201124135 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於一種硫化氫產生酶抑制劑，係以兒茶素類 作爲有效成分。 【先前技術】 硫化氫是具有刺激性味道的氣體，已知具有刺激皮膚 黏膜，還有引起呼吸麻痺等的毒性。其毒性在社會層面亦 被視爲問題’而希望能夠進行硫化氫的除去。硫化氫在自 然界是被含於火山氣體或溫泉等之中，人爲生產則是藉由 石油化學工業等方式。另外，也會有因爲厭氣性細菌等的 作用使硫化物被還原而產生硫化氫的情形，例如厭氣性細 菌在污物或排水等之中繁殖而產生硫化氫。另外，在產生 硫化氫的細菌之中，也有口腔內細菌或腸內細菌在生物體 內生存。該等細菌係以食物殘渣或生物體內的蛋白質作爲 原料而生產硫化氫。甚至還已知在生物體內會產生內因性 硫化氫。 已知硫化氫毒性的作用機制，係硫化氫的高反應性造 成對皮膚黏膜的刺激，以及對細胞色素C氧化酶的抑制。 由於細胞色素C氧化酶的抑制作用會急速發生，因此暴露 於高濃度硫化氫的情況，肺中的氧分壓急速降低以至於昏 倒。另外還有文獻指出硫化氫在腦內會增強N M D A受體的 活性（非專利文獻1 )。 如上所述’硫化氫也會由口腔內細菌或腸內細菌產生 -5- 201124135 。由口腔內細菌或腸內細菌所產生的硫化氫，與自然界或 工業級生產的硫化氫相比規模較小。然而，如果在生物體 內產生硫化氫，該個體會變成在非常封閉的狀態下暴露於 硫化氫，其影響爲直接性的。另外，所產生的硫化氫，會 導致被稱爲口臭或腸內臭氣這些令人厭惡、不愉快的氣味 。因此，正殷切期望有辦法阻礙或抑制由口腔內細菌或腸 內細菌所產生的硫化氫。另外，在呼出的氣體中，揮發性 硫化物（VSC )之內，硫化氫、甲硫醇及二甲基硫占了約 9 0%，硫化氫可說是口臭的主要原因之一。 在口腔內，脫落的上皮細胞或白血球、食物殘渣等， 會被來自於細菌的蛋白酶分解成半胱氨酸或甲硫胺酸等含 硫胺基酸，其後因爲硫化氫產生酶或甲硫氨酸酶的作用而 產生硫化氫。已有文獻指出在口腔內的硫化氫產生酶爲半 胱氨酸脫毓基酶或胱硫醚合成酶等。 專利文獻1揭示了由假單胞菌屬細菌或大腸菌精製的 揮發性硫化合物生合成抑制劑。然而，該抑制劑係以特定 的醛、十一烯醛、脂環式酮等香料作爲有效成分，目的爲 使用於家庭用品，並不能安全地對人體等使用。 專利文獻2揭示了 一種腸內硫化氫減低組成物，其中 含有水溶性難消化性糖質作爲有效成分。然而，專利文獻 2的腸內硫化氫減低效果只限於腸內，關於其減低的機制 仍然不明。 專利文獻3揭示了一種鎭痛用組成物，能夠阻礙、抑 制生物體內硫化氫的產生。但是，專利文獻3含DL-块丙基 201124135 甘胺酸及θ -氰基丙胺酸的鎭痛用組成物，係抑制胱硫醚 r -裂解酶’以抑制生物體內產生內因性硫化氫。 非專利文獻4的兒茶素衍生物，對於來自牙齦卟啉單 胞菌的蛋白酶表現出抑制。但是關於硫化氫產生酶的抑制 ，並無揭示或者提示。 非專利文獻5的綠茶兒茶素，對於金屬蛋白酶表現出 抑制。 但是關於硫化氫產生酶的抑制，亦並無揭示或者提示 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1]日本特開2008-173441號公報 [專利文獻2]日本特開2007-99672號公報 [專利文獻3]日本特開2007- 1 1 27 3 5號公報 [非專利文獻] [非專利文獻 1] Abe, K，Kimura H，J. Neurosci. 16, 1 066-7 1 , 1 996 [非專利文獻 2] Persson S, Edlund Μ-Β, Claesson R, Carlsson J :Oral Microbiol Immunol. 