TR201815563T4 - Anti-alfa sinüklein bağlayıcı moleküller. - Google Patents

Anti-alfa sinüklein bağlayıcı moleküller. Download PDF

Info

Publication number
TR201815563T4
TR201815563T4 TR2018/15563T TR201815563T TR201815563T4 TR 201815563 T4 TR201815563 T4 TR 201815563T4 TR 2018/15563 T TR2018/15563 T TR 2018/15563T TR 201815563 T TR201815563 T TR 201815563T TR 201815563 T4 TR201815563 T4 TR 201815563T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
synuclein
antibodies
antigen
human
Prior art date
Application number
TR2018/15563T
Other languages
English (en)
Inventor
Weihofen Andreas
Grimm Jan
Hock Christoph
Nitsch Roger
Su Lihe
Weinreb Paul
Original Assignee
Biogen Int Neuroscience Gmbh
Univ Of Zuerich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Int Neuroscience Gmbh, Univ Of Zuerich filed Critical Biogen Int Neuroscience Gmbh
Publication of TR201815563T4 publication Critical patent/TR201815563T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Anti-insan a-sinüklein-spesifik bağlanma molekülleri, örneğin antikorlar veya bunların antijen bağlayıcı fragmanları, varyantları veya türevlerine ilaveten ilgili yöntemler sunulmuştur. Ayrıca sunulanlar, insan a-sinüklein üzerindeki spesifik N-terminal ve C-terminal epitoplarına bağlanan anti-insan a-sinüklein bağlayıcı moleküllerdir. Burada tarif edilen bağlanma molekülleri, sırasıyla a-sinüklein hedefli immünoterapi ve tanı için farmasötik ve tanısal bileşimlerde kullanılabilir.

Description

TARIFNAME ANTI-ALFA SINÜKLEIN BAGLAYICI MOLEKÜLLER BULUSUN ARKAPLANI Mevcut bulus genel olarak yeni gelistirilen d-sinüklein- spesifik baglanma molekülleri, özellikle insan antikorlarinin yani sira bunlarin sirasiyla d-sinüklein ve agrege d-sinüklein formlarini taniyan fragmanlari, türevleri ve 'varyantlari ile ilgilidir. Ek olarak mevcut bulus, bu tür baglanma moleküllerini, antikorlarini ve bunlarin taklitlerini içeren, hem plazma ve BOS'taki (Beyin Omurilik Sivisi) d-sinüklein toksik türlerini tanimlamak için bir tani araci olarak hem de ayni zamanda Parkinson hastaligi (PH), Lewy cisimcikli demans (LCD) ve Alzheimer hastaligi (AH) ve diger sinükleinopatik hastaliklarin Lewy cisimcik varyanti gibi d-sinüklein agregeleri ile ilgili bozukluklarin tedavi edilmesi için pasif asilama stratejilerinde degerli olan farmasötik ve tanisal bilesimlere iliskindir.
Protein yanlis katlanmasi ve agregasyonu, birçok nörodejeneratif hastaligin patolojik yönleridir. d-sinüklein agregatlari, Lewy cisimciklerinin ve Parkinson hastaligi (PH) ile iliskili Lewy nevritlerinin majör bilesenleridir. Dogal olarak katlanmamis bir protein olan d-sinüklein, oligomerler, protofibriller ve fibrilleri içeren farkli agrege morfolojileri benimseyebilir. Küçük oligomerik agregelerin özellikle toksik oldugu gösterilmistir.
Saglikli kisilerde d-sinüklein'e karsi dogal olarak olusan otoantikorlar saptanmis ve hastalardaki degisken seviyeler, belirli nörodejeneratif bozukluklarla iliskilendirilmistir; inceleme için bkz., Neff ve arkadaslari, Autoimmun. Rev 7 (2008), 501-507. Bu nedenle, Parkinson hastaligindan muzdarip hastalarda, kendiliginden veya asilama sirasinda, özellikle saglikli hastalarda, dogal olarak olusan antikorlar, d-sinüklein agregasyonuna göre koruyucu bir rol oynayabilir; bakiniz örn., Simdiye kadar, otoantikorlarin terapötik öneminin degerlendirilmesi zor olmustur. Bu çogunlukla bunlarin in vitro izolasyonu ve ardil karakterizasyonu için dolaysiz deneysel yaklasimlarin eksikliginden kaynaklanmaktadir.
Son zamanlarda, plazmada ve BOS'da hücre disi olarak d- sinüklein oligomerik türleri bildirilmistir (El-Agnaf ve modellerindeki immünizasyon çalismalari, d-sinükleine karsi hücre disi fare monoklonal antikorlarinin, hücre içi d-sinüklein agregatlarinin birikimini azaltabildigini göstermekte, (Masliah sinükleinin yararli fonksiyonlarina müdahale etmeden nörotoksik agregatlari nötralize eden antikorlarin yararli terapötikler olabilecegi fikrini desteklemektedir. Bununla birlikte, insandaki murin bazli antikorlarin terapötik faydasi, insan disi kökenli olmalari açisindan insan anti-fare antikoru (HAMA) sadece d-sinüklein oligomerik bir formuna baglanan ve in vitro olarak d-sinükleinin hem. agregasyonunu hem de toksisitesini inhibe eden tek-Zincirli antikor fragmanlarinin (scFvs) d- sinükleine karsi insan dizilerine dayanan bir faj gösterimli antikor kütüphanesinden izolasyonunu tarif eder. Bununla birlikte, faj gösteriminden scFv'lerin üretiminin oldukça basit olmasina ragmen, bu teknik, bu sekilde üretilen antikorlar, kendi antijenlerine karsi istenmeyen. çapraz reaktivite riski tasidigindan ve insan bagisiklik sistemi tarafindan üretilen evrimsel olarak optimize edilmis dogal insan antikorlarinin özelliklerinden yoksun oldugundan ciddi dezavantajlara sahiptir.
Ayrica, bu tür antikorlar, normal fizyolojik ortani ve islev baglaminda diger proteinler ve/ veya hedef protein ile çapraz reaktivite nedeniyle yeterince spesifik olmayabilir. Örnegin Parkinson hastaliginda, d-sinüklein fizyolojik türevleri ile çapraz reaksiyona giren antikorlar, fizyolojik hedef yapilarin normal fonksiyonlari ile ilgili yan etkilere neden olma potansiyeline sahiptir. Bu baglamda, istenmeyen bir otoimmün hastalik tamamiyla indüklenecektir- protein yapilarini kullanan aktif immünizasyon deneylerinin kavramsal tasariminda da neredeyse hesaplanamayan bir risk, ayni zamanda, varyant formda fizyolojik olarak da meydana gelir.
Daha yakin zamanlarda Seitz ve arkadaslari (81. Ileri egitim akademisi ile Alman. Nöroloji Dernegi Kongresi, Hamburg 10.- l3.09.2008), farkli immünoglobulin çözeltilerinden anti-d- sinüklein poliklonal otoantikorunun izolasyonu ve afinite kromatografisi yoluyla tekli kan donörlerinin numuneleri hakkinda rapor verdiler. Bununla birlikte, bu yaklasimin, arzu edilen antikorun yalnizca sinirli miktarini sagladigi gerçeginin yani sira örnegin, heterojenlikleri ve istenmeyen yan etkilere sahip olan diger d-sinüklein ile iliskili moleküller ile kontamine olma riski nedeniyle poliklonal antikorlar terapötik uygulama için sadece sinirli kullanima sahiptir. Benzer sekilde, poliklonal antikorlarin tanisal degeri, antikorlarin bilesiminin degiskenliginin genel spesifisite ve reaktiviteyi etkileyecek olmasindan dolayi azalir. Bu, yanlis katlamaya bagli agregasyon ve birikime maruz proteinlere karsi olan antikorlar için daha uluslararasi basvuruda, ya tercihen agregasyon halinde ve N- terminal (aal-60) fragmaninda bulunan bir epitoptaki insan anti- d-sinükleinine veyaC-terminali (aa96-l40) fragmaninda bulunan bir epitopta anti-d-sinüklein monomerine baglanan insan anti-d- sinüklein antikorlari tanimlanmistir.
Yine de, yukarida açiklanan sinirlamalarin üstesinden gelmeye ve d-sinüklein'e karsi terapötik ve tanisal bir insan antikoru saglamaya hala bir ihtiyaç vardir.
BULUSUN ÖZETI Mevcut bulus, istemlerde karakterize edilen düzenlemelere iliskindir. Bir düzenleme, amino asitler 113 ila 123 içindeki veya d-sinüklein amino asitleri 117 ila 123 içindeki bir epitopa spesifik olarak baglanan izole edilmis bir baglanma molekülü saglar (DIZI KIM. NO: 1). Belirli yönlerde baglanma molekülü, referans monoklonal antikor NI-202.21D11 ile ayni insan d- sinüklein epitopuna spesifik olarak baglanir veya insan d- sinükleinine baglanma referansi monoklonal antikoru NI- 202.21D11'i rekabetçi bir sekilde inhibe eder. Bulusa ait bir baglanma molekülü, bir antikor veya bunun antijen baglayici bir fragmanidir. Bulusun özel bir baglanma molekülü, insan monoklonal antikoru NI-202.21D11 veya bunun bir antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevidir.
Bulus ayrica, bir immünoglobulin agir zincir degisken bölgesini (VH) ve bir immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesini (VL) içeren insan d-sinükleinine spesifik olarak baglanan izole edilmis bir antikor veya bunun antijen baglama fragmanini saglar, burada VH, DIZI KIM. NO: 15'e veya DIZI KIM.
NO: 20'ye %90 veya %100 oraninda özdes bir polipeptit dizisini içerir. Ayrica, bir VH ve bir VL içeren, insan d-sinükleinine spesifik olarak baglanan, izole edilmis bir antikor veya bunun bir antijen baglayici fragmani saglanmistir, burada VL, DIZI KIM.
NO: 22'ye veya DIZI KIM. NO: 26'ya %90 veya %100 oraninda özdes bir polipeptit dizisini içerir. Benzer sekilde bulus, bir VH ve bir` VL içeren insan d-sinükleinine spesifik olarak. baglanan izole edilmis bir antikor veya bunun antijen baglanma fragmanini saglar, burada VH ve VL sirasiyla DIZI KIM. NO: 15 ve DIZI KIM.
NO: 22, DIZI KIM. NO: 15 ve DIZI KIM. NO: 26, DIZI KIM. No: 20 ve DIZI KIM. NO: 22 veya DIZI KIM. NO: 20 ve DIZI KIM. NO: 26 referans polipeptitlere %90 veya %100 oraninda Özdes bir polipeptit dizisini içerir.
Bulusun bazi düzenlemelerinde, izole edilmis antikor veya bunun fragmani tercihen, insan d-sinükleininin dogrusal olmayan bir konformasyonel epitopuna baglanir. Baska düzenlemelerde izole edilmis antikor veya bunun fragmani tercihen insan d- sinükleinini oligomerik veya agrege formda baglar. Baska düzenlemelerde izole edilmis antikor veya bunun fragmani, insan ß-sinükleinine veya insan y-sinükleinine spesifik olarak baglanmaz ve/ veya murin d-sinükleinine spesifik olarak baglanmaz.
Ayrica, yukarida tarif edildigi gibi bir antikor veya bunun bir fragmanini ve bir tasiyiciyi içeren bir bilesim saglanmaktadir. Bilesim terapötik veya tanisal bir bilesim olabilir.
Ayrica, burada açiklanan bir polipeptid veya baglayici molekülü kodlayan bir veya daha fazla izole edilmis polinükleotid ve bu tür baglayici moleküllerin eksprese edilmesi için vektörler ve konakçi hücreler saglanmistir.
Bu bulusun özel bir amaci, Parkinson hastaligi (PH), Lewy cisimcikli demans (LCD) ve çoklu sistem atrofisi (ÇSA) gibi ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, bir sinükleinopatik hastaligin tedavisi veya önlenmesi için yöntemler saglamaktir. Yöntemler, antikorun d-sinükleini hedefledigi denege örnegin bir antikor veya bunun antijen baglama fragmani, varyanti veya türevi gibi etkili bir anti-insan d-sinüklein baglayici molekülü konsantrasyonunun uygulanmasini içerir.
Ayni zamanda bir denekte bir sinükleinopatik hastaligin teshisi için, bulusun bir antikoru veya fragmani ile teshis edilecek bir denekte d-sinüklein seviyesini, lokalizasyonunu, konformasyonunu veya bunlarin bir kombinasyonunu degerlendirmeyi ve bir veya daha fazla kontrol numunesinden türetilen bir veya daha fazla referans standardina göre denekteki d-sinüklein seviyesini, lokalizasyonunu, konformasyonunu veya bunlarin kombinasyonunu. karsilastirmayi içeren bir yöntem saglamak. da bulusun bir amacidir, burada, denekte d-sinükleinin seviyesi, lokalizasyonu, konformasyonu veya bunlarin kombinasyonu ile referans standardi arasindaki bir farklilik veya benzerlik, denegin bir sinükleinopatik. hastaliga sahip olup olmadigini gösterir.
Bulusun tani yöntemleri, hasta numunelerinin in vitro deneyi veya in vivo görüntüleme teknikleri ile olabilir.
Mevcut bulusun diger düzenlemeleri, asagidaki açiklamadan ve Örneklerden açikça görülecektir. ÇIZIMLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1 Degisken bölgenin amino asit ve nükleotit dizileri, yani insan antikoru NI-202.21Dll'in agir zincir ve kappa hafif zincirleri. Çerçeve (FR) ve tamamlayicilik belirleme bölgeleri (TBB'ler) alti çizilen TBB'lerle belirtilir.
Klonlama stratejisine bagli olarak, agir zincirin ve hafif zincirin N-terminusundaki amino asit dizisi, potansiyel olarak, antikorun biyolojik aktivitesini önemli ölçüde etkilemeyen FRl'de primer kaynakli degisiklikler içerebilir.
Bir konsensüs insan antikoru saglamak için, orijinal klonun nükleotid ve amino asit dizileri, veri tabanindaki uygun insan germ hatti degisken bölge dizilerine uygun olarak hizalanmistir ve ayarlanmistir; bakiniz, MRC Protein Engineering Center (Cambridge, Ingiltere) tarafindan barindirilan Vbase (vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk). Konsensüs germ hatti dizisinden potansiyel olarak sapma oldugu düsünülen ve bu nedenle PCR primerine bagli oldugu düsünülen amino asitler, kalin olarak gösterilmistir.
Sekil 2 Rekombinant insan NI-202.21Dll, dogrudan bir ELISA'da insan d-sinükleinini, ß-, y-sinüklein ve murin d- sinüklein üzerinde seçici olarak baglar. Rekombinant insan a-,ß-,y- sinüklein ve rekombinant insan ve murin His- etiketli d-sinüklein, esit konsantrasyonda (2 ug / ml) ELISA plakalari üzerine kaplanmistir. Plakalar daha sonra pan-sinüklein antikoru ile problanmistir. (A) Rekombinant NI-202.21Dll seçici olarak d-sinükleini baglar, oysa pan- sinüklein antikoru, rekombinant proteinlerin esit kaplanmasini dogrulayacak sekilde üç sinüklein proteinine de baglanir. (B) Rekombinant NI-202.21Dll, insan vs murin d-sinüklein için seçicidir. Diger taraftan NI-202.12F4 dogrudan bir ELISA'da hem insan hem de murin d-sinükleinine baglanir.
Sekil 3 Rekombinant NI-202.21Dll tercihen yüksek yogunluklu kaplanmis d-sinükleinine baglanir. Rekombinant insan d- sinüklein, belirtilen konsantrasyonlarda ELISA plakalari üzerinde kaplandi ve dogrudan ELISA ile çesitli NI- 202.21Dll konsantrasyonlari ile problandi(ü 20 ug/ml;A 5ug/m1;9 l ug/ml;I 0.25 ug/ml;V 0.1 ug/ml). Her bir kaplama konsantrasyonu için antikorun gücünü belirten yari maksimum etkili konsantrasyon (ECSO) belirlenmistir.
Sekil 4 NI-202.21Dll'in immünhistokimyasal baglanma analizi, insan d-sinüklein A53T'yi asiri eksprese eden (A) transgenik farelerden ve (C) Lewy Cisimcikli Demansa sahip bir hastanin insan beyni dokusundan parafin kesitlerinde Lewy cisimcik ve Lewy nörit gibi inklüzyonlari içeren d- sinüklein patolojisinin belirgin boyanmasini göstermistir.
(B) Yabani tip fare dokusunda ve ikincil bir antikorda (sag alt) sadece kontrolde herhangi bir boyanma gözlenmemistir.
HC = Hipokampus, CTX = Korteks, BS = Beyinsapi.
Sekil 5 Epitop haritalamasi, N1-202.21D11 için insan d- sinüklein (aa 117-123) içinde bir C-terminali baglanma epitopunu ortaya çikarmistir. (A) Dogrudan bir ELISA'da insan d-sinüklein C-terminal alanina baglanan rekombinant NI-202.21D11. d-sinüklein kesiklikleri, esit konsantrasyonlarda (2ug/ ml) ELISA plakalari üzerine kesikliklerine baglanmaz. (B) Pepscan analizi, NI- baglandigini göstermis, N1-202.21D11 baglanmasi için gereken minimal dizinin insan d-sinükleinindeki PVDPDNE (aa 117-123) oldugunu öne sürmüstür. (C) Rekombinant NI- N1228'ye azalmis baglanma göstermistir. Rekombinant wt ve mutasyona ugramis d-sinüklein proteinleri, ELISA plakalari üzerinde esit konsantrasyonda (2ug/ m1) kaplanmis ve rekombinant NI-202.21D11 baglanmasi için test edilmistir.
BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI: Mevcut bulus, istemlerde karakterize edilen düzenlemelere iliskindir.
Sinükleinopatik hastaliklar veya sinukleinopatiler, nöronlarin glialarin seçici olarak savunmasiz popülasyonlarinda çözünmeyen d-sinüklein proteininin agregatlarindan olusan ortak bir patolojik lezyonu paylasan çesitli nörodejeneratif bozukluklar grubudur. Bu bozukluklar Parkinson hastaligi (PH), Parkinson Hastaligi Demansi (PHD), Lewy cisimcikli demans (LCD), ergenlik baslangiçli genellestirilmis nöroaksiyel distrofi (Hallervorden-Spatz hastaligi), saf otonomik yetmezlik (PAF), çoklu sistem atrofisi (ÇSA) ve beyin demir akümülasyonu tip-l (NBIA-I) ile nörodejenerasyonu içerir. Klinik olarak, lezyonlarin dagilimina bagli olarak motor, bilissel, davranissal ve otonomik fonksiyonlarda kronik ve ilerleyici bir azalma ile karakterize edilirler.
Parkinson hastaligi, etiyolojisi bilinmeyen, yasa bagli bir nörodejeneratif hastaliktir. Sporadik Parkinson hastaliginin genetik savunmasizlik ve çevresel travmalarin birlesiminden kaynaklandigina inanilmaktadir. Ayrica, Parkinson hastaliginin (PH), farkli mekanizmalarla tetiklenirken, ortak bir patofizyolojik yolagi izledigine inanilmaktadir. Ortak bir nod, d-sinüklein katilimidir. Bu proteinin Parkinson hastaligi patogenezi ile baglantisi, ailesel olgularda hem nokta mutasyonlarinin hem de genin triplikasyonunun tanimlanmasi, d- sinükleininin Lewy cisimciklerine lokalizasyonu, Parkinson hastaliginin ayirt edici özelliklerinden biri ve Parkinson hastaliginin nörotoksik modellerinde d-sinüklein ekspresyonu ve hastalik patolojisinin korelasyonu ile saglanmistir. Diger bulgular, belirli d-sinüklein formlarinin (örn., yanlis katlanmis ve d-sinüklein bagli dopamin) sporadik hastalikta yer aldigini gösterir.
Sinükleinler, esas olarak nöral dokuda ve bazi tümörlerde eksprese edilen küçük, çözünür proteinlerdir. Aile, bilinen üç proteini içerir: d-sinüklein, ß-sinüklein ve yesinüklein. Tüm sinükleinlerin ortak olarak, degistirilebilir polipoproteinlerin A2 sinifi lipit baglama bölgelerine benzer sekilde yüksek ölçüde korunmus bir d-sarmal lipit baglama motifi vardir. Sinüklein ailesi üyeleri, bitkinin “geç embriyo-bagimli” proteinleri ile korunmus yapisal benzerlikleri olmasina ragmen, omurgalilarin disinda bulunmazlar. d- ve ß-sinüklein proteinleri esas olarak presinaptik terminallerde görüldükleri beyin dokusunda bulunur. y-sinüklein proteini esas olarak periferik sinir sistemi ve retinada bulunur, ancak gögüs tümörlerinde ekspresyonu tümör ilerlemesi için bir isarettir. Normal hücresel fonksiyonlar, bazi verilerin zar stabilitesinin ve/ veya döngüsünün regülasyonunda bir rolü oldugunu göstermesine ragmen, sinüklein proteinlerinin herhangi biri için belirlenmemistir. d- sinüklein mutasyonlari nadir görülen erken baslangiçli Parkinson hastaliklari ile iliskilidir ve protein, Parkinson hastaligi, Alzheimer hastaligi ve diger birçok nörodejeneratif hastalikta anormal olarak birikir. Inceleme için bakiniz, örn., çevrimiçi olarak 20 Aralik 2001'de yayinlanmis olan, George, Genome Biol. su anda GenBank'ta listelenen sinüklein ailesinin essiz üyelerini kataloglamaktadir. d-sinüklein orijinal olarak Alzheimer hastaligi (AH) plaklarinin non-amiloid bileseninin (NAC) öncü proteini olarak insan beyninde tanimlanmistir; bakiniz, örnegin Ueda ve Ayni zamanda, AH amiloid (NACP)'nin Aß olmayan bileseninin öncüsü olarak adlandirilan d-sinüklein, 140 amino asitlik bir proteindir. d-sinüklein, dogal formunda rastgele bir sarmal olarak bulunur; Bununla birlikte, pH, moleküler toplasma, agir metal içerigi ve dopamin seviyelerindeki degisiklikler protein uyumunu etkiler. Oligomerik, proto-fibril, fibril ve agrege kisimlara uyumdaki degisikliklerin protein toksisitesini regüle ettigi düsünülmektedir. Artan bulgular, dopamin eklentili d- sinükleininin, eklentisiz proteine kiyasla fibril olusumunda daha hizli sürece sahip oldugunu göstermektedir. Ayrica, d- sinüklein asiri ekspresyonunun arka planindaki dopamin toksiktir.
Bu tarifnamede, "d-sinüklein", "alfa-sinüklein", "a-sinüklein"10 ve "aSin" terimleri, d-sinüklein dogal monomer formuna spesifik olarak deginmek için birbirinin yerine kullanilabilmektedir. "d- sinüklein" terimi genel olarak d-sinükleinin diger konformerlerini, örnegin dopamin-kinona (DAQ) baglanan d- sinüklein ve d-sinüklein oligomerleri veya agregatlarini tanimlamak için kullanilir. “d-sinüklein" terimi ayni zamanda, bütün tipler ve d-sinüklein formlarina toplu olarak basvurmak için kullanilir. Insan d-sinüklein için protein dizisi MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHG VATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGÄGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGIL EDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA'dir. (DIZI KIM. No:1) Ot-sinüklein amino asit dizisi, literatürden ve ilgili veritabanlarindan elde edilebilir; bakiniz, örnegin Ueda ve arkadaslari, ibid .; GenBank swissprot: locus SYUA_HUMAN, katilim numarasi P37840. AH amiloidinin (NAC) Aß-olmayan bileseni, d-sinüklein'den türetilmistir. d-sinüklein içinde yüksek ölçüde hidrofobik bir alan olan NAC, en az 28 amino asit kalintisindan (kalinti 60-87) ve istege bagli olarak 35 amino asit kalintisindan (kalinti 61- 95) olusan bir peptittir. NAC, bir beta-yaprak yapisini olusturma egilimi gösterir (Iwai ve arkadaslari, Biochemistry, numarasi , 1282- 11286'da tanimlanmistir.
NAC dahil olmak üzere ayristirilmis d-sinuklein veya bunlarin fragmanlari, monomerik peptit birimleri anlamina gelir.
Ayristirilmis g-sinüklein veya bunlarin fragmanlari genellikle çözünürdür ve çözünür oligomerler olusturmak için kendiliginden agrege olabilir. d-sinüklein oligomerleri ve bunlarin fragmanlari genellikle çözünürdür ve agirlikli olarak d- sarmallari olarak bulunur. Monomerik d-sinuklein, liyofilize edilmis peptidi düzgün DMSO içinde sonikasyon ile çözerek in vitro hazirlanabilir. Ortaya çikan çözelti, çözünmeyen parçaciklarin ayrilmasi için santrifüje tabi tutulur. NAC dahil10 agregasyona ugramis d-sinüklein veya bunlarin fragmanlari, çözünmez ß-yaprak düzenekleri ile birlesmis olan d-sinüklein veyabunlarin fragmanlarinin oligomerleri anlamina gelir. NAC dahil olmak üzere agrege d-sinüklein veya bunun fragmanlari, fibril polimerleri anlamina gelir. Fibriller genellikle çözünmez.
Bazi antikorlar, ya çözünebilir d-sinüklein veyabunlarin fragmanlarini veyaagrege d-sinüklein veyabunlarin fragmanlarini baglar. Bazi antikorlar, d-sinüklein oligomerlerine monomerik formlardan veya fibril formlarindan daha kuvvetli bir sekilde baglanir. Bazi antikorlar hem çözünür hem de agrege d-sinüklein veya bunlarin fragmanlarini ve istege bagli olarak oligomerik formlari da baglar.
Burada açiklanan insan anti-d-sinüklein antikorlari, spesifik olarak d-sinüklein ve bunlarin epitoplarini ve d-sinüklein ve bunlarin epitoplarinin çesitli konformasyonlarini baglar. Örnegin burada açiklanan, dogal monomer formunda d-sinüklein, d- sinüklein, tam uzunlukta ve kesiklikli d-sinüklein ve d- sinüklein agregatlarini spesifik olarak baglayici antikorlardir.
Burada kullanildigi sekliyle d-sinüklein'i "spesifik olarak baglayici", "seçici olarak baglayici" veya "tercihen" baglayici” bir antikora yapilan referans, baska alakasiz proteinlere baglanmayan bir antikor anlamina gelir. Bir örnekte, burada açiklanan bir d-sinüklein antikoru, d-sinüklein veya bunun bir epitopunu baglayabilir ve diger proteinler için yaklasik 1.5 kat artalan daha fazla bir baglanma göstermez. d-sinüklein konformeri "spesifik olarak baglayici" veya "seçici olarak baglayici” bir antikor, d-sinükleinin tüm konformasyonlarina baglanmayan, diger bir deyisle en az bir baska d-sinüklein konformeri baglamayan bir antikor anlamina gelir. Örnegin burada açiklanan, d-sinükleinin monomerik ve agrege formlari, insan ve fare d-sinükleini; tam uzunluktaki d-sinüklein ;ve kesiklikli formlarin yani sira B- ve y-sinüklein'e karsi insan d-sinükleini arasinda ayirt edebilen antikorlardir. Bu bulusun insan anti-d- sinüklein antikorlari, Parkinsonizm belirtisi olmayan ve d-10 sinükleine özgü bir bagisiklik tepkisi gösteren yasli bireylerin bir havuzundan izole edildiginden, bu bulusun anti-d-sinüklein antikorlari ayrica, bu antikorlarin gerçekten de denekler tarafindan eksprese edildigini ve örnegin bir insan immünoglobulini eksprese eden faj kütüphanesinden izole edilmedigini vurgulamak için "insan otoantikorlari" olarak adlandirilir ki bu simdiye kadar insan benzeri antikorlar saglamaya çalismak için bilinen bir yöntemi temsil etmistir. atifta bulunduguna dikkat edilmelidir; örnegin "bir antikor" un, bir veya daha fazla antikoru temsil ettigi anlasilmaktadir.
Dolayisiyla “bir”, “bir veya daha fazla" ve “en az bir” bu belgede birbirinin yerine kullanilabilir.
Burada kullanilan sekliyle, "polipeptit" teriminin, tekil bir amaçlanmistir ve amit baglari (peptit baglari olarak da bilinir) ile lineer bir sekilde baglantilanan monomerlerden (amino asitler) olusan bir molekülü ifade etmektedir. “Polipeptit” terimi, iki veyadaha fazla amino asitin herhangi bir zincirini veya Zincirlerini ifade etmekte ve ürünün spesifik bir uzunlugunu belirtmemektedir. Bu yüzden, peptitler, dipeptitler, tripeptitler, oligopeptitler, “protein”, “amino asit zinciri”, veya iki veyadaha fazla amino asitin bir zincirini veya Zincirlerini ifade etmek için kullanilan herhangi bir terim, birbirlerinin alternatifi olarak kullanilabilir. glikozilasyon, asetilasyon, fosforilasyon, amidasyon, bilinen koruyucu/engelleyici gruplar tarafindan türevlendirme, proteolitik yarilma, veya dogal olmayan bir sekilde olusan amino asitler tarafindan modifikasyon da dahil olmak üzere10 polipeptitin post-ekspresyon modifikasyonlarinin ürünlerini ifade ettigi de kastedilmektedir. Bir polipeptit, dogal bir biyolojik kaynaktan türetilebilir veya rekombinant teknoloji ile üretilebilir, ancak belirlenmis bir nükleikr asit dizisinden dönüstürülmesi gerekli degildir. Kimyasal sentez de dahil olmak üzere herhangi bir sekilde meydana getirilebilir.
Bulusun bir polipeptiti, yaklasik 3 veya daha fazla, 5 veya fazla, veya2,000 veya daha fazla amino asit boyutuna sahip olabilir. Böyle bir yapiya sahip olmalari gerekli olmamasina ragmen polipeptitler tanimlanmis bir üç boyutlu yapiya sahip olabilir. Tanimlanmis bir üç boyutlu yapiya sahip polipeptitler katlanmis olarak ifade edilmektedir, ve tanimlanmis üç boyutlu bir yapiya sahip olmayan ancak çok sayidaki farkli konformasyonu sahiplenen polipeptitler ise katlanmamis olarak ifade edilmektedir. Burada kullanildigi sekliyle, glikoprotein terimi, bir amino asit kalintisinin, örn., bir serin kalintisi veya bir asparajin kalintisinin bir oksijen içeren veya bir azot içeren yan zinciri yoluyla proteine baglanan en az bir karbonhidrat parçasina baglanmis bir proteine karsilik gelir. veyabunlarin türevi ile, dogal ortaminda olmayan bir polipeptit kastedilmektedir. Özel bir saflastirma seviyesine gerek yoktur. Örnegin, izole edilmis bir polipeptit, natif ve dogal ortamindan uzaklastirilabilmektedir. Rekombinant bir sekilde üretilmis polipeptitlerin ve konak hücrelerde eksprese edilen proteinlerin, bulusun amacina uygun olarak, herhangi bir uygun teknikle ayrilmis, fraksiyonlara ayrilmis veyakismen veya büyük ölçüde saflastirilmis dogal veyarekombinant polipeptitler olarak izole edildigi kabul edilmektedir.
Ayrica mevcut bulusun polipeptitlerin fragmanlari, türevleri, polipeptitleri, analoglari yukaridaki varyantlari ve bunlarin herhangi bir kombinasyonu olarak eklenir.
Mevcut bulusa terimleri ilgili dogal baglanma molekülünün, polipept bulusun. polipeptidlerinin. fragmanlari, antijen baglanma özelliklerinin indiran herhangi ait antikorlara veya antikor polipeptitlerine antikorunun veya en azindan bir bir polipeptidi içerir. burada baska yerlerde tartisilan spesifik antikor fragmanlarina ek olarak proteolitik fragmanlarin yani sira delesyon fragmanlarini bulusa ait antikorlar ve antikor polipeptidlerinin varyantlari, yukarida ornatikl tarif edilen fragmanlari ve ayrica delesyonlari veya eklemeleri nedeniyle degistirilmis amino asit dizilerine sahip polipeptidleri içerir.
