JP7483907B2 - 強化された発現系及びその使用方法 - Google Patents

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Description

本開示は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン及び／又は制御エレメントを利用する有効的なタンパク質発現系に関する。
組換えタンパク質には、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、哺乳類細胞など、多くの発現系がある。タンパク質発現系の大きな違いは、タンパク質の発現、単離、精製に影響を与える可能性がある。一例を挙げると、細菌などの低レベルの発現系では、生物学的活性を達成するためにグリコシル化などの複雑な翻訳後修飾を必要とする特定のタイプのタンパク質の発現に用いられることができない。また、多くの治療用タンパク質は、生物学的活性を達成するために、グリコシル化などの複雑な翻訳後修飾を必要とする。
治療用組換えタンパク質を生産するための哺乳類の発現系は、通常製薬会社に使用されている。哺乳類細胞は、多くのタンパク質の治療上な活性に必要な、適切なタンパク質の折り畳みと複雑な翻訳後修飾を達成する能力を持っている。多くの哺乳類の細胞発現系は、治療用タンパク質の生産に使用することが承認されています。しかし、治療用組換えタンパク質の安定した哺乳類細胞発現系を確立することは時間のかかるプロセスであり、発現レベルが最適化されていない場合もあるため、大規模な生産には理想的とは言えない。
したがって、さまざまな治療用組換えタンパク質を高いレベルで発現できる安定した細胞株を生成するための柔軟なプラットフォームとして使用できる、改良された発現系が必要です。タイムリーに製造プロセスへ供給でき、同じ宿主細胞で組換えタンパク質を発現するための安定した細胞株を生成する能力は、初期段階の医薬品開発において特に有用です。転写および翻訳効率が向上した発現系も必要とされている。
本開示は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン及び／又は制御エレメントを利用する有効的なタンパク質発現系に関する。この発現系は、標的核酸を細胞のゲノムに効率的に組み込んで、細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞など）でのタンパク質発現を大幅に増加させることができる汎用のツールを提供する。一態様では、発現系は、トランスポゾンベクターにおけるベクター配列（例えば、２つのｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ間の配列）を標的ゲノムに効率的に移行させることができる。前記システムは、様々なタンパク質（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖）を発現させるための安定した細胞株を確立するために使用できる。一態様では、ｐｉｇｇｙＢａｃ発現系をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とともに使用して、組換えタンパク質を生産して、研究及び生物医薬品製造の両方の目的に供する。
一態様では、本明細書で提供される核酸は、５’－ＩＴＲ（逆方向末端反復）；３’－ＩＴＲ配列；及び配列番号１～３０及び配列番号３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である制御エレメント配列を含む。
いくつかの実施形態において、５’ＩＴＲ配列は、配列番号６８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなり、３’ＩＴＲ配列は、配列番号６０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、５’ＩＴＲ配列は、配列番号６８を含む；３’ＩＴＲ配列は、配列番号６０を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、さらに５’－内部ドメイン及び３’－内部ドメインを含む。いくつかの実施形態において、５’－内部ドメインが、配列番号６６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、３’－内部ドメインが、配列番号６７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、５’－内部ドメインが５’－ＩＴＲに直接隣接しており、３’－内部ドメインが３’－ＩＴＲに直接隣接している。
いくつかの実施形態において、前記核酸は、配列番号１～１５からなる群から選択される１つ以上の制御エレメント配列（例えば、配列番号２）を含む。
いくつかの実施形態において、前記核酸は、配列番号３５～４６からなる群から選択される１つ以上の制御エレメント配列（例えば、配列番号３６）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、さらにプロモーター及びポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコードする配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコードする配列は、２つの制御エレメント配列の間に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、さらにプロモーター及び２つ以上のポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、２つ以上のポリペプチドをコードする配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、配列が抗体重鎖及び抗体軽鎖をコードする。
いくつかの実施形態において、前記核酸は、さらに配列番号３５～４６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＷＸＲＥ配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸が２つ以上の発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、核酸が選択マーカーを含む。いくつかの実施形態において、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする配列、又はｌａｃＺである。
一態様では、本明細書は、本明細書に記載されるような核酸を含むベクターを提供する。
一態様では、本明細書は、配列番号６８と少なくとも９５％同一である配列からなる５’ＩＴＲ配列；非トランスポゾン異種ＤＮＡ配列；及び配列番号６０と少なくとも９５％同一である配列からなる３’ＩＴＲ配列が５’から３’へ含まれるトランスポゾンベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、５’ＩＴＲ配列が配列番号６８からなり、３’ＩＴＲ配列が配列番号６０からなる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるようなトランスポゾンベクターは、さらに５’－内部ドメイン及び３’－内部ドメインを含む。いくつかの実施形態において、５’－内部ドメインが、配列番号６６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、３’－内部ドメインが、配列番号６７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、５’－内部ドメインが５’－ＩＴＲに直接隣接しており、３’－内部ドメインが３’－ＩＴＲに直接隣接している。
いくつかの実施形態において、非トランスポゾン異種ＤＮＡ配列がプロモーター及び１つ以上のポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリペプチドをコードする配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターである。
いくつかの実施形態において、非トランスポゾン異種ＤＮＡ配列は、さらに配列番号１～３０及び３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である制御エレメント配列を含む。
いくつかの実施形態において、非トランスポゾン異種ＤＮＡ配列は、さらに配列番号３５～４６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＷＸＲＥ配列を含む。
いくつかの実施形態において、非トランスポゾン異種ＤＮＡ配列がマルチクローニングサイトを含む。
一態様では、本明細書は、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；配列番号１～３０及び３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一性である制御エレメント配列を含む非トランスポゾン異種ＤＮＡ配列；３’－ＩＴＲ配列；を含む第１の核酸；及び（ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする第２の核酸を含む発現系を提供する。
いくつかの実施形態において、第２の核酸が、配列番号３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする。
いくつかの実施形態において、非トランスポゾン異種ＤＮＡ配列がプロモーター及び１つ以上のポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリペプチドをコードする配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態において、配列が抗体重鎖及び／又は抗体軽鎖をコードする。いくつかの実施形態において、配列は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、組換えタンパク質、又は融合タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、メタロチオネインプロモーター、又は糖質コルチコイド応答エレメント）である。
いくつかの実施形態において、非トランスポゾン異種ＤＮＡ配列は、制御エレメント配列をさらに含み、前記制御エレメント配列は、配列番号１～３０及び３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。
いくつかの実施形態において、非トランスポゾン異種ＤＮＡ配列は、ＷＸＲＥ制御エレメント配列をさらに含み、前記ＷＸＲＥ制御エレメント配列は、配列番号３５～４６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。
一態様では、本明細書は、配列番号１～３０及び３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である制御エレメント配列を含む単離された核酸を提供する。
いくつかの実施形態において、前記核酸は、さらにプロモーター及びタンパク質コード配列を含む。
いくつかの実施形態において、制御エレメント配列は、プロモーターとタンパク質コード配列との間に位置する。
いくつかの実施形態において、制御エレメント配列は、タンパク質コード配列の３’末端に位置する。
いくつかの実施形態において、制御エレメント配列が５’－ＵＴＲ又は３’－ＵＴＲに転写可能である。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、さらに５’－ＩＴＲ及び３’－ＩＴＲを含み、制御エレメント配列が５’－ＩＴＲと３’－ＩＴＲとの間に位置する。
一態様では、本明細書は、本明細書に記載されるような核酸を含むベクターを提供する。
一態様では、本明細書は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含有するベクターを提供する。前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンには、５’から３’の方向に、ＴＲＬ、５’－ＩＴＲスペーサー、ＩＲＬを含む５’－ＩＴＲ；プロモーター；配列番号１～３０及び３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である制御エレメント配列；タンパク質コード配列；及びＩＲＲ、３’－ＩＴＲスペーサー、ＴＲＲを含む３’－ＩＴＲ；という遺伝的エレメントを含む。
一態様では、本明細書は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含有するベクターを提供する。前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンには、５’から３’の方向に、ＴＲＬ、５’－ＩＴＲスペーサー、ＩＲＬを含む５’－ＩＴＲ；プロモーター；タンパク質コード配列；配列番号１～３０及び３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である制御エレメント配列；及びＩＲＲ、３’－ＩＴＲスペーサー、ＴＲＲを含む３’－ＩＴＲ；という遺伝的エレメントを含む。
一態様では、本明細書は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含有するベクターを提供する。前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンには、５’から３’の方向に、ＴＲＲ、３’－ＩＴＲスペーサー、ＩＲＲを含む３’－ＩＴＲ；プロモーター；配列番号１～３０及び３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である制御エレメント配列；タンパク質コード配列；及ＩＲＬ、５’－ＩＴＲスペーサー、ＴＲＬを含む５’－ＩＴＲ；という遺伝的エレメントを含む。
一態様では、本明細書は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含有するベクターを提供する。前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンには、５’から３’の方向に、ＴＲＲ、３’－ＩＴＲスペーサー、ＩＲＲを含む３’－ＩＴＲ；プロモーター；タンパク質コード配列；配列番号１～３０及び３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である制御エレメント配列；及びＩＲＬ、５’－ＩＴＲスペーサー、ＴＲＬを含む５’－ＩＴＲ；という遺伝的エレメントを含む。
いくつかの実施形態において、５’－ＩＴＲが、配列番号６８の逆配列又は逆相補配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、３’－ＩＴＲが、配列番号６０との逆配列又は逆相補配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＴＲＬが、配列番号６１の逆配列又は逆相補配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、５’－ＩＴＲスペーサーは、配列番号６２の逆配列又は逆相補配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＩＲＬが、配列番号６３の逆配列又は逆相補配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＴＲＲが、配列番号６４の逆配列又は逆相補配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＩＲＲが、配列番号６５の逆配列又は逆相補配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、ベクターが２つ以上の制御エレメント配列を含む。制御エレメントのそれぞれは、配列番号１～３０及び３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。
いくつかの実施形態において、ベクターは、さらに５’－内部ドメイン配列及び３’－内部ドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態において、５’－内部ドメイン配列は、配列番号６６と少なくとも又は約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなり、３’－内部ドメイン配列は、配列番号６７と少なくとも又は約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、制御エレメント配列が５’－ＵＴＲ又は３’－ＵＴＲに転写可能である。
いくつかの実施形態において、ベクターは、さらにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする配列は、５’－ＩＴＲと３’－ＩＴＲとの間の領域以外にある。
一態様では、本明細書は、標的ポリペプチドを発現するための細胞を産生する方法を提供する。前記方法は、（ａ）５’－ＩＴＲ（逆方向末端反復）配列；３’－ＩＴＲ配列；配列番号１～３０及び３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である制御エレメント配列；及び標的ポリペプチドをコードする配列を含むトランスポゾンベクターを細胞に導入すること；及び（ｂ）適切な条件下で細胞を培養することが含まれる。いくつかの実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、標的ポリペプチドを発現するための細胞を産生する。
いくつかの実施形態において、前記方法は、さらにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする配列を含有するベクターを細胞に導入することが含まれる。
いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする配列を含む。
いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、マイクロインジェクション、高速推進（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｐｒｏｐｕｌｓｉｏｎ）、透過化、融合、又はエレクトロポレーションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞又は昆虫細胞である。
一態様では、本明細書は、本明細書に記載されるような核酸、本明細書に記載されるようなベクター、又は本明細書に記載されるような発現系を含む細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、前記細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
一態様では、本明細書は、タンパク質を発現させるための方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載されるような細胞がタンパク質を発現することを可能にする条件下で培養される；及びタンパク質が収集及び精製されることが含まれる。
一態様では、本明細書は、本明細書に記載されるような細胞によって発現されるか、或いは本明細書に記載されるような方法によって生成されるタンパク質を提供する。
一態様では、本明細書は、本明細書に記載されるようなタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
