TW200946913A - Sensitive immunoassays using coated nanoparticles - Google Patents

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200946913 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 相關申請案 本申請案係主張美國臨時巾請案號61/G71，G35，於2008 年4月9日提申，在此併入本案以作為參考資料。 發明領域 係提供一種經塗覆之奈米顆粒，包含一核心，由一可 增加奈米顆粒反射度之外殼環繞，其中該經塗覆之奈米顆 粒不需要’但可簡性地包括-純曼(R_n)光譜活性分 子。於此揭示之經塗覆奈米顆粒係用於定量及/或定性測試 裝置，測定液體樣本中是否存在有分析物。 t先前技勒守3 發明背景 免疫分析技術係提供一簡單與相對快速之方法，測定 生物樣本中分析物之存在與否。由免疫分析診斷測試提供 之資訊通常對於病患照顧相當重要。一般進行試驗以定性 或定量偵測特定分析物，例如，當病患罹患特定疾病或症 狀時會出現之抗體。此領域中使用之免疫試驗法有很多 種’包括用於疾病如細菌或病毒感染，或症狀如懷孕，之 試驗方法。 各種形式之免疫試驗法為此技術領域習知。其中一種 免疫試驗流程為橫向流動免疫試驗。橫向流動試驗法係利 用一固體支撐物，如硝基纖維素膜、塑膠或玻璃，以進行 分析物偵測。在“流式，，試驗中，取代由支撐物上垂直吸取 200946913 樣本’樣本可沿著支樓物側邊流動，藉由毛細作用與其他 力量’由施加區域流至表面上之反應區。在橫向流動試驗 中，捕捉用抗體係條狀塗覆於固體支撐物上。 則結合有偵測分子’其提供一可偵測訊號。液體樣本係設 置為與偵測用抗體接觸，該樣本/彳貞測抗體混合物可沿著固 體支標物流動。若該分析物存在，在固體支撐物之捕捉用 抗體塗覆位置上，便會形成“夾層，，錯合物。位於捕捉線上 偵測分子之訊號之後會被偵測到，不論是用視覺或儀器判 別。橫向流動試驗法可設置為偵測蛋白質、核酸、代謝物、 © 細胞、小分子或其他有興趣之分析物。 另一免疫試驗形式為流式免疫試驗。流式免疫試驗一 般係使用一孔狀材料，其上具有或結合有一含試劑之基質 - 層。測試樣本係施加並流至孔狀材料上，樣本中之分析物 _ 會與試劑反應’於孔狀材料上產生可偵測之訊號。這些裝 置一般包覆於塑膠外罩内，或附有校正器，以幫助特定分 析物之偵測。 ❹ 可用於橫向免疫試驗之許多不同種類之偵測分子為技 術上已知’如螢光發光團、金膠體溶液、經標記乳膠顆粒， 以及奈米顆粒如量子點（quanturn dot)，或表面強化拉曼 (Raman)散射（“SERS”）奈米顆粒。例如，美國專利號 5,591，645 ’描述使用目視“追蹤，，分子，如膠體金，其可目 視而不需儀器。此外，美國專利號6,514,767，Natan揭示 SERS-活性複合物奈米顆粒(SAcNs)，其包含一金屬奈米顆 粒’其表面聯結或結合有一或多種拉曼活性分子，可包覆 4 200946913 於一外殼中，該外殼包含一聚合物、玻璃或任一介電材料。 美國專利號5,714,389，描述一種橫向流動免疫試驗法，以 及使用染色顆粒之測試裝置，該顆粒可為金屬膠體溶液， 尤其是金。類似地，美國專利號7,109,042係描述一種橫向 流動免疫試驗裝置，其使用直接標記，如金溶膠與染料溶 膠’其可產生立即分析結果，而不需加入其他試劑，以顯 現該可偵測訊號。 SERS為化學分析最敏感方法之一，可偵測單一分子。 凊見Nie, S. and S. R. Emory, “Probing Single Molecules and Single Nanoparticle by Surface Enhanced Raman Scattering”, Science, 275，1102 (1997)。拉曼光譜，類似於紅外線光譜， 包括對應於待分析物（分析物）特定分子振動之光帶波長分 佈。在實施拉曼光譜分析時，光源一般為雷射，係聚焦於 樣本上，因而產生非彈性散射光，其經光學收集，並推導 為波長分散或傅立葉(Fourier)轉換光譜，其中偵測器係將照 射光子之能ΐ轉換為電流訊號強度。 入射光轉換為非彈性散射光之效率非常低，限制了拉 曼光譜之應用，非常難以紅外線光譜進行，如分析水性溶 液。然而，於1974年發現’當一分子接近粗糖化之銀電極 時，將其置於拉曼激發光源下，可使訊號增加，幅度達6倍。 (Fleischmann, M., Hendra, P. J., and McQuillan, A. J., “Raman Spectra of Pyridine Adsorbed at a Silver Electrode,” Chem. Phys. Lett, 26, 123, (1974), and Weaver, M. J., Farquharson, S., Tadayyoni, M. A., “Surface-enhancement 5 200946913 factors for Raman scattering at silver electrodes. Role of adsorbate-surface interactions and electrode structure，’’ J. Chem. Phys·，82, 4867 4874 (1985))。簡言之，入設雷射光 子耦合至金屬中侷限於顆粒表面之自由導電電子，會導致 電子雲共振。所得之表面電漿子場為一有效之路徑，可將 能量轉移為場内分子之分子振動模式，因而產生拉曼光子。 SERS奈米顆粒已於橫向流動偵測免疫試驗中使用作 為偵測分子。例如，Oxonica (Kidlington, UK)已發展出 NanoplexTM奈米顆粒，使用於此試驗中。該奈米顆粒係由 金奈米顆粒核心組成，其上吸附有拉曼報導子(rep〇rter)分 子，可產生表面強化拉曼光譜訊號。該拉曼標記之金奈米 顆粒係塗覆有二氧化石夕外殼’約10-50 nm厚。二氧化碎外 殼可保護報導子自表面脫附，預防鄰近金顆粒間之電漿子_ 電漿子交互作用，亦預防溶液成分產生8丑1^訊號。在二氧 化矽外衣上有聚合物塗覆之SERS奈米顆粒，係描述於美國 專利申請公開號2007/0165219。 當使用高敏感度SERS時，彳貞測由SERS奈米顆粒產生之 訊號需要使用可偵測拉曼訊號之儀器。在某些情況下較佳 具有可用於橫向流動免疫試驗之奈米顆粒，其具有增進之 敏感度，與SERS奈米顆粒相較，但僅需要相當簡單且不昂 貴之反射讀取技術，用於偵測。 【明内 發明概要 本發明係提供一種快速且準確之方法，以定性或定量 200946913 測定生物樣本中分析物之存在，並提供一種裝置與試劑， 以進行該方法。 本發明人已發現，使用於橫向流動或直式流動免疫試 驗中作為偵測分子之經塗覆奈米顆粒，可提供明顯之試驗 敏感度，與其他偵測分子相較，如膠體金，當試驗以反射 讀取儀讀取時。 在某些案例中，本發明為一經塗覆之奈米顆粒，包含 一核心與可增加奈米顆粒反射度之外殼，其中該經塗覆之 奈米顆粒並不包括一具拉曼(Raman)光譜活性分子。在其他 實施例中，該經塗覆奈米顆粒包括一拉曼活性分子。該核 心可為，但不受限制，金屬，如具有電聚子共振之金屬， 如金。 在某些實施例中，該外殼包含二氧化矽，而在其他實 施例中，該外殼則為另一陶莞材料，如另一氧化物，而在 其他實施例中，該外殼則包含一聚合物。該聚合物可為， 但不受限制，聚乙二醇、聚曱基曱基丙烯酸酯，或聚苯乙 烯。該外殼可完全或不完全環繞該核心。 本發明經塗覆之奈米顆粒可形成為不同尺寸之各種形 狀，包括，但不侷限於，球狀、棒狀、圓盤狀、金字塔狀、 立方體、圓柱等。在某些實施例中，該經塗覆奈米顆粒具 有至少一尺寸範圍為約1 nm至約1000 nm。在另一實施例 中，該經塗覆奈米顆粒之核心為球狀。在某些案例中，該 核心直徑為約10-100 nm，而在其他實施例中，該核心直徑 為約20-60 nm。在某些實施例中，該奈米顆粒包含多層核 200946913 心聚集物，如但不侷限於，雙層。 在某些案例中，該奈米顆粒之外殼係經修飾，以使分 子結合至奈米顆粒表面上。在特定實施例中，該修飾係將 硫基加至經塗覆奈米顆粒表面上。在其他實施例中，一配 位體如，但不偈限於，一抗體，係結合至經塗覆奈米顆粒 之外殼上，經由硫基。 該配位體可結合至任一有興趣之分析物上，其存在或 不存在於一樣本中。在某些實施例中，該配位體為一抗體， 可結合至特異於流感病毒A或流感病毒B之蛋白質上。 在某些其他實施例中，本發明為一經塗覆之奈米顆 粒，實質上係由一核心與可增加奈米顆粒反射度之外殼， 以及一結合至外殼表面上之配位體組成。 在其他實施例中，本發明為一種測試裝置，用於測定 液體樣本中分析物是否存在，包含：（a)—樣本接收元件； (b)—載體，與樣本接收元件呈液體連通；（c)一標記試劑， 在液體樣本存在下，其於載體中為可移動，該標記試劑包 含一與分析物結合之配位體，以及一經塗覆之奈米顆粒， 其包含一核心以及一外殼，該外殼可增加具有配位體聯結 於其上之奈米顆粒之反射度，其中該經塗覆之奈米顆粒並 不包括一具拉曼(Raman)光譜活性之分子；以及(d) —結合試 劑，可有效捕捉該分析物，當存在時，其固定於載體之經 定義偵測區域上；其中該液體樣本係施加於樣本接收元件 上，使該標記試劑流動，使得該樣本與標記試劑可沿著載 體長邊運送，到達偵測區域，其中，若偵測區域偵測到標 200946913 記試劑，代表液體樣本中存在有分析物。 在某些實施例中，該使用於測試裝置中之標記試劑包 含一與分析物結合之配位體，以及一經塗覆奈米顆粒，實 質上由一核心以及一外殼組成，該外殼可增加具有配位體 聯結於其上之奈米顆粒之反射，其中該配位體係結合至外 殼表面上。 在某些實施例中，該載體，如，但不侷限於，硝基纖 維素、塑膠或玻璃。在其他實施例中，該測試裝置更包含 一吸收墊及/或控制區域，與偵測區呈液體連通。 本發明之測試裝置可用於定性或定量偵測有興趣分析 物之存在，如但不偈限於，一蛋白質、核酸、代謝物、小 分子、病毒或細菌。在某些實施例中，該測試裝置可用於 偵測液體樣本中之多種分析物，其具有至少二不同之標記 試劑，其中該標記試劑之配位體可結合至不同分析物上， 以及至少二偵測區域，可偵測該至少二不同標記試劑之每 一者。 在某些實施例中，本發明為一系統，包含本發明之測 試裝置，以及一反射儀，用以偵測測試裝置中標記試劑之 存在。 在某些實施例中，本發明為一種測定液體樣本中分析 物是否存在之方法，包含： a) 提供本發明之測試裝置； b) 將該液體樣本與該測試裝置之樣本接收元件接觸； c) 將該液體樣本施加於樣本接收元件上，以使該標記 200946913 試劑流動，使得該液體樣本與標記試劑可沿著載體長邊運 送，到達偵測區域； d)藉由測量反射度來測定偵測區域中是否有標記試劑 存在，其中偵測區域若偵測到標記試劑，代表液體樣本中 存在有該分析物；偵測區域若未偵測到標記試劑，代表液 體樣本中不存在有該分析物。 在其他實施例中，本發明為一種測定液體樣本中分析 物是否存在之方法，包含： a) 提供一測試裝置，包含：⑴一樣本接收元件；（ii)一 載體，與樣本接收元件呈液體連通；以及(iii)一結合試劑， 可有效捕捉該分析物，當存在時，其係固定於載體之經定 義偵測區域上； b) 將該液體樣本與標記試劑混合，該標記試劑包含一 可結合至分析物之配位體，以及一經塗覆之奈米顆粒，其 包含一核心以及一外殼，該外殼可增加具有配位體聯結於 其上之奈米顆粒之反射度，其中該經塗覆之奈米顆粒並不 包括一具拉曼(Raman)光谱活性分子； c) 將b)之混合物與測試裝置之樣本接收元件接觸； d) 將b)之混合物施加於樣本接收元件上，沿著載體長邊 運送，到達偵測區域； e) 藉由測量反射度來測定偵測區域中是否有標記試劑 存在，其中偵測區域若偵測到標記試劑，代表液體樣本中 存在有該分析物；偵測區域若未偵測到標記試劑，代表液 體樣本中不存在有該分析物。 10 200946913