Varyantlar dogal olarak 'veya dogal olmayan yollarla meydana r. Dogal olmayan yollarla meydana gelen varyantlar, teknikte bilinen mutagenez teknikleri kullanilarak üretilebilir.
Varyant polipeptidler konservatif veya konservatif olmayan amino asit ornatiklari, delesyonlari veya eklemeleri içerebilir. Bu bulusa ait d-sinüklein spesifik baglanma moleküllerinin, örnegin antikorl polipept sekilde proteinlerini içerir. Varyant sekliyle ve antikor polipeptitlerinin üzerinde bulunmayan ek özellikler gistirilmis polipeptitlerdir. analoglari" olarak anilir. Burada türevleri Örnekler polipeptidler de sergileyecek kullanildigi bir "türevi", bir antikoru fonksiyo türetilmis bir yan grubun veya bir antikor reaksiyonuyla bir veya daha fazla kalintiya kimyasal sahip bir polipeptidi, polipeptide karsilik gelir. "Türevler" olarak da dahil edilenler, yirmi standart amino asidin bir veya daha fazla dogal olarak olusan amino asit türevlerini prolin 4-hidroksiprolin ornatilabilir; içeren peptitlerdir. hidroksilisin ornatilabilir; histidin için 3-metilhistidin ornatilabilir; serin homoserin için ornatilabilir; ve lisin için ornitin ornatilabilir. çogul nükleik asitleri kapsamasi amaçlanir ve izole edilmis bir nükleik asit molekülünü veya yapiyi, örnegin haberci RNA (mRNA) veya plazmid DNA'sini (pDNA) ifade eder. Bir polinükleotit, konvansiyonel bir fosfodiester bagi veya konvansiyonel olmayan bir bag (örn., peptit nükleik asitlerinde (PNA) bulunan bir amit bagi) içerebilir. “Nükleik asit” terimi, bir polinükleotitte bulunan herhangi bir veya daha fazla nükleik asit segmentini, örn., DNA veya RNA fragmanlarini, ifade etmektedir. “Izole edilmis” nükleik asit veya polinükleotit ile, dogal ortamindan uzaklastirilmis bir nükleik asit molekülü, DNA veya RNA kastedilmektedir. Örnegin, bir vektörün içindeki bir antikoru kodlayan rekombinant bir polinükleotitin mevcut bulusun amacina uygun olarak izole edildigi kabul edilmektedir. Izole edilmis bir polinükleotitin baska örnekleri arasinda heterolog konakçi hücrelerde muhafaza edilen rekombinant polinükleotitler veyaçözelti içinde saflastirilmis (kismen veya büyük ölçüde) polinükleotitler bulunmaktadir. Izole RNA molekülleri, bu bulusun polinükleotitlerinin in vivo veya in vitro RNA transkriptlerini içerir. Mevcut bulusa göre izole edilmis polinükleotitler veya nükleik asitler ayrica sentetik olarak üretilmis bu tür molekülleri de içermektedir. Bunlara ek olarak, bir polinükleotit veya bir nükleik asit, bir promotör gibi bir düzenleyici element, ribozom baglanma yeri veya bir transkripsiyon sonlandirici olabilir veya içerebilir.
Burada kullanilan sekliyle, bir "kodlama bölgesi", amino asitlere dönüstürülmüs kodonlardan olusan bir nükleik asit kismidir. Bir “dur kodonu" (TAG, TGA, veya TAA) bir amino asite dönüstürülmemesine ragmen, bunun, bir kodlama bölgesinin bir parçasi oldugu kabul edilebilir ancak herhangi bir yan dizi,10 örnegin promotörler, ribozom baglanma yerleri, transkripsiyonel sonlandiricilar, intronlar ve benzerleri bir kodlama bölgesinin parçasi degildir. Tek bir polinükleotit yapida, örn., tek bir vektör üzerinde veyaayri polinükleotit yapilari içerisinde, örn. ayri (farkli) vektörler üzerinde, mevcut bulusun iki veyadaha fazla kodlama. bölgesi mevcut olabilir. Ayrica, herhangi bir vektör tek bir kodlama bölgesi içerebilir veya iki veya daha fazla kodlama bölgesini içerebilir, örn., tek bir vektör bir immünoglobulin agir zincir degisken bölgesini ve bir immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesini ayri ayri kodlayabilir. Ek olarak, bulusun bir vektörü, polinükleotidi veya nükleik asidi, bir baglanma molekülünü, bir antikorunu veya bir fragmanini, varyantini veya türevini kodlayan bir nükleik aside kaynastirilmis veya kaynasmamis heterolog' kodlama bölgelerini kodlayabilir. Heterolog kodlama bölgeleri, bunlarla sinirli olmamakr üzere, salgilayici bir sinyal peptiti veyaheterolog bir fonksiyonel alan gibi özellestirilmis elementleri veya motifleri içermektedir.
Belirli uygulamalarda, polinükleotit veya nükleik asit DNA'dir.
DNA olmasi durumunda, bir polipeptidi kodlayan bir nükleik asit içeren bir polinükleotid, bir veya daha fazla kodlama bölgesi ile islevsel olarak baglantili bir promotör ve/ veya baska transkripsiyon veya translasyon kontrol elemanlari içerebilir.
Uygulanabilir bir birlesme (operable association), gen üretimine yönelik bir kodlama bölgesi, örn., bir polipeptit, düzenleyici dizi(ler)in etkisi veyakontrolü altindaki gen üretimi ekspresyonunu yerlestirecek sekilde bir veyadaha fazla düzenleyici diziyle birlestirildiginde gerçeklesmektedir. Iki adet DNA fragmani (örnegin bir polipeptit kodlama bölgesi ve bununla birlestirilmis bir promotör), eger promotör fonksiyonunun indüksiyonu, istenen gen ürününü kodlayan mRNA'nin transkripsiyonuyla sonuçlanirsa ve iki DNA fragmanini arasindaki baglantinin dogasi, ekspresyon düzenleyici dizilerin gen ürününün ekspresyonunu yönlendirme yetenegine engel olmuyorsa10 veyaDNA sablonunu transkribe edilme yetenegine engel olmuyorsa sekilde baglanmis”tir. Bu yüzden, eger promotör, nükleik asitin transkripsiyonunu etkileyebilirse bir promotör bölge, polipeptit kodlayan bir nükleik asit ile uygulanabilir sekilde birlestirilebilir. Promotör, DNA'nin önemli transkripsiyonunu yalnizca önceden belirlenmis hücrelerde yönlendiren hücreye özgü bir promotör olabilir. Promotörün yani sira diger transkripsiyon kontrol elementleri, örnegin güçlendiriciler, operatörler, represörler, ve transkripsiyon sonlandirma sinyalleri, hücreye özgü transkripsiyonu yönlendirmek amaciyla, polinükleotit ile uygulanabilir sekilde birlestirilebilmektedir. Uygun promotörler* ve diger transkripsiyon kontrol bölgeleri burada açiklanmaktadir. Çesitli transkripsiyon kontrol bölgeleri teknikte uzman kisilerce bilinmektedir. Bunlar, bunlarla sinirli olmamak üzere, sitomegalovirüsler (acil erken promotör, intron-A ile baglantili olarak), simian Virüs 40 (erken promotör) ve retrovirüslerden (Rous sarcoma Virüsü gibi) promotör ve güçlendirici segmentleri gibi omurgali hücrelerde fonksiyon gösteren transkripsiyon kontrol bölgelerini, sinirlama olmaksizin, içermektedir. Diger transkripsiyon kontrol bölgeleri, artin, isi sok proteini, sigir büyüme hormonu ve tavsan ß-globin gibi omurgali genlerden türetilenler ile birlikte ökaryotik hücrelerde gen ekspresyonunu kontrol edebilen diger dizileri içermektedir. Ilave uygun transkripsiyon kontrol bölgeleri, dokuya özgü promotörler ve güçlendiriciler ile birlikte lenfokin-indüklenebilir promotörleri (örnegin interferonlar veya interlökinler tarafindan indüklenebilir promotörler) içermektedir.
Benzer sekilde, çesitli translasyon kontrol elementleri, teknikte siradan uzmanliga sahip kisilerce bilinmektedir. Bunlar, bunlarla sinirli kalmamak üzere, ribozoni baglanma yerlerini, translasyon baslatma ve sonlandirma kodonunu ve10 pikornavirüslerden (özellikle bir iç ribozom giris yeri veya CITE dizisi olarak da adlandirilan IRES) türetilen elementleri içermektedir.
Diger uygulamalarda, mevcut bulusun bir polinükleotiti, örnegin mesajci RNA (mRNA) formundaki, RNA'dir.
Mevcut bulusun polinükleotit ve nükleik asit kodlama bölgeleri, salgilayici veyasinyal peptitleri kodlayan, mevcut bulusun bir polinükleotiti tarafindan kodlanan bir polipeptitin sekresyonunu yönlendiren ilave kodlama bölgeleri ile birlestirilebilir.
Sinyal hipotezine göre, memeli hücreleri tarafindan salgilanan proteinler, granüllü endoplazmik retikulum boyunca büyüyen protein zincirinin disari aktarimi baslatildiginda olgun proteinden ayrilan bir sinyal peptite veya salgilayici lider diziye sahiptir. Teknikte siradan uzmanliga sahip kisiler, omurgali hücreler tarafindan salgilanan polipeptitlerin genellikle, polipeptitin salgilanmis veya "olgun” bir formunu üretmek amaciyla tam veya “tam uzunluklu” polipettitten ayrilmis olan polipeptitin N-terminusuna kaynastirilmis bir sinyal peptitine sahip olduklarini bilmektedir. Belirli uygulamalarda, dogal sinyal peptiti, örn., bir immünoglobülin agir zincir veya hafif zincir sinyal peptiti veya uygulanabilir sekilde birlestirilmis polipeptitin sekresyonunu yönlendirme yetenegini muhafaza eden bu dizinin fonksiyonel bir türevi kullanilmaktadir.
Alternatif olarak, heterolog' bir' memeli sinyal peptiti veya bunun fonksiyonel bir türevi kullanilabilir. Örnegin, yabani tip lider dizi, insan doku plazminojen aktivatörünün (TPA) veya fare ß-glukuronidazin lider dizisi ile ornatilabilir.
Aksi belirtilmedigi sürece "bozukluk" ve "hastalik" terimleri burada birbirinin yerine kullanilabilir.
Mevcut bulus baglaminda kullanilan bir "baglayici molekül", antikorlar ve bunlarin fragmanlari ile ilgilidir.10 yerine kullanilmaktadir. Bir antikor veya immünoglobulin, bir agir zincirin en azindan degisken alanini içeren ve normal olarak en azindan bir agir zincirin ve bir hafif zincirin degisken alanlarini içeren bir d-sinüklein baglayici moleküldür. Omurgali sistemlerinde temel immünoglobulin yapilari nispeten iyi anlasilmistir; bkz., örn., Harlow ve dig., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.
Asagida daha ayrintili olarak tartisilacagi gibi, çesitli genis polipeptit siniflari içerir. Teknikte uzman kisiler, agir zincirlerin, aralarinda bazi alt (örn., yl-y4) siniflara sahip gamma, mu, alfa, delta veya epsilon (y, u, d, 5, ) olarak siniflandirildigini takdir edeceklerdir. Antikorun bu zincirin dogasidir. Immünoglobulin alt-siniflari (izotipler), örn., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, vs. iyi karakterize edilmistir ve fonksiyonel uzmanlasmayi sagladigi bilinmektedir.
Bu siniflarin ve izotiplerin her birinin modifiye edilmis sürümleri, halihazirdaki bulusu göz önünde bulundurarak, teknikte tecrübeli kisilerce kolayca ayirt edilebilir ve buna göre, mevcut bulusun kapsami dahilindedir. Tüm immünoglobulin siniflari, bu bulusun kapsami dahilindedir, asagidaki tartisma genellikle IgG immünoglobulin molekülleri sinifina yönlendirilecektir. IgG ile ilgili olarak, standart bir immünoglobulin molekülü, yaklasik 23,000 Dalton'luk moleküler agirliga sahip iki özdes hafif zincir polipeptidi ve molekül içerir. Dört zincir tipik olarak "Y" konfigürasyonunda disülfür baglari ile birlestirilir, burada hafif zincirler "Y" nin agzindan baslayan ve degisken bölge boyunca devani eden agir zincirler arasinda baglanti kurar.10 Hafif zincirler kappa veya lambda (K, A) olarak siniflandirilir.
Her agir zincir sinifi, bir kappa veya lambda hafif zinciriyle baglanabilir. Genel olarak, hafif ve agir zincirler birbirlerine kovalent olarak baglanir ve iki agir zincirin "kuyruk“ kisimlari, immünoglobulinler, hibridomlar, B hücreleri veya genetik olarak tasarlanmis konakçi hücreler tarafindan üretildiginde kovalent disülfür* baglari veya kovalent olmayan baglar baglanir. Agir zincirde, ile birbirine o asit dizileri, Y konfigürasyonunun çatalli uçlarindaki N-terminusundan her bir zincirin altindaki C-terminusuna geçer.
Hem hafif hem homolojinin bölgelerine ayrilir. islevsel olarak kullanilir. de agir zincirl er, yapisal ve agir (VH) zincir bölümlerinin degisken alanlarinin, islevsel Bu baglamda, hem hafif (VL) hem de antijen tanima ve spesifitesini belirledigi takdir edilecektir. Tersine, hafif zincirin (CL) alanlari, sekresyon, baglanmasi, tamamlayici ve agir zincirin (CHl, CH2 veya CH3) sabit transplasental hareketlilik, Fc biyolojik özellikler saglar baglanma reseptör ve benzeri gibi önemli 1 kabulde, sabit bölge tikorun antijen bölgesinden veya amino terminuslarindan daha uzaklastikça artar.
N-terminal kismi degisken bir bölge ve C-terminal kisminda sabit bir bölgedir; CH3 ve CL alanlari aslinda, sirasiyla, hafif zincirin karboksi terminisunu içerir.
Yukarida belirtildigi degisken bölge, agir ve antikorun antijenler üzerindeki epitoplari seçici bir sekilde tanimasina ve spesifik olarak baglamasina izin verir. Yani, bir antikorun VL alani ve VH alani veya tamamlayicilik belirleme bölgelerinin (TBB'ler) alt kümesi, üç boyutlu bir antijen baglama bölgesini tanimlayan degisken bölgeyi olusturmak üzere birlesir. Bu dörtlü antikor yapisi, Y' baglanma bölgesini olusturur. ucunda bulunan spesifik olarak, antijen antijen baglanma bölgesi, VH ve VL zincirlerinin her birindeki üç TBB ile tanimlanir. d-sinükleine spesifik olarak baglanmasi için yeterli yapi içeren herhangi bir antikor veya immünoglobulin fragmani, burada dönüsümlü olarak bir "baglayici fragman" veya Dogal olarak meydana gelen antikorlarda, bir antikor, her bir antijen baglama alaninda bulunan "tamamlayicilik belirleme bölgeleri" veya "TBB'ler" olarak adlandirilan, antikorlarin, sulu bir ortamda üç boyutlu konfigürasyonunu üstlendigi gibi spesifik olarak antijen baglama bölgesini olusturmak üzere konumlandirilan kisa, bitisik olmayan amino asit dizileri olan alti hiperdegisken bölge içerir. daha az gösteren "çerçeve" bölgeleri veya "FR" ler tarafindan kusatilmistir. Çerçeve bölgeleri büyük ölçüde bir ß-yaprak konformasyonunu benimserler ve TBB'ler ß-yaprak yapisinin bir kismini olusturan ve bazi durumlarda bir araya getiren halkalar olustururlar. Böylelikle, çerçeve bölgeleri TBB'lerin zincirler arasi, kovalent olmayan etkilesimler ile dogru yönde konumlandirilmasini saglayan bir iskele olustururlar.
Yerlestirilen TBB'ler tarafindan olusturulan antijen baglanma alani, immünoreaktif antijen üzerindeki epitopa tamamlayici bir yüzey tanimlar. Bu tamamlayici yüzey, antikorun kendi kognat epitopuna kovalent olmayan baglanmasini destekler. Sirasiyla TBB'leri ve çerçeve bölgelerini içeren amino asitler, herhangi bir agir veya hafif zincir degisken bölge için teknikte uzman kisilerce kolaylikla tanimlanabilir; çünkü bunlar tam olarak tanimlanmistir; bkz. "Sequences of Proteins of Immunological and Human Services, (1983); ve Chothia ve Lesk, J. Mol. Biol.
Teknikte kullanilan ve/ veya kabul edilen bir terimin iki veya daha fazla taniminin bulunmasi durumunda, burada kullanilan10 terimin tanimi, aksi açikça belirtilmedikçe, tüm anlamlari içerecek sekilde tasarlanir. Spesifik bir örnek, hem agir hem de hafif zincir polipeptitlerinin degisken bölgesi içinde bulunan bitisik olmayan antijen birlestirici bölgeleri tanimlamak için kullanilmasidir. Bu bölge, Kabat ve arkadaslari, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Seguences of Proteins of birbiriyle karsilastirildigi zaman çakisan amino asit kalintilarini veya amino asit kalintilarinin alt kümelerini içerir. Yine de, bir antikorun TBB'sini veya bunun varyantlarini ifade eden her iki tanimin kullanilmasi, burada tanimlandigi ve kullanildigi sekilde terimin kapsami içinde oldugunu kastetmektedir. Yukarida bahsedilen referanslarin her biri ile tanimlanan sekliyle TBB'leri kapsayan uygun amino asit kalintilari, bir karsilastirma olarak asagidaki Tablo 1'de gösterilmektedir. Belirli bir TBB'yi kapsayan tam kalinti numaralari, TBB'nin dizisine ve boyutuna bagli olarak degisiklik gösterecektir. Teknikte uzman kisiler, antikorun degisken bölge amino asit dizisi söz konusu oldugunda hangi kalintilarin belirli bir hiperdegisken bölge veya antikorun insan IgG alt tipinin TBB'sini içerdigini rutin olarak belirleyebilmektedir.
Tablo 1: TBB Tanimlari1 Kabat Chothia Kabat Chothia 1Tablo 1'de yer alan TBB tanimlarinin numaralandirilmasi, Kabat ve arkadaslari tarafindan ortaya konan numaralama konvansiyonlarina uygun olarak yapilmistir. (asagiya bakiniz).
Kabat ve ark. ayni zamanda degisken alan dizisi için herhangi bir antikora uygulanabilir bir numaralandirma sistemi tanimlanmistir. Teknikte siradan uzmanliga sahip kisilerden biri dizinin kendisinin ötesindeki herhangi bir deneysel veriye bagimli olmaksizin herhangi bir degisken alan dizisine bu "Kabat numaralandirma" sistemini açik bir sekilde tayin edebilmektedir.
Burada kullanilan sekliyle, “Kabat numaralandirmasi", Kabat ve ark., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983) tarafindan adi geçen belgede ortaya konulmus olan numaralandirma sistemini ifade etmektedir. Aksi belirtilmedikçe, mevcut bulusun bir antikoru veya antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevindeki spesifik amino asit kalinti pozisyonlarinin numaralandirilmasina yönelik referanslar, Kabat numaralandirma sistemine göre yapilir.
Bulusun antikorlari veya antijen baglayici fragmanlari, immünospesifik fragmanlari, varyantlari veya türevleri bunlarla sinirli olmamak üzere, poliklonal, monoklonal, multispesifik, insan, insanlastirilmis, primatize edilmis, murinlenmis veya kimerik antikorlari, tek zincirli antikorlar, epitop baglayici fragmanlar, örn., Fab, Fab' ve F (ab')2, Fd, Fvs, tek zincirli Fvs (scFV), tek zincirli antikorlar, disülfür bagli Fvs (deV), bir* VL veya VH alani içeren fragmanlar, bir Fab ekspresyon kütüphanesi tarafindan üretilen fragmanlar ve anti-idiyotipik (anti-Id) antikorlari(örn., burada açiklanan antikorlara karsi anti-Id antikorlari dahil) içerir. ScFv nmlekülleri teknikte bilinmektedir ve örn., ABD Patenti 5,892,019'da açiklanmaktadir.
Bulusa ait immünoglobulin veya antikor molekülleri, immünoglobulin molekülünün herhangi bir tipteki (örn., IgG, IgE, Bir düzenlemede, bu bulusun antikoru IgM veya pentavalent yapiya sahip bir türevi degildir. Özellikle, bu bulusun özel uygulamalarinda, özellikle terapötik kullanimda, lgM'ler, pentavalent yapilari ve afinite olgunlasmasinin olmamasi nedeniyle IgM'ler genellikle spesifik olmayan çapraz reaktiviteleri ve çok düsük afiniteleri gösterdiginden IgG ve diger bivalent antikorlardan veya karsilik gelen baglayici moleküllerden daha az faydalidir.
Bir düzenlemede, mevcut bulusun antikoru bir poliklonal antikor degildir, yani bir plazma immünoglobulin numunesinden elde edilen bir karisim olmaktan ziyade esas olarak belirli bir antikor türünü içerir.
Tek Zincirli antikorlar da dahil olmak üzere antikor fragmanlari, tek basina veya asagidakilerin bütünüyle veya bir kismi ile kombinasyon halinde degisken bölge (ler) içerebilir: eklem.bölgesi, CHl, CH2 ve CH3 alanlari. Bulusa ayrica, bir eklem bölgesi, CHl, CH2 ve CH3 alanlari ile herhangi bir degisken bölgenin (lerin) kombinasyonunu içeren d-sinüklein baglayici fragmanlar da dahildir. Mevcut bulusun antikorlari veya immünospesifik fragmanlari, kuslar ve memeliler dahil olmak üzere herhangi bir hayvan kökenli olabilir. Bazi düzenlemelerde antikorlar, insan, murin, esek, tavsan, keçi, gine domuzu, deve, lama, at veya tavuk antikorlaridir. Baska bir düzenlemede, degisken bölge köken olarak kikirdakli balikgiller (örn., köpekbaliklarindan) olabilir.10 Bir yönde, mevcut bulusun antikoru, bir insandan izole edilmis bir insan nmnoklonal antikorudur. Istege bagli olarak, insan antikorunun çerçeve bölgesi, veri tabanindaki ilgili insan germ hatti degisken bölge dizilerine uygun olarak hizalanir ve benimsenir; bakiniz, MRC Protein Engineering Center (Cambridge, Ingiltere) tarafindan barindirilan Vbase (vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk). Örnegin, gerçek germ hatti dizisinden potansiyel olarak saptigi düsünülen amino asitler, PCR primer dizilerinden dolayi klonlama islemi sirasinda birlesmis olabilir. Bir faj gösteren antikor kütüphanesinden veya ksenojenik farelerden elde edilen tek zincirli antikor fragmanlari (scFvs) gibi yapay olarak üretilen insan benzeri antikorlarla karsilastirildiginda mevcut bulusun antikoru (i) hayvan surrogatlarindan ziyade insan immün tepkisi kullanilarak elde edilmesi, yani antikorun, insan vücudundaki ilgili konformasyonunda dogal d-sinükleinine tepki olarak üretilmis olmasi, (ii) bireyi koruyor olmasi veya d- sinüklein varliginda en azindan anlamli olmasi ve (iii) antikorun insan kaynakli olmasi nedeniyle, kendi antijenlerine karsi çapraz reaktivite risklerinin en aza indirgeniyor olmasi ile karakterize edilir. Böylece, bu bulusa uygun olarak, "insan monoklonal antikoru", "insan monoklonal otoantikor", "insan antikoru" ve benzeri terimler, insan kaynakli, yani bir E hücresi veya hibridomu gibi bir insan hücresinden izole edilmis veya bir insan hücresinin, örnegin bir insan bellek B hücresinin mRNA'Sindan dogrudan klonlanmis olan cDNA'dan izole edilmis bir d-sinüklein baglanma molekülünü belirtmek için kullanilirlar.
Antikorda örn., baglanma özelliklerini gelistirmek için amino asit ornatimlari yapilsa bile, bir insan antikoru hala Insan immünoglobulin kütüphanelerinden veya bir veya daha fazla insan immünoglobulini için transgenik olan. ve endojen immünoglobulinleri eksprese etmeyen hayvanlardan elde edilen, burada infra olarak ve örnegin, Kucherlapati ve arkadaslari10 tarafindan 5,939,598 sayili ABD patentinde tarif edildigi gibi olan antikorlar ile bu bulusun gerçek insan antikorlarindan ayirmak için insan benzeri antikorlar belirtilir.
Bu tarifnamede kullanildigi haliyle, "murinlenmis antikor" veya“murinlenmis immünoglobulin" terimi, bu bulusun bir insan antikorundan bir veya daha fazla TBB içeren bir antikora ve bir fare antikor dizisine dayanan amino asit ornatiklari ve/ veya delesyonlari ve/ veya eklemeleri içeren bir insan çerçeve bölgesine deginmektedir. TBB'leri saglayan insan immünoglobulinine "ana" veya "alici“ denir ve çerçeve degisikliklerini saglayan fare antikoru "donör" olarak adlandirilir. Sabit bölgeler mevcut olmamalidir, ancak eger mevcutlarsa, bunlar genellikle, fare antikoru sabit bölgeleri ile büyük ölçüde özdestirler, yani en az yaklasik %85-90 veya yaklasikr %95 veya daha fazla özdestirler. Bu nedenle, bazi düzenlemelerde, tam uzunluktaki bir murinlenmis insan agir veya hafif zincir immünoglobulini, bir fare sabit bölgesini, insan TBB'lerini ve esas olarak, bir dizi "murinize" amino asit ornatigina sahip olan bir insan çerçevesini içerir. Tipik olarak bir "murinlenmis antikor", bir murinlenmis degisken hafif zincir ve/ veya bir murinlenmis degisken agir zincir içeren bir antikordur. Örnegin, bir murinlenmis antikor tipik bir kimerik antikoru kapsamaz, çünkü örnegin bir kimerik antikorun tüm degisken bölgesi fare degildir. "Murinleme" islemi ile saglayan ana antikorla ayni antijene baglanir ve ana antikorla karsilastirildiginda farelerde genellikle daha az immünojeniktir.
Burada kullanildigi sekliyle "agir zincir kismi" terimi, bir immünoglobulin agir zincirinden türetilen amino asit dizilerini içerir. Bir agir zincir kismi içeren bir polipeptit, asagidakilerden en az birini içerir: bir CHl alani, bir eklem (örn., üst, orta ve/ veya alt eklem bölgesi) alani, bir CH2 alani, bir CH3 alani veya bunun bir varyanti veya bir fragmani.10 Örnegin, bulusta kullanim için bir baglanma polipeptidi, bir CHl alanini içeren bir polipeptid zincirini; bir CHl alanini içeren, bir eklem alaninin en azindan bir kismini ve bir CHZ alanini içeren bir polipeptit zincirini; bir CHl alani ve bir CH3 alani içeren bir polipeptit bir CHl alani, bir alaninin en azindan bir kismi ve bir CH3 alani veya bir CHl alanini içeren bir polipeptid zincirini, azindan .bir kismi, bir eklem alaninin en bir' CH2 alaninin ve bir' CH3 alaninin en azindan bir kismini içeren bir polipeptit zincirini içerebilir.
Baska bir düzenlemede, bulusun bir polipeptidi, bir CH3 a içeren bir polipeptid zincirini içerir. Ayrica, bulusta kullanim kismindan (örn Bir CH2 alaninin tamami veya bir kismi) bir CHZ alaninin en azindan bir yoksun olabilir. Yukarida belirtildigi gibi, teknikte siradan uzmanliga sahip kisilerce anlasilacagi gibi, bu alanlar (örn., agir kisimlari), olarak olusan immünoglobulin molekü amino asit dizisinde degisecek sekilde modifiye edilebilir.
Burada açiklanan belirli antikorlarda veya antijen baglayici fragmanlarinda, varyantlarinda veya türevlerinde, bir multimerin bir polipeptit ikinci bir polipeptid degildir. zincirinin agir bulusun agir zincir kismi Örnegin, her bir monomer, zincirindekilerle kisimlari, mult aynidir. Alte içeren monomerleri rnatif örnegin bir bispesifik antikor veya diakoru olusturan farkli bir hedef baglama bölgesi içerebilir.
Baska bir düzenlemede, açiklanan antikorlar antijen baglayici fragmanlar, varyantlar veya bunlarin türevleri, scFv'ler gibi tek bir polipeptit zincirinden olusur ve in vivo terapötik ve (intraantikorlar) tanisal uygulamalar eksprese edilir. hücre içi Burada açiklanan teshis ve tedavi yöntemlerinde kullanim için baglayici polipeptidin kisimlari, farkli immünoglobulin moleküllerinden türetilebilir. Örnegin bir polipeptidin bir agir zincir kismi, bir IgGl molekülünden türetilen bir CHl bölgesini ve bir IgG3 molekülünden türetilmis bir eklem bölgesini içerebilir. Bir baska örnekte, bir agir zincir kismi, kismen bir IgGl molekülünden ve kismen bir IgG3 molekülünden türetilen bir eklem bölgesini içerebilir. Bir baska örnekte, bir agir zincir kismi, kismen bir IgGl molekülünden ve kismen bir IgG4 molekülünden türetilen kimerik bir eklemi içerebilir.
Burada kullanildigi sekliyle "hafif zincir kismi" terimi, bir immünoglobulin hafif zincirinden türetilen amino asit dizilerini içerir. Bir düzenlemede, hafif zincir kismi, bir VL veya CL alaninin en az birini içerir.
Bir antikor için bir peptit veya polipeptid epitopunun minimum boyutunun yaklasik dört ila bes amino asit oldugu düsünülmektedir. Peptid veya polipeptit epitoplari, örnegin en az yedi, en az dokuz veya en az yaklasik 15 ila yaklasik 30 amino asit içerebilir. Bir TBB, tersiyer formunda bir antijenik peptidi veya polipeptidi taniyabildiginden, bir epitop içeren amino asitler, bitisik olmamalidir* ve bazi durumlarda, ayni peptit zincirinde bile bulunmamalidir. Mevcut bulusta, mevcut bulusa ait antikorlar tarafindan taninan bir peptit veya polipeptit epitopu, en az 4, en az 5 en az 6, en az 7, en az 8, ila yaklasik 30 bitisik veya bitisik olmayan d-sinüklein amino asitleri dizisini içerir. Burada kullanildigi sekliyle, bir antikorun belirli bir amino asit araligi "içerisine" bagladigi, örn., "d-sinükleinin 4 ila 15 amino asitleri içinde" bir epitopa baglandigi söylenirse, epitopun belirtilen amino asitlerin tamamini kapsadigi veya daha küçük oldugu kastedilmektedir.
Baska bir deyisle, "d-sinükleinin 4 ila 15 amino asitleri içindeki" bir epitop için, epitop 4'ten 15'e kadar olan 12-amino asit peptid zincirinin tümünü içerebilir, fakat ayni zamanda10 daha küçük olabilir, örnegin 4 ila 12 amino asitleri, 4 ila 10 amino asitleri veya 4 ila 8 amino asitleri içeriyor olabilir. Bu alanda siradan uzmanliga sahip kisi, belirtilen araligin disindaki amino asitlerin, daha iyi bir baglanma afinitesine veya bir konformasyonel epitopun daha iyi taninmasina katkida bulunabilecegini, ancak baglanma için gerekli olmadigini kabul edecektir.
Burada birbirinin yerine kullanilan "spesifik olarak baglayici" veya "spesifik olarak taniyan" ile, genel olarak bir baglanma molekülünün, örn., bir antikorun antijen baglama alani yoluyla bir epitopa baglandigi ve baglamanin, antijen-baglama bölgesi ve epitop arasinda bir miktar tamamlayicilik gerektirdigi kastedilmektedir. Bu tanima göre, bir antikorun, epitopa baglandigi zaman bir epitopa, spesifik olarak rastgele, ilgisiz bir epitopa baglanmasindan daha kolay bir sekilde antijen baglama alani yoluyla "spesifik olarak baglandigi" söylenir. "Spesifite" terimi burada, belirli bir antikorun belirli bir epitopa baglandigi göreceli afiniteyi nitelendirmek için kullanilir. Örnegin, "A" antikorunun, belirli bir epitop için "B" antikorundan daha yüksek bir spesifiteye sahip oldugu kabul edilebilir veya "A" antikorunun, "C" epitopuna, ilgili "D" epitopuna olandan daha yüksek bir spesifite ile baglandigi söylenebilir.
