TR201816314T4 - Kimerik sitomegalovirüs promotörü ve güçlendirici dizileri içeren ekspresyon vektörleri. - Google Patents
Kimerik sitomegalovirüs promotörü ve güçlendirici dizileri içeren ekspresyon vektörleri. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201816314T4 TR201816314T4 TR2018/16314T TR201816314T TR201816314T4 TR 201816314 T4 TR201816314 T4 TR 201816314T4 TR 2018/16314 T TR2018/16314 T TR 2018/16314T TR 201816314 T TR201816314 T TR 201816314T TR 201816314 T4 TR201816314 T4 TR 201816314T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- sequence
- promoter
- nucleic acid
- expression
- chimeric
- Prior art date
Links
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 63
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 title claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 100
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 84
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 69
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 62
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims abstract description 57
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 241000701033 Simian cytomegalovirus Species 0.000 claims abstract description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 42
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 19
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 abstract description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 9
- 241001529936 Murinae Species 0.000 abstract description 8
- 241000701029 Murid betaherpesvirus 1 Species 0.000 abstract 3
- 101900065606 Human cytomegalovirus Immediate early protein IE1 Proteins 0.000 abstract 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 20
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 7
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 7
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 5
- 238000003491 array Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001010097 Shigella phage SfV Bactoprenol-linked glucose translocase Proteins 0.000 description 3
- 241000723806 Sugarcane mosaic virus Species 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 2
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000004236 Ponceau SX Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- XVVOVPFMILMHPX-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XVVOVPFMILMHPX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 101100348617 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) NIK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N His-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N Lys-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N Met-Thr Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C([O-])=O KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 241001136036 Murid betaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100007329 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS1 gene Proteins 0.000 description 1
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- LDKDSFQSEUOCOO-RPTUDFQQSA-N Tyr-Thr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LDKDSFQSEUOCOO-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Substances [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 235000008979 vitamin B4 Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Bu buluş, memeli hücrelerindeki ilgi konusu bir nükleik asit dizisinin heterolog ekspresyonuna yönelik ekspresyon vektörleri ile ilgilidir, vektörler, eksprese edilecek bir nükleik asit dizisine işlevsel olarak bağlı olan bir kimerik promotör regülatör diziyi içerir, burada kimerik promotör regülatör dizi, murin sitomegalovirüsünden veya insan sitomegalovirüsünden türetilen ve eksprese edilecek nükleik asit dizisinin transkripsiyonel başlangıç bölgesine işlevsel olarak bağlı olan bir sitomegalovirüs promotör dizi ve insan ve/ veya simian sitomegalovirüsten türetilmiş bir sitomegalovirüs yukarı akış bölgesi ve/ veya güçlendirici diziyi içerir, burada yukarı akış bölgesi ve/ veya güçlendirici dizi, murin veya insan promotör dizinin 5? kısmında yer alır ve buraya işlevsel olarak bağlıdır ve ki burada, kimerik promotör regülatör dizi, murin sitomegalovirüs, insan sitomegalovirüsü ve simian sitomegalovirüsünden oluşan grubun en az ikisinden türetilen dizi elemanları içerir. Özel uygulamalarda, kimerik promotör regülatör dizi, murin veya insan sitomegalovirüs IE1 promotöründen ve insan ve/ veya simian sitomegalovirüs IE1 bölgesinden türetilmiş dizi elemanlarını içerir. Buluş ayrıca bu tür ekspresyon vektörleri ile transfekte edilmiş memeli konakçı hücreleri, bir memeli konakçı hücresinde bir nükleik asit dizisinin bu tür ekspresyon vektörleri kullanılarak heterolog ekspresyonuna yönelik bir yöntem ve bir nükleik asit dizisinin heterolog ekspresyonu için bu gibi ekspresyon vektörlerinin kullanılması ile ilgilidir.
Description
TARIFNAME
KIMERIK SITOMEGALOVIRÜS PROMOTÖRÜ VE GÜÇLENDIRICI DIZILERI
IÇEREN EKSPRESYON VEKTÖRLERI
BULUSUN ALANI:
Bu bulus, memeli ekspresyon sistemleri ve özellikle dememeli
hücrelerinde ilgili bir nükleik asit dizisinin heterolog
ekspresyonu için kimerik promotör regülatör dizileri içeren
ekspresyon yapilari ile ilgilidir. Kimerik promotör regülatör
dizileri, SEQ ID. NO: 5'den olusan insan sitomegalovirüs IEl
promotöründen bir promotör dizi ve simian sitomegalovirüs IEl
bölgesinden olan bir güçlendirici diziden olusur veya insan ve
simian sitomegalovirüs IEl bölgelerinden. bir kimera temsil
eder; güçlendirici, SEQ ID. NO: 6'yi içerir.
BULusUN GEEMIsI
Antikor molekülleri, asilar, hormonlar ve büyüme faktörleri
gibi temel arastirma, teshis ve terapi uygulamalari için
rekombinant (poli) peptitler ve proteinler, hem prokaryotik hem
de ökaryotik hücreleri içeren çok çesitli genetik olarak
yapilandirilmis organizmalar kullanilarak üretilir. Bununla
birlikte, rekombinant peptitlerin veya proteinlerin büyük
çogunlugu, prokaryotik. konakçi hücreleri kullanirken taklit
edilemeyen veya yeniden üretilemeyen çevrim sonrasi
modifikasyonlari içerir. Bu nedenle, memeli gen ekspresyon
sistemleri, tercih edilen bir seçimi temsil etmek için ortaya
çikmistir.
Çin Hamster yumurtalik (CHO) hücrelerine dayanan memeli
ekspresyon sistemleri, rekombinant proteinin üretiminde yaygin
olarak kullanilmaktadir. Lenfoid hücre dizileri disinda, CHO
hücreleri, hayvan hücrelerinin basit ve verimli, yüksek
yogunluklu süspansiyon parti kültürüne izin veren birkaç hücre
tipini temsil eder. Ayrica, CHO hücrelerinin kullanimi, yüksek
ürün verimleri ile sonuçlanirken, lenfoid hücrelerin
endüstriyel ölçekte kültürlenmesi daha zordur. Polipeptidlerin
ve proteinlerin rekombinant üretimi için önemli maliyetler göz
önüne alindiginda, biyoreaktör çalismasi basina. rekombinant
proteinin verimini maksimize etmek de büyük önem tasimaktadir.
Ürün verimi üzerinde önemli etkisi olan islem parametreleri,
digerlerinin yani sira hücre kültürü kosullarini, eksprese
edilecek olan nükleik asitlerin (genlerin) kopya sayisini, bu
genlerin transkripsiyona ve ilgili mRNA'larin translasyona
ugradiklari etkiyi, mRNA'nin stabilitesini ve benzerlerini
Buna göre, gen ekspresyonunu kontrol eden regülatör genetik
elemanlarin gücünün veya transkripsiyonel aktivitesinin
iyilestirilmesi, üretilen rekombinant proteinin verimini
arttirmak için özellikle kritik bir faktör teskil eder. Tek
hücre seviyesinde, transkripsiyonel aktivitedeki küçük artislar
bile, nihayetinde yüksek yogunluklu endüstri ölçekli toplu
kültürlerdeki ürün veriminde kayda deger gelismelere
dönüsecektir.
Memeli gen ekspresyon sistemlerinin büyük çogunlugu,
virüslerden türetilen promotör regülatör dizilerin kontrolü
altinda eksprese edilecek olan heterolog nükleik asit
dizilerini kodlayan ekspresyon vektörlerini kullanir. Bu
ekspresyon kasetlerinde en sik kullanilan viral regülatör
elemanlardan ikisi, insan sitomegalovirüsünün (hCMV) erken
yanit veren 1 ve 2 genleridir (IEl ve IE2). Bununla birlikte,
hCMV IEl ve IE2 regülatör elemanlarin kullanimi ile ilgili bir
dezavantaj, onlarin belirgin tür özgüllükleridir.
ABD patenti 5,866,359, bu tür bir hCMV promotöründen gen
ekspresyonunun, zayif bir promotörün kontrolü altinda
adenoviral EIA proteininin birlikte sentezlenmesi ile
gelistirilebilecegini açiklar. EIA, hücre döngüsü regülasyonu
üzerinde etkili olabilen ve her ikisi de bagimsiz
transkripsiyonel aktive edici ve baskilayici fonksiyonel
alanlara sahip olan çok islevli bir transkripsiyon faktörüdür.
Gen transaktivasyonu ve hücre döngüsü progresyonu üzerindeki
herhangi bir olumsuz etki arasindaki ideal dengeyi elde etmek
için EIA ekspresyonunun hassas ayari çok önemlidir. Bununla
birlikte, EIA ekspresyonunun asiri ekspresyonu, hücrenin,
ilgili rekombinant proteini sentezleme kapasitesini
azaltabilir.
ABD patenti 5,591,639, eksprese edilecek bir heterolog nükleik
asit dizisinin yukari akisini (5'), güçlendiriciyi, promotörü
ve intron A dahil olmak üzere insan sitomegalovirüsünün (hCMV-
MIE) erken yanit veren birincil geninin 5'-dönüstürülmemis
bölgesinin tamamini içeren vektörleri tanimlar. Bununla
birlikte, bu dizinin birinci 400 bp'si (5'-uç) (toplam uzunluk
yaklasik 2100 bp) mevcut olsaydi, hem COS7 hem de CHO
hücrelerinde zayif gen ekspresyon oranlari gözlenirdi.
3986).
Siçan sitomegalovirüsünün (mCMV) erken yanit veren genlerinin
regülatör elemanlarinin transkripsiyonel aktivitesi, insan
dizileri için gözlenen belirgin tür tercihini sergilemeksizin
hCMV muadillerinden daha yüksektir. (Addison, C.L. ve
güçlendirici eleman ile kombinasyon halinde kullanilabilen mCMV
baculovirüs promotörü ile kombinasyon halinde mCMV IEl'in
promotör ve güçlendirici elemanlarini kullanan omurgali ve
böcek. hücrelerinde eszamanli yüksek seviyeli ikili protein
ekspresyonu için ekspresyon vektörleri Keil ve arkadaslari
tarafindan tarif edilmistir. (Keil, G.M. ve arkadaslari (2009)
J. Virol. Meth. 160, 132-137). Son olarak, her biri insan, murin
veya simian kökenli sitomegalovirüs IE genlerinden promotör ve
güçlendirici diziler içeren kimerik promotör yapilari, EP O 314
161 sayili Avrupa patent basvurusunda açiklanmistir. Bununla
birlikte, mCMV IE promotörünün murin birincil erken yanit
geninin asagi akisinin (3') dogal birinci intronunun
eklenmesiyle, hCMV muadillerine benzer sekilde mCMV IE promotör
regülatör elemanlarin aktivitesini artirma girisimleri
basarisiz olmustur.(digerlerinin yani sira EP patenti l 525 320
El). Bununla birlikte, mCMV IEl'in regülatör elemanlarindan
olusan kimerik bir kaseti ve insan birincil erken yanit geninin
dogal birinci intronunu içeren ekspresyon vektörlerinin
üretilmesi, tamamen insan dizilerinin kullanimina benzer ürün
Ayni gen ekspresyon oranlari, mCMV IEZ regülatör dizilerini
içeren ekspresyon vektörleri için de elde edilmistir
(digerlerinin yani sira EP patenti l 601 776 El).
Bu nedenle, rekombinant polipeptitlerin veya üretilen
proteinlerin yüksek verimlerine neden olan gelismis memeli gen
ekspresyon sistemleri için hala bir ihtiyaç vardir. Özellikle,
yukarida belirtilen sinirlamalarin üstesinden gelen memeli gen
ekspresyon sistemleri, yani, mCMV veya hCMV promotör dizilerine
dayanan, ancak mevcut sistemlere göre daha yüksek ekspresyon
oranlarina (ve dolayisiyla ürün verimlerine) dayanan ekspresyon
sistemleri için bir ihtiyaç vardir.
Buna göre, mevcut bulusun bir amaci, bu tür gen ekspresyon
sistemlerini, esas olarak uygun ekspresyon yapilarini ve
karsilik gelen memeli konakçi hücrelerini saglamaktir.