在某些實施例中，使用於本發明方法中之標記試劑包 含一與分析物結合之配位體，以及一經塗覆之奈米顆粒， 其其實質上由一核心以及一外殼組成’該外殼可增加具有 配位體聯結於其上之奈米顆粒之反射度，其中該配位體係 聯結至該外殼表面上。在其他實施例中，使用於本發明方 法中之標記試劑包含一與分析物結合之配位體，以及一經 塗覆之奈米顆粒，其包含一核心，在核心上聯結有一分子， 可藉由表面強化拉曼散射產生訊號，以及一外殼，環繞該 核心與該分子，並具有配位體聯結於其上。 在某些實施例中，一反射讀取儀係用於測定偵測區域 内之標記試劑，而在其他實施例中，偵測區域内標記試劑 之偵測係為目视。在某些實施例中，該分析物可定量分析， 而在其他實施例中，該分析物係定性分析。在某些實施例 中，本發明方法可用則貞測㈣樣本巾多種分析物，使用 至少兩種標記試劑，其中該標記試劑上之配位體會與不同 刀析物、.”卩及至少二偵測區用以偵測該至少二不同 標記試劑之每一者。 1實施财，本發明為-種用於進行流式分析測 =綠，藉妓射_顺體樣本中分 、 =卜測試裝置，包含—孔狀薄膜，其包含一丄 =檨劑，可有效捕捉該分析物，當存 中時，其係附著於該孔狀薄膜之上表面或下 以及經塗覆之奈讓，其可增4 11 200946913 米顆粒反射度之外殼，其中該經塗覆之奈米顆粒並不包括 一具拉曼(Raman)光譜活性之分子。 在某些實施例中，使用於本發明套組中之標記試劑包 含一可結合至分析物之配位體，以及一經塗覆之奈米顆 粒，實質上由一核心以及一外殼組成，該外殼可增加具有 配位體聯結於其上之奈米顆粒之反射度，其中該配位體係 結合至外殼之表面上。在其他實施例中，使用於本發明套 組中之標記試劑包含一與分析物結合之配位體，以及一經 塗覆之奈米顆粒，其包含一核心，一聯結至核心之分子， 可藉由表面強化拉曼散射產生訊號，以及一環繞該核心與 該分子之外殼，其具有配位體聯結於其上。 在某些實施例中，本發明套組之測試裝置更包含一吸 收墊，其中該孔狀薄膜之下表面與吸收墊呈物理性接觸， 並以流體連通，以及其中該結合試劑係聯結至該孔狀薄膜 之上表面。在其他實施例中，本發明套組之測試裝置更包 含一孔狀薄膜之外罩。 本發明套組可用於定性或定量偵測有興趣之分析物是 否存在，如，而不受侷限於一蛋白質、核酸、代謝物、小 分子、病毒或細菌。在某些實施例中，該套組可用於偵測 液體樣本中多種分析物，以至少二不同之標記試劑，其中 該標記試劑之配位體可結合至不同分析物上，以及至少二 偵測區域，可偵測該至少二不同標記試劑之每一者。 在某些實施例中，本發明為一種系統，包含本發明之套 組，以及一反射儀，用以偵測測試裝置中標記試劑之存在。 12 200946913 在其他實施例中，本發明為一種使用本發明之套組測 定液體樣本中分析物是否存在之方法，該方法包含：（幻將 該液體樣本與該孔狀薄膜之上表面接觸；使該液體樣本 流過該孔狀薄膜，使得至少一部分之分析物，當存在於液 體樣本中時’可結合至結合試劑上；（C)將該標記試劑與該 孔狀薄膜之上表面接觸；（d)使該標記試劑流過該孔狀薄膜 並進入吸收材料’使得至少一部份之標記試劑可結合至分 析物上；以及(e)藉由測量反射度偵測孔狀薄膜上標記試劑 之存在’其中該孔狀薄膜上若偵測到標記試劑，代表液體 樣本中存在有該分析物；該孔狀薄膜上若未偵測到標記試 劑’代表液體樣本中不存在有該分析物。 在其他實施例中，本發明為一種使用本發明套組測定 液體樣本中分析物是否存在之方法，該方法包含：（a)混合 液體樣本與標記試劑，使得該分析物，當存在於液體樣本 中時’可與該標記試劑結合；（b)將(a)之混合物與孔狀薄膜 之上表面接觸；（c)使(a)之混合物可流過該孔狀薄膜，使得 至少一部分已與標記試劑結合之分析物，當存在於液體樣 本中時’可結合至該結合試劑上；以及(d)藉由測量反射度 偵測孔狀薄膜上標記試劑之存在，其中該孔狀薄膜上若偵 測到標記試劑，代表液體樣本中存在有該分析物；該孔狀 薄膜上若未偵測到標記試劑，代表液體樣本中不存在有該 分析物。 在某些實施例中，該反射讀取儀係用於測定偵測區域 内之標記試劑，而在其他實施例中，偵測區域内標記試劑 13 200946913 之偵測係為目挽。在某些實施例中，該分析物可定量分析， 而在其他實施例中，該分析物係定性分析。在某些實施例 中本發明方法可用於偵測液體樣本中多種分析物，使用 至乂兩種標記試劑其中該標記試劑上之配位體會與不同 刀析物結合，以及至少二偵測區，用以偵測該至少二不同 標記試劑之每一者。 圖式簡單說明 第1圖顯示A型流感病毒之橫向流動試驗結果，係比較 膠體金與經一氧化石夕塗覆之金奈米顆粒之敏感度，當以反 射儀測量時。如圖中所示，經二氧化矽塗覆之金奈米顆粒 觀察到強烈的反應，與金膠體比較。 第2圖顯示顯示A型流感病毒之橫向流動試驗結果，係 比較使用經二氧化矽塗覆之金奈米顆粒之原型裝置敏感度 (第 2A圖），以及商用產品，bd DirectigenTM EZ A+B (第 2B 圖）之敏感度，此二裝置皆以反射儀讀取。使用經二氧化矽 塗覆之金奈米顆粒之裝置敏感度約為BD Directigen™ EZ A+B之7倍’以反射儀讀取。 【實施方式】 較佳實施例之詳細說明 除非另有定義，所有於此使用之技術與科學術語皆具 有與此技術領域者通用之意義。雖然這些方法與材料皆類 似或等同於申請專利範圍中所描述者，較適用之方法與材 料皆如下所述。本文提及之所有文獻、專利申請案、專利 案，與其他參考文獻，皆在此併入本案以作為參考資料。 200946913 為了避免衝突，本說明書，包括定義，皆有控制。此外， 該材料、方法，與範例僅用於說明，並非用於限制。 在此說明書中，單數描述亦包括複數，除非另有陳述。 在此說明書中，“或”代表“及/或”，除非另有指出。在多個 附屬項中，“或”一字之使用係指大於一項之前述獨立或附 屬項，僅用於替換使用。此外，術語“包括”，可使用多種 形式，如“包括”與“包含”，不受限制。此外，術語如“元件” 或“組成物”包含元件與組成物二者，包括一單元與包含大 於一種次單元之元件與組成物，除非另有指出。 其他特徵與優點將以下列發明詳述與申請專利範圍說 明而更臻清楚。 為了使本說明書更加易懂，係先定義某些術語。額外 之定義係分佈於詳細說明中。 術語“奈米顆粒”使用於此係指該顆粒包含至少一核心 與一外殼，具有一尺寸範圍約1至約1000奈米（“nm”）。本發 明之奈米顆粒可為任一形狀。在某些實施例中，該奈米顆 粒為球狀。本發明之奈米顆粒一般不，但可，包含一拉曼 活性分子。在某些實施例中，該奈米顆粒可包含多層核心 與一層外殼。 使用於此，術語“核心”係指本發明奈米顆粒之内部。 在某些實施例中，該核心為金屬，例如，但不偈限於金。 本發明之奈米顆粒亦包含一外殼，其可增加奈米顆粒 之反射度。該外殼可完全包覆該核心，或不完全包覆該核 心。該外殼可由任一材料或材料組合物組成，只要其具有 15 200946913 奈米顆粒反射度之特性。例如，在某些實施例中， =卜叹可包含任何穿透材料，在所需光譜範圍内。在某些 例中】中’該外殼包含二氧化#，即，玻璃。在其他實施 t 該外殼包含另一陶瓷材料，例如但不侷限於，具有 =折射指數之透明陶瓷，如鈣鈦礦與Zr〇2。在其他實施例 外设係由聚合物組成。在一特定實施例中，該聚合 3聚乙二醇、聚甲基甲基丙烯酸酯，或聚苯乙烯。在 某此香 一施例中，該形成外殼之材料係經處理或經衍生，可 聯結_ 4 、、’σ一配位體至該奈米顆粒表面。該聚合物之最佳選擇係 取決於待固定於奈米顆粒表面之配位體。 在外殼中’術語“增加奈米顆粒反射度，，代表外殼之存 在可導致奈米顆粒產生增加之訊號或敏感度，當以反射度 、】量時’如於橫向流動免疫試驗中，與不具外殼之奈米顆 相較。不受限於理論，環繞於核心之外殼可直接使顆粒

