TW201124537A - Isopropyl alcohol-producing bacterium and method for producing isopropylalcohol - Google Patents

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201124537 - 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係W於生產異邮的細狀使用該細 菌生產異丙醇的 方法。 【先前技術】 使用：等合成樹脂或石化製品的铃基礎原料，廣泛 H十減震器或食品容器、薄膜、醫療設備等。、 烯，因此，料製f的異丙醇’可經脱水步驟而變換為丙 先進國家為碳中性的丙稀的原料。依照京都議定書， .199。年降低5:，f見在°°:t 201弋年間將二氧化碳排出量比起 上極為重要。 ’反f的㈣由於其泛祕，在地球環境 將植物來源原料同化（anab〇 j i ze) ，揭^^ Γ異筛乂外尚含有丙，，因此為了作\:==中 ;從生一分離並除去，或將生異: 就將副生的丙酮變換為異丙醇的處理而t.， ίίίΞί trn7^ ^ 所使用的氫的量會增造成成I上=含量多’則為了氫化 因此，強烈需要降低由生產異丙醇 .的丙酮^量，使異轉的純度提高。—_生成物中 201124537 解糖系的主要酵素—即葡萄糖_6，酸 —的編碼基因發生缺失，而生產3^其、.、-义匍甸糖異構酶） 又，於日本特表_-52〇513^^酸乙ϊ的細菌。 魏異構酶的活性減少的酵母與使該酵載^^葡萄糖-6-比較’利用酵母生產多元醇時，維持巧、泰=口兀王缺失的酵母 =提高生紐树，若繼活性==== ’有人ί告:若將已導入2_去氧、装肌糖 麥照 了咖ai d Bl〇teeh祕gy.，129，p=:=^ 【發明内容】 [發明欲解決之課題] 得的=的=的量課題吏=^^^^^ 生產度生編醇為有用的 [解決課題的方法] 及生況而生’本發明之生產異丙醇的大腸菌 經去其葡萄糖+猶異構酶活性 氫酶L2=[:之生產異丙醇的大腸菌’其中葡萄糖-6,酸-1-去 [3] 如[1]或[2]之生產異丙醇的大腸菌，其中該 乙酸去_活性、異丙醇去氯酶活性、輔 姆Α ^私每,舌性、及硫解酶活性的大腸菌。 [4] 如[3]之生產異丙醇的大腸菌，其中前述乙醯乙酸去 活性、異丙醇去氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性，係 201124537 得。 種來/原的各酵素的編碼基因而獲 [5]如[3]之生產異丙醇的, 酶活性及異丙醇去氫酶活姓 囷^、中，前述乙醯乙酸去羧 酵素的編碼基因而i得，細菌來源的各 ⑻如m之生產異丙醇的大:素m因而獲得。 酶活性係藉由導入丙綱丁醇梭^的中乙醒乙酸讀 得，前述異丙醇去氯酶活性係^ 編碼基因而獲 大腸桿菌來源的各酵素 ===硫解酶活性係藉由導入 嚴糖非PTS基因』當]3,呈異丙醇的大腸菌，其中在 的大腸菌從植物來源==異会丙|含使用⑴〜⑺之生產異丙醇 【貫施方式】 [實施發明之形態] 經去=明;=異==產f編，酸異搆酶活性 萄糖原本具有的葡 生成，而以高純度生產異丙'醇。 此減低刎產物丙酮的 當中亦=代謝路徑 醇的純度提高1萄糖_6—魏里，物的異丙 .及異丙醇的生產性的見解。再者，吾 201124537 ===2化’在5巧生產上錢低副產物丙，的累 萄糖-6-雜里麻’至目則為止完全沒有朗過。因此，藉由葡 度，完全iSir。性的核化喊高生錄巾的異丙醇純 - 的：：===某 :=;=序列上產生改變者^ 本發明中「活性」或「能力的「 從寄主細菌的菌體外導入:菌=」= 又，本發明中，「寄主」係指接受 、 入的之生編醇的鳩的外導 糖-6,酸生成D-果糖-6—石粦酸的反應 葡4 素=¾班經= ==1破;)=。例如可利用破壞該酵‘ ί:=:ίΓ=結果，例如該基因無法轉 =的 …妹澤為構xe基因，或者經轉錄的^ 201124537 • 基因破壞株的製作，只要是可獲得該酵素或蛋白皙木矣招沾 破壞株的各種方法均可使用。基因破壞的方法已有各種方^被報 二（自然跡添加致變紫外線、照射放躲、隨機突^、 轉位，、部位專-性基因破壞〕’但是於能夠僅破壞某 因的觀點，較佳為利用相同重組的基因破壞 重、 、土 法及其應用’只要是該技術領域中具有 本發明中，生產異丙醇的大腸菌係指具備 =為:=組而受導入或改變的保有異== ΐΞί者Sr MU只要是使成為對象的大腸菌生產 以1例如賦料及異丙醇生產的酵素活性。本發明中， 去，i腸菌更佳為經賦予乙酿乙酸去麟活性、異丙醇 a u 酸去麟係指分_依_際生化學協會 ^此的酵素’例如丙酮丁醇梭桿时丨⑽咖咖 ^ ^cl〇stridium bei jerinckii) ^ ^者。、'’夕奇干固（BaciUus po1清xa)等芽孢桿菌屬細菌來 用從的基因，可利 仏考例如牙孢梭鹵屬細菌戎茧 + + 子又 π;:桿菌、多黏桿上===:= ί=丁=桿菌來源的基因_序== 中，兴丙醇去氫酶係指分類為依據國際生化學協會 201124537 會，之酵素編號U. h 8Q，催化從關生成里 丙醇的反應的酵素的總稱。 乂- , ^^^^aCClostridiu, beijerinckii)M 芽抱梭菌屬細菌來源者。 oeijennciao^ 發明之寄主細菌導入之異丙醇去氫酶的基因，可 從上述各來源生物獲得之具有異丙醇去氫酶之編 列的臟或依據其公知之驗基序列合成' 菌來源者，例如具有拜“ α :二輔會酶報? 輔酶a生成㈣乙_反應_/；^·。8，雜仗㈤乙酸基 如此的酵素，例如丙酮丁醇梭桿菌（Clostridium 氏梭8(c:1°stridium bei細滅⑴等芽孢 ^Rosebur.a ^test.naHs (Rosebur.a mtest^aH ) 寻R〇SebUria屬細菌、Faecallbacterium卿湖丨邱等^ F虫agal ibactenum屬細菌、糞球菌（c〇pr〇c〇ccus)屬細菌、布 ⑹等錐蟲屬、大腸桿菌（Escherichiacoll. 大^囷）寺大知桿菌屬細菌來源者。 . 發明之寄主細菌導入之輔酶A轉移酶的基因 ，得的具有輔酶a轉移酶的編碼基因的鹼i序 m康其公知的驗基序列合成的合成腦序列。較佳ΐ， 例如：具有丙^醇梭桿菌等芽孢梭菌屬細菌、Roseb也a者 intestinalis^% Roseburia^^g ^ Faecalibacterium Γ^Τ,11 ^Fa"calibactolu^^S > ^ ΪΓνΓ 等大腸桿菌屬細菌來源的基因的驗基序列 尤佳者，如牙孢梭藝細菌或大腸桿菌屬細菌來源者， 歹I^NA 丁醇梭桿菌或大腸桿菌來源的基因的驗基序 201124537 - ^發明中，硫解酶係指分類為依據國際生化學協會（ι.υ.Β)酵 素f員會報告的酵素編號2. 3.1. 9，催化從乙醯基輔酶A生成乙醯 乙酉&基輔S# A的反應的酵素的總稱。 .如此的酵素，例如丙酮丁醇梭桿菌（clostridium acet〇buty ljcum) 梭菌（Clostridium beijerinckii)等芽孢梭菌屬細 &1、大腸桿菌（Escherichia coli)等大腸桿菌屬細菌、親鹽桿菌 tHalobactenum sp. }細菌、生枝動膠桿菌⑸⑽⑽酬如⑷ 等菌勝團屬細菌、、根瘤菌種⑽iz〇biumsp )細菌、日本慢生根 ^菌（BmdyrMzobium慢生型根瘤菌屬細菌、、熱 帶念珠菌（Candida tropicalis)等念珠菌屬細菌、新月柄桿菌 (Caulobacter crescentus)等柄桿菌屬細菌、山丘鏈黴菌（如印 tomyces c〇liinus)等鏈黴菌屬細菌、糞腸球菌（Enter〇c〇ccus faecal is)等腸球菌屬細菌來源者。 對於本發明之寄主細菌導入之硫解酶的基因，可利用從上述 各來源生物獲得之具有硫解酶的編碼基因的驗基序列的臟或依 據其公知的鹼基序列合成的合成麵序列。較佳者，例如呈 酉同工醇，菌、拜氏梭菌等芽孢梭菌屬細菌、大腸桿菌等切桿 囷屬+細囷、親鹽桿紐細菌、生枝動膠桿菌等__細菌、根 瘤_細菌、日本慢生根瘤_慢生雜瘤賴細g、 珠菌屬細菌、新月柄桿菌等柄桿菌屬細菌、山丘鍵徽^ 鏈黴囷屬細菌、糞腸球麟腸球H屬細絲源之基因的驗基序列 更佳者’例如芽孢梭菌屬細菌或大腸桿菌屬細菌來源者， 尤^ ’為具有丙嗣丁醇梭桿菌或大腸桿菌來源的基因的鹼基序 上述4種酵素分別為選自於由芽孢梭_細®、芽抱 才干函屬細囷及大腸桿菌屬細菌構成之群組當中至少丨種 從ΐΐ活性的觀點為較佳’其中，乙酿乙酸去_及異丙醇去氫 輕為牙孢梭g屬細g來源、辅酶八轉移酶活性及硫解酶活性 菌屬細菌時，以及該等4種酵素均為芽孢梭菌屬細菌來 201124537 其中’本發明的4種酵素，於酵 . 丙酮丁醇梭賴、拜氏梭8或大 =^舰’較佳者各為 者係乙醯乙酸去羧酶為丙鲖丁 T之—的來源者，·更佳 酶及硫解酶各為丙酮丁醇梭桿菌：酵素、輔酶Α轉移 去氫酶為拜氏梭菌來源的酵來源的酵素、異丙醇 乙醯乙酸去_活性來自於_了^ =酵素，素活性的觀點， 活性來自於拜氏梭菌、輔酶A酶、U二，異丙醇去氫酶 腸桿菌尤佳。. 沾轉雜及硫解酶活性來自於大 本發明中’涉及異丙醇生產的 ^8 ^"a〇 W〇2〇〇9/〇°83^ 現即續-基因之表 在下表現也不啟動子，卩使料萄糖存 去氫酶（以下有時稱為4 D例如甘油醛3-碟酸 之啟動子。為APDH)之縣子或、__M基轉移酶 本考X明中，啟動子係指具有Sigma因子的 人 開始轉錄的部位。例如，大腸來源的GAPDH啟動1 Γ4δΓ細ber X02662的驗基序列資訊記載於驗基號^ (at〇Bin源的辅酶A轉移酶顧atoD及a⑽與硫解酶基因 1 Λ 削1〇取 V〇1.169 卯 42~52 “鄕 Sallus ίΪΐΙ♦人），因此#纽變atQD的啟動子，可_控制辅酶A 轉移酶基因與硫解酶基因的表現。 由此點，輔®^ A轉移酶活性及硫解酶活性為由寄主大腸菌 因獲得者時，由獲得充分的異丙醇生產能二S i ^將擔任兩酵素基_表現的啟動子取代為其他啟動子等而芦 =化兩酵素基因的表現。為了強化辅酶A轉移酶活性及硫解^ '而使用的啟動子，例如前述大腸桿菌來源的GAPDH啟動子等。 201124537 • 又’本發明中葡萄糖-6-填酸_1-去氫酶(Zwf)，係指分類為依 據國際生化學協會（I. U. B)酵素委員會報告的酵素編號 1.1.1. 49，催化從D-葡萄糖-6-磷酸生成D-葡萄糖酸-1, 5-内酯-6-磷酸的反應的酵素的總稱。 如此的酵素，例如：De i nococcus rad i oph i 1 us 等 De i noco ecus屬菌、黑麴菌（Aspergillus niger)、棘抱麴（Aspergillus aculeatus)專麴菌（Aspergi 1 lus)屬菌、Acetobacter hanseni i 專醋酸囷（Acetobacter)屬菌 '海棲熱袍菌（Thermotoga mari tima)等熱袍菌（Thermotoga)屬菌、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans)專隱球囷屬菌、盤基網柄菌（Dictyostelium disco ideum)專網柄菡屬菌、螢光假單胞菌（pseud〇m〇nas fluoresce ens)、銅綠單胞菌（pseud〇monas aeruginosa)等單胞菌屬、啤酒 酵母囷（Saccharomyces cerevisiae)等酵母（Saccharomyces)屬 、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium)等芽孢桿菌屬菌、大腸 桿菌等埃希氏菌（Escherichia)屬菌來源者。 本發明中使用的葡萄糖-6-碟酸-1-去氫酶(wf)的基因，可利 用從上述各來源生物獲得之具有硫解酶的編碼基因的鹼基序列的 DNA或依據其公知的驗基序列合成的合成醜序列。較佳者，例如 具有 Dei nococcus rad i oph ilus 等 Dei nococcus 屬菌、黑麴菌 (jsp^gilliis niger)、棘孢麴(Aspergillus acuieatus)等麴 菌屬菌、Acetobacter hansenii等醋酸菌屬菌、海棲熱袍菌 (Thermotoga mari t ima)等熱袍菌屬菌、新型隱球菌 (Cryptococcus neoformans)等隱球菌屬菌、盤基網柄菌 (Dictyostelium discoideum)寺網柄菌屬菌、螢光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens) ' 銅綠單胞菌（Pseud〇m〇nas aeruginosa)等單胞菌屬、啤酒酵母菌（Sacchar〇myces cerevisiae)等 Saccharomyces 屬、巨大芽孢桿菌（Baci丨lus megaterium)料抱桿_ g、大腸桿麟埃希氏g韻 因的驗基序列的DNA。更佳者，例如Dein〇c〇ccus屬菌、趨^ •醋酸菌制、熱袍、單胞菌屬、芽孢桿菌屬g、埃希 201124537 生物來源者’尤佳為具妓腸桿跡源的基因的驗基序 等酵素的活性’可為藉由從菌體外導入菌體内 啟動子活性強化或取 βΒ召=中糖非PTS，係、指微生物將嚴糖同化的—種機制。 ρΐ^ϋΛ見解/微生物將嚴糖同化的機制，可大別為嚴糖 JSCPhosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase 二===生 行嚴糖分解）、丁庶糖的碟酸化）、SCrB(於微生物内部進 磷酸化)5個因=成=制SCrA、Υ、β的表現)及ScrK(進行果糖的 當中ii菌在嚴糖㈣基因群 的大腸菌_糖的能力3 s 使用;、:從能以廉價且大量供給的嚴 來源株等姻W力的大，例如:仍株、B株、C株及其 中盘指微生物的嚴糖同化路徑當 5 Ccs：R)：