一態様では、本明細書で提供される核酸は、５’－ＩＴＲ配列；３’－ＩＴＲ配列；及びＣＨＯに由来する１つ以上の制御エレメント配列を含む。
一態様では、本明細書は、以下の発現系を提供する。この発現系には、（ａ） ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含む第１の核酸；前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンには、５’から３’の方向に、第１のＴＴＡＡ配列；ＴＲＬ、５’－ＩＴＲスペーサー及びＩＲＬを含む５’－ＩＴＲ；５’－内部ドメイン（ＩＤ）；標的配列；３’－ＩＤ；ＩＲＲ、３’－ＩＴＲスペーサー及びＴＲＲを含む３’－ＩＴＲ；及び第２のＴＴＡＡ配列；という遺伝的エレメントを含む；及び（ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする第２の核酸が含まれる。
一態様では、本明細書は、標的ポリペプチドを発現するための細胞を産生する方法を提供する。前記方法は、（ａ）５’から３’の方向に、第１のＴＴＡＡ配列；ＴＲＬ、５’－ＩＴＲスペーサー及びＩＲＬを含む５’－ＩＴＲ；５’－内部ドメイン（ＩＤ）；標的配列；３’－ＩＤ；ＩＲＲ、３’－ＩＴＲスペーサー及びＴＲＲを含む３’－ＩＴＲ；及び第２のＴＴＡＡ配列；という遺伝的エレメントを含むトランスポゾンベクターを細胞に導入すること、及び（ｂ）適切な条件下で細胞を培養することが含まれる。
一態様では、本明細書は、そのゲノムにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが安定して組み込まれた細胞株を提供する。前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンには、５’－ＩＴＲ配列；配列番号１～１５からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である制御エレメント配列；及び３’－ＩＴＲ配列；という遺伝的エレメントを含む。
一態様では、本明細書は、そのゲノムにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが安定して組み込まれた細胞株を提供する。前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンには、ＴＲＬ、５’－ＩＴＲスペーサー及びＩＲＬを含む５’－ＩＴＲ；５’－内部ドメイン（ＩＤ）；標的配列；３’－ＩＤ；ＩＲＲ、３’－ＩＴＲスペーサー及びＴＲを含む３’－ＩＴＲ；という遺伝的エレメントを含む：。
一態様では、本公開は、トランスポゾンベクターを提供する。前記トランスポゾンベクターには、配列番号３１と少なくとも９５％同一である配列を含むか、或いはそれからなる第１のＰＢトランスポザーゼ認識部位配列；非トランスポゾン異種ＤＮＡ配列；及び配列番号３２と少なくとも９５％同一である配列を含むか、或いはそれからなる第２のＰＢトランスポザーゼ認識部位配列；が含まれる。
一態様では、本公開は、さらに本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド分子を含むベクターに関する。いくつかの実施形態において、ベクターは、組換え発現ベクターである。
いくつかの実施形態において、本明細書は、１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含むベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体、融合タンパク質、酵素、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質、リボソームタンパク質、ザイモゲン、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Ｇタンパク質、神経活性ペプチド、免疫調節タンパク質、血液成分タンパク質（ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、イオンゲートタンパク質（ｉｏｎ ｇａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、抗生物質耐性タンパク質、任意の上記タンパク質の機能的フラグメント、任意の上記タンパク質のエピトープフラグメント、及びそれらの任意の組み合わせである。
一態様では、本開示は、本明細書に記載されるようなベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用される方法及び材料が本明細書に記載されているが、当技術分野で知られている他の適切な方法及び材料も使用することができる。材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
図１Ａは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドを示す概略図である。
図１Ｂは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼプラスミドを示す概略図である。
図２は、トランスフェクションされた宿主細胞における３つの抗体（Ａ、Ｂ、及びＣ）のタンパク質発現レベルを示す棒グラフである。
図３は、様々な制御エレメントを持つ宿主細胞におけるタンパク質発現レベルを示す棒グラフである。
図４は、制御エレメント有り／なしの、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドでトランスフェクションされた宿主細胞における３つの抗体（Ｄ、Ｅ、及びＦ）のタンパク質発現レベルを示す棒グラフである。
図５は、（１）ｐｉｇｇｙＢａｃ ５’－ＩＴＲ；（２）ｐｉｇｇｙＢａｃ ３’－ＩＴＲ；及び（３）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
図６－１は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの配列を示す。
図６－２は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの配列を示す。
図６－３は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの配列を示す。
図６－４は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの配列を示す。
図６－５は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの配列を示す。
図６－６は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの配列を示す。
図６－７は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの配列を示す。
図６－８は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの配列を示す。
図７－１は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの逆相補配列を示す。
図７－２は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの逆相補配列を示す。
図７－３は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの逆相補配列を示す。
図７－４は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの逆相補配列を示す。
図７－５は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの逆相補配列を示す。
図７－６は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの逆相補配列を示す。
図７－７は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの逆相補配列を示す。
図７－８は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの逆相補配列を示す。
図７－９は、ＷＸＲＥ ＩＤｓ:Ａ－Ｌの逆相補配列を示す。
図８は、人ＣＭＷプロモーター及びヒトＥＦ－１α遺伝子イントロン１の配列を示す。
図９は、ＷＸＲＥが挿入されていないＧＦＰ発現ベクターの概略図を示す。
図１０は、ＷＸＲＥが挿入されているＧＦＰ発現ベクターの概略図を示す。
図１１は、融合タンパク質の発現レベルに対する転写制御エレメントＡ~Ｋの添加後の効果を示す。ここで、Ａ１とＡ２はそれぞれ、転写制御エレメントＡの順方向と逆方向を示す。そのほかも同様である。
図１２は、融合タンパク質の発現の特定の生産性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）に対する転写制御エレメントＡ~Ｋの添加後の効果を示す。ここで、Ａ１とＡ２はそれぞれ、転写制御エレメントＡの順方向と逆方向を示す。そのほかも同様である。
図１３は、アダリムマブの重鎖を発現するＷＸＲＥ挿入ベクターの概略図を示す。ここで、ＨＣの意味は重鎖である。
図１４は、アダリムマブの軽鎖を発現するＷＸＲＥ挿入ベクターの概略図を示す。ここで、ＬＣの意味は軽鎖である。
図１５は、転写制御エレメントの異なる組み合わせ条件下での１４日目のアダリムマブの発現レベルの比較を示す。ここで、サンプル１～１２では、重鎖の上流と軽鎖の上流の転写制御エレメントの成分を表８に示す。
図１６は、ＰＤ－Ｌ１のＡ鎖、アダリムマブの重鎖（ＨＣ）、及び軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列を示す。
ＤＮＡトランスポゾンは、動物のゲノムで自然に発生する反復配列である。昆虫のゲノムで最初に発見されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンには、トランスポザーゼや逆方向末端反復配列などの重要なエレメントが含まれている。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムは、ゲノムとプラスミドの間で「カットアンドペースト」して、ＤＮＡ配列を置き換えることができる。他のトランスポゾンシステムと比較して、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、末端逆方向反復配列と反復配列の間にある配列を、ゲノムＤＮＡを他の修飾や損失なしに、「ＴＴＡＡ」ヌクレオチド配列を含むゲノムＤＮＡに正確に置き換えることができる。トランスポゾンシステムは、幹細胞研究、遺伝子改変、及び細胞工学の多くの分野で使用されてきた。
より速く、より効率的なタンパク質発現技術は、学界及び産業界の主要な関心事の１つである。一過性発現技術は、約２週間でグラムスケール（ｇｒａｍ－ｓｃａｌｅ）の組換えタンパク質を送達できるが、タンパク質の発現レベルは、古典的な安定した細胞プール（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｐｏｏｌ）と比較して制限されている。一方、安定した細胞プールのゲノムは、主に従来の安定したトランスフェクション法によるゲノムへの外因性ＤＮＡのランダムな組み込みのために、外因性ＤＮＡが挿入される可能性が低くなる。この非効率的なＤＮＡ組込の問題は、抗生物質の選択中の回復を遅らせる可能性がある。組換えタンパク質の発現レベルが比較的高いにもかかわらず、安定したプールでのタンパク質の時間のかかる生産は、この古典的な技術の広範な使用を制限し、産業のニーズを満たすことができない。
いくつかの既存のトランスポゾンシステムを使用して、組換えタンパク質生産のための安定した細胞株を構築することができる。しかし、これらのシステム（例えば、Ｔｏｌ２トランスポゾン）は、通常、有用な安定した細胞株を生成するのに１か月以上かかり、従来の安定した細胞プールアプローチに比べて時間的な利点がない。ＣＨＯ細胞株ための、本開示に記載されているｐｉｇｇｙＢａｃシステムの効率は、他のトランスポゾンシステム（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ及びＭｏｓ１）と比較して、有意な効率上の利点を有する。
また、外因性タンパク質の発現は、制御エレメント（ＲＥ）によって調節することができる。転写・翻訳調節機能を有する多くの因子は、タンパク質の発現レベルに影響を与える可能性がある。本開示は、さらにＲＮＡ存在量分析によって同定されたいくつかのＤＮＡ制御エレメントを提供する。それらが外来タンパク質の発現を改善できることを実証するために、さらなる実験が行われた。
本公開は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン及び／又は制御エレメントを利用する非常に効率的な発現系を提供する。発現系は、比較的短期間で高レベルで組換えタンパク質を発現できる安定した細胞株の確立を可能にする。
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンとトランスポザーゼ
ＤＮＡベースのトランスポゾンシステムは、メダカゲノムからのＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムの復活に続いて、哺乳類細胞のゲノム工学のための効率的なツールとして最初に登場した。トランスポゾンＤＮＡベクターは、トランスジェニック、遺伝子治療、遺伝子トラッピング、又は細胞のゲノムへの他のＤＮＡエレメントの挿入を含む多くの目的のために設計することができる。ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンシステムは自然に活性であり、もともと昆虫細胞で発見され、イラクサギンウワシの蛾（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ ｍｏｔｈ）Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉからのＴＮ－３８６細胞株でバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏ－ｖｉｒｕｓ）を感染させる。
ＰｉｇｇｙＢａｃに基づく遺伝子導入（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は、「カットアンドペースト」メカニズムによって実行される。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼタンパク質が哺乳動物細胞で発現すると、トランスポゾンの逆方向反復位置に結合し、ＤＮＡにニックを入れ、トランスポゾンの両端にある３'ヒドロキシル基を放出する。これにより、隣接するＴＴＡＡ配列の親水性攻撃（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｔｔａｃｋ）とヘアピン形成が起こり、プラスミドバックボーンからトランスポゾンが放出される。次に、プラスミドバックボーンは、相補的なＴＴＡＡオーバーハングのライゲーションによって宿主サイトカインによって修復される。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、ＴＴＡＡ配列を哺乳類細胞のゲノムＤＮＡに配置する。トランスポゾンのヘアピン分解（ｈａｉｒｐｉｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）と、ゲノムＤＮＡに対するトランスポゾンにおける３０個のヒドロキシル基の親水性攻撃により、ゲノムＤＮＡに千鳥状の４塩基対（ｂｐ）のカットが作成され、その結果、切断サイトに隣接するＴＴＡＡオーバーハングを伴う一時的な二本鎖（ｄｓ）切断が発生する。次に、トランスポゾンがゲノムＤＮＡのＴＴＡＡ部位に挿入され、トランスポゾンの両端にＴＴＡＡが見つかるようにＴＴＡＡが複製される。配列はゲノムに挿入され、配列はすべての子孫細胞に渡される。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼによるトランスポゾンの切除の場合、遺伝子導入細胞を除去するように誘導及び選択でき、一本鎖ＴＴＡＡを再ライゲーションして単一のＴＴＡＡを形成する。したがって、ｐｉｇｇｙＢａｃ転位の独自のメカニズムは、トランスポゾン配列のシームレスな切除という独自の利点をもたらす。ｐｉｇｇｙＢａｃがＤＮＡからトランスポゾンを切り出した後、元のｐｉｇｇｙＢａｃターゲットサイトをシームレスに生成する。ｐｉｇｇｙＢａｃの詳細な説明は、例えば、Ｗｏｏｄａｒｄらの「ｐｉｇｇｙＢａｃ－ｉｎｇ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ.」Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３.９（２０１５）:５２５－５３３；Ｃａｒｙらの「Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ:ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ＩＦＰ２ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ＦＰ－ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓｅｓ.」 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７２.１（１９８９）:１５６－１６９にあり、両方とも、参照によりその全体がここに組み込まれる。
野生型ｐｉｇｇｙＢａｃは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）とＩＴＲ内の５９４アミノ酸トランスポザーゼを備えた２４７２ｂｐトランスポゾンである。ＰＢトランスポザーゼはＰＢ ５’－ＩＴＲ及びＰＢ ３’－ＩＴＲを認識する。野生型５’－ＩＴＲには、左末端反復（ＴＲＬ）、３１ｂｐスペーサー（５’－ＩＴＲスペーサー）、及び左内部反復（ＩＲＬ）が含まれる。野生型５’－ＩＴＲの配列は、ＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＧＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＧ（配列番号６８）である。在野生型５’－ＩＴＲでは、ＴＲＬの配列は、ＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡ（配列番号６１）である。３１ｂｐスペーサー的配列は、ＡＴＣＡＴＡＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＧＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡ（配列番号６２）である。ＩＲＬの配列は、ＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＧ（配列番号６３）である。
同様に、野生型３’－ＩＴＲには、右末端反復（ＴＲＲ）、短スペーサー（ＧＡＣ；３’－ＩＴＲスペーサー）、及び右内部反復（ＩＲＲ）が含まれる。野生型３’－ＩＴＲの配列は、ＣＡＴＧＣＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＡＴＣＴＴＴＣＴＡＧＧＧ（配列番号６０）である。野生型３’－ＩＴＲでは、ＴＲＲの配列は、ＴＡＴＣＴＴＴＣＴＡＧＧＧ（配列番号６４）である。ＩＲＲの配列は、ＣＡＴＧＣＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＧＣＡ（配列番号６５）である。図５に示すように、末端反復は単一の下線で表され、内部反復は二重下線で表される。
