BRPI0911067B1 - métodos e sistemas para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido - Google Patents

Abstract

MÉTODOS E SISTEMAS PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE UM ANALITO EM UMA AMOSTRA DE LÍQUIDO Nanopartículas revestidas compreendendo um núcleo envolvido por um invólucro que aumenta a refletância da nanopartícula, em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman, são fornecidas. Dispositivos de teste e métodos de imunoensaio utilizando as nanopartículas revestidas são fornecidos.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. N2- 61/071.035, depositado em 9 de Abril de 2008, o qual é incorporado como referência neste relatório.

CAMPO

[002]Nanopartículas revestidas compreendendo um núcleo envolvido por um invólucro que aumenta a refletância da nanopartícula, em que a nanopartícula revestida não precisa, mas opcionalmente pode incluir uma molécula ativa no Raman, são fornecidas. As nanopartículas revestidas divulgadas neste relatório são úteis em dispositivos de teste e métodos para a determinação quantitativa e/ou qualitativa da presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido.

FUNDAMENTOS

[003]Tecnologias de imunoensaios fornecem um meio simples e relativamente rápido para determinar a presença ou ausência de analitos em amostras biológicas. As informações fornecidas a partir de testes diagnósticos de imunoensaio são frequentemente críticas no atendimento ao paciente. Os ensaios são tipicamente realizados para detectar qualitativa ou quantitativamente a presença de analitos particulares, por exemplo, anticorpos que estão presentes quando um paciente humano tem uma doença ou condição particular. Imunoensaios praticados na técnica são numerosos e incluem ensaios para doenças, tais como infecções causadas por bactérias ou vírus, ou condições, tais como gestação.

[004]Vários tipos de imunoensaios são conhecidos na técnica. Um tipo de procedimento de imunoensaio é o imunoensaio de fluxo lateral. Ensaios de fluxo lateral utilizam um suporte sólido, tal como nitrocelulose, plástico ou vidro, para realizar a detecção do analito. Ao invés de projetar a amostra através do suporte perpendicularmente, como no caso de um ensaio de “fluxo passante”, é permitido que a amostra flua lateralmente ao longo do suporte através de um tubo capilar e outras forças a partir de uma zona de aplicação a uma zona de reação na superfície. Em um ensaio de fluxo lateral, anticorpos de captura são marcados no suporte sólido. Os anticorpos de detecção são conjugados a uma molécula de detecção, que fornece um sinal que é detectável. Uma amostra de líquido é colocada em contato com os anticorpos de detecção, e a mistura de amostra/anticorpo de detecção é deixada fluir ao longo do suporte sólido. Se o analito está presente, um complexo em “sanduíche” é formado em uma localização no suporte sólido onde os anticorpos de captura foram marcados. O sinal a partir da molécula de detecção localizada na linha de captura depois é detectado, tanto visualmente quanto com um instrumento. Um ensaio de fluxo lateral pode ser configurado para detectar proteínas, ácidos nucleicos, metabólitos, células, moléculas pequenas ou outros analitos de interesse.

[005]Um outro formato de imunoensaio é um imunoensaio de fluxo passante. Um imunoensaio de fluxo passante geralmente utiliza um material poroso com uma matriz contendo um reagente em camadas na mesma ou incorporado na mesma. A amostra de teste é aplicada a, e flui através do material poroso, e o analito na amostra reage com o(s) reagente(s) para produzir um sinal detectável no material poroso. Estes dispositivos estão geralmente envolvidos em um alojamento ou envoltório plástico com calibrações para auxiliar na detecção do analito particular.

[006]Muitos exemplos de tipos diferentes de moléculas de detecção úteis em imunoensaios de fluxo lateral são conhecidos na técnica, tais como fluoróforos, ouro coloidal, partículas de látex marcadas e nanopartículas, tais como um ponto quântico ou uma nanopartícula de difusão Raman realçada na superfície (“SERS”). Por exemplo, a Patente U.S. N2 5.591.645 descreve o uso de moléculas “traçadoras” visíveis, tais como ouro coloidal, que podem ser observadas sem o uso de instrumentação. Além disso, a Patente U.S. N2 6.514.767, concedida a Natan, divulga nanopartículas compósitas ativas em SERS (SACNs) compreendendo uma nanopartícula metálica que foi ligada, ou associada com sua superfície uma ou mais moléculas ativas no Raman, e é encapsulada por um invólucro compreendendo um polímero, vidro ou qualquer outro material dielétrico. A Patente U.S. N2 5.714.389 descreve métodos de imunoensaio de fluxo lateral e dispositivos de teste usando uma partícula colorida que pode ser um metal coloidal, preferivelmente ouro. Similarmente, a Patente U.S. N2 7.109.042 descreve dispositivos de imunoensaio de fluxo lateral que utilizam marcações diretas, tais como gold sols e dye sols, que incluem a produção de um resultado analítico imediato, sem a necessidade de adicionar outros reagentes, de modo a desenvolver um sinal detectável.

[007]SERS é um dos métodos mais sensíveis para realizar análises químicas, permitindo a detecção de uma molécula única. Veja Nie, S. e S. R. Emory, “Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface Enhanced Raman Scattering”, Science, 275,1102 (1997). Um espectro Raman, similar a um espectro infravermelho, inclui uma distribuição de comprimento de onda de bandas correspondentes às vibrações moleculares específicas à amostra sendo analisada (o analito). Na prática da espectroscopia Raman, o feixe a partir de uma fonte de luz, geralmente um laser, é focalizado na amostra para, desse modo, gerar radiação inelasticamente difundida, que é opticamente coletada e dirigida em um espectrômetro por dispersão de comprimentos de onda ou por transformada de Fourier, em que um detector converte a energia de impingir fótons em intensidade de sinal elétrico.

[008]A conversão muito baixa da radiação incidente em radiação não elástica difundida limitou a espectroscopia Raman às aplicações que foram difíceis de realizar por espectroscopia de infravermelho, tais como a análise de soluções aquosas. Entretanto, em 1974, foi descoberto que quando uma molécula em proximidade a um eletrodo de prata áspero é submetida a uma fonte de excitação Raman, a intensidade do sinal gerado é aumentada em seis ordens de magnitude. (Fleischmann, M., Hendra, P. J., e McQuillan, A. J., “Raman Spectra of Pyridine Adsorbed at a Silver Electrode”, Chem. Phys. Lett, 26, 123, (1974), e Weaver, M. J., Farquharson, S., Tadayyoni, M. A., “Surface-enhancement factors for Raman scattering at silver electrodes. Role of adsorbate-surface interactions and electrode structure”, J. Chem. Phys., 82, 4867 4874 (1985)). Brevemente, um par de fótons do laser incidente conduz livremente elétrons dentro do metal que, confinado pela superfície da partícula, coletivamente causa a ressonância da nuvem de eletrônica. O campo do plasmon superficial resultante fornece uma via eficaz para a transferência de energia aos modos de vibração molecular de uma molécula dentro do campo e, desse modo, gera fótons Raman.

[009]Nanopartículas SERS foram usadas como uma molécula de detecção em imunoensaios de fluxo lateral. Por exemplo, a Oxonica (Kidlington, UK) desenvolveu as nanopartículas Nanoplex™ para o uso em tais ensaios. As nanopartículas consistem de um núcleo de nanopartícula de ouro, no qual são adsorvidas moléculas repórteres Raman capazes de gerar um sinal de espectroscopia Raman realçado na superfície. A nanopartícula de ouro marcada no Raman é revestida com um invólucro de sílica de aproximadamente 10 a 50 nm de espessura. O invólucro de sílica protege o repórter da dessorção a partir da superfície, previne interações plasmon-plasmon entre partículas de ouro adjacentes e também previne a geração de sinais SERS a partir dos componentes na solução. Nanopartículas SERS tendo um revestimento polimérico no lugar do revestimento de sílica são descritas na Publicação do Pedido de Patente U. S. N2 2007/0165219.

[0010]Enquanto toma vantagem da alta sensibilidade de SERS, a detecção do sinal produzido a partir de uma nanopartícula SERS exige o uso de um instrumento capaz de detectar um sinal Raman. Pode ser vantajoso, em algumas circunstâncias, ter uma nanopartícula para o uso em um imunoensaio de fluxo lateral possuindo sensibilidade aumentada, possivelmente comparável àquela de uma nanopartícula SERS, mas que exija apenas tecnologia de leitura de refletância relativamente simples e barata para a detecção.

SUMÁRIO

[0011]A invenção fornece métodos rápidos e exatos para determinar qualitativa ou quantitativamente a presença ou ausência de analitos em amostras biológicas e dispositivos e reagentes para realizar tais métodos.

[0012]Os inventores descobriram que nanopartículas revestidas usadas como uma molécula detectora em um imunoensaio de fluxo lateral ou fluxo passante vertical fornecem vantagens de sensibilidade de ensaio significantes sobre moléculas detectoras, tais como ouro coloidal, quando o ensaio é lido com um leitor de refletância.

[0013]Em certas modalidades, a invenção é uma nanopartícula revestida compreendendo um núcleo e um invólucro que aumenta a refletância da nanopartícula, em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman. Em outras modalidades, a nanopartícula revestida inclui uma molécula ativa no Raman. O núcleo, por exemplo e sem limitação, pode ser um metal, tal como um metal que exibe ressonância com plasmon, por exemplo, ouro.

[0014]Em algumas modalidades, o invólucro compreende sílica, enquanto em outras modalidades, o invólucro é um outro material cerâmico, tal como um outro óxido, e em outras modalidades, o invólucro é compreendido de um polímero. O polímero pode ser, por exemplo e sem limitação, polietilenoglicol, polimetilmetacrilato ou poliestireno. O invólucro pode envolver completa ou incompletamente o núcleo.

[0015]As nanopartículas revestidas da invenção podem ser formadas em qualquer variedade de formas tendo dimensões diferentes, incluindo, mas não limitadas a, esferoides, bastões, discos, pirâmides, cubos, cilindros, etc. Em certas modalidades, a nanopartícula revestida tem pelo menos uma dimensão na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 1000 nm. Em outras modalidades, o núcleo da nanopartícula revestida é esférico. Em alguns casos, o diâmetro do núcleo é de cerca de 10 a 100 nm, enquanto em outras modalidades, o diâmetro do núcleo é de cerca de 20 a 60 nm. Em algumas modalidades, as nanopartículas compreendem agregados multinucleados, por exemplo, mas não limitados a, dubletos.

[0016]Em certas modalidades, o invólucro da nanopartícula é modificado, de modo a incluir a conjugação de moléculas à superfície da nanopartícula. Em modalidades particulares, a modificação introduz grupos tiol na superfície da nanopartícula revestida. Em outras modalidades, um ligante, por exemplo e sem limitação, um anticorpo, é conjugado ao invólucro da nanopartícula revestida por intermédio dos grupos tiol.

[0017]O ligante pode se ligar a qualquer analito de interesse que pode estar ou não presente em uma amostra. Em certas modalidades, o ligante é um anticorpo que se liga às proteínas específicas ao vírus influenza A ou vírus influenza B.

[0018]Em outras modalidades, a invenção é uma nanopartícula revestida consistindo essencialmente de um núcleo e um invólucro que aumenta a refletância da nanopartícula, e um ligante ligado à superfície do invólucro. Ainda em outras modalidades, a invenção é um dispositivo de teste para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido, compreendendo: (a) um elemento que recebe a amostra; (b) um portador em comunicação de fluido com o elemento que recebe a amostra; (c) um reagente marcado que é móvel no portador na presença da amostra de líquido, o reagente marcado compreendendo um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida compreendendo um núcleo e um invólucro que aumenta a refletância da nanopartícula tendo o ligante ligado ao mesmo, em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman; e (d) um reagente de ligação eficaz para capturar o analito, quando presente, imobilizado em uma zona de detecção definida do portador; em que a amostra de líquido aplicada ao elemento que recebe a amostra mobiliza o reagente marcado, tal que a amostra e o reagente marcado são transportados ao longo da extensão do portador para passar na zona de detecção, e em que a detecção do reagente marcado na zona de detecção é indicativa da presença de analito na amostra de líquido.

[0019]Em certas modalidades, o reagente marcado usado no dispositivo de teste compreende um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida consistindo essencialmente de um núcleo e um invólucro que aumenta a refletância da nanopartícula tendo o ligante ligado ao mesmo, em que o dito ligante é ligado à superfície do invólucro.

[0020]Em certas modalidades, o portador é, por exemplo e sem limitações, nitrocelulose, plástico ou vidro. Em outras modalidades, o dispositivo de teste compreende ainda uma almofada absorvente e/ou uma zona de controle em comunicação de fluido com a zona de detecção.

[0021]O dispositivo de teste da invenção pode ser usado para detectar qualitativa ou quantitativamente a presença ou ausência de qualquer analito de interesse, tal como e sem limitação, uma proteína, ácido nucleico, metabólito, molécula pequena, vírus ou bactéria. Em certas modalidades, o dispositivo de teste pode ser usado para detectar múltiplos analitos em uma amostra de líquido com pelo menos dois reagentes marcados diferentes, em que os ligantes dos reagentes marcados se ligam a analitos diferentes, e pelo menos duas zonas de detecção para detectar cada um de pelo menos dois reagentes marcados diferentes.

[0022]Em certas modalidades, a invenção é um sistema compreendendo o dispositivo de teste da invenção e um refletômetro adaptado para detectar a presença do reagente marcado no dispositivo de teste.

[0023]Em certas modalidades, a invenção é um método para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido, compreendendo: a) fornecer um dispositivo de teste da invenção; b) contatar a amostra de líquido com o elemento que recebe a amostra do dispositivo de teste; c) permitir que a amostra de líquido aplicada ao elemento que recebe a amostra mobilize o dito reagente marcado, tal que a amostra de líquido e o reagente marcado se movem ao longo da extensão do portador para passar na zona de detecção; d) detectar a presença do reagente marcado na zona de detecção através da medição da refletância, em que a detecção do reagente marcado na zona de detecção é indicativa da presença de analito na amostra de líquido, e a falha para detectar a presença do reagente marcado na zona de detecção é indicativa da ausência do analito na amostra de líquido.

[0024]Em outras modalidades, a invenção é um método para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido, compreendendo: e) fornecer um dispositivo de teste compreendendo: (i) um elemento que recebe a amostra; (ii) um portador em comunicação de fluido com o elemento que recebe a amostra; e (iii) um reagente de ligação eficaz para capturar o analito, quando presente, imobilizado em uma zona de detecção definida do portador; f) misturar a amostra de líquido com um reagente marcado compreendendo um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida compreendendo um núcleo e um invólucro que aumenta a refletância da nanopartícula tendo o ligante ligado ao mesmo, em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman; g) contatar a mistura de b) com o elemento que recebe a amostra do dispositivo de teste; h) permitir que a mistura de b) aplicada ao elemento que recebe a amostra se mova ao longo da extensão do portador para passar na zona de detecção; i) detectar a presença do reagente marcado na zona de detecção através da medição da refletância, em que a detecção do reagente marcado na zona de detecção é indicativa da presença de analito na amostra de líquido, e a falha para detectar a presença do reagente marcado na zona de detecção é indicativa da ausência do analito na amostra de líquido.

[0025]Em algumas modalidades, o reagente marcado usado nos métodos da invenção compreende um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida consistindo essencialmente de um núcleo e um invólucro que aumenta a refletância da nanopartícula tendo o ligante ligado ao mesmo, em que o dito ligante é ligado à superfície do invólucro. Em outras modalidades, o reagente marcado usado nos métodos da invenção compreende um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida compreendendo um núcleo, uma molécula ligada ao núcleo e capaz de gerar um sinal por difusão Raman realçada na superfície, e um invólucro envolvendo o núcleo e a molécula tendo o ligante ligado à mesma.

[0026]Em algumas modalidades, um leitor de refletância é usado para detectar o reagente marcado na zona de detecção, embora em outras modalidades, a detecção do reagente marcado na zona de detecção seja visualmente determinada. Em algumas modalidades, o analito é quantitativamente detectado e, em outras modalidades, o analito é qualitativamente detectado. Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem ser usados para detectar múltiplos analitos em uma amostra de líquido com pelo menos dois reagentes marcados diferentes, em que os ligantes dos reagentes marcados se ligam a analitos diferentes, e pelo menos duas zonas de detecção para detectar cada um de pelo menos dois reagentes marcados diferentes.

[0027]Em outras modalidades, a invenção é um kit para realizar um teste analítico de fluxo passante para detectar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido através de refletometria, compreendendo: (a) um dispositivo de teste compreendendo uma membrana porosa compreendendo uma superfície superior e uma superfície inferior e um reagente de ligação eficaz para capturar o analito, quando presente na amostra de líquido, ligado à superfície superior ou inferior da membrana porosa; e (b) um reagente marcado compreendendo um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida compreendendo um núcleo e um invólucro que aumenta a refletância da nanopartícula, em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman.

[0028]Em certas modalidades, o reagente marcado usado nos kits da invenção compreende um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida consistindo essencialmente de um núcleo e um invólucro que aumenta a refletância da nanopartícula tendo o ligante ligado ao mesmo, em que o dito ligante é ligado à superfície do invólucro. Em outras modalidades, o reagente marcado usado nos kits da invenção compreende um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida compreendendo um núcleo, uma molécula ligada ao núcleo e capaz de gerar um sinal por difusão Raman realçada na superfície, e um invólucro envolvendo o núcleo e a molécula tendo o ligante ligado à mesma.

[0029]Em certas modalidades, o dispositivo de teste dos kits da invenção compreende ainda uma almofada absorvente, em que a superfície inferior da membrana porosa e a almofada absorvente estão em contato físico e em comunicação de fluido, e em que o reagente de ligação é ligado à superfície superior da membrana porosa. Em outras modalidades, o dispositivo de teste dos kits da invenção compreende ainda um alojamento para a membrana porosa.

[0030]Os kits da invenção podem ser usados para detectar qualitativa ou quantitativamente a presença ou ausência de qualquer analito de interesse, tal como e sem limitação, uma proteína, ácido nucleico, metabólito, molécula pequena, vírus ou bactéria. Em certas modalidades, os kits podem ser usados para detectar múltiplos analitos em uma amostra de líquido com pelo menos dois reagentes marcados diferentes, em que os ligantes dos reagentes marcados se ligam a analitos diferentes, e pelo menos duas zonas de detecção para detectar cada um de pelo menos dois reagentes marcados diferentes.

[0031]Em certas modalidades, a invenção é um sistema compreendendo o dispositivo de teste dos kits da invenção e um refletômetro adaptado para detectar a presença do reagente marcado no dispositivo de teste.

[0032]Ainda em outras modalidades, a invenção é um método para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido usando um kit da invenção, o dito método compreendendo: (a) contatar a amostra de líquido com a superfície superior da membrana porosa; (b) permitir que a amostra de líquido flua através da membrana porosa, tal que pelo menos uma porção do analito, quando presente na amostra de líquido, se liga ao reagente de ligação; (c) contatar o reagente marcado com a superfície superior da membrana porosa; (d) permitir que o reagente marcado flua através da membrana porosa, tal que pelo menos uma porção do reagente marcado se liga ao analito; e (e) detectar a presença do reagente marcado na membrana porosa através da medição da refletância, em que a detecção do reagente marcado na membrana porosa é indicativa da presença do analito na amostra de líquido, e a falha para detectar a presença do reagente marcado na membrana porosa é indicativa da ausência do analito na amostra de líquido.

[0033]Em outras modalidades, a invenção é um método para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido usando um kit da invenção, o dito método compreendendo: (a) misturar a amostra de líquido com o reagente marcado, tal que o analito, quando presente na amostra de líquido, se liga ao reagente marcado; (b) contatar a mistura de (a) com a superfície superior da membrana porosa; (c) permitir que a mistura de (a) flua através da membrana porosa, tal que pelo menos uma porção do analito ligado ao reagente marcado se liga ao reagente de ligação; e (d) detectar a presença do reagente marcado na membrana porosa através da medição da refletância, em que a detecção do reagente marcado na membrana porosa é indicativa da presença de analito na amostra de líquido, e a falha para detectar a presença do reagente marcado na membrana porosa é indicativa da ausência do analito na amostra de líquido.

[0034]Em algumas modalidades, um leitor de refletância é usado para detectar o reagente marcado na zona de detecção, enquanto em outras modalidades, a detecção do reagente marcado na zona de detecção é visualmente determinada. Em algumas modalidades, o analito é quantitativamente detectado e, em outras modalidades, o analito é qualitativamente detectado. Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem ser usados para detectar múltiplos analitos em uma amostra de líquido com pelo menos dois reagentes marcados diferentes, em que os ligantes dos reagentes marcados se ligam a analitos diferentes, e pelo menos duas zonas de detecção para detectar cada um de pelo menos dois reagentes marcados diferentes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0035]A Figura 1 mostra os resultados de um teste de fluxo lateral para o vírus influenza A comparando a sensibilidade de ouro coloidal e nanopartículas de ouro revestidas com sílica quando medida com um refletômetro. Conforme observado na Figura, uma resposta mais forte foi observada para as nanopartículas de ouro revestidas com sílica em comparação ao ouro coloidal.

[0036]A Figura 2 mostra os resultados de um teste de fluxo lateral para o vírus influenza A comparando a sensibilidade de um protótipo do dispositivo usando nanopartículas de ouro revestidas com sílica (Painel 2A) com a sensibilidade de um produto comercial, BD Directigen™ EZ A+B (Painel 2B), quando ambos os dispositivos são lidos com um refletômetro. O dispositivo usando as nanopartículas de ouro revestidas com sílica é aproximadamente 7 vezes mais sensível do que BD Directigen™ EZ A+B quando lido com um refletômetro.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES

[0037]A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste relatório possam ser usados na prática das reivindicações, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionados neste relatório são integralmente incorporados como referência. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não intencionados a limitar a invenção.

[0038]Neste pedido, o uso do singular inclui o plural, a menos que especificamente estabelecido de outro modo. Neste pedido, o uso de “ou” significa “e/ou”, a menos que estabelecido de outro modo. No contexto de múltiplas reivindicação dependentes, o uso de “ou” refere-se a mais do que uma reivindicação independente ou dependente precedente apenas na alternativa. Além disso, o uso do termo “incluindo”, assim como outras formas, tais como “inclui” e “incluído”, não é limitante. Além disso, termos, tais como “elemento” ou “componente”, abrangem elementos e componentes compreendendo uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais do que uma subunidade, a menos que especificamente estabelecido de outro modo.

[0039]Outras características e vantagens serão evidentes a partir da descrição detalhada e reivindicações seguintes.

[0040]Para que o presente pedido possa ser mais facilmente entendido, certos termos são primeiramente definidos. Definições adicionais são apresentadas por toda a descrição detalhada.

[0041]O termo “nanopartícula”, conforme usado neste relatório, refere-se a partículas compreendendo pelo menos um núcleo e um invólucro tendo uma dimensão na faixa de cerca de 1 a cerca de 1000 nanômetros (“nm”). As nanopartículas da invenção podem ser de qualquer forma. Em certas modalidades, as nanopartículas são esféricas. As nanopartículas da invenção tipicamente não incluem (mas podem incluir) uma molécula ativa no Raman. Em certas modalidades, as nanopartículas podem compreender múltiplos núcleos e um invólucro.

[0042]Conforme usado neste relatório, o termo “núcleo” refere-se à porção interna das nanopartículas da invenção. Em certas modalidades, o núcleo é um metal, por exemplo, mas não limitado a, ouro.

[0043]As nanopartículas da invenção também compreendem um invólucro que realça a refletância das nanopartículas. O invólucro pode encapsular completa ou incompletamente o núcleo. O invólucro pode ser composto de qualquer material ou combinação de materiais, contanto que ele possua a propriedade de realçar a refletância da nanopartícula. Por exemplo, em algumas modalidades, o invólucro pode compreender qualquer material transparente na faixa espectral exigida. Em certas modalidades, o invólucro compreende sílica, isto é, vidro. Em outras modalidades, o invólucro compreende um outro material cerâmico, por exemplo, mas não limitado a, cerâmicas transparentes com um alto índice refrativo, tais como perovskita e Zrθ2. Em outras modalidades, o invólucro é composto de um polímero. Em modalidades particulares, o polímero compreende polietilenoglicol, polimetilmetacrilato ou poliestireno. Em algumas modalidades, o material que forma o invólucro é tratado ou derivatizado para permitir a ligação de um ligante à superfície da nanopartícula. A escolha ideal do polímero pode depender do ligante que será imobilizado na superfície da nanopartícula.

[0044]Referindo-se ao invólucro, a frase “aumenta a refletância da nanopartícula” significa que a presença do invólucro resulta em uma nanopartícula que fornece sinal ou sensibilidade aumentado quando medido por refletância, por exemplo, em um imunoensaio de fluxo lateral, em comparação a uma nanopartícula sem o invólucro. Sem estar ligado pela teoria, a presença do invólucro que envolve o núcleo pode fazer com que a partícula diretamente reflita mais luz. Alternativamente, ou além disso, ligantes ligados à superfície do invólucro podem ser melhor orientados a participar em reações de ligação quando ligados ao material de invólucro, ao contrário de quando passivamente adsorvidos à superfície do núcleo.

[0045]Conforme usado neste relatório, “ligante” significa uma molécula de qualquer tipo que se ligará a um analito de interesse. Por exemplo e sem limitação, em certas modalidades, o ligante é um anticorpo, um antígeno, um receptor, um ácido nucleico ou uma enzima.

[0046]O termo “analito”, conforme usado neste relatório, refere-se a qualquer substância de interesse que uma pessoa habilitada pode detectar usando a invenção, incluindo, mas não limitada a fármacos, incluindo fármacos terapêuticos e fármacos de abuso; hormônios; vitaminas; proteínas, incluindo anticorpos de todas as classes; peptídeos; esteroides; bactérias; fungos; vírus; parasitas; componentes ou produtos de bactérias, fungos, vírus ou parasitas; alérgenos de todos os tipos; produtos ou componentes de células normais ou malignas; etc. Como exemplos particulares, podem ser mencionados gonadotropina coriônica humana (hCG); insulina; hormônio luteinizante; organismos que causam ou são associados com vários estados de doença, tais como Streptococcus pyogenes (grupo A), Herpes Simples I e II, citomegalovírus, Chlamydia, anticorpo da rubéola, influenza A e B; etc. Em certas modalidades da invenção, a presença ou ausência de um analito em uma amostra é qualitativamente determinada. Em outras modalidades, uma definição quantitativa da quantidade ou concentração de analito na amostra é determinada.

[0047]O termo “amostra”, conforme usado neste relatório, refere-se a qualquer amostra biológica que pode conter um analito para detecção. Em algumas modalidades, a amostra biológica está na forma líquida, enquanto em outras, ela pode ser modificada para uma forma líquida.

[0048]O termo “elemento que recebe a amostra”, conforme usado neste relatório, significa a porção do dispositivo de teste que está em contato direto com a amostra de líquido, isto é, ela recebe a amostra a ser testada quanto ao analito de interesse. O elemento que recebe a amostra pode ser parte de, ou separado do portador ou membrana porosa. A amostra de líquido depois pode migrar, através do fluxo lateral ou vertical, a partir do elemento que recebe a amostra em direção à zona de detecção. O elemento que recebe a amostra está em contato de fluxo de líquido com a zona de detecção do analito. Isto pode ser uma conexão sobreposta, topo ao fundo ou uma extremidade à extremidade. Em certas modalidades, o elemento que recebe a amostra é preparado de material poroso, por exemplo e não limitado ao papel.

[0049]Conforme usado neste relatório, o termo “portador”, tal como usado em um ensaio de fluxo lateral, refere-se a qualquer substrato capaz de fornecer fluxo de líquido. Isto incluiria, por exemplo, substratos, tais como nitrocelulose, combinações de nitrocelulose com poliéster ou celulose, papel não tratado, papel poroso, raiom, fibra de vidro, copolímero de acrilonitrila, plástico, vidro ou náilon. O substrato pode ser poroso. Tipicamente, os poros do substrato são de tamanho suficiente, tal que as nanopartículas da invenção fluem através da totalidade do portador. Uma pessoa habilitada na técnica será capaz de selecionar outros materiais que permitem o fluxo de líquido. O portador pode compreender um ou mais substratos em comunicação de fluido. Por exemplo, a zona do reagente e a zona de detecção podem estar presentes no mesmo substrato (isto é, almofada) ou podem estar presentes em substratos separados (isto é, almofadas) dentro do portador.

[0050]Conforme usado neste relatório, “membrana porosa”, tal como usada em um ensaio de fluxo passante, refere-se a uma membrana ou filtro de qualquer material que umedece facilmente com uma solução aquosa e tem poros suficientes para permitir que as nanopartículas revestidas da invenção fluam em fluxo passante. Materiais adequados incluem, por exemplo, nitrocelulose, combinações de nitrocelulose com poliéster ou celulose, papel não tratado, papel poroso, raiom, fibra de vidro, copolímero de acrilonitrila, plástico, vidro ou náilon.

[0051]Conforme usado neste relatório, “material absorvente” refere-se a um material poroso tendo uma capacidade de absorção suficiente para absorver substancialmente todos os líquidos dos reagentes do ensaio e quaisquer soluções de lavagem e, opcionalmente, para iniciar a ação capilar e sugar os líquidos do ensaio através do dispositivo de teste. Materiais adequados incluem, por exemplo, nitrocelulose, combinações de nitrocelulose com poliéster ou celulose, papel não tratado, papel poroso, raiom, fibra de vidro, copolímero de acrilonitrila, plástico, vidro ou náilon.

[0052]Conforme usado neste relatório, o termo “fluxo lateral” refere-se ao fluxo de líquido ao longo da superfície plana de um portador. No geral, os dispositivos de fluxo lateral podem compreender uma tira (ou várias tiras em comunicação de fluido) do material capaz de transportar uma solução por ação capilar, isto é, uma ação impregnante ou cromatográfica, em que áreas ou zonas diferentes na(s) tira(s) contêm reagentes do ensaio difusa ou não difusamente ligados que produzem um sinal detectável, conforme a solução é transportada a, ou passa através de tais zonas. Tipicamente, tais ensaios compreendem uma zona de aplicação adaptada para receber uma amostra de líquido, uma zona do reagente lateralmente espaçada a partir de, e em comunicação de fluido com a zona de aplicação, e uma zona de detecção lateralmente espaçada a partir de, e em comunicação de fluido com a zona do reagente. A zona do reagente pode compreender um composto que é móvel no líquido e capaz de interagir com um analito na amostra e/ou com uma molécula ligada na zona de detecção. A zona de detecção pode compreender uma molécula de ligação que é imobilizada na tira e é capaz de interagir com o analito e/ou o composto reagente para produzir um sinal detectável. Tais ensaios podem ser usados para detectar um analito em uma amostra através de ligação direta (ensaio em sanduíche) ou competitiva. Exemplos de dispositivos de fluxo lateral são fornecidos na Patente U.S. N- 6.194.220 concedida a Malick et al.', 5.998.221 concedida a Malick et al.', 5.798.273 concedida a Shuler etal.; e RE 38.430 concedida a Rosenstein.

[0053]Em um ensaio de fluxo lateral em sanduíche, uma amostra de líquido que pode ou não conter um analito de interesse é aplicada à zona de aplicação e deixada passar na zona do reagente por ação capilar. O analito, se presente, interage com um reagente marcado na zona do reagente e o complexo analito- reagente se move por ação capilar à zona de detecção. O complexo analito- reagente se torna capturado na zona de detecção através da interação com uma molécula de ligação específica para o analito e/ou reagente. A amostra não ligada pode se mover através da zona de detecção por ação capilar a uma almofada lateralmente absorvente justaposta e em comunicação de fluido com a zona de detecção. O reagente marcado depois pode ser detectado na zona de detecção por meios apropriados.

[0054]Em um ensaio de fluxo lateral competitivo, uma amostra de líquido que pode ou não conter um analito de interesse é aplicada à zona de aplicação e deixada passar na zona do reagente por ação capilar. A zona do reagente compreende um reagente marcado, que pode ser o analito por si só, um homólogo ou derivado do mesmo, ou uma porção que é capaz de imitar o analito de interesse quando se liga a um aglutinante imobilizado na zona de detecção. O reagente marcado é móvel na fase líquida e se move com a amostra de líquido para a zona de detecção por ação capilar. O analito contido na amostra de líquido compete com o reagente marcado na ligação ao aglutinante imobilizado na zona de detecção. A amostra não ligada pode se mover através da zona de detecção por ação capilar a uma almofada lateralmente absorvente justaposta e em comunicação de fluido com a zona de detecção. O reagente marcado depois pode ser detectado na zona de detecção por meios apropriados. A presença ou ausência do analito de interesse pode ser determinada através da inspeção da zona de detecção, em que, quanto maior a quantidade de analito presente na amostra de líquido, menor a quantidade de receptor marcado ligado na zona de detecção.

[0055]Conforme usado neste relatório, os termos “fluxo vertical” e “fluxo passante” referem-se ao fluxo de líquido transverso à superfície plana de um portador. No geral, os dispositivos de fluxo passante podem compreender uma membrana ou camadas de membranas empilhadas umas sobre as outras que permitem a passagem de líquido através do dispositivo. As camadas podem conter reagentes do ensaio difusa ou não difusamente ligados que produzem um sinal detectável, conforme a solução é transportada através do dispositivo. Tipicamente, o dispositivo compreende primeiro a camada tendo uma superfície superior e inferior, em que a dita superfície superior é adaptada para receber uma amostra de líquido, e uma camada absorvente verticalmente justaposta e em comunicação de fluido com a superfície inferior da primeira camada que é adaptada para sugar a amostra de líquido através da primeira camada. A primeira camada pode compreender um agente de ligação ligado à superfície superior da primeira camada que é capaz de interagir com um analito na amostra e capturar o analito na superfície superior da primeira camada. Exemplos de dispositivos de fluxo passante são fornecidos na Patente U.S. Ne 4.920.046 concedida a McFarland et al. e 7.052.831 concedida a Fletcher et al.

[0056]Na prática, uma amostra de líquido que pode ou não conter um analito de interesse é aplicada à superfície superior de uma primeira camada compreendendo um agente de ligação específico para um analito de interesse. A amostra de líquido depois flui através da primeira camada e na camada absorvente. Se o analito está presente na amostra, ele interage com o agente de ligação e é capturado na superfície superior da primeira camada. A primeira camada depois pode ser tratada com soluções de lavagem, de acordo com os procedimentos de imunoensaio convencionais. A primeira camada depois pode ser tratada com um reagente marcado que se liga ao analito capturado pelo agente de ligação. O reagente marcado depois flui através da primeira camada e na camada absorvente. A primeira camada pode ser tratada com soluções de lavagem, de acordo com procedimentos de imunoensaio convencionais. O reagente marcado depois pode ser detectado por meios apropriados. Alternativamente, a amostra de líquido pode ser misturada com o reagente marcado antes de ser aplicada à superfície superior da primeira camada. Outras variações adequadas são conhecidas àqueles habilitados na técnica.

[0057]Ensaios de fluxo passante e lateral podem ser usados para detectar múltiplos analitos em uma amostra. Por exemplo, em um ensaio de fluxo lateral, a zona do reagente pode compreender múltiplos reagentes marcados, cada um capaz de se ligar a (ou imitar) um analito diferente em uma amostra de líquido, ou um reagente marcado único capaz de se ligar a (ou imitar) múltiplos analitos. Alternativamente, ou além disso, a zona de detecção em um ensaio de fluxo lateral pode compreender múltiplas moléculas de ligação, cada uma capaz de se ligar a um analito diferente em uma amostra de líquido, ou uma molécula de ligação única capaz de se ligar a múltiplos analitos. Em um ensaio de fluxo passante, a membrana porosa pode compreender múltiplos agentes de ligação, cada um capaz de se ligar a um analito diferente em uma amostra de líquido, ou um agente de ligação único capaz de se ligar a múltiplos analitos. Alternativamente, ou além disso, uma mistura de reagentes marcados pode ser usada em um ensaio de fluxo passante, cada um configurado para se ligar a um analito diferente em uma amostra de líquido, ou um reagente marcado único configurado para se ligar a múltiplos analitos. Se os múltiplos reagentes marcados são usados em um ensaio de fluxo passante ou lateral, os reagentes podem ser diferencialmente marcados para distinguir tipos diferentes de analitos em uma amostra de líquido.

[0058]Conforme usado neste relatório, o termo “móvel” significa difusa ou não difusamente ligado, ou impregnado. Os reagentes que são móveis são capazes de dispersar com a amostra de líquido e são carregados pela amostra de líquido no fluxo lateral ou vertical.

[0059]Conforme usado neste relatório, o termo “reagente marcado” significa qualquer partícula, proteína ou molécula que reconhece ou se liga ao analito de interesse e tem ligado ao mesmo uma substância capaz de produzir um sinal que é detectável por meios visuais ou instrumentais, isto é, uma nanopartícula revestida, conforme definido neste relatório. A partícula ou molécula que reconhece o analito pode ser natural ou não natural. Em algumas modalidades, a molécula é um anticorpo monoclonal ou policlonal.

[0060]Conforme usado neste relatório, o termo “reagente de ligação” significa qualquer partícula ou molécula que reconhece ou se liga ao analito em questão. O reagente de ligação é capaz de formar um complexo de ligação com o complexo analito-reagente marcado. O reagente de ligação é imobilizado ao portador na zona de detecção ou à superfície da membrana porosa. O reagente de ligação não é afetado pelo fluxo lateral ou vertical da amostra de líquido, devido à imobilização ao portador ou membrana porosa. A partícula ou molécula pode ser natural ou não natural, isto é, sintética. Uma vez que o reagente de ligação se liga ao complexo analito-reagente marcado, ele previne que o complexo analito-reagente marcado continue com o fluxo da amostra de líquido.

[0061]Conforme usado neste relatório, “zona de detecção” significa a porção do portador ou membrana porosa contendo o reagente de ligação imobilizado.

[0062]O termo “zona de controle” refere-se a uma porção do dispositivo de teste compreendendo uma molécula de ligação configurada para capturar o reagente marcado. Em um ensaio de fluxo lateral, a zona de controle pode estar em contato de fluxo de líquido com a zona de detecção do portador, tal que o reagente marcado é capturado na zona de controle, conforme a amostra de líquido é transportada para fora da zona de detecção por ação capilar. Em um ensaio de fluxo passante, a zona de controle pode ser uma porção separada da membrana porosa, tal que o reagente marcado é aplicado à porção de aplicação da amostra da membrana porosa e à zona de controle. A detecção do reagente marcado na zona de controle confirma que o ensaio está em funcionamento quanto ao seu propósito intencionado.

[0063]O termo “alojamento” refere-se a qualquer invólucro adequado para os dispositivos de teste da invenção. Alojamentos exemplares serão conhecidos àqueles habilitado na técnica. O alojamento pode ter, por exemplo, uma porção base e uma porção de cobertura. A cobertura pode incluir uma parede superior e uma parede lateral substancialmente vertical. Uma borda pode se projetar para cima a partir da parede superior. A borda pode definir um recesso tendo no mesmo um inserto com pelo menos duas aberturas em alinhamento com pelo menos duas outras aberturas na cobertura para formar pelo menos dois poços no alojamento. O alojamento pode ser construído para garantir que não exista comunicação entre dois ou mais poços. Um exemplo de tal alojamento é fornecido na Patente U.S. N2 7.052.831 concedida a Fletcher et al. Outros alojamentos adequados incluem aqueles usados no dispositivo de ensaio de fluxo lateral BD Directigen™ EZ RSV.

[0064]Conforme usado neste relatório, “leitor de refletância” ou “refletômetro” refere-se a um instrumento capaz de detectar a mudança na refletância causada pela presença da nanopartícula revestida na zona de detecção do dispositivo de teste. Leitores de refletância ou refletômetros são conhecidos na técnica. Instrumentos representativos adequados para o uso na invenção incluem, mas não são limitados ao Immunochromato Reader C10066 da Hamamatsu ou ESE-Quant da ESE GmbH. A zona de detecção é mais comumente escaneada pela área de detecção do dispositivo ou diretamente representada visualmente no detector do refletômetro, levando a um traço de refletividade versus coordenada espacial. Um algoritmo adequado depois é usado para determinar, por exemplo, a mudança máxima de refletividade na zona de detecção.

[0065]Nanopartículas revestidas para o uso em métodos com base em SERS são conhecidas na técnica. Por exemplo, a Patente U.S. Ne 6.514.767 descreve nanopartículas compósitas ativas em SERS (SACNs) compreendendo uma nanopartícula metálica que foi ligada, ou associada com sua superfície uma ou mais moléculas ativas no Raman, e é encapsulada por um invólucro compreendendo um polímero, vidro ou qualquer outro material dielétrico. Tais partículas podem ser produzidas por cultivo ou, de outro modo, colocando um invólucro de um encapsulante adequado sobre um núcleo de nanopartícula metálica ativa no Raman. Nanopartículas metálicas do tamanho desejado podem ser cultivadas como metais coloidais através de várias técnicas bem conhecidas no ramo, tais como redução química ou fotoquímica de íons metálicos em solução usando agentes redutores. Por exemplo, partículas de ouro coloidal, que são suspensões de partículas classificadas em submicrômetro de ouro em fluido, podem ser produzidas em um líquido através da redução de ácido cloroáurico. Depois de dissolver o ácido, a solução é rapidamente agitada, enquanto um agente redutor é adicionado. Isto faz com que os íons ouro sejam reduzidos a átomos de ouro neutros, que se precipitam a partir da solução supersaturada e formam partículas. Para prevenir a agregação das partículas, um agente estabilizante que se adere à superfície da nanopartícula pode ser adicionado. Nanopartículas também podem ser preparadas por descarga elétrica em solução. As partículas podem ser funcionalizadas com vários ligantes orgânicos para criar híbridos orgânicos-inorgânicos com funcionalidade avançada.

[0066]Encapsulantes adequados incluem vidro, polímeros, metais, óxidos de metal e metal sulfetos. Se o encapsulante é vidro, os núcleos da nanopartícula metálica são preferivelmente tratados primeiro com um primer para vidro. O vidro depois é cultivado sobre a nanopartícula metálica por técnicas padrão. A espessura do encapsulante pode ser facilmente variada dependendo das propriedades físicas exigidas da partícula. Os invólucros podem ser derivatizados por técnicas padrão, permitindo que as partículas sejam conjugadas a moléculas (incluindo biomoléculas, tais como proteínas e ácidos nucleicos) ou a suportes sólidos.

[0067]Nanopartículas Oxonica Nanoplex™ comercialmente disponíveis consistem de um núcleo de nanopartícula de ouro, no qual são adsorvidas moléculas repórteres Raman capazes de gerar um sinal SERS. A nanopartícula de ouro marcada por Raman depois é revestida com um invólucro de sílica de aproximadamente 10 a 50 nm de espessura. O invólucro de sílica protege as moléculas repórteres da dessorção a partir da superfície do núcleo, previne interações plasmon-plasmon entre partículas de ouro adjacentes e também previne a geração de sinais SERS a partir de componentes na solução.

[0068]Para um ensaio de fluxo lateral lido com um leitor de refletância, uma pessoa habilitada pode esperar que as nanopartículas Oxonica Nanoplex™ forneçam uma sensibilidade de ensaio comparável àquela do ouro coloidal do mesmo diâmetro como o núcleo da nanopartícula Oxonica Nanoplex™ e usada na mesma densidade óptica. Ao contrário, os inventores observaram vantagens inesperadas e significantes na sensibilidade de ensaio quando ouro coloidal é substituído por nanopartículas Oxonica Nanoplex™ em ensaios de fluxo lateral lidos com um leitor de refletância ao invés de um detector de sinal Raman. Significantemente, os aperfeiçoamentos da sensibilidade obtidos com as nanopartículas Oxonica Nanoplex™, no geral, não foram obteníveis meramente através do ajuste do diâmetro do ouro coloidal não revestido. Além disso, significantemente, quando as nanopartículas Oxonica Nanoplex™ são usadas como um reagente marcado, a sensibilidade do ensaio pode ser equivalente, se o sinal for lido com um refletômetro ou um leitor SERS.

[0069]Acredita-se que as moléculas ativas no Raman nas nanopartículas Oxonica Nanoplex™ não contribuem para o desempenho do ensaio quando um refletômetro é usado para a leitura do sinal ao invés de um leitor Raman. Esta expectativa é confirmada por experimentos em que as nanopartículas revestidas por sílica (sem moléculas ativas no Raman) foram descobertas atuar de forma idêntica e foram usadas em um ensaio de fluxo lateral com base em refletômetro para fornecer vantagens de sensibilidade significantes sobre ouro coloidal bruto.

EXEMPLOS Exemplo 1:

[0070]Este experimento comparou o desempenho de nanopartículas de ouro revestidas com sílica àquele do ouro coloidal em um imunoensaio de fluxo lateral para o vírus influenza A. Neste experimento, aspirados nasofaríngeos negativos para o vírus influenza A foram reforçados com quantidades conhecidas de um vírus influenza A H1N1 vivo.

[0071]O ouro coloidal, obtido da British Biocell International (“BBInternational”; “BBI”), foi de 40 nm em diâmetro. As nanopartículas de ouro revestidas com sílica usadas no experimento foram nanopartículas Oxonica Nanoplex™. Estas nanopartículas consistem de um núcleo de ouro de 60 nm revestido com repórter Raman 4,4’-Dipiridila e um invólucro de sílica externo. A espessura do invólucro de sílica foi de aproximadamente 30 nm. Anticorpos de detecção de influenza A foram ligados ao ouro coloidal por adsorção passiva. Para as nanopartículas Nanoplex™, os anticorpos de detecção de influenza A foram covalentemente ligados a grupos tiol na superfície de sílica através da química de maleimida. Para ambos os ensaios, anticorpos de captura de influenza A foram marcados em membranas de nitrocelulose Whatman AE99. As membranas de nitrocelulose depois foram avaliadas em um formato líquido (“dipstick’) em que as partículas e os anticorpos de detecção foram misturados com as amostras nasofaríngeas contendo níveis variados de vírus. A mesma densidade óptica foi usada para o ouro coloidal e as nanopartículas revestidas. As misturas partícula/amostra depois foram colocadas nos poços de uma placa de 96 poços, e uma extremidade de uma membrana de nitrocelulose com anticorpos de captura foi colocada em cada poço. A amostra foi deixada impregnar a membrana de nitrocelulose, e os poços depois foram enchidos com um tampão de lavagem que depois impregnou as tiras da membrana de nitrocelulose.

[0072]O sinal resultante a partir da linha de captura foi lido com um refletômetro customizado para a Becton, Dickinson and Company (“BD”) pela UMM Electronics (Indianápolis, JN). A Figura 1 mostra um diagrama de sinal de refletômetro como uma função da concentração do vírus para testes de fluxo lateral com ouro coloidal e com nanopartículas revestidas. Uma resposta significantemente mais forte foi observada para as nanopartículas Oxonica versus o ouro coloidal.

Exemplo 2:

[0073]Neste exemplo, a sensibilidade das nanopartículas de ouro revestidas com sílica foi comparada com aquela de um produto comercial: o teste BD Directigen™ EZ Flu A+B. Como no exemplo 1, as nanopartículas de ouro revestidas foram avaliadas em um formato dipstick usando nitrocelulose Whatman AE99. O Directigen™ EZ Flu A+B foi testado em sua modalidade comercial (formato de “cartucho”). Os anticorpos de captura e detecção foram os mesmos para o produto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B e para o dispositivo com base em nanopartículas Oxonica Nanoplex™. As amostras foram preparadas, conforme descrito no Exemplo 1, exceto que o vírus influenza B B/Lee/40 vivo foi reforçado em aspirados nasofaríngeos negativos ao invés do vírus influenza A. Como antes, as nanopartículas de ouro revestidas com sílica usadas no experimento foram nanopartículas Oxonica Nanoplex™. Estas nanopartículas consistem de um núcleo de ouro revestido de 60 nm com o repórter Raman 4,4’-Dipiridila e um invólucro de sílica externo. A espessura do invólucro de sílica foi de aproximadamente 30 nm. O produto comercial BD utiliza ouro coloidal de 40 nm que não inclui um invólucro de sílica. O produto comercial BD foi usado, de acordo com o inserto da embalagem, apenas com o sinal da linha de teste lido com um refletômetro, assim como visualmente.

[0074]Os dados são mostrados na Tabela 1, que compara o limite de detecção (Reliable Detection Limit) para as duas partículas. O Reliable Detection Limit (RDL) é definido como a concentração onde o limite de confidência de 95 % inferior é igual ao limite de confidência de 95 % superior do blank.

[0075]Os RDLs, expressados em unidades arbitrárias (X) para o produto de ouro coloidal BD e para as nanopartículas revestidas com sílica, são relatados para três experimentos separados. O mesmo refletômetro customizado da UMM Electronics foi usado para a leitura do sinal a partir dos dispositivos dipstick de nanopartículas revestidas por sílica e a partir dos dispositivos Directigen™ EZ Flu A+B. O Fator de Aperfeiçoamento da Sensibilidade é definido como o RDL do produto com base em ouro não revestido dividido pelo RDL do produto de nanopartícula revestida por sílica.

[0076]Conforme observado a partir da tabela, as nanopartículas Oxonica Nanoplex™ forneceram sensibilidade aperfeiçoada em até 16 vezes em comparação às partículas de ouro bruto.

[0077]Em experimentos separados similares àqueles descritos acima, o diâmetro das partículas de ouro coloidal foi aumentado de 40 nm para 60 nm e tamanhos maiores. Nestes experimentos, apenas aperfeiçoamentos da sensibilidade limitados (até 2 vezes) foram observados, indicando que a diferença no tamanho entre o núcleo de ouro das nanopartículas Oxonica Nanoplex™ e o ouro coloidal não é a provável fonte dos aperfeiçoamentos da sensibilidade.

Exemplo 3:

[0078]Este experimento comparou a sensibilidade e especificidade do ouro coloidal versus nanopartículas Oxonica Nanoplex™ em um teste de imunoensaio de fluxo lateral de influenza B (B/Lee/40). Sessenta amostras clínicas foram preparadas. As amostras foram amostras nasofaríngeas negativas para influenza B. Vinte das amostras serviram como controles negativos. As 40 amostras remanescentes foram reforçadas com vírus influenza B vivo em dois níveis para criar um conjunto de 40 amostras positivas. Vinte destas quarenta amostras foram reforçadas com vírus influenza B vivo em uma concentração de 0,5 x (unidades arbitrárias). As vinte amostras remanescentes receberam 10 vezes menos o vírus influenza B, para uma concentração de 0,05 x. Todas as sessenta amostras (40 positivas e 20 controles negativos) depois foram testadas usando o produto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B em formato de cartucho e o dispositivo dipstick fabricado usando nanopartículas Oxonica Nanoplex™. O dispositivo dipstick foi preparado usando nitrocelulose Whatman AE99. As nanopartículas Oxonica Nanoplex™ consistiram de um núcleo de ouro revestido de 60 nm com o repórter Raman 4,4’-Dipiridila e um invólucro de sílica externo que foi de aproximadamente 30 nm de espessura. Os anticorpos de captura e detecção foram os mesmos para o produto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B e para o dispositivo com base em nanopartículas Oxonica Nanoplex™.

[0079]Os resultados são resumidos na Tabela 2. Na Tabela, a sensibilidade foi calculada como a porcentagem das 40 amostras positivas corretamente identificadas como positivas por cada teste. A especificidade foi calculada como a porcentagem das 20 amostras negativas corretamente identificadas como negativas por cada teste. Quando as leituras de instrumento são usadas, um teste é chamado positivo se a leitura de instrumento medida for maior do que um valor limiar estabelecido para cada tipo de dispositivo. O limiar foi estabelecido para garantir pelo menos uma especificidade de 95 % para cada dispositivo. Neste exemplo, o produto Directigen™ foi lido visualmente e com o refletômetro customizado da UMM Electronics. As nanopartículas Oxonica Nanoplex™ foram lidas com o mesmo refletômetro, e também com um leitor Raman de pesquisa BD (última linha da tabela). O leitor Raman de pesquisa utilizou um laser de 785 nm para excitação e um Acton Research Spectrometer (SpectraPro 25000Í) e um detector CCD (Pixis 400) para detectar o sinal Raman.

[0080]Conforme pode ser observado, uma vantagem de sensibilidade clara é observada com as nanopartículas Oxonica Nanoplex™ em comparação às partículas Directigen™ EZ, sem perda de especificidade.

Exemplo 4:

[0081]Este experimento comparou o desempenho das nanopartículas de ouro revestidas com sílica, com e sem uma molécula de difusão Raman realçada na superfície (SERS), em um imunoensaio de fluxo lateral com base na refletância.

[0082]As nanopartículas de ouro Oxonica Nanoplex™ contendo uma marcação SERS foram obtidas da Oxonica. As nanopartículas consistem de um núcleo de ouro de 60 nm fusionado com 4-4’-Dipiridila e revestido com um invólucro de sílica com 35 nm de espessura. O diâmetro das nanopartículas foi de 130 nm. A química Sulfo-SMCC (Pierce #22622) foi usada para ligar covalentemente anticorpos anti-influenza A aos grupos tiol de superfície nas nanopartículas.

[0083]Nanopartículas de ouro com diâmetro de sessenta nanômetros desprovidas de uma marcação SERS foram adquiridas da BBI. As nanopartículas de ouro depois foram revestidas com sílica pelo processo seguinte. 10 mL de ouro coloidal de 60 nm (BBI, ~2,6 x 1010 partículas/mL) foram primeiro tratados com 75 pL de uma solução 100 pM de 3-mercaptopropil-trietoxissilano em etanol. Depois de 3 horas, 75 pL de uma solução aquosa 2,7 % de silicato de sódio foram adicionados, e a reação contínua durante 24 horas. Na etapa seguinte, 40 mL de etanol foram adicionados à suspensão, seguido por 1 mL de amónia e 300 pL (solução 5 % em etanol) de ortossilicato de tetraetila. A reação foi mantida sob agitação durante 2 dias e finalmente purificada por centrifugação repetida. A espessura do revestimento de sílica produzido neste processo foi de 30 nm, para um diâmetro de partícula total do ouro revestido por sílica de 120 nm. Grupos tiol depois foram adicionados à superfície das partículas de ouro revestidas por sílica através da reação de uma suspensão aquosa de nanopartículas de ouro revestidas por vidro (10 mL, ~2,6 x 1O10 partículas/mL) com uma solução etanólica 1 % de mercaptopropil- trimetoxisilano (MPTMS) durante 24 horas na temperatura ambiente. A quantidade de solução MPTMS variou de 25 pL para 100 pL, para criar níveis variados de grupos tiol ativos na superfície em níveis de carregamento aproximado de 0,5, 1,0, 1,5, e 2,0 entre si (por exemplo, 2,0 é 4 x maior do que 0,5) através de um processo não otimizado. Depois da reação, as partículas foram purificadas por centrifugação repetida em água. A química sulfo-SMCC (Pierce #22622) foi usada para ligar covalentemente anticorpos anti-influenza A aos grupos tiol de superfície nas nanopartículas.

[0084]O imunoensaio de fluxo lateral foi realizado em um formato dipstick, como segue. Os anticorpos de captura de influenza A foram aplicados às tiras de nitrocelulose Whatman AE99. As tiras de nitrocelulose foram imersas em soluções de amostra contendo nanopartículas ajustadas em uma densidade óptica de 10 e várias concentrações do vírus influenza A H1N1. As soluções de amostra foram deixadas impregnar completamente as tiras de nitrocelulose. Um tampão de lavagem depois foi adicionado e também impregnou as tiras da membrana de nitrocelulose. As tiras depois foram secas, e a refletância foi lida usando um refletômetro Hamamatsu, modelo C10066. Os resultados são resumidos na Tabela 3.

[0085]Os dados na tabela 3 indicam que, se otimizadas, as nanopartículas de ouro revestidas com sílica sem um repórter SERS se desenvolvem, assim como nanopartículas que incluem um repórter SERS em um imunoensaio de fluxo lateral quando uma leitura por refletômetro é usada. Além disso, o desempenho das partículas de ouro revestidas por sílica pode depender da extensão da tiolação.

Exemplo 5:

[0086]Este experimento foi desenvolvido para testar o desempenho de um protótipo de dispositivo de fluxo lateral para detectar o vírus influenza A H1N1 vivo em amostras clínicas usando nanopartículas de ouro revestidas com sílica Oxonica Nanoplex™ como o repórter. As partículas Oxonica apresentaram um diâmetro do núcleo de ouro de aproximadamente 60 nm, um repórter Raman de 4,4’-Dipiridila e um invólucro de sílica externo com aproximadamente 35 nm de espessura. O protótipo do dispositivo com base em cartucho utilizou os mesmos anticorpos de captura e detecção como o produto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B e foi usado da mesma maneira como o produto comercial.

[0087]O protótipo do dispositivo de teste compreendeu uma tira de suporte sustentando uma extensão da membrana de fluxo lateral de nitrocelulose Millipore HFI 35. Os anticorpos de captura específicos para a nucleoproteína de influenza A (Flu A NP) foram marcados ao longo desta membrana para formar uma linha de teste. O anticorpo imunoglobulina anti-espécie foi marcado adjacente à linha de teste para formar uma linha de controle. As nanopartículas Oxonica Nanoplex™ SERS foram pulverizadas em uma almofada conjugada (Arista MAPDS-0399) que foi tratada com uma solução SEABLOCK 10 % (Pierce 37527). As nanopartículas foram conjugadas com um anticorpo de detecção para Flu A NP. A almofada conjugada foi aderida à tira de suporte em uma extremidade da membrana de fluxo lateral. Na extremidade oposta da membrana de fluxo lateral, uma almofada capilar absorvente (Whatman #470) foi ligada. A tira do ensaio de fluxo lateral resultante foi montada dentro de um cartucho de poliestireno de duas partes. Este cartucho envolveu completamente a tira do ensaio, exceto para uma janela central que revela o teste e região da linha de controle da membrana LF, e um poço de aplicação da amostra centralizado na almofada conjugada. Este alojamento de cartucho é usado no dispositivo de ensaio de fluxo lateral BD Directigen™ EZ RSV.

[0088]Similarmente ao Exemplo 1, amostras de aspirado nasofaríngeo pediátrico negativas para o vírus influenza A foram reforçadas com quantidades conhecidas do vírus influenza A vivo. Concentrações de vírus finais dentro das amostras reforçadas variaram de 0,25 x (unidades arbitrárias) a 0,0039 x em diluição em série de duas vezes. Uma amostra reforçada com o meio de diluição livre de vírus (“OX”) foi incluída como um controle. Depois da adição do vírus vivo, a série de amostras foi processada usando o protocolo de preparação da amostra BD Directigen™ EZ Flu A+B. Brevemente, uma quantidade de amostra reforçada com influenza A foi misturada com o reagente de extração em um tubo de amostra flexível. A amostra extraída depois foi expressada a partir do tubo através de uma ponteira de filtração de fibra de vidro e coletada. Cada amostra foi testada em triplicata através da aplicação de 100 pL ao poço de amostra de cada um dos três protótipos do dispositivo de teste.

[0089]Cada dispositivo preparado com as nanopartículas Oxonica Nanoplex™ SERS foi lido usando um refletômetro Hamamatsu (modelo C10066) em 15 minutos e 30 minutos após a aplicação da amostra. Depois de 30 minutos, cada tira de fluxo lateral foi removida de seu cartucho, separada do conjugado e das almofadas impregnantes e seca na temperatura e umidade ambiente durante pelo menos 1 hora. Cada tira foi lida novamente pelo refletômetro depois da secagem. Uma curva dose-resposta foi plotada usando os dados a partir de cada tempo de leitura e depois usada para calcular a sensibilidade de cada tempo de leitura em termos de concentração mínima detectável (a concentração mais baixa para que o sinal médio seja igual ao intervalo de confiança mais alto do blank- MDC) e limite de detecção confiável (RDL). Estes resultados são mostrados na tabela 4. A Tabela 4 também mostra o aperfeiçoamento de sensibilidade obtido usando as partículas Oxonica em comparação à sensibilidade do Directigen™ EZ. Directigen™ EZ utiliza ouro coloidal com diâmetro de 40 nm sem um revestimento de sílica. Tabela 4. Sensibilidade de um Sistema de Teste de Fluxo Lateral de Influenza A com base em Cartucho Utilizando Nanopatículas Ativas SERS Oxonica e Detecção por Refletometria

1 Expressado como concentração mínima detectável (MDC) e limite de detecção confiável (RDL)

[0090]0 limite de detecção (RDL) para o dispositivo Directigen™ EZ Flu A corrente é de aproximadamente 0,5 x a concentração do vírus Influenza A através da leitura visual, e de aproximadamente 0,2 x através da leitura por refletômetro. Conforme mostrado na tabela 4, o dispositivo de teste com base em cartucho usando nanopartículas repórteres Oxonica Nanoplex™ fornece um aumento acentuado na sensibilidade em relação ao dispositivo Directigen™ EZ Flu A corrente.

Exemplo 6:

[0091]Neste exemplo, a sensibilidade analítica de um protótipo de teste de fluxo lateral de Influenza A usando nanopartículas de ouro revestidas com sílica Oxonica Nanoplex™ foi comparada à sensibilidade analítica do produto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B lido com um refletômetro. As partículas Oxonica apresentaram um diâmetro do núcleo de ouro de aproximadamente 60 nm, molécula repórter Raman 4,4’-Dipiridila ligada à superfície do ouro e uma espessura do invólucro de sílica de aproximadamente 35 nm. Neste exemplo, a quantidade de nanopartículas SERS por dispositivo de fluxo lateral foi estimada ser levemente menor do que a quantidade de partículas de ouro coloidal no produto comercial. Os anticorpos de captura e detecção foram os mesmos para o produto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B e para o dispositivo com base em nanopartículas Oxonica Nanoplex™.

[0092]Conforme no exemplo 5, amostras de aspirado nasofaríngeo pediátrico negativas para o vírus influenza A foram reforçadas com quantidades conhecidas de vírus influenza A vivo. Os protótipos dos dispositivos otimizados foram construídos, conforme descrito no exemplo 5, e a extração da amostra foi realizada, de acordo com o inserto da embalagem BD Directigen™ EZ Flu A. Todos os dispositivos (protótipos com base em SERS e BD Directigen™ EZ Flu A+B) foram lidos 15 minutos depois da aplicação da amostra em um refletômetro Hamamatsu (modelo C10066). A Figura 2 mostra o sinal de refletância como uma função da concentração do vírus vivo para ambos os formatos de ensaio, e a Tabela 5 mostra o sinal do refletômetro obtido na concentração do vírus de teste mais alta (0,25 x) junto com o limite de detecção confiável (RDL) para os ensaios. Neste experimento, os dispositivos que utilizam as nanopartículas SERS forneceram sensibilidade aperfeiçoada em aproximadamente 7 vezes e brilho aperfeiçoado em 8 vezes em comparação ao BD Directigen™ EZ Flu A+B lido com um refletômetro.

Equivalentes

[0093]Aqueles habilitados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentos de rotina, diversos equivalentes às modalidades específicas descritas neste relatório. Tais equivalentes são abrangidos pelas reivindicações seguintes. Petição 870190013725, de 11/02/2019, pág. 48/61

Claims (12)

1. Método para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) fornecer um dispositivo de teste para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido, compreendendo: (i) um elemento que recebe a amostra; (ii) um portador em comunicação de fluido com o elemento que recebe a amostra; (iii) um reagente marcado que é móvel no portador na presença da amostra de líquido, o reagente marcado compreendendo um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida consistindo em um núcleo de ouro e um invólucro tendo o ligante ligado ao mesmo, em que o invólucro compreende vidro, um material cerâmico tal como perovskita e ZrO2, ou um polímero tal como polietilenoglicol, polime- tilmetacrilato e poliestireno, e aumenta a refletância da nanopartícula, e em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman; e (iv) um reagente de ligação eficaz para capturar o analito, quando presente, imobilizado em uma zona de detecção definida do portador; b) contatar a amostra de líquido com o elemento que recebe a amostra do dispositivo de teste; c) permitir que a amostra de líquido aplicada ao elemento que recebe a amostra mobilize o dito reagente marcado, tal que a amostra de líquido e o reagente marcado se movem ao longo da extensão do portador para passar na zona de detecção; d) detectar a presença do reagente marcado na zona de detecção através da medição da refletância, em que a detecção do reagente marcado na zona de detecção é indicativa da presença de analito na amostra de líquido, e a falha para detectar a presença do reagente marcado na zona de detecção é indicativa da ausência do analito na amostra de líquido.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: (i) o portador compreende nitrocelulose, plástico ou vidro, de preferência o portador compreende nitrocelulose; ou (ii) o analito é uma proteína, ácido nucleico, metabólito, molécula pequena, vírus ou bactéria; ou (iii) o dispositivo de teste compreende ainda uma almofada absorvente em comunicação de fluido com a zona de detecção; ou (iv) o dispositivo de teste compreende ainda uma zona de controle em comunicação de fluido com a zona de detecção; ou (v) a presença do analito na amostra de líquido é determinada quantitativamente; ou (vi) o dispositivo de teste é configurado para detectar múltiplos analitos, de preferência o dispositivo de teste compreende ainda pelo menos dois reagentes marcados diferentes, em que os ligantes dos reagentes marcados se ligam a analitos diferentes, e pelo menos duas zonas de detecção para detectar cada um dos pelo menos dois reagentes marcados diferentes.

3. Método para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) fornecer um dispositivo de teste compreendendo: (i) um elemento que recebe a amostra; (ii) um portador em comunicação de fluido com o elemento que recebe a amostra; e (iii) um reagente de ligação eficaz para capturar o analito, quando presente, imobilizado em uma zona de detecção definida do portador; b) misturar a amostra de líquido com um reagente marcado compreendendo um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida consistindo em um núcleo de ouro e um invólucro tendo o ligante ligado ao mesmo, em que o invólucro compreende vidro, um material cerâmico tal como perovskita e ZrO2, ou um polímero tal como polietilenoglicol, polimetilmetacrilato e poliestireno, e aumenta a refletância da nanopartícula, em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman; c) contatar a mistura de b) com o elemento que recebe a amostra do dispositivo de teste; d) permitir que a mistura de b) aplicada ao elemento que recebe a amostra se mova ao longo da extensão do portador para passar na zona de detecção; e) detectar a presença do reagente marcado na zona de detecção através da medição da refletância, em que a detecção do reagente marcado na zona de detecção é indicativa da presença de analito na amostra de líquido, e a falha para detectar a presença do reagente marcado na zona de detecção é indicativa da ausência do analito na amostra de líquido.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que: (i) um leitor de refletância é utilizado para detectar o reagente marcado na zona de detecção; ou (ii) a presença de analito na amostra de líquido é determinada quantitativamente; ou (iii) o método detecta múltiplos analitos na amostra de líquido, de preferência o dispositivo de teste compreende ainda pelo menos dois reagentes marcados diferentes, em que os ligantes dos reagentes marcados se ligam a diferentes analitos, e pelo menos duas zonas de detecção para detectar cada um dos pelo menos dois reagentes marcados diferentes.

5. Método para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido usando um kit para realizar um teste analítico de fluxo passante para detectar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido através de refletometria, o dito kit compreendendo: (i) um dispositivo de teste compreendendo uma membrana porosa compreendendo uma superfície superior e uma superfície inferior e um reagente de ligação eficaz para capturar o analito, quando presente na amostra de líquido, ligado à superfície superior ou inferior da membrana porosa; e (ii) um reagente marcado compreendendo um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida consistindo em um núcleo de ouro e um invólucro tendo o ligante ligado ao mesmo, em que o invólucro compreende vidro, um material cerâmico tal como perovskita e ZrO2, ou um polímero tal como polietilenoglicol, polime- tilmetacrilato e poliestireno, e aumenta a refletância da nanopartícula, em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) contatar a amostra de líquido com a superfície superior da membrana porosa; (b) permitir que a amostra de líquido flua através da membrana porosa tal que pelo menos uma porção do analito, quando presente na amostra de líquido, se liga ao reagente de ligação; (c) contatar o reagente marcado com a superfície superior da membrana porosa; (d) permitir que o reagente marcado flua através da membrana porosa tal que pelo menos uma porção do reagente marcado se liga ao analito; e (e) detectar a presença do reagente marcado na membrana porosa através da medição da refletância, em que a detecção do reagente marcado na membrana porosa é indicativa da presença de analito na amostra de líquido, e a falha para detectar a presença do reagente marcado na membrana porosa é indicativa da ausência do analito na amostra de líquido.

6. Método para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido usando um kit para realizar um teste analítico de fluxo passante para detectar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido através de refletometria, o dito kit compreendendo: (i) um dispositivo de teste compreendendo uma membrana porosa compreendendo uma superfície superior e uma superfície inferior e um reagente de ligação eficaz para capturar o analito, quando presente na amostra de líquido, ligado à superfície superior ou inferior da membrana porosa; e (ii) um reagente marcado compreendendo um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida consistindo em um núcleo de ouro e um invólucro tendo o ligante ligado ao mesmo, em que o invólucro compreende vidro, um material cerâmico tal como perovskita e ZrCte, ou um polímero tal como polietilenoglicol, polime- tilmetacrilato e poliestireno, e aumenta a refletância da nanopartícula, em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) misturar a amostra de líquido com o reagente marcado, tal que o analito, quando presente na amostra de líquido, se liga ao reagente marcado; (b) contatar a mistura de (a) com a superfície superior da membrana porosa; (c) permitir que a mistura de (a) flua através da membrana porosa, tal que pelo menos uma porção do analito ligado ao reagente marcado se liga ao reagente de ligação; e (d) detectar a presença do reagente marcado na membrana porosa através da medição da refletância, em que a detecção do reagente marcado na membrana porosa é indicativa da presença de analito na amostra de líquido, e a falha para detectar a presença do reagente marcado na membrana porosa é indicativa da ausência do analito na amostra de líquido.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de que: (i) um leitor de refletância é utilizado para detectar o reagente marcado na membrana porosa; ou (ii) a presença de analito na amostra de líquido é determinada quantitativamente; ou (iii) o método detecta múltiplos analitos na amostra de líquido, de preferência o dispositivo de teste compreende ainda pelo menos dois reagentes marcados diferentes, em que os ligantes dos reagentes marcados se ligam a diferentes analitos, e pelo menos duas zonas de detecção para detectar cada um dos pelo menos dois reagentes marcados diferentes.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de que no kit: (i) o analito é uma proteína, ácido nucleico, metabólito, molécula pequena, vírus ou bactéria; ou (ii) o dispositivo de teste compreende ainda uma almofada absorvente, em que a superfície inferior da membrana porosa e a almofada absorvente estão em contato físico e em comunicação de fluido, e em que o reagente de ligação está ligado à superfície superior da membrana porosa; ou (iii) o dispositivo de teste compreende ainda um alojamento para a membrana porosa; ou (iv) a presença de analito na amostra de líquido é determinada quantitativamente; ou (v) o dispositivo de teste é configurado para detectar múltiplos analitos, de preferência o dispositivo de teste compreende ainda pelo menos dois reagentes marcados diferentes, em que os ligantes dos reagentes marcados se ligam a analitos diferentes, e pelo menos duas zonas de detecção para detectar cada um dos pelo menos dois reagentes marcados diferentes.

9. Sistema CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (I) um dispositivo de teste para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido, compreendendo: (i) um elemento que recebe a amostra; (ii) um portador em comunicação de fluido com o elemento que recebe a amostra; (iii) um reagente marcado que é móvel no portador na presença da amostra de líquido, o reagente marcado compreendendo um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida consistindo em um núcleo de ouro e um invólucro tendo o ligante ligado ao mesmo, em que o invólucro compreende vidro, um material cerâmico tal como perovskita e ZrCte, ou um polímero tal como polietilenoglicol, polime- tilmetacrilato e poliestireno, e aumenta a refletância da nanopartícula, e em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman; e (iv) um reagente de ligação eficaz para capturar o analito, quando presente, imobilizado em uma zona de detecção definida do portador; em que a amostra de líquido aplicada ao elemento que recebe a amostra mobiliza o reagente marcado, tal que a amostra e o reagente marcado são transportados ao longo da extensão do portador para passar na zona de detecção, e em que a detecção do reagente marcado na zona de detecção é indicativa da presença de analito na amostra de líquido, (II) um refletômetro adaptado para detectar a presença do reagente marcado no dispositivo de teste.

10. Sistema, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que no dispositivo de teste: (i) o portador compreende nitrocelulose, plástico ou vidro, de preferência o portador compreende nitrocelulose; ou (ii) o analito é uma proteína, ácido nucleico, metabólito, molécula pequena, vírus ou bactéria; ou (iii) o dispositivo de teste compreende ainda uma almofada absorvente em comunicação de fluido com a zona de detecção; ou (iv) o dispositivo de teste compreende ainda uma zona de controle em comunicação de fluido com a zona de detecção; ou (v) a presença do analito na amostra de líquido é determinada quantitativamente; ou (vi) o dispositivo de teste é configurado para detectar múltiplos analitos, de preferência o dispositivo de teste compreende ainda pelo menos dois reagentes marcados diferentes, em que os ligantes dos reagentes marcados se ligam a analitos diferentes, e pelo menos duas zonas de detecção para detectar cada um dos pelo menos dois reagentes marcados diferentes.

11. Sistema CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (I) um kit para realizar um teste analítico de fluxo passante para detectar a presença ou ausência de um analito em uma amostra de líquido através de refleto- metria, compreendendo: (II) um dispositivo de teste compreendendo uma membrana porosa compreendendo uma superfície superior e uma superfície inferior e um reagente de ligação eficaz para capturar o analito, quando presente na amostra de líquido, ligado à superfície superior ou inferior da membrana porosa; e (III) um reagente marcado compreendendo um ligante que se liga ao analito e uma nanopartícula revestida consistindo em um núcleo de ouro e um invólucro tendo o ligante ligado ao mesmo, em que o invólucro compreende vidro, um material cerâmico tal como perovskita e ZrO2, ou um polímero tal como polietilenoglicol, polime- tilmetacrilato e poliestireno, e aumenta a refletância da nanopartícula, em que a nanopartícula revestida não inclui uma molécula ativa no Raman, e (IV) um refletômetro adaptado para detectar a presença do reagente marcado no dispositivo de teste.

12. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que no kit: (i) o analito é uma proteína, ácido nucleico, metabólito, molécula pequena, vírus ou bactéria; ou (ii) o dispositivo de teste compreende ainda uma almofada absorvente, em que a superfície inferior da membrana porosa e a almofada absorvente estão em contato físico e em comunicação de fluido, e em que o reagente de ligação está ligado à superfície superior da membrana porosa; ou (iii) o dispositivo de teste compreende ainda um alojamento para a membrana porosa; ou (iv) a presença de analito na amostra de líquido é determinada quantitativamente; ou (v) o dispositivo de teste é configurado para detectar múltiplos analitos, de preferência o dispositivo de teste compreende ainda pelo menos dois reagentes marcados diferentes, em que os ligantes dos reagentes marcados se ligam a analitos diferentes, e pelo menos duas zonas de detecção para detectar cada um dos pelo menos dois reagentes marcados diferentes.

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