成的基因群。i t，為==(=)、薦糖透過酵素(cscB)構 的編碼上:其=效率的利嶋，較佳為僅具有-A 國際生化會2酶、cscA)，係指分類為依據 θ ( · ϋ·β)酵素委貝會報告之酵素編號3. 2」.26，催 201124537 • 化從蔗糖生成D_葡萄糖與D-果糖的反應的酵素的總稱。 遠酵素為K12株及B株等大腸菌原本未保有的酵素，八 蔑糖透過酵素、蔬糖水解酵素、果糖激酶及嚴糖專一,卜生抑制_ 非pts代謝路徑當中的一個酵素（參照Canadian J〇urnai '

Microbiology，（1991) ν〇1· 45, PP418-422)。本發明中，葬由喊 予=CscA ’尤其是僅賦予CscA，在菌體外將嚴糖或許是在^細 胞膜處分解為葡萄糖及果糖並釋出到細胞外，並經由 代 及果糖PTS於細胞質_酸化並攝入。其結果，能將果糖於 供給予果糖代謝系並進行利用解糖系的同化。 導入到本發明之寄主細菌的嚴糖水解酵素(轉化酶、 J因’可_從保有該酵素的生物獲得的具有隸水解酵素化 的編碼基因的驗基序列的醜、或依據其公知的驗基序 列，佳者，例如伊文氏桿菌屬菌（Erwinia)、 „屬囷(Proteus)、弧菌屬菌⑽ri〇)、農桿菌屬菌 (伽rium)、根瘤菌屬菌（Rhiz〇bium)、葡萄球菌屬菌 ylQCQCCUS) ’ 雙叉桿闕菌（Bifid〇bactenum)、 來源者，例如具有大腸捍⑽57株來源的基 心其^列的臟。尤佳為，具有大腸桿菌0157株來源的基因 T °x, cscA csca 囷體的胞外質的信號序列。 π功q 可利導入的抑制子蛋白質（㈣的基因， 物獲得的抑制子蛋白質(⑽）的編碼基 ^ ίίϊ 或依據其公知的驗基序列合成的合成醜 =歹J。紹土者’例如伊文氏桿菌屬菌（Erwinia)、變形桿 iCAgrobactenum). Ϊ ^1Um) ' SCEschench.a)*^ 佳為且有大t囷G157株來源的基因的驗基序列的臟。尤 對株來雜因的鹼基序列的腦。 ；又之寄主細菌導入的果糖激酶(CscK)的基因，可利 13 201124537 =有該酵素的生物獲得的具有果糖激酶(。娜的編碼基因的 4列的DNA、或依據其公知的鹼基序列合成的合成⑽A序列。 ^ f，利如伊文氏桿菌屬菌（Erwinia)、變形桿菌屬菌 鉬r μ弧菌屬菌（Vibri〇)、農桿菌屬菌（Agrobacterium)、 :，„(Rhizobium)、葡萄球菌屬 g(Staphyl〇c〇ccus)，雙叉 ^«(Bifidobacterium) ^ g(Escherichia)*^ J炎例如具有大腸桿菌。157株來源的基因的驗基序列的腿。尤 土…具有大腸桿菌0157株來源的基因的驗基序列的])舰。 mi，!!本發明之寄主細料人之餘透過酵素(Gs⑻的基因， i i f從财鱗素的生物獲得的具有餘透過酵素(GscB)的編 的驗基序列的DNA、或依據其公知的驗基序列合成的合成 列。較佳者，例如伊文氏桿菌屬菌（Erwinia)、變形桿菌屬 囷(=>teus)、弧菌屬菌（Vibri〇)、農桿菌屬菌（Agr〇bacterium)、 ”屬菌(Rhiz〇bium)、葡萄球菌屬菌(Staphyl〇c〇ccus)，雙叉 ^屬菌（Bifidobacterium)、大腸桿菌屬菌（Escherichia)來源 者、’例如具有大腸桿菌0157株來源的基因的鹼基序列的DNA。尤 佳為，大腸桿菌0157株來源的基因的驗基序列的⑽a。 、本务明中，蔗糖同化係指將蔗糖維持原狀態'低分子化或高 为子化，較佳為低分子化而攝取到生體内的能力，或者以代謝變 換為其他物質的能力。又，本發明中，同化包含將餘更加低分 子化的分解。詳言之，包含將蔗糖分解為D_葡萄糖與卜果糖。 酵素活性的導人，例如可利祕此f 4 _素的編碼基因使 用基因重組技術’從寄主細菌的菌體外導入菌體内而進行。此時， 導入的酵素基因，對於寄主細胞可為同種或異種其中之一。將基 因從菌體外導入菌體内時，需要的基因體DM的製備、DNA的切& 及連結、轉形 '聚合酶連鎖反應（PCR，p〇lymerase Chain Reaction)、作為引子的募核苷酸的設計、合成等方法，可利用該 技術領域之人^士熟知的通常方法進行。該等方法，記載於Sambr〇3, J.，et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second

Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，（1989)等。 14 201124537 體外活性的大腸菌’係指以某種方法從菌 例如將該;的大腸菌。該等大腸菌，可使用 術從菌體外導入菌體前述者同樣的基因重組技 酵素的==腸菌，係指利用某個方法使該 體外導入到者同樣的基因重組技術使用質體從菌 等方法製作 代為其他啟動子，藉此使酵素基因強表現 產显=:力大，係指無論原先是否具備從植物來源原料生 固方法而獲得具有從植物來源原料生產 里丙ϋ匕產ίί上ΐίί因的導入對象的大腸菌，也可以不具有 菌=生“力，只要是可進行上述各基_導人及改變的大腸 更有=生=予異丙醇生產能力的大腸菌，藉此，能 丨務tU!生產異丙醇的大腸菌，例如國際公開2009/00咖號 ίΓΐί賦予乙醒乙酸去叛酶活性、異丙醇去氫酶活性、輔 生、及硫解酶活性，能從植物_原料生產異丙醇 的異丙醇生成大腸菌等。 /、内砰- ^發明之生產異丙醇的方法’係包含使用上述生產異丙醇的 ^囷而從植物來源原料生產異丙醇者，亦即包含以下步驟者使 μΪΪ生產異丙醇的方法可使用的植物來源原料，為從植物獲 付的蛱源且只要是為植物來源原料即不特殊限制。本發明中，係 花、種子等器官、含此等的植物體、此 寺植物裔g的/刀解產物，又，植物體、植物器官、或由此等的分 15 201124537 解產物獲得的碳源當中在微生物培養 在植物來源原料。 」作為奴源利用者，也包含 包含在如此的植物來源原料中的 葡萄糖、果糖、木糖、***糖等糖類咬含 糖、 草木質分解產物 '纖纟《水解物等或該等tlir 源的甘油或脂肪酸在本發明中也可包含在碳源。σ又，植物油來 本發明中，植物來源原料，較佳者^穀'物 米、小麥、大豆、甘嚴、甜菜、棉等，作物、玉米、 料的使用形態，為未加工品、搾汁、14 1 '、、且σ，其作為原 也可僅為上述碳源的形態。尉^物寺’不特別限定。又， 培養步驟中’生產異丙醇的大腸菌 -般而言’藉由以含有植物來源原料 接觸’ 大腸菌而進行。 。養基坨養生產異丙醇的 植物來源原料與生產異丙醇的大 、 丙醇的大腸g的活性而有所不同，—般而視生產異 源原料的濃度’可定為以葡萄糖換算^ 植物來 物總質量為20質量％以下，從大腸菌 培養基通常添加的量添加即可，無特'it ’以對於微生物的 類及i性丙量’視大腸菌的種 的量’相對於培養液為G. i 菌液 點，較佳為定在1質量%〜10質量％。、里°如。養條件控制的觀 量元素、核酸、微生素類等的培養基即I、無特子別斤 =的有機微 本發明，培養，培養條件無特別限制，可例如二 於ρΗ4〜9、較佳為ΡΗ6〜8、溫度2(TC〜5(TC、較俨為2S。乱下 範圍内適當控制pH與溫度的狀態進行轉。乂仏為25 ◦〜42 C的· 氣體對於前述混合物中的通氣量，無特舰制，但是當氣體 16 201124537 僅使用空氣N·，-般而§，為〇. 02vvm〜2. 〇vvm(vvm;通氣容暑 液容量[mL]/時間[分])，從抑制對於大腸菌的物理性損^ 點，於Q. lvvm〜1. 5vvm進行較佳。 咸 培養轉，可從培制始域到混合物巾的獅來源原 耗為止’敍到生產異丙_大腸8沒有活性為止持續進行j 養步驟的顧，視混合物巾的生產異丙醇的大腸8的數 。 性’以及植物來源原料的量而異，但一般而言為丨小 ’

，=小時以上=。另-方面，可藉由再度將植物來源原料車| ，產”物的大腸s投料而藉此將培養姻鎌制地連續，、曰3 是，從處理效率的觀點’一般而言可定為5日以下佳; 時以下。其他條件，可直接適用通常培養使用的條件。马55小 回收累積在培養液中的異丙醇的方法，無特別限制 採用從培養液將®體離心、分離等除去後，以雜或 I 的分離方法分離異丙醇的方法。 —、寺通书 又’本發明之生產異方法，在異 步驟之前’也可包含使得使_生產異丙_大腸 &f 數或適當活性狀態的前培養步驟。前培養步驟，^ = 醇生產細菌種類的通常使用的培養條件進行谇養。用u應異丙 本發明之生產異丙醇的方法，較佳為^以下步驟. Ϊ认ri在ί有前述異丙醇生產細菌及植物來源原料的混^中 〜、'口氣脰，一面培養该生產異丙醇的大腸菌；回收 培養生成的異丙醇從混合物分離並回收。 ‘λ 、刖处 (通用氣體—面培養生產大腸菌 同時，也從混合物蒸散，其結果可輕易地將合物中的 物分離。又，i減將生成的異丙醇從混合 刀離又*於將生成的異徘從混合物連續 抑制混合物巾的異哺濃度上升。藉此，_ ，此可 丙醇的大腸菌對於異丙醇的而;f受性。 ’ 1考慮生產異 典養是以大腸菌培養—般使用的基本 。養基為主脰者即可。培養條件可以直接應用前述事項。 17 201124537 驟中’係將於培養步射生成並從混合物分離的異丙 二邱狀法’只要是可將由於通常培養而從混合物蒸散 勺孔妝狀或〜沫狀異丙醇收集起來即可。如此的方法，例如可容 巧容器等收集構件等，其中，從能僅將異丙醇 句:::曰：二八’較佳為包含令使用於捕捉異丙醇的捕捉液 〃攸/吧&物刀離的異丙醇接觸的步驟。 ㈣，異丙醇能以溶於捕捉液或混合物的態樣回收。如 如國際公開2_/_377號小冊記瓣^ 醇可視二要HPLC等通常的檢測方法確認。回收的異丙 知了，而要進-步精製。如此的精製方法例如蒸鶴等。 了回水溶液狀態時’本異丙醇的生產方法，除 利用常ί進行。進一步含有脱水步驟。異丙醇的脱水，可 可岸=ίΐ捕混合物之態樣回收的異丙醇的生產方法中 if g 例如國際公開2嶋_號小冊的圖1所示的 的择=t納含有異丙醇生產細菌與植物來源原料 ===通ί接著用於將氣體從裝置外部注入的注入 集槽ί此Ϊ養有作為捕捉液的捕集液的捕 泡。彳在捕紅私動的氣體或液體與捕集液接觸而產生氣 於培養槽利用通氣培養生成的異丙醇，因為而γ ίί； 本發明之i差显精^的形態連續且簡便地生產。 樣方法通常獲得的副產物:::酮二^度=異，醇，且同 體内釋放到菌體外的所有;:物 18 201124537 質量％，較佳為8◦質量％]◦◦質量％。或者， 醇^生生的丙酮與異丙醇生成量的_，當以異丙 較佳為tf2為1時’副生丙_生成麵可為。〜〇·4， ㈣之生產異丙醇的方法獲得的生成物，由於丙 於異丙醇的比例低’因此當於例如固體酸物質及 ϊ= ΐ下’從植物來源原料利用異丙醇生產細菌生產的 3有丙—酮的異丙醇製造丙稀時，可減少丙喊化使用的氮量。 L貫施例] 々普載本發明之實施例’但本發明不限於該等實施例。又， 5己載中的％」如無特別指明，係代表質量基準。 [實施例1] 〈大腸桿菌Β株Apgi株之製作〉 大腸桿菌的基因體職的所有驗基序列為公知(GenBank ac=s=n number UQ_6)、大腸桿菌的墙酸葡萄糖異構酶（以 下有犄稱為pgi)的編碼基因的鹼基序列也已有人報告①印此故 afce^siori number X15196)。為 了選殖pgi 之編碼基因（165〇bp) 、，广序列附近區域，合成caggaa廿cgctatatctggctctgcacgC序 列編號 1)、cagtctagagcaatactcttctgattttgag(序列編號 2)、 g ctagatcatcgtcgatatgtaggcc(序列編號 3)及 gacctgcagatca ^ccgtcagctgtacgc(序列編號4)所示之4種寡核苷酸引子。序列編 號1的引子在5，末端侧具有EcoRi認識部位、序列編號2及3 的引子在5末端側具有Xbal認識部位，序列編號4的引子在5’ 末端側具有Pst I認識部位。 ^製備大腸桿菌MG1655株(ATCC700926)的基因體DNA，並將獲 侍的基因體DNA作為模板’以序列編號1與序列編號2的引子對 進1 PCR ’藉此將約1.贴的DNA片段放大（以下有時稱為pgi_L 片段）。又’以序列編號3與序列編號4的引子對利用進行PCR將 約γ Okb的DNA片段放大（以下有時稱為pgi—R片段）。將該等DNA 片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將pgi—L片段以Ecori及Xbai消 19 201124537 化，將pgi-R片段以Xbal及PstI消化。將該2種消化片段與溫 度感受性質體 pTH18csl(GenBank accession number AB019610)的EcoRI及PstI消化物混合，以T4DNA接合酶反應後， 轉形到大腸桿菌DH5a勝任細胞（東洋紡公司製），獲得於含有氣 徽素10/zg/ml之LB壤脂平板於30°C生長的轉形體。從獲得的轉 开>體回收質體’確認已在pTH18csl正確***pgi之編碼基因的5， 上游附近片段與3,下游附近片段的這2個片段。將獲得的質體以 Xbal消化後’利用T4DNA聚合酶進行平滑末端化處理。使用T4dna 接合酶，將該DNA片段與藉由將pUC4K質體（以沾她accessi〇n number X06404)(Pharmacia)以 EcoRI 消化獲得之康黴素 (kanamycin)耐受性基因進一步以T4DNA聚合酶進行過平滑末 i匕^的，片段連結。之後’轉形到大腸桿菌廳α勝任細胞， =在30°C下生長於含有氯黴素10/zg/ml與康徽素5〇⑽瓜的 脂平板上的轉形體。從獲得的轉形體回收質體，確認已在 康，游附近片段與3,下游附近片段之間蝴^ =此獲得的質體轉形到大腸桿菌8株⑽⑽⑻，在啊 H ，g/ml與雜素5(Wml的LB _平板上培 ί ί將獲得的轉形體接種於含有康徽素，_ 塗佈於含Τ 土 ’ = 3G晚。其次將該培養液的-部分 .菌_脂平板，獲得於饥生長的 有康娜姻的_旨 菌ί ^复脂平板生長的氯徽素^受性的 因取代為康徽==寺 株’並將獲得的菌株命名為b株屻i，、 20 201124537 △Pgi 株）。 心取^大腸桿㈣1655株及錯㈣β株可從美Μ種保存中 [實施例2] <大腸桿菌來源硫解酶基因、大腸桿菌來 ，、芽孢梭菌屬細菌來源乙驢乙酸去_基因、抱^土 因表現載體及該表現以轉 盥其_ Ϊ的硫解酶及大腸桿®的輔酶Α轉移酶的胺基酸序列 ^ r、Γ基序列已有人報告。亦即’硫解酶的編碼基因，記載 μ 皮aCCeSS1〇n number UOO〇96 的大腸桿菌 MG1655 株基因 您〜2325315。又，輔酶A轉移酶的編碼基因， =^大腸桿菌MG·株基因體序列的卿棚〜挪伽。藉由 :5亥等-起使|述芽孢梭菌屬細菌來源的乙酿乙酸去叛酶基因、 二丙醇去氫酶基因表現，可生產異丙醇。就為了使上述基因群表 必要的啟動子的驗基序列而言，可使用GenBank咖咖土㈤ number X02662的鹼基序列資訊中，記載於397_權的大腸桿菌 來源的甘油=3-麟酸去麟（以下有時稱為GApDH)的啟動子序列。 士 了取得GAPDH啟動子，將大腸桿菌MG1655株的基因體撕入 j乍，模板使用，利用 CgagCtacatatgCaatgattgacacgattccg(序列 、為號 5)、及 cgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(序列編號 6)以 PCR法放大’將獲得的麗A片段以限制酶NdeI、SphI消化，藉此 獲得約llObp的相當於GAPDH啟動子的臟片段。將獲得的眶 片段與藉由將質體 pBR322(GenBank accession number J01749)以限制酶Ndel及SphI消化獲得的片段混合，使用接合酶 接合，，轉形到大腸桿菌DH5a株勝任細胞（東洋紡(股)DNA_903) :獲得於含有安皮西林50//g/mL的LB瓊脂平板生長的轉形體。 將獲得的菌落於含有安皮西林5〇 Ag/mL的LB液體培養基於37。〇 培養一晚，從獲得的菌體回收質體pBRgapP。 為了取得異丙醇去氫酶基因，將Clostridium beijerinckii NRRL B 593的基因體DNA作為模板使用，利用aatatgcatgctggt 21 201124537 ggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(序列編號 7)、及 gcggatccgg taccttataatataactactgctttaattaagtc(序列編號 8)以 PCR 法放 大’將獲得的DNA片段以限制酶SphI、BamHI消化，藉此獲得約 1. lkbp的異丙醇去氫酶片段。將獲得的dna片段與將先前製作的 質體pBRgapP以限制酶SphI及BamHI消化所獲得的片段混合，使 用接合酶接合後，轉形到大腸桿菌DH5a株勝任細胞（東洋紡(股） DNA-903) ’獲得於含有安皮西林別^以虬的⑶瓊脂平板生長的 轉形體。。將獲得的菌落於含有安皮西林5〇#g/mL的LB液體培養 基於37°C培養一晚’從獲得的菌體回收質體pGAP-IPAdh。 為了取得大腸桿菌來源的硫解酶基因，將大腸桿菌MG1655株 的基因體DNA作為模板使用，利用atggatccgctggtggaacatatgaaa aattgtgtcatcgtcag(序列編號 9)、及 gCagaagcttgtctagattaattc aayttcaatcaccatc(序列編號1〇)以pcr法放大，將獲得的DM 片^段^限制酶BamHI、Hindlll消化，藉此獲得約丨.2kbp的硫解 酶片^段。將獲得的DM片段與將先前製作的質體pGAP_IPAdh以限 =酶BamHI及HindiII消化獲得的片段混合，使用接合酶接合後， 到☆腸桿菌DH5a株勝任細胞（東洋紡(股）DNA_9〇3)，獲得 於ΐΐ安皮西林50 Mg/mL的LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得 的菌落於含有安皮西林Ag/mL的LB液體培養基於37〇C培養一 晚’從獲得的菌體回收質體pGAp_IPAdh_at〇B。 為了取得大腸桿菌來源的辅轉移酶基因，將大腸桿菌 MG1655株的基因體DNA作為模板使用，利用gctctagagctggtggaa =tatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(序列編號丨丨）、及乜取妨队 ctact^gagttatttgctctcctgtgaaacg(序列編號 12)以 PCR 法放 么，將獲得的DNA片段以限制酶xbal、Hindi II消化，藉此獲得 f ^OObp的輔酶a轉移酶α次單元片段。將獲得的DNA片段與將 ，=作的質體pGAP-1PAdh-atoB以限制酶XbaI及HindIII消化 得的片段混合，使用接合酶接合後，轉形到大腸桿菌DH5a 勝任細胞（東洋紡(股）DNA_9〇3)，獲得於含有安皮西林 #g/mL的LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得的菌落於含有安皮 22 201124537 西林50//g/mL的LB液體培養基於37 C培養一晚，從獲得的菌體 回收質體 pGAP-1 PAdh-atoB-atoD。 — 又’將大腸桿菌MG1655株的基因體DNA作為模板使用，利用 aagtctcgagctggtggaacatatggatgcgaaacaacgtattg(序列編號丄3) 、及 ggccaagcttcataaatcaccccgttgc(序列編號 14)以 PCR 法放 大，將獲得的DNA片段以限制酶Xhol、Hindlll消化，藉此獲得 約600bp的輔酶A轉移酶/3次單元片段。將獲得的dna ^段^將 先鈾製作的質體pGAP-IPAdh-atoB-atoD以限制酶Xh〇l及Hindi Π 消化所獲得的片段混合’使用接合酶接合後，轉形到大腸桿菌 DH5a株勝任細胞（東洋紡（股）DNA-903)，獲得於含有安皮西林 50/zg/mL的LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得的菌落於含有安皮 西林50#g/mL的LB液體培養基於37〇C培養一晚，從獲得的菌體 回收質體 pGAP-1 PAdh-atoB-atoD-atoA。 _ 為了取得乙醯乙酸去敌酶基因，將Clostridium acetobutylicum ATCC824的基因體DNA作為模板使用，利用 caggtaccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc( 序列編號 15)、及 gcggatccttacttaagataatcatatataacttcagc(序