Mevcut oldugunda, "immünolojik baglama özellikleri" veya bir antikorun bir antijen ile diger tüm baglanma özellikleri, tüm gramer formlarinda, bir antikorun spesifitesini, afinitesini, çapraz reaktivitesini ve diger baglanma özelliklerini belirtir. antikorun, bir epitopa, ilgili, benzer, homolog veya analog bir epitopa baglanmasindan daha kolay bir sekilde spesifik olarak baglandigi kastedilmektedir. Böylece, belirli bir epitopa çapraz reaksiyona girebilse de, ilgili epitopa kiyasla bu epitopa daha büyük bir olasilikla baglanacaktir.
Sinirlayici olmayan bir örnek yoluyla, bir baglanma molekülü, örn., bir antikor, birinci epitopu, ikinci epitop için antikorun KD'sinden daha az olan bir bozunma sabitiyle (Km baglarsa tercihen bir birinci epitopu baglar. Bir baska sinirlayici olmayan örnekte, bir antikor, birinci epitopu, ikinci epitop için antikorun KD'sinden en az bir büyüklük derecesine sahip bir afinite ile baglarsa, tercihen bir birinci antijeni baglar. Bir baska sinirlayici olmayan örnekte, bir antikor, birinci epitopu, ikinci epitop için antikorun KD'sinden en az iki büyüklük derecesine sahip bir afinite ile baglarsa, tercihen bir birinci epitopu baglar.
Sinirlayici olmayan baska bir örnekte, bir baglanma molekülü, örn., bir antikor, ikinci epitop için antikorun k (kapali) oranindan daha az olan bir kapali orana ((k (kapali)) sahip birinci epitopu baglarsa tercihen bir birinci epitopu baglar. Bir* baska sinirlayici olmayan örnekte, bir antikor, birinci epitopu, ikinci epitop için antikorun k(kapali) oranindan en az bir büyüklük derecesine sahip bir afinite ile baglarsa, tercihen bir birinci epitopu baglar. Bir baska sinirlayici olmayan örnekte, bir antikor, birinci epitopu, ikinci epitop için antikorun k(kapali) oranindan en az iki büyüklük derecesine sahip bir afinite ile baglarsa, tercihen bir birinci epitopu baglar.
Bazi düzenlemelerde baglanma molekülü, örn-, burada açiklanan bir antikor veya bunun antijen baglayici fragman, varyant veya türev, bir d-sinükleini veya bir fragmanini veya varyantini 5 x esit veya daha düsük bir kapali oranla (k (kapali)) baglayabilir.
Bazi düzenlemelerde bulusa ait bir antikor, d-sinüklein veya bunun bir fragmanini veya varyantini 5 x 10“4 saniye*, 10'10 düsük bir kapali oranla (k (kapali)) baglayabilir.
Bazi düzenlemelerde bir baglanma molekülü, örn., burada açiklanan. bir antikor* veya bunun antijen baglayici fragman, varyant veya türevi, g-sinüklein veya bunun bir fragmanini veya 1 saniye* veya 5 x 104 M* saniye*'e esit veya daha büyük bir açik (k(açik)) oranla baglayabilir. Bazi düzenlemelerde bulusa ait bir antikor, d-sinüklein veya bunun bir fragmanini veya veya 5 x 106 M* saniye* veya 107 M* saniye*'e esit veya daha büyük bir açik (k(açik)) oranla baglayabilir.
Bir baglanma molekülünün, örn., bir antikorun, referans antikorun epitopa bir dereceye kadar baglanmasini engelleyecek ölçüde tercihen bu epitopa baglanmasi durumunda, bir referans antikorunun bir baglanma antikoruna baglanmasini rekabetçi bir sekilde inhibe ettigi söylenir. Rekabetçi inhibisyon, teknikte bilinen herhangi bir yöntemle, örnegin, rekabetçi ELISA analizleri ile belirlenebilir. Bir örnek olarak, bir antikor, referans antikorun belirli bir epitopa en az %90, en az %80, en az %70, en az %60 veya en az %50 oraninda baglanmasini rekabetçi bir sekilde inhibe edebilir.
Burada kullanildigi sekliyle "afinite" terimi, tek bir epitopun bir baglanma molekülünün TBB'si, örnegin bir immünoglobulin molekülü ile baglanmasinin kuvvetinin bir ölçüsünü belirtir; bkz., örn., Harlow ve arkadaslari, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, , 2. baski, (1988) sayfa 27-28. Burada kullanildigi sekliyle arasindaki kompleksin genel stabilitesini, yani bir immünoglobulin karisiminin antijen ile fonksiyonel birlesme10 gücünü göstermektedir; bakiniz, örnegin Harlow, sayfalar 29-34.
Avidite, heni bireysel immünoglobulin moleküllerinin spesifik epitoplar ile popülasyondaki afinitesi, hem de immünoglobulinlerin. ve antijenin valanslari ile iliskilidir. Örnegin, bir bivalent monoklonal antikor ve bir polimer gibi yüksek oranda tekrarlanan bir epitop yapisina sahip bir antijen arasindaki etkilesim, yüksek bir avidite olacaktir. Bir antikorun bir antijen için afinitesi veya aviditesi, herhangi bir uygun yöntem kullanilarak deneysel olarak belirlenebilir; bkz., örnegin, Berzofsky ve arkadaslari, "Antibody-Antigen lnteractions" In Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman ve Company New York, NY (1992) ve burada açiklanan yöntemler.
Bir antikorun bir antijene olan afinitesini ölçmek için genel teknikler arasinda ELISA, RIA ve yüzey plazmon rezonansi bulunur.
Belirli bir antikor-antijen etkilesiminin ölçülen yakinligi, farkli kosullar altinda, örn., tuz konsantrasyonu, pH ölçüldügünde degisebilir. Böylece, afinite ve diger antijen baglanma parametrelerinin, örn., KD, ICm'nin ölçümleri, standartlastirilmis antikor ve antijen çözeltileri ve standartlastirilmis bir tampon ile yapilabilir.
Baglayici moleküller, örnegin antikorlar veya antijen baglayici fragmanlar, bulusun varyantlari veya türevleri, çapraz reaktiviteleri açisindan da tarif edilebilir veya belirtilebilir.
Burada kullanildigi sekliyle "çapraz reaktivite" terimi, bir antijene özgü bir antikorun, ikinci bir antijenle reaksiyona girme kabiliyetini belirtir; iki farkli antijenik madde arasindaki bir iliski ölçüsü. Dolayisiyla, bir antikor, olusumunu indükleyen baska bir epitopa baglanirsa çapraz reaktiftir. Çapraz reaktif epitop, genellikle, indükleyici epitop ile ayni tamamlayici yapisal özelliklerin çogunu içerir ve bazi durumlarda, orijinalden daha uygun olabilir. Örnegin, bazi antikorlar, referans epitopa göre örn., en az %95,10 en az %60, en az %55, ve en az %50 özdes epitoplar (tekniktebilinen ve burada tarif edilen yöntemler kullanilarak hesaplandigi haliyle) gibi ilgili ancak ayni olmayan epitoplari bagladiklari için bir dereceye kadar çapraz reaktiviteye sahiptir. Bazi düzenlemelerde bir antikorun, referans epitopa göre örnegin %95'den az, %90'dan az, %85'den az, %80'den veya %50'den az özdes epitoplari (bu alanda bilinen ve burada tarif edilen yöntemler kullanilarak hesaplandigi haliyle) baglamiyorsa çok az çapraz reaktiviteye sahip oldugu veya hiç çapraz reaktiviteye sahip olmadigi söylenebilir. Bir antikor, bu epitopun baska herhangi bir analog, ortolog veya homologunu baglamazsa, belirli bir epitop için "oldukça spesifik" olarak kabul edilebilir.
Baglayici moleküller, örn., antikorlar veya antijen baglayici fragmanlar, bulusun varyantlari veya türevleri, d-sinükleine baglanma afiniteleri açisindan da tarif edilebilir veya belirtilebilir. Baglanma afiniteleri arasinda, bozunma sabiti M, 5 x 10"“3M, veya 10"15 M'den daha az olanlar bulunur.
Daha Önce belirtildigi gibi, çesitli immünoglobulin siniflarinin sabit bölgelerinin alt birim yapilari ve üç boyutlu konfigürasyonu iyi bilinmektedir. Burada kullanildigi sekliyle terminali degisken alanini içerir ve "CHl alani" terimi, bir immünoglobulin agir zincirinin birinci (çogu amino terminali) sabit bölge alanini içerir. CHl alani, VH alanina bitisiktir ve bir immünoglobulin agir zincir molekülünün eklem bölgesi için amino terminaldir.10 Burada kullanildigi sekliyle "CH2 alani" terimi, konvansiyonel numaralandirma semalarini kullanan bir antikorun yaklasik 244 kalintisindan 360 kalintisina kadar olan bir agir zincir molekülünün bir kismini içerir. (Kalintilar 244 ila 360, Kabat numaralandirma sistemi ve kalintilar 231-340, AB numaralandirma sistemi; bkz. a.g.e, Kabat EA ve ark.). CH2 alani, baska bir alanla yakindan eslesmemesi bakimindan benzersizdir. Daha dogrusu, iki N-baglantili dalli karbonhidrat zincirleri, bütün bir dogal IgG molekülünün iki CH2 alani arasinda yer alir. Ayni zamanda, CH3 alaninin, CH2 alanindan IgG molekülünün C- terminaline kadar uzandigi ve yaklasik 108 kalinti içerdigi de iyi bir sekilde belgelenmistir.
Burada kullanildigi sekliyle "eklem bölgesi" terimi, CH1 alanini CH2 alanina. birlestiren bir agir zincir` molekülünün bölümünü içerir. Bu eklem bölgesi yaklasik 25 kalinti içerir ve esnek olup iki N-terminal antijen-baglama bölgesinin bagimsiz olarak hareket etmesine izin verir. Eklem bölgeleri üç ayri alana ayrilabilir: üst, orta ve alt eklem alanlari; bkz. Roux ;ve Burada kullanildigi sekliyle "disülfit bagi" terimi, iki sülfür atomu arasinda olusan kovalent bagi içerir. Amino asit sistein, bir ikinci tiyol grubuyla bir disülfid bagi veya köprüsü olusturabilen bir tiyol grubunu içerir. Dogal olarak meydana gelen IgG moleküllerinin çogunda, CH1 ve CL bölgeleri bir disülfid bagi ile baglanir ve iki agir zincir, Kabat numaralandirma sistemi (pozisyon 226 veya 229, AB numaralandirma sistemi) kullanilarak 239 ve 242'ye karsilik gelen konumlarda iki disülfid bagi ile baglanir.
Burada kullanilan "baglanmis", "kaynasmis" veya "füzyon" terimleri birbirinin yerine kullanilir. Bu terimler, kimyasal konjugasyon veya rekombinant araçlar da dahil olmak üzere, her10 iki elemanin veya bilesenin bir araya getirilmesiyle ilgilidir.
Bir "çerçeve içi füzyon", orijinal ORF'lerin dogru translasyonel okuma çerçevesini koruyacak sekilde sürekli bir daha uzun ORF olusturmak için iki veya daha fazla polinükleotid açik okuma çerçevesinin (ORF'ler) birlestirilmesine refere eder.
Dolayisiyla, bir rekombinant füzyon proteini, orijinal ORF'ler tarafindan kodlanan polipeptidlere karsilik gelen iki veya daha fazla segmenti içeren tek bir proteindir (bu segmentler normal olarak dogada çok fazla birlestirilmez). Okuma çerçevesinin böylece kaynasikr segmentler boyunca sürekli hale getirilmis olmasina ragmen, segmentler fiziksel olarak veya uzaysal olarak örnegin çerçeve-içi baglayici dizisi ile ayrilabilir. Örnegin, bir immünoglobulin degisken bölgenin TBB'lerini kodlayan polinükleotidler çerçeve içinde kaynastirilabilirler ancak birlikte çevrildikleri sürece en az bir immünoglobulin çerçeve bölgesini veya ek TBB bölgelerini kodlayan bir polinükleotid ile ayrilmalidir.
Burada kullanilan "ekspresyon" terimi, bir genin bir biyokimyasali, örnegin bir RNA veya polipeptidi ürettigi bir prosese karsilik gelir. Proses, sinirlama olmaksizin, gen demontesinin yani sira hem geçici ekspresyon hem de stabil ekspresyon dahil olmak üzere, hücre içindeki genin fonksiyonel varliginin herhangi bir belirginlesmesini içerir. Sinirlama olmaksizin, genin haberci RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), küçük firkete RNA (shRNA), küçük interferansli RNA (siRNA) veya herhangi bir diger RNA ürünü içine transkripsiyonunu ve bu mRNA'nin polipeptit (ler) e dönüstürülmesini içerir- Eger arzu edilen nihai ürün bir biyokimyasal ise, ekspresyon bu biyokimyasalin ve herhangi bir öncünun yaratilmasini içerir. Bir genin ekspresyonu bir "gen ürünü" üretir. Burada kullanildigi gibi bir gen ürünü, bir genin transkripsiyonu veya bir transkriptten çevrilen bir polipeptit tarafindan üretilen bir haberci RNA, örnegin bir nükleik asit olabilir. Burada tarif10 edilen gen ürünleri ayrica transkripsiyon sonrasi modifikasyonlari olan nükleik asitleri, örn., poliadenilasyon veya post translasyonal modifikasyonlari olan polipeptidleri, örn., metilasyonu, glikosilasyonu, lipitlerin ilavesini, diger protein alt-birimleri ile iliskiyi, proteolitik parçalanma ve benzerlerini içerir.
Bu tarifnamede kullanildigi haliyle, "numune" terimi, bir denekten veya hastadan elde edilen herhangi bir biyolojik maddeye deginmektedir. Bir yönden bir numune, kan, beyin- omurilik sivisi ("BOS") veya idrari içerebilir. Baska yönlerden bir örnek, tam kani, plazmayi, kan numunelerinden zenginlestirilmis B hücrelerini ve kültürlenmis hücreleri (örn., bir denekten alinan B hücreleri) içerebilir. Bir numune ayrica nöral doku içeren bir biyopsi veya doku numunesini içerebilir.
Yine baska yönlerde, bir örnek, tüm hücreleri ve/ veya hücrelerin bir lizatini içerebilir. Kan numuneleri, teknik alanda bilinen yöntemlerle toplanabilir. Bir yönde pelet, 200 ul tampon içinde 4 °C'de vorteksleme ile yeniden süspanse edilebilir (20 mM Tris, pH 7.5, %0.5 Nonidet, l mM EDTA, l mM PMSF, 0.1M NaCl, IX Sigma Proteaz Inhibitörü ve IX Sigma Fosfataz Inhibitörleri 1 ve 2).
Süspansiyon, aralikli vorteksleme ile 20 dakika buz üzerinde tutulabilir. 15,000 x g'de 5 dakika boyunca yaklasik 4 °C'de döndürüldükten sonra, süzüntü bölüntüleri yaklasik -70 oC'de saklanabilir.
Burada kullanildigi sekliyle "tedavi etme" veya "tedavi" terimleri, hem terapötik tedaviyi hem de profilaktik veya önleyici tedbirleri belirtmektedir, burada amaç, Parkinsonizm gelisimi gibi istenmeyen bir fizyolojik degisim veya bozuklugu önlemek veya yavaslatmaktir (azaltmak). Yararli veya arzu edilen klinik sonuçlar arasinda, bunlarla sinirli kalmamak üzere, saptanabilir veya saptanamayan olsa da semptomlarin hafifletilmesi, hastaligin boyutunun azaltilmasi, stabilize (yani kötülesmeyen) hastalik durumu, hastaligin ilerlemesinin10 geciktirilmesi veya yavaslatilmasi, hastalik durumunun iyilesmesi veya hafifletilmesi ve (kismen veya tamamen) geriletilmesi yer alir. "Tedavi" ayrica, tedavi görmemesi halinde beklenen sagkalima kiyasla sag kalimi uzatmak anlamina da gelebilir. Tedaviye ihtiyaç duyan kisiler, hali hazirda durum veya rahatsizligi bulunanlar ile durum veya rahatsizliga yatkin bireyleri veya durum veya rahatsizligin belirtisinin önlenecegi durumda olanlari da kapsar. ile, herhangi bir denek, özellikle bir memeli denek, örn., teshis, prognoz, önleme veya terapinin arzu edildigi bir insan hasta kastedilmektedir.
Mevcut bulus, genel olarak, istemlerde karakterize edilen, insan anti-d-sinüklein antikorlari ve bunlarin antijen baglayici fragmanlari ile ilgilidir; bu, Örneklerde gösterilen antikorlar için ana hatlari çizilen immünolojik baglama özelliklerini ve/ veya biyolojik özellikleri gösterebilir. Mevcut bulusa göre, a- sinüklein için spesifik insan monoklonal antikorlari, yasli deneklerden olusan bir havuzdan klonlanmistir.
Mevcut bulusa uygun olarak gerçeklestirilen deneyler sirasinda, baslangiç girisimleri, d-sinüklein spesifik antikorlari klonlamakta basarisiz olmustur, ancak neredeyse her zaman hatali pozitif klonlarla sonuçlanmistir. Bu klonlarin daha fazla arastirilmasi, E. coli proteinlerini taniyan antikorlar ürettiklerini ortaya çikarmistir. Bu sorunu atlatmak için insan B bellek hücresi kültürlerinin kosullu ortamindaki antikorlar, kaplanmis tam uzunlukta alfa-sinüklein monomerine baglanmaya ve E. coli proteinlerine ve bovin serum albümine (BSA) baglanma absansina paralel olarak taranmistir. Özellikle, B hücresi kosullu ortam, d-sinüklein baglayici insan antikorlarinin taranmasi için ortamin bir ELISA analizine tabi tutulmasindan önce E. 0011 proteinleri ile önceden emdirilmistir.
Spesifik antikorlarin izole edilmesine yönelik ilk girisimler, dolasimdaki d-sinüklein antikorlari plazmasinin yüksek seviyelerini düsündüren, d-sinükleine yüksek plazma baglama aktivitesi olan insan deneklerinin havuzlarina odaklanmistir. Bu girisimler, d-sinüklein spesifik insan bellegi B hücrelerini üretmede basarisiz olmuslardir ve mevcut bulusta tarif edilen antikorlar, d-sinüklein'e düsük plazma reaktivitesi olan deneklerin havuzlarindan izole edilmistir.
Bu ölçüme bagli olarak, birkaç antikor izole edilmistir.
Seçilen antikorlar, sinif ve hafif zincir alt sinifi tayini için daha fazla analiz edilmistir. B Bellek hücresi kültürlerinden seçilen ilgili antikor mesajlari daha sonra RT-PCR ile kopyalanir, klonlanir ve rekombinant üretini için ekspresyon vektörleri halinde birlestirilir; bkz. PCT Yayin No. WO Burada açiklanan insan monoklonal antikoru NI-202.21Dll'dir.
HEK293 veya CHO hücrelerinde NI-202.21Dll'in rekombinant ekspresyonu ve insan d-sinüklein için baglanma spesifitesinin sonraki karakterizasyonu (Sekil 2A-B) belirlenmistir.
Dolayisiyla, mevcut bulusun bir yönü, izole edilmis insan monoklonal anti-d-sinüklein antikoru NI-202.21Dll ve bunun antijen baglayici fragmanlari, türevleri ve varyantlari ile ilgilidir. Mevcut bulus ayrica bir antikor veya bunun antijen baglayici fragman, varyant veya türevleri gibi bir* baglanma molekülüne çekilir, burada antikor, DIZI KIM.NO: 15 veya DIZI KIM.NO: 20'nin amino asit dizisine sahip bir VH'yi ve DIZI KIM.
NO: 22'nin veya DIZI KIM.NO: 26'nin amino asit dizisine sahip10 bir VL'yi veya bunun antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevlerini içerir. Bir düzenlemede bunun varyantlari, fragmanlari veya türevlerinin yani sira NI-202.21D11, insan ß- sinüklein ve insan y-sinüklein ile ve murin d-sinükleine göre insan d-sinükleini ile karsilastirildiginda spesifik olarak baglanan insan d-sinükleini olarak karakterize edilir. NI- 202.21D11 tercihen oligomerik veya agrege formdaki d-sinükleine baglanir.
Bir düzenlemede bu bulus, antikorun, referans antikoru NI- 202.21D11 ile ayni d-sinüklein epitopuna spesifik olarak baglandigi bir anti-d-sinüklein antikoruna veya antijen baglayici fragmana, varyantina veya türevlerine yöneliktir. Örneklerde gösterildigi gibi, NI-202.21D11 antikoru, örn., DIZI KIM. NO: 1'in 113 ila 123 amino asitleri içindeki direkt bir ELISA analizinde C-terminali asidik bölgesini (amino asitler 96- 140) içeren d-sinüklein kesikligine, ve spesifik olarak, PVDPDNE amino asitleri (DIZI KIM. NO: 1'in 117-123 amino asitleri) Antikor NI-202.21D11 tercihen, Örnek 2'de gösterildigi gibi d- sinüklein monomerik formu üzerindeki d-sinüklein agregatlarina veya fibrillerine baglanir. Dahasi, antikor Nl-202.21D11 beyindeki d-sinüklein patolojik formlarina, örn., Örnek 3'te tarif edilen immünohistokimyasal boyama ile örneklenen d- sinüklein patolojik agregatlarina baglanir. Dolayisiyla mevcut bulus, tani ve terapötik amaçlar için yararli yeni bir insan anti-g-sinüklein antikoru saglar.
Mevcut bulus, Sekil 1'de gösterilen amino asit dizilerinden herhangi birini içeren bir NI-202.21D11 VH ve VL degisken bölgesinin en az alti tamamlayicilik belirleme bölgesini (TBB) içeren baglanma molekülleri, örn., antikorlar ve antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya bunlarin türevlerini saglar. Yukarida tanimlanan degisken bölgeleri kodlayan karsilik10 gelen nükleotit dizileri, ekli dizi listesinde ortaya konmustur.
Sekil 1'de gösterildigi gibi VH ve/ veya VL bölgesinin yukaridaki amino asit dizilerinin TBB'lerinin seti, eklenmis dizi listesinde de belirtilmektedir. Bununla birlikte, asagida tartisildigi gibi, teknikte uzman bir kisi, bir, iki, üç, dört, bes veya daha fazla amino asitle Sekil 1'de ortaya konan amino asit dizileri açisindan farkli olan ek veya alternatif TBB'lerin kullanilabilecegi gerçeginin farkindadir. NI-202.21Dll'in VH'si, DIZI KIM. NO: 15'in amino asit dizisi ve DIZI KIM. NO: l9'un DNA dizisi ile temsil edilirve GL-düzeltilmis formu, DIZI KIM. NO: amino asit dizisi ve DIZI KIM. NO: 21'in DNA dizisi olarak temsil edilir. NI-202.21Dll'in VL'si, DIZI KIM. NO: 22'nin amino asit dizisi ve DIZI KIM. NO: 28'in DNA dizisi ile temsil edilir ve GL-düzeltilmis formu, DIZI KIM. NO: 26 amino asit dizisi ve DIZI KIM. NO: 27'nin DNA dizisi olarak temsil edilir. VH-TBBl, VH-TBB2 ve VH-TBB3'ün agir zincir TBB amino asit dizileri, sirasiyla DIZI KIM. NO: 16, DIZI KIM. NO 17 ve DIZI KIM. NO: 18 ile temsil edilir. VL-TBBl, VL-TBB2 ve VL-TBB3'ün hafif zincir TBB amino asit dizileri, sirasiyla DIZI KIM. NO: 23, DIZI KIM.
NO:24 ve DIZI KIM. NO: 25 ile temsil edilir.
Bir düzenlemede, mevcut bulusun bir antikoru, örn., bir antikor veya bunun antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevi Sekil 1'de tasvir edildigi gibi VH ve/ veya VL bölgesinin bir amino asit dizisini içeren antikorlardan herhangi biridir.
Alternatif olarak, mevcut bulusun antikoru, Sekil 1'de gösterildigi gibi bir VH ve/ veya VL bölgesine sahip bir antikor ile d-sinükleinine baglanma için rekabet eden örn., bir antikor veya bunun antijen baglama fragmani, varyanti veya bir türevi olan bir baglanma molekülüdür. Bu antikorlar, özellikle terapötik uygulamalar için de insan olabilir. Alternatif olarak, antikor, hayvanlarda teshis yöntemleri ve çalismalar için özellikle yararli olan bir murin, murinlenmis ve kimerik murin- insan antikorudur.
Yukarida belirtildigi gibi, insan immün tepkisi üzerine olusmasindan dolayi, mevcut bulusun insan monoklonal antikoru, özel olarak fizyolojik uygunluk gösteren ve örnegin sirasiyla fare monoklonal antikorlarinin üretimi ve faj gösterim kütüphanelerinin in vitro taranmasi için immünizasyon islemlerinde erisilebilir olmayan veya daha az immünojenik olan epitoplari taniyacaktir. Buna göre, mevcut bulusun bir insan anti-d-sinüklein antikorunun bir epitopu benzersiz olabilir. Bu nedenle, bu bulus ayni zamanda genel olarak. d-sinükleinine spesifik baglanma için mevcut bulusun insan monoklonal antikoru ile rekabet eden anti-d-sinüklein antikorlarina ve d-sinüklein baglayici moleküllere uzanir. Mevcut bulus daha spesifik olarak antikorun, referans antikoru NI-202.21D11 ile ayni d-sinüklein epitopuna spesifik olarak baglandigi bir baglanma molekülüne, örn., bir antikor veya bunun antijen baglayici fragman, varyant veya türevlerine yönlendirilir.
Antikorlar arasindaki rekabet, örnegin, test altindaki immünoglobulinin, bir referans antikorunun d-sinuklein gibi ortak. bir antijene spesifik baglanmasini inhibe ettigi bir analizle belirlenebilir. Çok sayida rekabetçi baglanma analizi türü bilinmektedir, örnegin: kati faz direkt veya indirekt radyoimmunoanaliz (RIA), kati faz direkt veya indirekt enzim immunoanalizi (EIA), sandviç rekabet deneyi; bkz. Stahli ve direkt biyotin-avidin. EIA; bkz. Kirkland ve arkadaslari, J. kati faz direkt etiketli sandviç testi; bkz. Harlow ve Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); 1125 isareti kullanilarak kati faz direkt isareti RIA; bkz. Morel ve arkadaslari, Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 ve Moldenhauer bu tür bir deney, saf bir d-sinüklein veya bunun agregatlarinin10 bir kati yüzeye veya bunlardan herhangi birini tasiyan hücrelere, isaretlenmemis bir test immünoglobulinine ve etiketli bir referans immünoglobulinine, yani mevcut bulusun bir insan monoklonal antikoruna bagli kullanimini içerir. Rekabetçi inhibisyon, test immünoglobulinin varliginda kati yüzeye veya hücreye baglanan isaret miktarinin belirlenmesiyle ölçülür.
Genellikle test immünoglobulini asiri miktarda bulunur.
Rekabetçi bir baglanma analizi, ekteki Örneklerde ELISA analizi için tarif edilen kosullar altinda gerçeklestirilebilir. Rekabet analizi (rakip antikorlar) ile tanimlanan antikorlar, referans antikor ile ayni epitopa baglanan antikorlari ve olusacak sterik engelleme için referans antikor tarafindan baglanan epitopa yeterince yakin bir bitisik epitopa baglanan antikorlari içerir.
Genellikle, rakip bir antikor fazla miktarda mevcut oldugunda, bir referans antikorun ortak bir antijene spesifik baglanmasini en az %50 veya %75 oraninda inhibe eder. Bu nedenle mevcut bulus, antikorun referans antikoru NI-202.22Gll'in d-sinüklein'e baglanmasindan rekabetçi bir sekilde inhibe ettigi durumda, örn., bir antikor veya bunun antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevleri için ayrica bir baglanma molekülüne çekilir.
Ayrica, izole edilmis bir baglanma molekülü, örn., DIZI KIM. veya %100 özdes bir immünoglobulin agir zincir degisken bölge (VH) amino asit dizisini içeren insan d-sinükleinine spesifik olarak baglanan bir antikor veya bunun antijen baglayici bir fragmani açiklanmistir.
Ayrica açiklanan, izole edilmis bir baglanma molekülü, örn., DIZI KIM. NO: 15'e veya DIZI KIM. NO: 20'ye özdes veya bir, iki, üç, dört, bes veya daha fazla amino asit ornatiklari hariç bunlarla özdes olan bir VH amino asit dizisi içeren, insan d- sinükleinine spesifik olarak baglanan bir antikor veya bunun antijen baglama parçasidir.
Ayrica, izole edilmis bir baglanma molekülü, örnegin, DIZI KIM. veya %100 özdes bir immünoglobulin hafif zincir degisken bölge (VL) amino asit dizisini içeren insan d-sinükleinine spesifik olarak baglanan bir antikor veya bunun antijen baglayici bir fragmani açiklanmistir.
Bazi düzenlemeler, izole edilmis bir baglanma molekülünü, örnegin, DIZI KIM. NO: 22 veya DIZI KIM. NO: 26'ya özdes veya buna bir, iki, üç, dört, bes veya daha fazla amino asit ornatigi disinda özdes bir VL amino asit dizisi içeren insan d- sinükleinine spesifik olarak baglanan bir antikor veya bunun antijen baglayici bir fragmani açiklamaktadir.
Diger düzenlemelerde, insan d-sinükleinine spesifik olarak baglanan, izole edilmis bir antikor veya bunun antijen baglayici bir fragmani, (a) sirasiyla DIZI KIM. NO: 15 ve DIZI KIM. NO: 22, (b) sirasiyla DIZI KIM. NO: 15 ve DIZI KIM. NO: 26, (c) sirasiyla DIZI KIM. NO: 20 ve DIZI KIM. NO: 22, (d) DIZI KIM. özdes olan VH ve VL amino asit dizilerini içerir, esas olarak Bir* immünoglobulin veya kodlayan cDNA. daha fazla. modifiye edilebilir. Böylece, bir baska düzenlemede, bu bulusun yöntemi bir kimerik antikor, murinlenmis antikor, tek Zincirli antikor, Fab-fragmani, bi-spesifik antikor, füzyon antikoru, isaretlenmis antikor veya bunlardan herhangi birinin bir analogunun üretilmesi adimindan herhangi birini içerir. Ilgili yöntemler, teknikte uzman kisilerce bilinir` ve örn., Harlow ve Lane'de (1988) 'de tarif edilir. Söz konusu antikorlarin türevleri faj gösterim teknigi ile elde edildiginde, BIAcore sisteminde kullanilan yüzey plazmon rezonansi, burada tarif edilen antikorlarin herhangi biriyle ayni epitopa baglanan faj10 antikorlarinin etkinligini arttirmak için kullanilabilir (Schier, örnegin, uluslararasi basvuru WO89 / O9622'de açiklanmaktadir.
Insanlastirilmis antikorlarin üretimi için yöntemler, örnegin Avrupa basvurusu EP-Al 0 239 400 ve uluslararasi basvuru WO9O / 07861'de tarif edilir. Mevcut bulusa uygun olarak kullanilabilecek baska bir antikor kaynagi, sözde ksenogeneik antikorlardir. Farelerde insan benzeri antikorlar gibi ksenogenik antikorlarin üretimi için genel prensip, örn., basvurularinda açiklanmaktadir. Yukarida tartisildigi gibi, bulusun bir antikoru, örnegin Fv, Fab ve F(ab)2 gibi tam antikorlarin yani sira scFv'ler gibi tek zincirlerde olmak üzere çesitli formlarda mevcut olabilir; bakiniz, örn., uluslararasi basvuru W088 / 09344.
