CN104854244A - 用于生产有机酸的重组微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明产生了共表达酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的重组微生物以生产有机酸。
Description
关于美国政府支持的声明
本发明的方面是在美国政府的支持下根据拨款号DE-FC36-02GO12001作出的。
相关申请的交叉引用以及以电子方式递交的材料的以引用方式的并入
本申请要求2012年10月2日提交的美国临时专利申请号61/708,998的优先权,该美国临时专利申请的公开内容特此以引用的方式整体并入本文。
本申请含有作为本公开的单独部分的呈计算机可读形式的序列表(文件名:40000A_SeqListing.txt,在2013年10月2日生成,20,065个字节),该序列表以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及被工程化以产生增加量的有机酸的微生物以及使用方法。
背景技术
有机酸具有在诸如聚合物、食品、药物以及化妆品等多种工业应用中取代以石油化学方式衍生的单体的潜能。使用基于生物的有机酸可以减小对化石燃料的依赖并且在减少二氧化碳产生方面有益于环境。
发明内容
本发明公开了用于生产有机酸的重组微生物。所公开的重组微生物表达酶葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶以及苹果酸脱氢酶,从而使得有机酸的产量增加。
以下编号的段落各自简明地限定了本发明的一个或多个示例性变化方案:
1.一种重组微生物,所述重组微生物表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶。
2.段落1的重组微生物,其中所述重组生物体是产丁二酸微生物。
3.段落1的重组微生物,所述重组微生物包含与琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)的16S核糖体RNA序列具有至少90%同一性的16S核糖体RNA序列。
4.段落1的重组微生物,所述重组微生物是琥珀酸放线杆菌、Bisgaard分类群(Bisgaard Taxon)6以及Bisgaard分类群10。
5.段落1至4中任一段落的重组微生物,所述重组微生物包含编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的异源多核苷酸或过表达的多核苷酸以及编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸或过表达的多核苷酸。
6.段落1至5中任一段落的重组微生物,其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶是琥珀酸放线杆菌酶。
7.段落1至5中任一段落的重组微生物,其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶是琥珀酸放线杆菌酶。
8.段落1至6中任一段落的重组微生物,其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶是大肠杆菌(E.coli)酶。
9.段落1至5中任一段落的重组微生物,其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶是大肠杆菌酶。
10.段落1至5中任一段落的重组微生物,其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶包含与SEQ ID NO:2中所示出的氨基酸序列具有至少约40%序列同一性的氨基酸序列。
11.段落1至5中任一段落的重组微生物,其中所述苹果酸脱氢酶包含与SEQ ID NO:4中所示出的氨基酸序列具有至少约60%序列同一性的氨基酸序列。
12.段落1至11中任一段落的重组微生物,其中所述微生物与单独表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶的微生物相比产生增加量的有机酸(例如丁二酸)。
13.段落1至12中任一段落的重组微生物,其中所述微生物能够产生约50g/L至150g/L浓度的丁二酸。
14.一种用于生产有机酸的方法,所述方法包括在发酵培养基中培养段落1至13中任一段落的重组微生物。
15.一种生产有机酸的方法,所述方法包括在有利于产生有机酸的条件下使用碳源培养重组微生物的步骤,其中所述重组微生物表达至少一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶。
16.段落15的方法,其中所述重组微生物表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶这两者。
17.一种生产有机酸的方法,所述方法包括在有利于产生有机酸的条件下使用碳源培养段落1至13中任一段落的重组微生物。
18.段落15至17中任一段落的方法,其中所述有机酸是丁二酸或丙酸。
19.段落18的方法,其中所述有机酸是丁二酸。
20.段落15至19中任一段落的方法,其中所述碳源是葡萄糖或山梨糖醇。
附图说明
图1描绘了pL88载体的示意图。
图2描绘了pISTONS1的示意图。
图3描绘了p830.60的示意图。
图4描绘了p856.78的示意图。
图5是来自大肠杆菌的Zwf酶的氨基酸序列(“查询”)与来自琥珀酸放线杆菌的Zwf酶的氨基酸序列(“sbjct”)之间的序列比较。
图6是来自大肠杆菌的Mdh酶的氨基酸序列(“查询”)与来自琥珀酸放线杆菌的Mdh酶的氨基酸序列(“sbjct”)之间的序列比较。
图7是来自黄曲霉(Aspergillus flavus)的Mdh酶的氨基酸序列(“查询”)与来自琥珀酸放线杆菌的Mdh酶的氨基酸序列(“sbjct”)之间的序列比较。
图8是p830.60中的琥珀酸放线杆菌zwf核酸序列。
图9是pISTONS1中的琥珀酸放线杆菌mdh核酸序列。
具体实施方式
在以下具体实施方式中,实施方案被足够详细地描述以使得本领域技术人员能够实施这些实施方案,并且应当理解的是,也可以利用其它实施方案并且可以进行化学上的和程序上的变化而不背离本发明主题的精神和范围。以下具体实施方式因此不应被视作具有限制性的意义,并且实施方案的范围仅由所附权利要求书限定。
术语“微生物”指的是单细胞生物体,如细菌、真菌或酵母。
术语“重组微生物”指的是如下的微生物,所述微生物经过改变、修饰或工程化(例如遗传工程化)以使它与产生它的天然存在的微生物或起始微生物相比表现出改变、改造或不同的基因型或表型(例如在遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。
遗传操作可以包括但不限于改变或修饰与特定基因的表达有关的调节序列或位点(例如通过使用强启动子、诱导型启动子或多重启动子);修饰特定基因的染色***置;改变靠近特定基因的核酸序列,如启动子区域中包括对于启动子活性来说重要的调节序列的序列、核糖体结合位点、或转录终止子;增加特定基因的拷贝数;修饰涉及特定基因产物的转录或翻译的蛋白质(例如调节蛋白、抑制因子、增强因子、转录激活因子等);或任何其它提高特定基因的表达的常规手段。
如本文所用的“有机酸”包括包含至少一个羧基的酸。任选地,所述有机酸是C1-C10有机酸,还任选地,所述有机酸包含两个羧基。举例来说,“有机酸”包括丁二酸或丙酸。有机酸的其它实例包括但不限于乳酸、苹果酸、柠檬酸、草酸以及酒石酸。如本文所用的有机酸还可以包括有机酸阴离子或其盐。举例来说,“丁二酸”可以被称为“丁二酸盐”;“丙酸”可以被称为“丙酸盐”。
“异源”指的是并非源于需要表达的特定细胞或生物体或并非是需要表达的特定细胞或生物体原生的任何多核苷酸或多肽。
“过表达”指的是多核苷酸表达而产生比该多核苷酸通常在宿主细胞中表达的水平更高的水平的产物(例如多肽或RNA)。过表达的多核苷酸一般是宿主细胞原生的多核苷酸,所述多核苷酸的产物以比通常存在于宿主细胞中的量大的量产生。过表达是通过例如而不限于使多核苷酸与和所述多核苷酸的原生启动子不同的启动子可操作地连接或将该多核苷酸的另外的拷贝引入到宿主细胞中来实现。