本明細書で使用されるように、「５’－ＩＴＲ」という用語は、トランスポゾン活性についてｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼによって認識される配列を指し、それは、ＴＲＬ、ＩＲＬ、必要に応じてその間にスペーサー（例えば、３１ｂｐスペーサー）を含む。本明細書で使用されるように、「３’－ＩＴＲ」という用語は、トランスポゾン活性についてｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼによって認識される配列を指し、ＴＲＲ、ＩＲＲ、必要に応じてその間にスペーサーを含む。
本公開は、ｐｉｇｇｙＢａｃ発現系を提供する。いくつかの実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、２つの別々のプラスミド（例えば、トランスポゾンベクターとトランスポザーゼベクター）に保有される（図１Ａ－１Ｂ）。トランスポザーゼとトランスポゾンは、同じプラスミド（ｃｉｓ）で送達することもできる。この場合、トランスポザーゼ遺伝子は、トランスポゾンの逆方向末端反復エレメント（ＩＴＲ）の外側にある。
いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）５’－及び３’－逆方向末端反復（ＩＴＲ）を有する。５’－ＩＴＲは、例えば、ＴＲＬ、及びＩＲＬ、及び必要に応じてスペーサー（例えば、３１ｂｐスペーサー）を含むか、或いはそれからなる。３’－ＩＴＲは、例えば、ＴＲＲ、及びＩＲＲ、及び必要に応じてスペーサー（例えば、ＧＡＣ）を含むか、或いはそれからなる。標的配列（例えば、標的遺伝子又はＧＯＩ）は、ベクターにおける５’－ＩＴＲと３’－ＩＴＲの間、又はＰＢトランスポザーゼ認識部位配列の間に挿入されることができる。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の制御エレメントに機能的に連結されている。制御エレメントは、ＧＯＩの５’末端又はＧＯＩの３’末端に位置することができる。いくつかの実施形態において、制御エレメントは、プロモーターとＧＯＩの間、又は在ＧＯＩとｐｏｌｙＡシグナル配列の間に位置することができる。ｐｏｌｙＡシグナル配列は、転写されたｍＲＮＡのポリアデニル化のシグナルを提供する。いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、選択可能なマーカーをさらに含み得る。選択可能なマーカーは、同一プロモーター又は異なるプロモーターに作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態において、選択マーカーとＧＯＩは、同一プロモーターの制御下に置くことができる。いくつかの実施形態において、選択マーカーは、独自のプロモーターを持つことができる。通常、宿主細胞のゲノム自体は、選択可能なマーカー機能を提供しない。したがって、正しい修飾を施した細胞を、選択可能なマーカーにてスクリーニングすることができる。
いくつかの実施形態において、標的配列には、様々な遺伝子エレメント、例えば、制限部位、ｌｏｘＰ部位、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、発現カセット、遺伝子オペレーターなどが含まれる。いくつかの実施形態において、標的配列にはタンパク質コード配列がいずれも持っていない。
いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼベクターを提供する。ＰＢトランスポザーゼベクターは、ＰＢトランスポザーゼを発現するように設計されている。実験中、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）に両方のベクターをトランスフェクトした。ＰＢトランスポザーゼベクターから発現されるＰＢトランスポザーゼは、トランスポゾンベクター上にあるＰＢ５'－ＩＴＲ及びＰＢ３'－ＩＴＲを認識し、ＰＢ５'－ＩＴＲと３'－ＩＴＲとの間にある核酸配列（ＰＢ５’－ＩＴＲ及び３’－ＩＴＲ両方をも含む）が効率的に移動され、細胞内の染色体内のＴＴＡＡ部位に組み込まれる。いくつかの実施形態において、次に、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）とタンパク質発現活性によって細胞が選択される。
いくつかの実施形態において、５'－内部ドメイン及び３'－内部ドメインを使用して、５'－ＩＴＲ及び３'－ＩＴＲと連結し、ＰＢトランスポゾンの組込効率を高めることができる（例えば、５'－内部ドメイン配列又は３'－内部ドメイン配列のないＰＢトランスポゾンと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％の増加がある）。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポゾン認識部位には、図５に示す５'－内部ドメイン配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である５'－内部ドメイン配列が含まれている。図５の５'－内部ドメイン配列は、ＴＧＴＴＴＴＡＴＣＧＧＴＣＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＧＡＡＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＴＴＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＴＡＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＡＴＴＴＣＴＴＣＴＡＴＡＡＡＧＴＡＡＣＡＡＡＡＣＴ（配列番号６６）である。
いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポゾン認識部位には、３’－内部ドメイン配列が含まれる。３’－内部ドメイン配列は、図５に示す３’－内部ドメイン配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。図５の３’－内部ドメイン配列は、
ＴＡＴＣＴＡＴＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＡＧＴＴＡＴＣＡＣＧＴＡＡＧＴＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＣＡＡＴＡＴＡＡＴＴＡＴＣＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡＡＡＴＣＴＴＡＡＡＡＧＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＧＣＧＴＣＡＴＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＣＧＧＴＣＧＴＴＡＴＡＧＴＴＣＡＡＡＡＴＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣＧＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＡＣＧＣＣＴＣＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＧＴＣＣＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＡＴＴＣＧＣＧＣＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＴＧ（配列番号６７）である。
いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポゾンは、配列番号６６の少なくとも又は約５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０又は１７２の連続するヌクレオチドを有する５’－内部ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポゾンは、配列番号６７の少なくとも又は約５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、又は２７２の連続するヌクレオチドを有する３’－内部ドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポゾンには５’内部ドメイン配列を有さない。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポゾンには３’－内部ドメイン配列を有さない。
本明細書で使用されるように、「ＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位」という用語は、ＰＢトランスポザーゼが認識及び相互作用する２対の部位のうちの１つを指し、これは、核酸の５'方向に位置する（コード配列又は参照配列のセンス鎖の５'から３'の方向に基づく）。「ＰＢトランスポザーゼ３’－認識部位」という用語は、ＰＢトランスポザーゼが認識及び相互作用する２対の部位のうちの１つを指し、これは、核酸の３'方向に位置する（コード配列又は参照配列のセンス鎖の５'から３'の方向に基づく）。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位配列は、ＴＲＬを含むか、或いはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ３’－認識部位配列は、ＴＲＲを含むか、或いはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位は、ＴＲＬ及びＩＲＬ、及び必要に応じてスペーサー及び／又は内部ドメイン配列を含むか、或いはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ３’－認識部位は、ＴＲＲ及びＩＲＲ、及び必要に応じてスペーサー及び／又は内部ドメイン配列を含むか、或いはそれからなる。
５’－ＩＴＲ及び３’－ＩＴＲの位置は、トランスポゾンベクター上で交換できる。したがって、いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ３’－認識部位配列は、ＴＲＬを含むか、或いはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位配列は、ＴＲＲを含むか、或いはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ３’－認識部位は、ＴＲＬ及びＩＲＬ、及び必要に応じてスペーサー及び／又は内部ドメイン配列を含むか、或いはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位は、ＴＲＲ及びＩＲＲ、及び必要に応じてスペーサー及び／又は内部ドメイン配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位が、配列番号３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ３’－認識部位が、配列番号３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含むか、或いはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位は、配列番号３１の少なくとも又は約５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、又は２３０の連続するヌクレオチド又は完全な配列を有する配列を含むか、或いはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＰＢトランスポザーゼ３’－認識部位は、配列番号３２の少なくとも又は約５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、又は３１０の連続するヌクレオチド又は完全な配列を有する配列を含むか、或いはそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＩＴＲ又はＰＢトランスポザーゼ認識部位間の配列の長さは、少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｋｂである。いくつかの実施形態において、トランスポゾンには、１.５－３ｋｂ、１.５－５ｋｂ、１.５－１０ｋｂ、１.５－２０ｋｂ、１.５－３０ｋｂ、１.５－５０ｋｂ、１.５－７５ｋｂ、２－５ｋｂ、２－１０ｋｂ、２－２０ｋｂ、２－３０ｋｂ、２－５０ｋｂ、２－７５ｋｂ、３－５ｋｂ、３－１０ｋｂ、３－２０ｋｂ、３－３０ｋｂ、３－５０ｋｂ、３－７５ｋｂ、５－１０ｋｂ、５－２０ｋｂ、５－３０ｋｂ、５－５０ｋｂ、５－７５ｋｂ、１０－２０ｋｂ、１０－３０ｋｂ、１０－５０ｋｂ、又は１０－７５ｋｂの範囲のインサートが含まれる。
本開示は、さらに目的の遺伝子又は配列を含むトランスポゾンベクターを調製するためのベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載されるような５'－ＩＴＲと３'－ＩＴＲ、及び５'－ＩＴＲと３'－ＩＴＲの間のリンカー配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載されるようなＰＢトランスポザーゼ５’認識部位及びＰＢトランスポザーゼ３’認識部位、ならびに２つの認識部位間のリンカー配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、近接して配置された多くの異なるエンドヌクレアーゼ制限部位を含む短い長さのＤＮＡ（例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００ヌクレオチド未満）である。リンカー配列の存在は、発現カセットなどの様々な外来配列の容易な挿入及び除去を可能にし、それにより、特定の標的ＤＮＡフラグメントを含むベクターを調製するプロセスを単純化するので有利である。本明細書で使用されるように、発現カセットは、トランスフェクトされた細胞によって発現される遺伝子及びその遺伝子の調節配列を有するベクター、又は配列からなるコンポーネントである。いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、例えば、プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）、エンハンサー、又はインシュレーターなどの様々な調節又は遺伝的エレメントを有することができる。
このトランスポゾンベクターが宿主細胞に導入されると、隣接する逆配列に特異的なトランスポゾン活性の存在下で、標的ＤＮＡ配列が導入されたベクターから切り出され、ゲノムの位置に挿入される。トランスポサーゼ活性の存在下で、標的ＤＮＡの転位が促進される。トランスポザーゼをコードする遺伝子は、宿主細胞のゲノムにすでに存在するトランスポゾンベクターに物理的に連結するか、或いは別のベクターの一部として細胞に導入することができる。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、産生又はトランスポナーゼ活性を開始する手段として使用することができる。
制御エレメント
本公開は、さらに様々な制御エレメントを提供する。本明細書で使用されるように、本公開における「制御エレメント」という用語は、遺伝子の転写及び／又は翻訳の調節に関与する配列を指す。いくつかの実施形態において、制御エレメントは、転写制御エレメント又は翻訳制御エレメントである。いくつかの実施形態において、制御エレメントはｍＲＮＡを安定化させることができる。いくつかの実施形態において、これらの制御エレメント、ＣＨＯ－Ｋ１細胞に由来する。いくつかの実施形態において、これらの制御エレメントは、標的遺伝子の発現レベルを増加させる。
本公開からわかるように、表１に記載されている制御エレメントは、標的遺伝子の発現レベルを高めることができる。理論に縛られることを望まないが、これらの制御エレメントは転写効率を高め、転写されたｍＲＮＡを安定化させることができるとの仮説が立てられている。いくつかの実施形態において、これらの制御エレメントは、分解に対するｍＲＮＡ耐性を向上する。
配列番号１～１５は制御エレメントの配列である。逆相補配列は、配列番号１６～３０に提供されている。一態様では、本公開は、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。単離されたポリヌクレオチド分子は、（ｉ）配列番号１～１５のいずれか１つの配列；（ｉｉ）配列番号１～１５のいずれか１つの配列の逆相補配列；（ｉｉｉ）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下又は非常に高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、（ｉ）又は（ｉｉ）の配列とハイブリダイズできる配列の逆相補配列；及び（ｉｖ）配列番号１～３０少なくとも又は約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である配列を含む。本明細書で使用されるように、本公開における「逆相補配列」という用語は、元のポリヌクレオチドの配列と反対方向にあり、また元のポリヌクレオチドの配列にも相補的な配列である。例示的には、元のポリヌクレオチド配列がＡＣＴＧＡＡＣである場合、その逆相補体はＧＴＴＣＡＧＴである。
一態様では、本開示は、さらにプロモーター及び標的遺伝子を含む配列を提供する。制御エレメント配列は、標的遺伝子の５'末端（例えば、プロモーターと目的の遺伝子の間）に位置し、又は標的遺伝子の３'（例えば、標的遺伝子とｐｏｌｙＡシグナル配列の間）に位置することができる。
いくつかの実施形態において、制御エレメントは、配列番号１～３０のいずれか１つの配列に対して少なくとも又は約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（これらの値の間のすべての範囲及びパーセンテージを含む）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号１～３０からなる群から選択される配列と少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドが異なる。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号１～３０から選択される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド以下が異なる。
シーケンスは順方向又は逆方向を持つことができる。いくつかの実施形態において、制御エレメント配列は、外因性タンパク質の発現を、（例えば、制御エレメント配列のない対照配列と比較して）約又は少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％増加させることができる。