BULUsUN ÖZETI
Bir yönüyle bu bulus, memeli hücrelerindeki ilgi konusu bir
nükleik asit dizisinin heterolog ekspresyonuna yönelik bir
ekspresyon vektörü ile ilgilidir; vektör, eksprese edilecek
olan bir birinci nükleik asit dizisine islevsel olarak baglanan
bir birinci kimerik promotör regülatör diziyi içerir; burada
kimerik promotör regülatör dizi, sunlari kapsar:
(i) SEQ ID. NO: 5'ten olusan sitomegalovirüs IEl
promotöründen gelen ve eksprese edilecek nükleik asit
dizisinin transkripsiyonel baslangiç bölgesine islevsel
olarak bagli olan promotör bir dizi; ve
(ii) simian sitomegalovirüs IEl bölgesinden veya insan ve
simian sitomegalovirüs IEl bölgesinden bir kimera temsil eden
güçlendirici bir dizi; güçlendirici dizi, promotör dizinin
' kisminda yer alir ve insan promotör dizisine islevsel
olarak baglidir, burada güçlendirici dizi, SEQ ID. NO: 6'nin
nükleotit dizisini içerir.
Özellikle tercih edilen uygulamalarda kimerik promotör
regülatör dizi, SEQ ID. NO:12 ve SEQ ID. NOle'ten olusan
gruptan seçilen bir nükleotit dizisi içerir.
Diger özel uygulamalarda, ekspresyon vektörü ayrica, eksprese
edilecek olan ikinci bir nükleik asit dizisine islevsel olarak
bagli olan ikinci bir kimerik promotör regülatör dizi içerir;
burada ikinci kimerik promotör regülatör dizi, birinci kimerik
promotör regülatör dizi ile özdestir.
Alternatif uygulamalarda, ekspresyon vektörü ayrica, eksprese
edilecek olan ikinci bir nükleik asit dizisine islevsel olarak
bagli olan ikinci bir kimerik promotör regülatör dizi içerir;
burada ikinci kimerik promotör regülatör dizi, birinci kimerik
promotör regülatör diziden farklidir.
Tercihen, eksprese edilecek olan birinci ve ikinci nükleik
asit dizileri farkli polipeptitleri kodlar. Spesifik
uygulamalarda farkli polipeptidler, dimerik veya multimerik bir
proteinin altbirimlerini temsil eder. Özellikle tercihen,
dimerik veya multimerik protein bir antikor molekülüdür.
Baska bir yönünde mevcut bulus, yukarida tanimlandigi gibi bir
ekspresyon vektörü ile transfekte edilmis bir memeli konakçi
hücre ile ilgilidir. Tercihen konak hücre, bir CHO hücresidir.
Yine baska bir yönüyle bu bulus, bir memeli konakçi hücredeki
ilgi konusu bir nükleik asit dizisinin heterolog ekspresyonuna
yönelik bir yönteme iliskin olup, asagidakileri içerir:
(i) memeli konakçi hücrenin yukarida tanimlandigi gibi
bir ekspresyon vektörü ile transfekte edilmesi; ve
(ii) transfekte edilmis memeli konakçi hücrenin, ilgi
konusu nükleik asit dizisinin ekspresyonuna izin veren
kosullar altinda kültürlenmesi.
Tercih edilen uygulamalarda transfeksiyon, stabil
transfeksiyondur.
Baska bir yönüyle bu bulus, bir memeli konakçi hücredeki ilgi
konusu nükleik asit dizisinin heterolog in vitro ekspresyonu
için yukarida tanimlandigi gibi bir ekspresyon vektörünün
kullanimi ile ilgilidir.
Bu bulusun diger uygulamalari, buradan itibaren olan detayli
tarifnameden anlasilacaktir.
ÇIZIMLERIN AÇIKLAMASI
Sekil 1, burada tanimlanan memeli ekspresyon vektörlerinin
üretilmesi için "ana vektör" olarak kullanilan ekspresyon
vektörü pRY42'yi (SEQ ID. NO: 1) göstermektedir. pRY42,
heterolog gen ekspresyonunu (sirasiyla "mCMV" ve "pA"
arasinda) gerçeklestirmek için iki regülatör kaseti kapsar:
Eksprese edilecek heterolog nükleik asit dizilerinin
eklenmesi için "Ex2" bölgelerinin 3' kisminda (yani "asagi
akis") yer alir çoklu klonlama alanlari. Regülatör kasetler,
mutant ("F5-mFRT") ve yabani tip ("wFRT") flippaz tanima
hedef alanlari tarafindan kusatilmistir. Bir çerçeve içi
baslatma metionin kodonu, wFRT alaninin ("ATG +- F") 5'-
ucuna eklenmistir. Bir SV4O erken yanit promotörü ("SV"), ATG
+ F'nin 5' ("yukari akisi")' kisminda. bulunur. Heterolog
nükleik asit dizilerinin transkripsiyonu, murin
sitomegalovirüs IEl geninin ("mCMV") promotörü tarafindan
gerçeklestirilir ve bunu 5'UTR izler, burada ekson l ("Exl"),
murin ("m") ve insan ("h") CMV türevli dizilerin bir
hibritidir ve burada ekson 2 ("Ex2") ve intron A dizisi ("Int
A") hCMV dizisinden türetilir. ß-laktamaz seçim markörü geni
farkli kimerik promotör regülatör dizileri klonlamak için bir
hedef vektör olarak kullanilir.
Sekil 2, her biri sirasiyla "Ex2" bölgelerinin 3' klonlama
alanlari ve poliadenilasyon alanlari ("pA") arasinda yer alan
fare-insan kimerik monoklonal antikorunun (mAb) cB hafif
("LC") ve agir ("HC") Zincirlerini kodlayan ekspresyon
vektörü pRY57'i (SEQ ID. NO: 2) göstermektedir. Aksi halde,
pRY57, pRY42 ile aynidir. pRY57'nin LC ve HC nükleik asit
dizileri çikarilmis ve orijinal mCMV promotör dizisinin
burada tarif edilen farkli kimerik promotör regülatör diziler
ile degistirildigi pRY42 varyantlarina klonlanmistir
Sekil 3, pRY42 (üst) içinde yer alan orijinal mCMV promotör
dizisinin (SEQ ID. NO: 3) yani sira bulusun bir parçasi
olmayan ve simian (sCMV) ve/ veya insan (hCMV) CMV IEl
bölgesinden güçlendirici elemanlarin 3' kisminda
konumlandirilan murin CMV IEl (mCMV) promotör dizileri içeren
bes farkli kimerik promotör regülatör diziyi (yapilar “1 ila
”), yani sirasiyla SEQ ID. No:7 ila SEQ ID. NO:11'i
göstermektedir. Ayrica, burada tanimlandigi haliyle iki ek
kimerik promotör regülatör dizi (yapilar "6 ve 7") (SEQ ID.
NO: 12 ve SEQ ID. NO: 13) gösterilmektedir, ki bunlar, sCMV
ve/ veya insan hCMV IEl bölgesinden olan güçlendirici
elemanlarin 3` kisminda yer alan hCMV IEl promotör dizilerini
içerir. Burada spesifik olarak kullanilan tüm mCMV ve hCMV
promotör dizileri, 3'-uçlarinda, transkripsiyonel baslangiç
alanini temsil eden ek bir guanosin ("G") nükleotitini
Sekil 4, mAb dizilerinin gen ekspresyonunun, Sekil 3'te
gösterildigi gibi, kimerik yapilar 1 ila 5'in (mevcut bulusun
bir` parçasi olmayan) kontrolü altinda oldugu kalimli CHO
hatlarinda üretilen mAb cB72.3 konsantrasyonlarinin bir
karsilastirmasini göstermektedir. Belirleme, beslenen parti
asiri büyümesi (FOG) protokolü kullanilarak E250 sallama
sisesi kültüründe 50 ml'lik büyüme ortaminda 15 günlük bir
büyümeden sonra Protein A HPLC ile gerçeklestirilmistir.
Kimerik yapilarin her biri için, n = 4, yapi 4 hariç olmakla
beraber ve n = 6 (üç kopya transfeksiyon için FOG analizi)
ve pRY57 (orijinal mCMV), n = 8 oldugunda, deney 1 ve Z'den
gelen veri noktalarinin birlestirilmis olmasi ile beraber
çift transfeksiyon için çift beslemeli parti analizini temsil
etmektedir.
Sekil 5, mAb dizilerinin gen ekspresyonunun, Sekil 3'te
gösterildigi gibi, kimerik yapilar 6 ve 7'nin kontrolü
altinda oldugu kalimli CHO hatlarinda üretilen mAb cB72.3
konsantrasyonlarinin bir karsilastirmasini göstermektedir.
Belirleme, parti asiri büyümesi (BOG) protokolü kullanilarak
E125 sallama sisesi kültüründe 30 ml'lik büyüme ortaminda 7
günlük bir büyümeden sonra Protein A HPLC ile
gerçeklestirilmistir. mCMV ve yapi 7 için, n = 6 (üç kopya
transfeksiyonu için çift parti analizi) ve yapi 6 için, n =
4 (çift transfeksiyon için çift parti analizi).
BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI
Mevcut bulus, eksprese edilecek olan nükleik asit dizisinin
transkripsiyonel baslangiç alanina islevsel olarak bagli olan
belirli bir hCMV IEl promotör diziden olusmakta olan kimerik
(yani hibrit) promotör regülatör diziyi içeren memeli
ekspresyon vektörlerinin ve 5' kisminda konumlandirilmis olan
ve yalnizca mCMV promotör dizilere dayanan mevcut ekspresyon
sistemlerine kiyasla özellikle gelistirilmis gen ekspresyon
oranlari ile sonuçlanan mCMV veya hCMV promotör dizisine
islevsel olarak bagli olan belirli bir sCMV IEl veya sCMV/ hCMV
proteinlerin çok daha yüksek (neredeyse 3-kat artisa)
verimlerinin beklenmedik kesfine dayanmaktadir.
Buna göre, burada tanimlanan memeli ekspresyon vektörleri,
özellikle de endüstri ölçegindeki rekombinant proteinlerin
üretimi için üstün moleküler araçlari temsil etmektedir.
Bu tarifnamede ve istemlerde "içeren" terimi kullanildiginda,
diger elemanlari veya adimlari hariç tutmaz. Mevcut bulusun
amaçlari için, "olusur" teriminin, "içeren" teriminin tercih
edilen bir uygulamasi oldugu düsünülmektedir. Buradan sonra,
bir grup en azindan belirli sayida uygulamayi içerecek sekilde
tanimlanmissa, bunun, tercihen sadece bu uygulamalardan olusan
bir grubu açikladigi anlasilmalidir.
Örnegin, "bir" veya "bu" gibi tekil bir isme atifta bulunurken
belirsiz veya kesin bir maddenin kullanildigi hallerde, bu,
aksi belirtilmedikçe, ismin çogul bir halini de içerir.
Sayisal degerlerin mevcut bulus kapsaminda belirtildigi
durumda, teknikte uzman kisi, söz konusu özelligin teknik
etkisinin, tipik olarak ±%lO ve tercihen %± 5 olan sayisal
degerin bir sapmasini kapsayan bir dogruluk araligi içinde
saglandigini anlayacaktir.
Ayrica tarifnamede ve istemlerdeki, birinci, ikinci, üçüncü,
(a), (b), (c) ve benzeri terimler, benzer elemanlar arasinda
ayrim yapmak için kullanilir ve sirali veya kronolojik bir
düzeni tanimlamak için zorunlu degildir. Bu sekilde kullanilan
terimlerin uygun kosullar altinda birbirinin yerine
geçebilecegi ve bu tarifnamede anlatilan bulusun
uygulamalarinin burada tarif edilen ya da burada
gösterilenlerden baska dizilerde de islev görebilecegi
anlasilmalidir. Terimlerin kullanildigi baglamda, bir terimin
diger tanimlari da verilecektir. Asagidaki terimler veya
tanimlar sadece bulusun anlasilmasina yardimci olmak için
saglanmistir. Bu tanimlarin, teknikte uzman bir kisi tarafindan
anlasildigindan daha az bir kapsami olmasi gerektigi
düsünülmemelidir.
Bir yönüyle bu bulus, memeli hücrelerindeki ilgi konusu bir
nükleik. asit dizisinin heterolog ekspresyonuna yönelik. bir
ekspresyon vektörü ile ilgilidir; vektör, eksprese edilecek
olan bir birinci nükleik asit dizisine islevsel olarak baglanan
bir birinci kimerik promotör regülatör diziyi içerir; burada
kimerik promotör regülatör dizi, sunlari kapsar:
(i) SEQ ID. NO: 5'ten olusan sitomegalovirüs IEl
promotöründen gelen ve eksprese edilecek nükleik asit
dizisinin transkripsiyonel baslangiç bölgesine islevsel
olarak bagli olan promotör bir dizi; ve
(ii) simian sitomegalovirüs IEl bölgesinden veya insan ve
simian sitomegalovirüs IEl bölgelerinden bir kimera temsil
eden güçlendirici bir dizi; güçlendirici dizi, promotör
dizinin 5' kisminda yer alir ve insan promotör dizisine
islevsel olarak baglidir, burada güçlendirici dizi, SEQ ID.