反射更多光線 更奸， 。此外，結合至外殼表面之配位體可定位地 以參與結合反應，當結合至外殼材料上，當被動吸 附於核心表面上。 使用於此’“配位體”係指可結合至有興趣分析物之任 ❹ 為 分子。例如，而不受侷限，在某些實施例中，該配位體 〜抗體、抗原、受體、核酸或酵素。 術語“分析物，’使用於此係指任一可使用本發明偵測之 有興趣物質’包括但不侷限於，藥物，包括治療用藥物或 '監用之藥物；贺爾蒙；維生素、蛋白質，包括所有種類之 ^趙；胜肽·，類固醇；細菌；黴菌；病毒；寄生蟲；細菌、 16 200946913

黴菌、病毒、寄生蟲之成分或產物；所有種類之過敏原； 一般或惡性癌細胞之產物或成分；等。作為特定範例，其 可為人類絨毛膜性腺激素(hCG);胰島素；黃體素；導致或 與多種疾病狀態相關之生物體，如化膿性鏈球菌（A群）、單 純泡疹I與II、巨細胞病毒、衣原體、德國麻疹抗體、A型與 B型流感病毒等。在本發明之某些實施例中，樣本中分析物 是否存在係以定性決定。在其他實施例中，樣本中分析物 之濃度或含量係以定量決定。 術語“樣本，，使用於此係指任一生物樣本，其含有用於 偵測之分析物。在某些實施例中，該生物樣本為液體形式， 而在其他實施例中，可變化為液體形式。 術語“樣本接收元件，，使用於此係指測試裝置之—部 刀，其直接與液體樣本接觸，亦即，其可接收待分析之有 興趣分析物樣本。該樣本接收元件可為載體或孔狀薄膜之 一部分或單獨元件。該液體樣本之後可自樣本接收元件流 出，經橫向或垂直流動，流往偵測區域。該樣本接收元件 係與分析物偵測區域呈液體連通。可能為重叠、 立唄邵對底 °3末端相連。在某些實施例中，該樣本接收元件係由孔 狀材料製造’例如但不偈限於，紙。 1史用於此’術語“載體’ m 、了只J ",L莉式驗中，係 曰任—可提供㈣流動之基板。此包括基板如硝基纖維素 ，、與聚㈣或纖維素摻合之硝基纖維素膜，未經處理之 紙、孔狀紙、螺縈、玻璃纖維、丙稀腈共聚物、塑膠、破 璃或耐隆。該基板可為孔狀。—般而言，該基板之孔具有 17 200946913 足夠大之尺寸，使得本發明之奈米顆粒可完全流過該載 體熟習此技術領域者應知道其他可允許液體流通之材 料。垓載體可包含一或多個呈液體連通之基板。例如，該 反應區域與偵測區域可存在於在載體内之同一基板（即，墊) 上，或可於不同基板（即，墊）上。 使用於此，用於流式試驗中之“孔狀薄膜，，係指任一材 料之薄膜或攄紙，其可立即以水性溶液濕潤，並具有足以 使本發明經塗覆之奈米顆粒通過之孔。適當之材料包括如 頌基纖維素膜、與聚酯類或纖維素摻合之峭基纖維素膜， 未經處理紙、孔狀紙、嫘縈、玻璃纖維、丙烯腈共聚物、 塑膠、破璃或耐隆。 使用於此，“吸收材料，，係指一具有吸收特性之孔狀材 料足以吸收試驗s式劑中與任一清洗溶液中實質上之所有 液體，以啟動毛細現象，並將試驗液體吸至測試裝置中。 適當之材料包括，如硝基纖維素膜、與聚酯類或纖維素摻 δ之硝基纖維素膜，未經處理紙、孔狀紙、嫘縈、玻璃纖 維、丙烯腈共聚物、塑膠、玻璃或耐隆。 使用於此，術語“橫向流動，，係指一液體沿著載體平面 流動。一般而言，橫向流動裝置可包含一長條（或數個以液 體連通之長條），其材料可藉由毛細作用，即潤濕或層析作 用，傳送一溶液，其中該長條之不同區域或區塊含有試驗 試劑，不論是以擴散性或非擴散性結合，當溶液傳送或通 過此區域時可產生可偵測訊號。一般而言，此試驗包含一 施加區域，用於接收液體樣本，試劑區域則設置於施加區 200946913 域之侧面並呈液體連通，偵測區域亦設置於施加區域之側 面並與甙劑區域呈液體連通。該試劑區域可包含一化合 物其在液體中為動相，並可與樣本中之分析物及/或偵測 區域上結合之分子產生交互作用。該偵測區域可包含一結 〇刀子’其固定於長條上並可與分析物及/或試劑化合物產 生父互作用’以產生可偵測訊號。此試驗可用於偵測樣本 中之分析物’經由直接（夾層試驗法）或競爭結合作用。橫向 流動裝置之範例係提供於美國專利號6，194,220，Malice 人提申 ’ 5,998,221，Malick等人提申；5,798,273，Shuler 等人知中’以及RE38,430，Rosenstein提申。 在夹層橫向流動試驗中，包含或不包含有興趣分析物 之液體樣本係施加於施加區域，並使其藉由毛細作用通過 4劑區域。該分析物，若存在，可與試劑區域内之標記試 劑作用，且該分析物-試劑錯合物會藉由毛細現象移動至偵 測區域。該分析物-試劑錯合物可由偵測區域捕捉，藉由與 特異於分析物之結合分子及/或試劑產生交互作用。未結合 樣本可藉由毛細作用移動通過偵測區域，到達橫向置放並 與偵測區域呈流體連通之吸收墊。該標記試劑之後可於谓 測區域以適當裝置偵測。 在競爭橫向流動试驗中’含有或不含有興趣分析物之 液體樣本係施加至施加區域’並允許其藉由毛細作用通過 試劑區域。該試劑區域包含一標記試劑，其可為分析物本 身、其類似物或衍生物’或一可模擬有興趣分析物之片段， 當結合至偵測區域之固定結合物上。該標記試劑在液相中 19 200946913 ^動態，並與液體樣本—同藉由毛細作用移動至福測區 體樣树所含之分析齡與標㈣_爭結合至偵 :之固疋結合物上。未結合之樣本可藉由毛細作用移 動通補魏域，到賴向置放麵彳貞魏域呈流體連通 之吸收塾。該標記試劑之後可於偵測區域以適當裝㈣ 測。有興趣分析物存在與否可經由檢測偵測區域而得，其 中若液體樣本中存在之分析物量越多，則制區域結合之 經標記受體量則越少。

使用於此，術語“垂直流過”與“流經，，係指液體流至載 體之垂直平面上一般而言，流動裝置可包含元件或層層 堆疊之元件層，其可允許液體流過該裝置。各層可包含試 驗試劑，不論是擴散或非擴散性結合，當溶液通過裝置時 其可產生可偵測訊號。一般而言，該裝置包含第一層，具 有一上表面與下表面，其中該上表面係用於接收液體樣 本，以及一垂直置放之吸收層，並與第一層之下表面呈液 體連通，其用於吸引液體樣本通過該第一層。該第一層可 包含一結合試劑，聯結於第一層之上表面，可與樣本中之 分析物接觸，並捕捉該分析物於第一層之上表面。流通裝 置之範例係提供於美國專利號4,920,046，McFarland等人提 申，以及7,052,831，Fletcher等人提申。 實際上，包含或未包含有興趣分析物之液體樣本係施 加於第一層之上表面，該處包含一特異於有興趣分析物之 結合試劑。之後該液體樣本流過該第一層’到達吸收層。 若分析物存在於樣本中，其會與結合試劑產生交互作用， 20 200946913 而被第一層之上表面捕捉。該第一層之後以清洗溶液處 理，依據一般免疫試驗流程。之後，該第一層以標記試劑 處理，其與被結合試劑捕捉之分析物結合。該標記試劑之 後流經該第一層，並到達吸收層。該第一層以清洗溶液處 理，依據一般免疫試驗流程。之後該標記試劑以適當裝置 偵測。此外，該液體樣本可與標記試劑混合，在施加至該 第一層上表面之前。其他適當變化為此技術領域者所熟知。 橫向與流式試驗可用於债測樣本中多種分析物。例 如’在橫向流動試驗中，試劑區域可包含多種標記試劑， 每一者皆可結合（或模擬)至液體樣本中之不同分析物，或單 一標記試劑可結合（或模擬）多種分析物。此外，橫向流動試 驗中之制區域可包含多種結合分子，每—者皆可結合至 液體樣本巾之*同分析物，或單-標記試劑可結合(或模擬) 多種分析物。在流通試驗中，該孔狀薄膜可包含多種結合