Mevcut bulusun antikorlari veya karsilik gelen immünoglobulin zinciri (leri) teknikte bilinen geleneksel teknikler, örnegin, amino asit delesyon (1ar)i, ekleme (ler)i, ornatma (1ar)i, ilave (ler)i ve / veya rekombinasyon (1ar)i ve / veya teknikte bilinen tek basina veya kombinasyon halinde herhangi bir baska modifikasyon (1ar)i kullanarak daha fazla modifiye edilebilir. Bir immünoglobulin zincirinin amino asit dizisinin altinda yatan DNA dizisinde bu gibi modifikasyonlarin uygulanmasi için yöntemler, teknikte uzman kisilerce iyi bilinmektedir; bakiniz, örn., Sambrook, Molecular Cloning .A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. ve Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994).
Bulusun antikorunun modifikasyonlari, yan zincir modifikasyonlari, omurga modifikasyonlari, ve asetilasyon, hidroksilasyon, metilasyon, amidasyon dahil olmak üzere N- ve C- terminali modifikasyonlari dahil bir veya daha fazla bilesen amino asitte kimyasal ve/ veya enzimatik türevlendirmeleri ve10 karbonhidrat veya lipit kisimlarinin, kofaktörlerin ve benzerlerinin eklemelerini içerir. Benzer sekilde, mevcut bulus, tarif edilen antikoru veya karboksil terminalinde bir immünostimülatör ligand gibi heterolog moleküle kaynasmis amino terminalinde bazi fragmanlarini içeren kimerik proteinlerin üretimini kapsar; ilgili teknik detaylar için Örn., uluslararasi basvuru WOOO/30680'e bakiniz.
Dolayisiyla mevcut bulus herhangi bir baglanma molekülü ile, örn., istemlerde karakterize edildigi gibi, bu bulusun insan anti-d-sinüklein antikorlarina yönelik olan ve belirtilen özellikleri gösteren, yani, spesifik olarak d-sinükleini taniyan örnegin bir antikor veya bunun bir baglayici fragmani ile ilgilidir. Bu antikorlar ve baglanma molekülleri, burada tarif edildigi gibi ELISA ve Western Blot ve immünohistokimya ile baglanma spesifisiteleri ve afiniteleri açisindan test edilebilir, bakiniz ör., Örnekler. Ayrica, mevcut bulusa uygun olarak gerçeklestirilen sonraki deneylerin ön sonuçlari, bu bulusun insan anti-d-sinüklein antikorunun, özellikle de NI- Parkinson hastaligi (PH)'ndan Hmzdarip olan hastalarin insan beyin bölümleri üzerinde bulunan d-sinüklein inklüzyon cisimciklerini tanidigini ortaya çikarmistir. Dolayisiyla, bu bulusun bir düzenlemesinde, insan antikoru veya baglayici fragmani, türevi veya varyanti, insan LCD veya PH beyin bölümleri üzerindeki d-sinükleinini tanir (bakiniz örn., Sekil 4G). Ölümsüzlestirilmis B hücreleri veya B bellek hücreleri, sonraki ekspresyon ve/ veya genetik manipülasyon için yeniden düzenlenmis agir zincir ve hafif zincir lokuslari kaynagi olarak kullanilabilir. Yeniden düzenlenmis antikor genleri, cDNA üretmek için uygun mRNA'lardan tersine kopyalanabilir. Istenirse, agir zincir sabit bölgesi, farkli bir izotipinki ile degistirilebilir veya tamamen ortadan kaldirilabilir. Nükleotid dizileri istenmeyen motifleri (ekleme alanlari veya kisitlama10 alanlari gibi) çikarmak için tasarlanabilir ve kodon kullanimi, antikorun veya bunun fragmaninin eksprese edilecegi hücre için optimize edilebilir. Ek olarak, degisken bölgelerdeki amino asitleri degistiren bir veya daha fazla mutasyon, örn., afiniteyi arttirmak veya stabiliteyi gelistirmek için yapilabilir. Degisken bölgeler, tek Zincirli FV bölgelerini kodlamak için baglanabilir. Birden fazla FV bölgesi, birden fazla hedefe baglanma kabiliyeti vermek için baglanabilir veya kimerik agir ve hafif zincir kombinasyonlari kullanilabilir.
Genetik materyal mevcut olduktan sonra, yukarida tarif edilen ve istenen hedefe baglanma yeteneklerini koruyan analoglarin tasarimi basittir. Antikor degisken bölgelerinin klonlanmasi ve rekombinant antikorlarin üretilmesi için yöntemler, teknikte uzman kisilerce bilinir ve örnegin Gilliland ve arkadaslari, Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke ve arkadaslari, Uygun genetik materyal elde edildiginde ve istenirse, bir analogu kodlamak için modifiye edildiginde, agir ve hafif zincirin degisken bölgelerini minimumda kodlayanlar' da dahil olmak üzere kodlama dizileri, standart rekombinant konakçi hücrelere transfekte edilebilen vektörler üzerinde bulunan ekspresyon sistemlerine eklenebilir. Verimli islem için çesitli konakçi hücreler kullanilabilir. Bu amaç için yararli olan tipik memeli hücre hatlari, bunlarla sinirli olmamak üzere, CHO hücreleri, HEK 293 hücreleri veya NSO hücrelerini içerir.
Antikor veya analogun üretimi, modifiye edilmis rekombinant konakçiyi, konakçi hücrelerin büyümesi ve kodlama dizilerinin ekspresyonu için uygun kültür kosullari altinda kültürlemek suretiyle gerçeklestirilir. Antikorlar daha sonra kültürden izole edilerek geri kazanilir. Ekspresyon sistemleri sinyal peptidlerini içerecek sekilde tasarlanabilir, böylece elde edilen antikorlar ortama salinir; bununla birlikte, hücre içi üretim de mümkündür.
Yukaridakilere uygun olarak, mevcut bulus ayrica, yukarida tarif edilen anti-d-sinüklein antikorlarinin bir immünoglobulin zincirinin antikorunu veya bir agir zincir veya hafif zincir degisken bölgelerini veya varyantlarini kodlayan bir polinükleotit ile ilgilidir.
Teknikte uzman kisi, Kabat; bkz, Örn., Riechmann, ve dig., veya hiperdegisken döngüler (Chothia ve Lesk, J. Mol. Biol. 196 ornatimlari yaparak baglanma afinitesinin arttirilabilecegini bilir. Teknikte siradan uzmanlikta kisilerce bilindigi gibi, bulusa ait baglayici moleküller, örnegin antikorlar veya antijen baglayici fragmanlar, varyantlar veya bunlarin türevleri, bir veya daha fazla efektör fonksiyonuna aracilik eden bir sabit bölge içerebilir. Örnegin, komplemanin Cl bileseninin bir antikor sabit bölgesine baglanmasi kompleman sistemini aktive edebilir. Kompleman aktivasyonu, hücre patojenlerinin opsonizasyonu ve lizisinde önemlidir. Komplemanin aktivasyonu ayrica inflamatuar tepkiyi uyarir ve ayrica otoimmün hipersensitivitede rol oynayabilir. Ayrica antikorlar, bir hücre üzerindeki bir Fc reseptörüne (FCR) baglanan antikor FC bölgesi üzerinde bir PC reseptörüne sahip FC bölgesi araciligiyla çesitli hücreler üzerindeki reseptörlere baglanir. IgG (gama reseptörleri), IgE (epsilon reseptörleri), lgA (alfa reseptörleri) ve IgM (mu reseptörleri) dahil olmak üzere farkli antikor siniflarina özgü bir dizi Fc reseptörü vardir. Antikorun Fc reseptörlerine hücre yüzeyleri üzerinde baglanmasi, antikor kapli parçaciklarin yutulmasi ve tahrip edilmesi, bagisiklik komplekslerinin klirensi, antikor kapli hedef hücrelerin öldürücü hücreler tarafindan (antikor bagimli hücre aracili sitotoksisite veya ADCC olarak adlandirilan) lizizlenmesi, enflamatuar aracilarin salinimi, plasental transfer ve immünoglobulin üretiminin kontrolü dahil olmak üzere bir dizi önemli ve çesitli biyolojik tepkileri tetikler.
Buna göre, mevcut bulusun bazi düzenlemeleri, azaltilmis efektör fonksiyonlar, kovalent olmayan dimerize etme yetenegi, d-sinüklein agregasyonu ve biriktirme alaninda lokalize etme kabiliyetinde artis, azalmis serum yari ömrü, yaklasik olarak ayni immünojenisiteye sahip tam, degistirilmemis bir antikor ile karsilastirildiginda artmis serum yari ömrü gibi istenen biyokimyasal özellikleri saglayacakr sekilde sabit bölge alanlarinin bir veya daha fazlasinin en azindan bir kisminin silinmis veya baska bir sekilde degistirildigi bir antikor veya bunun antijen baglayici fragman, varyant veya türevini içerir. Örnegin, burada tarif edilen teshis ve tedavi yöntemlerinde kullanim için bazi antikorlar, bir immünoglobulin agir zincirine benzer bir polipeptit zinciri içeren, ancak bir veya daha fazla agir zincir alaninin en azindan bir kismindan yoksun olan kisimdan silinmis antikorlardir. Örnegin, belirli antikorlarda, modifiye antikorun sabit bölgesinin bütün bir alani silinecektir, örnegin, CHZ alaninin tamami veya bir kismi silinecektir. Baska düzenlemelerde, burada tarif edilen teshis ve tedavi yöntemlerinde kullanilmak üzere bazi antikorlar, burada baska yerde aglikosile edilmis veya "agli" antikorlar olarak anilan, glikosilasyonu ortadan kaldirmak için degistirilen bir IgG agir zincir sabit bölgesi gibi bir sabit bölgeye sahiptir. Bu tür (lar) inin mühendisliginin yani sira enzimatik olarak da hazirlanabilir. Teoriye bagli kalmamakla birlikte, "agli" antikorlarin in vivo olarak gelistirilmis bir güvenlik ve stabilite profiline sahip olabilecegine inanilmaktadir. Istenen efektör fonksiyona sahip olan, aglikosile edilmis antikorlar basvuruda bulunmaktadir.
Burada açiklanan belirli antikorlarda veya antijen baglayici10 fragmanlarinda, varyantlarinda veya türevlerinde, Fc kismi, teknikte bilinen teknikler kullanilarak efektör fonksiyonunu azaltmak için mutasyona ugratilabilir. Örnegin, bir sabit bölge alaninin delesyonu veya inaktivasyonu (nokta mutasyonlari veya diger araçlar araciligiyla), dolasimdaki modifiye antikorun Fc reseptörünün. baglanmasini azaltabilir` ve böylece d-sinüklein lokalizasyonunu arttirabilir. Diger durumlarda, mevcut bulus ile tutarli sabit bölge modifikasyonlari, moderat kompleman baglanmasini ve böylece serum yari ömrünü ve konjuge sitotoksinin spesifik olmayan iliskisini azaltir. Yine de sabit bölgenin diger modifikasyonlari, artan antijen spesifitesi veya antikor esnekliginden ötürü arttirilmis lokalizasyonu saglayan disülfid baglarini veya oligosakkarit kisimlarini modifiye etmek için kullanilabilir. Elde edilen fizyolojik profil, biyoyararlanini ve d-sinüklein lokalizasyonu, biyo-dagilini ve serum yari ömrü gibi modifikasyonlarin diger biyokimyasal etkileri, gereksiz deneyler yapilmadan iyi bilinen immünolojik teknikler kullanilarak kolayca ölçülebilir ve nicelenebilir.
Burada açiklanan belirli antikorlarda veya antijen baglayici fragmanlarinda, varyantlarinda veya türevlerinde Fc kismi, örnek olarak Fcy reseptörleri, LRP veya Thyl reseptörleri veya antikorlarin canli hücrelere zarar vermeden canli hücrelere tasinmasini sagladigi söylenen (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241) "SuperAntibody Teknolojisi" ile antikorlarin reseptör aracili endositozunu gelistirerek, antikorlarin hücresel alimini arttirmak amaciyla alternatif protein dizileri için mutasyona ugrayabilir veya degistirilebilir. Örnegin, antikor baglama bölgesinin füzyon proteinlerinin ve hücre yüzeyi reseptörlerinin kognat protein ligandlari veya d-sinüklein ve ayni zamanda bir hücre yüzey reseptörüne baglanan spesifik dizilere sahip bi- veya multi-spesifik antikorlarin üretimi bu alanda bilinen teknikler kullanilarak tasarlanabilir.
Burada açiklanan belirli antikorlarda veya antijen baglayici10 fragmanlarinda, varyantlarinda veya türevlerinde, Fc kismi, alternatif protein dizileri için mutasyona ugrayabilir veya degistirilebilir veya antikor, kan beyin bariyeri penetrasyonunu arttirmak için kimyasal olarak modifiye edilebilir.
Bulusa ait antikorlarin modifiye edilmis formlari veya antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevleri, teknolojide bilinen teknikler kullanilarak tam öncü veya ana antikorlardan yapilabilir. Örnek teknikler burada daha ayrintili olarak tartisilmaktadir. Bulusun. antikorlari. veya. antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevleri, teknikte bilinen teknikler kullanilarak üretilebilir veya imal edilebilir. Bazi düzenlemelerde antikor molekülleri veya bunlarin fragmanlari kullanilarak üretilir. Antikor moleküllerini veya bunlarin fragmanlarini yapmak için örnek niteligindeki teknikler, burada baska bir yerde daha ayrintili olarak tartisilmaktadir.
Bulusun antikorlari veya antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevleri ayrica örnegin, herhangi bir molekül tipinin antikora kovalent baglanmasi ile kovalent baglanmanin, antikorun kendi es kökenli epitopuna spesifik olarak baglanmasini engellemeyecek sekilde modifiye edilmis türevleri de içerir. Örnek olarak, ancak sinirlama yoluyla degil, antikor türevleri, örn., glikosilasyon, asetilasyon, pegilasyon, fosforilasyon, amidasyon, bilinen koruyucu / bloke edici gruplarla türevlendirme, proteolitik parçalanma, bir hücresel ligand veya baska bir proteine baglanma vb. ile modifiye edilmis antikorlari içerir. Çok sayida kimyasal modifikasyonun herhangi biri, sinirli olmamakla birlikte spesifik kimyasal parçalanma, asetilasyon, formilasyon, tunikamisin metabolizmasi, vs. dahil olmak üzere bilinen tekniklerle gerçeklestirilebilir. Ayrica, türev bir veya daha fazla klasik olmayan amino asit içerebilir.
Bazi düzenlemelerde bulusa ait antikorlar veya antijen10 baglayici fragmanlar, varyantlar veya bunlarin türevleri, tedavi edilecek hayvanda, örn., bir insanda zararli bir` bagisiklik tepkisi ortaya çikarmayacaktir. Bazi düzenlemelerde baglanma molekülleri, örn., bulusun antikorlari veya antijen baglayici fragmanlari bir hastadan, örn., bir insan hastadan türetilir ve daha sonra türetildikleri ayni türde, örn., insanda kullanilarak zararli bagisiklik tepkilerinin ortaya çikmasini hafifletir veya en aza indirir.
De-immünizasyon ayrica bir antikorun immünojenisitesini azaltmak için kullanilabilir. Burada kullanilan "de- immünizasyon" terimi, T hücresi epitoplarini degistirmek için bir antikorun degistirilmesini içerir; bakiniz örnegin baslangiç antikorundan VH ve VL dizileri analiz edilir ve her V bölgesinden bir insan T hücresi epitopu "haritasi", tamamlayicilik belirleme bölgeleri (TBB'ler) ve dizi içindeki diger anahtar kalintilara göre epitoplarin yerini gösterir. T hücresi epitop haritasindaki tekil T hücre epitoplari, nihai antikorun düsük bir degisim aktivitesi riski ile alternatif amino asit ornatiklarini tanimlamak için analiz edilir. Bir dizi alternatif VH ve VL dizisi, amino asit ornatiklarinin kombinasyonlarini içerecek sekilde tasarlanir ve bu diziler burada açiklanan tani ve tedavi yöntemlerinde kullanim için daha sonra bir dizi baglanma polipeptidine, örn., d-sinükleine özgü antikorlar veya bunlarin immünospesifik fragmanlarina dahil edilir, ki bunlar daha sonra islev için test edilir. Tipik olarak 12 ila 24 varyantli antikorlar üretilir ve test edilir. Modifiye edilmis V ve insan C bölgelerini içeren komple agir ve hafif zincir genleri daha sonra ekspresyon vektörlerine ve daha sonra tüm antikorun üretimi için hücre hatlarina dahil edilen plazmitlere klonlanir. Antikorlar daha sonra uygun biyokimyasal ve biyolojik analizlerde karsilastirilir ve optimal varyant tanimlanir.
Monoklonal antikorlar, hibridoma, rekombinant ve faj gösterim teknolojilerinin. kullaninu. veya. bunlarin bir kombinasyonu. da dahil olmak üzere teknikte bilinen çok çesitli teknikler kullanilarak hazirlanabilir. Örnegin, monoklonal antikorlar, teknikte bilinenler ve örnegin Harlow ve digerleri, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. baski. (1988); Hammerling ve arkadaslari, Monoclonal Antibodies ögretilenler dahil olmak üzere hibridoma teknikleri kullanilarak üretilebilir. Burada kullanilan "monoklonal antikor" terimi, hibridoma teknolojisi ile üretilen antikorlarla sinirli degildir. veya faj klonu dahil olmak üzere tek bir klondan türetilen bir antikor anlamina gelir ve bunun üretildigi yöntemini kastetmez.
Dolayisiyla, "monoklonal antikor" terimi, hibridoma teknolojisi ile üretilen antikorlarla sinirli degildir. Bazi düzenlemelerde mevcut bulusun antikorlari, burada tarif edildigi gibi Epstein- Barr virüsü ile transformasyon yoluyla ölümsüzlestirilen insan B hücrelerinden türetilir.
Iyi bilinen hibridoma isleminde (Kohler ve arkadaslari, Nature burada tarif edildigi gibi bir insan denekten türetilen B hücrelerinden nispeten kisa ömürlü veya ölümlü lenfositler, bir ölümsüz tümör hücre hatti (örn., bir miyelom hücre hatti) ile kaynastirilir, böylece hem ölümsüz hem de B hücresinin genetik olarak kodlanmis antikorunu üretebilen hibrit hücreler veya antikorun olusumu için spesifik genler içeren her bir sus ile seleksiyon, seyreltme ve yeniden büyüme yoluyla tek genetik suslara ayrilir. Istenen bir antijene karsi homojen olan ve saf genetik soylarina referans olarak "monoklonal" olarak adlandirilan antikorlar üretirler.
Bu sekilde hazirlanan hibridoni hücreleri, kaynasmamis ana miyelom.hücrelerinin gelisimini veya sagkalimini inhibe eden bir veya daha fazla madde içerebilen uygun bir kültür ortamina ekilir ve burada yetistirilir. Teknikte uzman kisiler, hibridomalarin olusumu, seçimi ve büyümesi için reaktiflerin, hücre hatlarinin ve ortamlarin bir çok kaynaktan ticari olarak temin edilebildigini ve standartlastirilmis protokollerin iyi anlasildigini takdir edeceklerdir. Genel olarak, hibridoma hücrelerinin yetistirildigi kültür ortami, istenen antijene karsi monoklonal antikorlarin üretimi için tahlil edilir.
Hibridoma hücreleri tarafindan üretilen monoklonal antikorlarin baglanma spesifitesi, burada tarif edildigi gibi immünopresipitasyon, radyoimmünoanaliz (RIA) veya enzime bagli immüno-emici analiz (ELISA) gibi in vitro analizlerle belirlenir.
Istenen spesifiklige, afiniteye ve/veya aktiviteye sahip olan antikorlari üreten hibridom hücreleri belirlendikten sonra, klonlar, sinirlayici seyreltme prosedürleriyle alt klonlanabilir ve standart metotlarla büyütülebilir; bakiniz, örn., Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986). Ayrica takdir edilecektir ki alt klonlar tarafindan salgilanan monoklonal antikorlar, örnegin, protein- A, hidroksilapatit kromatografisi, jel elektroforezi, diyaliz veya afinite kromatografisi gibi konvansiyonel saflastirma prosedürleri vasitasiyla kültür ortamindan, assit sivisindan veya serumdan ayrilabilir.
Baska bir düzenlemede, lenfositler mikromanipülasyon ve izole edilen degisken genler ile seçilebilir. Örnegin, periferik kan mononükleer hücreleri, örnegin bir insan gibi bir immünize veya dogal immun memeliden izole edilebilir ve in vitro olarak yaklasik 7 gün boyunca kültürlenebilir. Kültürler, tarama kriterlerini karsilayan spesifik IgG'ler için taranabilir.
Pozitif kuyucuklardan hücreler izole edilebilir. Bireysel Ig- üreten B hücreleri, FACS ile veya kompleman aracili hemolitik10 plak tahlilinde tanimlanmalari ile izole edilebilir. Ig-üreten B hücreleri, genleri, VL genleri, bir tüpe mikromanipüle edilebilir ve VH ve VL örn., RT-PCR kullanilarak amplifiye edilebilir. VH ve ekspresyon için hücrelere (örn., ökaryotik veya hücreler) Alternatif olarak, transfekte edilebilir. bir antikor ekspresyon vektörüne klonlanabilir ve prokaryotik antikor üreten hücre dizileri, teknikte uzman kisilerce iyi bilinen teknikler kullanilarak seçilebilir ve kültürlenebilir. Bu teknikler çesitli laboratuvar kilavuzlari ve birincil yayinlarda açiklanmaktadir. tarif edildigi gibi bulusta kullanim için uygun Current Protocols in Immunology, Green Publishing Associates ve Wiley-Interscience, and Sons, New York (l99l)'de tarif edilmektedir.
Bu baglamda, asagida teknikler, Coligan ve arkadaslari, Eds., John Wiley Spesifik epitoplari taniyan antikor fragmanlari bilinen tekniklerle üretilebilir. Örnegin Fab ve F (ab')2 fragmanlari, papain (Fab fragmanlari üretmek için) veya pepsin fragmanlari üretmek için) gibi enzimler kullanilarak veya immünoglobulin moleküllerinin rekombinant proteolitik bölünmesiyle üretilebilir. F(ab')2 fragmanlari, degisken bölgeyi, hafif zincir sabit bölgesini ve agir zincirin CHl alanini içerir.
Bu tür fragmanlar, örnegin, immünoglobülinlerin immünospesifik kisimlarinin, radyoizotoplar gibi reaktiflerin tespitine baglanmasi ile ilgili imüno-tani prosedürlerinde kullanim için yeterlidir.
Burada tarif edildigi gibi tamamen insan antikorlari, insan hastalarin terapötik tedavisi Mevcut bulusun insan antikorlari, için özellikle tercih edilir. örn., yaslarindan dolayi, örn., Parkinson hastaligi veya olagandisi sekilde stabil bir hastalik seyri olan bir hastalik gibi bir bozukluk gelistirme riski tasidigindan süphelenilen yasli kisilerden izole edilir. Bununla birlikte, yasli saglikli ve semptomsuz bireylerin, sirasiyla, daha düzenli olarak daha genç deneklere göre koruyucu anti-d- sinüklein antikorlari gelistirmis olmalarini beklemek ihtiyatli olsa da, bu sonuncu, mevcut bulusun bir insan antikorunu elde etmek için olan kaynagin yani sira kullanilabilir. Bu özellikle, sinükleinopatik bir hastaligin ailesel bir formunu gelistirmeye yatkin olan ancak bagisiklik sistenû. ve tepki fonksiyonlari yasli yetiskinlerde oldugundan daha etkili oldugu için semptomsuz kaldigi için daha genç hastalar için geçerlidir.
Mevcut bulusa ait antikorlar, antikorlarin, özellikle kimyasal sentezle veya burada tarif edilen rekombinant ekspresyon teknikleriyle sentezlenmesi için teknikte bilinen herhangi bir yöntemle üretilebilir.
Bir düzenlemede, bulusun bir antikoru veya antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevi, bir veya daha fazla alanin kismen veya tamamen silindigi ("alan silinmis antikorlar") sentetik sabit. bir bölge içerir. Bazi düzenlemelerde uyumlu modifiye antikorlar, tüm CHZ alaninin çikarildigi (ACHZ yapilari) alan silinmis yapilari veya varyantlarini içerecektir. Diger düzenlemeler için, degisken bölge için esneklik ve hareket serbestligi saglamak üzere silinmis alan için kisa bir baglanti peptidi ornatilabilir. Alan silinen yapilar, bir IgGi insan sabit alanini kodlayan bir vektör kullanilarak türetilebilir, bakiniz vektör, CH2 alanini silmek ve bir alan silinmis lgGi sabit bölgesini eksprese eden bir sentetik vektör saglamak üzere tasarlanmistir.
Bazi düzenlemelerde mevcut bulusun antikorlari veya antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevleri minikorlardir.
Minikorlar, teknikte açiklanan yöntemler kullanilarak yapilabilir, bakiniz, örn., ABD Patenti 5,837,821 veya uluslararasi basvuru WO 94/09817.
Bir düzenlemede, bulusun bir antikoru veya antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevi, monomerik alt birimler arasindaki baglantiya izin verdigi sürece birkaç veya tek bir amino asidin delesyonuna veya ornatiginia sahip olan bir immünoglobulin agir zincirini içerir. Örnegin, CH2 alaninin seçilmis bölgelerinde tek bir amino asidin mutasyonu, Fc baglanmasini önemli ölçüde azaltmak ve böylece d-sinüklein lokalizasyonunu arttirmak için yeterli olabilir. Benzer sekilde, efektör fonksiyonunu (örn. kompleman baglama) kontrol eden bir veya daha fazla sabit bölge alani silinebilir. Sabit bölgelerin bu türden kismi delesyonlari, antikorun seçilmis özelliklerini (serum yari ömrü) gelistirirken, söz konusu sabit bölge alani ile iliskili olan diger istenen fonksiyonlari dokunulmamis sekilde birakabilir. Ayrica, yukarida belirtildigi gibi, açiklanan antikorlarin sabit bölgeleri, sonuçtaki yapinin profilini gelistiren bir veya daha fazla amino asidin mutasyonu veya ornatigi yoluyla sentetik olabilir. Bu baglamda, modifiye edilmis antikorun konfigürasyonu ve immünojenik profilini büyük oranda korurken korunmus bir baglanma bölgesi (örn., Fc baglanmasi) tarafindan saglanan aktiviteyi bozmak mümkün olabilir. Yine baska düzenlemeler, efektör fonksiyonu gibi istenen özellikleri arttirmak veya daha fazla sitotoksin veya karbonhidrat baglamasi saglamak için sabit bölgeye bir veya daha fazla amino asit eklenmesini içerir. Bu gibi uygulamalarda, seçilmis sabit bölge alanlarindan türetilen spesifik dizilerin eklenmesi veya replike edilmesi arzu edilebilir.
Mevcut bulus, ayni zamanda, esas olarak veya asagidakileri içeren, burada tarif edilen antikor moleküllerinin (örn., VH bölgeleri ve/ veya VL bölgeleri) varyantlarini (türevleri dahil) içeren, büyük ölçüde veya tamamen bunlardan olusan antikorlar da saglar ki bu antikorlar veya bunlarin fragmanlari, d-sinükleine immünospesifik olarak baglanir. Teknikte uzman kisilerce bilinen standart teknikler, bunlarla sinirli olmamak üzere, amino asit10 ornatiklari ile sonuçlanan, bölgeye yönelik mutagenez ve PCR aracili mutagenez dahil olmak üzere bir antikoru kodlayan nükleotit dizisine mutasyonlari eklemek. için kullanilabilir.
Varyantlar (türevler dahil), referans VH bölgesine göre 50 amino asit ornatigindan daha az, 40 amino asit ornatigindan daha az, amino asit ornatigindan daha az, 25 amino asit ornatigindan daha az, 20 amino asit ornatigindan daha az, 15 amino asit ornatigindan daha az, 10 amino asit ornatigindan daha az, 5 amino asit ornatigindan daha az, 4 amino asit ornatigindan daha az, 3 amino asit ornatigindan daha az, 2 amino asit ornatigindan daha az amino asit ornatigi kodlayabilir. Bir "konservatif amino asit ornatigi", amino asit kalintisinin, bir benzer yüke sahip bir yan zincire sahip olan bir amino asit kalintisi ile degistirildigi bir bilesiktir. Benzer yüklere sahip yan zincirlere sahip olan amino asit kalintilarinin aileleri, teknikte tanimlanmistir. Bu aileler arasinda bazik yan zincirlere sahip amino asitler (örn., lisin, arginin, histidin), asidik yan zincirler (örn., aspartik asit, glutamik asit), yüksüz polar yan zincirler (örn., glisin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, sistein), polar olmayan yan zincirler (örn., alanin, valin, lösin, izolösin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-dallanmis yan zincirler (örn., treonin, valin, izolösin) ve aromatik yan zincirler (örn., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin) bulunur. Alternatif olarak, mutasyonlar, doyma mutagenezi gibi kodlama dizisinin tamami veya bir kismi boyunca rastgele eklenebilir ve sonuçta meydana gelen mutantlar, aktiviteyi koruyan mutantlari (örn., d- sinüklein baglama yetenegi) belirlemek için biyolojik etkinlik açisindan taranabilir. Örnegin, mutasyonlarin sadece bir antikor molekülünün çerçeve bölgelerinde sokulmasi mümkündür. Sunulan mutasyonlar, sessiz veya nötr yanlis anlam mutasyonlari olabilir, örn., bir antikorun antijeni baglama kabiliyeti üzerinde hiç etkisi yoktur veya az bir etkisi vardir, aslinda bu mutasyonlarin bazilari, amino asit dizisini degistirmez. Bu tür mutasyonlar kodon10 kullanimini optimize etmek veya bir hibridoma antikor üretimini gelistirmek için yararli olabilir. Bu bulusun antikorlarini kodlayan kodon optimize edilmis kodlama bölgeleri, burada baska bir yerde açiklanmistir. Alternatif olarak, nötr olmayan yanlis anlam mutasyonlari, bir antikorun antijeni baglama yetenegini degistirebilir. En sessiz ve nötr yanlis anlam mutasyonlarinin konumunun çerçeve bölgelerinde olmasi muhtemelken çogu nötr olmayan yanlis anlam mutasyonlarinin yerlerinin TBB'de olmasi muhtemeldir, ancak bu mutlak bir gereklilik degildir. Teknikte uzman bir kisi, mutant molekülleri, antijen baglama aktivitesinde herhangi bir degisiklik veya baglanma aktivitesinde degisiklik (örn., antijen baglanma aktivitesindeki gelismeler veya antikor spesifitesindeki degisiklik) olmamasi gibi istenen özelliklere sahip olarak tasarlayabilir ve test edebilir. Mutagenezin ardindan, kodlanmis protein rutin olarak ifade edilebilir ve kodlanmis proteinin (örn., d-sinükleinin en az bir epitopunu immünolojik olarak baglama kabiliyeti) fonksiyonel ve / veya biyolojik aktivitesi, burada tarif edilen teknikler kullanilarak veya teknikte bilinen tekniklerin rutin olarak modifiye edilmesiyle belirlenebilir.
Bir antikoru veya antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevini kodlayan bir polinükleotit, modifiye edilmemis RNA veya DNA veya modifiye edilmis RNA veya DNA olabilen herhangi bir poliribonükleotit veya polideoksribonükleotitten olusabilir. Örnegin, bir antikoru veya bunun antijen baglayici fragmanini, varyantini veya türevini kodlayan bir polinükleotid tek ve çift iplikli DNA'dan, tek ve çift iplikli bölgelerin bir karisimi olan DNA'dan, tek ve çift iplikli RNA'dan, tek ve çift iplikli bölgelerin bir karisimi olan RNA'dan, tek iplikli veya daha tipik olarak çift iplikli veya tek ve çift iplikli bölgelerin bir karisimi olabilen DNA ve RNA içeren hibrit moleküllerden olusabilir. Ek olarak, bir antikoru veya antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevini kodlayan bir polinükleotid, RNA veya DNA veya hem RNA hem de DNA içeren üç iplikçikli bölgelerden olusabilir. Bir antikoru veya bir antijen baglayici fragmani, varyantini veya türevini kodlayan bir polinükleotid ayrica stabilite veya baska nedenlerden dolayi modifiye edilmis bir veya daha fazla modifiye baz veya DNA veya RNA omurgalari da içerebilir. "Modifiye" bazlar, örnegin, tritillenmis bazlari ve inosin gibi olagandisi bazlari içerir. DNA ve RNA'ya çesitli degisiklikler yapilabilir; bu nedenle, "polinükleotid" kimyasal olarak, enzimatik olarak veya nßtabolik olarak degistirilmis formlari kapsamaktadir.