“源自于”生物体的多肽或多核苷酸包含与来自该生物体的参考多肽或多核苷酸相同的氨基酸序列或核酸序列,或任选地相对于原生氨基酸序列或核苷酸序列含有一处或多处修饰,如下文进一步所述,并且任选地与原生酶相比即使没有表现出更好的活性,也表现出相似的活性(例如原生酶的活性水平的至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少100%、或至少110%)。将了解的是,“源自于”生物体的多肽或多核苷酸不限于以物理方式从特定的宿主生物体中取出的多肽或多核苷酸。
此外在本文中,由端点表述数值范围时,包括该范围内所包括的所有数字(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。此外,公开范围时,包括公开了更宽范围内所包括的所有子范围(例如1至5公开了1至4、1.5至4.5、4至5等)。
本发明提供了用于经由发酵生产有机酸的经过改进的材料和方法。发酵性能通常通过以下三个参数来获得:滴度、生产率以及收率。滴度表示在发酵结束时发酵液中产物(例如有机酸,如丁二酸)的浓度。生产率或生产速率表示达到产物滴度的时间。收率是产物的质量/原料(例如糖,如葡萄糖)的质量的商数。所有这三个参数均影响发酵生产工艺的经济情况。高滴度有助于产物回收;必须蒸发或去除更少的水,从而需要更少的能量,这会降低工艺的操作成本。生产率与滴度相关联,为滴度增添了时间维度。高生产率意味着快速的发酵工艺,并且允许缩减发酵容器的尺寸,这是因为可以更频繁地运行该工艺。生产率主要影响发酵生产工艺的资金成本。收率影响该工艺的操作成本,即收率越高,则获得产物所需的原材料或原料越少。
滴度、生产率以及收率相互交织并且相互影响。在短时间内实现高滴度的发酵将产生高生产率,反之亦然。发酵产物的积聚或更高的滴度可以使生产减慢。收率与生产率呈负相关,这是因为在发酵中不仅使用原料来支持生物体生长、细胞繁殖以及构筑生物质,而且还使原料代谢成所需的产物。一般来说,更多的细胞将产生更多的产物并且将更快地产生产物,从而将使得生产率更高,但会使得收率更低。因此,发酵优化必须使所有这三个参数平衡以实现最为经济的工艺。最终的目标在于实现所有这三个参数的值均较高的工艺。
值得注意的是,发现在如本文所述的重组微生物(例如琥珀酸放线杆菌)中磷酸戊糖途径(或ED途径(Entner-Doudoroff pathway))和三羧酸循环中的酶同时过量产生以促进更高收率的丁二酸,所述收率是确定发酵工艺的经济可行性的关键因素。在这方面,本发明至少部分地以如下惊人的发现为基础:在微生物中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的产生使得有机酸的产量与由单独表达单一酶的微生物所实现的产量水平相比有所提高。磷酸戊糖循环(或ED途径)利用多种酶,包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(例如葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶,它也被称为间酶(Zwischenferment enzyme)或Zwf);6-磷酸葡糖酸内酯酶;6-磷酸葡糖酸脱氢酶(也被称为Gnd);核糖-5-磷酸异构酶A和B;磷酸核酮糖3-差向异构酶;转酮醇酶I和II;转醛醇酶A和B;6-磷酸葡糖酸脱水酶(Edd);以及2-酮-3-脱氧磷酸葡糖酸醛缩酶(Eda)。厌氧产生丁二酸中所用的三羧酸循环使用例如以下酶:磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶、以及反丁烯二酸还原酶。
在一个方面,本发明提供了一种重组微生物,所述重组微生物产生葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(例如Zwf)和苹果酸脱氢酶(例如Mdh)这两者,因此在各种实施方案中,所述重组微生物与未修饰的亲本微生物相比表现出提高的有机酸(例如丁二酸或丙酸)产量。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)和苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.37)的活性是本领域充分了解的。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化例如以下反应:D-葡萄糖-6-磷酸+NADP+=>6-磷酸-D-葡糖酸-1,5-内酯+NADPH。苹果酸脱氢酶使草酰乙酸盐转化成苹果酸盐,或使草酰乙酸转化成苹果酸,从而经由使用诸如但不限于NADH或NADPH之类的辅因子来还原底物。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶存在于多种多样的生物体中。这些酶中的一种或这两种酶可以是重组微生物原生的,但编码所述酶的多核苷酸的多个拷贝被引入到宿主细胞中以增加所述酶的产生。在一些实施方案中,重组微生物以相对于非重组微生物或起始微生物中存在的水平升高的水平表达原生的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或原生的苹果酸脱氢酶(例如“过表达”所述酶)。或者,这些酶中的一种或这两种酶并非重组微生物原生的。在各种实施方案中,多核苷酸源自于天然产生丁二酸或苹果酸的生物体。根据本发明的实施方案,所述多核苷酸是从诸如细菌、藻类、真菌、植物或动物等天然来源中分离而来;经由半合成途径产生(例如对多核苷酸的核酸序列进行密码子优化以在诸如大肠杆菌之类的特定宿主细胞中表达);或从头合成而来。
编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸(例如mdh基因)可以源自于例如琥珀酸放线杆菌(例如NC_009655)或大肠杆菌(EG10576(EcoCyc))或被证实具有酶活性的其它合适的来源。类似地,在各种实施方案中,编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸源自于大肠杆菌(例如EG11221(EcoCyc);登录号:ECK1853)或琥珀酸放线杆菌(例如基因库登录号ABR73607.1GI:150839636)。任选地,对多核苷酸进行密码子优化以促进在特定微生物中的表达。在一些实施方案中,重组微生物包含含有编码Zwf酶的核酸序列SEQ ID NO:1的多核苷酸和/或含有编码Mdh酶的核酸序列SEQ ID NO:3的多核苷酸。在本文中还涵盖包含为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%(或上述百分比的任何范围)的核酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中,变体多核苷酸编码具有Zwf或Mdh酶的一种或多种生物化学活性的多肽。变体多核苷酸可以包括例如zwf或mdh基因的片段。在一些实施方案中,重组微生物可以表达由琥珀酸放线杆菌、大肠杆菌、巴斯夫菌(Basfia)(例如产琥珀酸巴斯夫菌(Basfia succinicproducens))、曼氏杆菌(Mannheimia)(例如产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens))、酵母菌、曲霉或其变体表达的zwf或mdh基因。
本申请的发明人已经发现在单个发酵工艺中Zwf和Mdh酶这两者的表达使得诸如丁二酸或丙酸等的有机酸的产量增加。在一些实施方案中,可以使用共表达Zwf和Mdh的单一重组生物体。在其它实施方案中,编码zwf和mdh的基因在不同的生物体中表达,但在单个发酵工艺中利用这两种酶的组合表达来生产有机酸。本发明涵盖了一种重组微生物,所述重组微生物包含(例如微生物已被转化而具有)任选地与编码具有Zwf酶的一种或多种生物化学活性的多肽的多核苷酸组合的编码具有Mdh酶的一种或多种生物化学活性的多肽的多核苷酸,所述Zwf酶的一种或多种生物化学活性如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性和/或NADP还原酶活性。举例来说,合适的Zwf或Mdh酶是大肠杆菌Zwf或Mdh酶或其变体。换句话说,在各种实施方案中,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或苹果酸脱氢酶是大肠杆菌或琥珀酸放线杆菌酶。