母一者皆結合至液體樣本中之不同分析物，或單一 標記試劑可結合(或難）多種分析物。此外，標記試劑混合 物可用於流職驗巾’每—者皆狀為可與㈣樣本中之 不同分析物結合，或單-標記試劑可結合(或模擬)多種分析 =種標記試劑用於橫向流動或流式試驗中，該試劑 刀払。己，以辨識液體樣本中不同種類之分析物 --使=:動相，，係指擴散性或非擴散性聯結或 動相之_可以㈣樣本分散， 帶於橫向或垂直流财。 由絲樣本搞 可辨識或結合至 使用於此，術語“標記試劑，，係指任〜 21 200946913 有興趣之分析物上之顆粒、蛋白或分子，其上並聯結有一 可產生訊號之物質’以視覺或儀器偵測，亦即，於此處定 義之經塗覆奈米顆粒。辨識該分析物之顆粒或分子可為天 然、或非天然。在某些實施例中’該分子為單株或多株抗體。 使用於此，術語“結合試劑，，係指任一顆粒或分子盆 可辨識有興趣之分析物。該結合試财與分析物標記試劑 錯合物形成-結合錯合物。該結合試劑係固定於债測區域 之載體上’或孔狀薄膜之表面。該結合試劑並不會受到液 體樣本之橫向流動或垂直流影響，由於已固定於載體或孔 〇 狀薄膜上。該顆粒或分子可為天然或非天然，亦即，合成 物。一旦該結合試騎合至分析物·標記試劑錯合物上，其 便可阻止分析物-標記試劑在液體樣本中之流動。 _ 使用於此，“偵測區域，，係指載體或孔狀薄膜部分，含 有經固定之結合試劑。 術語“控制區域，，係指測試裝置之—部分，包含一結合 分子’设置為捕捉該標記試劑用。在橫向流動試驗中肖 控制區域可與載體之偵測區域呈㈣連通，使得該標⑽ © 劑可在控制區域被捕捉’當液體樣本藉由毛細作用傳送至 偵測區域時。在流式試驗中，該控制區域可為孔狀薄膜之 單獨區域’如該標記試劑可施加於孔狀薄膜之樣本施加部 分與控制區域二者上。控制區域中標記試劑之偵測，係確 認該試驗可達到功能目的。 術語“外罩係指任—適合包覆本發明測試裝置者。示範 性外罩可為此技術領域所熟知者。該外罩可為如，一基底 22 200946913 部分與一上蓋部分。該上蓋可包括一頂壁與一實質上垂直 之側壁。一邊緣，可向上突出於該頂壁。該邊緣係定義一 凹口 ’其内具有一***物，具有至少二開口，可與上蓋之 至少二其他開口互相對準，以形成該外罩之至少二孔。該 外罩可建構為確保該二或多孔間不會互相連通。此外罩之 一範例係提供於美國專利號7,052,831，Fletcher等人提申。 其他適當之外罩包括使用於BD Directigen™ EZ RSV橫向 流動試驗裝置中者。 使用於此，“反射讀取儀”或“反射儀”係指一裝置，偵 測由於測試裝置偵測區域中經塗覆奈米顆粒之存在而造成 之反射度改變。反射讀取儀或反射儀為技術上已知。適用 於本發明之代表性儀器包括，但不侷限於，Immunochromato Reader Cl0066，得自 Hamamatsu ’ 或ESE-Quant，得自 ESE GmbH。該偵測區域最佳係由該裝置之偵測區域掃瞄，或直 接成像於反射儀之偵測器上，而可追縱空間位相上之反射 度。之後係使用適當演算法測定，如偵測區域内反射度之 最大變化量。 用於SERS·基礎法中之經塗覆奈米顆粒為技術上已 知。如美國專利號6,514,767，係描述SERS-活性複合物奈米 顆粒(SACNs)，其包含一金屬奈米顆粒，於其表面與一或多 個拉曼活性分子聯結或結合，並由一外殼包覆，其包含一 聚合物、玻璃，或任一其他介電材料。此顆粒可藉由在拉 曼活性金屬奈米顆粒核心上成長或者置放一適用於包覆之 外殼。具有希望尺寸之金屬奈米顆粒可成長為金屬膠體， 23 200946913 使用多種此領域已知之技術，如使用還原劑使溶液中金屬 離子進行化學或光化學還原。舉例而言，膠體金顆粒，其 為次微米尺寸金顆粒流體懸浮液，可藉由氯金酸 ⑽⑽audeaeid)於㈣巾_ 1轉後，贿液雜速 搜拌’同時加入還原試劑。此會導致金離子還原成中性金 原子，其會自過飽和溶液中·出，並形成顆粒。為了賴 防顆粒凝聚，可加人黏附於奈米顆粒表面上之穩定試刻。 奈米顆粒亦可於溶液巾以放電法製造。該雌可以各料 機配位體功能化’以創造出有機無機雜合物，具有增進I Θ 功能性^ 適當之包覆物包括玻璃、聚合物、金屬、金屬氧化物 以及金屬硫化物。若該包覆物為麵，則該金屬奈米雜 - 核心較佳先以玻璃底層處理。之後玻璃係以一般技術於全 屬奈米顆粒上成長。該包覆物之厚度可依據該顆粒需要<

物理特性而輕易變化。該外殼可以一般技術衍生使該顆 粒可共輛至分子上（包括生物分子，如蛋白質與核酸），或至 固體支撐物上。 U 商業上可獲得之〇xonica Nan〇plexTM奈米顆粒係由金 奈米顆粒核心組成，其上吸附有拉曼報導子分子，可產生 SERS訊號。該拉曼標記金奈米顆粒之後以約1〇_5〇nm厚之 二氧化矽外忒經塗覆。該二氧化矽外殼可保護報導子分子 自核心表面上脫附、預防鄰近金顆粒間電漿子-電漿子交互 作用’亦預防溶液内成分產生SERS訊號。 就以反射讀取儀偵測之橫向流動試驗而言，吾人可預 24 200946913 期Oxonica Nanoplex™奈米顆粒提供相當好之試驗敏感 度，可與具相同直徑，作為Oxonica Nanoplex™奈米顆粒 核心，並使用相同之光學密度之金顆粒比擬。此外，本發 明人觀察到未預期且明顯較佳之試驗敏感度，當金顆粒被 Oxonica Nanoplex™奈米顆粒取代時，於具有反射讀取儀 取代拉曼訊號偵測器之橫向流動試驗中。重要的是，由 Oxonica Nanoplex™奈米顆粒增進之敏感度，若僅調整未 經塗覆金膠體之直徑並無法達成。此外，亦相當重要地’ 當Oxonica Nanoplex™奈米顆粒使用作為標記試劑時，該 試驗之敏感度相等，不論該訊號是以反射儀或SERS讀取儀 讀取。

Oxonica Nanoplex™奈米顆粒中之拉曼活性分子一般 認為對於試驗表現度並無幫助，當使用反射儀讀取訊號’ 而非拉曼讀取儀。此預期係由實驗產生，其中經二氧化矽 塗覆之奈米顆粒（不具拉曼活性分子），係發現其表現度相 等，並用於反射儀基礎之橫向流動試驗中，提供明顯增進 之敏感度，與僅有金之膠體相較。 範例 範例1 : 此實驗係比較經二氧化矽塗覆之金奈米顆粒與金膠體 於橫向流動免疫試驗中之表現度，針對A型流感病毒。在此 試驗中，經測試為A型流感病毒陰性之鼻咽抽出液，係以已 知之活H1N1 A型流感病毒產生刺突(spiked)。 該金顆粒，得自 British Biocell International 25 200946913 (“BBInternational”； “BBI”）’ 直徑為4〇 nm。實驗中使用之 經二乳化石夕塗覆之金奈米顆粒為〇xoniea Nanoplex™奈米 顆粒。這些奈米顆粒係由經拉曼報導子4,4’-二》比咬塗覆之 60 nm金核心，以及二氧化矽外殼組成。該二氧化矽外殼厚 度約為30 nm。A型流感病毒偵測抗體係聯結至金膠體上， 藉由被動吸附。就NanoplexTM奈米顆粒而言，a型流感病毒 偵測抗體係共價性結合至二氧化矽表面之硫基上，透過順 丁稀，一酿胺化學。就一 §式驗而言’ A型流感病毒捕捉抗體係 塗佈於Whatman AE99硝基纖維素薄膜上。該硝基纖維素薄 膜之後以液體(“浸潰片（dipstick)’’)形式進行試驗，其中該顆 粒與彳貞測抗體係與含有各種含量病毒之鼻咽樣本混合。相 同之光學密度係使用於金膠體與經塗覆之奈米顆粒。該顆 粒/樣本混合物之後置於96-孔盤上，具捕捉抗體之硝基纖維 素薄膜之一端係置於每一孔中。該樣本可满濕(wick up)該 硝基纖維素薄膜，之後充滿清洗緩衝液，之後亦潤濕硝基 纖維素薄膜直條。 由捕捉線獲得之訊號係以客製化反射儀讀取，Becton， Dickinson and Company (“BD”)，UMM Electronics (Indianapolis，IN)。第1圖顯示反射儀訊號圖，其為病毒濃 度之函數，用於橫向流動試驗，具有金膠體與經塗覆之奈 米顆粒。使用Oxonica奈米顆粒有明顯較強反應，與金膠 體相較。 範例2 : 在此範例中，經二氧化矽塗覆之金奈米顆粒之敏感 26 200946913 度’係與市售產物相較：BD DirectigenTM EZ Flu A+B試 驗。如範例1所示，該經塗覆之金奈米顆粒係以浸潰片形式 试驗’使用Whatman AE99石肖基纖維素薄膜。 EZ Flu A+B係使用其商用實施例進行測試(“卡匣，，形式）。 BD DirectigenTM EZ Flu A+B 市售產物與 〇& Nanoplex™奈米顆粒_基礎裝置所使用之捕捉與偵測抗體 皆相同。樣本係依據範例1製備，除了使用活B/Lee/4〇 B型 φ 流感病毒，使其於陰性鼻咽抽物液中產生刺突，而非A型流 感病毒。如前所述，實驗中使用之經二氧化矽塗覆之金奈 米顆粒為Oxonica Nanoplex™奈米顆粒。這些奈米顆粒係 由經拉曼報導子4,4’-二。比咬塗覆之60 nm金核心，以及二氧 ' 化矽外殼組成。該二氧化矽外殼厚度約為30 nm。該BD市 - 售產物係使用nm金膠體，其不包含二氧化石夕外殼。該bd 市售產物係依據包裝指示使用，僅具有測試線訊號，以反 射儀讀取與視覺判定。 φ 數據列於表1，其比較二顆粒之偵測極限（信賴偵測極 限）。該信賴偵測極限(RDL)係定義為其95%信賴下極限等 於空白組95%信賴上極限時之濃度。RDLs，以不定單位(χ) 表示，用於表示BD金膠體產物與經二氧化矽塗覆之奈米顆 粒，係用於報導三個獨立的實驗。相同之客製化反射儀， 得自UMM Electronics，係用於讀取來自經二氧化矽塗覆之 不米顆粒次潰片裝置與DirectigenTM EZ Flu A+B裝置之訊 號。該敏感度增進倍數係定義為未經塗覆金基礎產物之 RDL ’除以經二氧化矽塗覆奈米顆粒產物2RDl。 27 200946913 表1 BD Directigen™ EZ 以Oxonica奈米顆粒 敏感度 具有未經塗覆之金 (以反射儀讀取） 測試之橫向流動試驗 (以反射儀讀取） 增進倍數 實驗1 0.23 0.015 15 實驗2 0.12 0.0075 16 實驗3 0.26 0.028 9 如上表所示，該Oxonica Nanoplex™奈米顆粒，最高 可增進16倍敏感度，與純金顆粒相較。 在類似於上述之單獨實驗中，金膠體顆粒之直徑係由4〇 nm增加至60 nm與更大尺寸。在這些實驗中，僅觀察到有限的 敏感度增進(至多2倍）’代表〇x〇nica Nanoplex™奈米顆粒之 金核心與金膠體尺寸上之差異，似乎並非敏感度增進之原因。 範例3 : 本實驗係比較金耀·體與Oxonica Narκ)plexTM奈米顆板 之敏感度與特異性，在偵測B型流感病毒（B/Lee/40)之橫向 流動免疫試驗中。係製備60個臨床樣本。該樣本經測試皆 為B型流感病毒陰性之鼻咽抽出液。2 〇個樣本作為陰性控制 組。剩餘之40個樣本係以二濃度之b型流感病毒產生刺突， 而產生40個陽性樣本。此40個樣本中之20個，係以濃度 0.5X(不定單位)之活B型流感病毒產生刺突。剩餘之2〇個樣 本則接受低10倍之B型流感病毒，濃度為0.05χ。所有6〇個 樣本（40個陽性與20個陰性控制組）之後皆使用BD DirectigenTMEZFluA+B市售產品，為卡匣形式，以及使用 Oxonica Nanoplex·™奈米顆粒製造之浸潰片裝置測試。該 浸潰片裝置係使用Whatman AE99硝基纖維素薄膜製備。該 Oxonica NanoPlex™奈米顆粒係由經拉曼報導子44,·二吼 28 200946913