NO: 6'nin nükleotit dizisini içerir.
Baska bir deyisle, burada tanimlandigi gibi kimerik promotör
regülatör dizinin, hem insan sitomegalovirüsünden hem de simian
sitomegalovirüsünden dizi elemanlari içermesinin saglanmasi,
talep edilen konunun sadece insan sitomegalovirüsünden
türetilen kimerik yapilari içermedigini garanti eder.
Burada kullanilan "ekspresyon vektörü" terimi, en az bir
nükleik asit araci (plazmid) anlamina gelir. Burada
kullanildigi sekliyle "ekspresyon kaseti" terimi, ilgi konusu
bir nükleik asit dizisinin (yani "heterolog" bir nükleik asit
dizisi) gen ekspresyonuna izin veren bir genetik yapiya atifta
bulunmaktadir. Bu, transkripsiyon ve/ veya translasyon
regülasyonuna iliskin bilgileri içeren regülatör dizi
elemanlarini ve bu regülatör dizilerin ilgi konusu nükleik asit
dizisine "islevsel olarak bagli” olmasini gerektirir. Islevsel
bir baglanti, regülatör dizi elemanlarinin ve eksprese edilecek
olan nükleik asit dizisinin, gen ekspresyonunu mümkün kilacak
sekilde baglandigi bir baglantidir.
Gen ekspresyonunun kontrolü ve gerçeklestirilmesi için gerekli
olan bir "ekspresyon kasetinin" regülatör bölgelerinin kesin
dogasi, türler arasinda degisebilir, fakat genel olarak bu
bölgeler, promotör regülatör dizileri (yani ilgi konusu nükleik
asit dizisinin 5' (“yukari akisi”) kisminda bulunan bir dizi
bölgesi) ve 3'-dönüstürülmemis regülatör dizileri (yani ilgi
konusu nükleik, asit dizisinin 3' ("asagi akisi") kisminda
bulunan bir dizi bölgesi) içerir.
Burada kullanilan "promotör" terimi ("çekirdek promotörü"
olarak da anilir), transkripsiyonun baslamasini kendi basina
dogrudan yönlendiren dizi elemanlarini belirtir (örnegin,
transkripsiyon faktörleri ve DNA'ya bagimli RNA-polimeraz için
baglanma bölgeleri, TATA kutusu, CAAT dizileri ve 5'-kapaklama
elemanlari). Transkripsiyon baslangicini desteklemenin bu
islevselligi muhafaza edildiginde veya büyük oranda muhafaza
edildigi (ör., vahsi tip aktivitenin en az %70'i, en az %80'i,
en az %90'i veya en az %95'i, yani tam uzunlukta bir dizinin
aktivitesi) sürece, (dogal olarak olusan) vahsi tip bir
promotör' dizisinin. herhangi bir kesilmis, mutasyona ugramis
veya baska bir sekilde degistirilmis varyantlari da yukaridaki
tanim dahilindedir. Burada kullanildigi sekliyle "çekirdek
promotör" terimi, promotör aktivitesini muhafaza eden minimal
uzunluktaki bir diziyi ifade eder. Burada kullanildigi
sekliyle, promotör dizi, eksprese edilecek olan nükleik asit
dizisinin transkripsiyonel baslangiç alanina islevsel olarak
baglanir.
Istem 1'de belirtildigi gibi mevcut bulusun ekspresyon
vektörleri, sonuçta insan sitomegalovirüs (hCMV) IEl
promotöründen belirli bir (çekirdek) promotör diziyi kapsayan
bir birinci (kimerik) promotör (bir ekspresyon kasetinin bir
parçasi olarak) regülatör diziyi (yani, en azindan bir adet
böyle bir dizi) içerir (You, C.Y. ve ark. (1992) Intervirology
1238-1250).
HCMV IEl promotörü, teknikte iyi bilinmektedir ve NCBI Viral
Genomes veritabaninda erisim numarasi NC_OO6273
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Genome- sHome; supra)ile
saklanmis olan hCMV genomundan kolaylikla türetilebilmektedir.
Burada tanimlanan ekspresyon vektörlerinde yer alan hCMV IEl
promotör dizisi, SEQ ID. NO: 5'te gösterildigi gibi 117 bp
uzunlugunda bir nükleik asit dizisine (ayrica "çekirdek
promotör" olarak da anilir) sahiptir.
101 gctcgtttag Lgdaccg
SEQ ID. NO: 5, 3' ucunda, transkripsiyonel baslangiç alanini
temsil eden ek bir guanosin ("G") nükleotidini içerir.
Ayrica, bir ekspresyon kasetinin promotör regülatör dizileri
genellikle "güçlendirici" bir dizi içerir. Burada kullanildigi
sekliyle "güçlendirici" terimi, eksprese edilecek olan nükleik
asit dizisi ile iliskili olarak konumu ve yönelimi ne olursa
olsun bir nükleik asit dizisinin transkripsiyonunu güçlendiren,
iyilestiren veya gelistiren dizi elemanlarini belirtmektedir.
Bir güçlendirici, transkripsiyonu, tek bir promotörden veya
ayni anda birden fazla promotörden güçlendirebilir.
Transkripsiyonu gelistirmenin bu islevselligi muhafaza
edildiginde veya büyük oranda muhafaza edildigi (ör., vahsi tip
(dogal olarak olusan) vahsi tip bir güçlendirici dizinin
herhangi bir kesilmis, mutasyona ugramis veya baska bir sekilde
degistirilmis varyantlari da yukaridaki tanim dahilindedir.
Istem 1'de belirtildigi gibi mevcut bulusun ekspresyon
vektörleri, ilgili birinci (kimerik) promotör regülatör
dizisinde (bir ekspresyon kasetinin parçasi olarak) simian
sitomegalovirüs (sCMV) IE bölgesinden veya insan
sitomegalovirüsünden (hCMV) ve simian sitomegalovirüs (sCMV)
güçlendirici dizi içerir (Meier, J.L. ve Stinski, M.F. (1996)
dahilinde, promotör regülatör dizi, sadece sCMV'den veya hCMV
ve sCMV'den dizilerinden olusan kimerik bir güçlendirici
diziden güçlendirici bir dizi içerebilir. Promotör regülatör
dizi içinde, güçlendirici diziler hCMV (çekirdek) promotör
dizilerinin 5' (yani "yukari akis") kisminda bulunur ve
islevsel olarak insan promotör dizisine baglanir. Tipik olarak,
güçlendirici diziler, promotör diziler ile ayni yönde
düzenlenir. Bununla birlikte, spesifik uygulamalarda, yukari
akis bölgesi ve/ veya güçlendirici diziler, promotör dizilere
göre ters yönde düzenlenir.
HCMV ve/ veya sCMV IEl güçlendirici dizileri, teknikte iyi
bilinmektedir ve NCBI Viral Genomes veritabaninda sirasiyla
genomlarindan kolaylikla türetilebilmektedir.
Istem 1'de belirtildigi gibi ekspresyon vektörlerinde yer alan
güçlendirici dizi, SEQ ID. NO: 6'da gösterildigi gibi, sCMV IE1
güçlendirici bölgesinden türetilen 452 bp'lik uzunluktaki
nükleotid dizisini içerir.
3D1 gcçaLachc aggatcßaia ;aLaggcaaL aLccaaLaLg gccctatgcc
Gül 3: atîi~a azatrqqî l i 1*ttc=" qLaqaLaqcc ::Lcccaatg
451 gg
Bazi uygulamalarda, SEQ ID. NO: 6'nin nükleik asit dizisi,
sCMV IEl bölgesinden, daha uzun bir dizi elemaninin ayrilmaz
bir parçasidir (örnegin, SEQ ID. NO: 13). Diger bazi
uygulamalarda, sCMV IEl bölgesinden SEQ ID. NO: 6 dizisine sahip
olan dizi elemani, hCMV IE1 bölgesinden baska bir dizi elemani
ile kombinasyon halinde mevcuttur (bakiniz örn., SEQ ID. NO:
Özellikle tercih edilen uygulamalarda kimerik promotör
regülatör dizi, SEQ ID. NO:12 ve SEQ ID. NO:13'ten olusan
gruptan seçilen bir nükleotit dizisi içerir.
SEQ ID. NO: 7'ye göre kimerik promotör regülatör dizi (ayrica
mevcut bulusun bir parçasi olmayan "yapi 1" olarak da anilir)
olup, 1074 bp'lik bir toplam uzunluga sahiptir ve bir 582 bp
hCMV IE1 güçlendirici dizi ve mCMV IE1 güçlendirici diziden
(italik olarak gösterilmektedir) ve bir 492 bp mCMV IEl promotör
diziden (ayrica SEQ ID. NO: 3 olarak da adlandirilir) olusur.
SEQ ID. NO: 8'ye göre kimerik promotör regülatör dizi (ayrica
mevcut bulusun bir parçasi olmayan "yapi 2" olarak da anilir)
olup, 1128 bp'1ik bir toplam uzunluga sahiptir ve bir 1026 bp
hCMV IEl güçlendirici diziden (italik olarak gösterilmektedir)
ve bir 102 bp mCMV IEl “çekirdek” promotör diziden (ayrica SEQ
SEQ 1D. NO: 9'ye göre kimerik promotör regülatör dizi (ayrica
mevcut bulusun bir parçasi olmayan "yapi 3" olarak da anilir)
olup, 509 bp'lik bir toplam uzunluga sahiptir ve bir 407 bp
hCMV IE1 güçlendirici diziden (italik olarak gösterilmektedir)
ve bir 102 bp mCMV IE1 "çekirdek” promotör diziden (ayrica SEQ
501 tcggtaccg
SEQ ID. NO: 10'ye göre kimerik promotör regülatör dizi
mevcut bulusun bir parçasi olmayan "yapi 4" olarak da anilir)
olup, 961 bp'lik bir toplam uzunluga sahiptir ve bir 452 bp
hCMV IEl güçlendirici dizi
gösterilmektedir)
iüttüîuîtq
TQLCQSLEP“
(ayrica SEQ ID. NO:
mevcut bulusun bir parçasi olmayan
(kalin olarak gösterilmistir;
407 bp hCMV IEl güçlendirici diziden
ve bir 102 bp mCMV IEl
4 olarak da adlandirilir)
JLjdgLJGCC
ll'ye göre kimerik promotör regülatör dizi
(italik olarak
promotör
da anilir)
olup, 909 bp'lik bir toplam uzunluga sahiptir ve bir 807 bp
SCMV IEl güçlendirici diziden (kalin olarak gösterilmistir; SEQ
mCMV lEl promotör diziden (ayrica SEQ ID. NO: 4
olarak da adlandirilir)
901 tcggtaccg
SEQ ID. NO: lZ'ye göre kimerik promotör regülatör dizi (ayrica
mevcut bulusun bir parçasi olmayan
SCMV IEl güçlendirici diziden
gösterilmistir)
NO: 6'ya sahiptir),
promotör
bir 407 hp hCMV IEl güçlendirici
(italik olarak gösterilmektedir)
olusmaktadir.
olarak da anilir)
976 bp'lik bir toplam uzunluga sahiptir ve bir 452 hp
(kalin olarak gösterilmektedir ve
117 bp hCMV
ggCQÇgLLêÇ
Lu bu `_r I ._ gür,
.' ;71:11:71. (Icaa I. L]
+- 4- -'- -' s'- 1-
LLtubtabru
isçgtiyhi;:;L : :
ÇLââdIQQCC
astaaîgacg
Lg'L pciçî'. &AJ-,hint
l.`;L1k7`4YLLZL 'IJ
fisi- L IIILTÇ
mevcut bulusun bir parçasi olmayan
çizili SEQ ID. NO:
promotöründen
(ayrica SEQ ID.
6 olan kisim)
1! yapi
924 bp'lik bir toplam uzunluga sahiptir ve 807 bp sCMV
l3'ye göre kimerik promotör regülatör dizi
(kalin olarak gösterilmistir;
olarak da anilir)
ve bir 117 hp hCMV "çekirdek"
olarak gösterilmistir)
Burada tanimlanan "ekspresyon kasetinin" 3'regü1atör dizileri
tipik olarak transkripsiyon sonlandirma, poliadenilasyon veya
benzerlerinde yer alan regülatör elemanlari kapsar. Bununla
birlikte, bu sonlandirma dizileri, belirli bir konakçi hücrede
tatmin edici derecede fonksiyonel degilse, o hücrede
fonksiyonel olan sinyaller ile ornatilabilirler. Böyle bir
arasinda, digerlerinin yani sira iç ribozom giris alanlarinin
(IRES; "polikistronik" nükleik asit dizilerinin ekspresyonuna
izin verir) yani sira, dogal polipeptidi bir konakçi hücrenin
spesifik bir bölmesine hedeflemek için dönüstürülmüs sinyal
dizileri yer alir. CHO hücreleri için uygun örnek sinyal
Teknikte uzman olan kisi, tüni bu regülatör elemanlarin ve
belirli bir hücresel ortamda bir nükleik asit dizisinin
ekspresyonu için uygun olan bu elemanlarin nasil seçileceginin
de farkindadir.