制御エレメント配列は、プロモーターの後に（例えば、コード配列のセンス鎖の５'から３'）、又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの後に（例えば、コード配列のセンス鎖の５'から３'に）位置することができる。いくつかの実施形態において、制御エレメントは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの前に位置している（例えば、５'非翻訳領域（５'－ＵＴＲ）に転写される）。いくつかの実施形態において、制御エレメント配列とプロモーターの間、又は制御エレメント配列とポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの間には、少なくとも又は約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、制御エレメント配列とプロモーターの間、又は制御エレメント配列とポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの間には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又はｌ０００以下のヌクレオチドしか存在しない。
いくつかの実施形態において、制御エレメント配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの後（例えば、直後に）に位置することができる（例えば、３’－ＵＴＲに転写される）。いくつかの実施形態において、制御エレメント配列とポリペプチドをコードする配列の末端の間、又は制御エレメント配列とｐｏｌｙＡシグナル配列の間には、少なくとも又は約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、制御エレメント配列とポリペプチドをコードする配列の末端の間、又は制御エレメント配列とｐｏｌｙＡシグナル配列の間には、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００以下のヌクレオチドしか存在しない。
本公開は、さらに制御エレメント配列をスクリーニングする方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）は、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のｍＲＮＡをシーケンシング及び定量するために使用できる。全ＲＮＡを抽出する。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、抽出されたＲＮＡから生成される。ＲＮＡの量を存在量でランク付けす。そして、トップＲＮＡの非翻訳領域の配列が選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような実験は、タンパク質発現に対する制御エレメントの効果を検証するために実施された。一態様では、様々な段階の望ましい宿主細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）のｍＲＮＡは、ハイスループットシーケンシング法（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ）によって配列決定及び定量化される。いくつかの実施形態において、一過性及び安定したトランスフェクションが可能である。一過性トランスフェクションにより、適切な時間（例えば、６日目、８日目、１０日目、１２日目、又は１４日目）後に適切な量（例えば、少なくとも又は約１０、２０又は３０）のサンプルから全ＲＮＡを抽出できるか、或いは適切な時間（例えば、６日目、８日目、１０日目、１２日目、又は１４日目）での従来のフィードバッチプロセス（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）（例えば、１４日間のフィードバッチプロセス）後に適切な量（例えば、少なくとも又は約１０、２０、又は３０）の安定トランスフェクションサンプル（例えば、安定したタンパク質発現細胞株）のサンプルから全ＲＮＡを抽出できる。
いくつかの実施形態において、（例えば、逆転写によって）ｃＤＮＡを生成し、（例えば、ハイスループットシーケンシングによる）配列決定に使用することができる。シーケンシングデータと相対読み取り（ｒｅａｄ）数の助けを借りて、ｍＲＮＡを抽出し、すべてのサンプルの平均存在量でランク付けすることができる。いくつかの実施形態において、制御エレメント（ＲＥ）配列は、トップランクのｍＲＮＡ（例えば、少なくとも又は約トップ５、トップ１０、トップ１５、トップ２０、トップ２５、トップ３０、トップ３５、トップ４０又はそれ以上）の非翻訳領域から抽出することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の制御エレメント配列は、融合タンパク質発現プラスミド（例えば、組換えタンパク質発現遺伝子の直前又は直後）に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、制御エレメント配列を含まない対照サンプルを使用して、制御エレメントの効果を決定することができる。
ＷＸＲＥ制御エレメント
制御エレメントは、遺伝子の転写及び/又は翻訳を調節することができる。いくつかの実施形態において、制御エレメントは、例えばＷＸＲＥ制御エレメントなどの転写制御エレメントである。図６に示すように、本公開におけるＷＸＲＥには、転写制御エレメントＡ（配列番号３５）、転写制御エレメントＢ（配列番号３６）、転写制御エレメントＣ（配列番号３７）、転写制御エレメントＤ（配列番号３８）、転写制御エレメントＥ（配列番号３９）、転写制御エレメントＦ（配列番号４０）、転写制御エレメントＧ（配列番号４１）、転写制御エレメントＨ（配列番号４２）、転写制御エレメントＩ（配列番号４３）、転写制御エレメントＪ（配列番号４４）、転写制御エレメントＫ（配列番号４５）、及び転写制御エレメントＬ（配列番号４６）を含む。これに対応して、図７に示すように、本公開におけるＷＸＲＥの逆相補配列には、転写制御エレメントＡの逆相補配列（配列番号４７）、転写制御エレメントＢの逆相補配列（配列番号４８）、転写制御エレメントＣの逆相補配列（配列番号４９）、転写制御エレメントＤの逆相補配列（配列番号５０）、転写制御エレメントＥの逆相補配列（配列番号５１）、転写制御エレメントＦの逆相補配列（配列番号５２）、転写制御エレメントＧの逆相補配列（配列番号５３）、転写制御エレメントＨの逆相補配列（配列番号５４）、転写制御エレメントＩの逆相補配列（配列番号５５）、転写制御エレメントＪの逆相補配列（配列番号５６）、転写制御エレメントＫの逆相補配列（配列番号５７）、転写制御エレメントＬの逆相補配列（配列番号５８）を含む。
いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列は、配列番号３５～５８のいずれか１つの配列の少なくとも又は約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（これらの値の間にすべての範囲とパーセンテージを含む）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列は、配列番号３５～５８からなる群から選択される配列とは、少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオチドだけ異なる。いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列は、配列番号３５～５８からなる群から選択される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以下のヌクレオチドだけ異なる。
ＷＸＲＥ配列は順方向又は逆方向を持つことができる。本明細書で使用されるように、センス鎖（５’から３’）が標的配列と同じ配列を有する場合、標的配列は順方向を有する。センス鎖が標的配列に逆相補的である配列を有する場合、標的配列は逆方向を有する。配列番号３５～４６に逆相補的な配列は、それぞれ配列番号４７～５８に記載されている。
いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列は、外因性タンパク質の発現を（ＷＸＲＥ配列を持たない制御配列と比較して）約又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％増加させることができる。
いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列、プロモーター、及びポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、互いに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び１つ以上のその他の制御エレメントは、互いに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、その他の制御エレメントは本明細書に記載されるような制御エレメント（例えば、配列番号１～３０）である。いくつかの実施形態において、ＥＦ－１αのイントロン（例えば、ヒトＥＦ－１αの第１のイントロン）を使用して、発現を増加させることができる。作動可能に連結されたＷＸＲＥ配列、プロモーター、及びポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、様々な配置を有することができる。例えば、ＷＸＲＥ配列は、プロモーターの前（例えば、コード配列のセンス鎖上の５’から３’）又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの後（例えば、コード配列のセンス鎖上の５’から３’）に位置することができる。いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列とプロモーターの間、又はＷＸＲＥ配列とポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの間には、少なくとも又は約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００又は５０００のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列とプロモーターの間、又はＷＸＲＥ配列とポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの間には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、ｌ０００、２０００、３０００、４０００又は５０００以下のヌクレオチドしか存在しない。いくつかの実施形態において、１つ以上のその他の制御エレメントは、プロモーターとポリペプチドをコードする配列の間に位置する。
いくつかの実施形態において、本公開に記載されている転写制御エレメント（ＷＸＲＥ）の使用により、外因性タンパク質は、発現レベルを大幅に増加（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、又は３０倍）させながら、その生物学的活性を依然として維持することができる。
いくつかの実施形態において、本公開に記載されている転写制御エレメント（ＷＸＲＥ）は、全体として他の制御エレメントと一緒に使用して、外因性タンパク質の発現レベルを大幅に増加させながら、それらの生物学的活性を維持することができる。
したがって、一態様では、本開示は、単離されたポリヌクレオチド分子に関する。この単離されたポリヌクレオチド分子には、以下の（ｉ）から（ｉｖ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む；（ｉ）配列番号３５～４６のいずれか１つの配列；（ｉｉ）配列番号３５～４６のいずれか１つの配列の逆相補配列；（ｉｉｉ）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下又は非常に高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（ｉ）又は（ｉｉ）の配列とハイブリダイズできる配列の逆相補配列；及び（ｉｖ）（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性、又は少なくとも９０％の配列同一性、任意に、少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列。
様々なＷＸＲＥ配列及びそれらを使用するための方法は、例えば、ＷＯ２０２０/０３４０９７Ａ１及びＷＯ２０２０/０３４９８６Ａ１に記載されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本公開のいくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列は、両方のベクターに挿入され得る。それらは同じでも異なっていてもよく、順方向又は逆方向を持つことができる。２つのベクターにおけるＷＸＲＥの例示的な組み合わせを表２に示す。
Figure 0007483907000001
Figure 0007483907000002
Figure 0007483907000003
Figure 0007483907000004
Figure 0007483907000005
発現系
本開示は、本明細書に記載されるようなｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン及び/又は１つ又は複数の制御エレメントを利用する効率的なタンパク質発現系を提供する。本明細書で使用されるように、「タンパク質発現系」又は「発現系」という用語は、宿主と、異種配列（例えば、外因性遺伝子）を含むベクターとを含むシステムであり、宿主における異種配列の発現を達成することができるものを指す。タンパク質発現系には通常、次の成分が含まれる。（１）細菌、酵母、植物細胞、動物細胞などから選択できる、タンパク質を発現する生物である宿主。（２）１つ以上のベクトル。ベクターのタイプは宿主と一致する。宿主に応じて、ベクターは、原核生物（細菌）発現ベクター、酵母発現ベクター、植物発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、昆虫発現ベクターなどであり得る。ベクターには異種遺伝子のフラグメントが含まれている。異種遺伝子は、ベクターを介して宿主で発現させることができる。いくつかの実施形態において、発現されたタンパク質産物は分泌される。いくつかの実施形態において、ベクターは、宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる。
ベクターは、ポリヌクレオチドの送達ビヒクル（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）であり得る。いくつかの実施形態において、ベクターには、特定のタンパク質をコードし、遺伝子操作された組換え技術における該タンパク質の発現を可能にする、それに作動可能に挿入されたポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、宿主細胞の形質導入、形質転換（transduce）、又はトランスフェクションに使用できる。本開示におけるベクターは、染色体、非染色体、及び合成核酸ベクター（様々なエレメントを発現する核酸配列の適切なセットを含む）を含む任意の適切なベクターであり得る。例えば、ベクターは、組換えプラスミドベクター、組換え真核生物ウイルスベクター、組換えファージベクター、組換え酵母ミニ染色体ベクター、組換え細菌人工染色体ベクター、又は組換え酵母プラスミドベクターであり得る。
いくつかの実施形態において、本公開におけるは、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、及びウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）などのベクターを含むことができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
本明細書で使用されるように、本開示における「宿主細胞」という用語は、異種ポリヌクレオチド及び／又はベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、真核生物宿主細胞又は原核生物宿主細胞であり得、ここで、真核生物宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核藻類（ａｌｇａｅ）宿主細胞、線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅ）宿主細胞、原生動物宿主細胞、及び魚宿主細胞であり得る。例示的には、本開示における宿主細胞は、例えば、哺乳動物の宿主細胞などの真核生物の宿主細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞、未成熟ハムスター腎臓細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ）、ＨｅＬａ細胞、ヒトＢ細胞、ｃｖ－１／ＥＢＮＡ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ ２９３）細胞、又はＭＤＣＫ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、アデノウイルス５型（ａｄ５）の形質転換初期領域（Ｅ１）を持つヒト胚性網膜細胞（ＰＥＲ.Ｃ６）である。ＣＨＯ細胞は、バイオ医薬品用タンパク質の生産に日常的に使用されている。いくつかの実施形態において、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、又はＣＨＯ－Ｓ細胞である。好ましい実施形態において、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞である。
タンパク質発現の重要なステップは、目的のタンパク質をコードする異種遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされた組換え宿主細胞の選択である。一般的に使用される選択マーカーのほとんどは、ベクターに含まれている。選択可能なマーカーは、マーカーを含む組換え宿主細胞とマーカーを含まない組換え宿主細胞との分離を可能にする遺伝子又はＤＮＡ配列であり得る。選択マーカーと選択培地の組み合わせは、ベクターでトランスフェクトされた組換え宿主細胞の増殖を可能にし、いくつかの実施形態では、トランスフェクトに失敗した宿主細胞の増殖を阻害する。
抗生物質耐性遺伝子は、組換え宿主細胞選択のために最も一般的に使用されるマーカーである。選択については、選択可能なマーカーとして抗生物質耐性遺伝子を、抗生物質を含む選択培地と併用して達成することができる。例示的な抗生物質選択マーカーには、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ポリミキシンＢ耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシンＢ耐性遺伝子などが含まれるが、これらに限定されない。したがって、選択抗生物質には、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサイクリン、ポリミキシンＢ、エリスロマイシン、カルベニシリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ブラストサイジン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、及びハイグロマイシンＢなどが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、選択マーカーはブラストサイジン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、選択マーカーはゼオシン耐性遺伝子である。