1 9 9 0; 5:1 95-20 1 [非專利文獻 3] Tanaka M, Yamamoto Y，Kuboniwa M, Nonaka A, Nishida N, Maeda K, Kataoka K, Nagata H, Shizukuishi S : Microbes and Infection 2007; 6: 1 078- 1 08 3 [非專利文獻 4] Okamoto M，Sugimoto A,Leung K-P， 201124135
Nakayama K, Kamaguchi A, Maeda N: Oral Microbiol. Immunol. 2004; 19: 118-120 [非專利文獻 5] Demeule M，Brossard M，Page M, Gingras D, Beliveau R: Biochim Biophys Acta. 2000; 1478: 51-60. 【發明內容】 [發明所欲解決之課題] 本發明以抑制硫化氫的產生爲目的，特別是提供硫化 氫產生酶抑制劑作爲課題。 [用於解決課題之方法] 本發明人等爲了解決上述課題，注目於無副作用、安 全性高、自古以來一直被使用的綠茶，來自其中的成分會 抑制細菌的硫化氫產生，實施測試的結果，發現兒茶素類 具有硫化氫產生酶抑制活性，而完成本發明。 [發明之效果] 依據本發明’藉由使用兒茶素類作爲有效成分，能夠 有效地抑制硫化氫產生酶，可阻礙或抑制硫化氫的產生。 另外，兒茶素類爲來自於綠茶的成分，安全性高、印 象良好。因此，以兒茶素類作爲有效成分的硫化氫產生酶 抑制劑容易被消費者接受。 201124135 【實施方式】 本發明提供一種硫化氫產生酶抑制劑’係以兒茶素類 作爲有效成分。 兒茶素（catechin)狹義而言’是指Ci5H1406、分子 量2 9 0.2 7，木本植物的木芯所富含的水溶性多價酚，廣義 而言包含其衍生物的多酚。在本說明書中’爲了使定義明 確，兒茶素是指狹義的兒茶素，在兒茶素類這樣的情況， 是指兒茶素及其衍生物一系列的多酚。兒茶素類，尤其以 茶中所含的茶兒茶素爲所周知。兒茶素類已知有（+ )-兒茶素、（_)·表兒茶素、（―）-表掊兒茶素、（一）· 表兒茶素掊酸酯、（一）-表掊兒茶素掊酸酯、（一）-掊 兒茶素掊酸酯、（一）-兒茶素掊酸酯等。 第二，本發明提供一種硫化氫抑制劑，其中兒茶素類 係（—）-表兒茶素掊酸酯、（-)-表掊兒茶素掊酸酯、 (一）-掊兒茶素掊酸酯、（一）·兒茶素掊酸酯或該等混 合物作爲有效成分。 第三，本發明提供一種硫化氫產生酶抑制劑，係以（ 一）-表兒茶素掊酸酯、（一）-表掊兒茶素掊酸酯、 )-掊兒茶素掊酸酯、（一）-兒茶素掊酸酯之任一者、或 該等混合物作爲有效成分，並抑制來自於具核梭桿菌（ Fusobacterium nucleatum )、牙銀卩卜啉單胞菌( Porphyromonasg gingivalis )、或齒垢密螺旋體（ Treponema denticola)的硫化氫產生酶。 已知具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體任 -9- 201124135 一者皆爲口腔內細菌，硫化氫或甲硫醇的生產能力高，另 外還已知其爲牙周病菌（非專利文獻2、非專利文獻3 )。 本發明另外還提供一種飲食品，係含有前述硫化氫產 生酶抑制劑。