代表性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氨基酸序列提供于SEQ ID NO:2中,该序列是琥珀酸放线杆菌Zwf氨基酸序列。重组微生物可以表达与Zwf酶的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2)具有至少约40%序列同一性,并且更理想地与Zwf酶的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2)具有至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、或至少约90%序列同一性的变体多肽。在各种实施方案中,所述变体多肽相对于参考序列包含一处或多处保守突变,即氨基酸被功能上相似的氨基酸置换。换句话说,保守性置换涉及氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域内加以定义,并且包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸以及组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸以及半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸以及色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸以及异亮氨酸)以及具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及组氨酸)。
代表性的苹果酸脱氢酶氨基酸序列提供于SEQ ID NO:4中,所述序列是琥珀酸放线杆菌Mdh氨基酸序列。重组微生物可以表达与Mdh酶的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:4)具有至少约50%或至少约60%序列同一性,并且更理想地与Mdh酶的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:4)具有至少约70%或80%或90%序列同一性的变体多肽。
在重组微生物的酶的背景下允许氨基酸序列内出现实质性变异。来自大肠杆菌与来自琥珀酸放线杆菌的Zwf酶的氨基酸序列例如共有44%的同一性,并且这两者在本发明的背景下均是合适的酶。参见图5。类似地,来自大肠杆菌与来自琥珀酸放线杆菌的Mdh酶的氨基酸序列共有69%的同一性,并且这两者在本发明的背景下均是合适的酶。参见图6。Mdh酶在不同的生物体之间一般是相当保守的。来自黄曲霉(一种丝状真菌)的Mdh酶的氨基酸序列与来自琥珀酸放线杆菌的Mdh酶序列表现出约50%的同一性,并且保持使草酰乙酸盐转化成苹果酸盐的能力。参见图7。
令人期望的是,变体多肽具有Zwf或Mdh酶的一种或多种生物化学活性,例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活性。变体多肽可以包括Zwf或Mdh酶的片段。评价葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性和苹果酸脱氢酶活性的方法是本领域已知的并且可商购自例如马萨诸塞州剑桥的Abcam公司(Abcam,Cambridge,MA)和密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。用于测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的示例性测定法描述于Rowley和Wolf,J.Bacteriology,173,968-977(1991);以及Wolf等人,J.Bacteriology,139,1093-1096(1979)中。反应的说明性条件如下:制备含有50mM Tris-HCl(pH 7.8)、10mM MgCl2、1mMNADP、1mM葡萄糖-6-磷酸以及细胞提取物的反应混合物,并且测量在340nm下的吸光度增加。在各种实施方案中,由所述多核苷酸编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶表现出SEQ ID NO:2的多肽的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或100%。由所述多核苷酸编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶可以表现出SEQ ID NO:2的多肽的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的大于100%(例如110%或更多、120%或更多、或130%或更多的活性)。作为另外一种选择或另外,由重组微生物产生的苹果酸脱氢酶表现出SEQ ID NO:4的多肽的苹果酸脱氢酶活性的至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或100%。由所述多核苷酸编码的苹果酸脱氢酶可以表现出SEQ ID NO:4的多肽的苹果酸脱氢酶活性的大于100%(例如110%或更多、120%或更多、或130%或更多的活性)。用于测定苹果酸脱氢酶活性的示例性测定法描述于Samuelov,J.Bacteriology,57,3013(1991)中。反应的说明性条件如下:制备含有100mM Tris-HCl(pH 8.1)、5mM草酰乙酸盐、0.3mM NADH、2mM DTT以及细胞提取物的反应混合物,并且测量在340nm下的吸光度减小(表示NADH的氧化)。
重组微生物可以源自于任何合适的微生物,例如像细菌细胞和其它原核细胞以及酵母细胞。通常,所述微生物能够以适合于商业生产的水平产生有机酸。对于制备如本文所述的重组微生物来说合适的微生物包括产丁二酸微生物。示例性微生物包括但不限于巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)的生物体。巴氏杆菌科成员的实例包括放线杆菌属(Actinobacillus)的成员,包括琥珀酸放线杆菌、Bisgaard分类群6(以保藏号15568保藏在瑞典哥德堡大学的培养物保藏中心(CultureCollection,University of Goteborg,Sweden,CCUG))、Bisgaard分类群10(以CCUG保藏号15572保藏)、产琥珀酸曼氏杆菌、产琥珀酸巴斯夫菌、大肠杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、嗜淀粉瘤胃杆菌(Ruminobacter amylophilus)、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolvens)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)、以及棒状杆菌(coryneform bacteria)(例如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentuin)、叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum));乳酸杆菌属(Lactobacillus)的成员;酵母(例如酵母菌属(Saccharomyces)的成员,如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae));以及其任何子集。在一些实施方案中,重组菌株可以(是)源自于如下的微生物,所述微生物的16S rRNA与琥珀酸放线杆菌的16S rRNA具有至少约90%的序列同一性(例如至少约95%的序列同一性)。举例来说,重组菌株可以源自于琥珀酸放线杆菌、Bisgaard分类群6或Bisgaard分类群10的菌株。