列編號.16)以PCR法放大，將獲得的DNA片段以限制酶KpnI、BamHI 消化，藉此獲得約700bp的乙醯乙酸去羧酶片段。將獲得的醜 片段與將先前製作的質體pGAP—IPAdh-at〇B_at〇D_at〇A以限制酶

Kpnl，BamHI消化所獲得的片段混合，使用接合酶接合後，轉形 到士腸桿菌DH5a株勝任細胞（東洋紡(股）dna_9〇3)，獲得於含 ^安皮西林50//g/mL的LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得的菌 洛於含有安皮西林50#g/mL的LB液體培養基於37〇c培養一晚， 從獲得的菌體回收質體pGAMaaa。 °養免 將4貝體pGAP-1 aaa轉形到實施例1製作的Apg丨株勝任細 ^於3有安皮西林5Q/Zg/mL的LB Bn)th，Miller if脂平板於 w c培，一晚，獲得大腸桿菌pGAp_Iaaa/B△飓丨株。 同樣地，將pGAP-Iaaa轉形到大腸桿菌B株⑽⑴咖)勝任 '、、田已’於含有安皮西林50//g/mL的LB Broth’Miller璦脂平板 23 201124537 於37 C培養一晚，獲得大腸桿菌PGAP-Iaaa/B株。 又大％桿菌 MG1655 株、Clostridium acetobutylicum 大腸桿菌8株，可從為細胞•微生物•基因庫的美國菌 種保存中心取得。 <B: :atoDAB株之製作〉 大腸桿菌MG1655株的基因體DNA的所有鹼基序列為公知 rss=，mber腦刪），大腸桿菌MG· 早兀的編碼基因（以下有時簡稱為_)的驗 土序列也有人報告。亦即，at〇D記載於GenBank 加 number U00096的大腸桿菌MG1655株基因體序列的 2321469〜2322131 。 為了使上述基因表現所必要的啟動子的鹼基序列，可使用於