Mevcut bulusun ekspresyon vektörü, örnegin bir plazmid,
kozmid, fajmid, yapay kromozom veya genetik mühendisliginde
yaygin olarak kullanilan baska bir araç olabilir.
Bu tür ekspresyon vektörleri tipik olarak, nükleik asit
dizilerinin eklenmesini ve/ veya Çikarilmasini kolaylastirmak
için yukarida tarif edilen regülatör dizileri, bir veya daha
fazla çoklu klonlama bölgesini kapsayan bir veya daha fazla
tarif edilen ekspresyon kasetlerinin yukari ve asagi akis
yönüne yerlestirilebilir, böylece tüm kasetin degistirilmesine
izin verilir. Çoklu klonlama bölgeleri, promotör regülatör
dizilerin asagi akisinda ve 3'-regülatör dizilerin yukari
akisinda bu tür bir ekspresyon kasetinin içine
yerlestirilebilir, böylece eksprese edilecek olan bir nükleik
asit dizisinin eklenmesine veya yer degistirmesine izin
verilir. Stabil transfeksiyonlar için (asagiya bakiniz),
ekspresyon vektörleri ayrica, konakçi hücrenin genomunda
rekombinasyonu ve kararli entegrasyonu kolaylastirmak için
alana özgü integrazlar veya rekombinazlar için tanimlama
dizileri içerebilir.
Ek olarak burada tanimlanan ekspresyon vektörleri tipik
olarak, replikasyon vektörünün otonom replikasyon/ epizomal
bakimini saglamak için kullanilan konakçi hücre ile uyumlu bir
türden türetilen kontrol dizilerinin yani sira replikasyonun en
az bir kaynagini içerir (özellikle, geçici transfeksiyonlarda
kullanim için; asagiya bakiniz). Memelilerde replikasyonun
örnek kökenleri arasinda SV4O ve EBV replikasyonunun kaynagi
yer alir. Birden fazla replikasyon kaynagini içeren özel olarak
tasarlanmis ekspresyon vektörleri (yani, mekik vektörleri),
bakteriyel ve hayvansal hücreler gibi farkli konaklar arasinda
geçise izin verir. Prokaryotik hücreler için replikasyonun
uygun kökenleri arasinda, örnegin, ColEl ve Ml3
replikasyonlarinin kökenleri bulunmaktadir.
Ayrica, burada tanimlandigi gibi bir ekspresyon vektörü,
transfekte edilmis hücreler üzerinde seçilebilir bir fenotip
sunan bir veya daha fazla seçim markörü içerebilir. Uygun seçim
markörleri, digerlerinin yani sira higromisin B fosfataz geni,
timidin kinaz geni, ornitin dekarboksilaz geni, dihidrofolat
redüktaz geni ve glutamin sentaz geni içerir. Tercihen,
glutamin sentaz (GS) geni kullanilir (Cockett, D.K. ve
Rekombinant ekspresyon vektörlerini tasarlamak Ve/ veya
modifiye etmek için kullanilabilen çok sayida yöntem, teknikte
iyi bilinmektedir (bkz., ör., Sambrook, J., ve Russel, D.W.
(2001), Molecular cloning: A laboratory manual (3. baski) Cold
Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press;
Ausubel, F.M. ve ark. (2001) Current Protocols in Molecular
Biology, Wiley & Sons, Hoboken, NJ, ABD). Çok sayida uygun
memeli ekspresyon vektörü de ticari olarak temin edilebilir ve
belirli bir ortamda ilgi konusu bir nükleik asit molekülünü
eksprese etmek için hangi vektörlerin uygun oldugunu
belirleyebilen uzman kisi tarafindan iyi bilinir. Bu tür
vektörlerin örnekleri arasinda, digerlerinin yani sira pcDNA3,
pFRT, pTARGET, pSVZ-dhfr ve ayrica asagida açiklanan pRY42 (SEQ
Bulusun ekspresyon vektörleri kullanilarak eksprese edilecek
olan nükleik asit dizileri, monosistronik (yani füzyon
proteinleri dahil tek bir polipeptit veya protein kodlayan)
veya polistronik (yani iki veya daha fazla bireysel polipeptit
veya proteinleri kodlayan) olabilir.
Özel uygulamalarda ekspresyon vektörü, eksprese edilecek bir
(birinci) nükleik asit dizisine islevsel olarak bagli olan tek
bir (yani, birinci) kimerik promotör regülatör dizi içerir.
Diger özel uygulamalarda, ekspresyon vektörü ayrica, eksprese
edilecek olan ikinci bir nükleik asit dizisine islevsel olarak
bagli olan ikinci bir kimerik promotör regülatör dizi içerir;
burada ikinci kimerik promotör regülatör dizi, birinci kimerik
promotör regülatör dizi ile özdestir.
Alternatif uygulamalarda, ekspresyon vektörü ayrica, eksprese
edilecek olan ikinci bir nükleik asit dizisine islevsel olarak
bagli olan ikinci bir kimerik promotör regülatör dizi içerir;
burada ikinci kimerik promotör regülatör dizi, birinci kimerik
promotör regülatör diziden farklidir.
Belirli uygulamalarda, ekspresyon vektörü, eksprese edilecek
bir üçüncü nükleik asit dizisine islevsel olarak bagli olan
üçüncü bir kimerik promotör regülatör dizi içerir, burada
üçüncü kimerik promotör regülatör dizi, birinci ve/ veya ikinci
promotör regülatör dizi ile ayni olabilir veya hem birinci hem
de ikinci kimerik promotör regülatör diziden farkli olabilir.
Belirli baska uygulamalarda ekspresyon vektörü, üçten fazla
kimerik promotör regülatör dizi içerir.
Mevcut bulusun ekspresyon vektörleri kullanilarak eksprese
edilecek olan nükleik asit dizileri, özellikle örnegin
digerlerinin yani sira büyüme faktörleri, sitokinler
(interferonlar, interlökinler), hormonlar, tirozin kinazlar,
reseptörler (GPCR'ler), integrinler, transkripsiyon
faktörleri, kan pihtilastirma faktörleri, tek zincirli
antikorlar, antikor fragmanlari veya antikor benzeri moleküller
(anticalinler) ve benzerleri gibi ilgi konusu herhangi bir
polipeptit veya proteini kodlayabilir.
Burada tarif edilen ekspresyon vektörlerinin iki kimerik
promotör regülatör dizisi (ekspresyon kasetlerinin bir parçasi
olarak) içermesi durumunda, eksprese edilecek olan birinci ve
ikinci nükleik asit dizileri farkli polipeptidleri (veya
proteinleri) kodlar. Spesifik uygulamalarda farkli
polipeptitler, digerlerinin yani sira homomerik veya
heteromerik reseptör molekülleri, peptit hormonlari, DNA/ RNA
polimerazlari, hemoglobinler, asilar ve benzerleri gibi dimerik
veya multimerik bir proteinin alt birimlerini temsil eder.
Özellikle tercih edilen uygulamalarda, dimerik veya multimerik
protein, birinci alt birim olarak hafif zinciri ve ikinci alt
birim olarak agir zinciri içeren "klasik" bir antikor
molekülüdür. Antikor molekülü, dogal olarak meydana gelen veya
genetik olarak tasarlanmis, ya tam uzunluklu bir antikor ya da
bunun kesilmis bir varyanti (Fab fragmanlari, Fab' fragmanlari,
F(ab')2 fragmanlari) olan bir antikor olabilir. IgG
immünoglobulin antikorlari özellikle tercih edilir. Spesifik
uygulamaya bagli olarak, antikor molekülleri kimerik (örnegin
murin/ insan), insanlastirilmis veya tamamen insan olabilir.
Iki kimerik promotör regülatör dizi içeren ekspresyon
vektörlerinin. kullanildigi diger uygulamalarda, eksprese
edilecek olan birinci ve ikinci nükleik asit dizisi, analiz
edilecek bir "hedef protein"i ve hedef proteinin örnegin
hücresel lokalizasyonu veya fonksiyonel aktivitesini izlemek
için uygun bir raportör` proteini (yesil flüoresan protein,
lusiferaz, alkalin fosfataz, ß-galaktosidaz ve yabanturpu
peroksidaz gibi) kodlar.
Farkli gen ekspresyon oranlari sergileyen iki (veya daha
fazla) kimerik promotör regülatör dizi kullanildiginda,
karsilik gelen ilgi konusu proteinlerin belirli molar
oranlarini üretmek mümkün olabilir.
Baska bir yönünde mevcut bulus, yukarida tanimlandigi gibi bir
ekspresyon vektörü ile transfekte edilmis bir memeli konakçi
hücre ile ilgilidir.
Uygun konakçi hücreler, herhangi bir memeli hücresi türü
içerir; hücreler, insan veya insan kaynakli olmayan
hücrelerdir. Insan kaynakli olmayan memeli hücreler arasinda,
digerlerinin yani sira fare, siçan, hamster, tavsan, kedi,
köpek, domuz, inek, at veya maymundan türetilen hücreler
Uygun memeli konakçi hücreler, insan Hela, MRC5 fibroblastlar,
983M melanom, HEK293, H9, MCF7 ve Jurkat hücreleri gibi
ölümsüzlestirilmis hücre dizilerini; MDCK köpek soyundan böbrek
hücreleri; Sprague-Dawley siçanlarindan izole edilen RF
kültürlü siçan akciger fibroblastlari; murin NIH3T3, C127, P815
mastositoma, MT1A2 meme adenokarsinomu ve L hücreleri; simian
COSl ve COS7 hücreleri, bildircin @Cl-3 hücreleri; ve Çin
hamsteri yumurtalik (CHO) hücreleri veya hücre hatlarini
Tercih edilen uygulamalarda, kullanilan konakçi hücreler CHO
hücreleri veya CHO hücre hatlaridir.
Uygun CHO hücre hatlari, digerlerinin yani sira CHO KI (Tjio,
özellikle CHOKl SV (Lonza Ltd. Basel, Isviçre) içerir. CHOKl
SV, glutamin sentetaz (GS) gen ekspresyon sistemini kullanan
bir süspansiyon, protein içermeyen uyarlanmis CHOKl türevidir:
pozitif transfektanlar, metionin sülfoksiminin ve glutamin
içermeyen ortamin ikili seçimi altinda elde edilmistir.
Tüm bu konakçi hücreler veya hücre hatlari, çesitli ticari
tedarikçilerden. oldugu. gibi .Amerikan, Tip Kültür` Koleksiyonu
(Manassas, VA, ABD) veya Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen (Braunschweig, Almanya) gibi depolardan elde
edilebilir. Yine bu bulus içinde birincil memeli hücreleri,
yani bir organizmadan dogrudan elde edilen hücreler
(digerlerinin yani sira blastositler, embriyolar, larva
asamalari ve yetiskinler dahil olmak üzere herhangi bir gelisim
asamasinda) vardir. Uygun birincil hücrelerin örnekleri,
kardiyomiyositler, birincil hepatositler, fibroblastlar,
nöronal hücreler ve ayrica kök hücreleri içerir. Ayrica mevcut
bulusun dahilinde olan, birincil hücrelerden türetilmis
ölümsüzlestirilmis stabil hücre hatlaridir. Bazi
uygulamalarda, mevcut bulusun konakçi hücresi, çok hücreli bir
organizmanin bir parçasini olusturur. Mevcut bulus dahilinde,
eklenen ekspresyon vektörü, konakçi hücrede, bagimsiz bir
genetik birim (yani epizomal olarak) (burada "geçici
transfeksiyon" olarak da adlandirilir) olarak çogaltilabilir ve
muhafaza edilebilir veya vektör fragmanlari, konakçi hücrenin
genomuna stabil bir sekilde entegre olabilir (burada ayrica
genomun rastgele pozisyonlarinda homolog olmayan rekombinasyon
ile veya genomun spesifik pozisyonlarinda homolog rekombinasyon
ile veya alana özgü integrazlar ile gerçeklesebilir. Tercihen
vektör fragmanlari (eksprese edilecek olan heterolog nükleik
asit dizileri dahil), tek bir kopya olarak konakçi hücrenin
genomuna entegre edilir.