Bir immünoglobulinden (örn., bir immünoglobulin agir zincir kismi veya hafif zincir kismi) türetilen bir polipeptidin dogal olmayan bir varyantini kodlayan izole edilmis bir polinükleotid, bir veya daha fazla amino asit ornatigi, ilavesi veya delesyonu kodlanmis proteine eklenecek sekilde immünoglobulinin nükleotit dizisine bir veya daha fazla nükleotid ornatigi, ilavesi veya delesyonu eklenerek yaratilabilir. Mutasyonlar, bölgeye yönelik mutagenez ve PCR aracili mutagenez gibi standart tekniklerle saglanabilir. Konservatif amino asit ornatiklari bir veya daha fazla temel olmayan amino asit kalintisina yapilabilir.
Iyi bilindigi gibi, RNA, orijinal B hücrelerinden, hibridoma hücrelerinden veya guanidinyum izotiyosiyanat ekstraksiyonu ve çökeltme, ardindan santrifüjleme veya kromatografi gibi standart tekniklerle diger dönüstürülmüs hücrelerden izole edilebilir. istendiginde, mRNA, oligo dT selüloz üzerinde kromatografi gibi standart tekniklerle toplam. RNA'dan izole edilebilir. Uygun teknikler teknikte iyi bilinir. Bir düzenlemede, antikorun hafif ve agir Zincirlerini kodlayan cDNA'lar, iyi bilinen yöntemlere uygun olarak, ters transkriptaz ve DNA polimeraz kullanilarak, es zamanli veya ayri olarak yapilabilir. PCR, konsensüs sabit bölge primerleri veya yayinlanan agir ve hafif zincir DNA ve amino asit dizilerine dayanan daha spesifik primerler tarafindan baslatilabilir. Yukarida tartisildigi gibi, PCR ayrica antikor hafif ve agir Zincirlerini kodlayan DNA klonlarini izole etmek için kullanilabilir. Bu durumda kütüphaneler, konsensüs primerler veya insan sabit bölge problari gibi daha büyük homolog problarla taranabilir.
DNA, tipik olarak plazmid DNA, teknikte bilinen teknikler kullanilarak hücrelerden izole edilebilir, kisitlama haritalanir ve rekombinant DNA teknikleri ile ilgili olarak yukarida belirtilen referanslarda ayrintili olarak ortaya konmus standart, iyi bilinen tekniklere örn., rekombinant DNA. teknikleri ile ilgili yukaridaki referanslara göre dizilir. Kuskusuz, DNA, mevcut bulusa göre, izolasyon islemi veya sonraki analiz sirasinda herhangi bir noktada sentetik olabilir.
Bir düzenleme, DIZI KIM. NO: 15'e veya DIZI KIM. NO: 20'ye en zincir degisken bölge (VH) amino asit dizisini kodlayan bir nükleik asidi içeren, esasen veya tamamen bundan olusan bir izole edilmis polinükleotit saglar.
Baska bir düzenleme, DIZI KIM. NO: 15'e veya DIZI KIM. NO:20'ye özdes veya bir, iki, üç, dört, bes veya daha fazla amino asit ornatigi hariç özdes olan bir VH amino asit dizisini kodlayan bir nükleik asidi içeren, esasen veya tamamen bundan olusan bir izole edilmis polinükleotit saglar.
Baska bir düzenlemede, mevcut bulus, Sekil 1'de gösterildigi gibi, DIZI KIM. NO: 16, DIZI KIM. NO: 17 ve DIZI KIM. NO:18 ile temsil edilen VH-TBBl, VH-TBBZ ve VH-TBB3 gruplari ile özdes polipeptit dizilerine sahip olan VH-TBBl, VH-TBBZ ve VH-TBB3 bölgelerinin bulundugu bir immünoglobulin agir zincir degisken bölgesini (VH) kodlayan bir nükleik asidi içeren, esasen veya tamamen bundan olusan bir izole edilmis polinükleotit saglar.
Baska bir düzenleme, insan d-sinükleinine spesifik olarak veya tercihen baglanan polinükleotid tarafindan kodlanan VH'yi içeren, örn., bir antikor veya antijen baglayici fragman gibi izole edilmis bir baglanma molekülü saglar.
Baska bir düzenleme, DIZI KIM. NO: 22'ye veya DIZI KIM. NO: immünoglobulin hafif zincir degisken bölge (VL) amino asit dizisini kodlayan bir nükleik asidi içeren, esasen veya tamamen bundan olusan bir izole edilmis polinükleotit saglar.
Ayrica bir düzenleme, DIZI KIM. NO: 22'e veya DIZI KIM.
NO:26'ye özdes veya bir, iki, üç, dört, bes veya daha fazla amino asit ornatigi hariç özdes olan bir VL amino asit dizisini kodlayan bir nükleik asidi içeren, esasen veya tamamen bundan olusan bir izole edilmis polinükleotit saglar.
Baska bir düzenlemede, mevcut bulus, Sekil 1'de gösterildigi gibi, DIZI KIM. NO: 16, DIZI KIM. NO: 17 ve DIZI KIM. NO:18 ile temsil edilen VH-TBBl, VH-TBB2 ve VH-TBB3 gruplari ile özdes polipeptit dizilerine sahip olan VL-TBBl, VL-TBBZ ve VL-TBBB bölgelerinin bulundugu bir immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesini (VL) kodlayan bir nükleik asidi içeren, esasen veya tamamen bundan olusan bir izole edilmis polinükleotit saglar.
Baska bir düzenleme, insan d-sinükleinine spesifik olarak veya tercihen baglanan polinükleotid tarafindan kodlanan VL'yi içeren, örn., bir antikor veya bunun antijen baglayici fragmani gibi izole edilmis bir baglanma molekülü saglar.
Teknikte bilindigi gibi, iki polipeptit veya iki polinükleotid arasindaki "dizi özdesligi", bir polipeptidin veya polinükleotitin amino asidi veya nükleik asit dizisinin, bir ikinci polipeptit veya polinükleotitin dizisiyle10 karsilastirilmasiyla belirlenir. Burada tartisildiginda, herhangi bir özel polipeptidin, baska bir polipeptit ile en az veya %95 özdes olup olmadigi BESTFIT programi gibi, ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, teknikte bilinen yöntemler ve bilgisayar programlari/ yazilimi kullanilarak belirlenebilir.
(Wisconsin Dizisi Analiz Paketi, Unix için Sürüm 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT, iki dizi arasindaki en iyi homoloji bölümünü bulmak için Smith and waterman, Advances in Applied kullanir. Belirli bir dizinin, örnegin, mevcut bulusa göre bir referans dizisine %95 özdes olup olmadigini belirlemek için, BESTFIT veya baska bir dizi hizalama programi kullanilirken, parametreler, tabi ki, referans polipeptid dizisinin tam uzunlugu üzerinden özdeslik yüzdesinin hesaplanacagi ve referans dizisindeki toplam amino asit sayisinin %5'ine kadar olan homolojideki bosluklara izin verilecek sekilde ayarlanir.
Mevcut bulusun bir düzenlemesinde, polinükleotid, DIZI KIM.
NO: 19 veya DIZI KIM. NO: 21'de belirtilen VH'ye veya DIZI KIM.
NO: 27 veya DIZI KIM. NO: 28'de belirtilen VL'ye ait bir polinükleotit dizisine sahip olan bir nükleik asidi içerir, esas olarak veya tamamen bundan olusur. Bu baglamda, teknikte uzman kisi, hafif ve/ veya agir zincirin en azindan degisken alanini sifreleyen polinükleotidlerin, her iki immünoglobulin zincirinin degisken alanini veya sadece birini kodlayabilecegini takdir edecektir.
Mevcut bulus ayrica, baska bir yerde tarif edildigi gibi, bulusun polinükleotitlerinin fragmanlarini da içerir. Ek olarak, burada tarif edildigi gibi füzyon polinükleotidlerini, Fab fragmanlarini ve diger türevleri kodlayan polinükleotidler de bulus tarafindan tasarlanmaktadir.
Polinükleotitler, teknik alanda bilinen herhangi bir yöntemle üretilebilir veya imal edilebilir. Örnegin, antikorun nükleotid dizisi antikoru kodlayan bir polinükleotit olarak biliniyorsa, antikor, kisaca, antikoru kodlayan dizinin kisimlarini içeren çakisan. oligonükleotidlerin sentezini, bu› oligonükleotidlerin yeniden baglanmasini ve ligasyonunu ve ardindan PCR ile ligatlanmis oligonükleotitlerin amplifikasyonunu içeren örn., Kutmeier ve arkadaslari, BioTechniques 17 (1994), 242'de tanimlandigi gibi kimyasal olarak sentezlenmis oligonükleotidlerden birlestirilebilir.
Alternatif olarak, bir antikoru veya bunun antijen baglayici fragmanini, varyantini veya türevini kodlayan bir polinükleotit, uygun bir kaynaktan gelen nükleik asitten üretilebilir. Belirli bir antikoru kodlayan bir nükleik asit içeren bir klon mevcut degilse, ancak antikor molekülünün dizisi bilinirse, antikoru kodlayan bir nükleik asit dizinin 3' ve 5' uçlarina hibritlenebilir sentetik primerler kullanilarak PCR amplifikasyonu ile veya örnegin, antikoru kodlayan bir cDNA kütüphanesinden bir cDNA klonunu tanimlamak için özel antikor dizisi için spesifikr bir oligonükleotid probu kullanilarak kimyasal olarak sentezlenebilir veya uygun bir kaynaktan (örn., bir antikor cDNA kütüphanesi, veya bir antikoru eksprese etmek üzere seçilen hibridoma hücreleri gibi d-sinükleine özgü antikoru eksprese eden herhangi bir doku veya hücreden izole edilmis poliA+ RNA gibi nükleik asit veya bunlardan olusturulan bir CDNA kütüphanesi) elde edilebilir. PCR ile üretilen amplifiye edilmis nükleik asitler, teknikte iyi bilinen herhangi bir yöntem kullanilarak yinelenebilir klonlama vektörlerine klonlanabilir.
Antikorun nükleotit dizisi ve karsilik gelen amino asit dizisi veya antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevi belirlendiginde, nükleotit dizisi, farkli bir amino asit10 dizisine sahip antikorlar üretmek, delesyonu ve/ veya eklemeleri örnegin amino asit dizilimi, olusturmak amaciyla nükleotit dizilerinin manipülasyonu için teknikte iyi bilinen yöntemler, Örnegin rekombinant DNA teknikleri, alana yönelik mutagenez, PCR, Vb.(bkz, örnegin, Sambrook ve ark.
Laboratory Manual, 2. versiyon.
Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) Protocols in Molecular Biology, Cloning, A ve Ausubel ve ark., e John Wiley & Sons, ds., Current tanimlanan teknikler) kullanilarak manipüle edilebilir.
Izole edilmis genetik materyalin bulusa ait antikorlar veya antijen baglayici fragmanlari saglamak için manipülasyonunu takiben, antikorla türevlerini ri kodlayan polinükleotidler tipik olarak. arzu edilen antikor miktarini üretmek için kullanilabilen konakçi hücrelere eklenmesi için bir ekspresyon vektörüne eklenir. Bir antikorun veya bir fragmaninin, türevinin veya bunun analogunun rekombinant ekspresyonu, örn., bir hedef moleküle baglanan bir antikorun bir agir veya hafif zinciri, burada açiklanmaktadir. Bir antikor molekülünü veya bir antikorun agir veya hafif polinükleotid veya bunun bir ki smi (örn., zincirini kodlayan bir degisken alani içeren) elde edildiginde, antikor agir veya hafif zincir molekülünün üretimi için vektör, teknikte iyi bilinen teknikler kullanilarak rekombinant DNA teknolojisi ile üretilebilir. antikoru. kodlayan nükleotid. dizisi Dolayisiyla, bir içeren bir polinükleotiti eksprese ederek bir proteinin hazirlanmasi için yöntemler burada tarif edilmistir. Teknikte tecrübeli kisilerce iyi bilinen yöntemler, antikor kodlama dizileri ve uygun transkripsiyon ve translasyon kontrol sinyaller olusturmak için kullanilabilir. rekombinant DNA teknikleri, i içeren ekspresyon Bu yöntemler, sentetik teknikler bu nedenle, vektörleri örnegin, in vitro ve in Vivo bulusun bir antikor molekülünü kodlayan bir nükleotit dizisi veya bunun bir agir veya hafif zincirini veya bir promotöre islevsel olarak bagli bir agir veya hafif zincir degisken alani içeren yinelenebilir vektörler saglar. Bu tür vektörler, antikor molekülünün (örnegin, uluslararasi patent basvurulari WO bölgesini kodlayan nükleotid dizisini içerebilir ve antikorun degisken alani, tüm agir veya hafif zincirin ekspresyonu için böyle bir vektöre klonlanabilir.
Burada "vektör" veya "ekspresyon vektörü" terimi, mevcut bulusa uygun olarak, bir konakçi hücrede arzu edilen bir geni tanitmak ve eksprese etmek için bir araç olarak kullanilan vektörleri belirtmek için kullanilmaktadir. Teknikte uzman kisilerce bilindigi gibi, bu tür vektörler, plazmidler, fajlar, virüsler ve retrovirüslerden olusan gruptan kolayca seçilebilir.
Genel olarak, mevcut bulus ile uyumlu vektörler, bir seçim markörü, istenen genin klonlanmasini ve ökaryotik 'veya prokaryotik hücrelere girebilme ve/ veya bu hücrelerde yinelenebilir` olabilmeyi kolaylastirmak için uygun kisitlama bölgelerini içerecektir. Bu bulusun amaçlari için çok sayida ekspresyon vektör sistemi kullanilabilir. Örnegin, bir vektör sinifi, sigir papilloma virüsü, polyoma virüsü, adenovirüs, vaksinia virüsü, bakulovirüs, retrovirüsler (RSV, MMTV' veya MOMLV) veya SV4O virüsü gibi hayvan virüslerinden türetilen DNA elemanlarini kullanir. Digerleri, iç ribozom baglama bölgeleri olan polistronik. sistemlerin kullanimini içerir. Ek olarak, DNA'yi kromozomlarina entegre eden hücreler, transfekte edilmis konakçi hücrelerin seçimine izin veren bir veya daha fazla markörün eklenmesiyle seçilebilir. Markör, bir oksotrofik konakçiya, biyosit direncine (örn., antibiyotiklere) veya bakir gibi agir metallere karsi dirence prototrofi saglayabilir.
Seçilebilir markör geni, eksprese edilecek DNA dizilerine direkt olarak baglanabilir veya es-transformasyon ile ayni hücreye eklenebilir. mRNA'nin optimal sentezi için ek elemanlar da10 eklenebilir. Bu elemanlar, sinyal dizileri, ekleme sinyalleri, ayrica transkripsiyonel promotörler, arttiricilar ve sonlandirma sinyallerini içerebilir.
Bazi düzenlemelerde klonlanmis degisken bölge genleri, yukarida tartisildigi gibi agir ve hafif zincir sabit bölge genleri (örn., insan) ile birlikte bir ekspresyon vektörüne eklenir. Bir düzenlemede, bu, ABD patent no. 6,159,730'da açiklanan, NEOSPLA olarak anilan Biogen IDEC, Inc.'in tescilli bir ekspresyon vektörü kullanilarak gerçeklestirilir. Bu vektör, sitomegalovirüs promotör/ güçlendirici, fare beta globin majör promotörü, replikasyonun SV4O orijini, bovin büyüme hormonu poliadenilasyon dizisi, neomisin fosfotransferaz ekzon 1 ve ekzon 2, dihidrofolat redüktaz geni ve lider diziyi içerir. Bu vektörün, degisken ve sabit bölge genlerinin eklenmesi, CHO hücrelerinde transfeksiyon, ardindan G4l8 içeren ortam ve metotreksat amplifikasyonu ile seçim yapildiktan sonra antikorlarin çok yüksek düzeyde ekspresyonu ile sonuçlandigi bulunmustur. Kuskusuz, ökaryotik hücrelerde ekspresyonu ortaya çikarabilen herhangi bir ifade vektörü mevcut bulusta kullanilabilir. Uygun vektörlerin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, plazmidler pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.l, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMVZ, pSV40/Ze02, pTRACER-HCMV, pUB6/V5- His, pVAXl ve pZeoSVZ (Invitrogen, San Diego, CA'dan temin edilebilir), ve plazmid pCI (Promega, Madison, WI'dan temin edilebilir) bulunur. Genelde, immünoglobulin agir ve hafif zincirler varsa, uygun sekilde yüksek seviyeleri eksprese edenler için çok sayida dönüstürülmüs hücrelerin taranmasi örnegin robotik sistemler tarafindan gerçeklestirilebilen rutin deneydir. Vektör sistemleri, ayrica ABD patent no. 5,736,137 ve ,658,570'de ögretilmektedir. Bu sistem, örn., >3O pg / hücre / gün gibi yüksek ekspresyon seviyelerini saglar. Diger örnek vektör sistemleri, örnegin ABD patenti No. 6,413,777'de açiklanmistir.
Diger düzenlemelerde bulusun antikorlari veya antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevleri ABD patent yapilar kullanilarak eksprese edilebilir. Bu ekspresyon sistemlerinde, agir ve hafif antikor zincirleri gibi ilgi konusu olan çoklu gen ürünleri, tek bir polistronik yapidan üretilebilir. Bu sistemler avantajli olarak nispeten yüksek antikor seviyeleri saglamak için bir dahili ribozom giris alani (IRES) kullanir. Uyumlu IRES dizileri, ABD patent no. 6,193,980'De açiklanmaktadir. Teknikte uzman kisiler, bu ekspresyon sistemlerinin, anlik uygulamada açiklanan tüm antikor dizisini etkili bir sekilde üretmek için kullanilabilecegini takdir edeceklerdir.
Daha genel olarak, antikorun bir monomerik alt-birimini kodlayan vektör veya DNA dizisi hazirlandiktan sonra, ekspresyon vektörü uygun bir konakçi hücreye eklenebilir. Plazmidin konakçi hücreye eklenmesi, teknikte uzman kisilerce iyi bilinen çesitli tekniklerle gerçeklestirilebilir. Bunlar arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, örn., Fugene veya lipofectamine, protoplast füzyonu, kalsiyum fosfat Çökeltme, zarflanmis DNA ile hücre füzyonu, mikroenjeksiyon ve intakt virüs ile enfeksiyon kullanilarak lipotransfeksiyon dahil transfeksiyon bulunur.
Tipik olarak, konakçiya plazmid eklenmesi, standart kalsiyum fosfat es-çökeltme yöntemiyle gerçeklestirilir. Ekspresyon yapisini barindiran konak hücreler, hafif zincirlerin ve agir zincirlerin üretimine uygun kosullar altinda büyütülür ve agir ve/ veya hafif zincirli protein sentezi için analiz edilir. Örnek analiz teknikleri, enzime bagli immünosorbent analizini (ELISA), radyoimmünoanalizi (RIA) veya floresansla aktive edilmis hücre siralayici analizi (FACS), immünohistokimyayi ve benzerlerini Ekspresyon vektörü, geleneksel tekniklerle bir konak hücreye10 transfer edilir ve transfekte edilmis hücreler daha sonra, burada tarif edilen yöntemlerde kullanim için bir antikor üretmek üzere geleneksel tekniklerle kültürlenir. Dolayisiyla, bulus, bir heterolog promotöre islevsel olarak. bagli olan, bulusun bir antikorunu kodlayan bir polinükleotit veya bunun agir veya hafif bir zincirini içeren konakçi hücreleri içerir. Çift zincirli antikorlarin ekspresyonu için, hem agir hem de hafif zincirleri kodlayan vektörler, asagida detayli olarak açiklandigi gibi, tüm immünoglobulin molekülünün ekspresyonu için bir konakçi hücreye eklenebilir.
Konakçi hücre, bulusun iki sentezleme vektörüyle, bir agir zincirden türetilmis polipeptidi kodlayan birinci vektör ve bir hafif zincirden türetilmis polipeptidi kodlayan ikinci vektör ile birlikte transfekte edilebilir. Iki vektör, agir ve hafif zincirli polipeptitlerin esit ekspresyonunu saglayan özdes seçilebilir markörleri içerebilir. Alternatif olarak, hem agir hem de hafif zincir polipeptitlerini kodlayan tek bir vektör kullanilabilir. Bu tür durumlarda, hafif zincir, agir zincirden önce, toksik olmayan agir zincirin fazlaligindan kaçinmak için avantajli bir sekilde yerlestirilir; bkz. Proudfoot, Nature 322 (, 2197.
Agir ve hafif zincirler için kodlama dizileri cDNA veya genomik DNA içerebilir.
Burada kullanildigi sekliyle "konakçi hücreler", rekombinant DNA teknikleri kullanilarak olusturulan ve en az bir heterolog gen kodlayan vektörleri tasiyan hücreler anlamina gelir.
Rekombinant konakçilardan antikorlarin izolasyonu için islemlerin açiklamalarinda, "hücre" ve "hücre kültürü" terimleri, aksi açikça belirtilmedikçe antikor kaynagini belirtmek için birbirinin yerine kullanilabilir. Baska bir deyisle, polipeptidin "hücrelerden" geri kazanimi, ya santrifüjlenmis tüm hücrelerden veya hem ortami hem de süspansiyon halindeki hücreleri ihtiva eden hücre kültüründen anlamina gelebilir.10 Burada tarif edilen metotlarda kullanim için antikor moleküllerini eksprese etmek amaciyla çesitli konakçi-ekspresyon vektör sistemleri kullanilabilir. Bu tür konakçi-ekspresyon sistemleri, ilgili kodlama dizilerinin üretilebildigi ve daha sonra saflastirilabilecegi araçlari temsil eder, fakat ayni zamanda, uygun nükleotid kodlama dizileri ile transforme veya transfekte edildiginde, bulusun bir antikor molekülünü yerinde eksprese edebilen hücreleri temsil eder. Bunlar arasinda, asagidakilerle sinirli olmamakla beraber antikor kodlama dizileri içeren rekombinant bakteriyofaj DNA, plazmid DNA veya kozmid DNA ekspresyon vektörleri ile dönüstürülmüs bakteriler (örn., E. coli, B. subtilis) gibi mikroorganizmalar; antikor kodlama dizileri içeren rekombinant maya ekspresyon vektörleri ile dönüstürülmüs maya (örn., Saccharomyces, Pichia): antikor kodlama dizileri içeren rekombinant Virüs ekspresyon vektörleri (örn., bakulovirüs) ile enfekte olmus böcek hücre sistemleri; rekombinant Virüs ekspresyon vektörleri (örn., karnabahar mozaik virüsü, CaMV; tütün mozaik Virüsü, TMV) ile enfekte edilen veya antikor kodlama dizileri içeren rekombinant plazmid ekspresyon vektörleri (örn., Ti plazmidi) ile transforme edilmis bitki hücre sistemleri; veya memeli hücrelerinin genomundan (örn., metalotiyonin promotörü) veya memeli virüslerinden (örn., adenovirüs geç promotörü; vaccinia virüsü 7.5K promotörü) türetilen promotörleri içeren rekombinant ekspresyon yapilarini barindiran memeli hücre sistemleri (örn., COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3 hücreleri) bulunur. Özellikle rekombinant antikor molekülünün ekspresyonu için Escherichia coli veya ökaryotik hücreler gibi bakteriyel hücreler, bir rekombinant antikor molekülünün ekspresyonu için kullanilir. Örnegin, insan sitomegalovirüsünden önemli ara erken gen promotör elemani gibi bir vektör ile baglantili olarak Çin Hamster Yumurtalik (CHO) hücreleri gibi memeli hücreleri, antikorlar için etkili bir ekspresyon sistemidir; bakiniz, örn., Foecking ve arkadaslari, (1990), 2.
Protein ekspresyonu için kullanilan konak hücre dizisi genellikle memeli kökenlidir; Teknikte uzman kisilerin, burada eksprese edilecek olan arzu edilen gen ürünü için en uygun olan özel konakçi hücre dizilerini belirleme kabiliyetine sahip olduklari kabul edilir. Örnek konakçi hücre hatlari, bunlarla sinirli olmamak üzere, CHO (Çin Hamster Yumurtaligi), DG44 ve DUXB11 (Çin Hamster Yumurtalik Çizgileri, DHFRV eksi), HELA (insan servika l karsinomu), CVI (maymun böbrek hatti), COS (SV4O T antijeni ile CVI türevi), VERY, BHK (bebek hamster böbregi), MDCK, W138, R fibroblasti), P3x63-Ag3.653 1610 (Çin hamster fibroblasti) BALBC/ 3T3 (fare HAK (hamster böbrek hatti), SP2/ O (fare miyelomu), (fare miyelomu), BFA-lclBPT (sigir endotel hücreleri), RAJI (insan lenfositi) ve 293 (insan böbregi) bulunur. Konak hücre hatlari tipik olarak ticari hizmetlerden, Amerikan Dok u Kültürü Koleksiyonundan veya yayinlanmis literatürden elde edilebilir.
Ek olarak, eklenen dizilerin ekspresyonunu modüle eden veya gen ürününü istenen spesifik sekilde modifiye eden ve isleyen bir konakçi hücre susu seçilebilir. Protein ürünlerinin bu gibi modifikasyonlari (örn., glikosilasyon) ve islenmesi (örn., bölünme), proteinin fonksiyonu için önemli olabilir. Farkli konakçi hücreler, proteinlerin ve gen ürünlerinin translasyon sonrasi isleme ve modifikasyonu için karakteristik ve spesifik mekanizmalara sahiptir. Eksprese edilen yabanci proteinin dogru modifikasyonunu ve islenmesini saglamak için uygun hücre dizileri veya transkriptin, uygun sekilde konakçi sistemler seçilebilir. Bu amaçla, birincil glikosilasyonun ve gen ürününün fosforilasyonunun islenmesi için hücresel mekanizmaya sahip olan ökaryotik konakçi hücreler kullanilabilir.
Uzun süreli, yüksek verimli rekombinant protein üretimi için10 stabil ekspresyon kullanilir. Örnegin antikor molekülünü kararli bir sekilde eksprese eden hücre hatl ari tasarlanabilir.
Replikasyonun Viral kaynaklarini içeren ekspresyon vektörlerini kullanmak. yerine, elemanlari transkripsiyon sonlandiricilar, ve seçilebilir bir dönüstürülebilir. Y konakçi hü creler, uygun ekspresyon kontrol tör, güçlendirici, ile kontrol poliadenilasyon alanlari, DNA'nin eklenmesinin diziler, edilen DNA tasarlanmis hücreler, örn., zenginlestirilmis bir ortamda 1-2 gün için büyümeye birakilir ve daha sonra seçici bir ortama geçirilir. karsi direnç kazandirir ve hücrelerin, Rekombinant plazmiddeki seçilebilir markör, plazmidi kromozomlarina sabit bir sekilde entegre etmesine ve sirayla klonlanip hücre hatlarina genlestirilebilen odaklar olusturmaya olanak tanir. Bu yöntem avantajli olarak antikor molekülünü kararli bir sekilde eksprese eden hücre hatlarini üretmek için kullanilabilir.
Herpes simpleks Virüsü timidin kinazi (Wigler ve arkadaslari, hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaz (Szybalska & Szybalski, Proc. 202), ve adenin fosforibosiltransferaz Natl. Acad. (1992), (Lowy ve arkadaslari, Cell 22 (1980), 817) dahil, ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, bir dizi seçim sistemi kullanilabilir, hgprt- veya aprt hücrelerinde kullanilabilir. Ayrica, genler için kullanilabilir: digerleri, arkadaslari, Proc. Natl. mikofenolik aside direnç kazandiran gpt Natl. Acad. kazandiran neo, seçimin temeli Natl. Acad. Sci. olarak anti-metabolit metotreksat'a direnç kazandiran dhfr Acad. Sci. USA 78 G-418 Goldspiel ve dig., (Mulligan & Berg, (1981), sirasiyla tk-, asagidaki direnci (Wigler ve 1527); (1981), 2072); aminoglikozide direnç Clinical Pharmacy 12 Toxicol. 32 (1993), Biochem.
Pharmacol. (1993), (1993), 926-932; 191-217; 573-596; Mulligan, ve Morgan ve Anderson, Ann. Rev.
TIB TECH 11 (1993), 155-215; higromisine direnç kazandiran higro 147).
Kullanilabilen (Santerre ve arkadaslari, rekombinant DNA teknolojisi alaninda yaygin olarak bilinen yöntemler Ausubel ve ark. (yayinlar), Wiley & Sons, A Laboratory Manual, Stockton Press, Current Protocols in Molecular Biologyi John Kriegler, Gene Transfer and Expression, bölümlerde Dracopoli ve dig.
Human Genetics, ve ark. J. Mol. Biol. 150:1 Bir anti amplifikasyonu ile arttirilabilir, ve Hentschel kor molekülünün (yayinlar) John Wiley & Sons, NY (1994); ekspresyo (1990);Ve 12 've 13.
Current Protocols in (1981)'de tanimlanmistir. n seviyeleri, Colberre-Garapin vektör inceleme için bkz. Bebbington (The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Cilt 3. (1987) Antikoru eksprese eden vektör sistemindeki bir markör amplifiye edilebilir oldugunda, konakçi hücre kültüründe bulunan inhibitör seviyesindeki artis, markör genin kopya sayisini antikor geni oldugundan, artiracaktir. Büyütülen antikorun üretimi de artacaktir; bkz. Crouse ve arkadaslari, Mol. Cell. Biol. 3 (1983), In vitro ü retim, istenen polipeptitlerin büyük miktarlarini vermek için ölçek büyütmeye izin verir. altinda memeli bilinmektedir` ve Örn., sürekli kari hücre kültüründe, agaroz mikroboncuklarda süspansiyon hücresi yetistirme Doku kültürü kosullari teknikleri teknikte bir hava tasima reaktöründe veya bir stirici reaktörde veya hareketsiz veya tutulmus kültürünü içerir. örnegin içi bos liflerde, veya seramik polipeptitlerin çözeltileri, Gerekirse ve/ veya mikro kapsüllerde, kartuslarda homojen istenirse, örn., bir sentetik eklem bölgesi polipeptidinin tercihi biyosentezinden sonra veya burada tarif edilen HIC kromatografi adimindan önce veya sonra geleneksel kromatografi yöntemleri örnegin jel filtrasyonu, degisimi kromatografisi, DEAE-selüloz veya immüno-afinite kromatografisi üzerinde kromatografi ile saflastirilabilir.
Bulusa ait antikorlari veya antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevlerini kodlayan genler, bakteri veya böcek veya maya veya bitki hücreleri gibi memeli olmayan hücrelerde de eksprese edilebilir. Kolaylikla nükleik asitleri alan bakteriler arasinda, Escherichia coli veya Salmonella suslari gibi enterobakteriaceae üyeleri, Bacillus subtilis gibi Bacillaceae; Pneumococcus; Streptococcus ve Haemophilus influenzae bulunur. Bakterilerde eksprese edildiginde heterolog polipeptidlerin tipik olarak inklüzyon cisimlerinin bir parçasi oldugu takdir edilecektir. Heterolog polipeptidler izole edilmeli, saflastirilmali ve sonra fonksiyonel moleküllere birlestirilmelidir. Tetravalent antikor formlarinin istendigi durumlarda, alt birimler daha sonra tetravalan antikorlar halinde kendi kendine toplanacaktir; bakiniz örn., uluslararasi basvuru WOO2/096948.