GenBank accession number χ〇2662的鹼基序列資訊中記截於 腸關來源的甘祕3—魏去麟(町有時稱為、 。為了取得以醜啟動子，將大腸桿菌MG1655 ，的=體，作為模板使用，利用cgctcaatt_tgaitgaca(：ga 44) ' ^ aCagaattcgctatttgtta^gaataaaagg(^ P 以-⑶法放大’將獲得的腿片段以限制酶MfeI及 =T碼約1〇〇bP的GAPM啟動子的DNA片段。 將獲侍的腦片段，與將f體pUC19(GenBank紅咖雇 n=er=0i5i4)^限制酶EcoRI消化再進行驗性鱗解酶處理過者 :σ ’使用接&酶接合後，轉形到大腸桿菌DH5a株勝任細胞 DM-9G3) ’獲得於含有安皮西林5Q/zg/mL的 旨 平板生長的轉形體。將獲得的質體1Q個分別在37。〇、含 二的⑶液體培養基中培養一晚，回收質體，淘選出以 限制辦EcoRI及_消化時，未切出動子者，又 pUCgapP以限制酶EC0RI及ΚρηΙ消化。 胸得atoD，將大腸桿請1655株的基因體臟作為 杈板使用，利用 cgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaat如如⑵ 24 201124537 ttacaagac(序列編號 46)、及 gcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg (序列編f虎47)以PCR法放大，將獲得的DNA片段以限制酶Ec〇ri 及pnl消化’藉此獲得約69〇bp的at〇D片段。將該眶片段與 先丽以限制酶EcoRI及ΚρηΙ消化得到的pUCgapp混合，使用接合 酶接合後，轉形到大腸桿菌Μ5α株勝任細胞（東洋紡（股） DNA-903)，獲得生長於含有安皮西林5〇 vg/mL的LB瓊脂平板上 的轉形體。從獲得的菌體回收質體，確認已正確***at〇D，將該 質體命名為pGAPatoD。 又，大腸桿菌MG1655株可從美國菌種保存中心取得。 如上述，大腸桿菌MG1655株的基因體DNA中的atoD的鹼基 序歹〗也有人報告。使用依據大腸桿菌MQ1655株的atoD的5’附近 區:或的基 ϋ 資 製作的 getctagatgctgaaatcxaetagtettgtcC序列 編號 48)與 tactgcagcgttccagcaccttatcaacc(序列編號 49)，以大 腸桿菌MG1655株的基因體DNA為模板進行pcR，藉此將約） 的ΜΑ片段放大。 制又，使用依據大腸桿菌MG1655株的GAPDH啟動子的序列資訊 ‘作的 ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列編號 50)與依據大 腸桿=MG1655株的at。])的序㈣訊製作的序列編號4的引子， 以先刖製作的表現載體pGAPat〇D為模板進行pcR，獲得由GApDH 啟動子與at〇D構成的約79〇bp的DNA片段。 .a將由上述獲得的片段分別以限制酶PstI與XbaI、XbaI與ΚρηΙ 消化，將該片段與將溫度感受性質體pTH18csl(GenBank accession number AB019610)[Hashimoto-Gotoh, T., Gene, ，185-191 (2000)]以psti與ΚρηΙ消化所獲得的片段混合， =用接合酶接合後，轉形到廳α株，獲得在航、含有氣黴素 # ml的jB瓊脂平板上生長的轉形體。在3〇。〇下，將獲得的 ，洛^含有驗素1()//g/ml的』液體培養基巾培養-晚，從獲 ，的，體回收气體。將該質體轉形到大腸桿菌Β^Τ(χι13⑹， 在30 C、含有氯黴素的LB瓊脂平板上培養一晚，獲得 轉形體。將獲得的轉形體.接種於含有氣黴㈣^g/ml的LB液體 25 201124537 培養基、於30 C培養-晚。將麟的培翻體塗佈於含有氯 l—OWml的LB瓊脂平板，於42t：培養並獲得菌落。將獲得的菌 洛於?含抗生物質的LB液體培養基巾於航培養2彳、時，塗佈於 不含抗生物質的LB瓊脂平板而獲得於42。〇生長的菌落。 .從出現的菌落中隨機挑取100個菌落，分職其於不含抗生 物質的LB瓊脂平板與含有氯黴素1〇//g/ml的LB瓊脂平板上生 長，選取氯黴素感受性的菌落。再從該等的選殖體的染色體舰， 利用PCR放大含有GAPDH啟動子與atoD的約79〇bp的片段，淘 atoD啟動子區域取代為GAPDH啟動子的菌株，將滿足以上的選殖 體命名為大腸桿菌:: atoDAB。 又，大腸桿菌B株(ATCC11303)可由為細胞•微生物.基因庫 的美國菌種保存中心取得。 〈質體plaz之製作〉 芽孢梭菌屬細菌的乙醯乙酸去羧酶，記載於GenBank accession number* M55392,異丙醇去氮酶記載於 accession number AF157307 。 為了使上述基因群表現所必要的啟動子的鹼基序列，可使用 於GenBank accession number X02662的鹼基序列資訊記載於 397 440的大腸桿菌來源的甘油醛3_鱗酸去氫酶（以下有時稱為 GAPDH)的啟動子序列。 ^ 了取得GAPDH啟動子’將大腸桿菌MG1655株的基因體脆 作f7模板使用，利用 cgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(序列 編號、5)、及 CgCgCgcatgctat1;tgttagtgaataaaagg(序列編號 6)以 PC^法放大，將獲得的DNA片段以限制酶Ndel、SphI消化，藉此 獲得約llObp的相當於GAPDH啟動子的DNA片段。將獲得的疆 片段與將質體 pBR322(GenBank accession number J01749)以 限制酶Ndel及SphI消化所獲得的片段混合，使用接合酶接合後， ，形到大腸桿菌DH5a株勝任細胞（東洋紡(股）DNA-903)，獲得 於含f安皮西林5〇#g/mL的LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得 的菌落於含有安皮西林50 # g/mL的LB液體培養基於37°C培養一 26 201124537 • 晚’從獲得的菌體回收質體pBRgapP。 為了取得異丙醇去氫酶基因，將Clostridium beijennckii NRRL B-593的基因體DNA作為模板使用，利用aatatgcatgctggtg gaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(序列編號 51)、及 gCggatccttat ⑽tataactactgctttaattaagtc(序列編號52)以PCR法放大，將獲 巧的=片段以限制酶Sphl、BamHI消化，獲得約1· ikbp的異丙 醇去氫酶片段。將獲得的DNA片段與將質體pBRgapp以限制酶如“ 及^amHI消化所獲得的片段混合，使用接合酶接合後，轉形到大 腸桿菌DH5a株勝任細胞（東洋紡(股）DNA_9〇3)，獲得於含有安 皮西林50//g/mL的LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得的菌落於 ^有^皮西林50/zg/mL的LB液體培養基於37。(：培養一晚，從獲 知·的菌體回收質體，確認已正確***ΙΡΑ^，將該質體命名為 pGAP-IPAdh ° 為了取得乙醯乙酸去羧酶基因，將n〇stridium acetobutylicum ATCC824的基因體DMA作為模板使用，利用 caggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc( 序列編號 53)、及 ggaattcggtaccttacttaagataatcatatataacttca gc(序列編號54)以PCR法放大，將獲得的謝a片段以限制酶 B^HI、EcoRI消化，獲得約700bp的乙醯乙酸去羧酶片段。將獲 得的DNA片段與將先前製作的質體pGAP—IpAdh以限制酶BamHi ^ =oRI消化所獲得的片段混合’使用接合酶接合後，轉形到大腸桿 菌DH5a株勝任細胞（東洋紡(股）DNA_9〇3)，獲得於含有安皮西 林50/zg/mL的LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得的菌落於含有 ^皮西林50//g/mL的LB液體培養基於37t：培養一晚，從獲得的 菌體回收質體，確認已正確***adc，並將談質體命名為pIa。

為了取得葡萄糖6磷酸-1-去氫酶基因（zwf)，將大腸桿菌B 株的基因體 DNA(GenBank accession No· CP000819)作為模板使 用’使用 caggatcccggagaaagtcttatggcggtaacgcaaacagcccagg(序 列編號 55)、及 cgtctagacggagaaagtcttatgaagcaaacagtttatatc gcc(序列編號56)以PCR法放大，將獲得的DNA片段以限制酶 27 201124537 H1、消化，藉此獲得約15〇_的葡萄糖6鱗酸ι~去氣酿 R ^ Τ° Γ γΐΐ的Λ DNA片段與將先前製作的質體pGAM a以限^酶 有π α /株勝任細胞(東洋纺(股）DNA-903)，獲得於含 於含有安ί西以mL的LB _平板生長的轉形體。獲得的菌落 將獲得的^吻液體培養基中於抓培養—晚， b 先前製作的大腸祕：：at。嶋勝任細 Q7>、i有皮西林 5〇/Zg/mI^LB Br〇th，Miller 瓊脂平柄於 37 養一晚’獲得大腸桿菌 PGAP-Iaz/B: :at〇DAB。 ； [實施例3] <:吏用3L培養槽利用大腸桿菌pGAp一匕減株及 ^異丙^/BAPgl株及pGAP~Iaz/B::伽_細丨做葡萄糖生 署庄ί中，使用麵Q9/_377號小冊圖1所示之生產裝 i 二培養槽使用容量3公升者’捕集槽使用容量i〇l 主=注入管、連結管、排出管， =彳曰中左入作為捕集液的水(捕集水)9L。又，培養槽設置廢 夕將由於糖或中和劑的流加而增量的培養液適當排出培養槽 pGAp-Iaaa/B ^ PGAP-Iaaa/BApg! #， 液ov'f裝安皮西林5〇/"g/mL^LB Br〇th，Miller培養 3(Tr H 2〇)1〇〇虬的容量5〇〇mL的三角燒瓶，於培養溫度 進行授掉培養一晚，作為前培養。將前培養侃 二二所不組成的培基855g的容量3L的培養槽⑽le 二smpi)進行培養。培養於大氣壓下、通氣量 卜田:、攪拌速度55Qrpm、培養溫度3(rc、pH7. Q(以·水溶 *進订。從培養開始至8小時後為止的期間，α 7·把/17小 ^爪速添加45wt/wt%的葡萄糖水溶液。之後，幻5g/L/小時的 机k添加45wt/wt%的葡萄糖水溶液。從培養開始起12〇小時後， 28 201124537 ，利用離心操作除去菌體後，利用HPLC依照定法 上清中的生成物的累積量。又，測定値係培養後 、:^養攻14捕木水㈤中的合計値。培養後的生成物的濃度與異 丙醇的純度，各如表1所示。 〈培養基組成〉

玉米浸液（曰本食品化工製）：2〇g/L Fe2S〇4 · 7H2〇:0. lg/L K2HP〇4：2g/L

KH2P〇4：2g/L MgS〇4 · 7H2〇: 2g/L (NH4)2S04:2g/L

Adekanol LG126(旭電化工業）〇. lg/L (殘份:水） [表1] pGAP-Iaaa /B株 pGAP-Iaaa/ΒΔ pgi株 pGAP-Iaz/B::at oDABApgi 株 生成物 (g/L) 異丙醇 56.38 36.80 53.20 丙酮 22.79 2.05 2.70 乙醇 0.00 0.00 0.00 有機酸 8.62 4. 17 1.70 丙酉同酸 0. 00 0. 00 0.00 琥珀酸 0.00 0.10 0. 00 乳酸 0.00 0.00 0.00 曱酸 4. 64 2.38 0.70 乙酸 3. 98 1.69 1.00 合計 87,77 43.05 57.60 異丙醇純 度⑻ 64.2 85.5 92.4 29 201124537 姓 丄以Gc 分析獲得的pGAP-laaa/B 株及 pGAp~iaaa/BApgi 旦 本水/結果得知：pGHaaa/B株的捕集水含有丙酮2. 6質 =Λ異。丙醇4. 6質量％。又，pGAP_Iaaa/BApgi株的捕集水含有 姓4 貝篁〇/〇、異丙醇 2· 8 質量〇/° , PGAP—Iaz/B: :atoDABZ\pgi 株的捕，^含有丙酮0.24質量％、異丙醇2.6質量％。 ^該等結果確認:藉由破壞大腸菌原本具有的葡萄糖-6-磷酸 :、構酶的編碼基因（pgi)，使葡萄糖_6_磷酸異構酶的活性完全去 ，異丙醇的純度提高。又，得知：藉由破壞pgi且同時強化葡 =·唐-6-碌酸-1-去氫酶基因（zwf)的表現，異丙醇的純度更加提 南0 "藉，進行該寺基因改變，能減少生成物中的丙酮量，因此即 使欲將副生的丙酮變換為異丙醇，也能減少變換所必要的物質（例 如氫）的用量。 [比較例1 ] 〈大腸桿菌B株ApikAApfliB株之製作〉 大腸桿菌的基因體DM的所有鹼基序列為公知(GenBank acc^^sion number ϋ〇〇〇96)，大腸桿菌的磷酸果糖激酶—％以下 有日寸稱為pfkB)的編碼基因的驗基序列也已有人報告①㈤如油 accession number K02500)。為 了選殖pfkB 的編碼基因（930bp) 的，基序列附近區域，合成ttggtacctt1：acatgctgtagccc吨K序列 編號 17)、cgtctagataggctgatttcagtctgg(序列編號 is)、attcta gaaixatcaccaacctgtcg(序列編號 19)及 gatattgCCgaaagCgatcc (序&列編號20)所示之4種寡核苷酸引子。序列編號丨7的引子於5’ 末端侧具有ΚρηΙ認識部位，序列編號18及19的引子於5，末端 側具有Xbal §忍識部位’序列編號2〇的引子於5’末端侧1有 認識部位。 "a