Burada tarif edilen ekspresyon vektörlerinin bir memeli
konakçi hücresine dahil edilmesi için, kullanilan belirli hücre
tipi için uygun olan herhangi bir transfeksiyon teknigi
kullanilabilir. Digerlerinin yani sira elektroporasyon,
kalsiyum fosfat es-çökeltme, kimyasal transfeksiyon (örn.,
siklodekstrin, DEAE-dekstran, polietilenimin), lipofeksiyon,
manyetofeksiyon ve "gen tabancasi" dahil olmak üzere birçok
transfeksiyon yöntemi teknikte iyi bilinmektedir (bkz., örn.,
Sambrook, J. ve Russell, D.W. (2001), supra; Ausubel, F.M. ve
ark. (2001), supra).
Yine baska bir yönüyle bu bulus, bir memeli konakçi hücredeki
ilgi konusu bir nükleik asit dizisinin heterolog ekspresyonuna
yönelik bir yönteme iliskin olup, asagidakileri içerir:
(i) memeli konakçi hücrenin yukarida tanimlandigi gibi
bir ekspresyon vektörü ile transfekte edilmesi; ve
(ii) transfekte edilmis memeli konakçi hücrenin, ilgi
konusu nükleik asit dizisinin ekspresyonuna izin veren
kosullar altinda kültürlenmesi.
Baska bir deyisle, bu bulus ayrica, söz konusu polipeptidleri
veya proteinleri kodlayan karsilik gelen nükleik asit dizileri
içeren, burada tanimlandigi gibi bir ekspresyon vektörü ile
transfekte edilen, memeli konakçi hücrelerindeki ilgi konusu
polipeptitler veya proteinlerin rekombinant (yani heterolog)
üretimi için bir prosese yöneliktir. Transfeksiyon, tek bir
sentezleme vektörüyle veya iki veya daha fazla farkli
ekspresyon vektörü ile es-transfeksiyon olarak
gerçeklestirilebilir.
Yukarida özetlendigi gibi, memeli konakçi hücrenin geçici veya
stabil transfeksiyonu için çesitli yöntemler mevcuttur. Tercih
edilen uygulamalarda transfeksiyon, hücrelerin veya hücre
hatlarinin, ilgili polipeptidleri veya ilgili proteinleri
kodlayan heterolog nükleik asit dizilerini sürekli olarak
eksprese etmek için olan stabil transfeksiyonudur. Bazi
uygulamalarda, yöntem ayrica, üretilen rekombinant
polipeptitleri veya proteinleri hasat etme (ve istege bagli
olarak saflastirma) asamasini da içerir. Bahsedilen
polipeptitlerin veya proteinin dogasina bagli olarak, konakçi
hücre zarina entegre edilmis hücre içi süpernatant içine
salinabilir veya hücre içi bir bölmede kalabilirler.
Tipik olarak, tek hücreli bir memeli konakçi hücresi
kullanilirsa, teknikte uzman kisi, ilgili nükleik asit
dizisinin ekspresyonunu saglayan çesitli hücre kültürü
kosullarina dönebilir. Elverisli olarak, üretilen polipeptitler
veya proteinler, kültür ortamindan, kültürlenmis hücrelerin
lizatlarir veyar ekstraktlarindanr veyar digerlerinin _yani sira
tuzlar veya organik çözücüler ile parçalanmis çökeltme, iyon
degistirme kromatografisi, jel kromatografisi, boyut dislama
kromatografisi, HPLC, afinite kromatografisi gibi bilinen
tekniklerle izole edilmis (biyolojik) zarlardan hasat edilir
(ve istege göre arindirilir) (bkz, ör., Sambrook, J., ve Russel,
D.W. (2001), supra). Konakçi hücre, çok hücreli bir
organizmanin bir parçasi oldugunda, bu hücrelerin bir kismi,
bulusun peptidini izole etmek için kaynak olarak hizmet
edebilir. Uygun kültür ortami ve yukarida tarif edilen konakçi
hücreler için kosullar, teknikte iyi bilinmektedir (örnegin,
Fresney, R.l (2000) Culture of Animal cells. A manual (4. Baski)
Wiley-Liss, New York). Kullanilan, konakçi hücrenin. spesifik
büyüme gereksinimlerine bagli olarak, memeli hücre kültürü,
örn., RPMI 1640 ortami, Ham's Fl2 ortami veya DMEM'de
(Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortami) gerçeklestirilebilir.
Alternatif olarak, Opti MEM gibi düsük serum konsantrasyonuna
sahip bir büyüme ortami kullanilabilir. Ortam. istege bagli
olarak %10 (hacim/ hacim) PCS (fetal buzagi serumu), çesitli
büyüme faktörleri, amino asitler, antibiyotikler ve diger katki
maddeleri ile desteklenebilir. CHO hücreleri için özel olarak
uyarlanmis hücre kültürü ortami, örn., EP 0 481 791 B1 ve EP l
525 320 Bl'de.tarif edilmistir. Transfekte edilmis memeli
konakçi hücreleri, %5'lik bir COz'de, su bakimindan doygun
atmosferinde 37 °C'de inkübe edilebilir. Ilgili büyüme ortami,
kitler ve reaktifler çesitli tedarikçilerden ticari olarak
temin edilebilir.
Baska bir yönüyle bu bulus, bir memeli konakçi hücredeki ilgi
konusu nükleik asit dizisinin heterolog in vitro ekspresyonu
için yukarida tanimlandigi gibi bir ekspresyon vektörünün
kullanimi ile ilgilidir. Tercihen, ilgili nükleik asit dizisi,
teshis veya terapötik uygulamalar için amaçlanan bir
polipeptidi veya proteini kodlayabilir. Tercih edilen
uygulamalarda ekspresyon vektörü, ayri kimerik promotör
regülatör dizilerinin kontrolü. altinda ekspresyon vektörüne
eklenen iki veya daha fazla ilgi konusu nükleik asit dizisinin
es zamanli in vitro ekspresyonu için kullanilir. Örnegin, bir
ekspresyon vektörü, ilgi konusu genin hücresel hedeflemesini
ve/ veya islevselligini izlemek için bir raportör gen ile
birlikte ilgi konusu bir genin ekspresyonu için kullanilabilir.
Özellikle tercihen, ekspresyon vektörü, bir dimerik veya
multimerik proteinin alt birimlerini, örnegin bir antikor
molekülünün veya bir asinin alt biriminin hafif ve agir
Zincirlerini kodlayan iki veya daha fazla ilgi konusu nükleik
asit dizisinin es zamanli ekspresyonu için kullanilir. Farkli
gen ekspresyon oranlariyla sonuçlanan farkli kimerik promotör
regülatör dizilerin kullanilmasiyla, burada tanimlanan bir
ekspresyon vektörü, belirli bir (molar) oranda ilgi konusu iki
veya daha fazla nükleik asit dizisinin ekspresyonu için
kullanilabilir.
Spesifik bir uygulamada, burada tanimlanan ekspresyon
vektörleri, gen terapisi için ilaçlar (veya bir ilacin
parçalari veya kit parçalari) olarak kullanim içindir.
Bulus ayrica, sadece bu bulusun özel uygulamalarini göstermek
amaciyla olan sekiller ve asagidaki örneklerle açiklanmaktadir
ve bulusun kapsamini herhangi bir sekilde sinirlandirdigi
düsünülmemelidir.
ÖRNEKLER
Temelin izahi: Istemlerde belirtildigi gibi yedi farkli
kimerik promotör regülatör dizi, insan ve simian
sitomegalovirüs (hCMV ve sCMV) genomlarinin dizilerine dayali
olarak üretilmistir (bakiniz Tablo 1, Sekil 3). Bu yapilar, Çin
hamster yumurtalik (CHO) hücrelerinde bir monoklonal antikorun
hafif ve agir zincirlerinin (LC ve HC) heterolog gen
ekspresyonunu kontrol etmedeki etkinlikleri açisindan analiz
edilmistir.
Örnek 1: vektör yapisi
Gen sentezi, burada kullanilan yedi farkli kimerik promotör
regülatör yapiyi üretmek için kullanilmistir (yani 1-7
yapilari, burada 1-5 yapilari bu bulusun bir parçasini
olusturmaz). Yapilar, burada bulunan orijinal fare
sitomegalovirüs (mCMV) promotörlerinin (SEQ ID. NO: 3) yerine
geçmek için "bos" hedefleme vektörü pRY42'ye (Sekil 1, SEQ ID.
NO: 1) klonlama için hazir olacak sekilde saglanmistir. Ana
vektör pRY42, her biri bir promotör regülatör dizinin kontrolü
altinda olan (aslinda mCMV'den türetilmis) iki ekspresyon
kaseti içerir. Kimerik yapilar (bkz. Tablo 1, Sekil 3, SEQ ID.
NO: 7 ila SEQ ID. NO: 13; burada SEQ ID. NO: 7 ila SEQ ID. NO:
11 bu bulusun bir parçasini olusturmaz), promotör regülatör
dizileri kusatan 5' ve 3' kisimlarinda ek DNA.dizileri içerecek,
böylece, nükleik asit fragmanlarinin degisimini kolaylastirmak
için endonükleaz kisitlama bölgelerinin (yani, pRY42'de de
mevcut) dahil edilmesine izin verecek sekilde sentezlenmistir.
Tablo 1, burada tarif edilen kimerik promotör regülatör yapilar
l-7'de yer alan çesitli dizi elemanlarini göstermektedir, ki
burada 1-5 yapilari bu bulusun bir parçasi degildir.
Gösterilen, NCBI Viral Genomes veritabaninda belirtildigi gibi,
bireysel regülatör dizilerin ilgili uzunluklari ve genetik
konumlaridir (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesHome;
Özellikle, burada kullanilan tüm mCMV veya hCMV promotör
dizileri, 3'-ucunda transkripsiyonel baslangiç alanini temsil
eden ek bir guanosin ("G") nükleotitini içerir.
wmaNmHimamNmH H.mmNwoD Noa N
wmmmmaimmmNmH H.amNwwo Nmv H
Humumasc Eawauw
nmaumcacuoom :msacSN: >zus Hamw
Eoswm Hmua> Hmuz
Newmeaiamemna H.moveax NHH mewwimemm H.oomwm: wow ›
vmNweaiHmmmea a.moe›ax «Nm @Nmeimemm a.oomwmb wa w
emNweaiwqmmea H.moveax now @waimemm H.womwm: wa w
vmNwNHimwmmeH H.moqeax Nov i i i m
Mmmwnaimwmmma H.mow›Hx @Noa i i i N
memweaiNmNwea H.mov›Hx Nmm i i i H
EHWHuw :msacsN: Eawauw :msaczws
umaumchuoox >zos umaumcanuoom >zom Hamw
Eocwm HmHH> Hmuz socmm Hana› Hmoz
1-7 kimerik yapilari içeren yeni vektörlerin (bu bulusun hiçbir
Tablo 2'de
yapilari
olmayan 1-5
parçasi
gösterilen semaya göre dört yönlü bir ligasyon reaksiyonu ile
Antikor hafif zincir nükleik asit dizisinin
olusturulmustur.
ekspresyonu için kimerik promotör regülatör dizi,
mutasyona ugramis FRT (Flippase Tanima Hedefi) (FS-mFRT)
alaninin 3' kismina (yani "asagi akis") eklenmis, bunu,
zincirler arasi bir fragman ve antikor agir zincir nükleik asit
dizisinin ekspresyonu için kimerik promotör regülatör dizi
takip etmistir.
Ligasyon reaksiyonlari, üreticinin talimatlarina göre Rapid
DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Almanya)
kullanilarak gerçeklestirilmistir. edilen plazmid
vektörleri DHSa E. 0011 yetkin hücrelerine (Invitrogen/ Life
Technologies GmbH; Darmstadt, Almanya) dönüstürülmüstür.
Numuneler 50 pg/ ml ampisilin ile desteklenmis Luria-Bertani
(LB) agar üzerine kaplanmis ve gece boyunca 37 °C'de inkübe
edilmistir. 200 ml LB sivi ortam arti 50 ug/ ml ampisilin içeren
500 ml çalkalama siselerini inoküle etmek için tekil koloniler
kullanilmistir. Siseler gece boyunca 37 °C'de, 200 rpm'de
çalkalamali bir inkübatörde inkübe edilmistir. Elde edilen
kültürler, üreticinin talimatlarina göre bir Nucleobond Maxi
DNA'nin hazirlanmasi için kullanilmistir.