いくつかの実施形態において、選択培地は、以下の成分のうちの１つ以上を含み得る：血清、多糖類（例えば、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）及び／又はデキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓｅ））、ピルビン酸ナトリウム、グルタチオン、エタノールアミン、アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及び／又はバリン）又はその塩、ビタミン（例えば、アスコルビルホスフェート、塩化コリン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、及び／又はイノシトール（ｉ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ））、無機塩（例えば、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び／又はリン酸水素二ナトリウム）、タンパク質（例えば、ヒトトランスフェリン及び／又は組換えインスリン）、及び／又は微量元素（例えば、メタバナジン酸アンモニウム、硫酸銅、二塩化マンガン（ｍａｎｇａｎｏｕｓ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、及び／又は亜セレン酸ナトリウム）。
発現系は、例えば抗体、融合タンパク質、酵素、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質、リボソームタンパク質、ザイモゲン、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Ｇタンパク質、神経活性ペプチド、免疫調節タンパク質、血液成分タンパク質、イオンゲートタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、抗生物質耐性タンパク質、任意の上記タンパク質の機能的フラグメント、任意の上記タンパク質のエピトープフラグメント、及びそれらの任意の組み合わせなどの様々なタンパク質又はポリペプチドを発現するために使用することができる。
本明細書で使用されるように、本公開におけるという用語は「抗体」は、イムノグロブリン、そのフラグメント、又はそれらの誘導体を指す；且つｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏで生成されたかどうかにかかわらず、抗原結合部位を含むすべてのポリペプチドが含まれる。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体（ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、変異抗体（ｍｕｔａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、及び移植抗体（ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）などが含まれるが、これらに限定されない。「抗体」という用語は、さらに例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなどの抗体フラグメント、及び抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメントを含む。典型的には、このようなフラグメントには、抗原結合フラグメントが含まれる。
本明細書で使用されるように、本公開における「融合タンパク質」という用語は、それぞれのペプチド骨格を介して共有結合によって連結された２つ以上のタンパク質又はそのフラグメントを含む分子を指し、より好ましくは、融合タンパク質は、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現によって生成される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質には免疫グロブリンドメインが含まれる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＦｃ融合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、発現系と組み合わせて使用できる抗体には、例えば、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（Ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、オビルトキサキシマブ（Ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、アリロクマブ（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、ラキシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ（Ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、セルトリズマブ（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、カプロマブ（Ｃａｐｒｏｍａｂ）、サトゥモマブ（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、及びムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）が含まれる。
いくつかの実施形態において、本開示において有用な融合タンパク質には、例えば、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、アレファセプト（Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）、アバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）、リロナセプト（Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）、ロミプロスチム（Ｒｏｍｉｐｌｏｓｔｉｍ）、ベラタセプト（Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ）、及びアフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）が含まれる。
いくつかの実施形態において、発現系は、少なくとも２つのトランスポゾンベクターを提供する。１つのトランスポゾンベクターは、第１のポリペプチド（例えば、抗体重鎖）をコードする配列を運ぶように設計されている。第２のトランスポゾンベクターは、第２のポリペプチド（例えば、抗体軽鎖）をコードする配列を運ぶように設計されている。いくつかの実施形態において、１つの単一のトランスポゾンベクターは、２つ以上のポリペプチドをコードする配列を提供する。例えば、抗体重鎖をコードする配列及び抗体軽鎖をコードする配列は、同じトランスポゾンベクター上にあり得る。それらは、トランスポゾンベクターの同じ発現カセット又は異なる発現カセットに配置することができる。
いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、５’から３’までの１つ以上の下記エレメントを含むか、又はそれらからなる配列を含み得る：ＴＴＡＡ、５’－ＩＴＲ、必要に応じて５’－内部ドメイン、プロモーター、標的遺伝子、選択マーカー、必要に応じて３’－内部ドメイン、３’－ＩＴＲ、及びＴＴＡＡ。いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、５’から３’までの１つ以上の下記エレメントを含むか、又はそれらからなる配列を含み得る：ＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位、プロモーター、標的遺伝子、選択マーカー、及びＰＢトランスポザーゼ３’－認識部位。いくつかの実施形態において、配列はさらに２つ以上の制御エレメントを含む。１つの又は２つの制御エレメントは、プロモーターと標的遺伝子の間及び／又は標的遺伝子とｐｏｌｙＡシグナル配列の間に位置する。したがって、いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、５’から３’までの１つ以上の下記エレメントを含むか、又はそれらからなる配列を含み得る：ＴＴＡＡ、５’－ＩＴＲ、必要に応じて５’－内部ドメイン、プロモーター、制御エレメント、標的遺伝子、制御エレメント、ｐｏｌｙＡシグナル配列、選択マーカー用のプロモーター、選択マーカー、選択マーカー用のｐｏｌｙＡシグナル配列、必要に応じて３’－内部ドメイン、３’－ＩＴＲ、及びＴＴＡＡ。いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、５’から３’までの１つ以上の下記エレメントを含むか、又はそれらからなる配列を含み得る：ＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位、プロモーター、制御エレメント、標的遺伝子、制御エレメント、ｐｏｌｙＡシグナル配列、選択マーカー用のプロモーター、選択マーカー、選択マーカー用のｐｏｌｙＡシグナル配列、及びＰＢトランスポザーゼ３’－認識部位。
標的遺伝子は、実際には、２つ以上のポリペプチド（例えば、抗体重鎖及び抗体軽鎖）をコードする配列を含み得る。これらの配列は、自己切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａ）又はプロテアーゼ認識部位（例えば、フューリン（ｆｕｒｉｎ））をコードする配列によって互いに分離することができる。これによって、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、翻訳中又は翻訳後に個々のタンパク質に切断できる単一のポリタンパク質をコードする。同様に、トランスポザーゼベクターは、プロモーター、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼコード配列、ｐｏｌｙＡシグナル配列を含むか、又はそれらからなる配列を有し得る。いくつかの実施形態において、トランスポザーゼベクターは、選択マーカーをさらに含む。
標的遺伝子の発現は、ＷＸＲＥ転写制御エレメントによってさらに増強することができる。いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、５’から３’までの１つ以上の下記エレメント、又はそれからなる配列を含み得る：ＴＴＡＡ、５’－ＩＴＲ、必要に応じて５’－内部ドメイン、ＷＸＲＥ転写制御エレメント、プロモーター、必要に応じてヒトＥＦ－１αの第１のイントロン、制御エレメント、標的遺伝子、制御エレメント、ｐｏｌｙＡシグナル配列、選択マーカー用のプロモーター、選択マーカー、選択マーカー用のｐｏｌｙＡシグナル配列、必要に応じて３’－内部ドメイン、３’－ＩＴＲ、及びＴＴＡＡ。いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターは、５’から３’までの１つ以上の下記エレメント、又はそれからなる配列を含み得る：ＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位、ＷＸＲＥ転写制御エレメント、プロモーター、必要に応じてヒトＥＦ－１αの第１のイントロン、制御エレメント、標的遺伝子、制御エレメント、ｐｏｌｙＡシグナル配列、選択マーカー用のプロモーター、選択マーカー、選択マーカー用のｐｏｌｙＡシグナル配列、及びＰＢトランスポザーゼ５’－認識部位。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、ＣＭＶプロモーターは、配列番号５９に示される配列と配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、配列番号５９に示される配列と配列同一性を有する配列は、配列番号５９に示される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（これらの値の間にすべての範囲とパーセンテージを含む）の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターには、誘導剤への曝露に応答して規定の遺伝子によって産生される遺伝子産物の量を増加させることができる任意のプロモーターが含まれる。したがって、このコンストラクトを使用すると、宿主細胞に導入された標的機能遺伝子又はトランスポザーゼの発現制御が可能になる。誘導性プロモーターは、当業者に知られており、発現を駆動するために使用することができる様々な誘導性プロモーターが存在する。誘導性システムには、例えば、熱ショックプロモーターシステム、メタロチオネインシステム、糖質コルチコイドシステム、組織特異的プロモーターなどが含まれる。７０ ｋＤａの熱ショックタンパク質をコードする遺伝子に一般的に関連するプロモーターなど、熱ショックによって調節されるプロモーターは、高温にさらされると発現を数倍に増加させる可能性がある。糖質コルチコイドシステムは、遺伝子発現の誘発にもうまく機能する。このシステムは、ステロイドホルモン（即ち、糖質コルチコイド又はデキサメタゾンなどのその合成同等物の１つ）の存在下でステロイドホルモンと複合体を形成する糖質コルチコイド受容体タンパク質（ＧＲ）をコードする遺伝子で構成されている。次に、この複合体は糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）と呼ばれる短いヌクレオチド配列（２６ ｂｐ）に結合し、連結された遺伝子は、この結合によって発現が活性化される。したがって、誘導性プロモーターは、導入された遺伝子の発現を制御するための環境誘導性プロモーターとして使用することができる。
いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、Ｔ７プロモーターである。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ＰＡ１ｌａｃＯ１プロモーターである。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ＩＰＴＧ、サリチル酸ナトリウム、オクトピン（ｏｃｔａｐｉｎｅ）、ノパリン、クォーラムシグナル（ｑｕｏｒｕｍ ｓｉｇｎａｌ）３ＯＣ６ＨＳＬ、ａＴｃ、クミン酸（ｃｕｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＤＡＰＧ、及びサリチル酸からなる群から選択される薬剤によって活性化される。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターにはターミネーターがあり、ターミネーターは、誘導性プロモーターの下流にある。外因的に提供されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン阻害システム（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍ）、テトラサイクリン誘導性システム、及びラパマイシン誘導性システムが含まれる。
プロモーターは、さらにポリシストロン性（ジシストロン性又はトリシストロン性）であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、転写ユニットは、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）を含むバイシストロンユニットとして設計することができ、単一のプロモーターからの情報によって遺伝子産物（例えば、抗体重鎖及び抗体軽鎖をコードする）の共発現を可能にする。任意に、場合によっては、単一のプロモーターが以下のＲＮＡの発現を指示することができる。前記ＲＮＡは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に自己切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａ）又はプロテアーゼ認識部位（例えば、フリン）をコードする配列によって互いに分離された２つ又は３つの遺伝子（ＴＣＲのアルファ及び/又はベータチェーンをコードする）を含む。したがって、ＯＲＦは、翻訳中（Ｔ２Ａなどの２Ａの場合）又は翻訳後のいずれかで個々のタンパク質に切断される単一のポリタンパク質をコードする。場合によっては、例えばＴ２Ａなどのペプチドにより、リボソームは２ＡエレメントのＣ末端でのペプチド結合の合成をスキップし（リボソームスキップ（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｓｋｉｐｐｉｎｇ））、これにより、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドが分離され得る。
ヒトＥＦ－１αの第１のイントロンを使用して、発現レベルを上げることができる。ヒトＥＦ－１αの第１のイントロンは、配列番号３４に示される配列と配列同一性を有する配列を有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号３４に示される配列と配列同一性を有する配列は、配列番号３４（ヒトＥＦ－１αの第１のイントロン）に示される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（これらの値の間にすべての範囲とパーセンテージを含む）の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような発現系は、外因性タンパク質の発現量を（例えば、制御エレメント配列又はｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを有しないコントロール発現系と比較して）約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０倍増加させることができる。
本公開は、さらに本明細書に記載の任意のヌクレオチド配列と少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である核酸配列を提供し、及び本明細書に記載の任意のアミノ酸配列と少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるような任意のペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は本明細書に記載されるような任意のヌクレオチド配列によってコードされる任意のアミノ酸配列に関する。いくつかの実施形態において、核酸配列は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又は５０００個未満のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、５００、又は１０００個未満のアミノ酸残基である。