製備大腸桿菌MG1655株(ATCC700926)的基因體DNA，以獲得 的基因體DNA作為模板，利用序列編號π與序列編號18的弓g 對’進行PCR藉此放大約1. 〇kb的DNA片段（以下有時稱為她只 片段）。又，利用序列編號19與序列編號2〇的引子對，進行pcR 30 201124537 藉此將約1· Okb的DM月段放大（以下有時稱為pfkB-：R片段）。將 該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將pfkB_L片段以Κρηϊ 及Xbal消化，將pfkB-R片段以Xbal及PstI消化。將該2種消 化片段與溫度感受性質體pTH18csl(GenBank accessi〇n number ---------八即19|：)1〇)的ΚρηΙ及PstI消化物混合，以T4DNA接合酶 反應後，轉形到大腸桿菌DH5a勝任細胞（東洋紡公司製），獲得 於含有氯黴素的LB瓊脂平板於3〇t：生長的轉形體二從 獲得的轉形體回收質體，確認pfkB的編碼基因的5，上游附近片 段與3下游附近片段的2個片段已正確***到pTH18cs卜將獲 得的質體以Xbal消化後，利用τ侧A聚合酶進行平滑末端化處又 理。將該DNA片段，與以轉位子躺伽驗咖細㈤ Γίΐ 9cagctgactcgacatcttggttaccg(4 f Cag^tgCaagagggtCattatatttcg(序列編號 22)的寡 *得四環徽素对受性基因後再將該臟片段以 ^核苷酸激酶處理並經先前的平滑末端處理過的質體連 ί°η °,轉形到大腸桿菌Μ5α勝任細胞，獲得於含有氯黴辛 與四環黴素20續的LB壤脂平板於航生長的轉： :游Γ二 體回收質體，確認已在_的編碼基因的〆 基因 下游附近片段之間正確***四環黴素耐受性 氧徵體轉形到大腸桿菌B株(AT(X113G3)，於含有 形體。將獲得的轉賴接培養7免，獲得轉 培養基，於3(TC培養-晚^⑽液體 有四環徽素20融丄的叫^平的;^塗佈於含 將獲得的g落於含有四環黴素^ 的菌落。 培養24小時，再塗佈於含主m^LB/夜肽i。養基’於30°C 獲得於42°C生長的菌落。摘素心咖的LB瓊脂平板， 從出現的菌落中隨機挑取〗 … 2〇咖的晴平板與含有氯黴生 201124537 S選:取f會ί含有四環黴素的LB _平板生長的氯黴素感受性 ΪίΓ二，I等選殖體的染色體臟，使用在野生株B株中 二f i, r因的pfkB基因附近區域的約3._片段放大的引 ί對1Ρί ^編!虎17與序列編號20，進行PCR，將_基因取代 ί ，受性基因’藉此淘選獲得有約3. 2kbp片段放大的菌 ，。獲=的囷株命名為B株_基因缺失株（以下有時簡稱為 ApikB 株）。 大腸桿菌的基因體DNA的所有鹼基序列為公知①邱此业 ^c^ion number _96)，大腸桿_顧果糖激酶](以下 有時稱為pfkA)的編碼基因的驗基序列也有人報告(GenBank accession number [)00096 4105575—4106537)。為 了選殖 pfkA的編碼基因（963bp)的鹼基序列附近區域，合成atctgcagtac tagCgtCag=gatagC(序列編號 23)、cgtctagatcctgctgaaUganca gg(序列編號 24)、tctctagactgaaaccgatgacagaagc(序列編號 25) 及aaggtaccaggcaatcagtacatcg(序列編號26)所示之4種寡核苦 酸引，。序列編號23的引子在5，末端側具有Psti認識部位，序 ，編號24及25的引子在5’末端側具有xbai認識部位，序列編 號26的引子在5’末端側具有Kpnl認識部位。 製備大腸桿菌MG1655株(ATCC700926)的基因體DNA，以獲得 的基因體DNA為模板’利用序列編號23與序列編號24的引子對， 進行PCR，藉此將約1. 〇kb的DNA片段放大（以下有時稱為pfkA_L 片段）。又’以序列編號25與序列編號26的引子對，進行PCR將 約1. Okb的DNA片段放大（以下有時稱為pfkA-R片段）。將該等dna 片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將pfkA-L片段以pstl及Xbai消 化’將pfkA-R片段以Xbal及Kpnl消化。將該2種消化片段，與 溫度感受性質體pTH18csl(GenBank accession number AB019610)的Kpnl及Pstl消化物混合，以T4DNA接合酶反應後， 轉形到大腸桿菌DH5a勝任細胞（東洋紡公司製），獲得於含有氯 黴素10//g/ml的LB瓊脂平板於30°C生長的轉形體。從獲得的轉 形體回收質體，確認pfkA的編碼基因的5，上游附近片段與3’ 32 201124537 =====，的質體 片段，與將PUC4K質體(GenBank :处理。將该舰 404)(Pha服Cla)以 Ec〇RI 消 ^ ^ =

接合S曼連結。之後，轉形到大腊卢 便用T4DNA

ΙΟ/zg/ml 5〇/g/m ^ LB

5 5 pfkA J 受性基^⑼與3 ™嫩权間，已正確***康黴素耐 將如此獲得的質體轉形到大腊^θ μ 10^/nil盥庵溆去In 梓囷△_株，於含有氣黴素 ”康放素5〇/ig/m的LB王复脂平板於3叱培養-晚，辑 Ϊ獲得的轉形體接種於含有康黴素5一~的LB液又 ^序^辛训於3乂培。其次將該培養液的—部分塗佈於 =了的园，於含有康黴素，g/ml的LB液體培養基中 從出現的菌落中隨機挑取i00個菌落，各使於含有康黴素 ^g/ml的LB _平板與含有氣黴素_ gM的财脂平板生 ^選取财在含錢《的LB _平板生長的驗素感受性的 又’使用轉的選殖體的染色體眶，使用使野生株b株中 有pfkA基因的pfkA基因附近區域的約& 〇kbp片段放大的引 =即序列編號7與序列編號1G，進行PCR，藉由將卿基因取 ^為康黴素耐受性基因，淘選獲得約3焉的片段經放大的菌 # —將獲得的菌株命名為B株pfkA，pf妨基因缺失株（以下有時 簡稱為ApikAApfliB株）。 心取彳Ϊ ’。大腸桿祕1655株及鴻㈣B株可從錢紐保存中 〈對於ApfkApfkB株導入有大腸桿菌來源硫解酶基因、大腸桿 201124537 細菌來源乙醯乙酸去羧酶 酶基因表現載體的轉形體 菌來源輔酶A轉移酶基因、芽 基因、芽孢梭賴細g來源異丙醇=氣 將實施例2製作的質^# ΓΑρ 任細胞，於含有安皮西咖轉形到△伽△_株勝 舡你97。广+立甚一咕 A A g//mL的LB Broth ’ Mi 1 ler瓊脂平

