TW200936764A - Processes for preparing an intermediate of sitagliptin via enzymatic reduction - Google Patents

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200936764 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 4’5-二氟苯基）-3-羥基 本發明係有關一種用於 本發明係有關一種用於製備4-(2,4,5 丁酸甲酯之酶還原法。特定言之， 製備在西他列汀（SITAGLIPTIN)合成法中作為主要中間體 之（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3_羥基丁酸甲酯之酶還原法。 ❹ 人本案。 本發明主張於2007年10月3日申請之美國臨時申請案第 60/977,210號之權益。此申請案内容於此以引用之形式併 【先前技術】 式-1之西他列汀（Sitagliptin)磷酸酯，3(R)-胺基小（3 (二I曱基）-5,6,7,8-四氫-(1，2,4)***并（4,3-已)吼嗓-7-基）_4 (2,4,5-二氟苯基）丁-1-酮磷酸鹽具有以下化學結構：

西他列汀磷酸鹽是胰高血糖素樣肽_丨新陳代謝調節劑、 降血糖藥和二肽基肽酶以抑制劑。當前，西他列汀磷酸鹽 呈單水合物形式，以商品名稱januviatM在美國市場銷 售。JANUVIATM據稱可改善2型糖尿病患者血糖控制。 PCT公告案第 WO 2004/087650("WO '650")號提及由4_ 135103.doc 200936764 (2,4,5-三氟笨基）-3-側氧基丁酸甲酯經由立體選擇性還原 法產生西他列汀（SITAGLIPTIN)中間物（S)-4-(2,4,5-三氟苯 基）-3-羥基丁酸甲酯，合成西他列汀。WO ’650, p. 19,實例 2。WO '650之實例2揭露：在鹽酸存在下，使用H2和（S)-BINAP-RuC12催化劑，經氫化法進行立體選擇性還原反 應。此方法闡明於以下反應圖1中。 反應圈1 : WO '650之催化性氫化法

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PCT公告案第W02004/085661(" WO，661")號提及由經 取代之烯胺與Pt〇2進行立體選擇性還原法，合成西他列 汀。WO (661，ρρ· 13-18 (實例1，反應圖2)。PCT公告案第 WO 2004/085378 ("WO '378")號提及由烯胺與[Rh(cod)Cl]2 與（R，S)第三丁基-Josiphos (係一種二茂絡鐵基二膦配位體） 進行立體選擇性還原法，合成西他列汀。WO '378，實例1 (反應圖2)。 【發明内容】 在一個實施例中，本發明提供一種用於製備（S)-或（R)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯之方法’其包括： a)合併如下式4-(2,4,5-三氟苯基）-3-側氧基丁酸曱酯： 135103.doc 200936764