啶塗覆之60 nm金核心，以及約30 nm厚之二氧化矽外殼組 成。A+B係使用其商用實施例進行測試(“卡昆，，形式）。bd Directigen™ EZ Flu A+B市售產物與〇χ〇η& Nan〇plexTM 奈米顆粒-基礎裝置所使用之捕捉與偵測抗體皆相同。 結果摘錄於表2。在此表中，敏感度係以每一次測試 中，40個陽性樣本中正確辨識出之樣本之百分比計算。特 異性係以每一次測試中，20個陰性樣本中正確辨識出之樣 本之百分比計算。當使用儀器讀取時，若測試儀器讀取值 大於每一種裝置内建之閾值，便可判定為陽性。該閾值係 經建立，以使每一裝置至少確保95%之特異性。在此範例 中，該DirectigenTM產物係以視覺判定，以及使用客製化反 射儀，得自 UMM Electronics，判定。Oxonica NanoplexTM 奈米顆粒係使用相同之反射儀，以及相同之研究用拉曼讀 取儀’由BD建構(表中最後一排）偵測。研究用拉曼讀取儀 係使用785 nm雷射作為激發光，並使用Acton研究用光譜儀 (SpectraPro 25000i)與CCD偵測器（Pixis 400)偵測拉曼訊號。 表2 測試 敏感度 特異性 Directigen™ EZ，視覺判別 45% 100% Directigen™ EZ，反射儀讀取 58% 95% Oxonica nanotags ' 反射儀讀取 100% 100% Oxonica nanotags，拉曼讀取 100% 100% 由此可發現一明顯之敏感度增進’使用Oxonica Nanoplex™奈米顆粒時，與DirectigenTMEZ顆粒相較，而不 會損失特異性。 範例4 : 29 200946913 本實驗係比較經二氧化矽塗覆之金奈米顆粒，具有或 不具有表面增強拉曼散射（SERS)分子之表現度，於反射度 基礎之橫向流動免疫試驗中。

Oxonica Nanoplex™之金奈米顆粒，含有SERS標記， 係得自Oxonica。該奈米顆粒係由60 nm金核心，末端有4-4，-二°比啶與35 nm厚經塗覆之二氧化矽外殼。該奈米顆粒之直 徑為130 nm。硫代-SMCC化學法(Pierce #22622)係用於將 A型流感病毒抗體共價性聯結至奈米顆粒之表面硫基上。 缺乏SERS標記之60 nm直徑金奈米顆粒，係購自BBI。 該金奈米顆粒之後經下列流程以二氧化矽塗覆。丨〇 mL之60 nm金膠體(BBI，〜2.6X101。particles/mL)首先以75 μί之 100 μΜ 3-Μ丙基三乙氧基矽烷之乙酵溶液處理。3小時後，加 入75 gL之2.7%矽酸鈉溶液，反應繼續24小時。下一步驟 中’ 40 mL乙醇係加至懸浮液中，之後加入1 mL氨水與300 pL (5%之乙醇溶液）之四乙基原矽酸鹽。反應維持攪拌2 天，最終以重複離心法純化。由此方法製得之二氧化石夕塗 覆物厚度為30 nm，經二氧化矽塗覆金之總顆粒直徑為12〇 nm。之後硫基係加至該經二氧化矽塗覆之金顆粒上，藉由 將經玻璃塗覆之金奈米顆粒水性懸浮液（1〇 mL，〜2.6xl〇10 顆粒/mL，與1%Μ丙基三甲氧基矽烷(MpTMS)之乙醇溶 液’於室溫下反應24小時。MPTMS溶液之量係由25 pL變 化至100 μι ’以於接近載入量之〇·5、丨〇、丨5與2 〇倍(例如， 2.0為0.5之4X)，產生各種量之表面活性硫基，經由非最佳 化製程。反應之後，顆粒經重複離心法於水中純化。硫代 30 200946913 -SMCC化學法(Pierce #22622)係用於將A型流感病毒抗體 共價性聯結至奈米顆粒之表面硫基上。 橫向流動免疫試驗係以下列浸潰片形式進行。A型流感 病毒捕捉抗體係施加於Whatman AE99墙基纖維素直條 上。該硝基纖維素直條係浸入含有奈米顆粒之溶液樣本 中，其調整至光學密度為10，並含有各種濃度之A型流感 H1N1病毒。該樣本溶液可完全濕潤該硝基纖維素直條。之 後加入清洗緩衝液，並亦濕潤該硝基纖維素薄膜直條。之 後β亥直條乾燥，反射度係使用Hamamatsu反射儀模組 C10066讀取。結果摘錄於表3。 表3 奈米顆粒種類 LOD-反射度讀取儀 (單位X，測詈^Τ?Γ)ΤΛ UXuiiicd JNIililuplex SERs，以4 4，-灿 0.0471 Oxonica Naiiuplex stKIS，以4 4， - 〇ll 啶拉曼報導子分子標一 0.0564 經氧化取室覆之金， 子分子-硫基載入产又報導 0.0901 經氣化 """a-----i-*u 0.135 ύτΐί 一 41τ 1U rh 费~~"Zλ------ 0.1063 經氧化 0.062 表3之資料顯示，若經最佳化’該不具有SERS報導子 之經一氧化⑪塗覆之金奈米顆粒，表現度與具有sers報導 子之奈米顆粒-樣好，在橫向流動免疫試驗中，當使用反 射讀取儀時。此外，經二氧切塗覆之金顆粒表現度係依 據硫化程度而決定。 範例S : 此實驗係用於測試橫向流動原型裝置之表現度，其用 31 200946913 於4貞測床樣本中活H1N1 A型流感病毒，使用〇x〇nica Nanoplex™經二氧化矽塗覆之金奈米顆粒作為報導子。該 Oxonica顆粒具有一直徑約60 nm之金核心，一拉曼報導子 4,4’-二11比咬，以及二氧化石夕外殼，約35 nm厚。該卡匣基礎 之原型裝置，係與BD DirectigenTM EZ Flu A+B市售產品使 用相同之捕捉與偵測抗體，並以相同方式使用。 測試裝置之原型係包含一背部直條支撑Millipore HF135硝基纖維素橫向流動薄膜之長邊部分。特異於流感病 毒A核蛋白（Flu ANP)之捕捉抗體係塗佈橫越此薄膜，形成 測試線。抗物種免疫球蛋白抗體係塗佈鄰近於測試線，形 成控制線。Oxonica Nanoplex™ SERS奈米顆粒塗覆於組合 墊上（Arista MAPDS-0399)，其經 10% SEABLOCK 溶液 (Pierce 37527)處理。該奈米顆粒係與一fiu A Np偵測抗體 結合。該組合墊附著於背部直條上，其位於橫向流動薄膜 之一端。在橫向流動薄膜之對側，係聯結一吸收濕潤塾 (Whatman #470)。所得之橫向流動試驗直條係置於二部分 聚苯乙烯卡匣中。此卡匣可完全密封該試驗直條，除了有 一中央視窗’可看到LF薄膜之試驗與控制區域，以及一樣 本施加孔’位於共軛(塾之中心。此卡g外罩係用於Bd DirectigenTMEZRSV橫向流動試驗裝置中。 類似於範例1，測試為A型流感病毒陰性之小兒科鼻咽 抽出物樣本’係以已知量之活A型流感病毒產生刺突。刺突 化樣本中之最終病毒濃度範圍為〇.25χ (不定單位）至 0.0039X ’以_一倍系列稀釋。以無病毒稀釋介質刺突化(“〇χ”) 200946913 之樣本係作為控制組。加入活病毒後，一系列之樣本係經 處理’使用BDDirectigenTMEZFluA+B樣本製備流程。簡 言之，經A型流感病毒-刺突化之樣本，係與萃取試劑於彈 性樣本試管中混合。該經萃取之樣本之後經玻璃纖維過遽 尖頭過濾並收集。每一樣本皆進行三重複試驗，施加1〇〇 至三測試裝置原型每一者之樣本孔中。 每一裝置皆具有Oxonica Nanoplex™ SERS奈米顆粒， 使用Hamamatsu反射儀(模組C10066)偵測，於施加樣本後15 分鐘與30分鐘。30分鐘後偵測，每一橫向流動直條係自卡 匣中移出’塗佈該共軛與濕潤墊，並於室内溫度與濕度下 乾燥至少1小時。每一直條皆於乾燥後以反射儀再偵測一 次。劑量反應曲線係繪製出，使用來自每一偵測時間之資 料’之後用於計算每一偵測時間之敏感度，換算為最小偵 測濃度（每一平均訊號之最低濃度等於空白樣本信賴曲線 之最大值；MDC)，以及可信賴偵測極限(RDL)。這些結果 顯示於表4。表4亦顯示出使用Oxonica顆粒可使敏感度增 進，與Directigen™ EZ相較。Directigen™ EZ使用不具二氧 化石夕塗覆物之40 nm-直徑金膠體。 表4.卡匣基礎FluA橫向流動試驗系統之敏感度，使用 Oxonica SERS -活性奈米顆粒，並以反射儀Y貞測 裝置狀態與 偵測時間 FluA偵測極限，以反射 儀讀來(Oxonica顆粒） RDL增進v.s. DirectigenIM EZ FluA裝置，以反射儀讀取 MDC (X) RDL (X) 於15分鐘濕潤 0.0341 0.0666 3.0-倍 於30分鐘濕潤 0.0131 0.0264 7.6-倍 30分鐘後乾燥 0.0130 0.0242 8.3-倍 表示為最低偵測濃度(MDC)，以及可信賴偵測極限(RDL) 33 200946913 目前Directigen™ EZ Flu A裝置之偵測極限(RDL)約為 0_5X Flu A病毒濃度，以視覺判定，若以反射儀讀取則為 0.2X。如表4戶斤示，該使用OxonicaNanoplex™報導子奈米 顆粒之卡匣基礎測試裝置，係提供明顯增進之敏感度，相 較於目前之Directigen™ EZ Flu A裝置。 範例6 : 在此範例中，該橫向流動Flu A試驗原型，使用Oxonica NanoplexTM經二氧化矽塗覆之金奈米顆粒之分析級敏感 度，係與BDDirectigenTMEZFluA+B市售產品，具有反射 儀，之分析級敏感度相較。該Oxonica顆粒具有直徑約60 nm 之金核心，具有拉曼報導子分子4,4’-二吡啶聯結於該金表 面，以及厚度約35 nm之二氧化矽外殼。在此範例中，每個 橫向流動裝置中SERS奈米顆粒之量，經預估微小於市售產 物中金膠體顆粒之量。BD Directigen™ EZ Flu A+B市售產 物與Oxonica Nanoplex™奈米顆粒-基礎裝置所使用之捕 捉與偵測抗體皆相同。 如同範例5所示，測試為A型流感病毒陰性之小兒科鼻 咽抽出物樣本，係以已知量之活A型流感病毒產生刺突。經 最佳化之原型裝置係如範例5中所述組裝，樣本萃取係依據 BD Directigen™ EZ Flu A包裝說明進行。所有裝置（SERS-基礎原型與BD Directigen™ EZ Flu A+B )皆於樣本施加後 15分鐘摘測，使用Hamamatsu反射儀(模組C10066)。第2圖 顯示反射訊號為活病毒濃度之函數，就二試驗形式，表5顯 示在最高測試病毒濃度(0.25X)下之反射儀訊號，伴隨該試 200946913 驗之可信賴偵測極限(RDL) ^在此實驗中，使用SERS奈米 顆粒之裝置可提供約7倍增進之敏感度，以及8倍增進之亮 度，與BD Directigen™ EZ Flu A+B，以反射儀偵測，相較。 表5 原型(使用Nanoplex™ SERS顆粒） BD DirectigenIM EZ A+B (使用金膠艚） RDL (不定） 0.027x 0.185x 反射度訊號強度， 於0.25χί不定單位） 0.419 0.054 等效範例 熟習此技術領域者應瞭解到或可考慮一般實驗流程 中，有許多等效於此述特定實施例之等效實施例。此等效 實施例亦包含於下列申請專利範圍中。 【圖式^簡翠_ ^明】 第1圖顯示A型流感病毒之橫向流動試驗結果，係比較 膠體金與經二氧化矽塗覆之金奈米顆粒之敏感度，當以反 射儀測量時。如圖中所示，經二氧化矽塗覆之金奈米顆粒 觀察到強烈的反應，與金膠體比較。 第2圖顯不顯示A型流感病毒之橫向流動試驗結果，係 比較使用經二氧化矽塗覆之金奈米顆粒之原型裝置敏感度 (第2A圖），以及商用產品，BD以代如呂⑶顶EZ A+B (第2B 圖）之敏感度，此二裝置皆以反射儀讀取。使用經二氧化矽 塗覆之金奈米顆粒之裝置敏感度約為