本明細書で使用されるように、本公開における「配列同一性」及び「百分比同一性」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の同一（即ち、相同）のヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージを指す。２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列同一性は、以下の方法によって決定することができる。ポリヌクレオチド又はポリペプチドのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を整列させ、整列されたポリヌクレオチド又はポリペプチドにおける同じヌクレオチド又はアミノ酸残基を含む位置の数をスコアリングし、整列されたポリヌクレオチド又はポリペプチドにおける相異ヌクレオチド又はアミノ酸残基を含む位置の数と比較する。ポリヌクレオチドは１つの位置で異なる場合があり、例えば、異なるヌクレオチド（即ち、置換又は突然変異）を含めることによるか、又はヌクレオチド（１つ以上）を削除することによる（即ち、１つの又は２つのポリヌクレオチドにヌクレオチド（１つ以上）を挿入するか又はヌクレオチド（１つ以上）削除することによる）。ポリペプチドは、例えば、１つの位置で異なる場合があり、例えば、異なるアミノ酸を含むこと（即ち、置換又は突然変異）によるか、アミノ酸の欠失（即ち、１つ以上）による（即ち、ポリペプチドにアミノ酸の挿入（１つ以上）又はアミノ酸の欠失（１つ以上）による）。配列同一性は、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基を含む位置の数を、ポリヌクレオチド又はポリペプチド中のアミノ酸残基の総数で割ることによって計算することができる。例えば、同一性パーセントは、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基を含む位置の数を、ポリヌクレオチドのヌクレオチドの総数又はポリペプチド中のアミノ酸残基の総数で割ることによって計算することができる。したがって、２つの配列間の同一性の割合は、ギャップの数と各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要がある。本開示の目的のために、シーケンスの比較と２つのシーケンス間の同一性パーセントの決定は、例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスと１２のギャップペナルティ、４のギャップ拡張ペナルティ、及び５のフレームシフトギャップペナルティを使用して実行できる。
本開示は、さらに本明細書に記載されるような組換え宿主細胞を含むキット、及び／又は本明細書に記載されるようなベクター又は発現系を含むキットを提供する。
発現系、トランスポゾンベクター、及びトランスポザーゼベクターの使用方法
本公開は、発現系、トランスポゾンベクター、及びトランスポザーゼベクターの使用方法を提供する。
一態様では、本明細書は、宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、又は当技術分野で知られているタンパク質発現に一般的に使用される任意の細胞）において組換えタンパク質を産生するための発現系を使用する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、適切な数の宿主細胞（例えば、少なくとも又は約１００万、２００万、３００万、５００万、６００万、８００万、９００万、１０００万、２０００万、３０００万、４０００万、５０００万、又は１億個）は、適切な量のトランスポゾンベクター（例えば、組換えタンパク質発現プラスミド）、及びトランスポザーゼベクター（例えば、トランスポザーゼ発現プラスミド）でトランスフェクションされる。いくつかの実施形態において、細胞密度は３５０万から４５０万個細胞／ｍＬの範囲であった。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、合計で少なくとも又は約１μｇのトランスポゾンベクターでトランスフェクションされた（例えば、少なくとも又は約１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、又は１００ μｇ）。
いくつかの実施形態において、トランスフェクションに使用されるトランスポゾンベクター（例えば、組換えタンパク質発現プラスミド）、及びトランスポザーゼベクター（例えば、トランスポザーゼ発現プラスミド）は、約１:１、約２:１、約３:１、約４:１、約５:１、約６:１、約７:１、約８:１、約９:１、約１０:１、約１１:１、約１２:１、約１３:１、約１４:１、約１５:１、約１６:１、約１７:１、約１８:１、約１９:１、又は約２０:１の質量比を有する。次に、トランスフェクションされた細胞は、適切な量（例えば、少なくとも又は約１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、又は５０ｍＬ）の宿主細胞培養物に再懸濁される。得られた溶液を混合し、振とうインキュベーター（例えば、Ｋｕｈｎｅｒ（登録商標）振とうインキュベーター）で培養することができる。
ベクターを細胞に導入するために、多くの形質転換又はトランスフェクション技術を使用することができる。エレクトロポレーションは、ＤＮＡを細胞に導入するために使用される一般的な方法でもある。この技術では、細胞は、外因性ＤＮＡ配列の侵入可能のように生体膜を可逆的に透過性にする高電界強度（ｈｉｇｈ ｆｉｅｌｄ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の電気パルスにさらされる。いくつかの実施形態において、受精卵にベクターをマイクロインジェクションする。いくつかの実施形態において、ＰＥＩ（ポリエーテルイミド）を添加して、本明細書に記載されるようなプラスミドを宿主細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）に形質導入することができる。いくつかの実施形態において、マイクロピペットを使用して、ベクターを細胞に直接マイクロインジェクションすることができる。任意に、高速弾道法（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）を使用して、小さなＤＮＡ保有粒子（ｓｍａｌｌ ＤＮＡ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を細胞内に推進することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、ポリエチレングリコールの存在によって透過性になり、拡散によってＤＮＡが細胞に入ることができる。ＤＮＡは、プロトプラストを他のＤＮＡ含有ベクターと融合させることによって細胞に導入することもできる。これらのベクターには、ミニセル（ｍｉｎｉｃｅｌｌ）、細胞、リソソーム、又はその他の可溶性脂質表面体（ｌｉｐｉｄ－ｓｕｒｆａｃｅｄ ｂｏｄｙ）が含まれる。得られた細胞培養物は、インキュベーター（例えば、振とうインキュベーター）内の適切な容器（例えば、スピンチューブ（ｓｐｉｎ ｔｕｂｅ））で培養することができる。
トランスフェクションからの適切な時間（例えば、少なくとも又は約２時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間又はそれ以上）の後、選択抗生物質（例えば、ブラストサイジン、ジェネティシン（Ｇ－４１８）、ハイグロマイシンＢ、ミコフェノール酸、ピューロマイシン、ゼオシン）を含む新しい培地を適切な量（例えば、少なくとも又は約１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、又は２０ｍＬ）でトランスフェクションされた細胞培養物に加えることができる。抗生物質試薬は、本明細書に記載の抗生物質耐性遺伝子に対応する。抗生物質の濃度は、ネイティブ宿主細胞（例えば、未修飾細胞）で（例えば、キル曲線アッセイによって）決定することができる。また、補充培地の濃度は、選択に使用される通常の抗生物質濃度と同じかそれより高くすることができる（例えば、少なくとも又は約２倍、３倍、４倍、５倍又はそれ以上）。
いくつかの実施形態において細胞は、選択した抗生物質を含む新鮮な培地で継代された（例えば、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、又は６日ごと）。播種密度は、細胞増殖条件（例えば、細胞生存率、増殖速度、倍加時間）に基づいて調整できる。
いくつかの実施形態において、適切な期間（約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間以上）の抗生物質による選択後、細胞培養物を使用して、トランスフェクトされた各細胞培養物について決定されたものとほぼ同じ播種密度で、生産用基本培地に別々に接種することができる。生産用細胞培養物は、振とうインキュベーターで培養できる。
いくつかの実施形態において、生産プロセスは、バッチ流加培養によって実行することができる。それに応じて、適切な種類と量の補足培地（ｆｅｅｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）を培養物に補充することができる。
いくつかの局面において、本開示は、ヘテロ多量体（例えば、抗体）の発現を急速に増加させるように設計された方法を提供する。例えば、抗体を効率的に発現させるには、抗体の重鎖と軽鎖を約１：１の比率で発現させる必要がある。選択用抗生物質の濃度が低すぎる場合、細胞内の機能的担体の量が少なすぎる可能性がある。選択用抗生物質の濃度が高すぎると、細胞の培養に不利な条件が生じる可能性がある。いくつかの実施形態において、この方法の発現系は、２つのベクターのペアを含み、１つは抗体重鎖をコードする異種遺伝子を運び、もう１つは抗体軽鎖をコードする異種遺伝子を運ぶ。２つのベクターにおける選択マーカーは異なってもよい。一実施形態において、第１のベクターにおける選択マーカーはブラストサイジンであり、第２のベクターは、ゼオシンである。ブラストサイジン及びゼオシンの濃度は本明細書に記載されるような任意の濃度であり得る。いくつかの実施形態において、この方法は、さらに抗体重鎖をコードする異種遺伝子及び抗体軽鎖をコードする異種遺伝子を含む単一のベクターに関する。２つのベクターの比率を適切に調整する必要がある。多くの異なる条件下での実験に基づいて、本明細書で提供される方法は、抗体を高効率で発現し、比較的短時間でヘテロ多量体発現を確実に増加させるために使用できることが決定された。また、本明細書で提供される方法は、高発現レベルで抗体を発現することができる。したがって、いくつかの実施形態において、この方法は、２つのトランスポゾンベクターのペアで細胞をトランスフェクトすることに関し、１つは第１のポリペプチドをコードする異種遺伝子を保有し、もう１つは第２のポリペプチドをコードする異種遺伝子を保有する。２つの選択マーカーが使用された。１つの選択マーカーはブラストサイジン耐性遺伝子であり、もう１つの選択マーカーはブレオマイシン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、ブラストサイジンは１～１５μｇ/ｍＬの量で選択培地に存在し、ブレオマイシンは５０～１５００μｇ/ｍＬの量で存在した。いくつかの実施形態において、トランスフェクションの約１８～３０時間（例えば、約２４時間）後、ブラストサイジン（例えば、９μｇ/ｍＬ）及びブレオマイシン（例えば、４００μｇ/ｍＬ）を含む適切な細胞培養培地で細胞を培養した。次に、細胞は、ブラストサイジンとブレオマイシンを含む新しい培地に２～４日ごとに継代された。細胞生存率が９０％以上に回復すると、ヘテロマルチマーの発現レベルを流加培養で評価できる。いくつかの実施形態において、流加培養用培地は、本明細書に記載されている任意の培地であり得る。いくつかの実施形態において、流加培養にはブラストサイジンとブレオマイシンが含まれていた。
本開示は、さらにトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。一態様では、この方法は、本明細書に記載されるようなトランスポゾンベクターを含む核酸、及び同じベクター又は別のベクターに本明細書に記載されるようなトランスポザーゼをコードするヌクレオチド配列をエクスビボで非ヒト脊椎動物の胚又は受精された卵母細胞に導入することが含まれる。得られた非ヒト脊椎動物の胚又は受精された卵母細胞を選択し、次に、胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物に発達させるのに有利な条件下で、同じ種の養母（ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒ）に移植することができる。次に、胚はトランスジェニック非ヒト脊椎動物に発達することができ、外因性ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を制作できる。
選択マーカーについては、例えば、抗生物質、農薬（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）、殺虫剤（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ）、除草剤に対する耐性を提供する遺伝子；例えば、目の色や緑色蛍光タンパク質などの宿主の生理機能を変更して、目に見える表現型を変化させる遺伝子；など多くの選択マーカーを使用することができる。挿入されたＤＮＡはゲノムに組み込まれ、その子孫に安定して受け継がれる。いくつかの実施形態において、交雑育種（ｃｒｏｓｓ－ｂｒｅｅｄｉｎｇ）は、挿入された配列を持つヘテロ接合又はホモ接合のトランスジェニック動物を生成するために実行される。
いくつかの実施形態において、動物は、牛、猫、犬、馬、羊、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ミンク（ｍｉｎｋ）、パンダ、又は豚である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物由来であり、本明細書に記載の様々な動物から得ることができる。
一態様では、本開示は、タンパク質を安定して発現する組換え宿主細胞を作製する方法に関する。この方法は、本明細書に記載されるようなベクターを宿主細胞に挿入するステップを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質産生を可能にする条件下で、本明細書に記載されるような組換え宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。
一態様では、本開示は、さらに所望の特性（例えば、結合特異性又は機能性）を有するポリペプチドを同定するための方法を提供する。この方法は、異なる特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの異なるセット、好ましくはプラスミドベクター又は二本鎖ＤＮＡ ＰＣＲアンプリコンを生成することを含む。ここで、前記ポリヌクレオチドは、ＩＴＲ配列の間に位置するポリペプチドをコードする配列を含み、前記ＩＴＲ配列は、少なくとも１つのトランスポザーゼによって認識され、それとともに機能する。次に、ポリヌクレオチドの異なるコレクションが宿主細胞に導入される。前記逆方向末端反復配列と共に機能する少なくとも１つのトランスポザーゼは、異なるセットのポリヌクレオチドが宿主細胞ゲノムに組み込まれて、前記ポリヌクレオチドの異なるセットを発現する宿主細胞の集団を提供するように、宿主細胞で発現される。前記ポリヌクレオチドは、異なる特性を持つポリペプチドをコードする。次に、宿主細胞をスクリーニングして、所望の特性（例えば、結合特異性又は機能性）を有するポリペプチドを発現する宿主細胞を同定する。次に、挿入された配列が宿主細胞から決定される。
一態様では、本開示は、本明細書に記載されるような組換え宿主細胞を含むキットに関して、異常なタンパク質発現に起因する疾患を検出するための試薬又はキットの調製における本明細書に記載されるような組換え宿主細胞の使用方法にも関する。一態様では、本開示は、さらに疾患の治療又は予防のための医薬組成物の調製において本明細書に記載されるような組換え宿主細胞を使用する方法を提供する。本開示は、さらに本明細書に記載の少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つ）のタンパク質（例えば、抗体又は抗原結合フラグメント）を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、当技術分野で知られている任意の方法で調製することができる。
実施例
本発明は、以下の実施例にさらに記載されており、これらは、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ベクターライブラリの構築及び緑色蛍光タンパク質発現用安定池（ｓｔａｂｌｅ ｐｏｏｌ）の構築
１.１ チャイニーズハムスター卵巣細胞のゲノム断片を含むベクターライブラリーの調製
１.１.１ １μｇのＧＦＰ発現ベクター（即ち、図９で示されるベクター）を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを含有する消化キット（ＮＥＢ）に付属のＢａｍＨＩで消化し、線形化させ、３７℃で一晩インキュベートした（酵素切断反応における試薬の組成と含有量を表３に示す）。なお、ＢａｍＨＩは、ＧＦＰに対応するプロモーターの上流に存在する特定の切断部位に対応する他のエンドヌクレアーゼで置き換えることができる。
ＧＦＰ発現ベクターの概略図は、図９に示すようである。
Figure 0007483907000006
１.１.２ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を回収し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ & Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＣＨＯ宿主細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを前述キットに付属の洗浄バッファー１００ μＬに溶解した。
１.１.３ ５ μｇのゲノムＤＮＡを１００ユニット（ｕｎｉｔ）の制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ（ＮＥＢ）又はＤｐｎＩＩ（ＮＥＢ）で消化した（消化反応における試薬の組成と含有量を表４に示す）。ステップ１.１.１で線形化されたベクターのエンドヌクレアーゼの粘着末端と一致する限り、他の制限エンドヌクレアーゼも使用できる。
Figure 0007483907000007
１.１.４ １.１.１で線形化されたベクターは、２ユニットの子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）で３７℃で約３０分間処理された。他のタイプのアルカリホスファターゼも使用できる。
１.１.５ １.１.４で線形化されたＧＦＰ発現ベクターと１.１.３で消化されたＣＨＯゲノムＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動によって分離された。ＧＦＰ発現ベクターの断片と消化されたゲノムの１～４ ｋｂの断片をゲル切断により回収し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して電気泳動したアガロースゲルからＤＮＡを抽出した。
１.１.６ ＤＮＡライゲーションキット（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｔａｋａｒａ, Ｃａｔ# ６０２２）を用いて、１.１.５で回収したＧＦＰ発現ベクターフラグメントとゲノムフラグメントをライゲーションした。ライゲーション反応は１６℃で４５分間行った（ライゲーション反応における試薬の組成と含有量を表５に示す）。