重组微生物可以表达zwf基因、mdh基因或这两者。zwf或mdh基因可以是重组微生物原生的。在其它实施方案中,zwf或mdh基因可以是异源的(即不是产生重组微生物的微生物原生的)。在一些实施方案中,对编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸和/或编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸(例如zwf或mdh基因)进行优化以在重组微生物中表达。举例来说,可以使zwf或mdh基因与促进基因相对于非重组微生物过表达的启动子可操作地连接。所述启动子可以是微生物内源性的(例如产生重组微生物的微生物原生的)或对于微生物来说是异源性的。在一些实施方案中,zwf和mdh基因来自于琥珀酸放线杆菌并且受它们的也来自于琥珀酸放线杆菌的对应的zwf和mdh启动子调节。
任选地对编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸和/或编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸(例如zwf或mdh基因)进行修饰以促进相应mRNA的翻译。举例来说,zwf或mdh基因可以经过修饰以包括在内源性的或原生的基因中不存在的密码子。这些非内源性密码子可以经过选择以反映重组微生物中的密码子使用频率。密码子使用表已被开发用于多种微生物并且是本领域已知的。举例来说,编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸和/或编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸(例如zwf或mdh基因)可以经过修饰以反映如美国专利号8,119,377中所提供的琥珀酸放线杆菌的密码子使用频率,该专利以引用的方式整体并入本文。
重组微生物可以源自于产生高水平的一种或多种有机酸(如丁二酸或丙酸)的菌株,或重组微生物可以经过选择或工程化以相对于非重组微生物产生高水平的或提高水平的一种或多种有机酸,如丁二酸或丙酸。
任选地,重组微生物经过选择或工程化(或这两者)以对相对高水平的不希望有的副产物具有抗性或产生相对低水平的不希望有的副产物。举例来说,在将编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的多核苷酸引入到细胞中(例如转化)后,任选地在一氟乙酸钠存在下培养重组微生物的群体以选择对相对高的乙酸盐水平具有抗性的菌株或产生相对低乙酸盐水平的菌株。不希望有的副产物包括但不限于甲酸盐(或甲酸)、乙酸盐(或乙酸)和/或丙酮酸盐(或丙酮酸)、乳酸盐、1.3-丙二醇以及乙醇。用于选择产生低乙酸盐水平的菌株的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,521,075和美国专利号5,573,931,这些专利以引用的方式并入本文,特别是有关它们对微生物菌株选择的论述。举例来说,可以通过在约1.0至约8.0g/L浓度的毒性乙酸盐衍生物(如一氟乙酸钠)存在下培养微生物来选择产生相对低乙酸盐水平的微生物的菌株。所选择的菌株在葡萄糖发酵中可以产生相对低的乙酸盐水平(例如低于约10g/L、低于约7g/L、低于约5g/L、或低于约2.0g/L)、甲酸盐(例如低于约2.0g/L)、和/或丙酮酸盐(例如低于约3.0g/L)。一种对于产生重组微生物或衍生物合适的一氟乙酸盐抗性菌株是以ATCC保藏号55618保藏的琥珀酸放线杆菌的菌株。还参见美国专利号5,573,931,该专利描述了用于制备对一氟乙酸盐具有抗性的微生物菌株的合适的方法。其它合适的一氟乙酸盐抗性菌株的实例包括FZ45和FZ53,它们也描述于美国专利号5,573,931中。
编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸和编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸(或具有Zwf或Mdh酶的一种或多种生物化学活性的多肽)可以通过利用本领域已知的方法(例如使用合适的引物进行PCR扩增并且克隆到合适的DNA载体中)来获得。合适的编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的zwf基因的多核苷酸序列已被公开。(参见例如基因库)。举例来说,琥珀酸放线杆菌zwf基因的多核苷酸序列已在美国专利号8,119,377中公布,该专利特此以引用方式并入本文。还参见能源部网站(Department of Energy website)联合基因组研究所(Joint Genome Institute)NCBI登录号NC_009655。大肠杆菌zwf基因交存于基因库中(例如以基因库登录号NC000913和基因库登录号M55005)。zwf基因或其变体可以通过使用适当的引物对微生物的基因组DNA进行PCR扩增来获得。
mdh序列可以例如从琥珀酸放线杆菌(基因库NC_009655)或大肠杆菌EG10576(EcoCyc)获得。
DNA载体可以是用于在重组微生物中表达一种或多种多核苷酸的任何合适的载体。合适的载体包括质粒、人工染色体(例如细菌人工染色体)和/或修饰的噬菌体(例如噬菌粒)。所述载体可以被设计成作为表观遗传元件存在和/或所述载体可以被设计成与微生物的基因组重组。
多核苷酸通常包括与编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶(即具有Zwf或Mdh酶活性的多肽)的核酸序列可操作地连接的启动子。所述启动子可以是产生重组微生物的微生物内源性的或原生的或对于微生物来说是异源性的(例如源自于除重组微生物以外的来源)。此外,所述启动子可以是所选的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶编码序列(即zwf或mdh基因)的原生启动子或可以是除所选的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶的原生启动子以外的启动子(例如非zwf或mdh基因启动子)。在一些实施方案中,重组微生物是琥珀酸放线杆菌菌株,并且使用琥珀酸放线杆菌zwf或mdh启动子。在其它实施方案中,启动子可以是包括核苷酸1-258的琥珀酸放线杆菌磷酸烯醇丙酮酸(PckA)羧激酶启动子(以基因库登录号AY308832交存)或其变体,如美国专利号8,119,377中所公开,该专利特此以引用的方式并入本文。可以使用可以引导所需序列在所需的微生物中表达的任何合适的启动子(例如诱导型启动子、组成型启动子、强启动子等)。可以使用本领域已知的克隆方法使启动子与编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸或编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸(例如zwf或mdh基因)可操作地连接。举例来说,可以通过使用包括相容的限制性内切酶识别位点的引物进行PCR对启动子和编码序列(例如zwf和mdh基因)进行扩增。然后可以使用酶将扩增了的启动子和编码序列消化并且克隆到包括合适的多克隆位点的适当载体中。
此外,一种或多种多核苷酸或载体可以包括或编码选择标记。所述选择标记可以赋予对一种或多种抗生素药剂的抗性。举例来说,选择标记可以包括氨苄西林(ampicillin)抗性、链霉素(streptomycin)抗性、卡那霉素(kanamycin)抗性、四环素(tetracycline)抗性、氯霉素(chloramphenicol)抗性、磺胺(sulfonamide)抗性的基因、或这些标记的组合。通常,选择标记与促进标记表达的启动子可操作地连接。包括选择标记的质粒和其它克隆载体是本领域已知的。
可以使用任何合适的宿主细胞来储存或繁殖包含所述一种或多种多核苷酸的载体。所述宿主细胞任选地表达DNA分子上的编码序列。合适的宿主细胞还可以包括能够在发酵过程中产生诸如丁二酸或丙酸等有机酸的细胞(即产生有机酸的细胞),所产生的有机酸的浓度适合于商业生产(例如至少约20g/L,更合适地至少约50g/L,并且更合适地至少约100g/L)。
在本发明的背景下,用于生产有机酸的方法通常包括使用重组微生物使营养培养基发酵。在一些实施方案中,重组微生物在发酵培养基中表达zwf和mdh基因。举例来说,所述方法可以包括使用表达zwf和mdh基因(例如原生的琥珀酸放线杆菌zwf或mdh基因)的重组琥珀酸放线杆菌使营养培养基发酵。可以设想的是,可以使用基因和生物体的其它组合来使培养基发酵以生产有机酸。举例来说,可以在合适的生物体中用异源启动子使异源性zwf基因和内源性mdh基因这两者表达,或任何其它合适的组合。