Bakteriyel sistemlerde, eksprese edilen antikor molekülü için amaçlanan kullanima bagli olarak bir dizi ekspresyon vektörü avantajli olarak seçilebilir. Örnegin, böyle bir proteinin büyük bir miktarinin üretilecegi zaman, bir antikor molekülünün farmasötik bilesimlerinin üretilmesi için, kolaylikla saflastirilan yüksek seviyelerdeki füzyon protein ürünlerinin ekspresyonunu yönlendiren vektörler kullanilabilir. Bu tür vektörler arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, buradaki antikor kodlama dizisinin, bir füzyon proteini üretilecek sekilde lacZ kodlama bölgesi ile çerçevedeki vektöre tek tek baglanabildigi E. coli ekspresyon vektörü pUR278 (Ruther ve arkadaslari, EMBO J. 2 (1983), 1791); pIN vektörleri (Inouye & bulunur. pGEX vektörleri ayrica yabanci polipeptidleri glutatiyon S-transferaz (GST) ile füzyon proteinleri olarak10 eksprese etmek için kullanilabilir. Genel olarak, bu tür füzyon proteinleri çözünürdür ve serbest glutatiyon varliginda elüsyon, ardindan glutatyon-agaroz taneciklerinin bir matrisine adsorpsiyon ve baglanma yoluyla lize edilmis hücrelerden kolaylikla saflastirilabilir. pGEX vektörleri, klonlanmis hedef gen ürününün GST kismindan salinabilmesi için trombin veya faktör Xa proteaz bölünme bölgelerini içerecek sekilde tasarlanmistir.
Prokaryotlara ek olarak, ökaryotik mikroplar da kullanilabilir. Saccharomyces cerevisiae veya bilindik firinci mayasi, ökaryotik mikroorganizmalar arasinda en yaygin kullanilanidir, ancak diger birçok sus yaygin olarak mevcuttur, örn., Pichia pastoris. Saccharomyces'te ekspresyon için, örnegin Kingsman ve arkadaslari, Gene 7 (1979), 141; Tschemper ve arkadaslari, Gene 10 (1980), 157) yaygin olarak kullanilir. Bu plazmid, hali hazirda, triptofanda büyüme kabiliyetine sahip olmayan, örnegin ATCC No. 44076 veya PEP4-l gibi bir mutant sus mayasi için bir seçinimarkörü saglayan TRPl genini içerir (Jones, Genetics 85 (1977), 12). Daha sonra maya konakçi hücre genomunun bir özelligi olarak trpl lezyonunun varligi, triptofanin yoklugunda büyümenin transformasyonunu saptamak için etkili bir ortam saglar.
Bir böcek sisteminde, Autographa californica nükleer polihedrozis virüsü (AcNPV) tipik olarak yabanci genleri eksprese etmek için bir vektör olarak kullanilir. Virüs Spodoptera frugiperda hücrelerinde büyür- Antikor kodlama dizisi virüsün zorunlu olmayan bölgelerine (örnegin polihedrin geni) tek tek klonlanabilir ve bir AcNPV promotörünün (örnegin polihedrin promotöri) kontrolü altinda yerlestirilebilir.
Bulusa ait bir antikor molekülü rekombinant olarak eksprese edildiginde, tüm antikorlar, bunlarin dimerleri, bireysel hafif10 ve agir zincirleri veya mevcut bulusun diger immünoglobulin formlari, teknikteki standart prosedürlere göre, örnegin kromatografi ile (örn., iyon degisimi, afinite, özellikle Protein A'dan sonra spesifik antijen için afinite ve boyutlandirma kolon kromatografisi), santrifüj, diferansiyel çözünürlük, örn., amonyum sülfat çökeltme veya proteinlerin saflastirilmasi için herhangi bir baska standart teknikle saflastirilabilir; Bkz. Örn., Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982). Alternatif olarak, bulusun antikorlarinin afinitesini arttirmak için bir yöntem, 2002- 0123057 Al sayili ABD patent yayininda açiklanmaktadir.
V. Füzyon Proteinleri ve Konjugatlari Bazi düzenlemelerde antikor polipeptidi, normal olarak bir antikor ile iliskili olmayan bir amino asit dizisi veya bir veya daha fazla kisim. içerir. Örnek. modifikasyonlar asagida daha ayrintili olarak açiklanmaktadir. Örnegin bazi düzenlemelerde bulusa ait tek Zincirli bir fv antikor fragmani, esnek. bir baglayici dizisi içerebilir veya fonksiyonel bir kisim eklemek üzere modifiye edilebilir (örn., PEG, bir ilaç, bir toksin veya bir floresan, radyoaktif, enzim, nükleer manyetik, agir metal ve benzeri gibi bir isaret).
Bazi düzenlemelerde bulusa ait bir antikor polipeptidi, bir füzyon proteini içerir veya esasen veya tamamen bundan olusur.
Füzyon proteinleri, örnegin, en az bir hedef baglama bölgesine sahip olan bir immünoglobulin d-sinüklein baglama bölgesi ve en az bir heterolog kisim, yani dogada dogal olarak bagli olmayan bir bölümü içeren kimerik moleküllerdir. Amino asit dizileri, normal olarak füzyon polipeptidinde bir araya getirilen ayri proteinler içinde mevcut olabilir veya normal olarak ayni protein içinde mevcut olabilir ancak füzyon polipeptidinde yeni bir düzende yerlestirilir. Füzyon proteinleri, örnegin, kimyasal sentez ile veya peptid bölgelerinin istenen iliskide kodlandigi bir polinükleotitin olusturulmasi ve translasyonu yoluyla olusturulabilir.
Bir polinükleotide veya bir polipeptide uygulanan "heterolog" terimi, polinükleotit veya polipeptidin, karsilastirilmakta oldugu antitenin geri kalanindan farkli bir antiteden türetildigi anlamina gelir. Örnegin burada kullanildigi haliyle, bir antikora veya bir antijene baglanan fragmana, varyanta veya analoga kaynastirilacak bir "heterolog polipeptid" ayni türün immünoglobulin olmayan bir polipeptidinden veya farkli bir türün bir immünoglobulin veya immünoglobulin olmayan polipeptidinden türetilir.
Burada daha detayli olarak tartisildigi gibi, bulusun antikorlari veya antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevleri ayrica, N-veya C-terminalinde bir heterolog polipeptide veya kimyasal olarak konjuge edilmis (kovalent ve kovalent olmayan konjügasyonlar dahil) polipeptitlere veya baska bilesimlere yeniden birlestirilebilir. Örnegin, antikorlar, tespit analizlerinde ve heterolog polipeptidler, ilaçlar, radyonüklidler veya toksinler gibi efektör moleküllerdeki isaretler olarak yararli moleküllere rekombinant olarak birlestirilebilir veya konjuge edilebilir; bakiniz, örn., Bulusun antikorlari veya antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevleri birbirlerine peptid baglari veya modifiye edilmis peptit baglari, yani peptit izosterleri ile birlestirilen amino asitlerden olusabilir ve 20 gen kodlu amino asitler disindaki amino asitleri içerebilir. Antikorlar, translasyon sonrasi isleme gibi dogal islemlerle veya teknikte iyi bilinen kimyasal modifikasyon teknikleriyle modifiye edilebilir. Bu tür modifikasyonlar, temel metinlerde ve daha detayli monograflarda ve ayni zamanda hacimli bir arastirma10 literatüründe iyi tanimlanmistir. Modifikasyonlar, peptid omurgasi, amino asit yan zincirleri. ve amino ;veya karboksil terminalleri dahil olmak üzere antikorun herhangi bir yerinde veya karbonhidratlar gibi parçalarda meydana gelebilir. Ayni tür bir modifikasyonun, belirli bir antikordaki çesitli bölgelerde ayni veya degisken derecelerde mevcut olabilecegi takdir edilecektir. Ayrica, belirli bir antikor birçok türde modifikasyon içerebilir. Antikorlar, örnegin, ubikutin eklemenin bir sonucu olarak dallara ayrilabilir ve bunlar, dallanma olsun olmasin döngüsel olabilir. Siklik, dalli ve dalli siklik antikorlar, translasyon sonrasi dogal islemlerden kaynaklanabilir veya sentetik yöntemlerle yapilabilir.
Modifikasyonlar, asetilasyon, asilasyon, ADP-ribosilasyon, amidasyon, flavin kovalent baglantisi, bir hem grubunun kovalent baglantisi, bir nükleotit veya nükleotit türevinin kovalent baglantisi, lipit veya lipid. türevinin kovalent baglantisi, fosfotidilinositol kovalent baglantisi, çapraz baglanma, siklizasyon, disülfid bag olusumu, demetilasyon, kovalent çapraz baglarin olusumu, sistein olusumu, piroglutamat formasyonu, formilasyon, gamma-karboksilasyon, glikozilasyon, GPI ankor olusumu, hidroksilasyon, iyodinasyon, metilasyon, miristoilasyon, oksidasyon, pegilasyon, proteolitik islem, fosforilasyon, prenilleme, rasemizasyon, selenoilasyon, sülfasyon, arjenilasyon gibi aminoasitlerin transfer-RNA aracili olarak proteinlere eklenmesi ve ubikuitin eklemesini içerir; bkz. örn., Proteins - Structure And. Molecular Properties, T. E.
Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 2. Baski (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B.
C. Johnson, Ed., Academic Press, New York,, sayfalar 1-12 Mevcut bulus ayrica bir antikor veya bunun antijen baglayici fragman, varyant veya bir türevini ve bir heterolog polipeptidi içeren füzyon proteinlerini saglar. Bir düzenlemede, bir füzyon10 proteini, bulusun bir antikorunun en az bir VH bölgesinin amino asit dizisine ve bulusa ait bir antikorun en az bir VL bölgesinin amino asit dizisine veya bunlarin fragmanlari, türevleri veya varyantlarina ve bir heterolog polipeptid dizisine sahip olan bir polipeptidi içerir. Bazi düzenlemelerde, füzyon proteininin VH ve VL bölgeleri, d-sinükleinine spesifik olarak baglanan bir tek kaynakli antikora (veya scFV veya Fab fragmanina) karsilik gelir. Yine baska bir düzenlemede, burada açiklanan tani ve tedavi yöntemlerinde kullanim için bir füzyon proteini, bir antikorun üç VH TBB'sinin amino asit dizisine ve bir antikorun üç VL TBB'sinin amino asit dizisi veya bunlarin fragmanlari veya varyantlari ve bir heterolog polipeptid dizisine sahip olan bir polipeptidi içerir. Bazi düzenlemelerde VH-TBB (ler) veya VL- TBB (ler) in iki, üç, dört, bes, alti veya daha fazlasi, bulusun tek kaynakli antikoruna (veya scFv veya Fab fragmanina) karsilik gelir. Bu füzyon proteinlerini kodlayan nükleik asit molekülleri de bulus tarafindan kapsanmaktadir.
Literatürde bildirilen örnek füzyon proteinleri sunlari içerir: T hücresi reseptörünün füzyonlari (Gascoigne ve ark., Proc. Natl.
Burada baska bir yerde tartisildigi gibi, bulusun antikorlari veya antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevleri, polipeptitlerin in vivo yari ömrünü arttirmak için veya teknikte bilinen yöntemler kullanilarak immüno-analizlerde kullanilmak üzere heterolog polipeptitlere kaynastirilabilir. Örnegin, bir düzenlemede, PEG, in vivo yari ömürlerini arttirmak için bulusa ait antikorlara konjuge edilebilir; bakiniz, örn., Leong *ve Rev. 54 (2002), 531; veya Weir ve arkadaslari, Biochem. Soc.
Transactions 30 (2002), 512.
Ayrica, bulusa ait antikorlar veya antijen baglayici fragmanlar, varyantlar veya bunlarin türevleri, saflastirma veya saptamalari kolaylastirmak için bir peptit gibi markör dizilere kaynastirilabilir. Bazi düzenlemelerde markör amino asit dizisi, digerleri arasinda, pQE vektöründe (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) saglanan etiket gibi bir heksa- histidin peptididir (HIS), ki bunlarin çogu ticari olarak temin edilebilir. Gentz ve arkadaslari, Proc. Natl. Acad. Sci. ABD 86 füzyon proteininin uygun sekilde saflastirilmasini saglar.
Saflastirma için yararli olan diger peptit etiketleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, influanza hemaglutinin proteinindenden (Wilson ve arkadaslari, Cell 37 (1984), 767) türetilen "HA" etiketi ve “bayrak" etiketi bulunur.
Füzyon proteinleri, teknolojide iyi bilinen yöntemler kullanilarak hazirlanabilir; bakiniz örnegin ABD patent no. proteininin sekresyonunu veya baglanma özelliklerini optimize etmek için deneysel olarak seçilebilir. Füzyon proteinini kodlayan DNA daha sonra ekspresyon için bir konakçi hücreye transfekte edilir.
Mevcut bulusa ait antikorlar, örn., molekülun terapötik özelliklerini gelistirmek, hedef tespiti kolaylastirmak veya hastanin görüntülemesi veya tedavisi için konjuge olmayan formda kullanilabilir veya çesitli moleküllerin en az birine konjuge edilebilir. Bulusun antikorlari veya antijen baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevleri, saflastirma yapildiginda ya saflastirma isleminden önce veya sonra ya isaretlenebilir veya konjuge edilebilir. Özellikle, bulusa ait antikorlar veya antijen baglayici fragmanlar, varyantlar veya bunlarin türevleri, terapötik ajanlara, ön ilaçlara, peptidlere, proteinlere, enzimlere, virüslere, lipidlere, biyolojik tepki modifiye edicilere, farmasötik ajanlara veya PEG'ye konjuge edilebilir.
Konvansiyonel antikorlari içeren. immünotoksinler olan konjugatlar, bu alanda yaygin olarak tarif edilmistir. Toksinler, geleneksel baglama teknikleriyle antikorlara baglanabilir veya protein toksini kisimlarini içeren immünotoksinler, füzyon proteinleri olarak üretilebilir. Mevcut bulusun antikorlari, bu tür immünotoksinlerin elde edilmesi için uygun bir sekilde kullanilabilir. Bu immünotoksinlerin açiklanmasi, Byers, (1991), 51-54 tarafindan tarif edilenlerdir.
Teknikte uzman kisiler, konjugatlarin, konjuge edilecek olan seçilmis maddeye bagli olarak çesitli teknikler kullanilarak birlestirilebilecegini takdir edeceklerdir. Örnegin biyotinli konjugeler, örn., bir d-sinüklein baglayici polipeptidi, biyotin N-hidroksisüksinimit ester gibi aktive edilmis bir biyotin esteriyle reaksiyona sokmak suretiyle hazirlanir. Benzer sekilde, bir flüoresan isaretli konjugeler, örnegin burada listelenenler gibi bir baglayici ajanin varliginda veya fluoresein- izotiyosiyanat gibi bir izotiyosiyanatla reaksiyona sokularak hazirlanabilir. Bulusun antikorlarinin veya antijen baglayici10 fragmanlarinin, varyantlarinin 'veya türevlerinin konjugatlari Mevcut bulus ayrica bir tanisal veya terapötik ajana konjuge edilen bulusa ait antikorlari veya antijen baglayici fragmanlarini, varyantlarini veya türevlerini de kapsar.
Antikorlar teshis amaciyla, örnegin, nörolojik bir hastaligin varligini göstermek, nörolojik bir hastalik alma riskini belirtmek, nörolojik bir hastaligin, yani bir klinik test prosedürünün bir parçasi olarak sinükleinopatik hastaligin gelisimini veya ilerlemesini izlemek, örnegin belirli bir tedavi ve/ veya önleme rejiminin etkinligini belirlemek için kullanilabilir. Tespit, antikoru veya antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevini saptanabilir bir maddeye baglamak suretiyle kolaylastirilabilir. Saptanabilir maddelerin örnekleri arasindar çesitli enzimler, prostetik gruplar, flüoresan materyaller, lüminesan materyaller, biyolüminesan materyaller, radyoaktif materyaller, çesitli pozitron emisyon tomografileri kullanilarak pozitron yayan metaller ve radyoaktif olmayan paramanyetik metal iyonlari bulunur; bakiniz, örn., mevcut bulusa göre teshis amaciyla kullanilmak üzere antikorlara birlestirilebilen metal iyonlari için ABD patent no. 4,741,900.
Uygun enzimlerin örnekleri arasinda yabanturpu peroksidaz, alkalin fosfataz, ß-galaktosidaz veya asetilkolinesteraz; uygun prostetik grup komplekslerinin örnekleri arasinda streptavidin/ biyotin ve avidin/ biyotin; uygun flüoresan materyallerin örnekleri arasinda umbelliferone, floresein, floresein izotiyosiyanat, rodamin, diklorotriazinilamin fluoresein, dansil klorür veya fikoeritrin bulunur; bir lüminesan materyal örnegi luminol içerir; biyolüminesan materyallerin örnekleri arasinda lusiferaz, lusiferin ve aequorin; ve uygun radyoaktif Bir antikor veya bunun antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevi, ayrica bir kemilüminesan bilesige baglanmasiyla10 tespit edilebilir sekilde isaretlenebilir. Kemilüminesan etiketli antikorun varligi, daha sonra bir kimyasal reaksiyon sirasinda ortaya çikan lüminesansin mevcudiyetinin saptanmasiyla belirlenir. Özellikle yararli kemilüminesan etiketleme bilesiklerinin örnekleri, luminol, izoluminol, aromatik akridinyum ester, imidazol, akridinyum tuzu ve oksalat esterdir.
Bir antikorun veya antijen baglayici fragmanin, varyantinin veya bunun türevinin tespit edilebilir sekilde isaretlenebilmesinin yollarindan biri, aynisini bir enzime baglayarak ve baglanmis ürünü bir enzim immünoanalizinde (EIA) kullanarak yapmaktir. (Voller, A., "The Enzyme Linked Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (yayin), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. ve ark., (yayinlar), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). Antikora baglanan enzim, örnegin, spektrofotometrik, florimetrik veya görsel vasitalarla tespit edilebilen bir kimyasal parça olusturacak sekilde, kromojenik bir substrat gibi uygun bir substratla reaksiyona girecektir.
Antikoru tespit edilebilir sekilde etiketlemek için kullanilabilen enzimler arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, malat dehidrogenaz, stafilokokal nükleaz, delta-S-steroid isomeraz, maya alkol dehidrojenaz, alfa-gliserofosfat, dehidrogenaz, trioz fosfat izomeraz, yabanturpu peroksidaz, alkalin fosfataz, asparajinaz, glukoz oksidaz, beta-galaktosidaz, ribonükleaz, üreaz, katalaz, glikoz-6-fosfat dehidrojenaz, glukoamilaz ve asetilkolinesteraz bulunur. Ek olarak, tespit, enzim için bir kromojenik substrat kullanan kolorimetrik yöntemlerle gerçeklestirilebilir. Tespit, benzer sekilde hazirlanmis standartlara kiyasla bir substratin enzimatik reaksiyonunun kapsaminin görsel olarak karsilastirilmasiyla da gerçeklestirilebilir.10 Tespit ayrica çesitli baska immün testlerden herhangi biri kullanilarak da gerçeklestirilebilir. Örnegin, radyoaktif olarak antikoru veya antijen baglayici fragmani, varyanti veya türevini isaretleyerek, bir radyoimmunoanaliz (RIA) kullanimi yoluyla antikoru tespit etmek mümkündür. (bakiniz örn., Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (Mart 1986)). Radyoaktif izotop, bunlarla sinirli olmamak üzere, bir gama sayaci, bir sintilasyon sayaci veya otoradyografi dahil olmak üzere vasitalarla tespit edilebilir.
Bir antikor veya bunun antijen baglayici fragman, varyant veya türevi ayrica, leu veya lantanid serilerinin digerleri gibi floresan yayici netaller kullanilarak tespit edilebilir sekilde isaretlenebilir. Bu metaller, dietilentriaminpentasetik asit (DTPA) veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) gibi metal kelatlama gruplari kullanilarak antikora baglanabilir. Çesitli parçalarin bir antikora veya bunun antijen baglayici fragmanina, varyantina veya türevine konjuge edilmesi teknikleri iyi bilinmektedir, bkz. örn., Arnon ve ark., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld ve ark. ark., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2. baski), Robinson ve ark. (yayinlar), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera ve ark.
Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin ve ark. (yayinlar), Academic Press pp. 303-16 (1985), ve Thorpe ve ark., “The Preparation And Cytotoxic10 Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62 Bahsedildigi gibi, bazi düzenlemelerde baglanma molekülünün, örn., bir` baglanma polipeptidinin, örn., bir antikorun veya immünospesifik fragmaninin stabilitesini veya etkinligini arttiran bir kisim konjuge edilebilir. Örnegin bir düzenlemede, PEG, in vivo yari ömürlerini arttirmak için bulusun baglayici moleküllerine konjuge edilebilir. Leong' ve ark., Cytokine 16 ve ark., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.
VI. Bilesimler ve Kullanim Yöntemleri Mevcut bulus, daha önce bahsedilen d-sinüklein baglayici molekülü, ör., bu bulusun antikoru veya bunun antijen baglayici fragmanini veya. bunun türevini veya 'varyantini veya bulusun polinükleotitini, vektörünü veya hücresini içeren bilesimlere iliskindir. Mevcut bulusun bilesimi ayrica farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içerebilir. Ayrica, mevcut bulusun farmasötik bilesimi, farmasötik bilesimin amaçlanan kullanimina bagli olarak interlökinler veya interferonlar gibi baska ajanlari da içerebilir. Örnegin, Parkinson hastaliginin tedavisinde kullanim için, ilave madde, küçük organik moleküller, anti-d-sinüklein antikorlari ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilebilir. Dolayisiyla, bir düzenlemede, bu bulus bir sinükleinopatik hastaligin profilaktik ve terapötik tedavisi için bir farmasötik veya tanisal bilesimin hazirlanmasi, bir sinükleinopatik hastaligin ilerlemesinin izlenmesi veya bir denekte bir sinükleinopatik hastalik tedavisine bir yanitin izlenmesi veya bir denegin bir sinükleinopatik hastalik gelistirme riskinin belirlenmesi için d-sinüklein baglanma molekülünün, örn., mevcut bulusun antikoru veya bunun antijen baglayici fragmani veya mevcut bulusun herhangi birinin, polinükleotidinin, vektörünün veya hücresinin esasen ayni baglanma özelliklerine sahip olan bir baglanma molekülünün kullanimi ile ilgilidir.
Dolayisiyla, bir düzenlemede mevcut bulus, beyinde ve merkezi sinir sisteminde anormal birikme ve/ veya d-sinüklein birikimi ile karakterize edilen bir nörolojik bozuklugun tedavi edilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir ki bu yöntem, ihtiyaç duyan bir denege, bu bulusun bir anti-d-sinüklein baglayici molekülü, antikoru, polinükleotiti, vektörü veya hücresinin terapötik olarak etkili bir Haktarinin uygulanmasini içerir.
Bazi düzenlemelerde NI-202.21Dll veya bir fragmani, varyanti veya türevi iletilir. "Nörolojik bozukluk" terimi, Parkinson hastaligi (PH), Lewy cisimcikli demans (LCD) ve çoklu sistem atrofisi (ÇSA) gibi sinükleinopatik hastaliklari kapsar, ancak bunlarla sinirli degildir. Aksi belirtilmedikçe, nörodejeneratif, nörolojik veya nöropsikiyatrik terimler burada birbirinin yerine kullanilabilir.
Mevcut bulusun terapötik yaklasiminin özel bir avantaji, mevcut bulusun antikorlarinin, Parkinsonizm belirtisi olmayan yasli kisilerin B hücreleri veya B bellegi hücrelerinden türetilmesi ve dolayisiyla, belli bir olasilikla, klinik olarak tezahür eden bir sinükleinopatik hastaligin önlenmesini veya klinik olarak tezahür eden hastaligin ortaya çikma riskinin azaltilmasini veya klinik olarak tezahür eden hastaligin baslangicini veya ilerlemesinin geciktirilmesini saglayabilmesi gerçeginde yatar. Tipik haliyle, bu bulusun antikorlari, somatik olgunlasmaya, yani antikorun degisken bölgelerinin somatik varyasyonu araciligiyla hedef d-sinüklein molekülüne yüksek afinite baglanmasinda seçicilige ve etkinlige göre optimizasyona kadar basarili bir sekilde geçmistir.
Bu gibi, örnegin bir insandaki in vivo hücrelerin, bir otoimmünolojik veya alerjik reaksiyon anlaminda ilgili veya diger fizyolojik proteinler veya hücre yapilari vasitasiyla aktive edilmemis olmalari da büyük tibbi öneme sahiptir çünkü bu, klinik test asamalarinda basarili bir sekilde hayatta kalma olasiligini gösterir. Bu nedenle, en azindan bir insan denekte profilaktik veya terapötik antikorun preklinik ve klinik gelisiminden önce, etkinlik, kabul edilebilirlik ve tolere edilebilirlik halihazirda gösterilmistir. Dolayisiyla, bu bulusun insan anti-d-sinüklein antikorlarinin, hem terapötik ajan olarak hedef yapisina-spesifik veriminin hem de yan etki olasiliginin azalmasinin, klinik basari olasiligini önemli ölçüde arttirmasi beklenebilir.
Mevcut bulus ayrica, yukarida tarif edilen bilesenler ile, örnegin bu bulusun anti-d-sinüklein antikoru, baglanma fragmani, türevi veya varyanti, polinükleotit, vektörü veya hücresinin bir veya daha fazlasi ile doldurulmus bir veya daha fazla kap içeren sirasiyla bir farmasötik ve tanisal paket veya kit saglar. Bu gibi kap(lar) ile baglantili olarak, farmasötik veya biyolojik ürünlerin üretimini, kullanimini veya satisini düzenleyen bir devlet dairesi tarafindan yazilan formda bir bildirim olabilir; bu bildirim, üretim ajansinin, insanda uygulama için üretim, kullanim veya satis onayini yansitir. Ilaveten veya alternatif olarak kit, uygun diyagnostik analizlerde kullanim için reaktifler ve/ veya talimatlar içerir. Bilesim, örn., bu bulusun kiti elbette d-sinüklein mevcudiyetine eslik eden bir bozuklugun risk degerlendirmesi, teshisi, önlenmesi ve tedavisi için özellikle uygundur, ve özellikle Parkinson hastaliginin (PH), Lewy cisimcigikli (LCD) demansin ve çoklu sistem atrofisinin (ÇSA) tedavisi için uygulanabilir.
Mevcut bulusun farmasötik bilesimleri, teknikte iyi bilinen yöntemlere göre formüle edilebilir; bkz. örnegin Philadelphia Bilim Üniversitesi tarafindan Remington: The Science and tasiyicilarin örnekleri teknikte iyi bilinmektedir ve fosfat10 tamponlu tuzlu su çözeltilerini, su, yag/ su emülsiyonlari gibi emülsiyonlari, çesitli tipte islatma maddelerini, steril çözeltileri vb. içerir. Bu tür tasiyicilari içeren bilesimler, iyi bilinen geleneksel yöntemlerle formüle edilebilir. Bu farmasötik bilesimler, uygun kür` dozda denege uygulanabilir.
Uygun bilesimlerin uygulanmasi, örnegin intravenöz, intraperitonal, subkütan, intramüsküler, intranazal, topikal veya intradermal uygulama veya omurilik veya beyin yoluyla farkli yollarla gerçeklestirilebilir. Nazal sprey formülasyonlari gibi aerosol formülasyonlari, koruyucu ajanlar ve izotonik ajanlar ile aktif maddenin saflastirilmis sulu veya diger solüsyonlarini içerir. Bu gibi formülasyonlar, nazal mukoza zarlariyla uyumlu bir pH ve izotonik duruma ayarlanabilir.
Rektal veya vajinal uygulama için formülasyonlar, uygun bir tasiyici ile bir süpozituvar olarak sunulabilir.
Ayrica, mevcut bulus, mevcut bulusun bir ilacini uygulamak için kafatasinda küçük bir deligin delinmesi için simdi mevcut (ancak nadir olan) prosedürü içerirken, bir yönden, baglayici molekül, özellikle mevcut bulusun antikoru veya antikor bazli ilaci, damar içi veya agizdan uygulamaya olanak saglayan kan- beyin bariyerini geçebilir.
Dozaj rejimi, katilimci hekim ve klinik faktörler tarafindan belirlenecektir. Tip tekniklerinde iyi bilindigi gibi, herhangi bir hasta için dozajlar, hastanin büyüklügü, Vücut yüzey alani, yas, uygulanacak özel bilesik, cinsiyet, zaman ve uygulama yolu, genel saglik ve ayni zamanda uygulanan diger ilaçlar dahil olmak üzere birçok faktöre baglidir. Parenteral uygulama için preparatlar arasinda steril sulu veya sulu olmayan çözeltiler, süspansiyonlar ve emülsiyonlar bulunur. Sulu olmayan çözücülerin örnekleri propilen glikol, polietilen glikol, zeytin yagi gibi bitkisel yaglar ve etil oleat gibi enjekte edilebilir organik esterlerdir. Sulu tasiyicilar, tuzlu su ve tamponlanmis ortam dahil olmak üzere su, alkollü/ sulu çözeltiler, emülsiyonlar10 veya süspansiyonlari içerir. Parenteral araçlar arasinda sodyum klorür çözeltisi, Ringer dekstrozu, dekstroz ve sodyum klorür, laktatlanmis Ringer veya sabit yaglar bulunur. Intravenöz araçlar arasinda sivi ve besleyici takviye maddeleri, elektrolit ikmal maddeleri (Ringer dekstrozu temelli olanlar gibi) ve benzeri yer alir. Örnegin antimikrobiyaller, antioksidanlar, kelatlama ajanlari ve inert gazlar ve benzerleri gibi koruyucular ve diger katki maddeleri de mevcut olabilir. Ayrica, bulusun farmasötik bilesimi, farmasötik bilesimin amaçlanan kullanimina bagli olarak dopamin veya psikofarmakolojik ilaçlar gibi baska ajanlari da içerebilir.
Ayrica, bir farmasötik bilesim, örnegin, bulusun farmasötik bilesimi, pasif immünizasyon için bir anti-d-sinüklein antikoru veya baglayici fragmani, türevi veya varyanti ihtiva ediyorsa, bir asi olarak formüle edilebilir. Arka plan bölümünde belirtildigi gibi, d-sinüklein oligomerik türleri plazma ve hücre disi olarak bildirilmistir ve Parkinson hastaliginin fare modellerinde pasif bagisiklik çalismalari, d-sinükleine karsi hücre disi fare monoklonal antikorlarinin hücre içi d-sinüklein agregatlarinin birikimini azaltabildigini göstermektedir bulusun insan anti-d-sinüklein antikorlarinin ve esdeger @- sinüklein baglayici moleküllerinin PH, LCD ve ÇSA gibi Sinükleinopatik hastaliklarin Önlenmesi veya iyilestirilmesi için bir asi olarak özellikle yararli olmalarini beklemek ihtiyatlidir.
Bir düzenlemede, mevcut bulusa ait antikorun bir hücre membranina daha kolay nüfuz edebilen rekombinant Fab (rFab) ve tek zincirli fragmanlarin (scFvs) kullanilmasi faydalidir. Örnegin, Robert ve arkadaslarinin onceden çevrimiçi olarak yayini, Aß'nin N-terminal bölgesinde bir epitopu taniyan10 monoklonal antikor WO-2'nin kimerik rekombinant Fab (rFab) ve tek zincirli fragmanlarinin (scFvs) kullanimini tarif eder.
Tasarlanan fragmanlar (i) amiloid fibrilizasyonunu önleyebilir, (ii) önceden olusturulmus Aß1-42 fibrillerini ayirir ve (iii) tüm IgG molekülü kadar verimli bir sekilde in vitro olarak Aßl- 42 oligomer aracili nörotoksisiteyi inhibe edebilir. Efektör fonksiyondan yoksun olan küçük Fab ve scFv ile tasarlanmis antikor formatlarinin kullaniminin avantajlari arasinda, kan- beyin bariyeri boyunca daha verimli geçis ve enflamatuar yan reaksiyonlarin tetiklenme riskini en aza indirgeme yer alir.