Figure 0007483907000008
１.１.７ １.１.６で得られたライゲーション産物１０μＬを取り、コンピテントセル１００μＬを加え、３０分間氷浴し、４２℃で１分間熱ショックを与え、氷上に１分間置いた。抗生物質を含まない５００μＬの新鮮なＬＢ培地を各チューブに加え、３７℃で細胞を４５分間で復活させた。プレーティングステップを省略し、１００ ｍｇ/Ｌアンピシリンを含む５００ｍＬの培地を直接添加した。ベクター抽出は、プラスミド抽出キット（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して実行された。抽出したＤＮＡをベクターライブラリーとして使用した。
１.１.８ 制限部位がベクターバックボーンの原核生物領域にのみ位置する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＰｖｕＩ（ＮＥＢ））を使用して、１.１.７で得られたベクターライブラリーを線形化し、１.１.１と同じ反応条件下で、３７℃で一晩培養した。翌日、フェノール・クロロホルム法でＤＮＡを回収し、トランスフェクションに使用した。
１.２緑色蛍光タンパク質を発現する安定したプールの構築
１.２.１ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。同時に、Ａｍａｘａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ# ＶＣＡ－１００５）に含まれる９０ μＬのＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２０ μＬのサプリメントＩ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ）及びステップ１.１.８で得られた０.３μｇから０.６ μｇの線形化ベクターライブラリーとよく混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーション用チューブ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｃｕｖｅｔｔｅ）に移した。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍエレクトロポレーターの各宿主細胞に対応するプログラムを使用して、細胞をトランスフェクトした。エレクトロポレーションした細胞を５ｍＬの抗生物質を含まない培地に再懸濁し、３７℃のシェーカーでインキュベートした。
１.２.２ トランスフェクションの２４時間後、ベクター中の耐性遺伝子に対応する抗生物質を含む等量の選択培地を、選択のために細胞培養培地に添加した（この実験では、抗生物質はブレオマイシン（８００μｇ／ｍＬ）であった）。
１.２.３ 細胞は、２～４日ごとにカウントされ、細胞は、その増殖に応じて継代され、ベクターの耐性遺伝子に対応する抗生物質を含む選択培地を使用してスクリーニングされた（この実験では、抗生物質はブレオマイシン（４００μｇ／ｍＬ）であった）。細胞生存率が９０％以上に回復した後、モノクローナルのスクリーニングを準備した。
実施例２：緑色蛍光タンパク質を高発現しているクローンのスクリーニング
２.１ 単細胞のソーティングと増幅
２.１.１ 実施例１のステップ１．２．３で回収されたプールから、より高いＧＦＰ発現レベル（例えば、発現レベルの上位０．５％）を有する細胞を、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩフローサイトメトリーにより培養用９６ウェルプレートにソーティングして、培養した。
２.１.２ 回収された細胞が肉眼で見えるようになるまで、２～４日ごとにプレート内の培地の７５％を交換した。
２.２ ＧＦＰ発現の高いクローンのスクリーニング
２.１.２で回収された細胞は、新しい９６ウェルプレートに順次に移して、合計約３００クローンが得られた（各ウェルのすべての細胞は、１つの細胞に由来するため、本明細書ではクローンと呼ばれる）。ＧＦＰの発現レベルはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩフローサイトメーターによって検出され、上位１０％の検出強度のクローンは増幅のために２４ウェルプレートに移された。
実施例３：転写制御エレメントのスクリーニング、同定及び検証
３.１転写制御エレメントの候補配列の同定
３.１.１ ２.２での２４ウェルプレートで増殖した細胞がプレートの底に実質的にコンフルエントになったとき、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して各クローンのゲノムを抽出した。
３.１.２ ベクター内にフォワードプライマーとリバースプライマー（それぞれＢａｍＨＩの制限部位の約２００ｂｐ上流と下流）を設計し、３.１.１で抽出したゲノムに対してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応において、フォワードプライマーの配列は、ＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧ（配列番号６９）であり、リバースプライマーの配列は、ＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡ（配列番号７０）である。
上記のＰＣＲ反応の反応系は表６に示すようである。
Figure 0007483907000009
上記のＰＣＲ反応の反応ステップは表７に示すようである。
Figure 0007483907000010
３.１.３ ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルを切断して１ ｋｂ以上の特定のバンド（１つ以上）を回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＤＮＡを抽出した。
３.１.４ 回収されたバンド（１つ以上）はシーケンスに委託して、候補となる転写制御エレメントの配列Ａ~Ｇが同定された。
３.１.５ シーケンシングにより同定された転写制御エレメントの配列Ａ～Ｇは以下のとおりであり、その中で、
転写制御エレメントＡの配列は、配列番号３５に示される配列である（転写制御エレメントＡの逆配列は、配列番号４７に示される配列である）；
転写制御エレメントＢの配列は、配列番号３６に示される配列である（転写制御エレメントＢの逆配列は、配列番号４８に示される配列である）；
転写制御エレメントＣの配列は、配列番号３７に示される配列である（転写制御エレメントＣの逆配列は、配列番号４９に示される配列である）；
転写制御エレメントＤの配列は、配列番号３８に示される配列である（転写制御エレメントＤの逆配列は、配列番号５０に示される配列である）；
転写制御エレメントＥの配列は、配列番号３９に示される配列である（転写制御エレメントＥの逆配列は、配列番号５１に示される配列である）；
転写制御エレメントＦの配列は、配列番号４０に示される配列である（転写制御エレメントＦの逆配列は、配列番号５２に示される配列である）；
転写制御エレメントＧの配列は、配列番号４１に示される配列である（転写制御エレメントＧの逆配列は、配列番号５３に示される配列である）；
転写制御エレメントＨの配列は、配列番号４２に示される配列である（転写制御エレメントＨの逆配列は、配列番号５４に示される配列である）；
転写制御エレメントＩの配列は、配列番号４３に示される配列である（転写制御エレメントＩの逆配列は、配列番号５５に示される配列である）；
転写制御エレメントＪの配列は、配列番号４４に示される配列である（転写制御エレメントＪの逆配列は、配列番号５６に示される配列である）；及び
転写制御エレメントＫの配列は、配列番号４５に示される配列である（転写制御エレメントＫの逆配列は、配列番号５７に示される配列である）。
３.２ 転写制御エレメントの検証
３.２.１ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローナルキット（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）（Ｔａｋａｒａ）を使用して、３.１.５でシーケンシングして特定された転写制御エレメントＡ～Ｋを、ＧＦＰ遺伝子含有ベクターの対応するプロモーターの上流のＢａｍＨＩ制限部位にそれぞれ挿入した。図１０に示すように転写制御エレメントが挿入されたベクターが得られた（ここで、ＷＸＲＥは、転写制御エレメントＡからＫのうちの１つを示す）。前述のベクターは、ベクターバックボーンの原核生物領域にのみ位置する制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＰｖｕＩ（ＮＥＢ））を使用して線形化され、３７℃で一晩インキュベートされた。翌日、フェノール－クロロホルムでＤＮＡを回収し、トランスフェクションに使用した。
３.２.２ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。同時に、Ａｍａｘａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ# ＶＣＡ－１００５）に含まれる９０ μＬのＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２０ μＬのサプリメントＩ及び発現させるタンパク質の遺伝子を含む線形化ベクター（３.２.１で得られた）３０ μｇを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーションチューブに移した。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標） Ｓｙｓｔｅｍエレクトロポレーターの各宿主細胞に対応するプログラムを使用して、細胞をトランスフェクトした。エレクトロポレーションした細胞を５ｍＬの抗生物質を含まない培地に再懸濁し、３７℃のシェーカーで培養した。各サンプルには１つの転写制御エレメントが含まれているか、転写制御エレメントのないコントロールであった。
３.２.３ トランスフェクションの２４時間後、ベクター中の耐性遺伝子に対応する抗生物質を含む等量の選択培地を、選択のために細胞培養培地に添加した。抗生物質（１つ以上）を含む培地を使用して、細胞を２～４日ごとに継代した。
３.２.４ 細胞生存率が９０％以上に回復した後、タンパク質の発現レベルに対する転写制御エレメントＡからＫの効果をバッチ流加培養によって評価した。
実施例４：異種タンパク質の発現に使用されるタンパク質発現システムの発現レベルに対する転写制御エレメントの影響
４.１.１ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を使用して、転写制御エレメントＡ～Ｋを融合タンパク質（前述の融合タンパク質はＰＤ－Ｌ１のＡ鎖であり、その配列は配列番号７１に示す配列である）のプロモーターの上流ＢａｍＨＩ位置に順方向及び逆方向に構築した。図１０に示すように、転写制御エレメントが挿入されたベクター（ＷＸＲＥは転写制御エレメントＡ～Ｋの１つである）を取得し、転写制御エレメントのテール番号１は順方向を示し、転写制御エレメントのテール番号２は逆方向を示す。例えば、転写制御エレメントＡ１（配列番号３５に示されている）は、コード配列のセンス鎖に転写された、配列の順方向（即ち、５'から３'）を示す。転写制御エレメントＡ２は、配列の逆相補体を示し、配列番号４７に示されている。即ち、実施例４のタンパク質コード配列のセンス鎖の転写制御エレメントＡ１は、本開示の実施例３の転写制御エレメントＡと同等である。
前述のベクターは、ベクター骨格の原核生物領域にのみ位置する制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＰｖｕＩ（ＮＥＢ））を使用して線形化され、３７℃で一晩インキュベートされた。翌日、翌日、フェノール－クロロホルムでＤＮＡを回収し、トランスフェクションに使用した。
４.１.２ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。同時に、Ａｍａｘａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ# ＶＣＡ－１００５）に含まれる９０ μＬのＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２０ μＬのサプリメントＩ及び融合タンパク質（４.１.１で取得）の遺伝子を含む線形化ベクター３０ μｇを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーションチューブ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｃｕｖｅｔｔｅ）に移した。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標） Ｓｙｓｔｅｍエレクトロポレーターの各宿主細胞に対応するプログラムを使用して、細胞をトランスフェクトした。エレクトロポレーションした細胞を５ｍＬの抗生物質を含まない培地に再懸濁し、３７℃のシェーカーで培養した。１グループのサンプルには、特定の方向（つまり、順方向又は逆方向）の転写調節エレメントが１つだけ含まれ、転写調節エレメントを含まないサンプルがコントロールとした。
４.１.３ トランスフェクションの２４時間後、８００μｇ/ｍＬのブレオマイシンを含む等量の培地をトランスフェクトされた細胞に添加した。
４.１.４ ４００μｇ/ｍＬのブレオマイシンを含む培地で２～４日ごとに細胞を継代した。
４.１.５ 細胞生存率が９０％以上に回復した後、融合タンパク質ＰＤ－Ｌ１の発現レベルをバッチ流加培養によって評価した。
４.１.６ 発現により得られたＰＤ－Ｌ１の配列が配列番号７１に示す配列と同一であるかどうかを確認した。
４.２ 実験結果
図１１に示すように、融合タンパク質のプロモーターの上流に転写制御エレメントを挿入すると、転写制御エレメントを含まない対照群と比較して、標的タンパク質の発現レベルを約１０％から２５％増加させることができた（図１１におけるＡ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ２、Ｅ２、Ｆ２、Ｇ１、Ｈ１、Ｉ２、Ｊ１、及びＫ２を参照）。前述の配列は、プロモーターの方向性に関連している可能性があるから、ある方向でのタンパク質発現を別の方向よりもよく促進する。
図１２に示すように、発現レベルに対応して、順方向又は逆方向の転写制御エレメントは、ユニット生産性を約１０％増加させ、特定の生産性を約１０％増加させることができた（図１２におけるＡ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ２、Ｅ２、Ｆ２、Ｇ１、Ｈ１、Ｉ２、Ｊ１、及びＫ２を参照）。
そして発現により得られたＰＤ－Ｌ１の配列は、配列番号７１に示す配列と同一であることが確認された。
実施例５：アダリムマブの発現に使用されるタンパク質発現システムの発現レベルに対する転写制御エレメントの影響
５.１.１ 転写制御エレメントＡの逆配列（Ａ２）、転写制御エレメントＢの順配列（Ｂ１）、及び転写制御エレメントＧの順配列（Ｇ１）は、アダリムマブを発現する遺伝子のプロモーターの上流に、タカラ社のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングキットを使用して構築された（具体的な条件を表７に示す）。図１３及び図１４に示すように、それぞれ、転写制御エレメントが挿入されたベクター（ＷＸＲＥは転写制御エレメントＡ～Ｇの一種である）を取得した。「重鎖の上流の転写制御エレメント」は図１３に示すベクターにクローン化され、「軽鎖の上流の転写制御エレメント」は図１４に示すベクターにクローン化された。その中で、図１３のアダリムマブの重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列は、配列番号７２に示されている。図１４のアダリムマブの軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列を配列番号７３に示されている。
前述のベクターは、ベクターのバックボーンの原核生物領域にのみ位置する制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＰｖｕＩ（ＮＥＢ））を使用して線形化され、３７℃で一晩インキュベートされた。翌日、フェノール－クロロホルムでＤＮＡを回収し、トランスフェクションに使用した。
Figure 0007483907000011
５.１.２ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。同時に、Ａｍａｘａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ# ＶＣＡ－１００５）に含まれる９０ μＬのＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２０ μＬのサプリメントＩ及びアダリムマブの配列を含む線形化ベクター（５.１.１で得られた）３０ μｇを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーションチューブ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｃｕｖｅｔｔｅ）に移した。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標） Ｓｙｓｔｅｍエレクトロポレーターの各宿主細胞に対応するプログラムを使用して、細胞をトランスフェクトした。エレクトロポレーションした細胞を５ｍＬの抗生物質を含まない培地に再懸濁し、３７℃のシェーカーで培養した。１グループのサンプルには、特定の方向（つまり、順方向又は逆方向）の転写調節エレメントが１つだけ含まれ、転写調節エレメントを含まないサンプルがコントロールとした。
５.１.３ 抗体発現の迅速な評価のために設計された方法を使用した。この方法により、抗体の重鎖と軽鎖がほぼ１：１の比率で発現され、抗体の発現を比較的短時間で確実に評価できる。トランスフェクションの２４時間後、１８μｇ/ｍＬのブラストサイジンと８００μｇ/ｍＬのブレオマイシンを含む等量の培地をトランスフェクトした細胞に添加した。
５.１.４ ９μｇ/ｍＬブラストサイジンと４００μｇ/ｍＬブレオマイシンを含む培地を使用して、２～４日ごとに細胞を継代した。
５.１.５ アダリムマブの発現レベルは、細胞生存率が９０％以上に回復したときに流加培養によって評価された。アダリムマブの重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの両方を同じ宿主細胞にトランスフェクトできるため、アダリムマブの重鎖と軽鎖を同時に発現させることができる。前述の重鎖及び軽鎖は宿主細胞内で自己組織化することができるため、無傷のアダリムマブが得られた。
５.１.６ 得られたアダリムマブの生物活性の測定。
５.２ 実験結果
対照群と比較して、転写制御エレメントＢを含むいくつかのフォワード配列（サンプル１、２、及び４を参照）では、アダリムマブの発現レベルが１０％から２０％増加した（図１５を参照）。
本異種タンパク質発現ベクターから発現されるアダリムマブの生物学的活性を決定することにより、その生物学的活性は、既知の市販のアダリムマブのものと同一であることが見出された。
実施例６：トランスポゾンベースの安定性プールの開発
組換えタンパク質発現遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼによって認識される一対の末端反復配列の間に挿入された。例えば、組換えタンパク質（例えば、抗体又はＦｃ融合タンパク質）が複数の発現ユニットを含む場合、これらの異なる発現ユニットは、異なる抗生物質耐性遺伝子を含むベクターにクローン化することができた。