因此,在一个方面,本发明提供了一种生产有机酸的方法,所述方法包括在有利于产生有机酸的条件下使用碳源培养本文所述的重组微生物。所述重组微生物例如包含编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的异源多核苷酸或过表达的多核苷酸以及编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸或过表达的多核苷酸,并且产生所述酶以使得能够产生所需的有机酸。在发酵中产生的有机酸可以包括例如丁二酸或丙酸、或本文所述的任何其它有机酸。
一种合适的用于本文所述的方法的重组微生物是表达大肠杆菌zwf基因的琥珀酸放线杆菌的重组菌株,该重组菌株以ATCC保藏号PTA-6255保藏。可以在发酵营养培养基上将这种生物体与另一种表达mdh基因的重组生物体这两者组合培养以产生有机酸。或者,对以ATCC保藏号PTA-6255保藏的菌株进行修饰以过表达mdh或产生异源Mdh。所述方法还可以包括使用表达zwf或mdh或这两种基因(例如,如来自大肠杆菌的异源zwf或mdh基因)的Bisgaard分类群6或Bisgaard分类群10的重组菌株使营养培养基发酵以产生丁二酸。
营养培养基通常包括可发酵的碳源。可发酵的碳源可以由可发酵的生物质提供。可发酵的生物质可以源自于多种作物和/或原料,包括:糖类作物(例如糖、甜菜、甜高粱、甘蔗、饲用甜菜);淀粉作物(例如谷物,如玉米、小麦、高粱、大麦,以及块茎,如马铃薯和甘薯);纤维素作物(例如玉米秸、玉米纤维、小麦秸,以及饲草,如苏丹草饲草、以及高粱)。可以对生物质进行处理以促进可发酵的碳源(例如糖)的释放。举例来说,可以用诸如纤维素酶和/或木聚糖酶等酶对生物质进行处理以释放单糖,和/或可以用热、蒸汽或酸对生物质进行处理以促进降解。可发酵的碳源可以包括单糖和糖醇,如葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇、半乳糖、木糖、木糖醇、***糖、***糖醇以及其混合物。在一些实施方案中,可以使用未纯化的经过最低限度处理的或粗的碳源进行有机酸生产。在一个实施方案中,碳源可以包括与美国临时专利申请号61/708998相同日期提交的名称为“Integrated Systems&Methods for Organic Acid Productions(用于生产有机酸的集成***和方法)”的美国专利申请序列号60/709,036中所述的粗多元醇,本申请要求该美国临时专利申请号61/708998的优先权,该美国专利申请序列号60/709,036以引用的方式整体并入本文。粗多元醇包括例如经由例如发酵或氢化产生并且另外进行最低限度的处理的多元醇。举例来说,未对粗多元醇进行过滤步骤以去除固体。因而,粗多元醇与精制的多元醇相比不太纯。
本发明的方法产生相对于诸如糖(例如葡萄糖或山梨糖醇)之类的输入碳源相对高的丁二酸收率。举例来说,所述方法任选地具有相对于碳源(例如葡萄糖)输入量(g)至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、或至少约95%(或上述百分比的任何范围)的丁二酸收率(g),或相对于碳源(例如葡萄糖)输入量(g)至少56%(例如至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、或至少约95%,或上述百分比的任何范围)的丙酸收率(g)。在一些实施方案中,所述收率可以被计算为丁二酸或丙酸产量(mol)/碳源(例如葡萄糖)输入量(mol)的百分比。因而,所述方法可以具有相对于碳源(例如葡萄糖)输入量(mol)至少约154%的丁二酸或丙酸收率(mol)。理想的是,所述方法可以具有相对于碳源(例如葡萄糖)输入量(mol)至少约130%或至少约170%的丁二酸或丙酸收率(mol)。
所述方法可以产生相对高的丁二酸浓度(例如相对于在发酵中使用非重组微生物的方法)。举例来说,发酵可以达到至少约50g/L丁二酸(例如至少约60g/L、至少约70g/L、或至少约80g/L)的浓度。理想的是,发酵可以达到至少约90g/L丁二酸(例如至少约100g/L丁二酸、至少约110g/L丁二酸、或至少约120g/L丁二酸)的浓度,或更理想的是,至少约130g/L丁二酸的浓度,并且甚至更理想的是,至少约140g/L的浓度。在一些实施方案中,发酵通常不产生显著水平的不希望有的副产物,如乙酸盐、甲酸盐、丙酮酸盐以及其混合物(例如不多于约11.0g/L的乙酸盐、不多于约10.0g/L的乙酸盐、不多于约9.0g/L的乙酸盐、不多于约8.0g/L的乙酸盐、不多于约7.0g/L的乙酸盐、不多于约6.0g/L的乙酸盐、不多于约5.0g/L的乙酸盐、不多于约4.0g/L的乙酸盐、不多于约3.0g/L、或不多于约2.0g/L的乙酸盐(例如1.5g/L或更少、或1.0g/L或更少);不多于约2.0g/L的甲酸盐(例如1.5g/L或更少、或1.0g/L或更少);和/或不多于约3.0g/L的丙酮酸盐(例如2.5g/L或更少、或2.0g/L或更少、或1.5g/L或更少、或1.0g/L或更少))。
本文所述的方法任选地产生相对高的生产速率。在各种实施方案中,所述方法实现至少约1.0g/L-h、至少约1.5g/L-h、至少约2.0g/L-h、至少约2.5g/L-h、至少约3.0g/L-h、至少约3.5g/L-h、或至少约4.0g/L-h的生产率。
在一个实施方案中,重组微生物是表达异源zwf和mdh基因的琥珀酸放线杆菌。可以对异源zwf和mdh基因进行优化以在琥珀酸放线杆菌中表达。异源zwf和mdh基因可以由大肠杆菌编码。举例来说,重组生物体是以ATCC保藏号PTA-6255保藏的琥珀酸放线杆菌(美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA)),该琥珀酸放线杆菌任选地经过修饰以过量产生Mdh。替代性重组微生物是以ATCC保藏号PTA-120462保藏的琥珀酸放线杆菌菌株,该琥珀酸放线杆菌菌株是与亲本(未修饰)琥珀酸放线杆菌菌株相比产生增加水平的Zwf和Mdh的菌株。所述重组菌株能够产生约50g/L至约150g/L浓度的丁二酸或丙酸(例如在利用合适的碳源的发酵***中)。重组菌株可以对至少约1g/L的一氟乙酸钠的水平具有抗性。
在另一个实施方案中,重组菌株是琥珀酸放线杆菌,所述琥珀酸放线杆菌包括含有与异源zwf或mdh基因可操作地连接的琥珀酸放线杆菌的转录启动子(例如与Zwf编码序列连接的琥珀酸放线杆菌启动子和与Mdh编码序列连接的琥珀酸放线杆菌启动子)的DNA分子(即多核苷酸)。所述转录启动子可以包括琥珀酸放线杆菌磷酸烯醇丙酮酸(PckA)羧激酶启动子或其变体,它的序列公开在美国专利号8,119,377中。异源zwf基因可以编码大肠杆菌间酶或其变体。异源mdh基因可以编码大肠杆菌Mdh酶或其变体。任选地,zwf基因和/或mdh基因可以被优化以在琥珀酸放线杆菌中表达。DNA分子可以是表观遗传的(例如存在于质粒上)。DNA分子可以包括选择标记(例如卡那霉素抗性、氨苄西林抗性、链霉素抗性、磺胺抗性、四环素抗性、氯霉素抗性或其组合)。
在一些实施方案中,DNA分子(多核苷酸)包含产丁二酸微生物的转录启动子,所述转录启动子与异源zwf基因可操作地连接。该转录启动子可以包括zwf启动子。DNA分子可以存在于质粒内。DNA分子可以存在于宿主细胞(例如产生约50g/L至约150g/L的浓度的丁二酸或丙酸的宿主细胞)中。
在一个实施方案中,提供了用于生产丁二酸的方法。该方法包括使用表达异源zwf基因以产生葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的重组微生物,任选地联同表达异源mdh基因以产生苹果酸脱氢酶的第二重组微生物一起使营养培养基发酵。在各种实施方案中,重组微生物表达异源mdh基因和异源zwf基因。重组微生物可以包括琥珀酸放线杆菌的重组菌株(例如以ATCC保藏号PTA-6255保藏的琥珀酸放线杆菌重组菌株)。该重组微生物可以包括Bisgaard分类群6、Bisgaard分类群10等的重组菌株。异源zwf基因可以包括大肠杆菌zwf基因。异源mdh基因可以包括大肠杆菌mdh基因。任选地,所述重组菌株对至少约1g/L的一氟乙酸钠水平具有抗性。任选地,所述重组菌株能够产生约50g/L至约150g/L浓度的丁二酸或丙酸。营养培养基可以包括发酵糖(例如葡萄糖)。通常,所述方法产生相对于葡萄糖(g)至少约100%的丁二酸收率(g)。