(Macherey-Nagel GmbH, DCiren, Almanya)
teshis kisitlama sindirimi ile dogrulanmistir.
olusturmadigi,
yapilarinin
mevcut
kullanilarak plazmid
Üretilen plazmidler
parçasini
kimerik promotör regülatör dizi yapilari l-7'yi
üretmek için olan klonlama semasini göstermektedir.
LC regülatörzincirler HC regülatörVektör
Yapi eleman arasi eleman omurgasi
l Aatll-Pacl Pacl-EcoRI EcoRI-Xhol Xhol-Aatll
2 Pvul-Sacll Sacll-EcoRI EcoRI-Bsu36lBsu361-Pvul
3 Sspl-Sacll Sacll-EcoRI EcoRI-Bsu36lBsu36l-Sspl
4 Sspl-Sacll Sacll-EcoRI EcoRI-Bsu36lBsu36l-Sspl
Sspl-Sacll Sacll-EcoRI EcoRI-Bsu36lBsu36l-Sspl
6 Sspl-Sacll Sacll-EcoRI EcoRI-Bsu36lBsu36l-Sspl
7 Sspl-Sacll Sacll-ECORI EcoRI-Bsu36lBsu36l-Sspl
Takip eden bir asamada,
(Whittle,
ve arkadaslari
(1987)
Protein Eng. l
lgG4 monoklonal antikoru cB72.3'ün
ve HC'si, 1-7 (mevcut bulusun bir parçasi olmayan 1-5 yapilari
ile) kimerik yapilari içeren yedi vektörün her birine
klonlanmistir. Antikor Zincirlerini kodlayan nükleik asit
dizileri, EcoRl/HindllI (LC) ve BamHI / Nrul (HC) restriksiyon
fragmanlari olarak vektör pRY57'den (Sekil 2, SEQ ID. NO: 2)
türetilmistir` ve ayni restriksiyon endonükleazlarini
kullanarak, her* bir' promotör yapisi için `vektörlere sirali
olarak klonlanmistir. Kullanilan yöntemler yukarida tarif
edildigi gibidir. Elde edilen plazmid vektörleri, sirasiyla,
promotör bölgelerin tanisal kisitlama sindirimi ve DNA dizilimi
ile dogrulanmistir.
Örnek 2: Transfeksiyon ve hücre hatti yapisi
Tüni deneyler için (Lonza Ltd., Basel, Isviçre) süspansiyon
adapte edilmis Çin hamsteri yumurtalik hücre hatti CHOKlSV'den
türetilmis bir hücre hatti kullanilmistir. Bu hücre hattinda,
nükleik asit ekspresyon yapilari, konak hücrenin spesifik bir
genomik lokusuna ve alana özgü bir entegrasyon (SSI) sistemi
vasitasiyla tanimlanmis kopya sayisinda eklenir.
Entegrasyon için pozitif seçim, SSI alaninda mevcut olan bir
higromisin B direnç kasetinin islevsel restorasyonu ile
gerçeklestirilir. Ekspresyon yapisinin konak genomuna
entegrasyonu ayrica, ön-ilaç gansiklovirini toksik,
fosforillenmis bir nükleotit analoguna dönüstüren timidin kinaz
geninin bir kopyasini çikarir. Böylece, hücre hatti yapilanmasi
sirasinda higromisin B ve gansiklovirin eklenmesi, hedef
genomik lokusta entegrasyon için sirasiyla pozitif ve negatif
seçim basinçlari saglar.
Konakçi hücre hatti, dondurularak saklanmis siselerden yeniden
canlandirilmis ve alt kültürlenmistir. Tüm hücre kültürü, CD-
CHO ortaminda (Invitrogen/ Life Technologies GmbH; Darmstadt,
Almanya) gerçeklestirilmistir. Transfeksiyondan 48 saat önce,
hücreler, 0.3 x 106 hücre/ ml'lik bir nihai konsantrasyonda 30
ml CD-CHO ortaminda ekilmistir.
Transfeksiyonun yapildigi günde, 1.2 xlO7 hücre topaklanmis ve
45 ug pOG44 plazmidi (Invitrogen/Life Technologies GmbH;
Darmstadt, Almanya) ile es zamanli transfeksiyondan önce 1 ml
CD-CHO içinde yeniden süspanse edilmis ve her bir hedefleme
vektörünün (sirasiyla kimerik yapilar l-7'yi içerir) 5 ug'si,
0.4 cm'lik bir Bio-Rad GenePulser Xcell (tek darbe 300 V/ küvetinde elektroporasyon
kullanilarak gerçeklestirilmistir. pOG44 plazmidi, hedef
konumda FRT alanlarinda rekombinasyonu kolaylastirmak için
gerekli olan maya FLP rekombinaz (flippaz) için bir ekspresyon
kasetini kapsamaktadir. Tüm transfeksiyon deneyleri en azindan
çift olarak gerçeklestirilmistir.
Her bir elektroporasyon numunesi, bir T75 sisesinde (BD
Biosciences, Heidelberg, Almanya) 20 ml CD-CHO ortamina
aktarilmis ve 36.5 °C'de, nemlendirilmis bir inkübatörde statik
modda inkübe edilmistir (havada %5 (hacim, / hacim) CO2).
Transfeksiyondan 48 saat sonra pellet haline getirilmis (150 X
g, 5 dk) ve 200 ug/ ml higromisin B (pozitif seçim) içeren 20
ml CD-CHO ortami içinde yeniden süspanse edilmistir. Kültür
statik modda tutulmus ve 72 saat sonra ortam, 200 ug/ ml
higromisin B içeren taze CD-CHO ile degistirilmistir.
Ardindan, her 72 saatte bir canli hücre konsantrasyonu
belirlenmis ve ortam 200 ug/ ml higromisin B ve 3 uM gansiklovir
(negatif seçim) içeren 20 ml taze CD-CHO ile degistirilmistir.
T75 sisesindeki kültür, 9 x 106 hücre/ ml'lik bir toplam hücre
konsantrasyonuna eristiginde, kültür, 200 ug/ ml higromisin B
ve 3 uM gansiklovir içeren. 30 ml'lik CD-CHO'nun nihai bir
hacmine ayarlanmistir. Seyreltilmis olan her bir kültür daha
sonra bir El25 çalkalama sisesine aktarilmistir.
Örnek 3: "Promotör yapilar 1-5" (bu bulusun bir parçasi
olmayan) kullanilarak üretilen monoklonal antikorun
konsantrasyonunu belirlemek için beslenen parti asiri büyüme
(FOG) süspansiyon kültürü
Beslenen parti asiri büyüme (FOG) çalkalama sisesi analizi, WO
edildigi gibi gerçeklestirilmistir. Belirli bir transfekte
hücre süspansiyonu kültürü için tüm FOG deneyleri en azindan
çift halinde gerçeklestirilmistir.
Kisaca, transfekte edilmis hücreler, her biri 50 ml CM42/ SPE
büyüme ortami (Lonza Ltd., Basel, Isviçre) içeren 250 ml
çalkalama siselerinde 2 x 105 hücre/ ml'lik bir konsantrasyonda
ekilmis ve 140 rpm'de nemlendirilmis bir orbital çalkalama
inkübatöründe (havada %5 (hacim/ hacim) C02) 37 °C'de inkübe
edilmistir. Hücreler, kültürün 3. gününden baslayarak, amino
asitler ve izleyici elemanlarin karisimindan olusan bir besleme
ile beslenmistir. Günlük canliliklar ve canli hücre
konsantrasyonlari bir Cedex Automated Cell Viability Analyzer
(Otomatik Hücre Canlilik Analizi CIhazi) (Roche Diagnostics
GmbH, Mannheim, Almanya) kullanilarak belirlenmistir. Ortamdaki
antikor konsantrasyonu, kültürün 15. gününde Protein A-HPLC ile
belirlenmistir ("büyümüs" kültürlerin hasat edilmesi).
Örnek 4: Protein A-HPLC vasitasiyla üretilen monoklonal antikor
konsantrasyonu (mevcut bulusun bir parçasi olmayan "promotör
yapilar 1-5" kullanilarak)
cB72.3 lgG4 monoklonal antikorünün (mAb), farkli kimerik
yapilar l-5'in kontrolü altinda LC/ HC gen ekspresyon
kasetlerini barindiran ilgili hücre dizileri tarafindan
üretilen ve hücre kültürü ortamina salgilanan
konsantrasyonlari, Protein A-yüksek performansli sivi
kromatografisi (HPLC) ile belirlenmistir. Hücresiz
süpernatanlar (0.22 üm'lik bir filtre biriminden
geçirilmistir), bir Agilent 1200 HPLC'ye bagli bir POROS
Protein A Immünmodetleme Kolonu (Applied Biosystems Inc.,
Foster City, Ca, ABD) üzerine yüklenmistir. Kolon yikanmis ve
baglanmis mAb, çözücünün pH'inin düsürülmesiyle
ayristirilmistir.
mAb'nin konsantrasyonu, MabSelect SuRe-saflastirilmis (GE
Healthcare GmbH, Freiburg, Almanya) cB72.3 lgG4'ün (standart
egri araligi: 1025 ng/ üI ila 200 ng/ pl) seri seyreltileri ile
üretilen standart bir egri ile karsilastirilarak
belirlenmistir.
Yukaridaki deneylerin sonuçlari sirasiyla Tablo 13 ve Sekil
4'te özetlenmistir: burada kullanilan kimerik yapilarin her
biri için, n = 4, yapi 4 hariç olmakla beraber ve n = 6 (üç
kopya transfeksiyon için çift FOG analizi) ve pRY57 (orijinal
mCMV), n : 8 oldugunda, deney 1 ve 2'den gelen veri noktalarinin
birlestirilmis olmasi ile beraber çift yapili transfeksiyonlar
için çift FOG analizlerini temsil eder. Hücre kültürü
parametrelerinin hesaplamalari daha önce tarif edildigi gibi
gerçeklestirilmistir (Porter ve digerleri (2010) Biotechnol.
Sekil 4'ten, kültür hasadi günü (yani 15. gün), kimerik yapilar
2-5'in herhangi birinin kullaniminin, orijinal mCMV promotör
dizisinin (yani vektör pRY57) kullanimindan daha yüksek antikor
konsantrasyonlarinin 'üretilmesi ile sonuçlandigi açiktir. 1
numarali kimerik yapinin kullanimi ayrica, sonuç, yapilar 1-
'in mevcut bulusun bir parçasini olusturmadigi durumda
istatistiksel olarak anlamliliga ulasmasa bile, mCMV
promotöründen (1.3l'lik bir faktör) daha yüksek bir antikor
konsantrasyonu ile sonuçlanmistir.
En iyi sonuçlar, mCMV promotörüne kiyasla yaklasik 2.88 kat
daha yüksek gen ekspresyonuna neden olan kimerik 4 numarali
yapiyi takiben (azalan sirada) 5 numarali kimerik yapi
(2.54'lük bir faktör), 2 numarali kimerik yapi (1.80'lik bir
faktör) ve 3 numarali kimerik yapi (1.45'lik bir faktör) ile
elde edilmistir.
Tablo 3, burada kullanilan farkli transfekte konak hücre
dizileri tarafindan üretilen mAb'nin büyüme oranlarini ve
miktarlarini göstermektedir (bu bulusun hiçbir parçasi olmayan
kimerik promotör regülatör diziler/ yapilar 1-5'i içerir).
Maks. IVC (106
Transfektan havuzu/
FOG (106 u (1/sa› hücre.sa/pp(pg/ [mAb] (mg/i›
hücre/ ml) hücre.sa)
Açiklama: Maks. - Haksimum canli hücre konsantrasyonu (106
hücre/ m1); u-spesifik büyüme orani (1/ sa): IVC - canli hücre
konsantrasyonunun zaman integra1i (106 hücre-sa/ m1); pp,
mAb'nin spesifik üretim. orani (pg / hücre-sa); ve [mAb] -
hasatta üretilen mAb'nin konsantrasyonu (mg/ l).
Yukaridaki veriler, mCMV promotör elemanlari ile kombinasyon
halinde sCMV' ve/ veya hCMV yukari akis bölgesini ve/ veya
güçlendirici elemanlari içeren kimerik promotör regülatör
dizilerin kullaniminin, memeli hücreleri için yüksek verimli
heterolog gen ekspresyon sistemleri elde etmek için üstün
genetik araçlari temsil ettigini göstermektedir.