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ発現遺伝子を含むプラスミド及び組換えタンパク質発現遺伝子を含むプラスミドは、それぞれエンドトキシンフリープラスミドキットによって調製された。これらのプラスミドは、いずれも消化によって線形化する必要はなかった。
トランスフェクションに使用された宿主細胞は、懸濁液に適応したＣＨＯ－Ｋ１細胞であった。宿主細胞の生細胞密度は、１００万から３００万細胞/ｍＬの間であることが望ましい。
異なるヒトＩｇＧ１抗体（Ａ、Ｂ及びＣ）を発現する細胞プールを生成するため、１,０００万個の宿主細胞に、抗体発現のために１０：１の質量比であるトランスポゾンベクターとトランスポザーゼベクターの合計２０ μｇをトランスフェクトした。トランスポゾンベクターは、約１：１の比率である抗体重鎖用のトランスポゾンベクターと抗体軽鎖用のトランスポゾンベクターを含む。
次に、トランスフェクトした細胞を１０ｍＬの細胞培養液に再懸濁した。コントロールについては、同量の宿主細胞に同量の線状化抗体発現プラスミドをトランスフェクトした。これらの線形化された抗体発現核酸は、トランスポザーゼ発現プラスミドに挿入されなかった。細胞をプラスミドと混合し、Ｋｕｈｎｅｒ（登録商標）振とうインキュベーターで培養した。
トランスフェクションの２４時間後、選択用の抗生物質を含む１０ｍＬの新鮮な培地を細胞培養に加えた。抗生物質は抗生物質耐性遺伝子に対応する。抗生物質濃度は、宿主細胞での殺傷曲線実験によって決定された。また、補充培地の濃度は、選択用の抗生物質濃度の２倍だった。これにより、得られた細胞培養の実際の抗生物質濃度を選択用の抗生物質濃度レベルにすることができた。
細胞は、選択した抗生物質を含む新鮮な培地で２～４日ごとに継代された。播種密度は、細胞の生存率、増殖速度、倍加時間に基づいて調整された。
約２週間の培養後、細胞培養物を使用して、トランスフェクトされた各細胞培養物について決定されたのと同じ播種密度で生産基本培地に接種した。振とうインキュベーターで生産用細胞培養を増殖させた。
生産プロセスは、バッチ流加培養によって実施された。したがって、適切な種類及び量の補足培地を培養物に補充した。
結果を図２に示す。１４日間の培養後、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムを使用した宿主細胞のバッチ供給培養により、２.４ｇ/Ｌの抗体Ａ、４.１ｇ/Ｌの抗体Ｂ、及び４.６ｇ/Ｌの抗体Ｃ（ＰＢ Ｄ１４力価）が生成された。図が示すように、可変領域の異なる配列は、異なる発現レベルをもたらす可能性がある。しかし、各抗体について、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現システムは発現レベルを大幅に増加させた。
対照的に、従来の安定したプールコントロールは０.２ｇ /Ｌ未満の抗体を産生した（従来のプールＤ１４力価）。したがって、同じ条件下で、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムはタンパク質発現を１０倍以上増加させた。
実施例７：制御エレメントのスクリーニング
以下に説明するように、ＣＨＯ－Ｋ１細胞からのｍＲＮＡのＲＮＡシーケンシングは様々な段階で実施された。一過性／安定なトランスフェクションを行い、以下のサンプルから全ＲＮＡを抽出した。サンプルは、１）一過性トランスフェクション後６日目に１０個のサンプル；２）一過性トランスフェクション後８日目に１０個のサンプル；３）従来のバッチ供給を１４日間実施する過程中の、１０日目に安定してトランスフェクトされた１０個のサンプル；である。
ｃＤＮＡが生成され、配列決定された。相対的な読み取り長に基づいて、ｍＲＮＡが抽出され、３０個のサンプルすべての平均存在量によってランク付けされた。制御エレメント（ＲＥ）配列は、上位のｍＲＮＡから抽出され、以下の表にリストされている。
Figure 0007483907000012
タンパク質発現に対するこれらのＲＥ配列の効果を評価するために実験が行われた。これらのＲＥ配列は、組換えタンパク質発現遺伝子の直後に融合タンパク質発現プラスミドに組み込まれた。対照サンプルには、制御エレメント配列は含まれていなかった。
合計１,０００万個の宿主細胞に、異なるＲＥ配列を持つ２０ μｇの融合タンパク質発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を１０ｍＬの宿主細胞培養物に再懸濁した。得られた溶液を混合し、Ｋｕｈｎｅｒ（登録商標）振とうインキュベーターで培養した。
トランスフェクションの２４時間後、選択抗生物質を含む１０ｍＬの新鮮な培地をトランスフェクトされた細胞培養物に加えた。細胞は、選択した抗生物質を含む新鮮な培地で２～４日ごとに継代された。播種密度は、細胞の生存率、増殖速度、倍加時間に基づいて調整された。
抗生物質の選択の約２週間後、細胞培養物を別々に使用して、トランスフェクトされた各細胞培養物について決定されたのと同じ播種密度で生産基本培地に接種した。振とうインキュベーターで生産用細胞培養を増殖させた。
生産プロセスは、バッチ流加培養によって実施された。したがって、適切な種類及び量の補足培地を培養物に補充した。
図３に示すように、ほとんどの制御エレメントは、コントロールと比較してタンパク質発現の生産性を少なくとも１０％増加させた。
実施例８：ｐｉｇｇｙＢａｃと制御エレメントの組み合わせ
組換えタンパク質発現遺伝子、標準的な制御エレメント配列、及び抗生物質耐性遺伝子は、ｐｉｇｇｙＢａｃリコンビナーゼによって認識される一対の末端反復配列の間にクローン化された。例えば、組換えタンパク質（例えば、抗体又はＦｃ融合タンパク質）が複数の発現ユニットを含む場合、これらの異なる発現ユニットは、異なる抗生物質耐性遺伝子を含むベクターにクローン化することができた。
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ発現遺伝子を含むプラスミド及び組換えタンパク質発現遺伝子を含むプラスミドは、それぞれ、エンドトキシンフリーのプラスミドキットによって調製された。これらのプラスミドはいずれも消化によって線形化されなかった。
トランスフェクションに使用した宿主細胞は、懸濁液に適応したＣＨＯ－Ｋ１細胞であった。宿主細胞の生細胞密度は、１００万から３００万細胞/ｍＬの間であることが望ましい。
異なるヒトＩｇＧ１抗体（Ｄ、Ｅ、及びＦ）を発現する細胞のプールを生成するために、１,０００万個の宿主細胞に２０ μｇのｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター（ＷＸＲＥ ＩＤ：Ｂ（配列番号３６）有り／なし）とトランスポザーゼベクターを１０：１の質量比でトランスフェクトした。次に、トランスフェクトされた細胞を１０ｍＬの宿主細胞培養物に再懸濁した。従来の安定したプールコントロールとして、同量の宿主細胞に同量の線状化抗体発現プラスミドをトランスフェクトした。得られた溶液を混合し、Ｋｕｈｎｅｒ（登録商標）振とうインキュベーターで培養した。
トランスフェクションの２４時間後、選択抗生物質を含む１０ｍＬの新鮮な培地をトランスフェクトされた細胞培養物に加えた。抗生物質は、本明細書で決定される抗生物質耐性遺伝子に対応した。抗生物質濃度は、宿主細胞での殺傷曲線実験によって決定された。また、補充培地の濃度は、選択に使用される選択された抗生物質濃度の２倍であるため、得られる細胞培養物の実際の抗生物質濃度は、選択された抗生物質濃度と同じであった。
細胞は、選択した抗生物質を含む新鮮な培地で２～４日ごとに継代された。播種密度は、細胞の生存率と倍加時間に基づいて調整された。
抗生物質選択の２週間後、細胞培養物を別々に使用して、トランスフェクトされた各細胞培養物について決定されたのと同じ播種密度で生産基本培地に接種した。振とうインキュベーターで生産用細胞培養を増殖させた。
生産プロセスは、バッチ流加培養によって実行された。したがって、適切な種類及び量の補足培地を培養物に補充した。
図４に示すように、１４日後、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムのみ（ＲＥ配列なし）を使用した生産用細胞培養の３つのグループのタンパク質発現（力価）は、それぞれ２.１ｇ/Ｌ、３.９ｇ/Ｌ、及び５.５ ｇ/Ｌであった。それに対して、抗体発現プラスミドにＲＥ配列が存在する場合、発現はそれぞれ２.８ｇ/Ｌ、５.２ｇ/Ｌ、６.５ ｇ/Ｌに増加した。結果は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムと制御エレメント配列（例えば、ＷＸＲＥ）の組み合わせがタンパク質生産をさらに増加させることができることを示している。
他の実施形態
本発明は本発明の詳細な説明と併せて説明されてきたが、前述の説明は例示を意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の側面、利点、及び修正は、添付の特許請求の範囲内にある。
本発明は、下記の態様を含む：
〈態様１〉
５’－ＩＴＲ（逆方向末端反復）配列；
３’－ＩＴＲ配列；及び
配列番号１～１５及び配列番号３５～５８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である制御エレメント配列；
を含む、核酸。
〈態様２〉
前記５’ＩＴＲ配列は、配列番号６８と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記３’ＩＴＲ配列は、配列番号６０と少なくとも９０％同一である配列を含むか、或いはそれからなる、態様１に記載の核酸。
〈態様３〉
前記５’ＩＴＲ配列は、配列番号６８を含み、前記３’ＩＴＲ配列は、配列番号６０を含む、態様１に記載の核酸。
〈態様４〉
さらに５’－内部ドメイン及び３’－内部ドメインを含む核酸であって、前記５’－内部ドメインが、配列番号６６と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記３’－内部ドメインが、配列番号６７と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記５’－内部ドメインが前記５’－ＩＴＲに直接隣接しており、前記３’－内部ドメインが前記３’－ＩＴＲに直接隣接している、態様１に記載の核酸。
〈態様５〉
前記核酸は、配列番号１～１５からなる群から選択される１つ以上の制御エレメント配列を含む、態様１に記載の核酸。
〈態様６〉
前記核酸は、配列番号３５～４６からなる群から選択される１つ以上の制御エレメント配列を含む、態様１に記載の核酸。
〈態様７〉
さらにプロモーター及びポリペプチドをコードする配列を含む核酸であって、前記ポリペプチドをコードする配列が前記プロモーターに作動可能に連結されている、態様１に記載の核酸。
〈態様８〉
前記ポリペプチドをコードする配列は、２つの制御エレメント配列の間に位置する、態様７に記載の核酸。
〈態様９〉
さらにプロモーター及び２つ以上のポリペプチドをコードする配列を含み、前記２つ以上のポリペプチドをコードする配列が前記プロモーターに作動可能に連結されている、態様１に記載の核酸。
〈態様１０〉
前記配列が抗体重鎖及び抗体軽鎖をコードする、態様９に記載の核酸。
〈態様１１〉
前記核酸は、さらに配列番号３５～４６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一性を有するＷＸＲＥ配列を含む、態様１に記載の核酸。
〈態様１２〉
前記核酸が２つ以上の発現カセットを含む、態様１に記載の核酸。
〈態様１３〉
前記核酸が選択マーカーを含む、態様１に記載の核酸。
〈態様１４〉
前記選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする配列、又はｌａｃＺである、態様１３に記載の核酸。
〈態様１５〉
態様１に記載の核酸を含むベクター。
〈態様１６〉
前記５’－ＩＴＲは、ＴＲ Ｌ 、５’－ＩＴＲスペーサー、ＩＲ Ｌ を含み、前記３’－ＩＴＲは、ＩＲ Ｒ 、３’－ＩＴＲスペーサー、ＴＲ Ｒ を含む、態様１に記載の核酸。
〈態様１７〉
前記ＴＲ Ｌ が、配列番号６１の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み；前記５’－ＩＴＲスペーサーは、配列番号６２の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み；前記ＩＲ Ｌ が、配列番号６３の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み；前記ＴＲ Ｒ が、配列番号６４の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み；前記ＩＲ Ｒ が、配列番号６５の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、態様１６に記載の核酸。
〈態様１８〉
５’から３’の方向に以下の遺伝的エレメントを含む態様１５に記載のベクター：
ＴＲ Ｌ 、５’－ＩＴＲスペーサー、ＩＲ Ｌ を含む５’－ＩＴＲ；
プロモーター；
制御エレメント配列；
タンパク質コード配列；及び
ＩＲ Ｒ 、３’－ＩＴＲスペーサー、ＴＲ Ｒ を含む３’－ＩＴＲ。
〈態様１９〉
前記ＴＲ Ｌ が、配列番号６１の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み；前記５’－ＩＴＲスペーサーは、配列番号６２の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み；前記ＩＲ Ｌ が、配列番号６３の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み；前記ＴＲ Ｒ が、配列番号６４の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み；前記ＩＲ Ｒ が、配列番号６５の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、態様１８に記載のベクター。
〈態様２０〉
態様１に記載の核酸を含む細胞。

Claims (19)

  1. ５’－ＩＴＲ（逆方向末端反復）配列；
    ３’－ＩＴＲ配列；及び
    配列番号４６、４３、３６、５８、５５、及び４８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である制御エレメント配列；
    を含む、核酸。
  2. 前記５’ＩＴＲ配列は、配列番号６８と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記３’ＩＴＲ配列は、配列番号６０と少なくとも９０％同一である配列を含むか、或いはそれからなる、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記５’ＩＴＲ配列は、配列番号６８を含み、前記３’ＩＴＲ配列は、配列番号６０を含む、請求項１に記載の核酸。
  4. さらに５’－内部ドメイン及び３’－内部ドメインを含む核酸であって、前記５’－内部ドメインが、配列番号６６と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記３’－内部ドメインが、配列番号６７と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記５’－内部ドメインが前記５’－ＩＴＲに直接隣接しており、前記３’－内部ドメインが前記３’－ＩＴＲに直接隣接している、請求項１に記載の核酸。
  5. 前記核酸は、配列番号４６、４３、３６、５８、５５、及び４８からなる群から選択される１つ以上の制御エレメント配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  6. さらにプロモーター及びポリペプチドをコードする配列を含む核酸であって、前記ポリペプチドをコードする配列が前記プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の核酸。
  7. 前記ポリペプチドをコードする配列は、２つの制御エレメント配列の間に位置する、請求項６に記載の核酸。
  8. さらにプロモーター及び２つ以上のポリペプチドをコードする配列を含み、前記２つ以上のポリペプチドをコードする配列が前記プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の核酸。
  9. 前記配列が抗体重鎖及び抗体軽鎖をコードする、請求項８に記載の核酸。
  10. 前記核酸は、さらに配列番号３５～４６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一性を有するＷＸＲＥ配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  11. 前記核酸が２つ以上の発現カセットを含む、請求項１に記載の核酸。
  12. 前記核酸が選択マーカーを含む、請求項１に記載の核酸。
  13. 前記選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする配列、又はｌａｃＺである、請求項１２に記載の核酸。
  14. 請求項１に記載の核酸を含むベクター。
  15. 前記５’－ＩＴＲは、ＴＲＬ、５’－ＩＴＲスペーサー、ＩＲＬを含み、前記３’－ＩＴＲは、ＩＲＲ、３’－ＩＴＲスペーサー、ＴＲＲを含む、請求項１に記載の核酸。
  16. 前記ＴＲＬが、配列番号６１の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記５’－ＩＴＲスペーサーは、配列番号６２の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記ＩＲＬが、配列番号６３の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記ＴＲＲが、配列番号６４の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み、かつ前記ＩＲＲが、配列番号６５の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１５に記載の核酸。
  17. ５’から３’の方向に以下の遺伝的エレメントを含む請求項１４に記載のベクター：
    ＴＲＬ、５’－ＩＴＲスペーサー、ＩＲＬを含む５’－ＩＴＲ；
    プロモーター；
    制御エレメント配列；
    タンパク質コード配列；及び
    ＩＲＲ、３’－ＩＴＲスペーサー、ＴＲＲを含む３’－ＩＴＲ。
  18. 前記ＴＲＬが、配列番号６１の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記５’－ＩＴＲスペーサーは、配列番号６２の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記ＩＲＬが、配列番号６３の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み、前記ＴＲＲが、配列番号６４の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含み、かつ前記ＩＲＲが、配列番号６５の逆配列又は逆相補配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１７に記載のベクター。
  19. 請求項１に記載の核酸を含む細胞。
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