成分。
  3. 一種新型流行性感冒病毒所導致之紅血球凝集之抑制劑，其特徵係以使用50%乙醇水萃取光皮木瓜，並藉由將其萃取液進行管柱區分以精製而得之萃取物作為有效成分。
  4. 一種新型流行性感冒病毒對細胞之吸附之抑制劑，其特徵係以使用50%乙醇水萃取光皮木瓜，並藉由將其萃取液進行管柱區分以精製而得之萃取物作為有效成分。
  5. 一種具有抗新型流行性感冒病毒作用之飲食品，其係含有光皮木瓜萃取物。
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