Örnek 5: "Promotör yapilar 6-7" kullanilarak üretilen
monoklonal antikorun konsantrasyonunu. belirlemek için. parti
asiri büyümesi (BOG) süspansiyon kültürü
Parti kültürleri, süspansiyon modunda 30 mL CD-CHO içeren
havalandirmali E125 siselerinde gerçeklestirilmistir (Kuhner 4
katmanli inkübatör, ve %
85 nem (hacim / hacim)). Kisaca, transfekte edilmis hücreler 2
x 105 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda ekilmis ve canli hücre
konsantrasyonlari kültür boyunca izlenmistir. Protein A HPLC
kullanilarak ortam içinde cB72.3'ün konsantrasyonunun
belirlenmesi için kültürün 7. gününde (yüksek kültür canliligi)
ortam numuneleri alinmistir. Belirli bir transfekte hücre
süspansiyonu kültürü için tüm BOG deneyleri en azindan çift
halinde gerçeklestirilmistir.
Örnek 6: Protein A-HPLC vasitasiyla üretilen monoklonal antikor
konsantrasyonu ("promotör yapilar 6-7" kullanilarak)
cB72.3 lgG4 monoklonal antikorunun (mAb), farkli kimerik
yapilar 6-7'in kontrolü altinda LC/ HC gen ekspresyon
kasetlerini barindiran ilgili hücre dizileri tarafindan
üretilen ve hücre kültürü ortamina salgilanan
konsantrasyonlari, Protein A-yüksek performansli sivi
kromatografisi (HPLC) ile belirlenmistir. Hücresiz
süpernatanlar (0.22 um'lik bir filtre biriminden
geçirilmistir), bir Agilent llOO HPLC'ye bagli bir POROS
Protein A Immünmodetleme Kolonu (Applied Biosystems Inc.,
Foster City, Ca, ABD) üzerine yüklenmistir. Kolon yikanmis ve
baglanmis mAb, çözücünün pH'inin düsürülmesiyle
ayristirilmistir.
mAb'nin konsantrasyonu, MabSelect SuRe-saflastirilmis (GE
Healthcare GmbH, Freiburg, Almanya) cB72.3 lgG4'ün (standart
egri araligi: 1025 ng/ uI ila 64 ng/ uI) seri seyreltileri ile
üretilen standart bir egri ile karsilastirilarak
belirlenmistir.
Yukaridaki deneylerin sonuçlari Sekil 5'de özetlenmistir: mCMV
ve yapi 7 için, n : 6 (üç kopya transfeksiyonu için çift parti
analizi) ve yapi 6 için, n = 4 (çift transfeksiyon için çift
parti analizi). Sekil 5'ten, kültürün '7. gününde, kimerik
yapilar 6 ve 7'nin herhangi birinin kullaniminin, orijinal mCMV
promotör dizisinin (yani vektör pRY57) kullanimindan daha
yüksek antikor konsantrasyonlarinin üretilmesi ile sonuçlandigi
açiktir.
En iyi sonuçlar, mCMV promotörüne kiyasla yaklasik 2.27 kat
daha yüksek mAb üretkenligi ile sonuçlanan kimerik promotör
yapisi 6 ile elde edilmistir.
Yukaridaki veriler, hCMV çekirdek promotör elemanlari ile
kombinasyon halinde SCMV ve/ veya hCMV yukari akis bölgesini
ve/ veya güçlendirici elemanlari içeren kimerik promotör
regülatör dizilerin kullaniminin, memeli hücreleri için yüksek
verimli heterolog gen ekspresyon sistemleri elde etmek için
üstün genetik araçlari temsil ettigini göstermektedir.
DIZI LISTESI
Lonza Biologics PLC
<120> Kimerik sitomegalovirüs promotörü ve güçlendirici
dizileri içeren ekspresyon vektörleri
<130> 827-1 PCT
<160> 15
<170> BiSSAP versiyon 1.1
<213> yapay dizi
<220>
<223> plazmid vektör pRY42
<220>
<223> SV4O poliA sinyali
<220>
< promotör fragman
<220>
< 5'UTR ekson 1'in bir kismi
<220>
< 5'UTR ekson l'in bir kismi
<220>
< intron A
<220>
<221 > 5'UTR
< 5'UTR ekson 2
<220>
<22l > poliA_sinyali
<223> SV4O poliA sinyali
<220>
<221 > promotör
türetilmistir
<220>
<22l > kaynak
< içinde yabani tip
FRT'nin yukari akisinda bulunan ATG bölgesini içeren
<220>
<221 > çesitli_rekombinasyonlar
pcDNAS-Frt (Invitrogen)'den türetilmistir
<220>
<221 > kaynak
<223> beta-laktamaz geminin ters tamamlayici CDS'si
<220>
<221 > çesitli_rekombinasyonlar
<220>
<221 > promotör
< promotör fragman
<220>
<221 > 5'UTR
<222>
(4902)...
<223> mCMV-MIE
<220>
<22]_ > 5'ITTR
<222>
(4947)...
<223> hCMV-MIE
<220>
<221 > intron
<222>
(5029)...
<223> hCMV-MIE
<220>
<221 > 5'UTR
<223>
hCMV-MIE
'UTR ekson 2
<4ÜC›1
(4935)
(5028)
(5855)
intron A
'UTR ekson 1'in bir kismi
'UTR ekson 1'in bir kismi
gLtlatdaLg
cqgtachqc
99CC99933C
<210> 2
<21l> 7948
<212> DNA
<213> yapay dizi
<220>
<223> plazmid vektör pRY57
<220>
<221 > CDS
<222> (67)...(713)
<223> gen optimize cB72.3 kappa hafif zincir
<220>
<221 > poliA_sinyali
<222> (720)...(958)
<223> SV4O poliA sinyali
<220>
<221 > promotör
<222> (979)...(l470)
< promotör fragman
<220>
<221 > 5'UTR
< 5'UTR ekson l'in bir kismi
<220>
<221 > 5'UTR
< 5'UTR ekson l'in bir kismi
<220>
<221 > intron
< intron A
<220>
<221 > 5'UTR
< 5'UTR ekson 2
<220>
<221 > CDS
<223> gen optimize cB72.3 gama-4 agir zincir
<220>
<221 > poliA_sinyali
<223> SV4O poliA sinyali
<220>
<221 > promotör
<'den türetilmistir
<220>
<221 > kaynak
<223> pFRT / lacZeo'daki yabani tip FRT'nin yukari akisinda bulunan
ATG bölgesini içeren dizi (Invitrogen)
<220>
<221 > çesitli_rekombinasyonlar
< alani, pcDNAS-Frt
<220>
<221 > kaynak
<222> (5259)...(6ll9)
<223> beta-laktamaz geninin ters tamamlayici CDS'si
<220>
<221 > çesitli_rekombinasyonlar
<220>
<221 > promotör
< promotör fragman
<220>
<221 > 5'UTR
<222> (6978)...
<223> mCMV-MIE
<220>
<221 > 5'UTR
<222> (7023)...
<223> hCMV-MIE
<220>
<221 > intron
<222> (7105)...
<223> hCMV-MIE
<220>
<221 > 5'UTR
<222> (7932)...
<223> hCMV-MIE
<400> 2
(7011)
(IE1) 5'UTR ekson 1'in bir kismi
(7108)
(IE1) 5'UTR ekson 1'in bir kismi
(7931)
(IE1) intron A
(7948)
(IE1)5'UTR ekson 2
Asp I1e G1n met Thr G1n ser Pro A1a Ser Leu Ser Va
9 c acc
G1u9 c
ggchLcatL
Gsygat
G1n va
A1d Ser
9933C99t9C
99CC9199C9
G1n Leu 61
n G1n Ser
9t99t99CCt
<2lO> 3
<211 >492
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 3
yapay dizi
99CC9C39t9
9939C999Ct
mCMV IEl promotör dizinin fragmani
<210>4
<211> 102
<212> DNA
<213> yapay dizi
<220>
<223> mCMV IEl promotör dizinin fragmani
("çekirdek promotör")
<400> 4
<210> 5
<211> 117
<212> DNA
<213> yapay dizi
<220>
<223> hCMV IEl promotör dizinin fragmani
("çekirdek promotör")
<400> 5
<210> 6
<211 >452
<212> DNA
<213> yapay dizi
<220>
<223> sCMV IEl güçlendirici dizinin
fragmani
<400> 6
<210> 7
<211> 1074
<212> DNA
<213> yapay dizi
<220>
<223>
regülatör dizi
' dönüstürülmemis
(Ilyapl lvl)
<221> güçlendirici
<222>
<223> hCMV 1E1 ve mCMV IEl güçlendirici
dizinin fragmani
<220>
<221 > promotör
<222>
(583)...(1074)
<223> mCMV IEl promotör dizinin fragmani
<400> 7
<210> 8
<211> 1128
<212> DNA
<213> yapay dizi
<220>
<223>
regülatör dizi
<220>
' dönüstürülmemis
(Ilyapi 2II)
<221 > güçlendirici
<222>
<223> fragman of hCMV IEl güçlendirici
<220>
<221 > promotör
<222>
(1027)...(1128)
<223> mCMV IEl promotör dizinin fragmani
("çekirdek promotör")
<400> 8
9C99tttt99
<210> 9
'-dönüstürülmemis
(Ilyapi 31')
<223> fragman of hCMV IEl güçlendirici
<211> 509
<212> DNA
<213> yapay dizi
<220>
<223> kimerik
regülatör dizi
<220>
<221 > güçlendirici
<222> (l)...(407)
<220>
<221 > promotör
<222>
(408)...(509)
<223> mCMV IEl promotör dizinin fragmani
("çekirdek promotör")
<400> 9
<210> 10
<211> 961
<212> DNA
<213> yapay dizi
<220>
<223>
regülatör
'-dönüstürülmemis
<220>
<221>
<222>
<223>
fragmani
<220>
<221 > güçlendirici
güçlendirici
sCMV IEl güçlendirici dizinin
<222> (453)...(859)
<223> hCMV IEl güçlendirici dizinin
fragmani
<220>
<221 > promotör
<222> (860)...(96l)
<223> mCMV IEl
fragmani
<400> 10
promotör dizinin
("çekirdek promotör")
<210> 11
yapay dizi
<211>
<212>
<2l3>
<220>
<223>
regülatör dizi
<220>
'-dönüstürülmemis
(“yapl SU)
<221 > güçlendirici
<222>
<223>
fragmani
<220>
<221 > promotör
<222>
güçlendirici
(808)...(909)
<223> mCMV IEl promotör dizinin fragmani
("çekirdek promotör")
<400> ll
<2lO> 12
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
regülatör dizi
<220>
yapay dizi
'-dönüstürülmemis
<221 > güçlendirici
<222>
<223>
fragmani
<220>
(1).. .(452)
güçlendirici
<221 > güçlendirici
<222>
<223>
fragmani
<220>
(453)
(859)
<221 > promotör
<222>
güçlendirici
(860)...(976)
99C993CCIQ
<223> hCMV IEl promotör dizinin fragmani
("çekirdek promotör")
<400> 12
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
regülatör dizi
<220>
<221>
<222>
<223> s
fragmani
<220>
yapay dizi
<221 > promotör
<222>
99C993Ctt9
99C3C99I9C
'-dönüstürülmemis
(Ilyapi 7II)
güçlendirici
güçlendirici
(808)...(924)
<223> hCMV IEl promotör dizinin fragmani
("çekirdek promotör")
<400> 13
939999tCtt
<210> 14
<211> 21
<212>
<213>
<220>
<223> optimize cB72.3 kappa hafif
<400>
SerGîu
yapay dizi
<2lO> 15
<211 >434
<212> PRT
<213> yapay dizi
<220>
<223> optimize cB72.3 gama-4 agir zincir
<400> 15
Trp Aîa Lys Gîn Lgs pro Gîu Gîn G1y
Gîn Ser Asp Aîa Gîu Leu Va] Lys
Cys Lys Aîa Ser Gîy Tyr Thr Phe
Gîy Asn Asp Asp Iîe Lys Tyr Asn70
Leu Thr A1a Asp Lys Ser Ser Ser
Leu Thr ser G1u Asp ser A1a Va]
Tyr Tyr Gîy His Trp G1y Gîn Gîy Thr Thr
Claims (12)
1. Ilgi konusu bir nükleik asit dizisinin heterolog ekspresyonuna yönelik olan, vektörün, eksprese edilecek olan. bir birinci nükleik. asit dizisine islevsel olarak baglanan bir birinci kimerik. promotör regülatör diziyi içerdigi bir ekspresyon vektörü olup, özelligi; burada kimerik promotör regülatör dizinin (i) SEQ ID. NO: 5'ten olusan sitomegalovirüs IEl promotöründen gelen ve eksprese edilecek nükleik asit dizisinin transkripsiyonel baslangiç alanina islevsel olarak bagli olan promotör bir diziyi; ve (ii) simian sitomegalovirüs IEl bölgesinden veya insan ve simian sitomegalovirüs IEl bölgelerinden bir kimera temsil eden güçlendirici bir diziyi içermesi, güçlendirici dizinin, promotör dizinin 5' kisminda yer almasi ve insan promotör dizisine islevsel olarak bagli olmasi, burada güçlendirici dizinin, SEQ ID. NO: 6'nin nükleotit dizisini içermesidir. 2.Istem l'e göre ekspresyon vektörü olup, özelligi; burada kimerik promotör regülatör dizinin SEQ ID. NO:12 ve SEQ ID.