Ayrica, scFV ve tek alanli antikorlarin tam uzunluktaki antikorlarin baglanma spesifikligini korumasi disinda, bunlar, hedeflerinin katlanmasi, etkilesimleri, modifikasyonlari veya hücre-içi lokalizasyonunun degismesi için potansiyel ile birlikte, tekil genler ve memelilerde hücre içi olarak eksprese edilebilirler; bakiniz, örnegin Miller ve Messer, Molecular Farkli bir yaklasimda Muller ve arkadaslari, Expert Opin. Biol. adlandirilan ve antikorlara zarar vermeden canli hücrelere yerlestirilmelerini saglayan bir teknoloji platformunu tanimlar.
Bu tarz hücreye-nüfuz edici antikorlar, yeni teshis ve terapötik pencereleri açar. Bu antikorlar için 'TransMabs' terimi bulunmustur.
Bir baska düzenleme, bir sinükleinopatik hastaligin tedavisi için yararli diger nöroprotektif ajanlarin birlikte veya sirayla uygulanmasini içerir. Bir düzenlemede, ek madde, mevcut bulusun farmasötik bilesiminde yer alir. Bir denegin tedavi edilmesi için kullanilabilen nöro-koruyucu ajanlarin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, bir asetilkolinesteraz inhibitörü, bir glutamaterjik reseptör antagonisti, kinaz inhibitörleri, HDAC inhibitörleri, anti-enflamatuar ajanlar, divalproeks sodyum veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu yer10 alir. Mevcut bulusun farmasötik bilesimi ile birlikte kullanilabilecek diger nöroprotektif ajanlarin örnekleri, teknikte tarif edilmistir; bakiniz örn., Uluslararasi basvuru WOZOO7/Oll907. Bir düzenlemede, eki madde, dopamin veya bir Mevcut bulusun bir baska düzenlemesinde, d-sinüklein baglayici moleküller, özellikle mevcut bulusun antikorlari, bir sinükleinopatik hastaligin tedavisi için yararli olan nöral transplantlar veya kök hücre terapisi ile transplantasyon terapisinden önce veya sonra veya beraberinde uygulanabilir.
Embriyonik mezensefalik nöronlarin transplantlari ile Imi tür yaklasimlar, Parkinson hastaligi olan hastalarda, hastalikta kaybolan nöronlarin degistirilmesi ve striatumda dopaminerjik nörotransmisyonun yeniden saglanmasi amaciyla gerçeklestirilmistir. Transplantasyondan 11-16 yil sonra, asili nöronlarin Lewy cisimcikleri ve Lewy nevritleri içerdigi tespit edilmistir. d-sinüklein patolojisinin konakçidan asilanmis dokulara bu yayilimi, d-sinüklein baglayici moleküllerin, özellikle mevcut bulusun antikorlarinin birlikte uygulanmasiyla önlenebilir.
Terapötik olarak etkili bir doz veya miktar, semptomlari veya durumu iyilestirmek için yeterli miktarda aktif bilesen anlamina gelir. Bu bilesiklerin terapötik etkinligi ve toksisitesi, hücre kültürlerinde veya deney hayvanlarinda, Örn.,- EDm (popülasyonun %50'sinde terapötik olarak etkili doz) ve LDw (popülasyonun %SO'sine öldürücü olan doz) gibi standart farmasötik prosedürlerle belirlenebilir- Terapötik ve toksik etkiler arasindaki doz orani terapötik endekstir ve LD5m/ ED& orani olarak ifade edilebilir. Bazi düzenlemelerde bilesimdeki terapötik ajan, PH, LCD veya baska sinükleinopatik hastaliklar durumunda normal davranisi ve/ veya bilissel özellikleri geri getirmek veya muhafaza etmek için yeterli bir miktarda mevcuttur.
Yukaridakilerden, mevcut özellikle yukarida belirtildigi gibi bir sinükleinopatik hastaligin teshisi ve/ veya tedavis bunlarin fragmanlarini, NI-202.21Dll'in en az bir TBB'sini 'veya varyantlarini veya türevlerini içeren bir d-sinüklein baglanma molekülünün herhangi bir kullanimini kapsadigi açiktir. antikoru veya bunun bir immünoglobulin zinciridir. mevcut bulus Baglanma molekülü, mevcut bulusun Ek olarak anti-idiyotipik antikorlari ile ilgilidir. Bunlar, bir antikorun antijen baglanma yerine yakin bir antikor bölgesi üzerinde yer alan benzersiz antijenik peptit dizisine baglanan ve örn., denegin numunesinde anti-d-sinüklein antikorlarinin saptanmasi için yararli olan antikorlar veya diger baglanma molekülleridir.
Baska bir düzenlemede mevcut bulus, bulusun, d-sinüklein antijen baglayici fragmanlarin, baglayici yukarida tarif edilen, moleküllerin, polinükleotidlerin, antikorlarin, vektörlerin veya hücrelerin herhangi birini içeren bir teshis bilesimi ve immüno veya nükleik asit bazli teshis yöntemlerinde geleneksel olarak kullanilan reaktifler gibi için istege bagli olarak uygun araçlar ile ilgilidir. Bulusun antikorlari, örnegin, sivi fazda kullanilabilecekleri veya bir kati faz tasiyicisina baglanabilecekleri immünoanalizlerde kullanilmak için uygundur.
Bulusun antikorunu dogrudan veya kullanabi dolayli bir olmayan immünoanalizlerdir. radyoimmunoanaliz sandviç len immünoanalizlerin örnekleri, formatta rekabetçi ve rekabetçi Bu immunoanalizlerin (immünometrik analiz), Örnekleri, sitometrisi ve Western blot analizidir. Bulusa ait antijenler ve antikorlar, birçok farkli spesifik olarak hücreleri izole etmek tasiyiciya baglanabilir ve bunlara kullanilabilir. Iyi bilinen tasiyicilarin örnekleri arasinda cam, polistiren, polikarbonat, selülozlar, Tasiyicinin polivinil dekstran, poliakrilamidler, dogasi, polipropilen, amilozlar, polietilen, dogal ve Hwdifiye amaçlari çözülebilir çözünmez olabilir. Teknikte siradan yetenege sahip kisilerce bilinen birçok farkli isaret ve isaretleme yöntemi vardir.
Mevcut bulusta kullanilabilecek isaret tiplerinin örnekleri arasinda enzimler, radyoizotoplar, kolloidal metaller, flüoresan bilesikler, kemilüminesan bilesikler ve biyolüminesan bilesikler bulunur; ayrica yukarida tartisilan düzenlemelere de bakiniz.
Baska bir düzenlemeyle, d-sinüklein baglayici moleküller, özellikle mevcut bulusun antikorlari bir bireyde bir hastaligin teshisi için, test edilen bireyden kan numunesi, lenf numunesi veya baska bir Vücut sivisi numunesi olabilen bir vücut sivisi numunesi elde edilmesi ve bu bulusun bir antikoru ile bu vücut sivisi numunesinin, antikor-antijen komplekslerinin olusumunu mümkün kilan kosullar altinda temas ettirilmesi ile bir yöntemde kullanilir. Bu tür komplekslerin seviyesi, daha sonra, teknikte bilinen yöntemlerle, test edilen bireyde hastaligi gösteren bir kontrol numunesinde olusturulandan önemli ölçüde daha yüksek bir seviyede belirlenir. Ayni sekilde, bulusun antikorlari ile baglanan spesifik antijen de kullanilabilir. Dolayisiyla mevcut bulus, örn., bulusun antikor veya bunun antijen baglayici fragmanini içeren baglayici bir nmlekülü içeren bir in vitro immünoanaliz ile ilgilidir.
Bu baglamda, mevcut bulus ayrica, bu amaç için özel olarak tasarlanan araçlarla da ilgilidir. Örnegin, Sözgelimi d- sinüklein'i spesifik olarak taniyan mevcut bulusa ait antikorlar veya esdeger antijen baglayici moleküller ile yüklenmis olan bir antikor bazli dizi kullanilabilir. Mikrodizi immunoanalizlerin tasarimi Kusnezow ve arkadaslari, Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696'da özetlenmistir. Buna göre, bu bulus, ayni zamanda, bu bulusa uygun olarak tanimlanan d-sinüklein baglayici moleküller ile yüklenmis mikrodizilere de iliskindir.
Bir düzenlemede, bu bulus bir denekte bir sinükleinopatik hastaliginin teshisi için bir yönteme iliskindir, yöntem asagidakileri kapsar: (a) bulusun antikoru veya fragmaninin herhangi biri ile teshis edilecek bir denekte d-sinüklein seviyesini, lokalizasyonunu, konformasyonunu veya bunlarin bir kombinasyonunu degerlendirmek ve (b) bir veya daha fazla kontrol numunesinden türetilen bir veya daha fazla referans standardina göre denekte d- sinüklein seviyesini, lokalizasyonunu, konformasyonunu veya bunlarin kombinasyonunu karsilastirmak, burada, denekte d-sinüklein seviyesi, lokalizasyonu, konformasyonu veya bunlarin kombinasyonu ile referans standardi arasindaki bir farklilik veya benzerlik, denegin bir sinükleinopatik hastaliga sahip olup olmadigini gösterir.
Tani konulacak denek, hastalik için asemptomatik veya preklinik olabilir. Referans standardi, örnegin, PH, LCD veya ÇSA gibi bir sinükleinopatik hastaliga sahip bir hastadan olabilir, burada teshis edilecek denekteki d-sinüklein seviyesi, lokalizasyonu, konformasyonu veya bunlarin kombinasyonu arasindaki benzerlik ve referans standart, teshis edilecek kisinin sinükleinopatik bir hastaliga sahip oldugunu gösterir.
Alternatif olarak veya ek olarak referans standart, bir sinükleinopatik hastaliga sahip olmayan bir denekten türetilir.
Bazi düzenlemelerde, teshis edilecek denek ve referans standart (lar) yas eslesmelidir. Analiz, in Vivo olarak veya teshis edilecek denekten izole edilen bir örnek vasitasiyla, örn., bir kan, BOS veya idrar numunesi gibi d-sinüklein içerdiginden süphelenilen herhangi bir vücut sivisi yoluyla yapilabilir. d-sinüklein seviyesi, lokalizasyonu ve/ veya konformasyonu, teknikte bilinen herhangi bir uygun yöntemle, örn., Western blot, immünopresipitasyon, enzime bagli immünosorbent analiz (ELISA), radioimmunoanaliz (RIA), floresan aktif hücre siralama (FACS), iki boyutlu jel elektroforezi, kütle spektroskopisi (MS), matris destekli lazer desorpsiyon/ iyonizasyon uçus zamani-MS (MALDI- TOF), yüzeyde gelistirilmis lazer desorpsiyonu iyonizasyon- uçus zamani (SELDI-TOF), yüksek performansli sivi kromatografisi (HPLC), hizli protein sivi kromatografisi (FPLC), çok boyutlu sivi kromatografisini (LC) takiben tandem kütle spektrometresi (MS/ MS) ve lazer dansitometrisinden seçilen bir veya daha fazla teknikle d-sinüklein analizi yapilarak degerlendirilebilir. A- sinüklein in vivo görüntüleme, pozitron emisyon tomografi (PET), tek foton emisyon tomografi (SPECT), yakin kizilötesi (NIR) optik görüntüleme veya manyetik rezonans görüntüleme (MRI) içerebilir.
PH, LCD veya ÇSA gibi bir sinükleinopatik hastaligin teshis eilmesi, bir sinükleinopatik hastalik ilerlemesinin izlenmesi ve bu bulusa uygun olarak uyarlanabilen antikorlar ve ilgili araçlar kullanilarak bir sinükleinopatik hastalik tedavisinin izlenmesi yöntemleri W02007/Oll907 sayili uluslararasi basvuruda açiklanmistir. Benzer sekilde, d-sinüklein için antikor bazli tespit yöntemleri, uluslararasi basvurularinda açiklanmaktadir. Bu yöntemler, tarif edildigi gibi, ancak bu bulusun bir d-sinüklein spesifik antikoru, baglayici fragmani, türevi veya varyanti ile uygulanabilir.
Bu ve diger düzenlemeler, bu bulusun tarifi ve örnekleri ile açiklanmaktadir ve kapsam dahilindedir. Mevcut bulusa uygun olarak kullanilacak malzemeler, yöntemler, kullanimlar ve bilesiklerden herhangi biri ile ilgili daha fazla literatür, örnegin elektronik cihazlar kullanilarak halk kütüphaneleri ve veri tabanlarindan elde edilebilir. Örnegin, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi ve/ veya Ulusal Saglik Enstitülerindeki Ulusal Tip Kütüphanesi tarafindan barindirilan10 Biyoloji Laboratuvari (EMBL) 'nin bir parçasi olan Avrupa Biyoenformatik Enstitüsü (EBI) gibi diger veri tabanlari ve web adresleri, teknikte uzman kisilerce bilinmektedir ve ayrica internet arama motorlari kullanilarak da elde edilebilir.
Biyoteknolojideki patent bilgisine genel bir bakis ve geriye dönük arastirmalar ve güncel farkindalik için yararli olan ilgili patent bilgi kaynaklari arastirmasi Berks, TIBTECH 12 Yukaridaki açiklama genellikle bu bulusu açiklar. Aksi belirtilmedikçe, burada kullanildigi gibi bir terim, Oxford University of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford gibi tanimlanmistir. Bu tarifname metni boyunca birkaç belge alintilanmistir.
Daha bütün bir kavrayis, sadece gösterim amaciyla burada sunulan asagidaki spesifik örneklere referansla elde edilebilir. ÖRNEKLER Takip eden örnekler bulusu daha da açiklamaktadir. Örneklerde asagidaki deneyler, klonlanmis olarak NI-202.21Dll ve NI- 202.12F4 antikoruna (Örnek. 1'de) yani, 1 lg degisken bölgelerinin son N-terminalinde primer kaynakli mutasyonlar içeren ve insan degisken agir ve hafif zincirlerin germ hatti (GL) dizilerine ayarlanmayan antikora göre gösterilmis ve tarif edilmistir; Sekil l'e bakiniz. Bu antikorlar insan IgGl molekülleri olarak ifade edilmistir.
Araç ve yöntemler Burada kullanilanlar gibi geleneksel yöntemlerin detayli açiklamalari, alinti yapilan literatürde bulunabilir. Asagida aksi belirtilmedikçe, d-sinükleine özgü B hücrelerinin tanimlanmasi ve rekombinant ekspresyonunun ve fonksiyonel karakterizasyonunun yani sira ilgi spesitifitesini sergileyen d- sinüklein antikorlarinin moleküler klonlanmasi, WOZOO8/O81008 Tamamlayici Yöntemler bölümünde tarif edildigi gibi gerçeklestirilmistir veya gerçeklestirilebilir.
Antijenin saflastirilmasi Rekombinant His-g-sinüklein, Escherichia coli'de rekombinant ekspresyon ve daha sonrasinda isi ile indüklenen çökeltme, Nikel afinitesi, anyon degisimi ve boyut dislama kromatografisi kullanilarak saflastirma ile elde edildi. Örnegin, T7 promotörünün kontrolü altinda d-sinüklein kodlayan cDNA'yi içeren bir DNA yapisi, BL21 (DE3) gibi uygun bir Escherichia coli susunu dönüstürmek için kullanildi ve 200 m1 hücre kültürünün ekspresyonu, lmM izopropil ß-D- tiogalaktopiranosid (IPTG) ilavesiyle indüklendi. Hücreler, 37 °C'de 4 saat indüksiyondan sonra toplandi ve daha sonra 20 ml 50mM Tris, 150 mM NaCl pH 8 içinde yeniden süspanse edildi, ardindan sonifikasyon yapildi. 15 dakika kaynatildiktan sonra isiya dayanikli 17000g süpernatant toplandi. Sahte Escherichia coli'den benzer, isiya dayanikli 17000g süpernatant toplandi.
Escherichia coli'den gelen, His-etiketli g-sinüklein'i eksprese mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8'e ayarlandiktan sonra, bir HisTrap HP lml (GE Life Science) kolonuna yüklendi ve HIS-d-sinüklein -500 mM imidazol gradyani ile elüt edildi. HIS-d-sinüklein içeren fraksiyonlar toplandi ve sonra 50 mM Tris pH 8 ile 1:10 oranina seyreltildi. Seyreltilmis toplanmis fraksiyonlar` bir HiTrap Q HP lml (GE Life Science) kolonuna uygulandi ve bagli proteinler 30-1000 mM NaCl gradyaninda elüte edildi. Son olarak, HIS-d-sinüklein içeren elüatlar, yüksek performansli jel filtrasyonu (Superdex 200 kullanilarak daha da saflastirildi. Bu saflastirma prosedürü, SBS-PAGE ve Coomassie boyamasi ile tahmin edildigi gibi %99 civarinda bir saflik derecesiyle HIS-d-sinükleinini verir. Saflastirilmis proteinin konsantrasyonu bir BCA testi (Pierce) kullanilarak belirlenmistir. a-sinüklein antikoru taramasi 96 kuyucuklu yarim alan Mikroplakalar (Corning), 4 °C'de gece boyunca kaplama tamponu (PBS pH 9.6) içinde standart bir 2 ug/ ml konsantrasyonda saflastirilmis HIS-d-sinüklein veya d- sinüklein (rPeptid) ile kaplandi. Plakalar, PBS-T pH 7.6'da yikandi ve spesifik olmayan baglanma alanlari, oda sicakliginda 1 saat süreyle, %2 BSA (Sigma, Buchs, Isviçre) içeren PBS-T ile bloke edildi. B hücresi kosullu ortam, %l BSA içinde %10 Isiya dayanikli E. coli proteinleri ile oda sicakliginda 1 saat boyunca ön-emdirildi. Bu ön-emilim asamasi, daha önceki birkaç ELISA taramasi girisiminin, insan d-sinüklein spesifik antikorlarinin belirlenmesinde basarisiz olmasindan sonra gelistirilmistir. Bu nedenle, nihayetinde, ELISA plakasinin isiya dayanikli E. coli proteinleri ile ön-emiliminin, muhtemelen saflastirilmis rekombinant d-sinüklein örneklerinde mevcut olan E. coli protein kontaminasyonlarina karsi yönlendirilen antikorlar ve yapiskan antikorlar gibi yanlis pozitif vurgular için taranmayi içermedigi ortaya çikmistir. Önceden emilen ortam daha sonra B bellek hücresi kültür plakalarindan ELISA plakalarina transfer edildi ve oda sicakliginda 2 saat inkübe edildi. ELISA plakalari PBS-T içinde yikandi ve daha sonra yabanturpu peroksidaz (HRP) ile konjuge esek anti-insan IgG (Fcy fragmani spesifik) poliklonal antikorlari ile inkübe edildi. PBS-T ile yikandiktan sonra, insan antikorlarinin baglanmasi, standart kolorimetrik analizde HRP aktivitesinin ölçülmesiyle belirlendi. a-sinüklein antikorlarinin moleküler klonlanmasi B bellek hücrelerini içeren numuneler, 60 yasindan büyük gönüllülerden elde edildi. Tüm gönüllülerin Parkinsonizm belirtilerinden yoksun olmasi ortak yönleriydi. Seçilen B bellek hücresi kültürlerinin yasayan B hücreleri toplandi ve mRNA hazirlandi. Immünoglobulin agir ve hafif zincir dizileri daha sonra tüm insan J segmentleri (agir ve kappa hafif zincir) için spesifik primerler ve 3' primerler olarak C segmentleri (lambda hafif zincir) ile kombinasyon halinde 5' primerleri olarak tüm insan degisken agir ve hafif zincir aileleri için Ig-çerçeve 1 spesifik primerler kullanilarak elde edildi (Marks ve Antikor klonunun istenen spesifiklik ile belirlenmesi, tam antikorlarin rekombinant ekspresyonu sonrasi ELISA üzerinde yeniden tarama ile gerçeklestirilir. Komple insan IgGl antikorlarinin veya kimerik IgG2a antikorlarinin rekombinant ekspresyonu, "dogru okuma çerçevesindeki" degisken agir ve hafif zincir dizilerinin degisken bölge dizisini 5'-ucunda. ve 3'- ucunda bir lider peptidi kodlayan bir dizi ile uygun sabit alani (alanlari) kodlayan bir dizi ile tamamlayan ekspresyon vektörlerine eklenmesi üzerine elde edilir. Bu amaçla primerler, degisken agir ve hafif zincir dizilerinin antikor ekspresyon vektörlerine klonlanmasini kolaylastirmak için tasarlanmis kisitlama bölgeleri ihtiva etmistir. Agir zincir immünoglobulin, çerçeve içi immünoglobulin agir zincir RT-PCR `ürününün, bir sinyal peptidi ve insan immünoglobulin gamma 1 veya fare immünoglobulin gamma 2a'nin sabit alanlarini tasiyan bir agir zincir ekspresyon vektörüne sokulmasiyla eksprese edilir. Kappa hafif zincir immünoglobulin, çerçeve içi NI-202.21Dll kappa hafif zincir RT-PCR-ürününün bir sinyal peptidi ve insan kappa hafif zincir immünoglobulinin sabit alanini saglayan bir hafif zincir ekspresyon vektörüne eklenmesiyle eksprese edilir.
Fonksiyonel rekombinant nwnoklonal antikorlar, bir Ig-agir zincir ekspresyon vektörünün ve bir kappa veya lambda Ig-hafif zincir ekspresyon vektörünün HEK293 veya CHO hücrelerine (veya insan veya fare kaynakli herhangi bir baska uygun hücre hatti) birlikte transfeksiyonu üzerine elde edildi. Rekombinant insan monoklonal antikoru daha sonra standart ;bir Protein A kolon aritma kullanilarak kosullu ortamdan aritildi.
Antikorlar Pan sinüklein antikoru Sin2ll (Sigma), üreticinin protokolüne göre kullanildi. Rekombinant insan d-sinüklein antikoru NI- HEK293 veya CHO hücrelerinde eksprese edildi ve daha sonra aksi belirtilmedikçe kosullandirilmis ortam dogrudan sonraki uygulamalarda kullanildi.
Dogrudan ELISA Antijenler, PBS pH 9.6'da belirtilen konsantrasyonda, 4 °C'de gece boyunca 96 kuyucuklu yarim alan mikroplakalarina (Corning) kaplandi. Plakalar, PBS-T pH 7.6'da yikandi ve spesifik olmayan baglanma yerleri, oda sicakliginda 1 saat süreyle %2 BSA (Sigma) içeren PBS-T ile bloke edildi. Problar (Primer antikorlar) daha sonra kuyucuklara aktarilmis ve oda sicakliginda 2 saat inkübe edilmistir. PBS-T pH 7.6'da yikandiktan sonra, kuyucuklar, yaban turpu peroksidazi (HRP) konjuge poliklonal anti-insan (rekombinant insan antikorlari için), anti-tavsan (pan sinüklein antikoru için) veya anti-fare (LB509 veya SinZll için) ikincil antikorlar ile oda sicakliginda 1 saat inkübe edildi. PBS-T içinde kati yikamadan sonra, problarin baglanmasi, kromojenik substrat olarak 3,3', 5,5'-tetrametilbifenil-4,4'-diamin (Sigma) kullanilarak standart kolorimetrik analizde HRP aktivitesinin Ölçülmesiyle belirlendi.
Epitop haritalamasi için peptid taramasi Insan d-sinükleininin tüm dizisi, 15 amino asidin (aa) uzunluklari ve bir selüloz zarina (JPT, Berlin, Almanya) esnek bir baglayici vasitasiyla baglanmis bir JJ_ aa çakismasi ile çakisan peptitler olarak sentezlendi. Toplam 33 peptit içeren bir zar metanol içinde durulanmis ve daha sonra Rotiblock (Roth, Karlsruhe, Almanya) ile bloke edilmistir. Zar, bloke edici çözelti içinde seyreltilmis belirli antikorlarla ve sonra 1 saat boyunca yabanturbu peroksidaz (HRP) isaretli sekonder antikorla inkübe edildi. Inkübasyonlar arasinda zar, 5 dakika boyunca 3x PBS-T ile yikandi. Zar daha sonra ECL ve Western Blot Saptama Reaktifleri (GE Healthcare) kullanilarak gelistirildi. Örnek 1: Insan kaynakli a-sinüklein antikoru NI-202.21D11, insan a-sinüklein için seçicidir d-, ß- ve y-sinüklein, agirlikli olarak sinir sistemi, iskelet kasi ve kalpte eksprese edilen yüksek derecede homolog proteinlerdir. d-sinüklein, genis bir CNS hastaligi spektrumu ile güçlü bir sekilde baglantiliyken, ß-sinüklein bir nöro- koruyucu protein olabilir. Dolayisiyla bulus, ß-ve y-sinüklein ile çapraz reaksiyona girmeyen patolojik d-sinüklein varyantlarina karsi terapötik antikorlar saglar. NI-202.21Dll'in potansiyel terapötik kullanimini desteklemek için, antikor dogrudan bir ELISA'da d-, ß- ve y- sinükleine baglanma açisindan test edilmistir. Rekombinant. d-,ß ve y-sinüklein, esit konsantrasyonda ELISA plakalari üzerine kaplandi ve daha sonra ya rekombinant NI-202.21Dll veya bir kontrol pan sinüklein antikoru ile inkübe edildi. Pan-sinüklein antikoru, üç sinüklein proteininin tümünü algilar, ancak NI-202.21Dll, d-sinüklein için seçici baglanmayi gösterir (Sekil 2a).
Insan ve fare d-sinüklein yüksek ölçüde korunmus proteinlerdir.
Rekombinant NI-202.21D11'in tercihen, insan vs murin d- sinükleinine baglanip baglanmadigini sorusturmak için, rekombinant His-etiketli insan veya murin d-sinüklein, esit konsantrasyonda ELISA plakalari üzerine kaplandi ve daha sonra 2b). NI-202.21Dll, sadece insan d-sinükleinini tespit ederken, NI-202.12F4, bu dogrudan ELISA'da hem insan hem de murin d- Al). Bu bulgular birlikte NI-202.21Dll'in insan d-sinüklein için oldukça seçici oldugunu göstermektedir. Örnek 2: NI-202.21D11, konformasyonel bir epitopa isaret eden yüksek kaplama konsantrasyonlarinda insan a-sinükleinine tercihi baglanma gösterir.
NI-202.21Dll'in gücünü gösteren yari maksimum etkili konsantrasyon (ECSO), bir dogrudan d-sinüklein ELISA kullanilarak rekombinant d-sinüklein düsük ve yüksek kaplama konsantrasyonlari için belirlenmistir. Rekombinant NI- 202.21Dll'in bir ECSO ~200 pM ile yüksek afiniteli baglanmasi, d-sinüklein proteininin (20 ug/ ml) yüksek kaplama konsantrasyonlari için gözlenmistir. Daha düsük d-sinüklein konsantrasyonlarinda, afinitede keskin bir azalma gözlenmistir (Sekil 3). Bu özellikler, d-sinüklein C-terminal alanindaki bir epitopu. da saptayan, ticari olarak. temin edilebilen antikor sinZll'in kuvvetli bir karsitligidir. Bu bulgu, NI-202.21Dll'in, yüksek moleküler agirlikli d-sinüklein türlerinde bulunan gibi yüksek yogunluklu kosullar altinda olusturulmus veya buna maruz kalmis bir epitopu tercih ettigini göstermektedir. Örnek 3: Rekombinant NI-202.21D11 beyindeki patolojik «- sinüklein türlerine baglanir.
NI-202.21D11'in insan d-sinükleinine baglanmasi ayrica, d- sinüklein transgenik farelerden ve nöropatolojik olarak dogrulanmis bir sinükleinopatisi olan bir hastadan (Lewy Cisimcikli Demans) beyin kesitlerinin immünohistokimyasal boyanmasi ile karakterize edilmistir. NI-202.21D11, Lewy Cisimcigi ve Lewy Nevritinin insan d-sinüklein A53T'yi asiri eksprese eden transgenik farelerin beyin dokusundan Proteinaz K ile muamele edilmis parafin bölümleri üzerindeki inklüzyonlar gibi belirgin lekelenmesini gösterir (Sekil 4a). NI-202.21D11'in insan d-sinüklein için spesifik oldugunu destekleyen yabani tip farelerden alinan beyin bölümlerinde N1-202-21D11 boyamasi saptanmistir (Sekil 4b). NI-202.21D11 de Lewy Cisimcikli Demansa sahip bir hastanin insan beyin dokusunda patolojik d-sinüklein saptamistir (Sekil 40). Bu sonuçlar, insan kaynakli antikor NI- 202.21D11'in beyinde patolojik d-sinüklein tespit ettigini göstermektedir. Örnek 4: insandan türetilmis a-sinükleine özgü antikor NI- 202.21D11'in epitopunun, insan a-sinükleininin C-terminal alani içindeki bir epitopa haritalanmasi. d-sinüklein, üç alandan olusan 140 amino asit (aa) uzunlugunda, dogal halinde katlanmamis olan bir proteindir. Bunlar N-terminal amfipatik tekrar bölgesi (aa 1-60), merkez bölge (aa 61-95) ve baglanma alaninar iliskin› bir ilkr kavrayisir elde etmekr için, rekombinant d-sinüklein kesiklikleri, bir dogrudan ELISA'da NI- 96-140 kalintilarindan rekombinant d-sinüklein kesiklikleri, ELISA plakalari üzerinde kaplanmis ve daha sonra rekombinant NI- sadece NI-202.21D11'in d-sinükleinin C-terminal asidik alanina (Sekil Sa) baglandigini gösteren d-sinüklein kesiklikleri 61- 140 ve 96-140'ta gözlemlenmistir.
NI-202.21D11'in tanima dizisini daha ayrintili olarak anlamak için, NI-202.21D11, tüm insan d-sinüklein amino asit dizisini kapsayan, çakisan lineer 15-mer peptitlere baglanmasi için test edilmistir. Komsu peptitler, 11 kalintinin bir çakismasini paylasir ve peptitler, bir selüloz destek membranina C-terminal olarak tespit edilir. NI-202.21D11, üç örtüsen peptide, yani insan d-sinükleinine ait ve 117- . Bu sonuç, NI- 202.21D11 baglanmasi için gerekli olan d-sinüklein C-terminusu içinde minimal tanima dizisinin PVDPDNE oldugunu ortaya BO8 ve 509 peptidlerinden biraz daha az baglar. Böylece a- üzerinde etkili olabilir.
NI-202.21D11'in fare d-sinükleinine hemen hemen hiç bir baglantisi dogrudan bir ELISA'da görülmemistir (Sekil 2B). NI- belirlenmis epitop dizisinin ilgili murin dizisine (PVDPggE) göre sira dizilimi, D121 ve N122'nin, insan ve murin d-sinükleini için NI-202.21D11'in seçiciligi için anahtar amino asitler oldugunu göstermektedir. D121/ N122'nin anahtar rolünü teyit etmek için, rekombinant mutasyona ugramis insan d-sinüklein D121G / N1228 üretilmis ve dogrudan ELISA'da N1202.21D11 baglanmasi için test edilmistir. Sekil 5C'de gösterildigi gibi NI-202.21D11, agirlikli insan d-sinüklein ile karsilastirildiginda insan d-sinüklein D121G / N1228'ye neredeyse hiç baglanma göstermemistir. Sinüklein proteinlerinin esit olarak kaplanmasi için bir kontrol pan-sinüklein antikoru, normalizasyon kontrolü olarak kullanilmistir.
Bu sonuçlar, NI-202.21D11'in insan d-sinükleininde bir C- terminal epitopunu (kalinti 117-123) saptayan bir insan türevli d-sinüklein antikoru oldugunu ve D121/ N122 amino asitlerinin, insana karsi murin d-sinüklein seçiciligine katkida bulundugunu göstermistir.