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與可以立體選擇性還原酮形成醇之酶、和輔因子，獲得反 • 應混合物； - b)維持混合物，以獲得（S)或（R)4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基 丁酸甲酯。 φ 在一個實施例中，本發明提供一種用於製備4-(2,4,5-三 氟苯基）-3-羥基丁酸酯，特定言之，在西他列汀合成中作 為主要中間體之（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯、 和高對映異構性純度之4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲 酯之（S)和（R)對映異構物之立體選擇性酶還原法。 在一個實施例中，本發明提供（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯，其經HPLC測定之對映異構性純度大於約 87%、大於約95%較佳、大於約98%更佳。 Ο 在一個實施例中，本發明進一步提供（R)4-(2,4,5-三氟苯 基）-3-羥基丁酸甲酯，其經HPLC測定之對映異構性純度大 於約86%、大於約95%較佳、大於約99%更佳。 在一個實施例中，本發明提供一種用於製備4-(2,4,5-三 氟苯基）-3-經基丁酸甲酯之方法，其包括形成一種包含基 4-(2,4,5-三氟苯基）-3-側氧基丁酸甲酯、選自由1〇^0-NADH-121 ' KRED-NADH-124 > KRED-NADH-128 ' KRED-NADH-108、KRED-NADH-110、KRED-NADH-116、KRED- 135103.doc 200936764 NADH-122、KRED-NADH-125、KRED-140、KRED-137、 KRED-NADH-112、KRED-NADH-114、KRED-NADH-117、 KRED-NADH 123、KRED-NADH-126 和 KRED-NADH-129 組成之群組之酮基還原酶，和辅因子之溶液，並維持溶液 態，以攪拌較佳，持續至足以經由酶還原法轉化4-(2,4,5-三氟苯基）-3-側氧基丁酸酯形成4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基 丁酸曱酯為止。該酶來自加州Redwood市Codexis公司。 在一個實施例中，本發明提供一種4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸曱酯之（R)-對映異構物，當酶選自由KRED-NADH-112 、 KRED-NADH-114 、 KRED-NADH-117 、 KRED-NADH-123、KRED-NADH-126和 KRED-NADH-129 組成之 群組時，主要形成（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲 酯。 在一個實施例中，本發明提供一種4-(2,4,5-三氟笨基）_ 3-羥基丁酸酯之（S)-對映異構物，當酶選自由KRED-NADH-121 > KRED-NADH-124 ' KRED-NADH-128 ' KRED-NADH-108 > KRED-NADH-110 ' KRED-NADH-116 ' KRED- NADH-122、KRED-NADH-125、KRED-140 以及 KRED-137 組成之群組時，主要形成（r)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁 酸甲酯。 在一個實施例中，本發明進一步提供一種用於製備西他 列汀之方法。其包括使用本發明之酶還原法製備 (2,4,5-三氟苯基）-3_羥基丁酸甲酯，並轉化（S)-4_(2,4,5-三 氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯形成西他列汀。 135103.doc -8- 200936764 【實施方式】 使用於此之術語”酮還原酶"、”酮還原酵素"或"KRED"意 指以立體選擇性方式催化還原酮形成相應醇之酶，其中視 需要使用輔因子。此酮還原酶包括例如：彼等分類在EC號 1.1.1下之類。除了酮還原酶之外，此類酶尚有很多不同名 稱，包括但不限於醇脫氫酶、羰基還原酶、乳酸脫氫酶、 羥酸脫氫酶、羥基異己酸鹽脫氫酶、β-羥丁酸脫氫酶、類 固醇脫氫酶、山梨醇脫氫酶和醛糖還原酶。依賴NADPH 的酮還原酶分類在EC號1· 1.1.2下和CAS號9028-12-0。依賴 NADPH的酮還原酶分類在EC號l.l.l.nΓ和CAS號9031-72-5。市面上可買到酮還原酶商品，例如從Codexis，Inc.公 司，產品編號KRED-101至KRED-177號。 KRED可為野生型或變體酶。野生塑和變體KRED酶之序 列提供於WO 2005/017135，其揭示内容已以引用方式併入 本文中。 市面上可買到KRED酶商品。此類實例包括反仗丑口-NADH-121 ' KRED-NADH 124 ' KRED-NADH-128 > KRED-NADH-108 > KRED-NADH-110 ' KRED-NADH-116 ' KRED-NADH-122、KRED-NADH-125、KRED-140、KRED-137、 KRED-NADH-112、KRED-NADH-114、KRED-NADH-117、 KRED-NADH 123、KRED-NADH-126 以及 KRED-NADH-129。使用之KRED酶較佳地選自由如下至少一種主要酶組 ： KRED-NADH-121 ' KRED-NADH 124 ' KRED-NADH-128 ' KRED-NADH-108 ' KRED-NADH-110 ' KRED- 135103.doc 200936764 NADH-116 ' KRED-NADH-122 > KRED-NADH-125 ' KRED-140、KRED-137及其組合。較佳地，此酶是〖11£0卞八011-108、KRED-NADH-110、KRED-NADH-116 和 KRED-NADH-12。最佳地，此酶是 KRED-NADH-108、KRED-NADH-110 〇 較佳地，此酮還原酶是已分離者《其可從任何寄主 (如：哺乳動物、絲狀真菌、酵母和細菌）分離。依賴 NADH的酮還原酶之單離、提純和表徵判別法已說明於例 ® 如：Kosjek等人之"適用於電偶氧化還原反應之化學耐受 性乙醇脫氫酶之提純和表徵（Purification and Characterization of a Chemotolerant Alcohol Dehydrogenase Applicable to Coupled Redox Reactions)"，生物技術和生 物工程（Biotechnology and Bioengineering，），86:55-62 (2004)。較佳地，此酮還原酶用合成法合成。以化學方法 或使用重組體方式合成酮還原酶。酮還原酶之化學合成法 _ 或重組體合成法敍述在如歐洲專利號EP 0918090中。較佳 地，使用重組體方式，在大腸桿菌中合成酮還原酶。較佳 地，純化酮還原酶；較佳地，純度大約90%或以上；更佳 地，純度大約95%或以上。較佳地，此酮還原酶實質上不 含細胞。 使用於此之術語"輔因子"意指與催化所需反應之酶組合 運作之有機化合物。輔因子包括菸鹼醯胺輔因子，如菸鹼 醯胺腺嘌呤二核苷酸（"NAD")、還原型菸鹼酿胺腺嘌呤二 核苷酸（"NADH”）、菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 135103.doc -10-

200936764 )、還原型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 ("NADPH”）及其任何衍生物或類似物。 本發明係有β卜種由4_(2,4,5•三氟苯基）_3_側氧基丁酸 甲經酶還原法製備4_(2,4,5•三氟苯基）·3·經基丁酸子 醋，特定言之西他心合成中間體⑻_4_(2,4,5-三氣苯基广 3_經基丁酸甲@旨之方法’其包括由4_(2,4,5•三氟苯基）^匈 氧基丁酸甲S旨經酶還原法製備本發明之（S)-4-(2,4,5-三氟 苯基）-3·羥基丁酸甲酯和高對映異構性純度之（s)_和（r)_扣 (2,4,5-二氟苯基）_3_經基丁酸甲酯。 4-(2’4’5-三氟苯基）_3_側氧基丁酸甲醋可按照相關技藝 上熟知之任何方法製備，例如按照揭露在…丁公告案號 WO 2〇〇4/〇87650之製程，其包括：在二氣甲烧存在下，、由 草酿氣與2,5-二氟苯乙酸反應，所得之美德魯酸陶心― acid)續於甲醇中回流，獲得所需產物。 相較於先前㈣使狀金屬純劑，本發㈣還原法中 以酶作為還原催化劑之作法對環境較有利。相較於侧 2_/087650之釕催化齊！，此酶一般成本更低。另外，金 屬催化劑’如：用於WO 2004/08765〇之㈣化劑、揭露在 wo 2004/085661之銘催化劑及揭露在w〇 之 铑催化劑在最終產品中會留下微量金屬，因此，成為製造 本發明提供下式（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）_3 •羥基丁酸甲酯 135103.doc 200936764

其經過HPLC測定之對映異構性純度為大於約86%、大於約 95%較佳及大於約99%更佳。 本發明進一步提供下式（R)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁 酸曱酯

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OCH, 其經過HPLC測定之對映異構性純度為大於約87%、大於約 95%較佳及大於約98%更佳。 用於製備下式之西他列汀中間體（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸曱酯之本發明方法

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OCH, ❿ 包括以立體選擇性方式合併如下式4-(2,4,5-三氟苯基）-3 側氧基丁酸甲酯 135103.doc -12- 200936764

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及催化酮形成醇之酶與輔因子，以獲得反應混合物，並且 ' 維持反應混合物，以獲得中間體。較佳地，此酶是酮還原 - 酶（KRED)。其可從天然源分離或使用重組體技術合成。 較佳地，在本發明過程中，此酮還原酶能產生d.e.約 φ 90%或更高的（S)-或（R)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3羥基丁酸甲 酯。較佳地，在本發明過程中，此酮還原酶能產生產率大 約50%或更高的（S)-或（R)-4-(2,4,5·三氟苯基）-3-羥基丁酸 甲酯。 較佳地，此酮還原酶選自由依賴NADH的酮還原酶和依 賴NADPH的酮還原酶組成之群組。適當酮還原酶實例包 括但不限於具有如下產品編號之Codexis Inc產品：KRED-NADH-121、KRED-NADH 124、KRED-NADH-128、KRED-❷ NADH-108 ' KRED-NADH-110 > KRED-NADH-116 ' KRED-NADH-122、KRED-NADH-125、KRED-140、KRED-137、 KRED-NADH-112、KRED-NADH-114、KRED-NADH-117、 KRED-NADH 123、KRED-NADH-126，KRED-NADH-129 以及其組合。較佳地，此酮還原酶選自由具有如下產品編 號之Codexis Inc產品之主要酶組成之群組：KRED-NADH-121 > KRED-NADH-124 ' KRED-NADH-128 ' KRED-NADH-108、KRED-NADH-110、KRED-NADH-116、KRED-NADH- 135103.doc •13- 200936764 122、KRED-NADH-125、KRED-140、KRED-137以及其組 合。較佳地， 110、KRED-NADH-116和 KRED-NADH-12。更佳地，此酮 還原酶選自由KRED_NADH-108、KRED-NADH-110以及其 組合組成之群組。 此輔因子選自由NADH、NADPH、NAD+、NADP+、其 鹽以及其混合物組成之群組。較佳地，當此酮還原酶依賴 NADH時，其輔因子選自由NADH、NAD+、其鹽以及其混 合物組成之群組。更佳地，該輔因子是NADH或其鹽。較 佳地，當此酮還原酶依賴NADPH時，其輔因子選自由 NADPH、NADP+、其鹽以及其混合物組成之群組。更佳 地，該辅因子是NADPH或其鹽。輔因子鹽之實例包括 NAD-四（環己基銨）鹽、NAD-四鈉鹽、NAD_四鈉水合物、 NADP+-磷酸鹽水合物、NADP+-磷酸鈉鹽及NADH-二鉀 rrfe. 鹽。 在一個實施例中，本發明方法於緩衝劑中進行。較佳 地，此緩衝劑pH介於大約4至9之間、介於大約4至8之間更 佳、介於大約5至8之間更佳、介於大約6至8之間或介於大 約5至7之間最佳。較佳地，此緩衝劑是鹽溶液。較佳地， 此鹽選自由磷酸鉀、硫酸鎂以及其混合物組成之群組。此 緩衝劑視需要包含硫醇。較佳地，此硫醇是DTT。較佳 地，此硫醇還原酶之二硫鍵。

在一個實施例中，在大約10°C至50°C溫度下進行本發明 方法。較佳地，在室溫下進行本方法，在大約20°C至30°C 135103.doc 200936764 溫度下或在大約25°C至35°C下。較佳地，在大約25〇C至 30°C溫度下進行本方法，例如在大約3〇〇c下。 此反應混合物視需要進一步包括輔因子再生系統。一種 輔因子再生系統包括受質和脫氫酶。由受質與脫氫酶之間 之反應再生輔因子《較佳地，此辅因子再生系統包括成對 之受質/脫氫酶’其選自由如下組成之群組：D_葡萄糖/葡 糖脫氫酶、甲酸鈉/甲酸脫氫酶、亞磷酸鹽/亞磷酸鹽脫氫 酶’和異丙醇和酮還原酶/氫化酶。較佳地，此葡糖脫氫 酶選自由如下產品編號之Codexis inc產品之主要酶組成之 群組：GDH-102、GDH-103、GDH-104以及其混合物。較 佳地’此葡糖脫氬酶是GDH-104中之酶。較佳地，此甲酸 脫氫酶是產品編號FDH-101之Codexis lnc產品之主要酶。 較佳地’此亞磷酸鹽脫氫酶是產品編號FDH-101之Codexis Inc產品之主要酶。 在一個實施例中’在溶劑（如：有機溶劑）存在下，進行 φ 本發明方法。較佳地，此有機溶劑為水混溶性，如：水混 溶性醇、乙腈、四氫呋喃和二曱亞颯。較佳地，此醇是 c〗-C4醇，以曱醇或IPA(異丙醇）更佳。使用水混溶性溶 劑，特定言之醇和二ψ亞砜時，反應介質主要是水，其使 ' 反應更環保。 ' 本方法可包含以下步驟：（a)於溶劑中溶解4-(2,4,5-三氟 苯基）-3-侧氧基丁酸曱酯；和（b)使來自（幻之溶液與包含輔 因子和酮還原酶之缓衝劑合併。此溶液視需要包含輔因子 再生系統。較佳地，獲得之混合物維持一段足夠時間，以 135103.doc -15- 200936764 得到（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯。較佳地，本 反應維持在約1(TC至約50°C溫度下或在約2〇。(：至約40。〇 下，在約25°C至約30°C溫度下或在約3〇°C下更佳。較佳 地’本反應持續約0.5小時或以上、約1 5小時或以上或約 2.5小時或以上。較佳地，本反應持續約5〇小時或以内。 較佳地’本反應持續約3小時至約4 〇小時之間，更佳地， 持續約6小時至約24小時之間或約ό小時至約丨6小時之間。 可授掉反應物。

可視需要添加與水不混溶的有機溶劑至反應混合物中， 較佳地，在授拌之後添加。視需要在添加與水不混溶的有 機/谷劑後，分離反應混合物成為有機相和水相。視需要蒸 發有機相，回收（S)-4-(2,4,5-三氟苯基羥基丁酸甲酿Y 與水不混溶的有機溶劑實例包括但不限於C2_C8醚、 酿（如：Et〇Ac)、c4_c8酮（如：MIBK)和齒代烴（如： DCM)。較佳地’與水不混溶的有機溶劑選自由雇。 MTBE、***和其混合物組成之群組。較佳地，與水不混 溶的有機溶劑是EtOAc。 視需要最好錢拌之後過濾、此反應混合物，回收固態產 物’其視需要進—步純化，獲得（SM_(2,4,5_三氟苯 羥基丁酸甲醋。 視需要在分離產物後，處理水相，使輔因子再生系統中 之酶、輔因子及/或脫氫酶進再 „ 丹循環。視需要調節水相 PH達到所需pH 〇視需要蒸發水相除去有 相可視需要A爾 /齊丨殘質。水 优萬要再用於本發明過程中。 135103.doc 16 200936764 由本發明方法獲得之如下式4-(2,4,5-三氟笨基）-3-羥基 丁酸曱酯之相應（R)-對映異構物，（R)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸曱酯

❹ 其製法係製備包含4-(2,4,5-三氟苯基）-3-側氧基丁酸甲 酯、選自由1〇^0』八01'1-121、10^0"^八011-124、10^0· NADH-128 ' KRED-NADH-108 ' KRED-NADH-110 ' KRED-NADH-116、KRED-NADH-122、KRED-NADH-125、KRED-140及KRED-137組成之群組之酶之溶液，並維持溶液，攪 拌較佳，持續至足夠由4-(2,4,5-三氟苯基）-3-側氧基丁酸 酯經酶還原法轉化成（R)-4-(2,4,5-三氟苯基）_3_羥基丁酸甲 酯。較佳地，此酶是 KRED-NADH-114 或 KRED-NADH-❹ 117。 本發明進一步提供用於製備西他列汀之方法，其包括使 . 用本發明酶還原法製備（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸 甲醋並轉化（S)-4-(2,4,5-三氟1苯基）-3-經基丁酸曱醋形成西 他列汀。可依相關技藝熟知之任何方法轉化（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯形成西他列汀；例如：WO 2004/087650中提及之方法，其揭示内容已以引用之方式 併入本文中。 I35103.doc -17- 200936764 較佳地’採用高效液層析法（"HPLC")測定4-(2,4 % = g

，_ 二 HL 苯基）-3 -經基丁酸甲酯化學純度。高效液相層析法可以包 括在以下條件下’進行高效液相層析法分析4-(2,4,5-=氣 苯基）-3-羥基丁酸甲酯樣品 管柱：Discovery, 150 mm><4.6 mm (Supelco); 洗提劑：洗提劑A (於1升乙腈中之〇.08%(0.8加）TFa)); 洗提劑B (於1升水中之0.1%(1.〇 mi) TFA)。 洗提劑梯度 ❹ 時間（min) 洗提#|A(%) 洗提劑B(%) 0 40 60 10 40 60 30 70 30 流速：1 ·〇 ml/min ; 管柱溫度：3〇°C ; 檢測器：PDA，210 nm。 ❹ 用於測定4-(2,4,5-三氟苯基）-3-經基丁酸曱酯之對映異 構性純度之高效液相層析法亦可能包括在以下條件下，進 . 行高效液相層析法，分析4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸 曱S旨樣品· * 管柱：Chiralpak-AD-H，5 μιη，150 mmx4.6 mm ; 洗提劑·· 5%2-丙醇/95%正己烷卜~); 流速：1.0 ml/min ; 管枉溫度：35°C。 135103.doc • 18- 200936764 檢測器：PDA/UV，260 nm。 已經引用某些最佳實施例敍述本發明，習此相關技藝之 人士從本說明書即可了解其他實施例。以下實例進一步說 明本發明*習此相關技藝之人士咸了解，可在不脫離本發 明範圍内修改許多物質和方法。 實例 高效液相層析法分析： (a)化學纯度 使用配置於210 nm之光電二極體陣列檢測裝置之 Discovery, 150 mm><4.6 mm (Supelco)管柱，進行高效液相 層析法，分析4-(2,4,5·三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯樣品。 管柱溫度是30°C。流速是1.0 ml/min。 使用洗提劑A (於1升乙腈中之0.8 ml TFA)和洗提劑B(於 1升水中之1.0 ml TFA)之混合物，通過管柱進行梯度洗提 樣品。梯度如下： 時間（min) 洗提齊丨A(%) 洗提劑B(%) 〇 40 60 10 40 60 30 70 30 (b)對映異槿性姑.磨 使用 Chiralpak-AD-H，5 μπι，150 mm><4.6 mm管柱，進行 高效液相層析法，分析4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲 S旨樣品。管柱溫度是35°C。流速是1 .〇 ml/min。按體積計 算’使用5%體積比2-丙醇和95%體積比正己烷之混合物， 135103.doc •19- 200936764 通過管柱，洗提樣品。此酶和緩衝劑係由美國Pasadena市 之則00&131丫1；]：08 1110公司（現在為加州尺6(1'\¥00(1市之€：0(16乂18 公司）提供。 在此類條件下，4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯之S-對映異構物之滯留時間（RT)為10分鐘，4-(2,4,5-三氟苯 基）-3-羥基丁酸曱酯之R-對映異構物滯留時間為12分鐘。 實例1 :製備（S)-4-(2,4,5·三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯之一 般製程 ® 製備再循環混合物以提供用於再生和回收酶。 (a) 用於KRED-NADH之再循環混合物 KRED-NADH再循環混合物A: 250 mM磷酸鉀、0.5 mM 二硫蘇糖醇、2 mM硫酸錢、1.3 mM NAD+、80 mM右旋葡 萄糖、10 U/ml葡糖脫氫酶，pH 7.0 KRED-NADH再循環混合物B: 200 mM MOPS、160 mM TRIS、100 mM氯化鉀、2 mM氯化鎂、1.3 mM NAD+、80 mM右旋葡萄糖、10 U/ml葡糖脫氫酶，pH 7.5 ❿ (b) 用於KRED-NADPH之再循環混合物 KRED-NADH再循環混合物A: 250 mM磷酸鉀、0.5 mM ' 二硫蘇糖醇、2 mM硫酸鎂、1.1 mM NADP+、80 mM右旋 , 葡萄糖、10 U/ml葡糖脫氫酶、pH 7.0 (c) 製備4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯 取溶於 0.2 ml DMSO 之 50 mg (250 μηιο1)4-(2,4,5-三氟苯 基）-3-側氧基丁酸曱酯溶液添加至含於5 ml再循環混合物 溶液中之5 mg酶溶液，並且擾拌24小時。使用5 ml EtOAc 135103.doc -20- 200936764 提取產物4·(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯，經由蒸發 分離’並採用上述高效液相層析法分析對映異構性和化學 純度。結果概括於以下表1和2中。 如表 1所示，使用酶KRED_NADH-121、KRED-NADH-124 ' KRED-NADH-128 ' KRED-NADH-108 ' KRED-NADH-110 ' KRED-NADH-116 > KRED-NADH-122 ' KRED-NADH-125、KRED-140和KRED-137，獲得對映異構性純度大於 86%面積百分比之4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸曱酯之S-對映異構物。如表2所示，使用酶KRED-NADH-112、 KRED-NADH-114、KRED-NADH-117、KRED-NADH-123、 KRED-NADH-126 和 KRED-NADH-129，獲得光學對映異 構係純度大於87%面積百分比之4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基 丁酸甲酯之R-對映異構物。 表1 實例 編號 酶 再循環混合 物 對映異構性純度(峰面積％) 化學純度(峰面積％)(使用 210 nm波長測量） 波長 (nm) R對映 異構物 S對映 異構物 RT-10 (min) RT〜7 (min) 1 KRED-NADH-121 B- KRED-NADH 210 1.8 98.2 97.2 2.8 2 KRED-NADH-124 B- KRED-NADH 210 6.9 93.1 99,1 0.9 3 KRED-NADH-128 B- KRED-NADH 210 8.5 91.5 98.0 2.0 4 KRED-NADH-108 A- KRED-NADH 260 0.63 99.37 0.9 99.1 5 KRED-NADH-110 A- KRED-NADH 260 0.11 99.89 0.3 99.7 6 KRED-NADH-116 A- KRED-NADH 260 1.9 98.1 24.5 75.5 7 KRED-NADH-122 A- KRED-NADH 210 1.4 98.6 10.2 89.8 8 KRED-NADH-125 KRED- NADH 210 7.8 92.2 84.1 15.9 9 KRED-140 A- KRED-NADPH 210 5.3 94.7 99.9 0,1 10 KRED-137 A· KRED· NADPH 210 13.5 86.5 99.3 0.7 -21 · 135103.doc 200936764 表2 實例 酶 再循環混合物 對映異; _(%) 波長 編號 S對映異構物 R對映異構物 (run) 1 KRED-NADH-112 A-KRED-NADH 93.0 7.0 260 2 KRED-NADH-114 A-KRED-NADH 95.4 4.6 260 3 KRED-NADH-117 A-KRED-NADH 98.3 1.7 210 4 KRED-NADH-123 A-KRED-NADH 87.5 12.5 210 5 KRED-NADH-126 A-KRED-NADH 88.2 11.8 210 6 KRED-NADH-129 A-KRED-NADH 89.9 10.1 210 表3 :批號和生產年份 產品號碼 批號 生產年份 KRED-NADH-108 171706CL 2006 KRED-NADH-110 073106CL 2006 KRED-NADH-112 140207PB 2007 KRED-NADH-114 211006WW 2006 KRED-NADH-116 100906CL 2006 KRED-NADH-117 082707WW 2007 KRED-NADH-121 122206WW 2006 KRED-NADH-122 121806WW 2006 KRED-NADH-123 222006WW 2006 KRED-NADH-124 013107MM 2007 KRED-NADH-125 191806CL 2006 KRED-NADH-126 013107WW 2007 KRED-NADH-128 213107WW 2007 KRED-NADH-129 022607WW 2007 KRED-137 213006MM 2006 KRED-140 220905CL 2005 135103.doc 22-

Claims (1)

1. 200936764 十、申請專利範圍： h 一種用於製備（S)_或（R)-4-(2,4,5·三氟苯基）_3_羥基丁酸 甲醋之方法，其包括： a)合併如下式之4_(2,4,5_三氟苯基）_3_羥基丁酸甲酯： F

   與可立體選擇性還原酮形成醇之酶和輔因子，以獲得反 應混合物； b)維持該混合物，以獲得（S)-或（R)_4-(2,4,5-三氟笨 基）-3-羥基丁酸甲酯。 2. 如請求項1之方法，其中此酶是酮還原酶。 3. 如請求項1或2之方法，其中係獲得（S)-4-(2,4,5-三氟苯 基）-3·羥基丁酸甲酯。 4. 如請求項2或3之方法，其中此酶選自由至少如下一種組 成之群組：KRED-NADH-121、KRED-NADH-124、KRED- NADH-128 > KRED-NADH-108 > KRED-NADH-110 > KRED-NADH-116、KRED-NADH-122、KRED-NADH-125、KRED-140、KRED-137以及其組合。 5. 如請求項4之方法，其中此酶是KRED-NADH-108或 KRED-NADH-110。 6. 如請求項1或2之方法，其中係獲得（R)-4-(2,4,5-三氟苯 基）-3-羥基丁酸曱酯。 135103.doc ❹