株。 亍大腸才干滴 pGAP-Iaaa/BZXpfkAApfkB -Iaaa/BApfkAzXpfkB 株 〈使用3L培養槽利用大腸桿菌pGAp 從葡萄糖生產異丙醇〉 與實施例3明樣方法生產異丙醇。惟，菌體使用 pGAP-Iaaa/BApfkAApfkB株。從培養開始起12〇小時後取樣菌體 培養液，利用離心操作除去菌體後，以HPLC依照定法測定得到的 培養上清中的生成物的累積量。又，測定値係培養後的培養液與 捕集水(9L)中的合計値。培養後的生成物的濃度及異丙醇的純^ 如表2所示。 表2] pGAP-Iaaa/BApfkApfkB ^ 生成物(g/L) 異丙醇 34.78 丙_ 48.39 乙醇 0.00 有機酸 26.38 丙酉同酸 0.00 琥珀酸 6.85 乳酸 3.78 曱酸 0.52 乙酸 15.23 合計 109.55 異丙醇純度 00 31.7 34 201124537 滅Ϊ該結果及實施例3的結果，確娜切《縣具有的為解 ;日士 ’、里而，酵素的葡萄糖—6—磷酸異構酶的編碼基因（pgi)破i穿 ί果糖但相反地，破壞同樣解糖系的酵素即磷 -y二噂的'、扁碼基因（pfkA及pfkB)時，異丙醇的純度降低。 L貫施例4] " 抑〈入If 1培養槽利用大腸桿菌pGAP—Ia—CscA/GAPPa⑽基因 肢***株Pgi破壞株從蔗糖生產異丙醇> (大η腸^菌B株基因體上at〇D啟動子取代為GApM啟動子） 大腸桿ϋ MG1655株的基因體腿的所有驗基序列為公知 mmber U00096) 5 MGi65s I广MU夕_ a -人早元的編碼基因（以下有時簡稱為atoD)的齡 tH。亦即，翩記載於 aCCeSS10n U00096的大％杯菌齡1655株基因體序列的2321469〜2322131。 為了使上述基因表現所必要的啟動子的驗基序列，可使用 accession細ber XG2662的驗基序列資訊中記載於 397-440力大腸桿菌來源的甘油酸3_石粦酸去氯酶（以下有時稱為 GAPDH)的啟動子序列。為了取得GApDH啟動子，將大腸桿菌脇655 株的基因體DNA作為模板使用，利用cgctcaatt譯邮恤峰 ttccg(^^.J^^ 27) ^ ^ acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(^ 列編號28)以jCR法放大：將獲得的DNA片段以限制酶MfeI及 EcoRI消化”藉此獲得編碼約如〇13?的^从⑽啟動子的D似片段。 將獲得的、DNA片段與將質體pUC19(GenBank accessi〇n仙齡 X0251j)以限制酶EcoRI消化再經鹼性磷解酶處理過者混合，使用 接合酶接合後’轉形到大腸桿菌廳α株勝任細胞（東洋紡(股） DNA-903) ’獲得於含有安皮西林5〇#g/mL的⑶瓊脂平板生長的 轉形體。將獲得的質體1〇個分別於含有安皮西林5〇㈣mL的LB 液體培養基中於37C培養一日免，回收質體，淘選以限制_Ec〇Ri 及ΚρηΙ消化時未切出gapdh啟動子者，再確認D|yA序列，以已正 確***GAPDH啟動子者作為p[jCgapp。將獲得的pUCgapP以限制酶 EcoRI 及 ΚρηΙ 消化。 35 201124537 又，為了取得atoD，將大腸桿菌MG1655株的基因體DNA作為 模板使用，利用 cgaattcgctggtggaacaiiatgaaaacaaaattgatgacat tacaagac(序列編號 29)、及 gcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg(序 列編號30)以PCR法放大，將獲得的])NA片段以限制酶EcoRI及 ΚρηΙ消化，藉此獲得約_bp的atoD片段。將該DNA片段與先前 以限制酶EcoRI及ΚρηΙ消化過的pUCgapP混合，使用接合酶接合 後’轉形到大腸桿菌DH5a株勝任細胞（東洋紡（股）dna-903)， 獲得於含有安皮西林50从g/mL的LB瓊脂平板生長的轉形體。從 獲知·的函體回收質體，確認已正確***at〇D ’將該質體命名為 pGAPatoD ^ 又’大腸桿菌MG1655株可從美國菌種保存中心取得。 如上述，大腸桿菌MG1655株的基因體DNA中的atoD的鹼基 序列也已有人報告。使用依據大腸桿菌MG1655株的at〇D的5，附 近區域的基因資訊製作的gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc(序 列編號 31)與 tactgcagcgttccagcaccttatcaacc(序列編號 32)，以 大腸桿菌MG1655株的基因體DNA為模板進行PCR，藉此放大約 l.lkbp 的 DNA 片段。 、 制又，使用依據大腸桿菌MG1655株的GAPDH啟動子的序列資訊 〒巧ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列編號切與依據大 腸桿f MG1655株的at〇D的序列資訊製作的序列編號％的引子， 以先前製作的表現載體pGAPatoD為模板進行pcr，獲得由GAPDH 啟動子與at〇D構成的約790bp的DNA片段。 將由上述獲得的片段分別以限制酶Pst j與χΜ、腕與 消化，將該片段與將溫度感受性質體pTH18csl(GenBank accession number A謝9610)[Hashim〇t〇—G〇t〇h， τ.， g咖 241’ 185-191 (2刪）]以pstl與ΚρηΙ消化而獲得的片段混人， =接合酶接合後，轉形到DH5a株，獲得於含有氯徽素iQ^/[d 遠脂平板於3{rc生長的轉形體。將獲得的菌落於含有氯徽素 H的⑶液體培養基中於3(rc培養—晚，從獲得的菌體回 收貝月豆。將的體轉形到大腸桿菌_(ATCC11303)，於含有氯徽 201124537 ιο〇〇Γ/1~^ 5 ° 培養一晚。g 1白⑽液體培養基於3〇°c :ί= 生/質的LB液體培養基中培養2小時，塗佈 物貝ΐ 瓖脂平板而獲得於42°C生長的菌落:」布於不^几生 質的落中隨機挑取1〇0個菌落，分別使於不含抗生物 貝的LB王复月曰平板與含有氯黴素工 取氣黴素感受性的菌落。又，從兮板生長’ 4 放大含有GAPDH啟動子盥atoD^勺寺 ===色體臟以PCR 動抑心㈣2 的約79〇bp的片段，淘選at〇D啟 為大t ί ίΗ啟動子的菌株，將滿足以上的選殖體命名 馮大㈣干囷Β株at〇D缺失GAPpat〇D基因體***株。 的盖。if ϊΐ _(ATrai3Q3)可從為細胞•微生物·基因庫 的吳國囷種保存中心取得。 菌GAPpatoD基因體***株pgi破壞株之製作） 大腸桿菌的基i]體dm的所有驗基序列為公知(GenBank number UGQG%) ’大腸桿菌的碟酸葡萄糖異構酶（以 下有蚪稱為pgl)的編碼基因的鹼基序列也已有人報告（GenBank ^cession number X15196)。為 了選殖pgi 的編碼基因（1，65〇bp) 勺鹼，序列附近區域，合成caggaattcgctatatctggct邮卿(序 =號 34)、cagtctagagcaatactcttctgattttga g(序列編號 )、cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc(序列編號 36)及 gacctg cagatcatccgtcagctgtacgc(序列編號37)所示的4種募核苷酸引 ，。序列編號1的引子在5’末端側具有£coRI認識部位，序列編 諕2及3的引子在5’末端側具有xbal認識部位，序列編號4的 引子在5’末端侧具有psti認識部位。 製備大腸桿菌MG1655株(ATCC700926)的基因體DNA，以獲得 的基因體DNA作為模板’以序列編號34與序列編號35的引子對 進行PCR，放大約1. 〇kb的DNA片段（以下有時稱為pgi-L片段）。 又’以序列編號36與序列編號37的引子對進行PCR，放大約1. 〇kb 37 201124537 的DNA片段（以下有時稱為pgi_R片段）。將該等DNA片段以瓊脂 糖電泳分離、回收’將pgi—L片段以Ec〇RI及XbaI消化，將pgi_R 片段以Xbal及PstI消化。將該2種消化片段與溫度感受性質體 pTH18csl(GenBank accession number AB019610)的 EcoRI 及

PstI消化物混合’以T4DNA接合酶反應後，轉形到大腸桿菌£)邢 巧任細胞（气洋紡公司製），獲得於含有氯黴素1〇/zg/ml的LB瓊 脂平板於30 C生長的轉形體。從獲得的轉形體回收質體，確認pgi 的編碼基因的5’上游附近片段與3’下_近片段的2個片段已 正確=入pTH18csl。將獲得的質體以XbaI消化後，利用T4DM 聚合酶進行平滑末端化處理。將該DNA片段，與將pUC4K質體 (GenBank accession number 消 化所獲得的康黴素耐受性基因再以T4DNA聚合酶進行平 處理而得的DNA片段，使用T4DNA接合酶連結。之後，轉形到大 ，桿菌DH5a勝任細胞，獲得於含有氯黴素1〇#g/mi與康黴 = 复脂平f在3〇〇C生長的轉形體。從獲得的轉形體回 l片I又之間，已正確***康黴素體性基因。 將如此獲得的質體轉形到前述大腸桿菌B才朱的⑹缺失 PpatoD基目赫碌，於含有驗素1() 於含有康 從出現的菌落中隨機挑取⑽個菌落，各使於含 g/ml的L_旨平板及含有氯徽素i〇 ^ g/mi的f H ^遥取僅^於含有雜素的LB壤脂平板生長的氯徵素感曰 Ξ:又，ί§亥等目的選殖體的染色體dna利用pcr，放ϋ腸方 园Β株獅缺失GAP购D基因體***株中之含有如基^^ 38 201124537 .基因附近區域的約3. 7kbp >；段，藉由將pgl基因取 受性基，淘選獲得放大約3. 3kbp的片段的菌株，得到的^株乂 1 為GAPpatoD基因體***株pgl基因缺失株（ j =叩名 GAPpatoD基因體***株）。 ㈣間％為 又，大腸桿菌MG1655株可從美國菌種保存中心取得。 (芽孢_屬細g麵H酸去綱基因、芽孢梭 =來源去氫酶基因、大腸桿菌㈣來源轉化酶基因表現 體及该表現載體轉形體之建構） 載 芽孢梭菌屬細菌的乙醯乙酸去羧酶記載於GenBank accession number M55392，異丙醇去氫酶記載於以沾如匕 accession number AF157307 。 為了取得異丙醇去氫酶基因，將cl〇stri ·· NRRL B-593的基因體DNA作為模板使用，利用 euenncku aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctaggC^^j^^ 以ΡΠ? （序列編號39) ΐί 放大’將獲得的職片段以限制酶_、BamHI消化， 約1. lkbp的異丙醇去氫酶片段。將獲得的臟片段與將 先别衣作的質體pBRgapP以限制酶_及此_消化而獲得的片 段使r!接合酶接合後’轉形到大腸桿菌DH5 α株勝任細胞(東 ί ϋΓΑ—9〇3) ’獲得於含有安皮西林5(wmL的lb j复脂平

。將獲得的8落於含有安皮西林心_的LB f f。養基於37C培養-晚，從獲得的g體回收f體，確認已正 確***IPAdh ’將該質體命名為pGAp—IpMh。 為了取得乙醯乙酸去羧酶基因，將cl〇stridium acetobutylicum ATCC824的基因體DM作為模板使用，利用 raggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc( 序列/扁唬 40)、及 ggaattcggtacct^cttaagataatcaMataact^ gc(序列編號41)以PCR法放大，將獲得的疆#段以限制酶 BamHI、EcoRI消化，得到約7〇〇bp的乙酿乙酸去缓酶片段。將得 到的DNA片段與將先前製作的質體以限制酶及 39 201124537

EcoRI消化獲得的片段混合，使用接合酶接合後，轉形到大腸 DH5a株勝任細胞（東洋纺(股）DNA-903)，獲得於含有芬古西妖 心g/mL的LB _平板生長的轉形體。將獲得的菌落有:含皮有^皮 西林50//g/mL的LB液體培養基於37°C培養一晚，從獲得的菌體 回收質體，確認已正確***acic，將該質體命名為pGAp_Ia。 大腸桿菌0157株的基因體DNA的所有鹼基序列為公知 (GenB^nk accession number AE005174)’大腸桿菌 0157 株的 f化酶的編碼基因（以下有時簡稱為cscA)的鹼基序列也有人報 α 亦即，CSCA 記載於 GenBank accession number ΑΕ005174 記 載的大腸桿菌0157株基因體序列的3274383〜3275816。 為了取得cscA，將大腸桿菌〇157株的基因體DNA作為模板使

利用 atggtaccgctggtggaacatatgacgcaatctcgattgcatg(序列 編號 42)、及 cgaattcttaacccagttgccagagtgc(序列編號 43)以 PCR 法放大，將得到的DNA片段以限制酶ΚρηΙ及EC0RI消化，獲得約 1470=的cscA片段。將該DNA片段與將前述pGAp_Ia(芽孢梭菌 ，巧菌來源乙醯乙酸去羧酶基因、芽孢梭菌屬細菌來源異丙醇去 氫酶基因表現載體）以限制酶ΚρηΙ及eC0RI消化過者混合，使用 接合酶接合彳^，轉形到大腸桿菌DH5a株勝任細胞（東洋紡(股） DNA-903)，獲得於含有安皮西林5〇/zg/mL的⑶瓊脂平板生長的 轉形體。從獲得的菌體回收質體，確認已正確***cscA，將該質 體命名為'pGAB-Ia-cscA。 - (pGAP-Ia-cscA/GAPpatoD基因體***Apgi株之建構）