BD Directigen™ EZ A+B之7倍，以反射儀讀取。 【主要元件符號說明】 (無） 35

Claims (1)

1. 200946913 七、申請專利範圍： 1. 一種測試裝置，用於測定在一液體樣本中分析物的存在 或不存在，該裝置包含：（a) 一樣本接收元件；（b) 一 載體，與該樣本接收元件呈液體連通；（c) 一標記試劑， 在液體樣本存在下，該標記試劑於載體中為可移動，該 標記試劑包含一與該分析物結合之配位體，以及一經塗 覆之奈米顆粒，該奈米顆粒包含一核心以及一外殼該 外殼可增加具有配位體聯結於其上之奈米顆粒之反射 度’其中該經塗覆之奈米脉並不包括—具拉曼(R_n) UI1 生之分子，以及⑷—結合試劑，可有效捕捉該 分析物，當存在時，該結合試劑係被固定於載體之經定 義债測區域上，其巾該液體樣本係施加於樣本接收元件 上’使該標記試劑流動，使得該樣本與標記試劑可沿著 載體長邊運送，到達該偵測區域，其中，若在偵測區域 侧到標記_，代表在該㈣穌巾存在有分析物。 2. 如申請專利第丨項之測職置，其中該載體包含硝 基纖維素、塑膠或玻璃。 3. 如申請專利範圍第2項之測試裝置，其中該載體包含确 基纖維素。 4·如申請專利範圍第i項之測試裝置，其中該分析物為一 蛋白質、核酸、代謝物、小分子、病毒或細菌。 5.如申請專利範圍第丨項之測試裝置，其更包含一吸收 墊，與偵測區呈液體連通。 6_如申請專利範圍第i項之測試褒置，其更包含一控制區 36 200946913 域’與偵測區呈液體連通。 7· ^申請專職圍第〗項之測試裝置，其巾該液體樣本中 分析物之存在可定量測定。 8. =申請專利範圍第i項之測試裝置，其中該測試裝置係 °又置為可偵測多種分析物。 ，、 9. 如申請專利範圍第8項之測試裝置，其更包含至少二不 同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體可結合至不同

   刀析物上’以及至少二镇測區域，用於_該至少二不 同才示s己試劑之每一者。 10. 及 在 種系統，包含如申請專利範圍第丨項之測試裝置以 —反射儀’用以偵測在該測試裝置中標記試劑之存 U· 一種用於測定在-液體樣本中—分析物的存在或不广 在之方法，包含： a) 提供如申請專利範圍第1項之測試裝置； _ b) 將該液體樣本與該測試裝置之樣本接收元件接觸； c) 允許將該液體樣本施加於樣本接收元件上，以 使該標記試動’使得紐體樣本與標記試劑沿 體長邊運送，到達偵測區域； 句精由測反射度來侧在偏㈣域中標記試劑 在偵測區域若_到標記試劑，代表液體 在有該分析物；且在仙傻域若未㈣到標記 忒劍，代表液體樣本令不存在有該分析物。 ❹申物咖㈣之方法射係㈣反射讀取儀 37 200946913 測定偵測區域之標記試劑。 13. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該偵測區域内標記 試劑係以目視測定。 14. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該液體樣本中分析 物之存在係經定量測定。 15. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該方法可偵測液體 樣本中之多種分析物。 16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該測試裝置更包含 至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會結 合至不同分析物上，以及至少二偵測區，用以偵測該至 少二不同之標記試劑之每一者。 17. —種用於測定在一液體樣本中分析物的存在或不存在 之方法，包含： a) 提供一測試裝置，包含：⑴一樣本接收元件；（ii) 一載體，與該樣本接收元件呈液體連通；以及(Hi)—結 合試劑，可有效捕捉該分析物，當存在時，該結合試劑 係係固定於該載體之經定義偵測區域上； b) 將該液體樣本與標記試劑混合，該標記試劑包 含一可結合至分析物之配位體，以及一經塗覆之奈米顆 粒，該奈米顆粒包含一核心以及一外殼，該外殼可增加 具有配位體聯結於其上之奈米顆粒之反射度，其中該經 塗覆之奈米顆粒並不包括一具拉曼光譜活性分子； c) 將b)之混合物與該測試裝置之樣本接收元件接 觸； 38 200946913 句允許將b)之混合物施加於樣本接收元件上，沿著 載體長邊運送以到達該偵測區域； e)藉由測量反射度來偵測在該偵測區域中標記試 劑的存在，其中在偵測區域中若偵測到標記試劑，代表 在該液體樣本中存在有該分析物；且在偵測區域中若未 偵測到該標記試劑，代表在該液體樣本中不存在有該分 析物。 〇 18.如申請專利範圍第17項之方法，其中係使用反射讀取儀 測定偵測區域之標記試劑。 19. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該偵測區域之標記 試劑係以目視測定。 20. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該液體樣本中分析 物之存在係定量測定。 21. 如申咕專利範圍第17項之方法，其中該方法可偵測液體 樣本中之多種分析物。 參 22.如申凊專利範圍第21項之方法，其中該測試裝置更包含 至；—不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會結 合至不同分析物上，以及至少二偵測區，用以偵測該至 少一不同標記試劑之每一者。 23.種測试裝置’用於測定在一液體樣本中分析物的存在 或不存在，包含：（a) 一樣本接收元件；（b) 一載體， 與該樣本接收元件呈液體連通；（c) 一標記試劑，在液 體樣本存在下，該標記試劑於載體中為可移動，該標記 «式劑包含一與分析物結合之配位體，以及一經塗覆之奈 39 200946913 米顆粒，該奈米顆粒基本上係由一核心以及一外殼所構 成，該外殼可增加具有配位體聯結於其上之奈米顆粒之 反射度，其中該配位體係結合至該外殼之表面上；以及 (d) —結合試劑，可有效捕捉該分析物，當存在時，該 結合試劑係固定於該載體之經定義偵測區域；其中該液 體樣本係施加於樣本接收元件上，使標記試劑流動，以 使得該樣本與標記試劑可沿著載體長邊運送，到達該偵 測區域，且其中，若在偵測區域中偵測到標記試劑，代 表在該液體樣本中存在有分析物。 24. 如申請專利範圍第23項之測試裝置，其中該載體包含硝 基纖維素、塑膠或玻璃。 25. 如申請專利範圍第24項之測試裝置，其中該載體包含硝 基纖維素。 26. 如申請專利範圍第23項之測試裝置，其中該分析物為一 蛋白質、核酸、代謝物、小分子、病毒或細菌。 27. 如申請專利範圍第23項之測試裝置，其更包含一吸收 墊，與偵測區呈流體連通。 28. 如申請專利範圍第23項之測試裝置，其更包含一控制區 域，與偵測區呈流體連通。 29. 如申請專利範圍第23項之測試裝置，其中該液體樣本中 分析物之存在可定量測定。 30. 如申請專利範圍第23項之測試裝置，其中該測試裝置係 設置為可偵測多種分析物。 31. 如申請專利範圍第30項之測試裝置，其更包含至少二不 200946913 同之標記試劑，其巾該標記試劑之配倾會結合至不同 分析物上’以及至少二偵測區，用則貞測該至少二不同 標記試劑之每—者。 32. -種包含如申請專利範圍第23項之測試裝置，以及一反 射儀之系統，用以偵測測試裝置中標記試劑之存在。 33. -種用於測定在—液體樣本中分析物的存在或不存在 之方法，包含： φ 幻提供如申請專利範圍第23項之測試裝置； b) 將該液體樣本與該測試裝置之樣本接收元件接觸； c) 允許將該液體樣本施加於樣本接收元件上，使 該標記試·動’錢制雜樣本能記賴沿著載 體長邊運送，到達偵測區域； )藉由測$反射度來偵測在债測區域中標記試劑 的存在，其中在偵測區域若偵測到標記試劑，代表在該 液體樣本中存在有分析物；且在該偵測區域若未偵測到 e 該標記試劑，代表液體樣本中不存在有該分析物。 34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中係使用反射讀取儀 測定偵測區域之標記試劑。 35. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該偵測區域中標記 試劑係以目視測定。 36. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該液體樣本中分析 物之存在係定量測定。 37. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該方法可偵測液體 樣本中之多種分析物。 200946913 38. 如申請專利範圍第37項之方法，其中該測試裝置更包含 至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會結 合至不同分析物上，以及至少二偵測區’用以偵測該至 少二不同之標記試劑之每一者。 39. —種用於測定在一液體樣本中分析物的存在或不存在 之方法，包含： a) 提供一測試裝置，包含：（丨）一樣本接收元件； (ii) 一載體，與該樣本接收元件呈液體連通；以及(iii) 一結合試劑’可有效捕捉該分析物，當存在時，該結合 試劑係固定於該載體之經定義偵測區域； b) 將該液體樣本與標記試劑混合，該標記試劑基 本上係由一核心與一增加奈米顆粒反射度之外殼，以及 一聯結至該外殼表面上之配位體所構成，該配位體係與 該分析物結合，； c) 將b)之混合物與該測試裝置之樣本接收元件接 觸； d) 允許將b)之混合物施加於樣本接收元件上，以沿 著載體長邊運送，到達該偵測區域； e) 藉由測量反射度來偵測在偵測區域中該標記樣 本的存在’其中在偵測區域中若偵測到該標記試劑，代 表在液體樣本中存在有該分析物；且在偵測區域中若未 積測到該標記試劑’代表在液體樣本中不存在有該分析 物。 40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中係使用反射讀取儀 42 200946913 測定偵測區域之標記試劑。 41. 如申請專利範圍第39項之方法其中該彳貞測區域中標記 試劑之偵測係以目視決定。 42. 如申請專利範圍第％項之方法，其中該液體樣本中分析 物之存在係定量測定。 43. 如申凊專利範圍第39項之方法，其中該方法可偵測液體 樣本中之多種分析物。 φ 44.如申請專利範圍第43項之方法，其中該測試裝置更包含 至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會結 合至不同分析物上’以及至少二偵測區，用以偵測該至 少一不同標記試劑之每一者。 45. —種用於測定在一液體樣本中一分析物的存在或不存 在之方法，包含： a) 提供一測試裝置，包含：⑴一樣本接收元件； (η) —載體，與該樣本接收元件呈液體連通；（出）一標 φ 記試劑，在該液體樣本存在下，該標記試劑於載體中為 可移動，該標記試劑包含一與分析物結合之配位體、一 經塗覆之奈米顆粒，該奈米顆粒包含一核心、一聯結至 該核心並可藉由表面強化拉曼散射產生訊號之分子，以 及-環繞_，讀該分子之外殼，該外殼具有配位體聯 結於其上；以及(iv) 一結合試劑，可有效捕捉該分析 物，當存在時，該結合試劑係固定於載體之經定義偵測 區域， b) 將該液It縣與制試裝置之樣本接收元件接觸； 43 200946913 C)允許將該液體樣本施加於樣本接收元件上，使 該標記試劑流動，以使得該液體樣本與標記試劑可沿著 載體長邊運送，到達偵測區域； d)藉由測量反射度來偵測在該偵測區域中該標記 樣本的存在，其中在該偵測區域中若偵測到該標記試 劑’代表在該液體樣本中存在有該分析物；且在該偵測 區域中若未偵測到該標記試劑，代表在該液體樣本中不 存在有該分析物。 46. 如申請專利範圍第45項之方法，其中係使用反射讀取儀 測定偵測區域之標記試劑。 47. 如申請專利範圍第45項之方法，其中該偵測區域内標記 試劑係以目視測定。 48. 如申請專利範圍第45項之方法，其中該液體樣本中分析 物之存在係定量測定。 49. 如申請專利範圍第45項之方法，其中該方法可偵測液體 樣本中之多種分析物。 50. 如申請專利範圍第49項之方法，其中該測試裝置更包含 至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會結 合至不同分析物上，以及至少二偵測區，用以偵測該至 少二不同標記試劑之每一者。 51. —種用於測定在一液體樣本中一分析物存在或不存在 之方法，包含： 勾提供一測試裝置，包含：（i) 一樣本接收元件； (Π) 一载體，與該樣本接收元件呈液體連通；以及(iii) 44 200946913 一結合試劑，可有效捕捉該分析物，當存在時，該結合 試劑係固定於該載體之經定義偵測區域； b) 將該液體樣本與標記試劑混合，該標記試劑包 含一與分析物結合之配位體、及一經塗覆之奈米顆粒， 該奈米顆粒包含一核心、一聯結至該核心並可藉由表面 強化拉曼散射產生訊號之分子，以及一環繞該核心與該 分子之外殼，該外殼具有配位體聯結於其上； c) 將b)之混合物與該測試裝置之樣本接收元件接 觸； d) 允許將b)之混合物施加於該樣本接收元件上，以 沿著載體長邊移動，到達該偵測區域； e) 藉由測量反射度來偵測在該偵測區域中該標記 試劑的存在，其中在偵測區域中若偵測到標記試劑，代 表在該液體樣本中存在有該分析物，且在該貞測區域中 若未偵測到該標記試劑，代表在該液體樣本中不存在有 該分析物。 52. 如申請專利範圍第51項之方法，其中係使用反射讀取儀 測定偵測區域之標記試劑。 53. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該偵測區域内標記 試劑係以目視測定。 54. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該液體樣本中分析 物之存在係定量測定。 55. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該方法可偵測液體 樣本中之多種分析物。 45 200946913 56·如申請專利範圍第55項之方法，其中該測試裝置更包含 至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會結 合至不同分析物上，以及至少二偵測區，用以偵測該至 少二不同標記試劑之每一者。 57_ —種用於進行一流式分析測試(flow-through analytical

   test)之套組’該套組係藉由反射法偵測在液體樣本中分 析物存在或不存在，該套組包含：（a) 一測試裝置，包 含一孔狀薄膜，其包含一上表面與下表面，以及一有效 捕捉该分析物之結合試劑，當存在於該液體樣本中時， 該結合試劑係附著於該孔狀薄膜之上表面或下表面；以 及⑻-標記試劑’包含-與分―結合之配位體以及 -經塗覆之奈米顆粒’該奈米顆极包含―核心以及一可 增加該奈米顆粒反射度之外殼，其中該經塗覆之奈米顆 粒並不包括一拉曼光譜活性之分子。

   从如申料職㈣57奴綠，㈠至少—分析物為一 f白質、核酸、代謝物、小分子、病毒或細菌。 59.如申請專利範圍第57項之套組，其中該測試裳置更以 一吸收墊，其中該孔㈣膜之下表面與吸收塾呈物理七 接觸，並以流體連通，以及其中該結合㈣係 孔狀薄膜之上表面。 " 其中該測試裝置更包含 其中該液體樣本中分析 60.如申請專利範圍第57項之套組， 一孔狀薄膜之外罩。 61.如申請專利範圍第S7項之套組， 物之存在係定量測定。 46 200946913 62. t申請專利範圍第57項之套組，其中該測試裝置係設置 為可偵測多種分析物。 63. 如切專利制第62項之套組，其中該測試裝置更包含 不同之心。己式劑，其中該標記試劑之配位體可結 了至不同分析物上’以及至少二彳貞測區域，可侧該至 〉、二不同標記試劑之每—者。