   維持此混合物於約 200936764 7. 如請求項6之方法，其中此酶選自由至少如下一種組成 ： KRED-NADH-112 > KRED-NADH-114 ^ KRED- NADH-117、KRED-NADH-123、KRED-NADH-120、KRED- NADH-129以及其組合。 8. 如請求項1至5中任一項之方法，其中（s)_4_(2,4,5三氟苯 基）-3-羥基丁酸曱酯具有以HPLC測定之對映異構性純度 大於約99%。 9. 如請求項！、2、6或7之方法，其巾（RM (2 4 5三氣苯 基）-3-羥基丁酸甲酯具有以HpLC測定之對映異構性純度 大於約98%。 10. 如先前請求項中住一 ^ , 哨T任項之方法，其中維持此混合物約2 小時至約24小時之間。 11. 如先前請求項中任一頊 法’/、中維持此混合物約3 小時至約24小時之間。 12. 如先則§青求項中任—+ 方法，其中維持此混合物約4 小時至約1 6小時之間。 13. 如先前請求項中任一項 1。至約5(TC之溫度間。 ，、中維持此混合物於約 14. 如先前請求項中任-項之方法，其中 20至約40°C之溫度間。 15·如先前請求項中任一項之 25至約30。(：之溫度間。 、，、維持此混合物於約 16.如先前請求項中任 胺輔因子。 項之方法，其中 此輔因子是菸鹼醯 135103.doc 200936764 17. 如请求項16之方法’其中此輔因子選自由如下組成之群 組·終驗醯胺腺嘌呤二核苷酸（"Nad")、還原型菸鹼醯 胺腺不呤二核苷酸（”NADH")、菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸 麟酸（NADP+")、還原型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 ("NADPh”）和其混合物。 18. 如先别請求項中任一項之方法，其中此反應混合物進一 步包括含脫氫酶和受質之輔因子再生系統。 19. 如睛求項18之方法，其中此成對之受質/脫氫酶係選自由 如下組成之群組：D-葡萄糖/葡萄糖脫氫酶、曱酸鈉/曱 酸脫氫酶和亞磷酸鹽/亞磷酸鹽脫氫酶。 2〇·如先前請求項中任一項之方法，其中此方法於有機溶劑 中進行》 21 ·如4求項20之方法’其中此溶劑是水混溶性有機溶劑。 22. 如請求項2〇之方法，其中此溶劑是醇或 二甲亞爾·。 23. =請求項！至2、6至7、9至22中任一項之方法其中所

   知之（R)-4-(2,4,5·二氟苯基）_3_羥基丁酸甲酯具有以 HPLC測定之對映異構性純度大於約98%。 24. 如請求項⑴小邮^中任一項之方法其中所得 = (S) 4 (2,4,5-二氟苯基）_3_經基丁酸甲醋具有以HpLC測 疋之對映異構性純度大於約99%。 25. 如先前請求項中任-項之方法’其包括混合4-(2,4,5-三 氣^基）_3_侧氧基丁酸甲酿溶液和酶溶液製成4-(2,4,5-三 苯土）3側氧基丁酸甲醋和畴之混合物之預備步驟， 其中4 (2,4,5-二氟苯基）_3_侧氧基丁酸甲醋溶液包括有機 135103.doc 200936764 溶劑’且酶溶液包括再循環混合物。 26. 如請求項丨至2、6至7、9至19中任一項之方法其中所 得之（11)-4-(2,4,5-三氟苯基）_3_羥基丁酸甲酯具有以 HPLC測定之對映異構性純度大於約98%。 27. 如請求項1至5、8、1〇至22中任一項之方法其中所得 之（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲酯具有以Hp]LC；測 定之對映異構性純度大於約99%。

   28· —種製備西他列汀（Sitagliptin)之方法，其包括採用如請 求項2之方法製備（R)-或（S)_4_(2,4,5·三氟苯基）3·羥基丁 酸甲酿並轉化（R)-或（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）_3_經基丁酸 甲酯形成西他列汀。 29. —種（R)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲醋，其具有以 HPLC測定之對映異構性純度大於約98%。 30. —種（S)-4-(2,4,5-三氟苯基）-3-羥基丁酸甲醋，其具有以 HPLC測定之對映異構性純度大於約99% 〇

   135103.doc 200936764 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

   135103.doc