將前述質體pGAP-Ia-cscA轉形到B株GAPpatoD基因體*** △fgi株的勝任細胞，於含有安皮西林5〇/zg/mL的LB 壤脂平板於 C培養一晚，獲得大腸桿菌pGAp_ia_cscA/GAPpat〇j)基因體插 入Apgi 株（以下有時簡稱為 pGAp_ia_cscA/BGAPpatoDZ\pgi 株）。 (利用pGAP-Ia-cscA/GAPpatoD基因體***Apgi株從蔗糖 生產異丙醇） 實施例3同樣生產異丙醇。惟，糖源使用5〇%(w/w)蔗糖代 替葡萄糖。培養開始起120小時後，取樣菌體培養液，以離心操 201124537 後 依照定法測定得刺培養上清中的生成物 ^累積^。又，測定値係、培養後的培養液與捕集水㈤中的合計 値。培養後的生的遭度與料醇的純度，各如表3所示。 --- -^tla-cscA/BGAPpatoD/Apgi 生成物（g/L) 異丙醇 64. 83 丙嗣 9.86 乙醇 0. 00 有機酸 〇. 00 丙酮酸 0.00 琥珀酸 0.00 乳酸 0.00 曱酸 0.00 乙酸 • — 1 合計 〇. 00 * —- 異丙醇純度 ' 74.69 (%) 86.8 大腸 葡萄㈣，咖酶的編二因仍= 高。又，也確認生產的異丙_量(=加而使異丙_純度指 的：丙產異丙醇為有 號的:申請編麟觸部 個文i說=口:所=;利申請案、及技術規格，^ 記載的情形上納==口=與胸 41 201124537 SEQUENCE LISTING <110> Mitsui Chemicals, Inc. <120> Isopropylalcohol-producing bacterium and Method for producing Isopropylalcohol <130> MT-F03084-00 <150> JP2009-249418 <151> 2009-10-29 <160〉 56 <170> Paten tin version 3.1 <210> 1 <211> 29

<212〉DN A <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 1 29 caggaattcg ctatatctgg ctctgcacg <210> 2 <211> 31

<212〉DN A <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cagtctagag caatactctt ctgattttga g 31 201124537 <210> 3 <211> 29

<212〉DN A <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 3 cagtctagat catcgtcgat atgtaggcc <210> 4 <211> 29

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gacctgcaga tcatccgtca gctgtacgc <210> 5 <211> 33

<212〉DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400〉 5 cgagctacat atgcaatgat tgacacgatt ccg 201124537 <210> 6 <211> 32 .

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 6 cgcgcgcatg ctatttgtta gtgaataaaa gg <210> 7 <211> 45

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 7 aatatgcatg ctggtggaac atatgaaagg ttttgcaatg ctagg <210> 8 <211> 44

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400〉 8 gcggatccgg taccttataa tataactact gctttaatta agtc <210> 9 <211> 44 201124537

<212〉DN A <213> Artificial Sequence <220 <223> primer <400> 9 atggatccgc tggtggaaca tatgaaaaat tgtgtcatcg tcag <210〉 10 <211> 42

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gcagaagctt gtctagatta attcaaccgt tcaatcacca tc <210> 11 <211> 51

<212〉DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gctctagagc tggtggaaca tatgaaaaca aaattgatga cattacaaga c <210〉 12 <211> 41

<212> DNA <213〉 Artificial Sequence 201124537 <220> <223〉primer <400> 12 tagcaagctt ctactcgagt tatttgctct cctgtgaaac g <210〉 13 <211> 44

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400〉 13 aagtctcgag ctggtggaac atatggatgc gaaacaacgt attg <210> 14 <211> 28

<212〉DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> primer <400> 14 ggccaagctt cataaatcac cccgttgc <210> 15 <211> 54

<212〉DNA <213> Artificial Sequence <220> 201124537 <223〉primer <400> 15 caggtaccgc tggtggaaca tatgttaaag gatgaagtaa ttaaacaaat tagc <210> 16 <211> 38

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcggatcctt acttaagata atcatatata acttcagc <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213〉Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 17 ttggtacctt tacatgctgt agcccagc <210> 18 <211> 27

<212〉DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer 201124537 <400 18 cgtctagata ggctgatttc agtctgg <210> 19 <211> 26 <212〉DN A <213> Artificial Sequence <220 <223> primer <400> 19 attctagaat catcaccaac ctgtcg <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gatattgccg aaagcgatcc <210> 21 <211> 26

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > primer <400 21 cagctgactc gacatcttgg ttaccg 201124537 <210> 22 <211> 27

<212〉DN A <213〉Artificial Sequence <220> <223> primer <400〉 22 cagctgcaag agggtcatta tatttcg 27 <210> 23 <211> 28

<212〉DN A <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 atctgcagta ctagcgtcag ttgatagc 28 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400〉 24 cgtctagatc ctgctgaatt gattcagg 28 201124537 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 25 tctctagact gaaaccgatg acagaagc <210> 26 <211〉 25

<212〉.DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 aaggtaccag gcaatcagta catcg <210> 27 <211> 30

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cgctcaattg caatgattga cacgattccg <210> 28 <211> 32 201124537

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> primer <400> 28 acagaattcg ctatttgtta gtgaataaaa gg <210〉 29 <211> 50

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 cgaattcgct ggtggaacat atgaaaacaa aattgatgac attacaagac <210> 30 <211> 30

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> primer <400> 30 gcggtacctt atttgctctc ctgtgaaacg <210> 31 <211> 31

<212〉DNA <213> Artificial Sequence 201124537 <220> <223> primer <400〉 31 gctctagatg ctgaaatcca ctagtcttgt c <210> 32 <211> 29

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tactgcagcg ttccagcacc ttatcaacc <210> 33 <211> 29

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉primer <400> 33 ggtctagagc a对gattgac acgattccg <210〉 34 <211> 29

<212〉DNA <213> Artificial Sequence <220〉 201124537 <223〉primer <400> 34 caggaattcg ctatatctgg ctctgcacg <210> 35 <211> 31

<212> DNA <213〉 Artificial Sequence <220> <223> primer <400〉 35 cagtctagag caatactctt ctgattttga g <210> 36 <211> 29

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 36 cagtctagat catcgtcgat atgtaggcc <210> 37 <211> 29

<212> DNA <213〉 Artificial Sequence <220> <223> primer 201124537 <400〉 37 gacctgcaga tcatccgtca gctgtacgc <210> 38 <211> 45

<212〉DN A <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 38 aatatgcatg ctggtggaac atatgaaagg ttttgcaatg ctagg <210〉 39 <211> 38 "

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400〉 39 gcggatcctt ataatataac tactgcttta attaagtc <210 40 <211> 54

<212> DNA <213〉 Artificial Sequence <220〉 <223> primer <400> 40 caggatccgc tggtggaaca tatgttaaag gatgaagtaa ttaaacaaat tagc 201124537 <210> 41 <211> 43

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 41 ggaattcggt accttactta agataatcat atataacttc age <210> 42 <211> 43

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 atggtaccgc tggtggaaca tatgacgcaa tetegattge atg <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 egaattetta acccagttgc cagagtgc 201124537 <210> 44 <211> 30

<212〉DN A <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 cgctcaattg caatgattga cacgattccg <210> 45 <211> 32

<212> DNA <213〉Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 45 acagaattcg ctatttgtta gtgaataaaa gg <210> 46 <211> 50

<212〉DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cgaattcgct ggtggaacat atgaaaacaa aattgatgac attacaagac <210> 47 <211> 30 201124537

<212〉DN A <213〉Artificial Sequence <220> <223〉primer <400〉 47 gcggtacctt atttgctctc ctgtgaaacg <210> 48 <211> 31

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gctctagatg ctgaaatcca ctagtcttgt c <210> 49 <211> 29

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉primer <400> 49 tactgcagcg ttccagcacc ttatcaacc <210 50 <211> 29

<212> DNA <213> Artificial Sequence 201124537 <220> <223> primer <400〉 50 ggtctagagc aatgattgac acgattccg *<210> 51 <211> 45 <212〉DN A <213> Artificial Sequence <220 <223> primer <400> 51 aatatgcatg ctggtggaac atatgaaagg ttttgcaatg ctagg <210〉 52 <211> 38

<212〉DN A <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gcggatcctt ataatataac tactgcttta attaagtc <210> 53 <211> 54

<212> DNA <213〉Artificial Sequence <220> <223〉 primer 201124537 <400> 53 caggatccgc tggtggaaca tatgttaaag gatgaagtaa ttaaacaaat tagc 54 <210 54 <211> 43

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400〉 54 ggaattcggt accttactta agataatcat atataacttc age 43 <210> 55 <211> 46

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220 <223〉primer <400> 55 46 caggatcccg gagaaagtet tatggcggta acgcaaacag cccagg <210> 56 <211> 45

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220 <223> primer <400> 56 cgtctagacg gagaaagtet tatgaagcaa acagtttata tegee 45

Claims (1)

1. 201124537 七、申請專利範圍： 1' 妨__性經去 3、 Ϊ=，第1項之生產異丙醇的大腸菌，其中該生產 酿ϊί ii級經賦予乙醒乙酸去_活性、異丙醇去ΐ 彳 · Α轉料雜、及硫觸活性的大腸菌。 4、 如Γί專利範圍第3項之生產異丙醇的大腸菌，其中該乙防 ίί酶Ϊ:活:藉JJ性、輔酶A轉移酶活性： 大腸桿菌屬細 的各酵素的編碼基因而獲得。 〒、且丄檀；源 5、 如申請專利範圍第3項之生產显 乙酸去羧酶活性及里丙醇去“η” ’其中戎乙醯 細菌來源的各酵素的編!係====菌屬 碼基因而獲得。¥入大喊菌屬細菌來源的各酵素的編 6、 如申請專利範圍第3項之峰吝思二# 乙酸去細每活性係藉由導2 = Τ巧腸菌、’其中該乙酿 碼基因而獲得’該異丙醇去氫二::梭，菌來源的酵素的編 源的酵素轉馬基因而獲得，：鯆：,藉由導入拜氏梭菌來 活性係藉由導入大腸桿；；诉A轉移酶活性及硫解酶 干固不源的各酵素的編碼基因而獲得。 如申請專利範圍第1項之生產料醇的大腸菌，其中在嚴糖 42 201124537 非PTS基因群當中至少具有蔗糖水解酵素基因。 8、 一種生產異丙醇的方法，包含使用如申請專利範圍第1項之 生產異丙醇的大腸菌從植物來源原料生產異丙醇。 八、圖式： 43