DIZI LISTESI <110> Biogen Idec International Neuroscience GmbH University of Zurich WEIHOFEN, Andreas GRIMM, Jan HOCK, Christoph NITSCH, Roger WEINREB, Paul <120> ANTI-ALFA SINÜKLEIN BAGLAYICI MOLEKÜLLER <14l> <150> <151> <160> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 2159.353PC01 Bu sekilde Atanacak 61/500,580 2011-06-23 PatentIn versiyon 3.5 alfa-sinüklein <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> .'51 !I Ev faresi . Met. Lys A1 15 T'hr' (51 y TiyS alfa-sinüklein (3'. u Lys T":ir' Lys Tâîy TIe <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Tiyti :1U GIu fgîu beta-sinüklein A1::: (51 i: . 7.611.: (2-11: .'5 1 1.: 63'. u .'51 i.: (5'. n (51:: <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 1.315 gama-sinüklein A1::: 131.21 (31.11 7.611.: P 3] P. .'51 i.: NI-202.12F4-VHAlb ÇESITLI_ÖZELLIK ÇESITLI_ÖZELLIK îhr Lys SluVal GIri SerA1& VE.] Ser*?hr Val Sin <210> 5 <211> 113 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> <220> <221> <222> (3l)..(35) <223> TBBl <220> <221> <222> (50)..(68) <223> TBBZ (31 ;i (3'. n C- 1 ;I .'31 ;i (degisken agir zincir dizisi VHAlb) <220> <221> ÇESITLI_ÖZELLIK <222> <223> TBB3 <400> 5 fg'li; Va] .'51n Trp Met SerA1& Arg 'Ile Pro Va]LSJ Tyr teu <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Yapa <220> .3171 (101)..(102) <400> 6 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Yapay <220> <400> 7 Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala Pro 1 5 10 15 <210> 8 <211> 2 <212> PRT <213> Yapay <220> <400> 8 <210> 9 <211> 113 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> NI-202.12F4-VHAlb-GH (Germ Hatti Dizisi ile hizalanmis) <400> 9 1.01.: <210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> 1 :II 0 (51 1:. 1' h 1: NI-202.12F4-VLa1 ÇESITLIIÖZELLIK (23)..(33) ÇESITLI_ÖZELLIK (49)..(55) 1'31 I.` Me 1;. <220> <221> ÇESITLI_ÖZELLIK <222> <223> TBB3 <400> 10 Z'hr Ala <210> ll <2ll> ll <212> PRT <213> Yapay <220> (88)..(98) (5'. u <223> NI-202.12F4-VLal TBBl <400> ll 2.ei.: ~ (3:15 Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala His <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> NI-202.12F4-VLa1 TBB2 NI-202.12F4-VLa1 TBB3 Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr Glu Vai NI-202.12F4-VLa1-GH (Germ Hatti Dizisi ile hizalanmis) <210> <211> <212> <213> Yapay <220> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> Tlir Ghz Pro ?ro Gly fâ'ly 'Hzr ByS ÇESITLI_ÖZELLIK (31)..(35) ÇESITLI_ÖZELLIK (50)..(66) ÇESITLIIÖZELLIK <222> <400> 15 1 1:. Ve. 1 Ala Met. .'51 y Tf'p (5] r: Asp Met. CLii <210> 16 <211> 5 <212> PRT .'51 n <213> Yapay <220> (99)..(113) <223> TBB3 A1::: G 1 1.: <223> NI-ZOZ . 21D11-VH TBBl <400> 16 (51 11 Ser 'T'î'ir T1e Val 'i'yr '_y_Let. Ser' Met. <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Yapay <220> <400> 17 Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Lys Arg Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Yapay <220> <400> 18 Glu Giu Asp His Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Ser Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 19 <211> 372 <212> DNA <213> Yapay <220> <400> 19 Z;fif]-IiLfJ-Iiii;:' ETI'IIZ;I]Z]I.ifI.\A ;:;' i).i.ii;r;' î <210> 20 <211> 124 <2l2> PRT <213> Yapay <220> <223> NI-202.21Dll-VH-GH (Germ Hatti Dizisine göre düzeltildi) <400> 20 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 21 4...' NI-202.21D11-VH-GH ..::':Jtsi'jiyi Alf." f (1 ;i f ° ::i-”ri- <210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <22l> <222> <223> <400> NI-202.21Dll-VK ÇESITLI_ÖZELLIK (26).. (40) ÇESITLI_ÖZELLIK (56)..(63) ÇESITLI_ÖZELLIK (95)..(103) <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Yapay <220> Me 1:. (3] r: (513( <400> 23 13'. y 1_ c 11 .'51 :i Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu <2lO> 24 <211> 7 <212> <213> <220> <223> <400> NI-202.21D11-VK TBBZ <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> NI-202.21D11-VK TBB3 Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr <210> <211> <212> <213> <220> <223> NI-202.21Dll-VK-GH (Germ Hatti Dizisine göre düzeltilmistir) <400> Pro .Ays <210> 27 <2ll> 339 <212> DNA <213> Yapay <220> Me 1:. (_1 ;1' <223> NI-202.21Dll-VK-GH <400> 27 51'_ :RIJICIIIC A553 Va . <2lO> <211> <212> <213> <220> <223>

Claims (1)

ISTEMLER d-sinükleine (DIZI KIM. NO:
1) baglanan izole edilmis bir antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; buradaki antikor veya bunun antijen baglayici fragmaninin (i) DIZI KIM. NO: 16 ile özdes olan bir TBBl bölgesini; (ii) DIZI KIM. NO: 17 ile özdes olan bir TBB2 bölgesini; ve (iii) DIZI KIM. NO: 18 ile özdes olan bir TBB3 bölgesini içeren VH tamamlayicilik belirleme bölgeleri (TBB'ler) l, 2 ve 3'ü içeren bir agir zincir degisken bölgesini (i) DIZI KIM NO: 23 ile özdes olan bir TBBl bölgesini; (ii) DIZI KIM NO: 24 ile özdes olan bir TBB2 bölgesini; ve (iii) DIZI KIM NO: 25 ile özdes olan bir TBB3 bölgesini içeren VL TBB'leri 1, 2 ve 3'ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini (VL) içeriyor olmasidir. Istem› 1'e göre antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; (a) VH dizisi DIZI KIM. NO: 15 ve VL dizisi DIZI KIM. NO: 22'yi; veya (b) VH dizisi DIZI KIM. NO: 20 ve VL dizisi DIZI KIM. NO: 26'yi içeriyor olmasidir. Istem 1 veya Z'ye göre antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; bunun (i) insanlastirilmis; kimerik veya tamamen insan; (ii) bir Fab fragmani, bir Fab' fragmani, bir F(ab)2 fragmani, bir tek Zincirli FV fragmani veya bir tek Zincirli antikor olmasi; ve/ veya (iii) ayrica buna kaynasik bir heterolog polipeptid içeriyor olmasidir. Istem.l ila 3'ten herhangi birine göre antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; burada antikor veya bunun antijen baglayici fragmaninin bir terapötik ajan, bir ön ilaç, bir peptit, bir protein, bir enzim, bir Virüs, bir lipit, bir biyolojik tepki modifiye edicisi, bir farmasötik ajan ve polietilen glikolden (PEG) olusan gruptan seçilen bir ajana konjuge ediliyor olmasidir. Bir farmasötik bilesim olup, özelligi; istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre olan antikor veya bunun antijen baglayici fragmanini ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyiciyi içeriyor olmasidir. Izole edilmis polinükleotit veya polinükleotitler olup, özelligi; istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre olan antikor veya bunun antijen baglayici fragmanini kodlayan nükleik asidi veya nükleik asitleri içeriyor olmasidir. Vektör veya vektörler olup, Özelligi; istem 6'ya göre olan polinükleotit veya polinükleotitleri içeriyor olmasidir. (i) istem 6'ya göre olan polinükleotit veya polinükleotitleri veya istem 7'ye göre olan vektör veya vektörleri; veya (ii) en az bir birinci ve bir ikinci vektörü içeren bir konakçi hücre olup, özelligi; buradaki birinci vektörün VH'yi kodlayan, istem 6'ya göre olan polinükleotiti içeriyor olmasi ve burada söz konusu ikinci vektörün, antikorun veya bunun antijen baglayici fragmaninin VL'sini kodlayan, istem 6'ya göre olan polinükleotidi içeriyor olmasidir. Bir anti-insan d-sinüklein antikoru veya bunun antijen baglayici fragmaninin üretilmesi için bir yöntem olup, özelligi; istem 8'e göre olan konakçi hücrenin kültürlenmesini ve antikorun veya bunun antijen baglayici fragmaninin hücre kültüründen geri kazanilmasini içeriyor olmasidir. Bir anti-insan d-sinüklein antikoru veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; istem 9'a göre olan yönteme göre üretiliyor olmasidir. Istemler 1 ila 4 veya lO'a göre antikor veya bunun antijen baglayici fragmani, istem 5'e göre farmasötik bilesim, istem 6'ya göre polinükleotit, istem 7'ye göre vektör veya istem 8'e göre konakçi hücre olup, özelligi; bir denekte sinükleinopatik bir hastaligin tedavisinde veya önlenmesinde kullanim için olmasidir. Bir denekte sinükleinopatik bir hastaligi teshis etmek (a) istemler 1 ila 4 veya lO'dan herhangi birine ait antikor veya bunun antijen baglayici fragmani ile teshis edilecek bir denekte a-sinüklein düzeyini, lokalizasyonunu, konformasyonunu veya bunlarin bir kombinasyonunu degerlendirmeyi ve (b) bir veya daha fazla kontrol numunesinden türetilen bir veya daha fazla referans standardina göre denekte d-sinüklein seviyesini, lokalizasyonunu, konformasyonunu veya bunlarin kombinasyonunu karsilastirmayi, içeren in vitro bir yöntem olup, Özelligi; burada, denekteki d-sinüklein seviyesi, lokalizasyonu, konformasyonu veya bunlarin kombinasyonu ile referans standardi arasindaki bir farklilik veya benzerligin, denegin bir sinükleinopatik hastaliga sahip olup olmadigini gösteriyor olmasidir. Istem ll'e göre kullanim için antikor veya bunun antijen baglayici fragmani veya istem lZ'ye göre yöntem olup, özelligi; burada sinükleinopatik hastaligin Parkinson hastaligi (PH), Lewy cisimcikli demans (LCD), çoklu sistem, atrofisi (ÇSA) veya bunlarin bir kombinasyonu olmasi ve/ veya burada denegin bir memeli olmasi, tercihen burada memelinin bir insan olmasidir. Bir denekte sinükleinopatik bir hastaligin teshisi için (a) istemler 1 ila 4 veya lO'dan herhangi birine ait antikor veya bunun antijen baglayici fragmani ile teshis edilecek bir denekte -sinüklein düzeyini, lokalizasyonunu, konformasyonunu veya bunlarin bir kombinasyonunu degerlendirmeyi ve (b) bir veya daha fazla kontrol numunesinden türetilen bir veya daha fazla referans standardina göre denekte d-sinüklein seviyesini, lokalizasyonunu, konformasyonunu veya bunlarin kombinasyonunu karsilastirmayi, içeren bir yöntemde kullanim için istem 1 ila 4 veya 10'dan herhangi birine ait antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; burada, denekteki d-sinüklein seviyesi, lokalizasyonu, konformasyonu veya bunlarin kombinasyonu ile referans standardi arasindaki bir farklilik veya benzerligin, denegin bir sinükleinopatik hastaliga sahip olup olmadigini gösteriyor olmasi, burada sinükleinopatik hastaligin Parkinson hastaligi (PH), Lewy cisimcikli demans (LCD), çoklu sistem atrofisi (ÇSA) veya bunlarin bir kombinasyonu olmasi ve/ veya burada denegin bir* memeli olmasi, tercihen burada memelinin bir insan olmasidir. Istem 14'e göre antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; burada, denekteki d-sinüklein seviyesi, lokalizasyonu, konformasyonu veya bunlarin kombinasyonunun in vivo görüntüleme ile ölçülüyor olmasi, tercihen burada in Vivo görüntülemenin, pozitron emisyon tomografisi (PET), tek foton emisyon tomografisi (SPECT), yakin kizilötesi (NIR), optik görüntüleme veya manyetik rezonans görüntülemeyi (MRI) içeriyor olmasidir.
TR2018/15563T 2011-06-23 2012-06-22 Anti-alfa sinüklein bağlayıcı moleküller. TR201815563T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161500580P 2011-06-23 2011-06-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201815563T4 true TR201815563T4 (tr) 2018-11-21

Family

ID=47422964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/15563T TR201815563T4 (tr) 2011-06-23 2012-06-22 Anti-alfa sinüklein bağlayıcı moleküller.

Country Status (23)

Country Link
US (3) US9580493B2 (tr)
EP (1) EP2723379B1 (tr)
JP (2) JP2014528695A (tr)
KR (1) KR101976887B1 (tr)
CN (1) CN103796679B (tr)
AU (1) AU2012272790B2 (tr)
BR (1) BR112013033258B1 (tr)
CA (1) CA2839563C (tr)
CY (1) CY1121392T1 (tr)
DK (1) DK2723379T3 (tr)
EA (1) EA030777B9 (tr)
ES (1) ES2699801T3 (tr)
HR (1) HRP20181553T1 (tr)
HU (1) HUE041391T2 (tr)
IL (1) IL230028B (tr)
LT (1) LT2723379T (tr)
MX (1) MX357193B (tr)
PL (1) PL2723379T3 (tr)
PT (1) PT2723379T (tr)
SI (1) SI2723379T1 (tr)
TR (1) TR201815563T4 (tr)
WO (1) WO2012177972A1 (tr)
ZA (1) ZA201309623B (tr)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2949666B1 (en) 2008-12-19 2018-12-19 Biogen International Neuroscience GmbH Human anti-alpha-synuclein antibodies
AU2012272790B2 (en) 2011-06-23 2016-10-06 Biogen International Neuroscience Gmbh Anti-alpha synuclein binding molecules
US9534044B2 (en) * 2013-02-28 2017-01-03 United Arab Emirates University Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
EP2970378B1 (en) 2013-03-15 2021-05-26 Biogen MA Inc. Hydrophobic interaction protein chromatography under no-salt conditions
US10214592B2 (en) 2014-08-22 2019-02-26 Nitto Boseki Co., Ltd. Protein assay method specific to TRACP-5b (tartrate resistant acid phosphatase 5b)
CN107074938A (zh) 2014-10-16 2017-08-18 豪夫迈·罗氏有限公司 抗‑α‑突触核蛋白抗体和使用方法
GB201512203D0 (en) * 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
US11340225B2 (en) 2016-03-14 2022-05-24 Biogen International Neuroscience Gmbh Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis assay for reliably measuring uptake of aggregated proteins
AU2017272804B2 (en) 2016-06-02 2023-11-23 Medimmune Limited Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
MA45715A (fr) 2016-07-25 2019-05-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-hspa5 (grp78) et leurs utilisations
WO2018091444A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy
US11325968B2 (en) 2016-12-16 2022-05-10 H. Lundbeck A/S Alpha-synuclein antibodies
MA47163A (fr) 2016-12-16 2019-11-06 Biogen Ma Inc Facteur 11 de différenciation de croissance activé protéolytiquement stabilisé
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
JP2018109560A (ja) 2017-01-04 2018-07-12 オムロンオートモーティブエレクトロニクス株式会社 走査式距離測定装置
WO2018151821A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
JOP20190227A1 (ar) * 2017-03-31 2019-09-30 Biogen Int Neuroscience Gmbh تركيبات وطرق لعلاج اعتلالات السينوكلين
WO2018237338A1 (en) * 2017-06-23 2018-12-27 Denali Therapeutics Inc. ANTI-ALPHA-SYNCUCIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
EP3661961A4 (en) * 2017-08-02 2021-04-14 Stressmarq Biosciences Inc. ANTIBODIES BINDING TO ACTIVE ALPHA-SYNUCLEIN
US11155608B2 (en) 2017-08-23 2021-10-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies against pathological alpha-synuclein, and methods using same
AU2017434556A1 (en) * 2017-09-28 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing regimes for treatment of synucleinopathies
AU2018370279B2 (en) * 2017-11-17 2022-11-03 Abl Bio Inc. Antibodies to a-synuclein and uses thereof
GB201720970D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201720975D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
US20220018851A1 (en) 2018-08-09 2022-01-20 Hoffmann-La Roche Inc. Determination of parkinson's disease
KR20210111242A (ko) 2018-10-29 2021-09-10 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 혈액 뇌 장벽 수송을 향상시키기 위한 인간화 및 안정화된 fc5 변이체
TWI734279B (zh) * 2018-12-14 2021-07-21 美商美國禮來大藥廠 抗α-突觸核蛋白抗體及其用途
AU2019456113A1 (en) * 2019-07-11 2022-03-03 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Tetravalent symmetric bispecific antibody
NL2025332B1 (en) * 2020-04-10 2021-10-26 Syngle Therapeutics B V Novel alpha-synuclein binding antibodies, or antigen binding portions thereof.
KR20230005172A (ko) 2020-04-24 2023-01-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 설프히드릴 화합물 및 이의 유도체를 사용한 효소 및 경로 조절
US11339212B2 (en) * 2020-06-26 2022-05-24 Bioarctic Ab α-synuclein protofibril-binding antibodies
CN112920274A (zh) * 2021-03-17 2021-06-08 江苏贝格尔生物医药有限公司 一种检测alpha-synuclein蛋白的鼠单克隆抗体及其应用
WO2023099788A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Neurimmune Ag Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
CN117106081B (zh) * 2023-09-28 2024-05-07 北京凯祥弘康生物科技有限公司 一种抗nfl蛋白的捕获抗体

Family Cites Families (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
WO1988009344A1 (en) 1987-05-21 1988-12-01 Creative Biomolecules, Inc. Targeted multifunctional proteins
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP0362371A4 (en) 1988-04-15 1990-10-24 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
ATE120454T1 (de) 1988-06-14 1995-04-15 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
AU654811B2 (en) 1990-03-20 1994-11-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
JPH09506761A (ja) 1990-11-09 1997-07-08 ステファン ディー．ギリーズ サイトカインの免疫複合体
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
FR2686087A1 (fr) 1992-01-13 1993-07-16 Inst Nat Sante Rech Med Nouvel antigene lymphocytaire, anticorps correspondant et leurs applications.
AU675661B2 (en) 1992-07-24 1997-02-13 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
ATE236987T1 (de) 1992-11-13 2003-04-15 Idec Pharma Corp Konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier- exprimierung
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5676950A (en) 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
DE69525544T2 (de) 1994-11-18 2002-08-22 Neurocrine Biosciences Inc Peptidanaloga des menschlichen myelinbasischen proteins mit substitution in position 91 zur behandlung von multipler sklerose
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
RO120148B1 (ro) 1997-03-14 2005-09-30 Idec Pharmaceuticals Corporation Sistem vector şi procedeu de inserţie a unui fragment adn, în genomul celulelor de mamifere
EP0994728B1 (en) 1997-04-09 2008-07-30 Intellect Neurosciences, Inc. Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, dna encoding and methods of use thereof
US8173127B2 (en) 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US20020086847A1 (en) 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US6703015B1 (en) 1999-09-03 2004-03-09 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Filamentous bacteriophage displaying an β-amyloid epitope
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6905686B1 (en) 1997-12-02 2005-06-14 Neuralab Limited Active immunization for treatment of alzheimer's disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6710226B1 (en) 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
US7462605B2 (en) 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
WO1999050300A1 (en) 1998-03-30 1999-10-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of identifying, diagnosing and treating synuclein positive neurodegenerative disorders
WO2000030680A1 (en) 1998-11-23 2000-06-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Tumor antigen-specific antibody-gp39 chimeric protein constructs
WO2000034317A2 (en) 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
CA2274414A1 (en) 1999-06-11 2000-12-11 Universite Laval Dietary fish protein for use in restoring normal insulin function insulin-resistant individuals
US6919075B1 (en) 1999-09-03 2005-07-19 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Bacteriophage displaying aβ epitopes and method of use
US6713058B2 (en) 1999-09-14 2004-03-30 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for alleviating symptoms associated with neuropathic conditions comprising administration of low levels of antibodies
US6187309B1 (en) 1999-09-14 2001-02-13 Milkaus Laboratory, Inc. Method for treatment of symptoms of central nervous system disorders
US6436401B1 (en) 1999-09-14 2002-08-20 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for alleviating symptoms associated with diabetes and diabetic neuropathy comprising administration of low levels of antibodies
US6294171B2 (en) 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
DE60140252D1 (de) 2000-06-22 2009-12-03 Genentech Inc Agonistische monoklonale antikörper gegen trkc
WO2002003911A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
EP1340088B1 (en) 2000-11-17 2007-01-17 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US7319139B2 (en) 2001-01-29 2008-01-15 Biogen Idec, Inc. TAG-72 specific CH2 domain deleted antibodies
EP1373321A2 (en) 2001-01-29 2004-01-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Modified antibodies and methods of use
ITPV20010007U1 (it) 2001-07-19 2003-01-19 Maruscia Food Specialties Comp Contenitore per profilattico nuovo e usato
PT1944040E (pt) 2001-08-17 2012-10-31 Univ Washington Método de avaliação para a doença de alzheimer
US7414111B2 (en) 2001-09-19 2008-08-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered templates and their use in single primer amplification
US20030157641A1 (en) 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
GB0203446D0 (en) 2002-02-14 2002-04-03 Univ Lancaster Detection and/or monitoring of synuclein-related diseases
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20110200609A1 (en) 2002-09-12 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies specific for pathological amyloid aggregates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
JP4690046B2 (ja) 2002-11-22 2011-06-01 中外製薬株式会社 病巣組織に対する抗体
AU2003276107A1 (en) 2003-04-24 2004-11-19 Universitat Zurich Method of monitoring immunotherapy
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
WO2005018424A2 (en) 2003-08-18 2005-03-03 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Antibodies specific for fibrillar amyloid and a procedure to detect fibrillar amyloid deposits
AU2004266159A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
US20070031416A1 (en) 2003-09-09 2007-02-08 Takeda Pharmaceutical Company Limited Use of antibody
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
CA2556436C (en) 2004-02-23 2014-04-01 Eli Lilly And Company Process for preparing anti-a.beta. antibody
US7763249B2 (en) 2004-04-27 2010-07-27 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Human anti-amyloid β peptide antibody and fragment of said antibody
DE602005022871D1 (de) 2004-06-07 2010-09-23 Univ Ramot Verfahren zur passiven immunisierung gegen eine durch amyloidaggregation gekennzeichnete krankheit oder erkrankung mit vermindertem nervenentzündungsrisiko
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
EA013752B1 (ru) 2004-08-09 2010-06-30 Элан Фармасьютикалз, Инк. Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
WO2006050041A2 (en) 2004-10-28 2006-05-11 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Methods for reducing or inhibiting brain inflammation or for promoting neurogenesis
EP1838854B1 (en) 2004-12-15 2012-10-31 Janssen Alzheimer Immunotherapy Antibodies that recognize Beta Amyloid Peptide
WO2006066171A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Amyloid βετα antibodies for use in improving cognition
DE602006012459D1 (de) 2005-03-05 2010-04-08 Abbott Gmbh & Co Kg Screening-verfahren, verfahren zur aufreinigung nichtdiffundierbarer a-beta-oligomere, selektive antikörper gegen diese nichtdiffundierbaren a-beta-oligomere und verfahren zur herstellung dieser antikörper
JP2006265189A (ja) 2005-03-24 2006-10-05 Kyoto Univ βアミロイドペプチド、及びそれを用いたアルツハイマー病治療薬又は予防薬のスクリーニング方法
ES2318918B1 (es) 2005-04-01 2010-02-16 Biotherapix Molecular Medicines, S.L.U. Anticuerpos humanos con capacidad de union al peptido beta-amiloide y sus aplicaciones.
WO2006116192A2 (en) 2005-04-21 2006-11-02 Medarex, Inc. Irta-1 antibodies and their uses
UY29504A1 (es) 2005-04-29 2006-10-31 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el péptido amiloide beta y métodos que utilizan los mismos.
ITMI20050912A1 (it) 2005-05-19 2006-11-20 Erregierre Spa Processo di preparazione di acidi 3-a-ya(b)-diidrossi-6-a(b)-alchil-5b-colanici
CA2657953A1 (en) * 2005-07-19 2007-01-25 University Of Rochester Alpha-synuclein antibodies and methods related thereto
WO2007021255A1 (en) * 2005-08-09 2007-02-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
AU2006347287A1 (en) 2005-11-14 2008-02-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Imaging correlates of neurogenesis with MRI
AU2006318537A1 (en) 2005-11-22 2007-05-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antibody treatment of Alzheimer's and related diseases
EP1963363A2 (en) 2005-11-30 2008-09-03 Abbott Laboratories Methods of preparation of recombinant forms of human beta-amyloid protein and uses of these proteins
SG2014013437A (en) 2005-11-30 2014-07-30 Abbott Lab Monoclonal antibodies and uses thereof
RU2442793C2 (ru) 2005-11-30 2012-02-20 Эбботт Лэборетриз АНТИТЕЛА ПРОТИВ ГЛОБУЛОМЕРА Аβ, ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ЧАСТИ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ГИБРИДОМЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОРЫ, КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ, КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННЫЕ АНТИТЕЛА, ПРИМЕНЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ
MX2008007477A (es) 2005-12-12 2008-09-03 Ac Immune Sa Anticuerpos monoclonales especificos 1-42 beta con propiedades terapeuticas.
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EA029481B1 (ru) 2007-01-05 2018-04-30 Юнивэсэти Оф Цюрих Способ получения человеческого рекомбинантного антитела, специфично связывающего вариант эндогенного белка, формирующий аномальные патологические белковые структуры путем агрегации, олигомеризации или образования фибрилл
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
PL2118300T3 (pl) 2007-02-23 2015-11-30 Prothena Biosciences Ltd Zapobieganie i leczenie synukleinopatii i amyloidozy
WO2008110372A1 (en) 2007-03-13 2008-09-18 University Of Zurich Monoclonal human tumor-specific antibody
CA2684323A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of cerebral amyloid angiopathy
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
CN101778867A (zh) * 2007-06-08 2010-07-14 地中海大学 用于治疗胰腺肿瘤的组合物和方法
ES2498040T3 (es) 2007-07-27 2014-09-24 Janssen Alzheimer Immunotherapy Tratamiento de enfermedades amiloidogénicas con anticuerpos anti-beta humanizados
JP2010536907A (ja) 2007-08-31 2010-12-02 ニューリミューン セラピューティクス エイジー 患者にアミロイドーシスおよびタンパク質凝集性障害における特異的免疫応答をもたらす方法
EP2185592B1 (en) 2007-09-13 2013-01-23 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
EP2207809B1 (en) * 2007-09-26 2013-07-03 U3 Pharma GmbH Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor antigen binding proteins
EP2210901A4 (en) 2007-10-19 2012-04-25 Immunas Pharma Inc ANTIBODY CAPABLE OF BINDING SPECIFICALLY TO OLIGOMER A, AND USE THEREOF
GB0720912D0 (en) 2007-10-25 2007-12-05 Univ Cardiff Monoclonal Anitbody for APP
CN101883792B (zh) 2007-10-29 2014-08-27 基因创新有限公司 特异于β-淀粉状蛋白肽的新抗体以及其用作诊断剂或药物的用途
CA2705582A1 (en) 2007-11-16 2009-05-22 The Rockefeller University Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
US8414893B2 (en) * 2007-12-21 2013-04-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
AT506535B1 (de) 2008-02-22 2010-04-15 Affiris Forschungs & Entwicklungs Gmbh Vaccine enthaltend alpha-synuclein-mimotope auf basis von peptiden
WO2009133521A2 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Bioartic Neuroscience Ab Antibodies and vaccines for use in therapeutic and diagnostic methods for alpha-synuclein-related disorders
CA2730073A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 University Of Zurich Method of promoting neurogenesis
BRPI0918555A2 (pt) * 2008-09-19 2016-05-03 Medimmune Llc anticorpo, composição, molécula de ácido nucleico, método de tratamento de um tumor maligno em um animal, e, uso da composição.
WO2010057020A2 (en) 2008-11-13 2010-05-20 Modgene, Llc Modification of amyloid-beta load in non-brain tissue
EP2949666B1 (en) 2008-12-19 2018-12-19 Biogen International Neuroscience GmbH Human anti-alpha-synuclein antibodies
JP5015984B2 (ja) * 2009-03-18 2012-09-05 株式会社コナミデジタルエンタテインメント ゲームサーバ、ゲームシステム、ゲーム装置、巡回地点更新方法、および、プログラム
US20100256596A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Cabochon Aesthetics, Inc. Fiber growth promoting implants for reducing the appearance of cellulite
EP2419447B1 (en) 2009-04-17 2017-08-23 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
US8613924B2 (en) 2009-08-06 2013-12-24 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to A beta oligomers and use thereof
JP5769316B2 (ja) 2009-08-06 2015-08-26 イムナス・ファーマ株式会社 Ａβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
US8378061B2 (en) 2009-09-02 2013-02-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Polyester films with improved oil repellency
AU2012272790B2 (en) 2011-06-23 2016-10-06 Biogen International Neuroscience Gmbh Anti-alpha synuclein binding molecules
CN107091931A (zh) 2011-11-02 2017-08-25 生物国际神经***科学公司 抗α‑共核蛋白抗体诊断脑中的α‑共核蛋白的升高水平的用途
ITRM20120383A1 (it) 2012-03-20 2013-09-21 Uni Degli Studi Di Milano B Icocca Metodo e kit per la rivelazione di anticorpi.

Also Published As

Publication number Publication date
EA030777B1 (ru) 2018-09-28
PT2723379T (pt) 2018-11-14
MX2014000054A (es) 2014-05-01
JP2017000160A (ja) 2017-01-05
BR112013033258A2 (pt) 2017-03-01
AU2012272790B2 (en) 2016-10-06
DK2723379T3 (en) 2018-10-15
CA2839563C (en) 2019-10-29
HUE041391T2 (hu) 2019-05-28
EP2723379A4 (en) 2015-03-04
EP2723379A1 (en) 2014-04-30
US9580493B2 (en) 2017-02-28
HRP20181553T1 (hr) 2018-11-30
US20180355027A1 (en) 2018-12-13
PL2723379T3 (pl) 2019-05-31
EA030777B9 (ru) 2019-02-28
US9975947B2 (en) 2018-05-22
US20140369940A1 (en) 2014-12-18
CN103796679B (zh) 2016-10-19
ES2699801T3 (es) 2019-02-12
NZ618914A (en) 2015-12-24
AU2012272790A1 (en) 2013-05-09
JP6302517B2 (ja) 2018-03-28
BR112013033258B1 (pt) 2022-09-20
EP2723379B1 (en) 2018-09-12
KR101976887B1 (ko) 2019-05-09
CY1121392T1 (el) 2020-05-29
EA201391761A1 (ru) 2014-09-30
US10301381B2 (en) 2019-05-28
BR112013033258A8 (pt) 2018-04-03
JP2014528695A (ja) 2014-10-30
CN103796679A (zh) 2014-05-14
ZA201309623B (en) 2014-08-27
MX357193B (es) 2018-06-29
US20170233463A1 (en) 2017-08-17
WO2012177972A1 (en) 2012-12-27
KR20140053974A (ko) 2014-05-08
SI2723379T1 (sl) 2019-03-29
LT2723379T (lt) 2018-10-25
IL230028B (en) 2018-06-28
CA2839563A1 (en) 2012-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10703808B2 (en) Human anti-alpha-synuclein antibodies
JP6841449B2 (ja) トランスサイレチン（ｔｔｒ）アミロイドーシスに対する抗体療法及びそのためのヒト由来抗体
US10301381B2 (en) Anti-alpha synuclein binding molecules
CN108064248B (zh) 人源抗二肽重复(dpr)抗体
TR201812636T4 (tr) İnsan anti-tau antikorları.
CN107074937B (zh) 人源抗亨廷顿蛋白(htt)抗体及其用途
US11542322B2 (en) Nano-theranostics for Parkinson&#39;s disease
NZ618914B2 (en) Anti-alpha synuclein binding molecules