飮食品是指包含生鮮食品、肉、魚等動物性 食品、榖物、蔬菜等植物性食品、乳製品、麵包、即時食 品等加工食品、點心類等嗜好食品、甘味料、調味料等烹 飪調味用材料、健康食品，特殊用途食品、水、清涼飲用 水、酒精飲料、茶等飲料、食品加工材料、食品添加物等 〇 本發明進一步還提供一種含有前述硫化氫產生酶抑制 劑之口腔用組成物。口腔用組成物，可採用牙膏、液體牙 膏、液狀牙膏、濕潤牙膏等牙膏類、漱口劑、口腔洗劑、 喉錠劑、口香糖等形態。 以下對本發明舉例說明，而本發明之範圍並不受以下 範例侷限。 [實施例1 ] 進行關於兒茶素類對硫化氫產生酶及甲硫氨酸酶酶抑 制活性的實驗。亦即，使用半胱氨酸及甲硫胺酸作爲基質 ，加入來自於具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋 體的粗酵素液，將各試藥混合，並且定量甲硫氨酸酶的生 成物：α-酮酪酸及甲硫醇、或硫化氫產生酶的生成物： 丙酮酸及硫化氫，藉此測定對甲硫氨酸酶及硫化氫產生酶 的抑制活性。 -10 - 201124135 材料及方法 1 -1材料 1 ·1 2 3 -1硫化氣產生酶抑制劑候選 使用以下試藥作爲硫化氫產生酶抑制劑候選。亦即， 兒茶素類係使用（ + )-兒茶素、（一）·表兒茶素、（-)-表掊兒茶素、（一）-表兒茶素掊酸酯、（一）-表掊兒 茶素掊酸酯、（一）-掊兒茶素掊酸酯、（一）-兒茶素掊 酸酯（兒茶素類由Nagara Science購得）、及没食子酸、 氯化鋅。該等抑制劑候選，在本說明書之中有採用以下簡 記的情形，（+ )-兒茶素：C、（一）-表兒茶素：EC、 (_ )-表掊兒茶素：EGC、（—）-表兒茶素掊酸酯： ECg、（一）-表掊兒茶素掊酸酯：EGCg、（—）-掊兒茶 素掊酸酯：GCg、（一）-兒茶素掊酸酯：Cg、没食子酸： G、氯化鋅：ZnCl2。没食子酸已知有殺菌活性，其衍生物 被使用作爲口腔用組成物。氯化鋅已知有口臭預防活性， 而被使用於漱口劑。 -11 - 1 -1 - 2使用菌株 2 硫化氫產生細菌，係使用具核梭桿菌（本說明書中有 簡記爲F . η的情形）、牙齦卟咐單胞菌（本說明書中有簡 記爲P.g的情形）、齒垢密螺旋體（本說明書中有簡記爲 T · d的情形）。具核梭桿菌使用j C μ 8 5 3 2菌株，牙齦卟啉單 胞菌使用W83菌株，齒垢密螺旋體使用ATCC寄存編號 3 5405之菌株。 201124135 1 - 2測試方法 1-2-1由各菌調製粗酵素液 將 F.n 植菌於 Trypticase Soy Broth ( TSB) 15ml，進行 厭氣培養直到生長達定常期。另外，Trypticase Soy Broth (TSB)係使 Trypticase Soy Broth ( DIFCO) 3g 與 Yeast Extract ( DIFCO ) 0.3g 溶於 100ml 水之後，加入 hemin ( 5mg/ml in 0.1N NaOH) 0.1ml 與 menadione ( 0.5mg/ml in 50%EtOH ) 0· 1ml而調製。 以上述培養作爲前培養，然後進一步植菌於TSB200ml ，從生長達定常期開始至24小時後（培養期間2days )， 在3 7 °C進行厭氣培養。 接下來，以3,000xg、lOmin、4°C將培養液離心分離 ，除去培養基成分，回收菌體。其後加入50mM Tris-HCl 緩衝液（ρΗ7·5 )(使三羥甲基胺基甲烷（分子量121 ) 6.〇5g溶於水，並以HC1調整成PH7.5後，定量爲1L而調製 )，進一步離心並將菌體洗淨後，除去緩衝液，將菌體冷 凍於-80 °C。進一步使菌體懸浮於20〜25ml的Tris-HCl緩 衝液中，以超音波將細胞膜打碎（20W，30secxl5times， 〇°C )。 