在另一个实施方案中,重组微生物是产丁二酸微生物的重组菌株。所述重组微生物包含(例如已被转化而具有)异源zwf基因(即编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的异源多核苷酸)。异源zwf基因可以被优化以在微生物中表达。在一些实施方案中,异源zwf基因可以编码大肠杆菌Zwf酶。
在另一个实施方案中,重组微生物是产丁二酸微生物的重组菌株,所述重组菌株已被转化而具有包括与编码具有Zwf酶活性的多肽的多核苷酸可操作地连接的磷酸烯醇丙酮酸(PckA)羧激酶的转录启动子的DNA分子(多核苷酸)。重组微生物任选地已被转化而具有包括与编码具有Mdh酶活性的多肽的多核苷酸可操作地连接的磷酸烯醇丙酮酸(PckA)羧激酶的转录启动子的DNA分子(多核苷酸)。转录启动子可以包括琥珀酸放线杆菌磷酸烯醇丙酮酸(PckA)羧激酶启动子。在另一个实施方案中,重组微生物是被转化而具有表观遗传的DNA分子的重组菌株。所述DNA分子可以存在于质粒上。
在另一个实施方案中,重组微生物是能够产生约50g/L至约150g/L浓度的丁二酸或丙酸的重组菌株。
所述重组菌株可以对至少约1g/L的一氟乙酸钠水平具有抗性。在一些实施方案中,使用以ATCC保藏号PTA-6255保藏的重组琥珀酸放线杆菌产生重组菌株,或重组菌株是以ATCC保藏号PTA-120462保藏的琥珀酸放线杆菌。
在另一个实施方案中,在包括使用重组微生物使营养培养基发酵的方法中使用重组微生物产生丁二酸或丙酸。营养培养基通常包括发酵糖,如葡萄糖或山梨糖醇。所述方法可以产生相对于葡萄糖(g)至少约70%、至少约80%、至少约90%、或至少约100%的丁二酸收率(g)。所述方法可以产生相对于葡萄糖(g)至少约62%至约72%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%(或这些百分比以内的任何范围)的丙酸(g)。
用于生产有机酸的方法可以包括在含有碳源(例如粗山梨糖醇)的合适的发酵液中培养合适的微生物。在一个实施方案中,发酵液还含有氮源、无机盐、维生素或生长促进因子等。在一些实施方案中,盐、铵源以及其它营养培养基要求可以从玉米浆(CSL)中获得,所述玉米浆是玉米湿磨工业的副产物。对于盐,钠源包括但不限于Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、Na2CO3、NaHCO3、NaCl、以及来自有机盐(例如谷氨酸一钠、乙酸钠)的Na。钠浓度可以在约1200mg/L至约6800mg/L的范围内。在一些实施方案中,钠浓度是约3000mg/l至约3500mg/L。本发明不限于钠盐;其它盐也被涵盖作为本发明的一部分。
通过将碳源和发酵液在任何合适的发酵罐中组合,并且使用合适的微生物进行接种来进行发酵。可以在有助于微生物生长以及产生合适的有机酸的条件下进行好氧发酵或厌氧发酵。在一个实施方案中,将发酵温度维持在至少约25℃并且低于约50℃的范围内。在一些实施方案中,温度是约30℃至约39℃(例如约38℃)。在一些实施方案中,温度是约30℃至约37℃。
发酵液还可以包括甜菜碱或加成盐或其混合物。在一些实施方案中,所述甜菜碱是甜菜碱-HCl、甜菜碱游离碱等。
在其它实施方案中,所述甜菜碱可以作为含有甜菜碱的饲料产品的组分存在。示例性甜菜碱或含有甜菜碱的至少一种饲料产品包括甜菜碱、氨基酸发酵副产物可溶物、含有甜菜碱的糖蜜、浓缩的分离器副产物、浓缩糖蜜可溶物、酒糟、或其任何混合物。含有甜菜碱的饲料产品的其它实例包括浓缩的提取的谷氨酸发酵产品、来自赖氨酸发酵生产的氨基酸发酵副产物可溶物、来自苏氨酸发酵生产的氨基酸发酵副产物可溶物、或来自色氨酸发酵生产的氨基酸发酵副产物可溶物。甜菜碱浓度可以在约0.05g/l至约2g/l的范围内。在一些实施方案中,所用的甜菜碱浓度可以是0.2g/l至0.5g/l。
在一个实施方案中,在发酵开始时发酵液的pH值在约pH 6-7的范围内或在约pH 7至约pH 8.0的范围内(例如约pH 8.0)。发酵pH值可以通过添加碱来控制,例如可以控制pH值以在发酵进行时实现约pH 5至约pH 7、或约pH 6至约pH 7(例如约pH 6.6)、或约pH 4.5至约6、或约5至约5.5。镁碱在本发明的背景下适合于控制pH值。在一个实施方案中,提供MgCO3以在CO2气氛中控制pH值从而任选地实现约pH 6.0至约pH 7.0(例如约pH 6.4至约pH 6.8),优选地约pH 6.6的近似pH值。Mg(OH)2也是适当的。可以使用NH4OH、NaOH、气态NH3、Na3PO4或它们的碳酸盐形式,尽管所述方法并不取决于具体的pH值控制剂。
实施例
实施例1
微生物菌株和质粒
琥珀酸放线杆菌菌株FZ45和FZ53是对一氟乙酸钠具有抗性的琥珀酸放线杆菌130Z的稳定性细菌变体。参见Guettler等人,INT'L J.SYST.BACT.(1999)49:207-216;以及美国专利号5,573,931。大肠杆菌-琥珀酸放线杆菌穿梭载体pLS88(以ATCC保藏号86980保藏在美国典型培养物保藏中心)是从加拿大曼尼托巴大学(University of Manitoba,Canada)的Leslie Slaney博士获得的。质粒pLS88被描述为已从杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)中分离并且可以赋予对磺胺、链霉素以及卡那霉素的抗性。
遗传操作:
重组DNA操作大体上遵循本领域所述的方法。通过碱裂解法制备质粒DNA。从1.5ml培养物中提取的多拷贝质粒的典型再悬浮体积是50μl。更大的DNA制备根据制造商的说明书使用Qiagen质粒纯化Midi和Maxi试剂盒。限制性核酸内切酶、分子量标准以及预染色的标记购自新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs)和英杰公司(Invitrogen),并且按照制造商的建议进行消化,不同的是使用约5倍过量的酶。在Tris-乙酸-琼脂糖凝胶上,在溴化乙锭存在下分析DNA。使用Qiagen凝胶提取试剂盒,根据制造商的说明书将DNA从琼脂糖凝胶中提取出并且纯化。使用虾碱性磷酸酶或小牛碱性磷酸酶(罗氏公司(Roche))联同限制性消化一起将DNA去磷酸化。将磷酸酶在70℃下热灭活15分钟或通过穿过Qiagen纯化柱来热灭活。在25℃下,使用在20μl反应体积中相对于载体DNA 3至5倍摩尔过量的***物和1μl的T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室公司)进行连接,持续1小时。通过使用购自英杰公司的“文库效率感受态细胞(libraryefficiency competent cell)”,遵循制造商的说明书来进行大肠杆菌转化。
将使用连接混合物的转化体在未经稀释的情况下接种到含有适当抗生素的标准LB培养板上。使用Perkin Elmer手册作为准则进行PCR扩增。引物设计是基于所公开的序列(如由美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,NCBI)数据库所提供)并且从英杰生命科学公司(Invitrogen Life Sciences)获得。所述引物包括工程化的限制性内切酶识别位点。使用Vector NTI程序分析引物的二聚体和发夹结构形成以及解链温度。所有引物均是从密歇根州大分子结构设施(Michigan State Macromolecular Structure Facility)定制的。在Eppendorf梯度主循环仪(Eppendorf Gradient Master Cycler)中或在Perkin Elmer热循环仪中进行PCR扩增。使用Vector NTI程序确定每一个引物对的起始退火温度。用于消化扩增产物的限制性内切酶购自英杰公司或新英格兰生物实验室公司。
通过在补充有葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤TSB培养基中在MgCO3存在下培养细胞来制备用于电穿孔的琥珀酸放线杆菌感受态细胞并且在对数期早期至中期收获所述细胞。通过低速离心去除未被使用的碳酸盐。将细胞旋降,用无菌水洗涤两次,用10%v/v甘油洗涤两次,并且再悬浮于0.01×原始培养物体积的10%甘油中。使细胞悬浮于小等分部分中,快速冷冻并且储存在-80℃。利用0.1cm的小槽和BioRad GenePulser在400W、25mF、1.8kV的设置下,使用40μl所制备的细胞进行电穿孔。在电穿孔后,立即将1ml室温的TSB培养基添加到小槽中并且在37℃下孵育1小时。将细胞溶液接种到含有适当抗生素的TSB琼脂平板上,并且在37℃下在CO2气氛中孵育3天。