   4-種包含如申請專利範圍第57項之套組，以及一反射儀 =系統’該系統係適用以伽在測試裝置中標記試劑之 種使用如巾請專利範圍第57項之套組來取在一液 體樣本中分㈣存錢不存紅方法，财法包含：⑷ =該液體樣本魏料狀上表面制；（b)允許該液 體樣本流過該孔狀薄膜，使得至少_部分之分析物在當 存在於該賴樣本中時結合至該結合_上；⑷將該 標記試劑與該孔狀薄膜之上表面接觸；⑷允許該標記 試_過朗膜，使得至少—部份之標記試劑結合 s析物’以及(e)藉由測量反射度來谓測該孔狀薄 膜>上該標記試劑之存在，其中該孔狀賴上若偵測到標 °己試劑’代表在魏體樣本巾存在有該分析物；且該孔 狀4膜上右未彳貞測到標記試劑的存在，代表在該液 本中不存在有該分析物。 ，其中係使用反射讀取儀 ，其中該孔狀薄膜上標記 66.如申請專利範圍第幻項之方法 偵測孔狀薄膜上之標記_。 67.如申請專利範圍第65項之方法 47 200946913 試劑係以目視測定。 68·如申請專利範圍第65項之方法，其中該液體樣本中分析 物之存在係定量測定。 69. 如申請專利範圍第65項之方法，其中該方法可偵測液體 樣本中之多種分析物。 70. 如申請專利範圍第69項之方法，其中該測試裝置更包含 至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會結 合至不同分析物上，以及至少二偵測區，用以偵測該至 少'一不同標記試劑之每一者。 71. —種使用如申請專利範圍第57項之套组來測定在一液體 樣本中一分析物存在或不存在之方法，該方法包含：（a) 混合該液體樣本與該標記試劑，使得該分析物，當存在 於該液體樣本中時，結合至該標記試劑；將（a)之混 合物與孔狀薄膜之上表面接觸；（c)允許(a)之混合物流 過该孔狀薄膜，使得至少一部分已與標記試劑結合之分 析物，結合至結合試劑上；以及(句藉由測量反射度來 偵測孔狀薄膜上標記試劑之存在，其中該孔狀薄膜上若 偵測到標記試劑，代表在該液體樣本中存在有該分析 物；且在該孔狀薄膜上若未偵測到該標記試劑的存在， 代表在該液體樣本中不存在有該分析物。 72. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該反射讀取儀係用 於測定孔狀薄膜上之標記試劑。 73. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該孔狀薄膜上標記 试劑係以目視測定。 48 200946913 74. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該液體樣本中分析 物之存在係定量測定。 75. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該方法可偵測液體 樣本中之多種分析物。 76. 如申請專利範圍第75項之方法，其中該測試裝置更包含 至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會結 合至不同分析物上，以及至少二偵測區，用以偵測該至 少二不同標記試劑之每一者。 77. —種用於進行流式分析測試之套組，該套組係藉由反射 法來偵測在該液體樣本中分一析物存在或不存在，該套 組包含：（a) —測試裝置，包含一孔狀薄膜，其包令— 上表面與下表面，以及一有效捕捉該分析物之結合試 劑，當存在於該液體樣本中時，該結合試劑係附著於該 孔狀薄膜之上表面或下表面；以及(b) —標記試劑，包 含一與該分析物結合之配位體以及經塗覆之奈米顆粒， 該奈米顆粒基本上由一核心以及一增加該奈米顆粒反射 度之外殼所構成，其中該配位體係結合至該外殼之表面。 78. 如申請專利範圍第77項之套組，其中該分析物為一蛋白 質、核酸、代謝物、小分子、病毒或細菌。 79. 如申請專利範圍第77項之套組，其中該測試裝置更包含 一吸收墊，其中該孔狀薄膜之下表面與該吸收墊呈物理 性接觸，並以流體連通，以及其中該結合試劑係附著至 該孔狀薄膜之上表面。 80. 如申請專利範圍第77項之套組，其中該測試裝置更包含 49 200946913 一孔狀薄膜之外罩。 81. 如申請專利範圍第77項之套組，其中該液體樣本中分析 物之存在可定量測定。 82. 如申請專利範圍第77項之套組，其中該測試裝置係設置 為可偵測多種分析物。 83. 如申凊專利範圍第82項之套組，其中該測試裝置更包含 至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體可結 合至不同分析物上，以及至少二偵測區域，可偵測該至 少一不同標記試劑之每一者。 84. —種包含如申請專利範圍第”項之套組以及一反射儀 之系統，該系統係適用以偵測在測試裝置中標記試劑之 存在。 紅-種使用如中請專利範圍第77項之套組來測定在一液 體樣本中分析物存錢轉在之料，财法包含：⑷ 將該液體樣本與該孔狀薄叙上表面接觸；（b)允許該 液體樣本々IL過该孔狀薄膜並進入吸收材料中，使得至少 部分之分析物在當存在於該液體樣本中時結合至該 、、Q 口忒劑上，（c)將該標記試劑與該孔狀薄膜之上表面 接觸，（d)允夺該標記試劑流過該孔狀薄膜並進入吸收 材料，使得至少一部份之標記試劑可結合至該分析物 上，以及（e)藉由測量反射度來偵測在該孔狀薄膜上該 標記試劑之存在，其中在該孔狀薄膜上若偵測到該標記 試削’代表在該液體樣本巾存在有該分析物；且在該孔 狀薄膜上若未制職標記試_存在，代表在液體樣 50 200946913 本中不存在有該分析物。 86. 如申請專利範圍第85項之方法，其中係使用反射讀取儀 測定孔狀薄膜上之標記試劑。 87. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該孔狀薄膜上之標 記試劑係以目視測定。 88. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該液體樣本中分析 物之存在係定量測定。 〇 89·如申請專利範圍第85項之方法，其中該方法可偵測液體 樣本中之多種分析物。 90. 如申請專利範圍第89項之方法，其中該測試裝置更包含 至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會結 , 合至不同分析物上，以及至少二偵測區，用以偵測該至 少二不同標記試劑之每一者。 91. 一種使用如申請專利範圍第77項之套組來測定在—液 體樣本中一分析物存在或不存在之方法，該方法包含： ® (a)混合該液體樣本與該標記試劑，使得該分析物在當 存在於該液體樣本中時結合至該標記試劑；（b)將(a)之 混合物與孔狀薄膜之上表面接觸；（c)允許(3)之混合物 流過該孔狀薄膜，使得至少—部分已與該標記試劑結合 之分析物，結合至該結合試劑上；以及(d)藉由測量反 射度來偵測在該孔狀薄膜上標記試劑之存在，其中在該 孔狀薄膜上若偵測到標記試劑，代表在該液體樣本中存 在有該分析物；且在該孔狀薄膜上若未偵測到標記試劑 的存在，代表在_麟材不存麵該分析物。 51 200946913 ，其中係使用反射讀取儀 ，其中該孔狀薄膜上之標 ，其中該液體樣本中分析 ，其中該方法可偵測液體 ，其中該測試裝置更包含 92. 如申請專利範圍第91項之方法 測定孔狀薄膜上之標記試劑。 93. 如申請專利範圍第91項之方法 記試劑係以目視偵測。 94. 如申請專利範圍第91項之方法 物之存在係定量測定。 95. 如申請專利範圍第91項之方法 樣本中之多種分析物。 96. 如申請專利範圍第95項之方法 至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會結 合至不同分析物上，以及至少二偵測區，用以偵測該至 少二不同標記試劑之每一者。 97. —種進行流式分析測試之套組以用於藉由反射法來偵 測在一液體樣本中一分析物存在或不存在，包含：（a) — 測試裝置，包含一孔狀薄膜，其包含一上表面與下表 面，以及一有效捕捉該分析物之結合試劑，當存在於液 體樣本中時，該結合試劑係附著於該孔狀薄膜之上表面 或下表面；以及(b) —標記試劑，包含一與該分析物結 合之配位體，以及一經塗覆之奈米顆粒，該奈米顆粒包 含一核心、一聯結至核心且可藉由表面強化拉曼散射產 生訊號之分子，以及一環繞該核心與該分子之外殼。 98. 如申請專利範圍第97項之套組，其中該分析物為一蛋白 質、核酸、代謝物、小分子、病毒或細菌。 99. 如申請專利範圍第97項之套組，其中該測試裝置更包含 52 200946913 -吸收墊，其中該孔狀薄膜之下表面與吸收塾呈物理性 接觸，並以流體連通，以及其中該結合簡係附著至該 孔狀薄膜之上表面。 Λ 100. 如申請專利範圍第97項之套組，其中該測試裝置更包含 一孔狀薄膜之外罩。 匕3 101. 如申請專利範圍第97項之套組，其中該液體樣本中 物之存在可定量測定。 77 ❹ 胤如申請專利範圍第97項之套組，其中該測試裝置係設置 為可偵測多種分析物。 m如申請專利範圍第102項之套組，其中該測試裝置更包 含至少三不狀標記試劑，其中該標記試劑之配位體可 結合至不同分析物上，以及至少二制區域，可偵測該 至少二不同標記試劑之每一者。 μ ·-種包含如中請專利範圍第97項之套組的測試裝置以 及-反射儀之純，該系統係適用以_在測試裝置中 藝 標記試劑之存在。 敝-種使用如巾請專利範圍第97項之套組來狀在一液 體樣本中分錢存在心存在之枝，該方法包含：⑷ 將該液體樣本與孔㈣狀上表面接觸；（b)允許該液 體樣本流職孔狀_錢人魏材料，使得至少一部 分之分析物在當存在於該液體樣本中時結合至該結合 試劑上’（c)將該標記試劑與該孔狀薄膜之上表面接 觸；⑷允許該標記試劑流過該孔狀薄膜並進入吸收材 料’使得至少-部份之標記試劑結合至分析物上；以及 53 200946913 (e)藉由測量反射度來偵測在該孔狀薄膜上該標記試劑 之存在，其中該孔狀薄膜上若偵測到標記試劑，代表在 該液體樣本中存在有該分析物；且在該孔狀薄膜上若未 偵測到該標記試劑的存在’代表在該液體樣本中不存在 有該分析物。 106•如申請專利範圍第1〇5項之方法，其中係使用反射讀取 儀測定孔狀薄膜上之標記試劑。

   107•如申請專利範圍第1〇5項之方法，其中該孔狀薄膜上之 標記試劑係以目視測定。 108•如申請專利範圍第105項之方法，其中該液體樣本中分 析物之存在係定量測定。 109. 如申請專利範圍第105項之方法，其中該方法可偵測液 體樣本中之多種分析物。 110. 如申請專利範圍第109項之方法，其中該測試裝置更包 含至少二不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會 結合至不同分析物上，以及至少二偵測區，用以偵測該 至少一不同標記試劑之每一者。 in.-種使用如中請專利範圍第97項之套組來測定在一液 體樣本中—分析物存在或林在之方法，該方法包含： ⑷/“該液體樣本與標記試劑，使得該分析物在當存 在於該液體樣本中時與該標記試劑結合；（b)將⑷之混 。物與孔狀;|膜之上表面接觸；（e)允許⑷之混合物流 過該孔狀4膜，使得至少__部分已與標記賴結合之分 析物，結合至該結合試劑上；以及⑷藉由測量反射度 54 200946913 來偵測在觀狀賴上該標記_之存在，其中在該孔 狀薄膜上若制到該標記試劑’代表在該液體樣本中存 在有》亥刀析物，且在該孔狀薄膜上若未偵測到標記試劑 的存在，代表在該液體樣本中不存在有該分析物。 112.如U利㈣第ηι項之方法，其中係使用反射度讀 取儀測疋孔狀薄膜上之標記試劑。 113·如申請專·圍第U1項之方法，其中該孔狀薄膜上之 Φ 標記試劑係以目視測定。 114.如申請專利範圍第U1項之方法，其中該液體樣本中分 析物之存在係定量測定。 115·如中請專利範圍第⑴項之方法，其中該方法可债測液 體樣本中之多種分析物。 申請專圍第115項之方法，其中該測試裝置更包 3至J一不同之標記試劑，其中該標記試劑之配位體會 結合至不同分析物上，以及至少二偵測區，用則貞測該 〇 至少二不同標記試劑之每一者。 55