以20,000xg、30min、4°C將其離心，以上清液作爲粗 酵素液。粗酵素液係使用DC Protein Assay kit ( Pierce) 進行蛋白質定量，稀釋成在測試系統中最終濃度爲0.3 mg protein/ml而使用。 與F.n相同地，以TSB培養基培養P.g。另外，T.d係以 -12- 201124135 TYGVS培養基進行培養。培養時間爲7天。關於P.g及T.d 粗酵素液之調製，係與F.n相同的方式進行。 另外，TYGVS培養基之調製如以下所述。亦即將以下 I液〜111液進一步與不活化的兔血清1 0 〇m 1加以混合而調製 I液： 將 heart infusion broth 5g、 tryptone 1 〇g、 yeast extract lOg、明膠 lOg、硫酸銨 〇.5g、K2HP04 〇_5g、 MgS04 O.lg製成750ml之水溶液，調整成pH7.0後，在121 t高壓滅菌1 5分鐘。 II液： 將L-半胱氨酸HC1 lg、 葡萄糖lg、 丙酮酸鈉〇 . 2 5 g、 VFA液（將醋酸1.7ml、丙酸0.6ml、正酪酸〇.4ml、正 纈草酸0.1ml、異纈草酸0.1ml、異酪酸0.1ml、DL-metylbutyric acid 0.1ml及蒸餾水 27_9ml力□以混合）5ml、 TPP液（於硫胺素焦磷酸0.25 g添加蒸餾水100ml並混 合）5ml、 1 -N KOH 1 6ml 加以混合，進一步加水製成50ml水溶液，調整成 PH7.2後，過濾滅菌。 -13- 201124135 III 液： 使果膠lg溶於蒸餾水100ml，並在121 °c高壓滅菌15分 鐘。 1_2-2以比色定量進行的硫化氫產生酶（半胱氨酸脫毓基酶 )抑制測試 硫化氫產生酶的一種：半胱氨酸脫锍基酶，能夠由半 腕氣酸產生丙酮酸、氨及硫化氫。在以比色定量進行的硫 化氫產生酶抑制測試中，係以半胱氨酸爲基質，由半胱氨 酸脫毓基酶所產生的丙酮酸量作爲指標，比較各試藥對硫 化氫產生酶的抑制活性。 溶液之調製 如以下方式調製出300mM半胱氨酸溶液、酶-輔酶混 合溶液、試樣溶液、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙（MB TH) 反應溶液。 300mM半胱氨酸溶液：以Tris-HCl緩衝液將半胱氨酸 稀釋成爲300mM。 酶-輔酶混合溶液：在正要開始測試之前，以Tris-HC1緩衝液將反應系統中粗酵素液之蛋白質量調製成爲 〇.3mg/ml、5·-磷酸吡哆醛成爲0.05mM。 試樣溶液：以Tris-HCl緩衝液將氯化鋅或兒茶素類稀 釋成各濃度》 3-甲基-2·苯并噻唑啉酮腙（MBTH )反應溶液：使 -14- 201124135 MBTH30mg溶於50ml蒸餾水。其後，添加1M醋酸鈉緩衝液 100ml ( ρΗ5·0)(使醋酸鈉82.03g溶於水，並以醋酸調整 成PH5.0之後，定量爲1L而調製）。 丙酮酸之定量 在3 00mM半胱氨酸溶液0.1 ml及試樣溶液〇.2ml加入酶 —輔酶混合溶液〇 . 7 m 1，在3 7 °C震盪。1小時後，加入6 %過 氯酸0.5ml，使反應停止，離心分離（3，000xg、1〇分鐘、4 °C )後，回收上清液。 於上清液〇.4ml添加MBTH反應溶液1.2ml，使其在50 °C反應3 0分鐘。以醋酸鈉緩衝液將反應液稀釋3倍，測定 3 3 5 n m的吸光度。全部的測試進行2次，求其平均値。另外 還進行丙酮酸檢量線的製作。 抑制率 將加入試樣溶液時的丙酮酸量定爲Pi，加入Tris-HCl 緩衝液代替抑制劑溶液時的丙酮酸量定爲P()，由以下方式 求得抑制率。 抑制率（％ ) = ( P〇- Pi ) /PqX1〇〇 -15- 201124135 酸酶抑制測試中，係由甲硫氨酸酶產生的α -酮酪酸之量 作爲指標，比較各試藥對甲硫氨酸酶的抑制活性。 試藥之調製 如以下所述方式，調製出3 00mM甲硫胺酸溶液。關於 酶-輔酶混合溶液、試樣溶液、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙 (MBTH )反應溶液之調製，係與上述相同的方式進行。 3 00mM甲硫胺酸溶液：以Tris-HCl緩衝液將甲硫胺酸 稀釋成300mM。 α -酮酪酸之定量
在3 OOmM甲硫胺酸溶液0.1 ml及試樣溶液0.2ml加入酶 —輔酶混合溶液〇.7ml，在37°C震盪。1小時後，加入6%過 氯酸0.5ml使反應停止，離心分離（ 3,000xg、10分鐘、4°C )後，回收上清液。 在上清液0.4ml添加MBTH反應溶液1.2ml，使其在50 °C反應30分鐘。以醋酸鈉緩衝液將反應液稀釋3倍，測定 在3 3 5nm的吸光度。全部的測試進行2次，求其平均値。另 外還進彳7 α-酮酷酸檢量線的製作。 抑制率 將加入試樣溶液時的α -酮酪酸量定爲Ki，加入Tris-HC1緩衝液以代替抑制劑溶液時的α -酮酪酸量定爲Kq，由 以下方式求得甲硫氨酸酶的抑制率。 -16- 201124135
抑制率（％) = (K〇-Ki) /KoxlOO 1 -2-4藉由氣相層析進行的硫化氫產生酶抑制測試 硫化氫產生酶能夠由半胱氨酸產生硫化氫。在藉由氣 相層析進行的硫化氫產生酶抑制測試中，係以半胱氨酸作 爲基質，由硫化氫產生酶產生的硫化氫量作爲指標，比較 各試藥對硫化氫產生酶的抑制活性。 硫化氫的定量 在試管中加入L -半胱氨酸溶液0 · 1 m 1、試樣（抑制劑 候選）溶液〇 . 2 m 1、酶一輔酶混合溶液0 · 7 m 1，以橡膠栓密 封，在3 7 °C水浴攪拌同時保溫。6 0分鐘後，加入3 Μ磷酸水 溶液，使反應停止後，進一步保溫於3 7 °C並攪拌1 0分鐘。 抽取頂空氣體（headspace gas)在F.n的情況爲15yl、P.g 則爲1 0 0 1、T · d爲5 0 /z丨，並以氣相層析測定硫化氫量。 另外，分析條件如以下所述。 管柱：HP-PLOT/Q ( ψ 0.53mmx30m) 溫度：70°C (2.5min)—以 30°C/min升溫至 190°C — 190 °C (3.5min)
偵測器：FPD 分流比：4 8 : 1 注入量：15、50及1〇〇仁1 1 - 2 - 5藉由氣相層析進行的甲硫氨酸酶抑制測試 -17- 201124135 測定對甲硫氨酸酶的酶抑制活性，以作爲硫化氫產生 酶的對照。甲硫氨酸酶係以甲硫胺酸作爲基質，產生甲硫 醇、氨及〇：·酮酪酸。在藉由氣相層析進行的甲硫氨酸酶 抑制測試中，係以由甲硫氨酸酶產生的甲硫醇之量作爲指 標，比較各試藥對甲硫氨酸酶的抑制活性。 甲硫醇之定量 在試管中加入L-甲硫胺酸溶液0· lml、試樣溶液0.2ml 、酶—輔酶混合溶液〇.7ml，以橡膠栓密封，在37 °C水浴 攪拌同時保溫。60分鐘後，加入3M磷酸水溶液，使反應停 止後，進一步保溫於37 °C並攪拌10分鐘。抽取頂空氣體， 在F.n的情況爲40 μ 1、P.g及T.d爲200 // 1，以氣相層析測 定甲硫醇量。另外，分析條件如同上述。 2-3結果
2-3-1藉由比色定量進行的兒茶素類產生的F.η的硫化氫產 生酶（半胱氨酸脫锍基酶）及甲硫氨酸酶抑制測試之結果 將1-2-2之結果揭示於表1、2，將1-2-3的結果揭示於 表3。兒茶素類對F.n的硫化氫產生酶（半胱氨酸脫毓基酶 )抑制活性的高低順序爲Cg> GCg> EGCg> ECg>没食子 酸、（+ ) -C，特別是在Cg、GCg、EGCg及ECg具有高抑 制活性。兒茶素類對F.n的甲硫氨酸酶的抑制活性高低順 序爲EGCg > ECg > EGC〉EC、没食子酸、C，特別是在 EGCg及ECg具有高抑制活性。此時的IC50在EGCg爲0.4mM -18- 201124135 '在 E C g 爲 〇 _ 8 m Μ。 [表1] 表1各種兒茶素類對於F.n硫化氫產生酶（半胱氨酸脫毓 一_____^酶）的抑制宅_ ----- —MH#· / HV J 1 抑制劑濃度 抑制率（％) UM) 没食子酸 （ + )-C EC EGC ECfi EGCg 1.50 4.6 1.6 0.1 0.0 40.3 53.2 [表2] 表1 各種兒茶素類對於F . __碁酶）的抑制率 η硫化氫 產生酶 (半胱氨酸脫锍 制率 抑制劑濃度 (mM) Cg 抑制率（％) GCg EGCg 78.8 68.1 54 [表3] 鱼種兒茶素類對於F.n 甲硫氨酸酶的抑 抑制劑濃度 抑制率（％) (mM) 没食子酸 ( + )-C EC EGC ECg EGCg 2.00 10.7 8.1 11.0 25.3 83.8 82.1 1.00 9.9 5.7 8.2 17.9 63.8 75.1 0.44 9.6 2.7 5.1 12.3 29.3 50.5 0.22 9.2 2.1 4.4 6.6 15.5 26.4 _____〇JJ 7.9 — 3.4 2.1 10.9 13.2 -19- 1 -2-2藉由比色進行的EGCg對於En、P.g及T.d的酶抑制測 2 試 201124135 將1-2-2的硫化氫產生酶抑制測試結果及1-2-3的甲硫 氨酸酶抑制測試之中，EGCg與氯化鋅抑制活性的比較揭 示於圖1。另外將1C 50揭示於表4。圖1中，白點是EGCg， 黑點是指氯化鋅的結果。另外，已知氯化鋅具有口臭預防 活性，是被期待能夠抑制硫化氫產生酶及甲硫氨酸酶的物 質。由圖1的結果看來，關於甲硫氨酸酶的抑制，在來自 F.n、P.g及T.d的任一個情況中，由氯化辞產生的抑制活性 皆高於由EGCg產生的抑制活性。另一方面，關於硫化氫 的產生，在來自F.n、P.g及T.d的任一個情況中，由EGCg 產生的抑制活性皆高於由氯化鋅產生的抑制活性。由表4 也可得到同樣的結果。 [表4] 表 4 來自 F.nucleatum JCM8532、P.gingivalis W83 及 T.denticola ATCC3 5405的粗酵素液的IC50 (比色分析） 甲硫氨酸酶 硫化氫產生酶 IC50 (mM) 氯化鋅 EGCg 氯化鋅 EGCg F.n JCM8532 0.038 0.363 2.080 1.336 P.g W83 0.007 0.131 1.571 0.189 T.d ATCC35405 0.009 0.259 2.223 0.199 2-3-3藉由氣相層析進行的EGCg對於F.n、P.g及T.d的酶抑 制測試 將1-2-4之硫化氫產生酶抑制測試及1-2-5之甲硫氨酸 酶抑制測試結果揭示於圖2。另外，關於1C 5 0係揭示於表5 。由圖2之結果看來，關於甲硫氨酸酶的抑制’在來自F.n -20- 201124135 、P.g及T.d的任一個情況中’由氯化鋅產生的抑制活性皆 高於由E G C g產生的抑制活性。