质粒p830.60
使用引物TD299(SEQ ID No.5)和TD300(SEQ ID No.6)从琥珀酸放线杆菌FZ45基因组DNA扩增琥珀酸放线杆菌zwf基因和启动子,并且将它们***pJR762.47的BamH1和Sal1位点中,该pJR762.47是pLS88的衍生物,具有多克隆位点,所述多克隆位点被***pLS88的EcoRI和SphI位点中并且如图3中所示。
p830.60中的克隆基因具有1781个碱基对(bp),编码区起始于位置272(在图8中粗体加下划线的atg)并且终止于位置1757(在图8中粗体加下划线的taa)并且它的序列以SEQ ID NO:1提供。启动子序列起始于起点并且终止于编码序列之前。
质粒pISTONS1
使用引物TD223(SEQ ID NO:7)和TD218(SEQ ID NO:8)从琥珀酸放线杆菌FZ45基因组DNA扩增琥珀酸放线杆菌Mdh基因和启动子。将扩增的DNA克隆成EcoRI片段并且***pLS88的EcoRI位点中,如图2中所示。pISTONS1中的mdh基因具有1558个bp,其中编码区起始于303(在图9中粗体加下划线的atg)并且终止于1239(在图9中粗体加下划线的taa)并且以SEQ ID NO:3提供,并且启动子被显示从序列的起点开始并且终止于编码区之前。
质粒p856.78
使用限制性内切酶EcoRI从pISTONS1中切除琥珀酸放线杆菌mdh基因,将末端用克列诺聚合酶(Klenow Polymerase)补平以制备钝端并且与质粒p830.60连接,已使用限制性核酸内切酶BamHI将该质粒p830.60线性化并且已用克列诺聚合酶将末端补平。这两种基因被布置成头对尾***物。
实施例2
用山梨糖醇通过Zwf和Mdh酶的过表达来生产丁二酸
将琥珀酸放线杆菌菌株(FZ53;FZ53/pLS88;FZ53/p830.60;FZ53/pPISTONS1;以及FZ53/p856.78)培养在容纳2L培养基的发酵容器(Bioflo III,新布朗斯维克公司(New Brunswick))中。该培养基含有120g/L的山梨糖醇、30g/L(固体)的玉米浆(CSL)(10%-12%固体,来自ADM公司)、1.6g/L的Mg(OH)2、0.2mg/L的生物素、0.5g/L的甜菜碱盐酸盐、0.2mg/L的MSG、6.5mM磷酸钠、7g/L的Na2CO3、0.5g/L的酵母提取物(AG900)。
使用来自小瓶培养物的6.25%接种物对发酵罐进行接种,所述小瓶培养物被培养在与发酵罐相同的培养基(但省去了Mg(OH)2)中并且在38℃下在以150rpm进行的恒定振荡下被孵育13小时。
将接种过的发酵罐在38℃下在以380转/分钟进行搅拌以及0.025至0.05vvmCO2的鼓泡下进行孵育。通过自动添加6M Mg(OH)2或添加120g/L的MgCO3将发酵培养基的pH值维持在pH 6.8。
在12小时至22小时之间执行碳源进料,在此期间将15g另外的碳源添加至发酵容器中。
糖和有机酸测定:
每隔一段时间从发酵罐中取出样品并且通过以10,000×g进行离心4分钟来去除固体。在分析之前经由0.2μM过滤器对上清液进行过滤。通过HPLC(Agilent1200系列)测定培养上清液和滤液中糖和有机酸的浓度。使用Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)柱(伯乐公司(Bio-Rad)),其中流动相由0.013N H2SO4组成,流速为1.4毫升/分钟。使用折射率检测器(Waters 2414)对分析物峰进行检测和定量,通过参考购自西格玛公司(Sigma)的有机酸标准溶液确定对峰的鉴定。下表1示出了对在山梨糖醇上培养的多种琥珀酸放线杆菌转化体的发酵评价。
表1:
使用不含待由宿主过表达的基因的“空”载体(pLS88)对琥珀酸放线杆菌进行转化并未显著影响在山梨糖醇是碳源时丁二酸发酵的性能。zwf基因或mdh基因作为单个基因(分别是载体p830.60和pPISTONS1)过表达提高了丁二酸的收率。在Mdh酶过表达的情况下获得最高的收率,然而达到这种高收率是以生产率为代价的,在这种转化体的情况下的生产率低于在表达Zwf的菌株、未经过转化的亲本以及具有空载体的转化体的情况下的生产率。
zwf和mdh基因的共表达也产生高收率(等同于对于mdh转化体所观测到的收率),而且支持提高的生产率(与zwf转化体无显著不同)。
已证实,Zwf和Mdh酶的共表达在山梨糖醇是碳源时会以高生产率、收率以及滴度促进丁二酸的形成。
实施例3
用葡萄糖通过Zwf和Mdh酶的过表达来生产丁二酸
在50mL厌氧小瓶中将实施例1中所述的琥珀酸放线杆菌菌株(FZ53;FZ53/pLS88;FZ53/p830.60;FZ53/pISTONS1;以及FZ53/p856.78)培养在与实施例2中所述的培养基相同的培养基中,其中改动之处在于瓶中预装有6g MgCO3以维持培养物的pH值。使用来自相同种菌小瓶的2.5mL(5%v/v接种物)对小瓶进行接种。将小瓶在38℃下在以150转/分钟进行的恒定振荡下孵育。
如实施例2中所述对培养物滤液进行分析。分析结果的实例如下(在46小时之时计算):FZ53pLS88实现了80.0g/L的滴度、1.74g/L-h的生产率以及每克糖0.76g丁二酸的收率;FZ53p830.60(Zwf)实现了100.6g/L的滴度、2.19g/L-h的生产率以及每克糖0.89g丁二酸的收率;FZ53pPISTONS1(Mdh)实现了80.2g/L的滴度、1.87g/L-h的生产率以及每克糖0.77g丁二酸的收率;并且FZ53p878.56(Zwf+Mdh)实现了110.0g/L的滴度、2.16g/L-h的生产率、以及每克糖0.96g丁二酸的收率。还参见表2,该表2汇总了对依赖葡萄糖的琥珀酸放线杆菌转化体的发酵评价的结果。
表2:
虽然Zwf的过表达被确认是有益的,会提高由葡萄糖生产丁二酸的生产率和收率这两者,但单独Mdh过表达并未表现出任何有益的影响。Zwf和Mdh的共表达相比于单独Zwf的表达的确提供益处,能够提高收率同时不显著降低丁二酸生产率。另外的观测结果提供于下文中。
使用琥珀酸放线杆菌进行的丁二酸生产是一种厌氧生产工艺。该生物体是一种天然的产丁二酸菌。该产生过程是通过将培养物补充以H2或更具还原性的底物(例如山梨糖醇或甘露醇)来刺激的,这表明还原能力(NADPH)限制了琥珀酸放线杆菌中丁二酸的产生。考虑到这一点,使Zwf(直接产生NADPH并且使葡萄糖分流到磷酸戊糖途径或ED途径中的酶)在琥珀酸放线杆菌中过表达。这种干预会在收率方面提高丁二酸发酵性能。因此,经由磷酸戊糖途径或ED途径使葡萄糖从糖酵解途径中分流(以及增加细胞内NADPH池)有益于丁二酸产生。
对琥珀酸放线杆菌的生物化学研究以及与产生丁二酸的大肠杆菌的比较证实涉及使磷酸烯醇丙酮酸转化成丁二酸的酶(磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶、苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶以及反丁烯二酸还原酶)在琥珀酸放线杆菌中高度表达,这表明了琥珀酸放线杆菌的巨大的积聚丁二酸的能力背后的机制。具体来说,苹果酸脱氢酶的活性被发现在琥珀酸放线杆菌中是非常高的,是大肠杆菌中的苹果酸脱氢酶活性的超过10倍(2100纳摩尔/分钟/毫克蛋白质相比于160纳摩尔/分钟/毫克蛋白质(Van der Werf,Arch.Microbiol.,167,332-342(1997)))。因此,苹果酸脱氢酶活性预期不会限制琥珀酸放线杆菌中丁二酸的产生。实际上,单独Mdh过表达与缺乏异源的编码Mdh的多核苷酸的对照微生物相比未能显著地提高滴度、生产率或收率。参见表2。这一观测结果似乎确认了在对琥珀酸放线杆菌进行生物化学分析后所得出的结论,即Mdh由于它天然高的内源性活性而不是琥珀酸放线杆菌中产生丁二酸的速率限制步骤。
基于对于单独Mdh过表达的生物化学研究和表2中所报告的数据,并不会预料到琥珀酸放线杆菌中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸(zwf)和编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸(mdh)共表达的益处。