NO:13'ten olusan gruptan seçilen bir nükleotit dizisi içermesidir.
.Istem 1 veya Z'ye göre ekspresyon vektörü olup, özelligi; ayrica, eksprese edilecek olan ikinci bir nükleik asit dizisine islevsel olarak bagli olan ikinci bir kimerik promotör regülatör dizi içermesi, burada ikinci kimerik promotör regülatör dizinin birinci kimerik promotör regülatör dizi ile özdes olmasidir.
.Istemler 1 veya Z'den herhangi birine göre bir ekspresyon vektörü olup, Özelligi; eksprese edilecek olan ikinci bir nükleik asit dizisine islevsel olarak bagli olan ikinci bir kimerik promotör regülatör dizi içermesi, burada ikinci kimerik promotör regülatör dizinin birinci kimerik promotör regülatör diziden farkli olmasidir.
5.Istem 3 veya 4'e göre ekspresyon vektörü olup, özelligi; burada, eksprese edilecek olan birinci ve ikinci nükleik asit dizilerinin farkli polipeptitleri kodluyor olmasidir.
6.Istem 5'e göre ekspresyon vektörü olup, özelligi; burada farkli polipeptidlerin, dimerik veya multimerik bir proteinin alt birimlerini temsil ediyor olmasidir.
7. Istem 6'nin ekspresyon vektörü olup, özelligi; burada dimerik veya multimerik proteinin bir antikor molekülü olmasidir.
8.Bir memeli konakçi hücresi olup, özelligi; istemler 1 ila 7'den herhangi birinde tanimlandigi üzere bir ekspresyon vektörü ile transfekte edilmis olmasidir.
9.Istem 8'e göre memeli konakçi hücre olup, özelligi; burada konakçi hücrenin bir CHO hücresi olmasidir.
10. Bir memeli konakçi hücredeki ilgi konusu bir nükleik asit dizisinin heterolog ekspresyonuna yönelik bir yöntem olup, özelligi; (i) memeli konakçi hücrenin istemler 1 ila 7'den herhangi birinde tanimlandigi üzere bir ekspresyon vektörü ile transfekte edilmesini; ve (ii) transfekte edilmis memeli konakçi hücrenin, ilgi konusu nükleik asit dizisinin ekspresyonuna izin veren kosullar altinda kültürlenmesini içermesidir.
11. Istem lO'a göre yöntem olup, özelligi; burada transfeksiyonun stabil transfeksiyon olmasidir.
12. Istemler ]. ila 7'den herhangi birinde tanimlandigi üzere bir ekspresyon vektörünün kullanimi olup, özelligi; bir memeli konakçi hücrede ilgi konusu bir nükleik asit dizisinin heterolog in vitro ekspresyonu için olmasidir.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP12185728.8A EP2711426B1 (en) | 2012-09-24 | 2012-09-24 | Expression vectors comprising chimeric cytomegalovirus promoter and enhancer sequences |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201816314T4 true TR201816314T4 (tr) | 2018-11-21 |
Family
ID=46888330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/16314T TR201816314T4 (tr) | 2012-09-24 | 2013-09-23 | Kimerik sitomegalovirüs promotörü ve güçlendirici dizileri içeren ekspresyon vektörleri. |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9777290B2 (tr) |
| EP (2) | EP2711426B1 (tr) |
| JP (2) | JP6162246B2 (tr) |
| KR (1) | KR101757083B1 (tr) |
| CN (1) | CN104718296B (tr) |
| AU (1) | AU2013320157B2 (tr) |
| BR (1) | BR112015005604B1 (tr) |
| CA (1) | CA2880750C (tr) |
| DK (2) | DK2711426T3 (tr) |
| EA (1) | EA033008B1 (tr) |
| ES (2) | ES2540753T3 (tr) |
| HK (1) | HK1206061A1 (tr) |
| HU (2) | HUE026516T2 (tr) |
| IL (1) | IL237171B (tr) |
| MX (1) | MX371007B (tr) |
| PL (2) | PL2711426T3 (tr) |
| SG (1) | SG11201502243YA (tr) |
| TR (1) | TR201816314T4 (tr) |
| TW (1) | TWI507526B (tr) |
| WO (1) | WO2014044845A1 (tr) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2540753T3 (es) | 2012-09-24 | 2015-07-13 | Lonza Biologics Plc. | Vectores de expresión que comprenden secuencias quiméricas de promotor y amplificador de citomegalovirus |
| WO2014127148A1 (en) * | 2013-02-14 | 2014-08-21 | The J. David Gladstone Institutes | Compositions and methods of use thereof for identifying anti-viral agents |
| JP6566536B2 (ja) * | 2014-06-16 | 2019-08-28 | 国立大学法人山口大学 | フォワードプライマー |
| GB201603577D0 (en) * | 2016-03-01 | 2016-04-13 | Oxford Genetics Ltd | Promoter |
| RU2745500C2 (ru) * | 2016-06-20 | 2021-03-25 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Эффективный и сбалансированный двунаправленный промотор |
| CN110785494B (zh) | 2017-06-16 | 2024-07-02 | 隆萨有限公司 | 用于生产生物制品的通用自调节哺乳动物细胞系平台 |
| CN109988759A (zh) * | 2017-12-29 | 2019-07-09 | 上海细胞治疗研究院 | 一种在t细胞中具有高转录活性的嵌合启动子 |
| WO2020034097A1 (en) * | 2018-08-14 | 2020-02-20 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | Transcriptional regulatory element and its use in enhancing the expression of exogenous protein |
| JP7483907B2 (ja) * | 2020-02-19 | 2024-05-15 | ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド | 強化された発現系及びその使用方法 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4963481A (en) * | 1985-12-18 | 1990-10-16 | Genetics Institute Inc | Promoter system |
| GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
| GB8723818D0 (en) | 1987-10-10 | 1987-11-11 | Brico Eng | Sintered materials |
| FI884924A (fi) * | 1987-10-28 | 1989-04-29 | Oncogen | Humanimmuglobulin som producerats med hybrid-dna-teknik. |
| GB8900483D0 (en) | 1989-01-10 | 1989-03-08 | Celltech Ltd | Recombinant dna method |
| GB9022545D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
| US20020106635A1 (en) | 1998-05-27 | 2002-08-08 | Bruce Freimark | Cytokine resistant cytomegalovirus promoter mutants and related products and methods |
| US7074590B2 (en) | 2000-06-23 | 2006-07-11 | Maxygen, Inc. | Chimeric promoters |
| US20030157641A1 (en) * | 2001-11-16 | 2003-08-21 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Polycistronic expression of antibodies |
| GB0216648D0 (en) | 2002-07-18 | 2002-08-28 | Lonza Biologics Plc | Method of expressing recombinant protein in CHO cells |
| ES2309508T3 (es) | 2003-03-11 | 2008-12-16 | Laboratoires Serono Sa | Vectores de expresion que comprenden el promotor de mcmv-ie2. |
| PL1685251T3 (pl) | 2003-10-10 | 2014-07-31 | Powderject Vaccines Inc | Konstrukty kwasu nukleinowego |
| US8741650B2 (en) | 2004-01-22 | 2014-06-03 | Dnavec Research Inc. | Methods for producing minus-strand RNA viral vectors using hybrid promoter comprising cytomegalovirus enhancer and chicken β-actin promoter |
| WO2006111387A2 (en) | 2005-04-22 | 2006-10-26 | Lonza Biologics Plc. | Mammalian expression vector comprising the mcmv promoter and first intron of hcmv major immediate early gene |
| EP2152889B1 (en) | 2007-05-29 | 2017-03-15 | Nature Technology Corporation | Vectors and methods for genetic immunization |
| GB0710614D0 (en) | 2007-06-04 | 2007-07-11 | Lonza Biologics Plc | Mammalian expression vector with a highly efficient secretory signal sequence |
| US20120100573A1 (en) | 2010-10-21 | 2012-04-26 | Thudium Kent B | Cytomegalovirus intron a fragments |
| CN102392047B (zh) | 2011-11-11 | 2014-01-01 | 苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司 | 一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体及其应用 |
| ES2540753T3 (es) | 2012-09-24 | 2015-07-13 | Lonza Biologics Plc. | Vectores de expresión que comprenden secuencias quiméricas de promotor y amplificador de citomegalovirus |
-
2012
- 2012-09-24 ES ES12185728.8T patent/ES2540753T3/es active Active
- 2012-09-24 DK DK12185728.8T patent/DK2711426T3/en active
- 2012-09-24 EP EP12185728.8A patent/EP2711426B1/en active Active
- 2012-09-24 HU HUE12185728A patent/HUE026516T2/en unknown
- 2012-09-24 PL PL12185728T patent/PL2711426T3/pl unknown
-
2013
- 2013-09-23 KR KR1020157006996A patent/KR101757083B1/ko active IP Right Grant
- 2013-09-23 JP JP2015532436A patent/JP6162246B2/ja active Active
- 2013-09-23 CA CA2880750A patent/CA2880750C/en active Active
- 2013-09-23 WO PCT/EP2013/069715 patent/WO2014044845A1/en active Application Filing
- 2013-09-23 HU HUE13773651A patent/HUE040463T2/hu unknown
- 2013-09-23 TR TR2018/16314T patent/TR201816314T4/tr unknown
- 2013-09-23 AU AU2013320157A patent/AU2013320157B2/en active Active
- 2013-09-23 TW TW102134171A patent/TWI507526B/zh active
- 2013-09-23 ES ES13773651.8T patent/ES2694778T3/es active Active
- 2013-09-23 MX MX2015002888A patent/MX371007B/es active IP Right Grant
- 2013-09-23 SG SG11201502243YA patent/SG11201502243YA/en unknown
- 2013-09-23 US US14/426,329 patent/US9777290B2/en active Active
- 2013-09-23 EA EA201590264A patent/EA033008B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-09-23 BR BR112015005604-0A patent/BR112015005604B1/pt active IP Right Grant
- 2013-09-23 EP EP13773651.8A patent/EP2898077B1/en active Active
- 2013-09-23 PL PL13773651T patent/PL2898077T3/pl unknown
- 2013-09-23 DK DK13773651.8T patent/DK2898077T3/en active
- 2013-09-23 CN CN201380049575.6A patent/CN104718296B/zh active Active
-
2015
- 2015-02-10 IL IL237171A patent/IL237171B/en active IP Right Grant
- 2015-07-13 HK HK15106669.0A patent/HK1206061A1/xx unknown
-
2017
- 2017-03-28 JP JP2017063537A patent/JP2017136081A/ja active Pending
- 2017-08-28 US US15/687,835 patent/US10294491B2/en active Active
-
2019
- 2019-04-02 US US16/372,738 patent/US20200002721A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TR201816314T4 (tr) | Kimerik sitomegalovirüs promotörü ve güçlendirici dizileri içeren ekspresyon vektörleri. | |
| KR101812348B1 (ko) | 단백질의 생산 방법 | |
| DK2825036T3 (en) | Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents to generate them | |
| JP6279466B2 (ja) | 新規な発現ベクター | |
| US10611831B2 (en) | Production cell line enhancers | |
| EA034039B1 (ru) | Клетка-хозяин, способная к сайт-специфической интеграции, способ ее получения и применение | |
| US20130236957A1 (en) | Expression vector and methods of producing high levels of proteins | |
| EA037273B1 (ru) | Экспрессионная кассета | |
| TW201124535A (en) | SORF constructs and multiple gene expression | |
| CN107012168A (zh) | 人工染色体载体 | |
| JP2010522549A (ja) | 目的のポリヌクレオチドの発現を増強するためのポリヌクレオチド | |
| WO2007021353A2 (en) | Improving antibody expression using vectors containing insulator elements | |
| EP2653541B1 (en) | Method for producing proteins | |
| DK2697375T3 (en) | EXPRESSION SYSTEM WITH A SAR (SCAFFOLD ATTACHMENT REGION) ELEMENT OF INTERFERON 2 | |
| EP3705575A1 (en) | High-yield production method for protein by using mammalian artificial chromosome vector | |
| WO2024068995A1 (en) | Novel transposase system |