另一方面，關於硫化氫的 產生，在來自F.n、P.g及T.d的任一個情況中，由EGCg產 生的抑制活性皆高於'由氯彳匕鋅產生的抑1制活性°由表5也 可得到同樣的結# ° [表5] 表 5 來自 F.nucleatum JCM8532、P.gingivalis W83及 T.denticola ATCC3 5405的粗酵素液的IC50 (氣相層析分析） 甲硫氨酸酶 硫化氫產生酶 IC50 ( mM ) 氯化鋅 EGCg 氯化鋅 EGCg F.n JCM8532 0.039 0.351 2.369 1.106 P.g W83 0.003 0.078 1.840 0.136 T.d ATCC35405 0.009 0.175 1.812 0.133 2 - 4實施例1之總結 由以上可知’兒茶素類其中的GCg、Cg、ECg及EGCg 具有硫化氫產生酶抑制活性。特別是明顯具有對硫化氫產 生酶的一種：半胱氨酸脫巯基酶的抑制活性。進一步可知 E G C g之活性大幅高於氯化鋅之活性。可知e G C g之硫化氫 產生酶抑制活性，在來自P.g及T.d的粗酵素液中活性特別 高’而且在來自F.n的粗酵素液之中也會表現出活性。 [實施例2] 以吊法製造含有本發明由兒茶素類所構成之硫化氫產 生酶抑制劑的牙膏、口腔噴劑、喉錠、口香糖、糖果、軟 -21 - 201124135 糖、飲料。於以下揭示該等配方。另外，本發明品之範圍 不會受該等所限制。 牙膏之配方 碳酸鈣 50.0重量％ 甘油 20.0 羧甲基纖維素 2.0 月桂基硫酸鈉 2.0 香料 1.0 糖精 0.1 EGCg 1.0 洗必泰（chlorhexidine) 0.01 _其餘部分 100.0 口腔噴劑之配方 乙醇 1 0.0重量％ 甘油 5.0 香料 0.05 著色劑 0.00 1 ECg 1 .0 水 其餘部分 100.0 -22- 201124135 喉錠之配方 葡萄糖 7 3 . 3重量％ 乳糖 16.0 ***膠 6.0 香料 1.0 單氟磷酸鈉 0.7 GCg 1.0 乳糖 2.0 100.0 口香糖之配方 口香膠基材 2 0.0重量％ 砂糖 54.7 葡萄糖 15.3 水飴 9.3 EGCg 0.2 香料 0.5 100.0 糖果之配方 砂糖 5 0.0重量％ 水飴 34.0 檸檬酸 2.0 EGCg 0.6 -23- 201124135 香料 0.2 水 其餘部分 100.0 軟糖之配方 明膠 6 0.0重量％ 水飴 20.5 砂糖 8.5 植物油脂 4.5 甘露醇 3.0 蘋果酸 2.0 Cg 1.0 香料 0.5 100.0 飲料之配方 柳橙汁 3 0.0重量％ 異構糖 15.24 檸檬酸 0.10 維生素C 0.04 香料 0.10 ECg 0.10 水 其餘部分 100.0 -24- 201124135 【圖式簡單說明】 圖1 A表示由比色分析所得到EGCg及氯化鋅對於半胱 氨酸脫锍基酶及甲硫氨酸酶的抑制活性之結果。圖1 A爲 F . η之結果。 圖1Β表示由比色分析所得到EGCg及氯化鋅對於半胱 氨酸脫锍基酶及甲硫氨酸酶的抑制活性之結果。圖1 B爲 P . g之結果。 圖1C表示由比色分析所得到EGCg及氯化鋅對於半胱 氨酸脫巯基酶及甲硫氨酸酶的抑制活性之結果。圖1 C爲 T . d之結果。 圖2 A表示藉由氣相層析進行的分析所得到e g C g及氯 化鋅對於硫化氫產生酶及甲硫氨酸酶的抑制活性之結果。 圖2A爲F.n之結果。 圖2 B表示藉由氣相層析進行的分析所得到E G C g及氯 化鋅對於硫化氫產生酶及甲硫氨酸酶的抑制活性之結果。 圖2 B爲P . g之結果。 圖2 C表示藉由氣相層析進行的分析所得到E G C g及氯 化鋅對於硫化氫產生酶及甲硫氨酸酶的抑制活性之結果。 圖2 C爲T . d之結果。 -25-