然而,在对琥珀酸放线杆菌的过表达Zwf的菌株进行表征期间,惊人地观测到HPLC副产物曲线中与Zwf过表达有关的并且随Zwf过表达而增加的峰。该峰被确定对应于草酰乙酸盐,所述草酰乙酸盐是一种容易脱羧、二聚化并且转化成苹果酸盐的非常不稳定的化合物。这表明,出人意料地,在琥珀酸放线杆菌中过表达Zwf时,Mdh变成丁二酸产生中的限制酶,从而导致它的底物(草酰乙酸盐)积聚。不希望受具体理论所束缚,作为副产物的草酰乙酸盐的积聚使碳流分流,从而降低发酵的丁二酸收率。因此,与证实琥珀酸放线杆菌中Mdh活性高的生物化学体外研究相反,在体内酶活性出人意料地受到限制。Mdh与Zwf的组合的过量产生克服了该限制因素,从而避免草酰乙酸盐积聚并且提高丁二酸的收率。
这个实施例证实在使用葡萄糖作为碳源时,Zwf和Mdh的共表达与任何一种单个酶的表达相比提供益处。先前已证实Mdh在琥珀酸放线杆菌产生丁二酸中不具限制活性。出人意料地发现,Mdh的过表达在Zwf也过表达时会使琥珀酸放线杆菌产生丁二酸的性能得到提高。
一些另外的非限制性实施方案提供于下文中以进一步举例说明本发明。
在一个实施方案中,重组微生物表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中,单个酶或这两种酶对于生物体来说是异源性的。在各种实施方案中,异源多核苷酸的表达或编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或苹果酸脱氢酶的多核苷酸的过表达使得酶活性与在亲本(未修饰的匹配的)微生物中所观测到的酶活性相比增加到大于两倍、五倍、十倍、25倍、50倍、100倍、或250倍、或500倍。
在各个方面,本发明的微生物与不包含所述一种或多种异源多核苷酸或不过表达所述一种或多种多核苷酸的在其它方面相似的微生物相比产生更多的有机酸(或者更快速地或更高效地产生有机酸)。在各种实施方案中,所述微生物在相同的时间范围内比不包含所述一种或多种异源多核苷酸或不过表达所述一种或多种多核苷酸的在其它方面相似的微生物多产生至少2%、至少3%、至少5%、至少6%、至少7%、至少10%、至少12%、至少15%、至少17%、至少20%、至少25%、或至少30%的有机酸。作为另外一种选择或另外,所述微生物表现出比未修饰的(亲本)微生物好至少2%、至少3%、至少5%、至少6%、至少7%、至少10%、至少12%、至少15%、至少17%、至少20%、至少25%、或至少30%的生产率水平。作为另外一种选择或另外,所述微生物在收率方面表现出与未修饰的(亲本)微生物相比至少2%、至少3%、至少5%、至少6%、至少7%、至少10%、至少12%、至少15%、至少17%、至少20%、至少25%、或至少30%的提高。
在其它实施方案中,这两种酶均是由琥珀酸放线杆菌表达的。在另外的其它实施方案中,这两种酶均是由大肠杆菌表达的。在另外的其它实施方案中,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是由大肠杆菌编码的并且苹果酸脱氢酶是由琥珀酸放线杆菌编码的。可以将所述基因组合颠倒。在其它实施方案中,表达Zwf和Mdh的微生物包括巴氏杆菌科的成员。在另外的其它实施方案中,所述微生物包括琥珀酸放线杆菌、Bisgaard分类群6以及Bisgaard分类群10或与琥珀酸放线杆菌具有大于90%的rRNA序列同一性的微生物。表达这些基因的宿主细胞可以是琥珀酸放线杆菌。在另外的其它实施方案中,这些基因可以在不同的生物体中表达,但这两种生物体均被纳入发酵培养基中以产生有机酸。在一个实施方案中,有机酸是丁二酸或丙酸。
在一些实施方案中,可以使用粗多元醇作为碳源。在其它实施方案中,培养所述微生物的发酵液或培养基包括玉米浆、甜菜碱、钠、镁离子及其组合。
本发明公开了磷酸戊糖途径(或ED途径)和还原三羧酸循环中所用的酶的表达会使得与单独的单个酶表达相比有机酸的产量增加。
本申请意图涵盖本发明主题的任何改动方案或变化方案。举例来说,虽然主要被描述为共表达zwf和mdh的单个重组生物体,但可以设想的是,可以在单个发酵工艺中包括各自表达zwf和mdh的多种生物体以生产有机酸。本发明包括本文所述的微生物的保持重组微生物的表型特征的变体或子代。还提供了本文所述的微生物的基本上纯的单一培养物(即包含至少80%或至少90%的所需微生物的培养物)。
Claims (20)
1.一种重组微生物,所述重组微生物表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶。
2.如权利要求1所述的重组微生物,其中所述重组生物体是产丁二酸微生物。
3.如权利要求1所述的重组微生物,其包含与琥珀酸放线杆菌的16S核糖体RNA序列具有至少90%同一性的16S核糖体RNA序列。
4.如权利要求1所述的重组微生物,其是琥珀酸放线杆菌、Bisgaard分类群6或Bisgaard分类群10。
5.如权利要求1至4中任一项所述的重组微生物,其包含编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的异源多核苷酸或过表达的多核苷酸以及编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸或过表达的多核苷酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的重组微生物,其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶是琥珀酸放线杆菌酶。
7.如权利要求1至5中任一项所述的重组微生物,其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶是琥珀酸放线杆菌酶。
8.如权利要求1至6中任一项所述的重组微生物,其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶是大肠杆菌酶。
9.如权利要求1至5中任一项所述的重组微生物,其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶是大肠杆菌酶。
10.如权利要求1至5中任一项所述的重组微生物,其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶包含与SEQ ID NO:2中所示出的氨基酸序列具有至少约40%序列同一性的氨基酸序列。
11.如权利要求1至5中任一项所述的重组微生物,其中所述苹果酸脱氢酶包含与SEQ ID NO:4中所示出的氨基酸序列具有至少约60%序列同一性的氨基酸序列。
12.如权利要求1至11中任一项所述的重组微生物,其中所述微生物与单独表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶的微生物相比产生增加量的有机酸。
13.如权利要求1至12中任一项所述的重组微生物,其中所述微生物能够产生约50g/L至150g/L浓度的丁二酸。
14.一种用于生产有机酸的方法,其包括在发酵培养基中培养如权利要求1至13中任一项所述的重组微生物。
15.一种生产有机酸的方法,其包括以下步骤:
在有利于产生有机酸的条件下使用碳源培养重组微生物,其中所述重组微生物表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的至少一种。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述重组微生物表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶这两者。
17.一种生产有机酸的方法,其包括在有利于产生有机酸的条件下使用碳源培养如权利要求1至13中任一项所述的重组微生物。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法,其中所述有机酸是丁二酸或丙酸。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述有机酸是丁二酸。
20.如权利要求15至19中任一项所述的方法,其中所述碳源是葡萄糖或山梨糖醇。
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |