CN102724997A - 在原核细胞中产生免疫原性多糖的生物合成*** - Google Patents

在原核细胞中产生免疫原性多糖的生物合成*** Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含N-糖基化蛋白的生物缀合物疫苗。此外，本发明涉及一种重组原核生物合成***，包含编码差向异构酶的核酸，该差向异构酶合成在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的寡糖或多糖。本发明还涉及含有在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的寡糖或多糖的N-糖基化蛋白及用于产生这类N-糖基化蛋白的表达***和方法。

Description

在原核细胞中产生免疫原性多糖的生物合成***
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求于2009年11月19日提交的美国临时专利申请第61/272,931号的权益，该美国临时专利申请通过引用其全部结合到本文中。
发明领域
本发明涉及生物合成***和蛋白质在制备疫苗中的应用。另外，本发明涉及重组原核生物合成***，该***具有启动在还原末端具有特定单糖的寡糖或多糖(oligo- or polysaccharide)的合成的差向异构酶。本发明还涉及在表达***中用聚糖产生的N-糖基化蛋白及由包含免疫原性聚糖的所述N-糖基化蛋白制成的生物缀合物疫苗（bioconjugate vaccines），并且提供用于产生N-糖基化蛋白的方法。
发明背景
糖蛋白是具有一个或多个共价连接的糖聚合体的蛋白质。N-联蛋白质糖基化是在真核生物的内质网中发生的一种必需和保守的过程。它对于分泌蛋白和膜蛋白的蛋白质折叠、寡聚化、稳定性、质量控制、分选(sorting)和转运来说是十分重要的(Helenius,A.和Aebi,M.(2004).Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum(N-联聚糖在内质网中的作用).Annu.Rev.Biochem.73,1019-1049)。
蛋白质糖基化对于蛋白质的免疫原性、稳定性和半寿期具有深远的影响。另外，糖基化可有助于蛋白质的纯化，即利用与固相结合并与蛋白质的糖基化部分相互作用的凝集素配体进行层析(例如亲和层析)来纯化蛋白质。因此，为了提供生物学和药学上有用的糖基化模式，惯例是在真核细胞中重组产生许多糖基化蛋白。
WO 2003/07467(Aebi等人)证明了经食物传播的病原体空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(它是一种细菌)可以使其蛋白质N-糖基化，除了古生菌(archaea)的某些种以外，在已知的原核生物中，这是一种独特的特征。糖基化所需要的机器由12个基因编码，这12个基因在所谓的pgl基因座中是成簇的。N-糖基化的破坏会影响空肠弯曲杆菌(C.jejuni)的侵袭和致病机制但并不是致死的，正如在大多数真核生物中(Burda P.和M.Aebi,(1999).The dolichol pathway of N-linkedglycosylation(N-联糖基化的多萜醇途径).Biochem Biophys Acta1426(2):239-57)。在大肠杆菌(E.coli)中通过同时重组表达pgl基因座和受体糖蛋白来重建空肠弯曲杆菌蛋白的N-糖基化是可能的(Wacker等人(2002).N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and itsfunctional transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-联糖基化及其功能性转移到大肠杆菌中).Science 298,1790-1793)。
N-聚糖具有一种与蛋白质中的共有序列连接的聚糖。蛋白质中已知的N-糖基化共有序列允许原核生物中重组靶蛋白的N-糖基化。这类生物体包含寡糖基转移酶(“OT”;“OTase”)，例如空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶，寡糖基转移酶是一种将聚糖转移到蛋白质的共有序列上的酶。
WO 2003/07467(Aebi等人)教导了一种被导入了编码以下(i)、(ii)和(iii)的核酸的原核生物：(i)在脂质载体上装配寡糖的特定糖基转移酶，(ii)包含共有序列“N-X-S/T”的重组靶蛋白，其中X可以为除脯氨酸以外的任何氨基酸，和(iii)寡糖基转移酶，例如将所述寡糖与靶蛋白的共有序列共价连接的空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶。所述原核生物产生具有由特定糖基转移酶类型限定的特定结构的N-聚糖。
WO 2006/119987(Aebi等人)描述了用于在原核生物体内(in vivo)高效N-糖基化的蛋白质，以及高效产生N-糖基化蛋白质的手段(means)和方法。它进一步描述了将N-聚糖有效引入到重组蛋白中以改变所述蛋白的免疫原性、稳定性、生物活性、预防和/或治疗活性，并且提供了在其表面有效地展示本发明的重组N-糖基化蛋白的宿主细胞。另外，它描述了一种重组N-糖基化蛋白，其包含以下N-糖基化最优化氨基酸序列中的一个或多个：
D/E-X-N-Z-S/T(最优化共有序列),
其中X和Z可以为除Pro以外的任何天然氨基酸，并且其中所述N-糖基化部分氨基酸序列中的至少一个被引入。将特定部分氨基酸序列(最优化共有序列)引入到蛋白质会导致产生在这些引入的位置中被寡糖基转移酶有效地N-糖基化的蛋白质。
不同多糖的生物合成在细菌细胞中是保守的。多糖在载体脂质(carrier lipid)上从细胞质膜上的共同前体(活化糖核苷酸)由具有确定特异性的不同糖基转移酶进行装配。脂多糖(“LPS”)仅在革兰氏阴性菌例如志贺氏菌(Shigella spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和大肠杆菌(E.coli)(ExPEC,EHEC)中提供。
LPS的合成始于在膜的细胞质一侧将单糖添加到载体脂质十一异戊二烯基磷酸(undecaprenyl phosphate,“Und-P-P”)上。通过不同糖基转移酶序贯添加来自活化糖核苷酸的单糖构建抗原，而脂质-连接的多糖通过翻转酶(flippase)穿过膜转向。抗原-重复单位通过酶反应进行聚合。然后多糖通过连接酶(Ligase)WaaL转移到脂质A，形成LPS，再输出到表面，而荚膜多糖在聚合后从载体脂质中释放出来并输出到表面。这些多糖的生物合成途径使得LPS生物缀合物能够在体内(invivo)产生，俘获周质中的多糖到蛋白载体。
寡糖或多糖(即糖残基)和蛋白(即蛋白载体)的这类合成复合物可以用作缀合物疫苗以抵抗多种细菌感染。缀合物疫苗已经成功地用于抵抗细菌感染。抗原性多糖与蛋白载体的缀合需要保护性记忆应答，因为多糖是不依赖T-细胞的免疫原。利用多糖以及蛋白载体中的活化反应基团，通过不同的化学方法已经使多糖与蛋白载体缀合。
缀合物疫苗可以给予儿童以抵抗细菌感染并且也可以给成年人提供长时间持续的免疫应答。WO 2009/104074(Fernandez等人)的构建体已经发现在动物中产生IgG应答。在人类中，已经发现针对志贺氏菌属O-特异性多糖-蛋白缀合物疫苗的IgG应答与人体内的免疫保护有关(Passwell,J.H.等人,“Safety and Immunogenicity of ImprovedShigella O-Specific Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccines in Adultsin Israel(改进的志贺氏菌属O-特异性多糖-蛋白缀合物疫苗在以色列成年人中的安全性和免疫原性)”Infection and Immunity,69(3):1351-1357(2001年3月))。据信多糖(即糖残基)触发糖特异性的短期免疫应答。事实上，人体的免疫***对细菌的特定多糖表面结构例如O-抗原和荚膜多糖会产生强烈应答。然而，由于对多糖的免疫应答是依赖IgM的，因此免疫***不产生记忆。携带多糖的蛋白载体能触发IgG应答，IgG应答是依赖T-细胞的并提供长时间持续的保护作用，因为免疫***产生了记忆。
大肠杆菌O157是一种引起溶血性尿毒综合征所有当前病例三分之二左右的肠出血性菌株并造成严重的人类健康担忧(Law,D.(2000)J.App.Microbiol.,88,729-745;Wang,L.和Reeves,P.R.(1998)Infect.Immun.66,3545-3551)。
大肠杆菌菌株O157(Escherichia coli strain O157)产生含有重复四糖单元(4-N-乙酰基 perosamine→岩藻糖→葡萄糖→GalNAc)(α-D-PerNAc-α-L-Fuc-β-D-Glc-α-D-GalNAc)的O-抗原(Perry,M.B.,MacLean,L.和Griffith,D.W.(1986)Biochem.Cell.Biol.,64,21-28)。该四糖在十一异戊二烯基焦磷酸上预装配。大肠杆菌细胞被膜含有内浆膜即带有应力的(stress-bearing)肽聚糖层和由磷质内单层和外单层组成的不对称外膜，这构成了细菌LPS。LPS含有脂质A锚形体、含有3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸的核心和O-抗原区三个组分(参见:Raetz,C.R.H.和Whitfield,C.(2002)Annu.Rev.Biochem.,71,635-700;Whitfield,C.(2006)Ann.Rev.Biochem.75,39-68;Samuel,G.和Reeves,P.R.(2003)Carbohydrate Research,338,2503-2519;及其中关于细菌LPS的O-抗原装配综述的参考文献)。
细菌LPS的O-抗原组分是大的、极度多变的多糖，可以是同聚的，由单一重复单糖组成，或者杂聚的，含有3-6个糖单元的10-30个重复(Reeves,P.R.,Hobbs,M.,Valvano,M.A.,Skurnik,M.,Whitfield,C.,Coplin,D.,Kido,N.,Klena,J.,Maskell,D.,Raetz,C.R.H.和Rick，P.D.(1996)Trends Microbiol.,4,495-503)。因此，O-抗原是细菌细胞表面的主要特征并构成毒力和致病性的重要决定因子(Law,D.(2000)J.App.Microbiol.,88,729-745;Spears,K.J.,Roe,A.J.和Gally,D.L.(2006)FEMS Microbiol.Lett.,255,187-202;Liu,B.,Knirel,Y.A.,Feng,L.,Perepelov,A.V.,Senchenkova,S.N.,Wang,Q.,Reeves,P.R.和Wang,L(2008)FEMS Microbiol.Rev.32,627-653;Stenutz,R.,Weintraub,A.和Widmalm,G.(2006)FEMS Microbiol.Rev.30,382-403)。已经鉴定出具有超过180个独立O-血清型(属于独特的O-抗原结构)的大肠杆菌菌株(Stenutz,R.,Weintraub,A.和Widmalm,G.(2006)FEMS Microbiol.Rev.30,382-403)。
O-抗原重复单位在与十一异戊二烯基焦磷酸连接的内膜细胞溶质面上进行预装配。脂质-连接的重复单位横向地扩散(翻转(flip-flop))到内膜的周质表面并在转运到外膜和连接到LPS之前聚合。大多数杂聚合O-抗原重复单位在还原末端或者具有N-乙酰基葡萄糖胺(“GlcNAc”)或者具有N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)。
已假定通过被WecA催化的GlcNAc-P或GalNAc-P从其相应的糖核苷酸衍生物转移到十一异戊二烯基单磷酸(“Und-P”)上，启动脂质中间体的生物合成(Samuel,G.和Reeves,P.R.(2003)CarbohydrateResearch,338,2503-2519;Alexander,D.C.和Valvano,M.A.(1994)J.Bacteriol.,176,7079-7084;Zhang,L.,Radziejewska-Lebrecht,J.,Krajewska-Pietrasik,D.,Tolvanen,P.和Skurkik,M.(1997)Mol.Microbiol.23,63-76;Amor,P.A.和Whitfield,C.(1997)Mol.Microbiol.26(145-161);Wang,L.和Reeves,P.R.(1998)Infect.Immun.66,3545-3551)。虽然已经表征了WecA的GlcNAc-磷酸转移酶活性的性质和特异性(Rush,J.S.,Rick,P.D.和Waechter,C.J.(1997)Glycobiology,7,315-322)，但是WecA催化GalNAc-P-P-Und合成的结论是基于遗传学研究(Wang,L.和Reeves,P.R.(1998)Infect.Immun.66,3545-3551)。这样的较早遗传学研究表明通过被WecA催化的GalNAc-P从UDP-GalNAc酶促转移到Und-P上启动脂质-连接的四糖中间体的生物合成(Wang,L.和Reeves,P.R.(1998)Infect.Immun.66,3545-3551)。然而，没有直接的酶学证据证明WecA利用UDP-GalNAc作为GalNAc-P供体。
此外，先前已提出大肠杆菌O55 gne和gne1基因编码UDP-GlcNAc 4-差向异构酶(Wang,L.,Huskic,S.,Cisterne,A.,Rothemund,D.和Reeves,P.R.(2002)J.Bacteriol.184,2620-2625;Guo,H.,Yi,W.,Li,L.和Wang,P.G.(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.,356,604-609)。先前的报导鉴定了分别来自大肠杆菌O55(Wang,L.,Huskic,S.,Cisterne,A.,Rothemund,D.和Reeves,P.R.(2002)J.Bacteriol.184,2620-2625)和大肠杆菌O86(Guo,H.,Yi,W.,Li,L.和Wang,P.G.(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.,356,604-609)的两个基因，分别为大肠杆菌O55 gne和大肠杆菌O86 gne1，它们与同一基因家族内的Z3206基因有100%同一性。
因此，将会一直导致技术人员相信Z3206基因也编码UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc差向异构酶。
发明简述
现在令人惊奇地发现，由大肠杆菌O157中的Z3206基因编码的差向异构酶能催化在十一异戊二烯基焦磷酸上合成N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)的反应，从而启动寡糖或多糖的形成。
在一个方面，本发明涉及一种重组原核生物合成***，其产生多糖的全部或一部分，包含在十一异戊二烯基焦磷酸上合成GalNAc的差向异构酶。本发明进一步包括合成在还原末端具有GalNAc的多糖的全部或一部分的糖基转移酶，并且再进一步包括合成在还原末端具有GalNAc的抗原性多糖的全部或一部分的糖基转移酶。
在另一个方面，本发明涉及在十一异戊二烯基焦磷酸上产生GalNAc的差向异构酶，和在一个进一步方面，该差向异构酶由Z3206基因编码。
在一个另外的方面，本发明涉及用于产生N-糖基化蛋白的表达***，包含：编码寡糖基转移酶的核苷酸序列；编码蛋白载体的核苷酸序列；来自至少一种细菌的至少一种寡糖或多糖基因簇；其中该多糖在还原末端含有GalNAc；和编码差向异构酶的核酸序列。
在一个再进一步方面，本发明涉及一种包含Z3206基因的重组原核生物合成***，该Z3206基因编码将GlcNAc-P-P-Und转变成GalNAc-P-P-Und的差向异构酶。
在又一个另外的方面，本发明涉及一种包含大肠杆菌O55 gne基因或大肠杆菌O86 gne1基因的重组原核生物合成***，该基因编码将GlcNAc-P-P-Und转变成GalNAc-P-P-Und的差向异构酶。
在再一个方面，本发明涉及一种N-糖基化蛋白，其包含至少一种引入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸，和在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的聚糖。
在还另一个方面，本发明涉及一种生物缀合物疫苗，其包含具有至少一种引入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T的N-糖基化蛋白，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸；在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的免疫原性聚糖；和佐剂。
在一个另外的方面，本发明涉及在宿主细胞中产生N-联糖基化蛋白的方法，该宿主细胞包含：编码由在还原末端含有GalNAc的至少一种细菌装配至少一种寡糖或多糖的糖基转移酶的核酸；编码蛋白载体的核酸；编码寡糖基转移酶的核酸；和编码差向异构酶的核酸。
在一个进一步方面，本发明涉及生物合成***和蛋白质在制备生物缀合物疫苗中的应用。
在一个另外的方面，本发明涉及用于产生单糖、寡糖和多糖的方法，和在一个再进一步方面，本发明涉及用于产生抗原性聚糖和N-糖基化蛋白的方法。
附图简述
图1显示由来自大肠杆菌O157的膜部分合成[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und的时程。将来自大肠杆菌菌株O157的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc一起于37℃孵育指定时间。按实施例2中描述的方法提取[3H]脂质产物并测定[3H]GlcNAc掺入到[3H]GlcNAc-P-P-Und(O)和[3H]GalNAc-P-P-Und(●)中。
图2显示由GlcNAc-P-P-Und形成GalNAc-P-P-Und的提出的生物合成途径。
图3显示由来自大肠杆菌菌株O157的膜部分合成[3H]GalNAc-P-P-Und的纯化和表征。将来自大肠杆菌O157的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc一起孵育，并按实施例3中描述的方法纯化[3H]GalNAc脂质。图3A显示在硼酸盐浸渍的硅胶G(Quantum 1)上经DEAE-纤维素纯化后[3H]HexNAc脂质的制备型薄层层析图。图3B显示从小图A中制备板中回收后在硼酸盐浸渍的硅胶G(Baker,Si250)上经纯化的[3H]GalNAc-P-P-Und的薄层层析图。图3C显示在图3B中纯化的[3H]GalNAc-P-P-Und经温和的酸水解后回收的[3H]-氨基糖的下行纸层析图(硼酸盐浸渍的瓦特曼1号纸(Whatman No.1paper))。图3D显示用NaBH4还原来自图3C的[3H]氨基糖产生的[3H]HexNAc-糖醇的下行纸层析图(Whatman No.3MM)。
图4显示大肠杆菌21546细胞和大肠杆菌21546细胞在用pMLBAD:Z3206转化后的代谢性标记。大肠杆菌21546(图4A)和大肠杆菌21546:pMLBAD/Z3206(图4B)用[3H]GlcNAc于37℃进行代谢性标记5分钟。按实施例3中描述的方法提取[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und，使其不含水溶性污染物后在硼酸盐浸渍的硅胶板(Baker Si250)上通过薄层层析进行分离。使用Bioscan层析扫描仪检测放射性脂质。GalNAc-P-P-Und和GlcNAc-P-P-Und的层析位置用箭头表示。
图5显示由来自大肠杆菌菌株的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc一起孵育形成的[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und的薄层层析图。将来自大肠杆菌菌株K12(图5A)、O157(图5B)、21546(图5C)和21546:pMLBAD/Z3206(图5D)的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc一起于37℃孵育10分钟，按实施例3中描述的方法提取[3H]脂质产物，通过分配使其不含水溶性污染物，然后在硼酸盐浸渍的硅胶板(BakerSi250)上通过薄层层析进行分离。GalNAc-P-P-Und和GlcNAc-P-P-Und的层析位置用箭头表示。
图6显示GlcNAc-P与UMP孵育后的卸载(discharge)。将来自大肠杆菌21546:Z3206的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc一起于37℃预孵育至将GlcNAc-P-P-Und酶标记10分钟(图6A)，然后与1mM UMP一起进行第二个孵育期，包括或1min(图6B)或2min(图6C)。在指定的孵育期后，按实施例3中描述的方法提取[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und，并在硼酸盐浸渍的硅胶板(Baker Si250)上通过薄层层析进行解析。GalNAc-P-P-Und和GlcNAc-P-P-Und的层析位置用箭头表示。
图7显示由来自表达Z3206的菌株21546的膜催化的外源[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und转变成直接有关的[3H]HexNAc-P-P-Und产物。将来自大肠杆菌菌株21546(图7B和图7E)和21546:pMLBAD/Z3206(图7C和图7F)的膜部分与纯化的[3H]GlcNAc-P-P-Und(图7A,图7B和图7C)或[3H]GalNAc-P-P-Und(图7D,图7E和图7F的分小图)(在1%曲通X-100(Triton X-100)中超声处理进行分散)一起于37℃孵育1分钟。按实施例3中描述的方法提取[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und，在硼酸盐浸渍的硅胶板(BakerSi250)上通过薄层层析进行解析并用Bioscan AR2000放射性层析扫描仪进行检测。
图8显示未糖基化和糖基化AcrA蛋白的SDS-PAGE分析。由携带AcrA表达质粒和与pMLBAD:Z3206(第1泳道)、pMLBAD:gne(第2泳道)或载体对照pMLBAD(第3泳道)互补的pgl操纵子Δgne的大肠杆菌DH5α细胞制备的周质提取物用10%SDS-PAGE分离后转移到硝化纤维素膜上。用抗AcrA抗血清检测AcrA及其糖基化形式。显示了对应于未糖基化(AcrA)和糖基化AcrA(gAcrA)的条带位置。
图9显示已经由Liu B等人鉴定的基因(Liu B等人,Structure andgenetics of Shigella O antigens(志贺氏菌O抗原的结构和遗传学)FEMS Microbiology Review,2008.32:p.27)。
图10是显示含有合成弗氏志贺氏菌6(S.flexneri 6)O抗原所需基因的DNA区的方案。
图11显示弗氏志贺氏菌6 O抗原在大肠杆菌中的表达。LPS通过银染色或者通过转移到硝化纤维素膜和通过抗弗氏志贺氏菌6的抗体检测予以显现。
图12显示O抗原的HPLC。含有弗氏志贺氏菌-Z3206的大肠杆菌细胞(SCM3)、含有弗氏志贺氏菌+Z3206的大肠杆菌细胞(SCM3)或空大肠杆菌(SCM3)细胞的LLO分析。
图13显示来自表达EPA、pglB和弗氏志贺氏菌6O-抗原+/-Z3206的大肠杆菌细胞的经镍纯化的蛋白的蛋白质印迹图。
发明详述
本发明包括一种重组原核生物合成***，其包含编码差向异构酶的核酸，该差向异构酶合成在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的寡糖或多糖和在聚糖的还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的N-糖基化蛋白。
术语“部分氨基酸序列”也称为“最优化共有序列”或“共有序列”。最优化共有序列被寡糖基转移酶(“OST,”“OTase”)进行N-糖基化，其效率比常规共有序列“N-X-S/T”高得多。
一般而言，术语“重组N-糖基化蛋白”是指在天然不包含所述蛋白编码核酸的宿主细胞中产生的任何多肽或寡肽。在本发明的正文中，该术语是指在原核宿主细胞例如埃希氏菌(Escherichia spp.)、弯曲杆菌(Campylobacter spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌(Shigellaspp.)、螺杆菌(Helicobacter spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)中，和在进一步实施方案大肠杆菌(Escherichiacoli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等中重组产生的蛋白质，其中将所述蛋白编码核酸导入到所述宿主细胞中并且其中所编码的蛋白被OTase进行N-糖基化，所述转移酶天然存在于或者被重组地导入到所述宿主细胞中。
根据氨基酸的国际上接受的单字母代码，缩写词D、E、N、S和T分别表示天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸。
根据本发明所述的蛋白质包含被引入到蛋白质并被N-糖基化的最优化共有序列D/E-X-N-Z-S/T中的一个或多个。因此，本发明的蛋白质不同于也含有该最优化共有序列但不包含任何额外的(引入的)最优化共有序列的天然存在的空肠弯曲杆菌N-糖蛋白。
最优化共有序列的引入可以通过一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代来完成。可通过化学合成策略(例如固相辅助的化学肽合成)完成一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代以引入最优化共有序列，根据本发明，这项技术对于本领域技术人员来说是众所周知的。对于较大的多肽来说可选和优选的是，根据本发明，可通过作为本领域标准技术的重组技术来制备本发明的蛋白质。
本发明的蛋白质具有它们可以以高效和在任何宿主中产生的优点。在本发明的一个实施方案中，宿主包含来自弯曲杆菌、例如来自空肠弯曲杆菌的功能性pgl操纵子。在进一步实施方案中，来自弯曲杆菌并用于实施本发明的寡糖基转移酶是来自大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)或海欧弯曲杆菌(Campylobacter lari)。根据本发明，寡糖基转移酶对于本领域技术人员来说是显而易见的。例如，寡糖基转移酶公开于诸如以下的参考文献中：Szymanski,C.M.和Wren,B.W.(2005)Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens(细菌粘膜病原体中的蛋白质糖基化),Nat.Rev.Microbiol.3:225-237。当所述原核宿主是弯曲杆菌，或者例如空肠弯曲杆菌时，功能性pgl操纵子可天然存在。然而，根据本领域之前所证明的及以上提及的，pgl操纵子可以被转移到细胞中并在所述新的细胞环境中仍保留有功能。
术语“来自弯曲杆菌、优选空肠弯曲杆菌的功能性pgl操纵子”意指编码弯曲杆菌、例如空肠弯曲杆菌的功能性寡糖基转移酶(OTase)和能够在脂质载体上装配寡糖的一个或多个特异性糖基转移酶的核酸簇，并且其中所述寡糖可以通过OTase从脂质载体转移到具有一个或多个最优化氨基酸序列D/E-X N-Z-S/T的靶蛋白上。应当理解，术语“来自弯曲杆菌、优选空肠弯曲杆菌的功能性pgl操纵子”在本发明的正文中不一定就是指作为一个转录单位的操纵子。该术语只是要求在一个宿主细胞中重组蛋白N-糖基化的功能性组分存在。这些组分可以转录成为一个或多个独立的mRNA并且可以被一起或单独地调节。例如，该术语也包括位于一个宿主细胞中基因组DNA和质粒上的功能性组分。为了效率，在一个实施方案中，功能性pgl操纵子的所有组分都可以被同时调节和表达。
寡糖基转移酶，在有些实施方案中可来源于弯曲杆菌，而在其它实施方案中可来源于空肠弯曲杆菌。在另外的实施方案中，寡糖基转移酶可来源于本领域技术人员已知的具有寡糖基转移酶的其它生物体，例如沃林氏菌(Wolinella spp.)和真核生物。
能够在脂质载体上装配寡糖的一个或多个特异性糖基转移酶可来源于宿主细胞或被重组地引入到所述宿主细胞中，唯一的功能性限制是由所述糖基转移酶装配的寡糖可以通过OTase从脂质载体转移到具有一个或多个最优化共有序列的靶蛋白上。因此，天然包含特异性糖基转移酶的宿主细胞的选择和/或替代所述宿主中天然存在的特异性糖基转移酶以及异源特异性糖基转移酶的引入都将能够使本领域技术人员去改变与本发明蛋白质中的最优化N-糖基化共有位点结合的N-聚糖。
根据以上结果，本发明提供本发明蛋白质上N-聚糖模式的个体设计。因此，所述蛋白在它们的N-聚糖模式上可以是个性化的以满足生物学、药学和纯化的要求。
在本发明的实施方案中，所述蛋白可包含所述N-糖基化最优化氨基酸序列中的一个但也可不止一个，例如至少两个、至少3个或至少5个。
本发明蛋白质中一个或多个N-糖基化最优化氨基酸序列的存在可具有增加其免疫原性、增加其稳定性、影响其生物活性、延长其生物半寿期和/或使其纯化简化的优点。
最优化共有序列在位置X和Z上可包括除脯氨酸以外的任何氨基酸。术语“任何氨基酸”意指包括常用和稀有天然氨基酸以及合成氨基酸衍生物和类似物，它们都将仍然允许最优化共有序列被OTase进行N-糖基化。天然存在的常用和稀有氨基酸对于X和Z是优选的。X和Z可以相同或不同。
需要注意的是，对于根据本发明所述的蛋白质中的每个最优化共有序列，X和Z可以是不同的。
可以通过特异性糖基转移酶及其当在脂质载体上通过OTase进行转移来装配寡糖时相互作用来决定与最优化共有序列结合的N-聚糖。根据本发明，本领域技术人员通过改变所需宿主细胞中存在的特异性糖基转移酶的类型和数量将能够设计出N-聚糖。
本文所用的“单糖”是指一个糖残基。“寡糖和多糖”是指两个或更多个糖残基。本文所用的术语“聚糖”是指单糖、寡糖或多糖。“N-聚糖”在本文中定义为蛋白质中通过N-糖苷键与天冬酰胺残基的ε-酰胺氮连接的可变组成的单糖、寡糖或多糖。在一个实施方案中，通过OTase转移的N-聚糖在革兰氏阴性或阳性细菌的细胞质膜中存在的十一异戊烯醇焦磷酸(“Und-P-P”)脂质-锚形体上进行装配。它们参与O抗原、O多糖和肽聚糖的合成(Bugg,T.D.和Brandish,P.E.(1994).From peptidoglycan to glycoproteins:common features of lipid-linkedoligosaccharide biosynthesis(从肽聚糖到糖蛋白：脂质连接的寡糖生物合成的共同特征).FEMS Microbiol Lett 119,255-262;Valvano,M.A.(2003).Export of O-specific lipopolysaccharide(O-特异性脂多糖的输出).Front Biosci 8,s452-471)。
进行了多项研究以决定脂质连接的重复四糖(4-N-乙酰基perosamine→岩藻糖→葡萄糖→GalNAc)的生物合成是否是通过WecA形成GalNAc-P-P-Und启动的。当来自大肠杆菌菌株K12、O157和PR4019(一种WecA-过量表达菌株)的膜部分与UDP-[3H]GalNAc一起孵育时，既未检测到[3H]GlcNAc-P-P-Und也未检测到[3H]GalNAc-P-P-Und的酶促合成。然而，当来自菌株O157的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc一起孵育时，观察到两种酶标记的产物具有[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und的化学和层析特性，证实菌株O157含有能够使GlcNAc-P-P-Und和GalNAc-P-P-Und相互转变的差向异构酶。当外源[3H]GlcNAc-P-P-Und与来自菌株O157的膜一起孵育时，外源[3H]GlcNAc-P-P-Und被转变成[3H]GalNAc-P-P-Und也证实了差向异构酶的存在。当菌株O157用[3H]GlcNAc进行代谢性标记时，[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und两者都被检出。用Z3206基因转化大肠杆菌菌株21546能够使这些细胞在体内(in vivo)和体外(in vitro)合成GalNAc-P-P-Und。当来自菌株O157的膜与外源[3H]GalNAc-P-P-Und一起孵育时重新形成[3H]GlcNAc-P-P-Und，证明了差向异构酶反应的可逆性。在空肠弯曲杆菌N-糖基化***在大肠杆菌中的表达中，Z3206不能代偿gne基因的损失，表明它没有作为UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc差向异构酶起作用。基于这些结果，证实了在大肠杆菌O157中，GalNAc-P-P-Und通过GlcNAc-P-P-Und差向异构酶可逆地合成后通过WecA形成GlcNAc-P-P-Und。
对大肠杆菌O157 O-抗原亚基装配的起始反应进行研究证实GalNAc-P-P-Und合成是被有些先前未知的机制而不是被WecA催化的。本文给出的证据说明在大肠杆菌O157中，GalNAc-P-P-Und不是由WecA催化的GalNAc-P从UDP-GalNAc转移合成的，而是由Z3206基因编码的差向异构酶催化的GlcNAc-P-P-Und的4-OH可逆差向异构化合成的。
因此，本发明包括用于装配重要的细菌细胞表面组分的一种新的生物合成途径以及用于合成GalNAc-P-P-Und的一种新的生物合成途径。本发明的一个进一步实施方案包括作为抗微生物剂新靶标的细菌差向异构酶。
大肠杆菌O157合成具有重复四糖结构(4-N-乙酰基perosamine→岩藻糖→葡萄糖→GalNAc)的O-抗原。本文说明了脂质连接的四糖中间体的生物合成不是通过由WecA催化的GalNAc-P从UDP-GalNAc酶促转移到Und-P而启动的，这与较早的遗传学研究正好相反(Wang,L.和Reeves,P.R.(1998)Infect.Immun.66,3545-3551)。本文描述的发明是通过同源性检索获得后再通过遗传学、酶学和代谢性标记实验的结果来验证的，证明WecA没有利用UDP-GalNAc作为底物，而是需要WecA来合成GlcNAc-P-P-Und，然后通过菌株O157中Z3206基因编码的差向异构酶将其可逆地转变成GalNAc-P-P-Und。
本发明的Z3206基因属于产生在其还原末端含有GalNAc残基的表面O-抗原重复单位的几个菌株中存在的基因家族(表1)。Z3206基因序列示于SEQ ID NO:1。先前的报导鉴定了分别来自大肠杆菌O55(Wang,L.,Huskic,S.,Cisterne,A.,Rothemund,D.和Reeves,P.R.(2002)J.Bacteriol.184,2620-2625)和大肠杆菌O86(Guo,H.,Yi,W.,Li,L.和Wang,P.G.(2007)Biochem.Biophys.Res.Comm.,356,604-609)的两个基因即大肠杆菌O55gne和大肠杆菌O86 gne1，这两个基因与Z3206基因有100%同一性(表1)。大肠杆菌O55gne基因序列显示为SEQ ID NO:3，而大肠杆菌O86 gne1基因序列显示为SEQ ID NO:5。
表1
Z3206基因在表达在还原末端具有GalNAc的O-抗原链的细菌菌株中的相关性
因此，我们得出的结论是大肠杆菌O55gne和大肠杆菌O86gne1分别在菌株O55和O86中也编码能够将GlcNAc-P-P-Und转变成GalNAc-P-P-Und的差向异构酶，这也产生了在还原末端具有GalNAc的O-抗原重复单位(表1)。
在本研究中的两个实验方法表明Z3206蛋白不催化菌株O157中UDP-GlcNAc向UDP-GalNAc的差向异构化。首先，当将来自菌株O157的膜与[3H]UDP-GalNAc一起孵育时，既未检测到[3H]GlcNAc-P-P-Und也未检测到[3H]GalNAc-P-P-Und(表3)。如果Z3206催化[3H]UDP-GalNAc向[3H]UDP-GlcNAc的转变，将预期观察到[3H]GlcNAc-P-P-Und。其次，我们已经表明血凝素标记的Z3206不能代偿依赖UDP-GalNAc的空肠弯曲杆菌N-糖基化报道***(图8)。
来自菌株O55的大肠杆菌O55gne基因(Wang,L.,Huskic,S.,Cisterne,A.,Rothemund,D.和Reeves,P.R.(2002)J.Bacteriol.184,2620-2625)也测定了差向异构酶活性，即将粗提取物与UDP-GalNAc一起孵育并通过测定酸水解后与对二甲氨基苯甲醛的反应性增加来间接测定向UDP-GlcNAc的转变。在两个研究中，产物的形成是基于与对二甲氨基苯甲醛的反应性变化并且不是糖核苷酸终产物的决定性特征。在偶联测定中，相对于Gne2，90%纯的多聚组氨酸标记的大肠杆菌O86 gne1也显示具有低水平的UDP-葡萄糖差向异构酶活性。
因此，本发明的一个实施方案涉及一种重组原核生物合成***，其含有将GlcNAc-P-P-Und转变成GalNAc-P-P-Und的Z3206基因、大肠杆菌O55 gne基因或大肠杆菌O86 gne1基因。
显然，大肠杆菌O86(其合成含有两个GalNAc残基的O-抗原，其假定需要UDP-GalNAc作为额外非还原末端GalNAc的糖基供体)，也具有额外的GlcNAc 4-差向异构酶基因，称为gne2，在O-抗原基因簇内(Guo,H.,Yi,W.,Li,L.和Wang,P.G.(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.,356,604-609)。这个额外的差向异构酶基因与荚膜异多糖酸(colanic acid)基因簇的galE基因有高同源性并且似乎是能够合成UDP-GalNAc的UDP-GlcNAc 4-差向异构酶。
Z3206基因似乎在用GalNAc起始的大肠杆菌O-血清型中是高度保守的。在最近的一项研究中，通过基于聚合酶链式反应的方法，利用针对特异性检测大肠杆菌O157 Z3206基因设计的核苷酸引物，根据Z3206的表达筛选出62个具有建立的O-抗原重复单位结构的大肠杆菌菌株(Wang,L.,Huskic,S.,Cisterne,A.,Rothemund,D.和Reeves,P.R.(2002)J.Bacteriol.184,2620-2625)。在该项研究中，在已知含有GalNAc的22个大肠杆菌菌株中有16个检测到Z3206，而在缺乏GalNAc的40个菌株中只有4个检测到Z3206。而且，用设计检测具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的替代差向异构酶的引物类似筛选22个含GalNAc的菌株(大肠杆菌O113的GalE基因)没有检测到携带该基因的菌株，表明Z3206是大肠杆菌的O-抗原重复单位中与还原末端GalNAc的存在最常见相关的GlcNAc 4-差向异构酶基因。
通过多种基于web的拓扑预测算法分析Z3206蛋白质序列表明Z3206蛋白不是高度疏水性的。绝大多数拓扑预测算法表明Z3206是一种可溶性37kDa蛋白，尽管TMPred(Hofmann,K.和Stoffel,W.(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 374,166(摘要))预测有一个弱的N-端跨膜螺旋。然而，来自表达血凝素标记的Z3206的大肠杆菌细胞的细胞馏份的SDS-PAGE后的蛋白质转印清楚地显示标记的蛋白与细胞低渗裂解后的颗粒部分缔合。初步实验表明该蛋白质在膜部分与1MKCl孵育后，仍保留与颗粒部分缔合，但是与0.1%Triton X-100孵育呈有活性的形式增溶。
大肠杆菌O157Z3206与氧化还原酶的短链脱氢酶/还原酶家族具有显著序列同源性，包括GXXGXXG基序(罗斯曼折叠(Rossmanfold))，与NAD(P)结合口袋(Allard,S.T.M.,Giraud,M.F.和Naismith,J.H.(2001)Cell.Mol.Life Sci.58,1650-1655)和保守的S X24YX3K序列相一致，参与质子夺取和供给(Field,R.A.和Naismith,J.H.(2003)Biochemistry 42,7637-7647)。基于UDP-Glc 4-差向异构酶即短链脱氢酶/还原酶家族的另一个成员的晶体结构的分子建模，提示在氢化物夺取之后，4-酮基中间体围绕UDP的β磷酸旋转以呈现该酮基中间体的相反一面并允许从该相反一侧重***氢化物，因此在碳4上羟基的构型发生颠倒。这些保守序列的存在提示Z3206很可能通过类似的机制起作用。虽然图7中见到的差向异构酶产物的平衡分布好像有利于GlcNAc-P-P-Und的形成，但是利用GalNAc-P-P-Und进行O-抗原重复单位装配将按GalNAc-P-P-Und的方向通过质量作用驱动差向异构化反应。
自然界中聚类异戊二烯脂质中间体的糖基部分的差向异构化一直未广泛报道。在一个先前的研究中，报道了核糖基-P-十异戊烯醇的2-差向异构化形成***糖基-P-十异戊烯醇，分枝杆菌中***半乳聚糖生物合成的一种***糖基供体(Mikusová,K.,Huang,H.,Yagi,T.,Holsters,M.,Vereecke,D.,D’Haeze,W.,Scherman,M.S.,Brennan,P.J.,McNeil,M.R.和Crick,D.C.(2005)J.Bacteriol.187,8020-8025)。***糖基-P-十异戊烯醇通过两步氧化/还原反应来形成，需要Rv3790和Rv3791两个分枝杆菌蛋白。虽然加入NAD和NADP能适度地刺激差向异构化，但是Rv3790和Rv3791两者都不含有罗斯曼折叠或SX24YXXXK基序，即短链脱氢酶/还原酶家族的特征(Allard,S.T.M.,Giraud,M.-F.和Naismith,J.H.(2001)Cell.Mol.Life Sci.58,1650-1655;Field,R.A.和Naismith,J.H.(2003)Biochemistry 42,7637-7647)。
总之，描述了通过GlcNAc-P-P-Und差向异构化形成GalNAc-P-P-Und的一种新的生物合成途径。
已经表明有若干抗生素能抑制GlcNAc-P-P-Und的合成，但是在其应用中有限制，因为它们也阻断GlcNAc-P-P-多萜醇(蛋白质N-糖基化途径的起始多萜醇连接的中间体)的合成。虽然GlcNAc-P-P-多萜醇是细菌糖脂中间体GlcNAc-P-P-Und的一种结构上相关的哺乳动物对应物(counterpart)，但是没有关于在真核细胞中将GlcNAc-P-P-多萜醇转变成GalNAc-P-P-多萜醇的类似差向异构化反应的证据。因此，这提高了在其中在还原末端含有GalNAc的表面O-抗原参与病理过程的菌株中，O-抗原合成可以潜在地通过抑制细菌差向异构酶来阻断的可能性。
本发明的一个实施方案涉及在大肠杆菌O157中将GlcNAc-P-P-Und(N-乙酰基葡糖胺基焦磷酰基十一异戊烯醇)转变成GalNAc-P-P-Und(N-乙酰基半乳糖胺基焦磷酰基十一异戊烯醇)的差向异构酶。本发明的一个再进一步的示例性方面涉及在还原末端具有GalNAc的脂质结合的重复四糖合成的起始。
本发明另一个方面的基础包括发现了空肠弯曲杆菌含有通用的N-联蛋白质糖基化***。已经表明空肠弯曲杆菌的各种蛋白都被七糖进行了修饰。这种七糖在十一异戊二烯基焦磷酸即载体脂质上在内膜的细胞质一侧进行装配，即通过逐步加入特异性糖基转移酶催化的核苷酸活化单糖。然后，该脂质连接的寡糖通过翻转酶(例如PglK)翻转(横向地扩散)到周质间隙。在N-联蛋白质糖基化的最后一步，寡糖基转移酶(例如PglB)催化寡糖从载体脂质转移到具有共有序列D/E-X-N-Z-S/T的天冬酰胺(Asn)残基上，其中X和Z可以为除Pro以外的任何氨基酸。七糖的糖基化簇已成功地转移到大肠杆菌中并产生了弯曲杆菌(Campylobacter)的N-联糖蛋白。
已经证明PglB对于脂质连接的糖底物没有严格的特异性。在十一异戊二烯基焦磷酸上装配的抗原性多糖通过周质中的PglB俘获并转移到蛋白载体上(Feldman,2005;Wacker,M.等人,Substratespecificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a commontransfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems(细菌寡糖基转移酶的底物特异性提示细菌和真核***的一种共同转移机制).ProcNatl Acad Sci U S A,2006.103(18):p.7088-93)。该酶也将转移各式各样的十一异戊二烯基焦磷酸(UPP)连接的寡糖，如果它们在还原末端含有N-乙酰基化己糖胺的话。在WO2009/104074中公布了pglB的核苷酸序列和PglB的氨基酸序列。
因此，本发明的一个实施方案涉及一种重组N-糖基化蛋白，其包含：引入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T中的一个或多个，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸；和在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺和并且与所述一个或多个引入的共有序列的每一个通过N-糖苷键N-连接的寡糖或多糖。
在一个进一步实施方案中，本发明涉及一种用于产生多糖的全部或一部分的重组原核生物合成***，其包含在十一异戊二烯基焦磷酸上合成N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)的差向异构酶。在一个进一步实施方案中，多糖的全部或一部分是有抗原性的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种重组原核生物合成***，其包含：在十一异戊二烯基焦磷酸上合成GalNAc的差向异构酶；和合成在还原末端具有GalNAc的多糖的糖基转移酶。
本发明的一个实施方案进一步包含一种重组原核生物合成***，其包含在十一异戊二烯基焦磷酸上合成GalNAc的差向异构酶和合成多糖的糖基转移酶，其中所述多糖具有以下结构：α-D-PerNAc-α-L-Fuc-β-D-Glc-α-D-GalNAc；并且其中GalNAc是在所述多糖的还原末端。
重组原核生物合成***可以产生各种来源的单糖、寡糖或多糖。本发明的实施方案涉及各种来源的寡糖和多糖。这样的寡糖和多糖可以是原核或真核生物来源的。原核生物来源的寡糖或多糖可以来自革兰氏阴性或***。在本发明的一个实施方案中，寡糖或多糖是来自大肠杆菌。在本发明的一个进一步方面中，所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌O157。在另一个实施方案中，所述寡糖或多糖包含以下结构：α-D-PerNAc-α-L-Fuc-β-D-Glc-α-D-GalNAc。在本发明的一个进一步实施方案中，寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌。在一个再进一步实施方案中，寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌6。在一个再进一步方面，所述寡糖或多糖包含以下结构：
Figure BDA00001877727000181
本发明的实施方案进一步包括各种来源的蛋白质。这样的蛋白质包括对原核和真核生物来说是天然的蛋白质。蛋白载体可以是例如AcrA或者经修饰含有蛋白质糖基化的共有序列即D/E-X-N-Z-S/T的蛋白载体，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何氨基酸(例如修饰的外毒素铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(“EPA”))。在本发明的一个实施方案中，蛋白质是铜绿假单胞菌EPA。
本发明的一个进一步方面涉及在N-聚糖的还原末端具有GalNAc的新的生物缀合物疫苗。本发明的一个另外的实施方案涉及用于产生这类生物缀合物疫的一种新方法，该方法使用含有在十一异戊二烯基焦磷酸上产生GalNAc的差向异构酶的重组细菌细胞。在一个实施方案中，生物缀合物疫苗可以用来治疗或预防细菌疾病。在进一步实施方案中，生物缀合物疫苗可具有治疗和/或预防癌症或其它疾病的潜力。
用于人体的典型接种剂量为约1-25μg，优选约1μg至约10μg，最优选约10μg。任选地，疫苗，例如本发明的生物缀合物疫苗包括佐剂。
在一个另外的实施方案中，本发明涉及用于产生抵抗至少一种细菌的生物缀合物疫苗的表达***，其包含：编码寡糖基转移酶的核苷酸序列；编码蛋白载体的核苷酸序列；来自至少一种细菌的至少一种多糖基因簇，其中该多糖在还原末端含有GalNAc；和编码差向异构酶的核酸序列。在一个进一步实施方案中，多糖基因簇编码抗原性多糖。
在又一个进一步实施方案中，本发明涉及用于产生抵抗至少一种细菌的生物缀合物疫苗的表达***，其包含：编码寡糖基转移酶的核苷酸序列；编码包含至少一种***的共有序列D/E-X-N-Z-S/T的蛋白载体的核苷酸序列，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸；来自至少一种细菌的至少一种多糖基因簇，其中该多糖在还原末端含有GalNAc；和Z3206基因。在一个进一步实施方案中，多糖基因簇编码抗原性多糖。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种生物缀合物疫苗，其包含：蛋白载体；至少一种与蛋白载体连接的免疫原性多糖链，其中所述多糖在还原末端具有GalNAc，和进一步其中所述GalNAc直接与蛋白载体连接；和佐剂。
在还一个另外的实施方案中，本发明涉及一种生物缀合物疫苗，其包含：包含至少一种***的共有序列D/E-X-N-Z-S/T的蛋白载体，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸；来自至少一种细菌并与蛋白载体连接的至少一种免疫原性多糖，其中该至少一种免疫原性多糖在还原末端含有直接与蛋白载体连接的GalNAc；和任选地，佐剂。
本发明的另一个实施方案涉及产生生物缀合物疫苗的方法，所述方法包括：在重组生物体中通过使用糖基转移酶装配在还原末端具有GalNAc的多糖；在所述重组生物体中将所述GalNAc与一个或多个靶蛋白的天冬酰胺残基相连接，其中所述一个或多个靶蛋白含有一个或多个T-细胞表位。
在一个进一步实施方案中，本发明涉及产生生物缀合物疫苗的方法，所述方法包括：将编码执行靶蛋白N-糖基化的代谢装置(apparatus)的遗传信息导入原核生物中，产生修饰的原核生物；其中将一个或多个重组靶蛋白表达所需的遗传信息导入所述原核生物中；其中将大肠杆菌菌株O157差向异构酶表达所需的遗传信息导入所述原核生物中；和其中该代谢装置包含将在还原末端具有GalNAc的多糖装配在脂质载体上的类型的糖基转移酶，和寡糖基转移酶，该寡糖基转移酶将多糖的GalNAc与靶蛋白的天冬酰胺残基共价连接，和含有至少一种T-细胞表位的靶蛋白；产生经修饰的原核生物的培养物；和从培养基中获得糖基化蛋白。
本发明的一个进一步方面涉及一种药物组合物。本发明的一个另外的方面涉及一种药物组合物，其包含根据本发明所述的至少一种N-糖基化蛋白。根据本文的公开内容，包含蛋白的药物的制备在本领域是众所周知的。本发明的一个再进一步方面涉及一种药物组合物，其包含抑制将GlcNAc-P-P-Und转变成GalNAc-P-P-Und的差向异构酶的抗生素。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含药学上可接的赋形剂、稀释剂和/或佐剂。
合适的赋形剂、稀释剂和/或佐剂在本领域是众所周知的。赋形剂或稀释剂可以是固体、半固体或可用作活性成分的溶媒或介质的液体材料。本领域普通技术人员在制备组合物的领域中根据所选产品的特殊性质、待治疗疾病或病症、疾病或病症的阶段以及其它相关情况，可以容易地选出适当的给药形式和给药方式(Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(1990))。药学上可接的稀释剂或赋形剂的比例和性质由所选药用活性化合物的溶解度和化学特性、精选的给药途径及标准药学实践来决定。药物制剂可适合于口服、胃肠外或局部使用并且可以按片剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、混悬剂等形式给予患者。本发明的药用活性化合物当它们本身有效时，为了稳定性、结晶方便、溶解度增加等目的，可以进行配制并按其药学上可接的盐(例如酸加成盐或碱加成盐)的形式给予。
在标注特定核苷酸或氨基酸序列的情况下，应当理解，本发明包括同源序列，该同源序列仍然执行与所标注序列相同的功能性。在本发明的一个实施方案中，这样的序列有至少85%同源性。在另一个实施方案中，这样的序列有至少90%同源性。在再进一步实施方案中，这样的序列有至少95%同源性。
两个核苷酸或氨基酸序列间百分同一性的测定方法是本领域技术人员已知的。
本文描述的核酸序列，例如以下序列表描述的核酸序列都仅仅是实例，对本领域技术人员来说显而易见的是，这些序列可以按不同的方式进行组合。本发明另外的实施方案包括核酸的变异体。核酸的变异体(例如密码子优化核酸)可以是实质上相同的，即与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29有至少80%同一性，例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同一性。含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的序列的核酸变异体包括相对含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29或其部分的序列来说具有一个或多个核苷酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175或200个核苷酸)的取代、变异、修饰、置换、缺失和/或添加的核酸。
例如，在本发明的一个实施方案中，这样的变异体包括编码将GlcNAc-P-P-Und转变成GalNAc-P-P-Und的差向异构酶并且i)在宿主细胞例如大肠杆菌中表达和ii)与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQID NO:5,SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9或其部分实质上相同的核酸。
本文描述的核酸包括重组DNA和合成(例如化学合成)DNA。核酸可以是双链或单链的。就单链核酸而论，核酸可以是有义链或反义链。核酸可以利用寡核苷酸类似物或衍生物来合成。
包括本文所述核酸的质粒可以转染或转化到宿主细胞中进行表达。用于转染和转化的技术是本领域技术人员已知的。
本文提及的所有出版物都通过引用其全部作为参考。应当理解，本文所用的术语“或”表示可选择，适当的时候可以组合；也就是说，术语“或”包括所列举的独立选择的每一个以及它们的组合。除非文中清楚地描绘，否则本文所用的单数术语包括它们的复数形式，并且提及复数时包括单数。
参照以下实施例对本发明作了进一步限定，以下实施例进一步描述了本发明的组合物和方法，以及它的实用性。对本领域技术人员显而易见的是，在本发明的范围内可以实施对组合物和方法两者的修改。
实施例
细菌菌株和质粒-大肠杆菌菌株PR4019(Rush,J.S.,Rick,P.D.和Waechter,C.J.(1997)Glycobiology,7,315-322)和PR21546(Meier-Dieter,U.,Starman,R.,Barr,K.,Mayer,H.和Rick,P.D.(1990)J.Biol.Chem.,265,13490-13497)是由Paul Rick博士(Bethesda,MD)慷慨馈赠的礼物，而大肠杆菌O157:H45(Stephan,R.,Borel,N.,Zweifel,C.,Blanco,M.和Blanco,J.E.(2004)BMC Microbiol 4:10)是得自Claudio Zweifel博士(苏黎世大学兽医研究所(Veterinary Institute,University of Zurich))的礼物。使用大肠杆菌DH5α(Invitrogen)作为克隆实验和蛋白质糖基化分析的宿主。使用的质粒列于表2。
表2
实施例中使用的质粒
Figure BDA00001877727000221
材料-[1,6-3H]GlcNAc(30Ci/mmol)、UDP-[1-3H]GlcNAc(20Ci/mmol)和UDP-[6-3H]GalNAc(20Ci/mmol)得自AmericanRadiolabeled Chemicals公司(St.Louis,MO)。Quantum 1硅胶G薄层板是Quantum Industries公司(Fairfield,NJ)的产品，而Baker Si250硅胶G板由Mallinckrodt Chemical Works公司制造。酵母膏和细菌用蛋白胨是BD Biosciences公司的产品。所有其它化学品都从标准商业来源获取。甲氧苄啶(50μg/ml)、氯霉素(20μg/ml)、氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)都按需要加到培养基中。
重组质粒的构建—使用大肠杆菌菌株DH5α进行DNA克隆实验，所构建的质粒通过DNA测序进行验证。用寡核苷酸Z3206-Fw和Z3206-RvHA(AAACCCGGGATGAACGATAACG TTTTGCTC(SEQID NO:17)和AAATCTAGATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACTCAGAAACAAACGTTATGTC(SEQ ID NO:18)；限制位点加上下画线)，通过PCR从大肠杆菌O157:H45扩增Z3206基因。PCR片段用SmaI和XbaI消化后，连接到经SmaI-XbaI切割的pMLBAD载体中(Lefebre,M.D.和Valvano M.A.(2002)Appl Environ Microbiol 68:5956-5964)。这导致得到质粒pMLBAD:Z3206(SEQ ID NO:23)，其编码具有C-端血凝素标签的Z3206。
用寡核苷酸gne-Fw和gne-RV(AAACCATGGATGAAAATTCTTATTAGCGG(SEQ ID NO:19)和AAATCTAGATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGCACTGTTTTTCCCAATC(SEQ ID NO:20)；限制位点加上下画线)，从pACYCpgl扩增gne基因(Wacker,M.,Linton,D.,Hitchen,P.G.,Nita-Lazar,M.,Haslam,S.M.,North,S.J.,Panico,M.,Morris,H.R.,Dell,A.,Wrenn,B.W.,Aebi,M.(2002)Science 298,1790-1793),编码空肠弯曲杆菌pgl簇。PCR产物用NcoI和XbaI消化后，连接到pMLBAD的相同位点，得到质粒pMLBAD:gne(SEQ ID NO:24)，其编码具有C-端血凝素标签的Gne(表2)。
生长条件、蛋白质表达和免疫检测—大肠杆菌菌株在Luria-Bertani培养基(1%酵母膏,2%细菌用蛋白胨,0.6%NaCl)中于37℃进行培养并剧烈摇动。通过向生长至A600为0.05-0.4的大肠杆菌细胞中加入终浓度为0.02-0.2%(w/v)的***糖实现***糖诱导的表达。诱导后5小时再次加入相同数量的***糖，并继续培养4-15小时。
分析程序—根据Pierce公司的生物技术最新报告“EliminateInterfering Substances from Samples for BCA Protein Assay(消除BCA蛋白质测定中来自样品的干扰物质)”，在用脱氧胆酸和三氯乙酸使膜蛋白沉淀之后，利用BCA蛋白质测定法(Pierce)测出蛋白质浓度。在加入0.5ml 1%SDS和4ml Econosafe Economical BiodegradableCounting混合物(Research Products International,Corp.,Mount Prospect,IL)之后，在Packard Tri-Carb 2100TR液体闪烁分光计中，通过闪烁光谱测定法分析样品的放射性。
实施例1：编码GlcNAc-P-P-Und 4-差向异构酶的大肠杆菌O157基因的鉴定
我们在本文中描述了一种新生物合成途径的惊奇发现，其中，通过4-差向异构酶先前未知的作用催化的GlcNAc-P-P-Und的4-OH差向异构化形成了GalNAc-P-P-Und。在这个途径中，GlcNAc-P-P-Und如下形成：从UDP-GlcNAc转移GlcNAc-P，由WecA催化，然后通过GlcNAc-P-P-Und-4-差向异构酶将GlcNAc-P-P-Und差向异构化成为GalNAc-P-P-Und，这是一个先前未知的途径(图2)。
通过DNA同源性检索鉴定出GlcNAc-P-P-Und 4-差向异构酶候选物的编码基因。利用在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上找到的美国国家医学数据库的文库(the U.S.National Library of Medicinedatabases)进行同源性检索。筛选出编码在还原末端具有GalNAc的O抗原重复单位的不同细菌的基因组序列。将一个在还原末端含有GalNAc的重复单位的组和第二个在重复单位中缺乏末端GalNAc的组进行比较以鉴定潜在的差向异构酶。使用这些标准，Z3206鉴定为候选GlcNAc-P-P-Und 4-差向异构酶(表1)。
在具有含GalNAc的O-抗原重复单位的大肠杆菌菌株中存在的GlcNAc 4-差向异构酶基因可以分成两个同源性组，如表1所示。令人惊奇地发现一个同源性组(含有gne1)明显地与GalNAc的存在相关联，因为O-抗原重复单位上的起始糖。进一步令人惊奇地发现第二组(含有gne2)表现出与UDP-Glc差向异构酶GalE高度的相似性，并存在于不起始O-抗原重复单位合成并具有GalNAc的大肠杆菌菌株中。大肠杆菌O157中的Z3206，一种与gne1具有高度同源性的基因，鉴定为候选GlcNAc-P-P-Und 4-差向异构酶。Z3206基因的基因组位置与该途径中的作用相一致，因为它位于O-抗原簇的galF和属于荚膜异多糖酸簇的wcaM之间。
实施例2-11描述的研究进一步证实了以上的发现，包括将GlcNAc 4-差向异构酶(大肠杆菌O157 Z3206)鉴定为催化GalNAc-P-P-Und的形成。
实施例2：UDP-GalNAc不是大肠杆菌WecA(GlcNAc-磷酸转移酶)的底物
为了确定大肠杆菌WecA将是否利用UDP-GalNAc作为GalNAc-P供体来形成GalNAc-P-P-Und，将来自大肠杆菌菌株K12、PR4019(一种WecA-过量表达菌株)和O157的膜部分与UDP-[3H]GalNAc一起孵育，该膜部分能合成据推测由GalNAc-P-P-Und的合成起始的在还原末端具有GalNAc的四糖O-抗原重复单位。
大肠杆菌膜的制备—通过以1,000Xg离心10分钟收集细菌细胞，依次在冰冷的磷酸缓冲盐水中洗涤一次，用冷水洗涤一次，用10mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.25M蔗糖洗涤一次。将细胞重新悬浮至在10mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.25M蔗糖、10mM EDTA(含有0.2mg/ml溶菌酶)中密度为～200 A600单位/ml，再于30℃孵育30分钟。通过以1,000Xg离心10分钟回收细菌细胞，快速重新悬浮在40体积的冰冷的10mM Tris-HCl(pH 7.4)中，再放置在冰上。10分钟后，用紧扣的杜恩斯匀浆器(tight-fitting Dounce homogenizer)将细胞匀浆15个冲程后，补充0.1mM苯甲基磺酰基氟和蔗糖至终浓度为0.25M。通过以1,000Xg离心10分钟去除未破碎的细胞，通过以40,000Xg离心20分钟回收细胞被膜。将膜部分重新悬浮于10mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.25M蔗糖、1mM EDTA中，再次以40,000Xg沉降后，重新悬浮于相同缓冲液至蛋白质浓度为～20mg/ml。将膜部分保存在-20℃备用。
在大肠杆菌膜中[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und生物合成的体外测定—用于合成GlcNAc-P-P-Und和GalNAc-P-P-Und的反应混合物含有50mM Tris-HCl(pH 8)、40mM MgCl2、5mM二硫苏糖醇、5mM 5′AMP、大肠杆菌膜部分(50-200μg膜蛋白和任一个5μM UDP-[3H]GlcNAc/GalNAc(500-2500dpm/pmol)，总体积为0.05ml。于37℃孵育后，加入40体积的CHCl3/CH3OH(2:1)终止反应，按先前所述方法(Waechter,C.J.,Kennedy,J.L.和Harford,J.B.(1976)Arch.Biochem.Biophys.174,726-737)，制备含有[3H]HexNAc-P-P-十一异戊烯醇的总脂质提取物。在分配之后，将有机相在氮气流下干燥，再重新溶解于1ml CHCl3/CH3OH(2:1)，取出等分试样(0.2ml)，在闪烁小瓶中干燥后，在Packard Tri-Carb 2100TR液体闪烁分光计中通过液体闪烁光谱测定法分析其放射性。为了测定[3H]GlcNAc-P-P-Und或[3H]GalNAc-P-P-Und的合成速率，将脂质提取物在氮气流下干燥，再重新溶解于小体积的CHCl3/CH3OH(2:1)中，点样到10X 20cm硼酸盐浸渍的Baker Si250硅胶板上，该板用CHCl3,CH3OH,H2O,0.2M硼酸钠(65:25:2:2)展层。各个糖脂用Bioscan AR2000成像扫描仪(Bioscan,Washington,D.C.)进行检测。把[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und中的放射性总量乘以各个[3H]糖脂的百分率，计算出各糖脂的生物合成速率。
将来自不同大肠杆菌菌株(K12、PR4019和O157)的膜部分与或者UDP-[3H]GlcNAc或者UDP-[3H]GalNAc一起孵育，如上所述测定[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und中的掺入。如表3所示，在与UDP-[3H]GalNAc一起孵育后未检测出标记的糖脂，当膜部分与UDP-[3H]GlcNAc一起孵育时仅GlcNAc-P-P-Und是可检测的。
表3
利用UDP-[3H]GlcNAc或者UDP-[3H]GalNAc作为底物在大肠杆菌膜部分中[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-十一异戊烯醇的合成
此外，加入外源Und-P后再与来自PR4019(WecA-过量表达菌株)的膜一起孵育和加入来自O157细胞的细胞溶质部分两者都没有导致由UDP-GalNAc形成GalNAc-P-P-Und。这些结果证明UDP-GalNAc不是WecA的底物，提示GalNAc-P-P-Und是由替代机制形成。
当来自菌株K12的膜与UDP-[3H]GlcNAc一起孵育时，按预期合成了[3H]GlcNAc-P-P-Und(Rush,J.S.,Rick，P.D.和Waechter,C.J.(1997)Glycobiology,7,315-322)。然而，当来自菌株O157的膜与UDP-[3H]GlcNAc一起孵育时，除了[3H]GlcNAc-P-P-Und之外，还观察到显示为[3H]GalNAc-P-P-Und的第二种标记脂质(参见下文)。当检查两种糖脂的形成时程时，[3H]GlcNAc-P-P-Und(图1,O)中放射性的掺入比[3H]GalNAc-P-P-Und(图1,●)中放射性的掺入发生更快，程度更高，这与前体-产物关系相匹配(图2)。
大肠杆菌O157膜不利用UDP-GalNAc作为GalNAc-P供体进行GalNAc-P-P-Und合成的观察结果是一个实例，它证实了图2中说明的GalNAc-P-P-Und形成的生物合成途径。在该方案中，GlcNAc-P-P-Und如下形成：从UDP-GlcNAc转移GlcNAc-P，由WecA催化，然后通过先前未知的4-差向异构酶的作用使GlcNAc-P-P-Und差向异构化产生GalNAc-P-P-Und。
实施例3：用来自大肠杆菌菌株O157的膜部分在体外形成的[3H]GalNAc-P-P-Und的表征
与图1检测到的额外O157-特异性糖脂产物相一致，作为GalNAc-P-P-Und，它对温和的碱甲醇解(甲苯/甲醇1:3,含有0.1NKOH,0℃,60min)是稳定的，通过在CHCl3/CH3OH/H2O(10:10:3)中平衡的DEAE-纤维素保留，再用含有20mM乙酸铵的CHCl3/CH3OH/H2O(10:10:3)洗脱，按先前关于[3H]GlcNAc1-2-P-P-Dol报道的(Waechter,C.J.和Harford,J.B.(1977)Arch.Biochem.Biophys.181,185-198)。
[3H]GalNAc-P-P-Und在硼酸盐浸渍的硅胶G上通过薄层层析法从[3H]GlcNAc-P-P-Und中清楚地解析出来(Kean,E.L.(1966)J.LipidRes.7,449-452)并通过制备型TLC纯化，如图3A和图3B所示。
硼酸盐浸渍的薄层板和瓦特曼1号纸的制备—硅胶薄层板用硼酸钠浸透，即按照Kean的所述方法(Kean,E.L.(1966)J.Lipid Res.7,449-452)，将硅胶薄层板短暂浸入2.5%Na2B4O7·10H2O的95%甲醇中。将该硼酸盐浸渍的TLC板在室温下干燥过夜后，放在Drierite上的真空干燥器内保存备用。刚好在层析之前，将板在短时间(～10-15min)加热至100℃而把板活化。将20X 30cm的瓦特曼1号(Whatman1)纸片浸渍在0.2M Na2B4O7·10H2O中而把瓦特曼1号纸用硼酸钠浸渍。按照Cardini和Leloir的所述方法(Cardini,C.E.和Leloir,L.F.(1957)J.Biol.Chem.225,317-324)，把Whatman No.1纸片紧紧地压在两块Whatman No.3MM纸片之间并让其在室温下干燥数天。
在体外反应中形成的聚糖产物的表征—个体糖脂([3H]GalNAc-P-P-Und和[3H]GlcNAc-P-P-Und)的聚糖在温和的酸水解释放之后通过下行纸层析法来表征。将GlcNAc/GalNAc脂质在氮气流下在带螺旋帽的锥形管中干燥并在0.2ml 0.01M HCl中加热到100℃达15分钟。水解后，将样品加到含有0.4ml的AG50WX8(H+)和0.4ml AG1X8(乙酸盐形式)的0.8ml混合床离子交换柱中，用1.5ml水洗脱。洗脱液在氮气流下干燥，重新溶解于小体积的H2O(0.02ml)中，点样在一条长30cm的硼酸盐浸渍的瓦特曼1号纸条上，用丁醇/吡啶/水(6:4:3)按下行模式展开40-50小时。干燥后，把纸条切割成1cm的小长带，用闪烁光谱测定法分析放射性。GlcNAc和GalNAc标准品用苯胺-二苯胺蘸浸(dip)试剂检测(Schwimmer,S.和Benvenue,A.(1956)Science 123,543-544)。
按照上述方法，在温和的酸水解之后，聚糖产物用0.1M NaBH4的0.1M NaOH(终体积0.1ml)还原而转变成它们的相应糖醇。在室温下温育过夜后，反应物用几滴冰醋酸猝灭，在氮气流下干燥使甲醇不含1滴醋酸，重复几次。将糖醇溶于水，过AG50WX8(H+)和AG1X8(乙酸盐)的0.5ml柱脱盐，在氮气下干燥，点样到长30cm的WhatmanNo.3MM纸条上。Whatman No.3MM纸条用乙酸乙酯、吡啶、0.1M硼酸(65:25:20)按下行模式展开过夜，干燥，切割成1cm的小长带，用闪烁光谱测定法分析放射性。GlcNAcitol和GalNAcitol标准品用改进的高碘酸盐-联苯胺(periodate-benzidine)蘸浸(dip)程序显现(Gordon,H.T.,Thornburg,W.和Werum,L.N.(1956)Anal.Chem.28,849-855)。将纸条浸渍在丙酮、0.1MNaIO4(95:5)中，让其风干3分钟，然后浸渍在丙酮/乙酸/H2O/o-联甲苯胺(96:0.6:4.4:0.2gm)中，含顺式二醇的糖醇在蓝色背景上染色成黄色斑点。
糖脂的质谱测定法(“MS”)—用带有ABI Turbo V电喷雾离子源的ABI/MDS Sciex 4000Q-Trap混合式三节四极线性离子阱质谱仪(ABI/MDS-Sciex,Toronto,Canada)分析纯化的糖脂。简而言之，将样品按10μl/min灌到凭经验确定的离子源装置中，通过将分子离子以线性离子阱模式碎裂获得了MS/MS(呈二维的质谱)信息。
当糖脂用温和的酸(0.01N HCl,100℃,15min)处理时，水溶性产物与[3H]GalNAc一起在下行纸层析上用硼酸盐浸渍的瓦特曼1号纸进行共层析分析(图3C)。另外，当标记的糖还原时，它被转变成[3H]糖醇GalNAc-OH(图3D)。此外，负离子MS分析得出[M-H]-离子为m/z=1128，对于GalNAc-P-P-Und的预期，MS/MS子离子谱显示突出离子在m/z=907，对于含P-P-Und的糖脂的预期(Guan,Z.,Breazeale,S.D.和Raetz,C.R.(2005)Anal.Biochem.345,336-339)。由菌株O157形成的糖脂产物鉴定为GalNAc-P-P-Und也得到了其形成来自外源GlcNAc-P-P-Und的支持(参见实施例7)。
实施例4：在表达Z3206基因的大肠杆菌细胞中用[3H]GlcNAc代谢性标记[3H]GalNAc-P-P-Und(体内)
为了研究大肠杆菌O157 Z3206基因的表达是否能够使细胞合成GalNAc-P-P-Und，表达Z3206基因的大肠杆菌菌株21546(Meier-Dieter,U.,Starman,R.,Barr,K.,Mayer,H.和Rick,P.D.(1990)J.Biol.Chem.,265,13490-13497)用[3H]GlcNAc进行代谢性标记并分析[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und的形成。
细菌细胞的代谢性标记—大肠杆菌细胞在剧烈摇动下在Luria-Bertani培养基中于37℃培养至A600为0.5-1。加入[3H]GlcNAc至终浓度为1μCi/ml，继续于37℃温育5分钟。加入0.5gm/ml碎冰终止放射性标记掺入到糖脂中，将培养物充分混合。以4000Xg离心10分钟来回收细菌细胞，弃去上清液。细胞用冰冷的磷酸缓冲盐水洗涤两次，通过剧烈涡旋混合而重新悬浮在10体积(细胞沉淀物)的甲醇中，用探测超声器按40%全功率短暂超声处理。超声处理后，加入20体积的氯仿，将提取物剧烈混合后，让其静置在室温下15分钟。不溶性物质通过离心沉淀出来，沉淀用小体积的CHCl3/CH3OH(2:1)反萃取两次。合并的有机提取物如下所述进行加工处理。
GlcNAc-P-P-Und和GalNAc-P-P-Und的纯化-GlcNAc/GalNAc-P-P-Und用CHCl3/CH3OH(2:1)抽提，按文献中描述的方法进行分配(Waechter,C.J.,Kennedy,J.L.和Harford,J.B.(1976)Arch.Biochem.Biophys.174,726-737)使其没有水溶性物质。然后将有机提取物在氮气流下干燥，通过在含有0.1N KOH的甲苯/甲醇(1:3)于0℃脱酰基达60分钟使甘油磷酸脂质破坏。脱酰化反应用乙酸中和，用4体积的CHCl3/CH3OH(2:1)稀释，用1/5体积的0.9%NaCl洗涤。有机(下层)相用1/3体积的CHCl3、CH3OH、0.9%NaCl(3:48:47)洗涤，弃去水相。有机相用足够的甲醇稀释以在有机相中容纳残留的水相，上样到用CHCl3/CH3OH(2:1)平衡的DEAE-纤维素柱(5ml)上。柱子用20柱体积的CHCl3/CH3OH/H2O(10:10:3)洗涤，然后用含有20mM乙酸铵的CHCl3/CH3OH/H2O(10:10:3)洗脱。在硼酸盐浸渍的硅胶板上通过薄层层析解析(如较早所述)后，收集馏份(2ml)，用茴香醛喷雾试剂监测放射性或GlcNAc/GalNAc-P-P-Und(Dunphy,P.J.,Kerr,J.D.,Pennock,J.F.,Whittle,K.J.和Feeney,J.(1967)Biochim.Biophys.Acta 136,136-147)。
选择大肠杆菌菌株21546作为Z3206表达研究的宿主，因为UDP-ManNAcA合成中的突变导致利用GlcNAc-P-P-Und合成肠细菌共同抗原时出现阻断。因为大肠杆菌21546来源于大肠杆菌K12，所以它也不合成O-抗原重复片段(Stevenson,G.,Neal,B.,Liu,D.,Hobbs,M.,Packer,N.H.,Batley,M.,Redmond,J.W.,Lindquist,L.和Reeves,P.(1994)J.Bacteriol.,176,4144-4156)，因此，较大量的GlcNAc-P-P-Und累积用于转化成GalNAc-P-P-Und。当表达Z3206基因的菌株21546和转化体用[3H]GlcNAc标记并且放射性标记脂质用薄层层析在硼酸盐浸渍的硅胶板上分析时，母菌株(图4A)仅合成一种标记的脂质GlcNAc-P-P-Und。然而，表达Z3206基因的21546细胞(图4B)也合成另外的标记脂质，显示为GalNAc-P-P-Und。
实施例5：来自表达Z3206基因的大肠杆菌细胞的膜部分在体外合成GalNAc-P-P-Und
为了证实由大肠杆菌O157 Z3206基因编码的蛋白质能催化GalNAc-P-P-Und的合成，将来自表达Z3206基因的大肠杆菌细胞的膜部分与[3H]UDP-GlcNAc一起孵育，通过薄层层析(色谱制备和表征方法在实施例3中描述)在硼酸盐浸渍的硅胶板上分析[3H]糖脂产物，如图5所示。当来自大肠杆菌K12或宿主菌株大肠杆菌21546细胞的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc一起孵育时，仅仅观察到[3H]GlcNAc-P-P-Und(图5A和图5C)。然而，来自大肠杆菌O157和表达Z3206的大肠杆菌21546的膜部分也形成了GalNAc-P-P-Und(图5B和图5D)。
实施例6：GlcNAc-P-P-Und但不是GalNAc-P-P-Und的形成在UMP存在下被逆转
为了提供GalNAc-P-P-Und是从GlcNAc-P-P-Und而不是通过WecA的作用利用UDP-GalNAc作为糖基供体合成的另外证据，检查了用UMP卸载内源预标记的[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und的作用。被WecA催化的GlcNAc-磷酸转移酶反应通过加入过量的UMP而自由地逆转，即重新合成UDP-GlcNAc并释放Und-P。
在这个实验当中，来自表达Z3206的大肠杆菌菌株21546的膜部分用UDP-[3H]GlcNAc预先标记10分钟，然后加入1mM UMP，测定各标记的糖脂的剩余量。图6A所示结果表明在10分钟标记期结束时[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und的相对量。在与1mM UMP一起孵育1分钟后，可以见到[3H]GlcNAc-P-P-Und的明显损失，而[3H]GalNAc-P-P-Und峰相对来说无变化(图6B)(色谱制备和表征方法在实施例5中描述)。这一观察结果与表3中的结果相一致，说明WecA不催化从UDP-GalNAc将GalNAc-P转移到GalNAc-P-P-Und上。值得关注的是，在与UMP一起孵育的第2分钟(图6C)，GlcNAc-P-P-Und的损失慢下来，并且在[3H]GalNAc-P-P-Und的峰中有略微减少，提示[3H]GalNAc-P-P-Und通过差向异构酶反应的逆转用[3H]GlcNAc-P-P-Und库重新平衡(参见实施例7)。
实施例7：由来自表达Z3206的大肠杆菌细胞的膜催化的外源纯化[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und的相互转化
为了提供GlcNAc-P-P-Und和GalNAc-P-P-Und可以通过来自表达Z3260的大肠杆菌细胞的膜部分直接相互转化的直接证据，将纯化的[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und作为外源底物进行了测试。
纯化的[3H]GlcNAc-P-P-Und/[3H]GalNAc-P-P-Und按实施例4中描述的方法(细菌细胞的代谢性标记和GlcNAc-P-P-Und和GalNAc-P-P-Und的纯化)来制备。按实施例2中关于在大肠杆菌膜中[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und生物合成的体外测定，将[3H]HexNAc-P-P-十一异戊烯醇(2000dpm/pmol,在1%TritonX-100中分散,终浓度0.1%)与大肠杆菌膜一起孵育。
初步实验表明当将外源[3H]GlcNAc-P-P-Und加入到在TritonX-100、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸)、NonidetP-40或辛基葡糖苷中分散的反应混合物中时，差向异构酶是有活性的，并表现出pH最大在7-8.5的范围内。在与膜部分孵育之前纯化[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und的色谱迁移率示于图7A和图7D。如图7B和图7E中见到的，与来自大肠杆菌21546的膜部分孵育不影响糖脂。然而，纯化糖脂与来自表达Z3206的大肠杆菌21546的膜部分的孵育能催化外源[3H]GlcNAc-P-P-Und向[3H]GalNAc-P-P-Und的转变(图7C)和[3H]GalNAc-P-P-Und向[3H]GlcNAc-P-P-Und的转变(图7F)。这些结果直接证明GlcNAc-P-P-Und和GalNAc-P-P-Und在表达Z3206的大肠杆菌菌株中经酶催化而相互转变。
实施例8:大肠杆菌Z3206不是UDP-GlcNAc 4-差向异构酶
为了确定Z3206是否可以催化UDP-GalNAc的形成，使来自空肠弯曲杆菌的N-糖基化器(apparatus)在大肠杆菌中表达。在这个报道***中，靶蛋白AcrA的糖基化依赖于pgl基因座的存在(Wacker,M.,Linton,D.,Hitchen,P.G.,Nita-Lazar,M.,Haslam,S.M.,North,S.J.,Panico,M.,Morris,H.R.,Dell,A.,Wrenn,B.W.,Aebi,M.(2002)Science 298,1790-1793)，包括功能性Gne UDP-Glc/UDP-GlcNAc差向异构酶(Bernatchez,S.,Szymanski,C.M.,Ishiyama,N.,Li,J.,Jarrell,H.C.,Lau,P.C.,Berghuis,A.M.,Young,N.M.,Wakarchuk,W.W.(2005)J.Biol.Chem.280,4792-4802)。如果pgl簇含有gne的缺失，那么AcrA的糖基化就失去了(Linton,D.,Dorrell,N.,Hitchen,P.G.,Amber,S.,Karlyshev,A.V.,Morris,H.R.,Dell,A.,Valvano,M.A.,Aebi,M.和Wren,B.W.(2005)Mol Microbiol.55,1695-1703)。通过表达AcrA(pWA2)以及由Gne(pMLBAD:gne)或Z3206(pMLBAD:Z3206)代偿的pgl基因座Δgne研究了体外情况下在pgl操纵子Δgne存在下Z3206恢复AcrA-糖基化的能力。
使用重新悬浮于100μl的上样缓冲液中浓度等于1 A600单位的细胞，制备出总的大肠杆菌细胞提取物进行了免疫检测分析(Laemmli,U.(1970)Nature 227,680-685)。将10μl的等分试样上样到10%SDS-PAGE上。通过溶菌酶处理制备大肠杆菌细胞的周质提取物(Feldman,M.F.,Wacker,M.,Hernandez,M.,Hitchen,P.G.,Marolda,C.L.,Kowarik,M.,Morris,H.R.,Dell,A.,Valvano,M.A.,Aebi,M.(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102,3016-3021)，最终样品取10μl(相当于细胞的0.2 A600单位)通过SDS-PAGE进行分析。在硝化纤维素膜上转印后，样品用特异性抗血清进行免疫染色(Aebi,M.,Gassenhuber,J.,Domdey,H.和te Heesen,S.(1996)Glycobiology 6,439-444)。使用抗AcrA(Wacker,M.,Linton,D.,Hitchen,P.G.,Nita-Lazar,M.,Haslam,S.M.,North,S.J.,Panico,M.,Morris,H.R.,Dell,A.,Wrenn,B.W.,Aebi,M.(2002)Science 298,1790-1793)抗体。使用抗兔IgG-HRP(Bio-Rad)作为第二抗体。用ECLTM蛋白质印迹分析检测试剂(AmershamBiosciences)进行检测。
如图8所示，糖基化蛋白，它比非糖基化形式迁移慢，仅当表达pgl基因座Δgne的细胞被Gne代偿时才形成(第2泳道)。Z3206无法恢复报道糖蛋白的糖基化(图8,第1泳道)。因此，在依赖Gne的糖基化***中，Z3206不会代偿AcrA的糖基化。Gne和膜缔合Z3206的表达通过免疫检测予以证实。
实施例9：弗氏志贺氏菌6+/-Z3206LPS的分析
在图9显示了弗氏志贺氏菌6 O-抗原生物合成所需要的一些基因：编码核苷酸糖前体生物合成的酶的基因；编码糖基转移酶的基因；编码O抗原加工蛋白的基因；和编码负责O-乙酰化的蛋白的基因。O抗原的结构由Dmitriev,B.A等人进行了阐述(Dmitriev,B.A.等人,Somatic Antigens of Shigella(志贺氏菌属的菌体抗原)Eur JBiochem,1979.98:p.8;Liu B等人,Sructure and genetics of Shigella O antigens(志贺氏菌属O抗原的结构和遗传学)FEMS Microbiology Review,2008.32:p.27)。
为了鉴定弗氏志贺氏菌6 O-抗原生物合成所需要的所有基因，构建了基因组文库。
弗氏志贺氏菌6基因组DNA的克隆 根据来自细菌的DNA分离方案，使用Macherey-Nagel NucleoSpin
Figure BDA00001877727000331
Tissue试剂盒，分离出弗氏志贺氏菌6基因组DNA。从5个弗氏志贺氏菌6过夜培养物(各2ml)中分离出DNA，用100μl洗脱缓冲液(5mM Tris/HCl,pH 8.5)进行最后的洗脱。根据CopyControlTM Fosmid文库产生试剂盒(EPICENTRE)给出的方案所述，将洗脱的馏份合并，用异丙醇沉淀，将最终的沉淀物重新悬浮于52μl TE缓冲液，其总体积经历了终点修复。根据试剂盒方案所述，用1X TAE缓冲液，在1%低熔点琼脂糖凝胶上跑胶，来将终点修复的DNA纯化，回收后用乙醇沉淀。在7μl TE缓冲液中进行沉淀DNA的重新悬浮，再按照EPICENTRE方案，将其中的0.15μl DNA连接到pCC1FOS(SEQ ID NO:27)中。按照方案所述进行连接产物包装到噬菌体中。经包装的噬菌体在噬菌体稀释缓冲液中进行1:1稀释，取10μl用来感染100μl EPI300-T1细胞，该细胞先前按EPICENTRE所述进行生长。该细胞(110μl)接种6块板，每板约100个菌落，使得6块板均含有完整弗氏志贺氏菌6基因组文库。板通过菌落转印来显现，阳性/阴性菌落进行蛋白质印迹分析和银染色。
菌落转印法 对于菌落转印，把硝化纤维素膜放在固体琼脂板上面，再取下来，放入1X PBST中洗涤三次并按同样的方式进行处理。将膜首先在10%乳中在室温下封闭1小时，然后在室温下在2ml 1%乳(在PBST中)中与抗VI型抗血清(第一抗体)一起保温。在PBST中洗涤三次(每次10分钟)后，将膜与第二抗体、1:20000过氧化物酶缀合的山羊-抗兔IgG(BioRad)(在2ml 1%乳(在PBST中)中)在室温下再保温另外1小时。用PBST进行最后三次洗涤(每次10分钟)后，将膜在由SuperSignal
Figure BDA00001877727000341
West Dura Extended Duration底物试剂盒(Thermo Scientific)提供的具有鲁米诺(luminol)和过氧化物缓冲液的1:1混合物的UVP Chemi Doc成像***中显影。
在产生弗氏志贺氏菌6基因组文库之后，与弗氏志贺氏菌6抗血清反应的克隆用Liu等人(Liu等人,2008)先前测序的区域的引物步查从rmlB到wfbZ进行测序(图9)。引物rmlB_rev和wfbZ_fwd(弗氏志贺氏菌-Z3206)在rmlB和wfbZ中退火并用来测定克隆***片段的序列直至分别达到wcaM和hisI/F(弗氏志贺氏菌+Z3206)(图10)。
为了建立O抗原合成是否在缺乏Z3206(因此阻碍und-GlcNAc向und-GalNAc的差向异构化)的克隆中保持，构建了两种质粒(SEQID NO.28和SEQ ID NO.29)(图10)，转化到大肠杆菌细胞中并通过银染色和蛋白质印迹进行分析。
如图11所示，在大肠杆菌细胞+或-Z3206中产生了LPS。O抗原在没有Z3206时可以产生，然而产量较低，这表明没有差向异构酶(Z3206)的多糖产生效率较低。
实施例10：弗氏志贺氏菌6+/-Z3206LLO的分析
通过C18柱层析纯化十一异戊烯醇-PP-O抗原 使表达弗氏志贺氏菌(S.flexeneri)抗原+/-Z3206的大肠杆菌细胞沉淀，在50ml 0.9%NaCl中洗涤一次，将终沉淀物冻干过夜。该沉淀物在30ml 85-95%甲醇中洗涤一次，用10:10:3氯仿-甲醇-水(v/v/v)反萃取，通过加水将提取物转变成两相Bligh/Dyer***，导致最终比率为10:10:9(C:M:W)。通过离心分离各相，上层水相分别上样到用10ml甲醇调节并用10ml 3:48:47(C:M:W)平衡的C18 Sep-Pak柱体上。上样后，柱体用10ml 3:48:47(C:M:W)洗涤并用5ml 10:10:3(C:M:W)洗脱。将C18柱的上样、流通、洗涤和洗脱的20个OD样品在EppendorfConcentrator Plus管中干燥，用250μl甲醇洗涤，重蒸发后用30μlddH2O多洗涤三次。
糖脂水解。来自C18柱洗涤的糖脂样品如下水解：将干燥的样品溶解在2ml正丙醇:2M三氟乙酸(1:1)中，加热到50℃达15分钟并在N2下蒸发至干。
用氨基苯甲酸盐和HPLC进行寡糖标记。按照Bigge等人(Bigge,1995)中描述的方法进行标记，按照Merry等人(2002)(Merry等人,2002)所述的纸盘方法进行聚糖提纯(cleanup)。按照Royle等人(Royle,2002)中描述的方法但修改到三个溶剂***，采用GlycoSep-N正相柱，通过HPLC进行2-AB标记的聚糖的分离。溶剂A是10mM甲酸铵pH 4.4的80%乙腈。溶剂B是30mM甲酸铵pH 4.4.的40%乙腈。溶剂C是0.5%甲酸。柱温为30℃，并通过荧光(λex=330nm,λem=420nm)检测2-AB标记的聚糖。梯度条件是100%A至100%B的线性梯度，历经160分钟，流速为0.4ml/min，然后2分钟100%B至100%C，流速至1ml/min。柱用100%C洗涤5分钟，回到100%A历经2分钟后，用100%A按流速为1ml/min流过15分钟，然后回到流速至0.4ml/min达5分钟。所有样品都在水中注射。
将表达有(SEQ ID NO:29)或无(SEQ ID NO:28)Z3206的弗氏志贺氏菌O抗原的质粒转化到SCM3细胞中(图10)。迟洗脱体积的痕迹显示含有弗氏志贺氏菌O抗原+/-Z3206的两个样品曲线间的差异(图12)。这种在洗脱模式中的差异可以用在还原端带有不同单糖的不同寡糖结构进行解释：GlcNAc或GalNAc取决于差向异构酶(Z3206)的存在。
实施例11：通过由弗氏志贺氏菌6+/-Z3206产生的生物缀合物的制备和表征分析pglB的特异性
为了评价PglB是否可以将在还原端具有GlcNAc(弗氏志贺氏菌6O-抗原)的寡糖转移到载体蛋白EPA Nickel上，使用抗EPA和抗VI型抗体，通过蛋白质印迹法分析来自表达EPA(SEQ ID NO:25)、PglB(SEQ ID NO:26)和弗氏志贺氏菌6O-抗原+/-Z3206(SEQ IDNO:29/SEQ ID NO:28)的大肠杆菌细胞的纯化提取物。将在还原端有和无GalNAc的弗氏志贺氏菌O6抗原通过PglB转移到EPA上并用抗EPA和抗VI抗血清进行检测(图13)。
O抗原仍可产生和检出，但产量较低，这表明没有差向异构酶的多糖产生效率较低。
尽管本发明参照其实施方案进行了具体地说明和描述，但是本领域技术人员应当理解，在不偏离由权利要求书涵盖的发明范围的情况下，可以在形式和细节上对本发明进行各种变化。本领域技术人员将理解为落入本发明的范围之内的这些各种变化，特别是包括含有除来自在还原末端具有GalNAc的大肠杆菌和弗氏志贺氏菌以外的聚糖的N-糖基化蛋白和生物缀合物。
序列表
申请人:GlycoVaxyn AG
名称：在原核细胞中产生免疫原性多糖的生物合成***
SEQ ID NO的数目:29
SEQ ID NO:1-大肠杆菌O157 Z3206的核苷酸序列
长度:993
类型:DNA
生物体:大肠杆菌O157
序列:
ATGAACGATAACGTTTTGCTCATAGGAGCTTCCGGATTCGTAGGAACCCGACTACTT
GAAACGGCAATTGCTGACTTTAATATCAAGAACCTGGACAAACAGCAGAGCCACTTT
TATCCAGAAATCACACAGATTGGCGATGTTCGCGATCAACAGGCACTCGACCAGGCG
TTAGTCGGTTTTGACACTGTTGTACTACTGGCAGCGGAACACCGCGATGACGTCAGC
CCTACTTCTCTCTATTATGATGTCAACGTTCAGGGTACCCGCAATGTGCTGGCGGCC
ATGGAAAAAAATGGCGTTAAAAATATCATCTTTACCAGTTCCGTTGCTGTTTATGGT
TTGAACAAACACAACCCTGACGAAAACCATCCACACGACCCTTTCAACCACTACGGC
AAAAGTAAGTGGCAGGCAGAGGAAGTGCTGCGTGAATGGTATAACAAAGCACCAACA
GAACGTTCATTAACCATCATCCGTCCTACCGTTATCTTCGGTGAACGCAACCGCGGT
AACGTCTATAACTTGCTGAAACAGATCGCTGGCGGCAAGTTTATGATGGTGGGCGCA
GGGACTAACTATAAGTCCATGGCTTATGTTGGAAACATTGTTGAGTTTATCAAGTAC
AAACTGAAGAATGTTGCCGCAGGTTATGAGGTTTATAACTACGTTGATAAGCCAGAC
CTGAACATGAACCAGTTGGTTGCTGAAGTTGAACAAAGCCTGAACAAAAAGATCCCT
TCTATGCACTTGCCTTACCCACTAGGAATGCTGGGTGGATATTGCTTTGATATCCTG
AGCAAAATTACGGGCAAAAAATACGCTGTCAGCTCAGTGCGCGTGAAAAAATTCTGC
GCAACAACACAGTTTGACGCAACGAAAGTGCATTCTTCAGGTTTTGTGGCACCGTAT
ACGCTGTCGCAAGGTCTGGATCGAACACTGCAGTATGAATTCGTTCATGCCAAAAAA
GACGACATAACGTTTGTTTCTGAG
SEQ ID NO:2-Z3206的氨基酸序列
长度:331
类型:PRT
生物体:大肠杆菌O157
序列:
MNDNVLLIGASGFVGTRLLETAIADFNIKNLDKQQSHFYPEITQIGDVRDQQALDQALVGFDTVVLLAAEHRDDVSPTSLYYDVNVQGTRNVLAAMEKNGVKNIIFTSSVAVYGLNKHNPDENHPHDPFNHYGKSKWQAEEVLREWYNKAPTERSLTIIRPTVIFGERNRGNVYNLLKQIAGGKFMMVGAGTNYKSMAYVGNIVEFIKYKLKNVAAGYEVYNYVDKPDLNMNQLVAEVEQSLNKKIPSMHLPYPLGMLGGYCFDILSKITGKKYAVSSVRVKKFCATTQFDATKVHSSGFVAPYTLSQGLDRTLQYEFVHAKKDDITFVSE
SEQ ID NO:3-大肠杆菌O55gne的核苷酸序列
基因座    AF461121_1    BCT 02-MAY-2002
定义(UDP-GlcNAc 4-差向异构酶Gne[大肠杆菌(Escherichia coli)])
检索号AAL67550
长度:993
类型:DNA
生物体:大肠杆菌O55
序列:
ATGAACGATA ACGTTTTGCT CATAGGAGCT TCCGGATTCG TAGGAACCCGACTACTTGAA ACGGCAATTG CTGACTTTAA TATCAAGAAC CTGGACAAAC AGCAGAGCCACTTTTATCCA GAAATCACAC AGATTGGTGA TGTTCGTGAT CAACAGGCAC TCGACCAGGCGTTAGCCGGT TTTGACACTG TTGTGCTACT GGCAGCGGAA CACCGCGATG ACGTCAGCCCTACTTCTCTC TATTATGATG TCAACGTTCA GGGTACCCGC AATGTGCTGG CGGCCATGGAAAAAAATGGC GTTAAAAATA TCATCTTTAC CAGTTCCGTT GCTGTTTATG GTTTGAACAAACACAACCCT GACGAAAACC ATCCACACGA TCCTTTCAAC CACTACGGCA AAAGTAAGTGGCAGGCAGAG GAAGTGCTGC GTGAATGGTA TAACAAAGCA CCAACAGAAC GTTCATTAACCATCATCCGT CCTACCGTTA TCTTCGGTGA ACGGAACCGC GGTAACGTCT ATAACTTGCTGAAACAGATC GCTGGCGGCA AGTTTATGAT GGTGGGCGCA GGGACTAACT ATAAGTCCATGGCTTATGTT GGAAACATTG TTGAGTTTAT CAAGTACAAA CTGAAGAATG TTGCCGCAGGTTACGAGGTT TATAACTACG TTGATAAGCC AGACCTGAAC ATGAACCAGT TGGTTGCTGAAGTTGAACAA AGCCTGAACA AAAAGATCCC TTCTATGCAC TTGCCTTACC CACTAGGAATGCTGGGTGGA TATTGCTTTG ATATCCTGAG CAAAATTACG GGCAAAAAAT ACGCTGTCAGCTCTGTGCGC GTGAAAAAAT TCTGCGCAAC AACACAGTTT GACGCAACGA AAGTGCATTCTTCAGGTTTT GTGGCACCGT ATACGCTGTC GCAAGGTCTG GATCGAACTC TGCAGTATGAATTCGTCCAT GCCAAAAAAG ACGACATAAC GTTTGTTTCT GAG
SEQ ID NO:4-大肠杆菌O55UDP-GlcNAc 4-差向异构酶Gne的氨基酸序列
基因座    AF461121_1
定义(UDP-GlcNAc 4-差向异构酶Gne[大肠杆菌])
检索号AAL67550
长度:331aa线性
类型:PRT
生物体:大肠杆菌O55
序列:
mndnvlliga sgfvgtrlle taiadfnikn ldkqqshfyp eitqigdvrd
qqaldqalag fdtvvllaae hrddvsptsl yydvnvqgtr nvlaamekng
vkniiftssv avyglnkhnp denhphdpfn hygkskwqae evlrewynka
ptersltiir ptvifgernr gnvynllkqi aggkfmmvga gtnyksmayv
gnivefikyk lknvaagyev ynyvdkpdln mnqlvaeveq slnkkipsmh
lpyplgmlgg ycfdilskit gkkyavssvr vkkfcattqf datkvhssgf
vapytlsqgl drtlqyefvh akkdditfvs e
SEQ ID NO.5-大肠杆菌O86gne1的核苷酸序列
基因座    AAO37706    BCT 06-DEC-2005
定义UDP-GlcNAc C4-差向异构酶[大肠杆菌O86]。
检索号AAO37706
长度:993
类型:DNA
生物体:大肠杆菌O86
序列:
ATGAACGATA ACGTTTTGCT CATAGGAGCT TCCGGATTCG TAGGAACCCG ACTACTTGAA
ACGGCAATTG CTGACTTTAA TATCAAGAAC CTGGACAAAC AGCAGAGCCA CTTTTATCCA
GAAATCACAC AGATTGGTGA TGTTCGTGAT CAACAGGCAC TCGACCAGGC GTTAGCCGGT
TTTGACACTG TTGTACTACT GGCAGCGGAA CACCGCGATG ACGTCAGCCC TACTTCTCTC
TATTATGATG TCAACGTTCA GGGTACCCGC AATGTGCTGG CGGCCATGGA AAAAAATGGC
GTTAAAAATA TCATCTTTAC CAGTTCCGTT GCTGTTTATG GTTTGAACAA ACACAACCCT
GACGAAAACC ATCCACACGA CCCTTTCAAC CACTACGGCA AAAGCAAGTG GCAGGCGGAG
GAAGTGCTGC GTGAATGGTA TAACAAAGCA CCAACAGAAC GTTCATTAAC TATCATCCGT
CCTACCGTTA TCTTCGGTGA ACGCAACCGC GGTAACGTCT ATAACTTGCT GAAACAGATC
GCTGGCGGCA AGTTTATGAT GGTGGGCGCA GGGACTAACT ATAAGTCCAT GGCTTATGTT
GGAAACATTG TTGAGTTTAT CAAGTACAAA CTGAAGAATG TTGCCGCAGG TTACGAGGTT
TATAACTACG TTGATAAGCC AGACCTGAAC ATGAACCAGT TGGTTGCTGA AGTTGAACAA
AGCCTGAACA AAAAGATCCC TTCTATGCAC TTGCCTTACC CACTAGGAAT GCTGGGTGGA
TATTGCTTTG ATATCCTGAG CAAAATTACG GGCAAAAAAT ACGCTGTCAG CTCTGTGCGC
GTGAAAAAAT TCTGCGCAAC AACACAGTTT GACGCAACGA AAGTGCATTC TTCAGGTTTT
GTGGCACCGT ATACGCTGTC GCAAGGTCTG GATCGAACTC TGCAGTATGA ATTCGTCCAT
GCCAAAAAAG ACGACATAAC GTTTGTTTCT GAG
SEQ ID NO:6-大肠杆菌O86UDP-GlcNAc C4-差向异构酶的氨基酸序列
基因座    AAO37706
定义UDP-GlcNAc C4-差向异构酶[大肠杆菌O86]。
检索号AAO37706
长度:331aa线性
类型:PRT
生物体:大肠杆菌O86
序列:
mndnvlliga sgfvgtrlle taiadfnikn ldkqqshfyp eitqigdvrd
qqaldqalag fdtvvllaae hrddvsptsl yydvnvqgtr nvlaamekng
vkniiftssv avyglnkhnp denhphdpfn hygkskwqae evlrewynka
ptersltiir ptvifgernr gnvynllkqi aggkfmmvga gtnyksmayv
gnivefikyk lknvaagyev ynyvdkpdln mnqlvaeveq slnkkipsmh
lpyplgmlgg ycfdilskit gkkyavssvr vkkfcattqf datkvhssgf
vapytlsqgl drtlqyefvh akkdditfvs e
SEQ ID NO:7-鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O18gne的核苷酸序列
基因座ACD09753    BCT 05-MAY-2008
定义UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-差向异构酶[鲍氏志贺氏菌(Shigellaboydii)CDC3083-94]。
检索号ACD09753
长度:993
类型:DNA
生物体:鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O18
序列:
ATGAACGATA ACGTTTTGCT CATAGGAGCT TCCGGATTCG TAGGAACCCG ACTACTTGAA
ACGGCAATTG CTGACTTTAA TATCAAGAAC CTGGACAAAC AGCAGAGCCA TTTTTATCCA
GCAATCACAC AGATTGGCGA TGTTCGTGAT CAACAGGCAC TCGACCAGGC GTTAGCCGGT
TTTGACACTG TTGTACTACT GGCAGCGGAA CACCGCGATG ACGTCAGCCC TACTTCTCTC
TATTATGATG TCAACGTTCA GGGTACCCGC AATGTGCTGG CGGCCATGGA AAAAAATGGC
GTTAAAAATA TCATCTTTAC CAGTTCCGTT GCTGTTTATG GTTTGAACAA ACACAACCCT
GACGAAAACC ATCCACACGA CCCTTTCAAC CACTACGGCA AAAGTAAGTG GCAGGCAGAG
GAAGTGCTGC GTGAATGGTA TAACAAAGCA CCAACAGAAC GTTCATTAAC CATCATCCGT
CCTACCGTTA TCTTCGGTGA ACGCAACCGC GGTAACGTCT ATAACTTGCT GAAACAGATC
GCTGGCGGCA AGTTTATGAT GGTGGGCGCA GGGACTAACT ATAAGTCCAT GGCTTATGTT
GGAAACATTG TTGAGTTTAT CAAGTACAAA CTGAAGAATG TTGCCGCAGG TTATGAGGTT
TATAACTATG TTGATAAGCC AGACCTGAAC ATGAACCAGT TGGTTGCTGA AGTTGAACAA
AGCCTGAACA AAAAGATCCC TTCTATGCAC TTGCCTTACC CACTAGGAAT GCTGGGTGGA
TATTGCTTTG ATATCCTGAG CAAAATTACG GGCAAAAAAT ACGCTGTCAG CTCTGTGCGC
GTGAAAAAAT TCTGCGCAAC AACACAGTTT GACGCAACGA AAGTGCATTC TTCAGGTTTT
GTGGCACCGT ATACGCTGTC GCAAGGTCTG GATCGAACTC TGCAGTATGA ATTCGTCCAT
GCCAAAAAAG ACGACATAAC GTTTGTTTCT GAG
SEQ ID NO:8-鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O18UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-差向异构酶的氨基酸序列
基因座ACD09753
定义UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-差向异构酶[鲍氏志贺氏菌(Shigellaboydii)CDC3083-94]。
检索号ACD09753
长度:331aa线性
类型:PRT
生物体:鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O18
序列:
mndnvlliga sgfvgtrlle taiadfnikn ldkqqshfyp aitqigdvrd qqaldqalag
fdtvvllaae hrddvsptsl yydvnvqgtr nvlaamekng vkniiftssv avyglnkhnp
denhphdpfn hygkskwqae evlrewynka ptersltiir ptvifgernr gnvynllkqi
aggkfmmvga gtnyksmayv gnivefikyk lknvaagyev ynyvdkpdln mnqlvaeveq
slnkkipsmh lpyplgmlgg ycfdilskit gkkyavssvr vkkfcattqf datkvhssgf
vapytlsqgl drtlqyefvh akkdditfvs e
SEQ ID NO:9-肠沙门氏菌(Salmonella enterica)O30gne的核苷酸序列
基因座    AAV34516    BCT 25-OCT-2004
定义UDP-GlcNAc 4-差向异构酶[肠沙门氏菌(Salmonella enterica)亚种salamae serovar Greenside]。
检索号AAV34516
长度:993
类型:DNA
生物体:肠沙门氏菌(Salmonella enterica)O30
序列:
ATGAACGATA ACGTTTTGCT CATTGGTGCT TCCGGATTCG TAGGAACCCG ACTCCTTGAA
ACGGCAGTGG ATGATTTTAA TATCAAGAAC CTGGATAAAC AGCAAAGCCA TTTCTACCCA
GAGATTACAC ACATTGGCGA TGTTCGTGAC CAACAAATCC TTGACCAGAC GTTGGTGGGT
TTTGACACCG TAGTACTATT GGCTGCGGAG CATCGTGATG ATGTTAGTCC TACCTCGCTT
TATTATGATG TCAACGTCCA GGGAACGCGT AATGTACTGG CGGCGATGGA AAAAAATGGT
GTAAAAAATA TCATTTTTAC CAGTTCCGTT GCAGTTTATG GACTCAACAA GAAAAATCCT
GACGAAACGC ACCCTCACGA TCCCTTTAAT CATTACGGAA AAAGTAAATG GCAAGCAGAA
GAAGTTCTGC GTGAGTGGCA TGCTAAAGCG CCGAATGAGC GTTCTTTGAC CATAATTCGT
CCTACCGTTA TTTTCGGGGA GCGTAACCGC GGTAATGTAT ACAATCTCTT GAAACAGATC
GCTGGTGGTA AATTTGCGAT GGTTGGTCCG GGAACTAACT ATAAATCAAT GGCTTATGTT
GGTAATATCG TTGAGTTTAT CAAATTCAAA CTCAAGAATG TTACGGCGGG CTATGAAGTT
TATAATTATG TTGATAAACC TGATCTGAAT ATGAATCAAT TGGTTGCTGA AGTAGAGCAG
AGCCTGGGCA AAAAAATACC ATCGATGCAC CTTCCATATC CATTAGGTAT GCTGGGGGGT
TACTGTTTCG ATATCCTGAG CAAAGTAACG GGCAAGAAGT ACGCTGTAAG TTCGGTTCGT
GTTAAAAAAT TCTGTGCGAC AACGCAGTTT GATGCAACAA AAGTGCATTC TTCTGGTTTT
GTTGCGCCAT ACACCTTATC TCAGGGGTTG GATCGTACAC TGCAATATGA ATTTGTTCAT
GCAAAGAAAG ATGACATTAC ATTCGTTTCA GAG
SEQ ID NO:10-肠沙门氏菌(Salmonella enterica)O30UDP-GlcNAc 4-差向异构酶的氨基酸序列
基因座    AAV34516
定义UDP-GlcNAc 4-差向异构酶[肠沙门氏菌(Salmonella enterica)亚种salamaeserovar Greenside]。
检索号AAV34516
长度:331aa线性
类型:PRT
生物体:肠沙门氏菌(Salmonella enterica)O30
序列:
mndnvlliga sgfvgtrlle tavddfnikn ldkqqshfyp eithigdvrd qqildqtlvg
fdtvvllaae hrddvsptsl yydvnvqgtr nvlaamekng vkniiftssv avyglnkknp
dethphdpfn hygkskwqae evlrewhaka pnersltiir ptvifgernr gnvynllkqi
aggkfamvgp gtnyksmayv gnivefikfk lknvtagyev ynyvdkpdln mnqlvaeveq
slgkkipsmh lpyplgmlgg ycfdilskvt gkkyavssvr vkkfcattqf datkvhssgf
vapytlsqgl drtlqyefvh akkdditfvs e
SEQ ID NO:11-空肠弯曲杆菌(C.jejuni)gne的核苷酸序列
基因座    YP_002344524    BCT 14-SEP-2010
定义UDP-GlcNAc/Glc 4-差向异构酶[空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacterjejuni subsp.jejuni)
检索号  YP_002344524
长度:987
类型:DNA
生物体:空肠弯曲杆菌(C.jejuni)
序列:
ATGAAAATTCTTATTAGCGGTGGTGCAGGTTATATAGGTTCTCATACTTTAAGACAAT
TTTTAAAAACAGATCATGAAATTTGTGTTTTAGATAATCTTTCTAAGGGTTCTAAAAT
CGCAATAGAAGATTTGCAAAAAACAAGAGCTTTTAAATTTTTCGAACAAGATTTAAGT
GATTTTCAAGGCGTAAAAGCATTGTTTGAGAGAGAAAAATTTGACGCTATTGTGCATT
TTGCAGCAAGCATTGAAGTTTTTGAAAGTATGCAAAATCCTTTAAAATATTATATGAA
CAACACTGTTAATACGACAAATCTCATCGAAACTTGTTTGCAAACTGGAGTGAATAAA
TTTATATTTTCTTCAACGGCGGCCACTTATGGCGAACCACAAACTCCCGTTGTGAGCG
AAACAAGTCCTTTAGCACCTATTAATCCTTATGGGCGTAGTAAGCTTATGAGTGAAGA
AGTTTTGCGTGATGCAAGTATGGCAAATCCTGAATTTAAGCATTGTATTTTAAGATAT
TTTAATGTTGCAGGTGCTTGTATGGATTATACTTTAGGACAACGCTATCCAAAAGCGA
CTTTGCTTATAAAAGTTGCAGCTGAATGTGCCGCAGGAAAACGTGATAAACTTTTCAT
ATTTGGCGATGATTATGATACAAAAGATGGTACTTGCATAAGAGATTTTATCCATGTA
GATGATATTTCAAGTGCACATTTAGCGGCTTTGGATTATTTAAAAGAGAATGAAAGCA
ATGTTTTTAATGTAGGTTATGGACATGGTTTTAGCGTAAAAGAAGTGATTGAAGCGAT
GAAAAAAGTTAGCGGAGTGGATTTTAAAGTAGAACTTGCCCCACGCCGTGCGGGTGAT
CCTAGTGTATTGATTTCTGATGCAAGTAAAATCAGAAATCTTACTTCTTGGCAGCCTA
AATATGATGATTTAGAGCTTATTTGTAAATCTGCTTTTGATTGGGAAAAACAGTGTTA
A
SEQ ID NO:12-空肠弯曲杆菌(C.jejuni)UDP-GlcNAc/Glc 4-差向异构酶的氨基酸序列
基因座 YP_002344524
定义UDP-GlcNAc/Glc 4-差向异构酶[空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacterjejuni subsp.jejuni)
检索号 YP_002344524
长度:328aa线性
类型:PRT
生物体:空肠弯曲杆菌(C.jejuni)
序列:
mkilisggag yigshtlrqf lktdheicvl dnlskgskia iedlqktraf
kffeqdlsdf qgvkalfere kfdaivhfaa sievfesmqn plkyymnntv
nttnlietcl qtgvnkfifs
staatygepq tpvvsetspl apinpygrsk lmseevlrda smanpefkhc
ilryfnvaga cmdytlgqry pkatllikva aecaagkrdk lfifgddydt
kdgtcirdfi hvddissahl
aaldylkene snvfnvgygh gfsvkeviea mkkvsgvdfk velaprragd
psvlisdask irnltswqpk yddlelicks
afdwekqc
SEQ ID NO:13-大肠杆菌K12galE的核苷酸序列
基因座  AP_001390    BCT 30-APR-2010
定义UDP-半乳糖-4-差向异构酶[大肠杆菌菌株K-12亚菌株W3110]。
检索号 AP_001390
长度:1,017
类型:DNA
生物体:大肠杆菌K12
序列:
ATGAGAGTTCTGGTTACCGGTGGTAGCGGTTACATTGGAAGTCATACCTGTGTGCAAT
TACTGCAAAACGGTCATGATGTCATCATTCTTGATAACCTCTGTAACAGTAAGCGCAG
CGTACTGCCTGTTATCGAGCGTTTAGGCGGCAAACATCCAACGTTTGTTGAAGGCGAT
ATTCGTAACGAAGCGTTGATGACCGAGATCCTGCACGATCACGCTATCGACACCGTGA
TCCACTTCGCCGGGCTGAAAGCCGTGGGCGAATCGGTACAAAAACCGCTGGAATATTA
CGACAACAATGTCAACGGCACTCTGCGCCTGATTAGCGCCATGCGCGCCGCTAACGTC
AAAAACTTTATTTTTAGCTCCTCCGCCACCGTTTATGGCGATCAGCCCAAAATTCCAT
ACGTTGAAAGCTTCCCGACCGGCACACCGCAAAGCCCTTACGGCAAAAGCAAGCTGAT
GGTGGAACAGATCCTCACCGATCTGCAAAAAGCCCAGCCGGACTGGAGCATTGCCCTG
CTGCGCTACTTCAACCCGGTTGGCGCGCATCCGTCGGGCGATATGGGCGAAGATCCGC
AAGGCATTCCGAATAACCTGATGCCATACATCGCCCAGGTTGCTGTAGGCCGTCGCGA
CTCGCTGGCGATTTTTGGTAACGATTATCCGACCGAAGATGGTACTGGCGTACGCGAT
TACATCCACGTAATGGATCTGGCGGACGGTCACGTCGTGGCGATGGAAAAACTGGCGA
ACAAGCCAGGCGTACACATCTACAACCTCGGCGCTGGCGTAGGCAACAGCGTGCTGGA
CGTGGTTAATGCCTTCAGCAAAGCCTGCGGCAAACCGGTTAATTATCATTTTGCACCG
CGTCGCGAGGGCGACCTTCCGGCCTACTGGGCGGACGCCAGCAAAGCCGACCGTGAAC
TGAACTGGCGCGTAACGCGCACACTCGATGAAATGGCGCAGGACACCTGGCACTGGCA
GTCACGCCATCCACAGGGATATCCCGATTAA
SEQ ID NO:14-大肠杆菌K12UDP-半乳糖-4-差向异构酶的氨基酸序列
基因座 AP_001390
定义UDP-半乳糖-4-差向异构酶[大肠杆菌菌株K-12亚菌株W3110]。
检索号 AP_001390
长度:338aa线性
类型:PRT
生物体:大肠杆菌K12
序列:
mrvlvtggsgyigshtcvqllqnghdviildnlcnskrsvlpvierlggkhptfvegd
irnealmteilhdhaidtvihfaglkavgesvqkpleyydnnvngtlrlisamraanv
knfifsssatvygdqpkipyvesfptgtpqspygksklmveqiltdlqkaqpdwsial
lryfnpvgahpsgdmgedpqgipnnlmpyiaqvavgrrdslaifgndyptedgtgvrd
yihvmdladghvvameklankpgvhiynlgagvgnsvldvvnafskacgkpvnyhfap
rregdlpaywadaskadrelnwrvtrtldemaqdtwhwqsrhpqgypd
SEQ ID NO:15-大肠杆菌O86gne2的核苷酸序列
基因座  AAV85952    BCT 27-MAR-2005
定义Gne[大肠杆菌O86]。
检索号AAV85952
长度:1,020
类型:DNA
生物体:大肠杆菌O86
序列:
ATGGTGATTT TCGTAACAGG CGGTGCAGGA TATATTGGAT CCCATACCAT ACTTGAGTTA
CTTAATAATG GTCATGATGT CGTTTCGATA GATAATTTTG TCAATTCCTC TATAGAATCA
TTAAAAAGAG TAGAGCAAAT AACTAATAAG AAAATTATTT CTTATCAAGG TGATATCCGT
GATAAAAATC TACTTGATGA GATTTTTTCA AGACACCATA TCGATGCTGT AATTCACTTT
GCATCGTTAA AATCTGTAGG TGAGTCTAAG TTAAAGCCCT TAGAGTATTA TTCTAATAAT
GTTGGTGGAA CTTTAGTATT ACTTGAATGC ATGAAGAGAT ATAACATTAA TAAAATGATA
TTTAGCTCTT CTGCTACTGT TTATGGGAGT AACAGTATCC CTCCCCATAC GGAAGATAGA
CGAATTGGTG AAACTACAAA CCCATATGGG ACATCGAAAT TTATAATAGA AATAATTTTG
AGTGATTATT GTGATAGTGA TAATAATAAA TCAGTAATTG CACTGCGTTA CTTTAATCCA
ATCGGAGCAC ATAAGTCCGG GATGATTGGT GAAAATCCTA ACGGGATCCC TAATAATCTG
GTTCCTTATA TATCTAAAGT TGCACAAAAT CAACTTCCTG TATTAAATAT TTATGGCAAC
GATTATCCAA CTAAAGATGG TACAGGAGTA AGAGACTATA TACATGTCTG TGATTTGGCT
AAAGGGCATG TTAAAGCATT AGAATATATG TTTTTAAATG ATGTCAATTA TGAAGCTTTT
AATTTAGGTA CTGGTCAAGG TTATTCTGTT TTAGAGATTG TAAAAATGTT TGAGATAGTC
ACTAAAAAGA GTATACCTGT TGCTATTTGT AATAGACGTG AGGGGGATGT TGCGGAGTCA
TGGGCGTCTG CTGATTTGGC ACATAAAAAG CTTTCCTGGA AAGCGGAAAA AAATTTGAAA
GAAATGATCG AAGATGTATG GCGTTGGCAA ACAAACAATC CAAATGGATA TAAAAAATAA
SEQ ID NO:16-大肠杆菌O86Gne的氨基酸序列
基因座  AAV85952
定义Gne[大肠杆菌O86]。
检索号AAV85952
长度:339aa(gne2)线性
类型:PRT
生物体:大肠杆菌O86
序列:
mvifvtggag yigshtilel lnnghdvvsi dnfvnssies lkrveqitnk kiisyqgdir
dknlldeifs rhhidavihf aslksvgesk lkpleyysnn vggtlvllec mkryninkmi
fsssatvygs nsipphtedr rigettnpyg tskfiieiil sdycdsdnnk svialryfnp
igahksgmig enpngipnnl vpyiskvaqn qlpvlniygn dyptkdgtgv rdyihvcdla
kghvkaleym flndvnyeaf nlgtgqgysv leivkmfeiv tkksipvaic nrregdvaes
wasadlahkk lswkaeknlk emiedvwrwq tnnpngykk
SEQ ID NO:17-编码Z3206的末端的合成寡核苷酸Z3206-Fw(引物)的核苷酸
序列;限制位点加下画线
长度:30
类型:DNA
序列:AAACCCGGGATGAACGATAACGTTTTGCTC
SEQ ID NO:18-编码Z3206的末端的合成寡核苷酸Z3206-RvHA(引物)并具有血凝素标签(HA标签)的核苷酸序列;限制位点加下画线
长度:60
类型:DNA
生物体:
序列:AAATCTAGATTAAGCGTAATCTGGAAC
ATCGTATGGGTACTCAGAAACAAACGTTATGTC
SEQ ID NO:19-合成寡核苷酸gne-Fw(引物)的核苷酸序列，其中限制位点加下画线
长度:29
类型:DNA
生物体:
序列:AAACCATGGATGAAAATTCTTATTAGCGG
SEQ ID NO:20-合成寡核苷酸gne-RV(引物)的核苷酸序列，其中限制位点加下画线
长度:57
类型:DNA
生物体:
序列:AAATCTAGATTAAGCGTAATCTGGAAC
ATCGTATGGGTAGCACTGTTTTTCCCAATC
SEQ ID NO:21-含有NheI限制酶的限制位点的寡核苷酸的核苷酸序列
长度:11
类型:DNA
生物体:
序列:AAAAAGCTAGC
SEQ ID NO:22-含有AscI限制酶的限制位点的寡核苷酸的核苷酸序列
长度:8
类型:DNA
生物体:
序列:CCGCGCGG
SEQ ID NO:23-编码Z3206的质粒pMLBAD:Z3206(质粒中的大肠杆菌O157***片段)并具有C-端血凝素标签的核苷酸序列
定义  产物连接到Z3206-pMLBAD*
特征  位置/合格者
CDS    2105..3098
       /标记物=Z3206
CDS    3098..3127
       /标记物=HA
长度:7794bp
类型:DNA    环状UNA
序列:
1   TCTACGGGGT  CTGACGCTCA  GTGGAACGAA  ATCGATGAGC  TCGCACGAAC  CCAGTTGACA
61   TAAGCCTGTT  CGGTTCGTAA  ACTGTAATGC  AAGTAGCGTA  TGCGCTCACGCAACTGGTCC
121  AGAACCTTGA  CCGAACGCAG  CGGTGGTAAC  GGCGCAGTGG  CGGTTTTCATGGCTTGTTAT
181  GACTGTTTTT  TTGTACAGTC  TAGCCTCGGG  CATCCAAGCT  AGCTAAGCGCGTTACGCCGT
241  GGGTCGATGT  TTGATGTTAT  GGAACAGCAA  CGATGTTACG  CAGCAGGGTAGTCGCCCTAA
301  AACAAAGTTA  GGCAGCCGTT  GTGCTGGTGC  TTTCTAGTAG  TTGTTGTGGGGTAGGCAGTC
361  AGAGCTCGAT  TTGCTTGTCG  CCATAATAGA  TTCACAAGAA  GGATTCGACATGGGTCAAAG
421  TAGCGATGAA  GCCAACGCTC  CCGTTGCAGG  GCAGTTTGCG  CTTCCCCTGAGTGCCACCTT
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541  TTGGTATTGC  ACAAAACTCA  CTCCTGAAGG  CTATGCGGTC  GAGTCCGAATCCCACCCAGG
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901  TTTCTTCACA  ACCGGCACGG  AACTCGCTCG  GGCTGGCCCC  GGTGCATTTTTTAAATACCC
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SEQ ID NO:24-编码Gne的pMLBAD:gne(质粒中的大肠杆菌O157***片段)并具有C-端血凝素标签的核苷酸序列
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5161 CGATGCCCCG  TTGCAGCCCT  AGATCGGCCA  CAGCGGCCGC  AAACGTGGTCTGGTCGCGGG
5221 TCATCTGCGC  TTTGTTGCCG  ATGAACTCCT  TGGCCGACAG  CCTGCCGTCCTGCGTCAGCG
5281 GCACCACGAA  CGCGGTCATG  TGCGGGCTGG  TTTCGTCACG  GTGGATGCTGGCCGTCACGA
5341 TGCGATCCGC  CCCGTACTTG  TCCGCCAGCC  ACTTGTGCGC  CTTCTCGAAGAACGCCGCCT
5401 GCTGTTCTTG  GCTGGCCGAC  TTCCACCATT  CCGGGCTGGC  CGTCATGACGTACTCGACCG
5461 CCAACACAGC  GTCCTTGCGC  CGCTTCTCTG  GCAGCAACTC  GCGCAGTCGGCCCATCGCTT
5521 CATCGGTGCT  GCTGGCCGCC  CAGTGCTCGT  TCTCTGGCGT  CCTGCTGGCGTCAGCGTTGG
5581 GCGTCTCGCG  CTCGCGGTAG  GCGTGCTTGA  GACTGGCCGC  CACGTTGCCCATTTTCGCCA
5641 GCTTCTTGCA  TCGCATGATC  GCGTATGCCG  CCATGCCTGC  CCCTCCCTTTTGGTGTCCAA
5701 CCGGCTCGAC  GGGGGCAGCG  CAAGGCGGTG  CCTCCGGCGG  GCCACTCAATGCTTGAGTAT
5761 ACTCACTAGA  CTTTGCTTCG  CAAAGTCGTG  ACCGCCTACG  GCGGCTGCGGCGCCCTACGG
5821 GCTTGCTCTC  CGGGCTTCGC  CCTGCGCGGT  CGCTGCGCTC  CCTTGCCAGCCCGTGGATAT
5881 GTGGACGATG  GCCGCGAGCG  GCCACCGGCT  GGCTCGCTTC  GCTCGGCCCGTGGACAACCC
5941 TGCTGGACAA  GCTGATGGAC  AGGCTGCGCC  TGCCCACGAG  CTTGACCACAGGGATTGCCC
6001 ACCGGCTACC  CAGCCTTCGA  CCACATACCC  ACCGGCTCCA  ACTGCGCGGCCTGCGGCCTT
6061 GCCCCATCAA  TTTTTTTAAT  TTTCTCTGGG  GAAAAGCCTC  CGGCCTGCGGCCTGCGCGCT
6121 TCGCTTGCCG  GTTGGACACC  AAGTGGAAGG  CGGGTCAAGG  CTCGCGCAGCGACCGCGCAG
6181 CGGCTTGGCC  TTGACGCGCC  TGGAACGACC  CAAGCCTATG  CGAGTGGGGGCAGTCGAAGG
6241 CGAAGCCCGC  CCGCCTGCCC  CCCGAGCCTC  ACGGCGGCGA  GTGCGGGGGTTCCAAGGGGG
6301 CAGCGCCACC  TTGGGCAAGG  CCGAAGGCCG  CGCAGTCGAT  CAACAAGCCCCGGAGGGGCC
6361 ACTTTTTGCC  GGAGGGGGAG  CCGCGCCGAA  GGCGTGGGGG  AACCCCGCAGGGGTGCCCTT
6421 CTTTGGGCAC  CAAAGAACTA  GATATAGGGC  GAAATGCGAA  AGACTTAAAAATCAACAACT
6481 TAAAAAAGGG  GGGTACGCAA  CAGCTCATTG  CGGCACCCCC  CGCAATAGCTCATTGCGTAG
6541 GTTAAAGAAA  ATCTGTAATT  GACTGCCACT  TTTACGCAAC  GCATAATTGTTGTCGCGCTG
6601 CCGAAAAGTT  GCAGCTGATT  GCGCATGGTG  CCGCAACCGT  GCGGCACCCTACCGCATGGA
6661 GATAAGCATG  GCCACGCAGT  CCAGAGAAAT  CGGCATTCAA  GCCAAGAACAAGCCCGGTCA
6721 CTGGGTGCAA  ACGGAACGCA  AAGCGCATGA  GGCGTGGGCC  GGGCTTATTGCGAGGAAACC
6781 CACGGCGGCA  ATGCTGCTGC  ATCACCTCGT  GGCGCAGATG  GGCCACCAGAACGCCGTGGT
6841 GGTCAGCCAG  AAGACACTTT  CCAAGCTCAT  CGGACGTTCT  TTGCGGACGGTCCAATACGC
6901 AGTCAAGGAC  TTGGTGGCCG  AGCGCTGGAT  CTCCGTCGTG  AAGCTCAACGGCCCCGGCAC
6961 CGTGTCGGCC  TACGTGGTCA  ATGACCGCGT  GGCGTGGGGC  CAGCCCCGCGACCAGTTGCG
7021 CCTGTCGGTG  TTCAGTGCCG  CCGTGGTGGT  TGATCACGAC  GACCAGGACGAATCGCTGTT
7081 GGGGCATGGC  GACCTGCGCC  GCATCCCGAC  CCTGTATCCG  GGCGAGCAGCAACTACCGAC
7141 CGGCCCCGGC  GAGGAGCCGC  CCAGCCAGCC  CGGCATTCCG  GGCATGGAACCAGACCTGCC
7201 AGCCTTGACC  GAAACGGAGG  AATGGGAACG  GCGCGGGCAG  CAGCGCCTGCCGATGCCCGA
7261 TGAGCCGTGT  TTTCTGGACG  ATGGCGAGCC  GTTGGAGCCG  CCGACACGGGTCACGCTGCC
7321 GCGCCGGTAG  CACTTGGGTT  GCGCAGCAAC  CCGTAAGTGC  GCTGTTCCAGACTATCGGCT
7381 GTAGCCGCCT  CGCCGCCCTA  TACCTTGTCT  GCCTCCCCGC  GTTGCGTCGCGGTGCATGGA
7441 GCCGGGCCAC  CTCGACCTGA  ATGGAAGCCG  GCGGCACCTC  GCTAACGGATTCACCGTTTT
7501 TATCAGGCTC  TGGGAGGCAG  AATAAATGAT  CATATCGTCA  ATTATTACCTCCACGGGGAG
7561 AGCCTGAGCA  AACTGGCCTC  AGGCATTTGA  GAAGCACACG  GTCACACTGCTTCCGGTAGT
7621 CAATAAACCG  GTAAACCAGC  AATAGACATA  AGCGGCTATT  TAACGACCCTGCCCTGAACC
7681 GACGACCGGG  TCGAATTTGC  TTTCGAATTT  CTGCCATTCA  TCCGCTTATTATCACTTATT
7741 CAGGCGTAGC  ACCAGGCGTT  TAAGTCGACC  AATAAC
SEQ ID NO:25-具有信号序列的修饰EPA的氨基酸序列
公开于WO 2009/104074(作为SEQ ID NO.6)
类型:PRT
生物体:人工的
/注释=″人工序列的描述:合成多肽″
长度:643
序列:
Figure BDA00001877727000671
Figure BDA00001877727000681
Figure BDA00001877727000691
Figure BDA00001877727000701
Figure BDA00001877727000711
SEQ ID NO:26-PglB的氨基酸序列
公开于WO 2009/104074(作为SEQ ID NO.2)
长度:722
类型:PRT
生物体:空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
序列:
Figure BDA00001877727000712
Figure BDA00001877727000721
Figure BDA00001877727000731
Figure BDA00001877727000741
Figure BDA00001877727000751
SEQ ID NO:27-pCC1FOS空质粒的核苷酸序列
ORIGIN
长度:8171bp
类型:DNA    环状UNA
生物体:人工的
序列:
1   GCGGCCGCAA GGGGTTCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGGCTTAACTATG
61  CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATACCGCACAGAT
121 GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC ATTCGCCATT CAGCTGCGCAACTGTTGGGA
181 AGGGCGATCG GTGCGGGCCT CTTCGCTATT ACGCCAGCTG GCGAAAGGGGGATGTGCTGC
241 AAGGCGATTA AGTTGGGTAA CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGACGTTGTAAAACGACGGC
301 CAGTGAATTG TAATACGACT CACTATAGGG CGAATTCGAG CTCGGTACCCGGGGATCCCA
361 CGTGGCGCGC CACTAGTGCT AGCGACGTCG TGGGATCCTC TAGAGTCGACCTGCAGGCAT
421 GCAAGCTTGA GTATTCTATA GTCTCACCTA AATAGCTTGG CGTAATCATGGTCATAGCTG
481 TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGCCGGAAGCATA
541 AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGCGTTGCGCTCA
601 CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAATCGGCCAACGC
661 GAACCCCTTG CGGCCGCCCG GGCCGTCGAC CAATTCTCAT GTTTGACAGCTTATCATCGA
721 ATTTCTGCCA TTCATCCGCT TATTATCACT TATTCAGGCG TAGCAACCAGGCGTTTAAGG
781 GCACCAATAA CTGCCTTAAA AAAATTACGC CCCGCCCTGC CACTCATCGCAGTACTGTTG
841 TAATTCATTA AGCATTCTGC CGACATGGAA GCCATCACAA ACGGCATGATGAACCTGAAT
901 CGCCAGCGGC ATCAGCACCT TGTCGCCTTG CGTATAATAT TTGCCCATGGTGAAAACGGG
961 GGCGAAGAAG TTGTCCATAT TGGCCACGTT TAAATCAAAA CTGGTGAAACTCACCCAGGG
1021 ATTGGCTGAG ACGAAAAACA TATTCTCAAT AAACCCTTTA GGGAAATAGGCCAGGTTTTC
1081 ACCGTAACAC GCCACATCTT GCGAATATAT GTGTAGAAAC TGCCGGAAATCGTCGTGGTA
1141 TTCACTCCAG AGCGATGAAA ACGTTTCAGT TTGCTCATGG AAAACGGTGTAACAAGGGTG
1201 AACACTATCC CATATCACCA GCTCACCGTC TTTCATTGCC ATACGAAATTCCGGATGAGC
1261 ATTCATCAGG CGGGCAAGAA TGTGAATAAA GGCCGGATAA AACTTGTGCTTATTTTTCTT
1321 TACGGTCTTT AAAAAGGCCG TAATATCCAG CTGAACGGTC TGGTTATAGGTACATTGAGC
1381 AACTGACTGA AATGCCTCAA AATGTTCTTT ACGATGCCAT TGGGATATATCAACGGTGGT
1441 ATATCCAGTG ATTTTTTTCT CCATTTTAGC TTCCTTAGCT CCTGAAAATCTCGATAACTC
1501 AAAAAATACG CCCGGTAGTG ATCTTATTTC ATTATGGTGA AAGTTGGAACCTCTTACGTG
1561 CCGATCAACG TCTCATTTTC GCCAAAAGTT GGCCCAGGGC TTCCCGGTATCAACAGGGAC
1621 ACCAGGATTT ATTTATTCTG CGAAGTGATC TTCCGTCACA GGTATTTATTCGCGATAAGC
1681 TCATGGAGCG GCGTAACCGT CGCACAGGAA GGACAGAGAA AGCGCGGATCTGGGAAGTGA
1741 CGGACAGAAC GGTCAGGACC TGGATTGGGG AGGCGGTTGC CGCCGCTGCTGCTGACGGTG
1801 TGACGTTCTC TGTTCCGGTC ACACCACATA CGTTCCGCCA TTCCTATGCGATGCACATGC
1861 TGTATGCCGG TATACCGCTG AAAGTTCTGC AAAGCCTGAT GGGACATAAGTCCATCAGTT
1921 CAACGGAAGT CTACACGAAG GTTTTTGCGC TGGATGTGGC TGCCCGGCACCGGGTGCAGT
1981 TTGCGATGCC GGAGTCTGAT GCGGTTGCGA TGCTGAAACA ATTATCCTGAGAATAAATGC
2041 CTTGGCCTTT ATATGGAAAT GTGGAACTGA GTGGATATGC TGTTTTTGTCTGTTAAACAG
2101 AGAAGCTGGC TGTTATCCAC TGAGAAGCGA ACGAAACAGT CGGGAAAATCTCCCATTATC
2161 GTAGAGATCC GCATTATTAA TCTCAGGAGC CTGTGTAGCG TTTATAGGAAGTAGTGTTCT
2221 GTCATGATGC CTGCAAGCGG TAACGAAAAC GATTTGAATA TGCCTTCAGGAACAATAGAA
2281 ATCTTCGTGC GGTGTTACGT TGAAGTGGAG CGGATTATGT CAGCAATGGACAGAACAACC
2341 TAATGAACAC AGAACCATGA TGTGGTCTGT CCTTTTACAG CCAGTAGTGCTCGCCGCAGT
2401 CGAGCGACAG GGCGAAGCCC TCGGCTGGTT GCCCTCGCCG CTGGGCTGGCGGCCGTCTAT
2461 GGCCCTGCAA ACGCGCCAGA AACGCCGTCG AAGCCGTGTG CGAGACACCGCGGCCGGCCG
2521 CCGGCGTTGT GGATACCTCG CGGAAAACTT GGCCCTCACT GACAGATGAGGGGCGGACGT
2581 TGACACTTGA GGGGCCGACT CACCCGGCGC GGCGTTGACA GATGAGGGGCAGGCTCGATT
2641 TCGGCCGGCG ACGTGGAGCT GGCCAGCCTC GCAAATCGGC GAAAACGCCTGATTTTACGC
2701 GAGTTTCCCA CAGATGATGT GGACAAGCCT GGGGATAAGT GCCCTGCGGTATTGACACTT
2761 GAGGGGCGCG ACTACTGACA GATGAGGGGC GCGATCCTTG ACACTTGAGGGGCAGAGTGC
2821 TGACAGATGA GGGGCGCACC TATTGACATT TGAGGGGCTG TCCACAGGCAGAAAATCCAG
2881 CATTTGCAAG GGTTTCCGCC CGTTTTTCGG CCACCGCTAA CCTGTCTTTTAACCTGCTTT
2941 TAAACCAATA TTTATAAACC TTGTTTTTAA CCAGGGCTGC GCCCTGTGCGCGTGACCGCG
3001 CACGCCGAAG GGGGGTGCCC CCCCTTCTCG AACCCTCCCG GTCGAGTGAGCGAGGAAGCA
3061 CCAGGGAACA GCACTTATAT ATTCTGCTTA CACACGATGC CTGAAAAAACTTCCCTTGGG
3121 GTTATCCACT TATCCACGGG GATATTTTTA TAATTATTTT TTTTATAGTTTTTAGATCTT
3181 CTTTTTTAGA GCGCCTTGTA GGCCTTTATC CATGCTGGTT CTAGAGAAGGTGTTGTGACA
3241 AATTGCCCTT TCAGTGTGAC AAATCACCCT CAAATGACAG TCCTGTCTGTGACAAATTGC
3301 CCTTAACCCT GTGACAAATT GCCCTCAGAA GAAGCTGTTT TTTCACAAAGTTATCCCTGC
3361 TTATTGACTC TTTTTTATTT AGTGTGACAA TCTAAAAACT TGTCACACTTCACATGGATC
3421 TGTCATGGCG GAAACAGCGG TTATCAATCA CAAGAAACGT AAAAATAGCCCGCGAATCGT
3481 CCAGTCAAAC GACCTCACTG AGGCGGCATA TAGTCTCTCC CGGGATCAAAAACGTATGCT
3541 GTATCTGTTC GTTGACCAGA TCAGAAAATC TGATGGCACC CTACAGGAACATGACGGTAT
3601 CTGCGAGATC CATGTTGCTA AATATGCTGA AATATTCGGA TTGACCTCTGCGGAAGCCAG
3661 TAAGGATATA CGGCAGGCAT TGAAGAGTTT CGCGGGGAAG GAAGTGGTTTTTTATCGCCC
3721 TGAAGAGGAT GCCGGCGATG AAAAAGGCTA TGAATCTTTT CCTTGGTTTATCAAACGTGC
3781 GCACAGTCCA TCCAGAGGGC TTTACAGTGT ACATATCAAC CCATATCTCATTCCCTTCTT
3841 TATCGGGTTA CAGAACCGGT TTACGCAGTT TCGGCTTAGT GAAACAAAAGAAATCACCAA
3901 TCCGTATGCC ATGCGTTTAT ACGAATCCCT GTGTCAGTAT CGTAAGCCGGATGGCTCAGG
3961 CATCGTCTCT CTGAAAATCG ACTGGATCAT AGAGCGTTAC CAGCTGCCTCAAAGTTACCA
4021 GCGTATGCCT GACTTCCGCC GCCGCTTCCT GCAGGTCTGT GTTAATGAGATCAACAGCAG
4081 AACTCCAATG CGCCTCTCAT ACATTGAGAA AAAGAAAGGC CGCCAGACGACTCATATCGT
4141 ATTTTCCTTC CGCGATATCA CTTCCATGAC GACAGGATAG TCTGAGGGTTATCTGTCACA
4201 GATTTGAGGG TGGTTCGTCA CATTTGTTCT GACCTACTGA GGGTAATTTGTCACAGTTTT
4261 GCTGTTTCCT TCAGCCTGCA TGGATTTTCT CATACTTTTT GAACTGTAATTTTTAAGGAA
4321 GCCAAATTTG AGGGCAGTTT GTCACAGTTG ATTTCCTTCT CTTTCCCTTCGTCATGTGAC
4381 CTGATATCGG GGGTTAGTTC GTCATCATTG ATGAGGGTTG ATTATCACAGTTTATTACTC
4441 TGAATTGGCT ATCCGCGTGT GTACCTCTAC CTGGAGTTTT TCCCACGGTGGATATTTCTT
4501 CTTGCGCTGA GCGTAAGAGC TATCTGACAG AACAGTTCTT CTTTGCTTCCTCGCCAGTTC
4561 GCTCGCTATG CTCGGTTACA CGGCTGCGGC GAGCGCTAGT GATAATAAGTGACTGAGGTA
4621 TGTGCTCTTC TTATCTCCTT TTGTAGTGTT GCTCTTATTT TAAACAACTTTGCGGTTTTT
4681 TGATGACTTT GCGATTTTGT TGTTGCTTTG CAGTAAATTG CAAGATTTAATAAAAAAACG
4741 CAAAGCAATG ATTAAAGGAT GTTCAGAATG AAACTCATGG AAACACTTAACCAGTGCATA
4801 AACGCTGGTC ATGAAATGAC GAAGGCTATC GCCATTGCAC AGTTTAATGATGACAGCCCG
4861 GAAGCGAGGA AAATAACCCG GCGCTGGAGA ATAGGTGAAG CAGCGGATTTAGTTGGGGTT
4921 TCTTCTCAGG CTATCAGAGA TGCCGAGAAA GCAGGGCGAC TACCGCACCCGGATATGGAA
4981 ATTCGAGGAC GGGTTGAGCA ACGTGTTGGT TATACAATTG AACAAATTAATCATATGCGT
5041 GATGTGTTTG GTACGCGATT GCGACGTGCT GAAGACGTAT TTCCACCGGTGATCGGGGTT
5101 GCTGCCCATA AAGGTGGCGT TTACAAAACC TCAGTTTCTG TTCATCTTGCTCAGGATCTG
5161 GCTCTGAAGG GGCTACGTGT TTTGCTCGTG GAAGGTAACG ACCCCCAGGGAACAGCCTCA
5221 ATGTATCACG GATGGGTACC AGATCTTCAT ATTCATGCAG AAGACACTCTCCTGCCTTTC
5281 TATCTTGGGG AAAAGGACGA TGTCACTTAT GCAATAAAGC CCACTTGCTGGCCGGGGCTT
5341 GACATTATTC CTTCCTGTCT GGCTCTGCAC CGTATTGAAA CTGAGTTAATGGGCAAATTT
5401 GATGAAGGTA AACTGCCCAC CGATCCACAC CTGATGCTCC GACTGGCCATTGAAACTGTT
5461 GCTCATGACT ATGATGTCAT AGTTATTGAC AGCGCGCCTA ACCTGGGTATCGGCACGATT
5521 AATGTCGTAT GTGCTGCTGA TGTGCTGATT GTTCCCACGC CTGCTGAGTTGTTTGACTAC
5581 ACCTCCGCAC TGCAGTTTTT CGATATGCTT CGTGATCTGC TCAAGAACGTTGATCTTAAA
5641 GGGTTCGAGC CTGATGTACG TATTTTGCTT ACCAAATACA GCAATAGTAATGGCTCTCAG
5701 TCCCCGTGGA TGGAGGAGCA AATTCGGGAT GCCTGGGGAA GCATGGTTCTAAAAAATGTT
5761 GTACGTGAAA CGGATGAAGT TGGTAAAGGT CAGATCCGGA TGAGAACTGTTTTTGAACAG
5821 GCCATTGATC AACGCTCTTC AACTGGTGCC TGGAGAAATG CTCTTTCTATTTGGGAACCT
5881 GTCTGCAATG AAATTTTCGA TCGTCTGATT AAACCACGCT GGGAGATTAGATAATGAAGC
5941 GTGCGCCTGT TATTCCAAAA CATACGCTCA ATACTCAACC GGTTGAAGATACTTCGTTAT
6001 CGACACCAGC TGCCCCGATG GTGGATTCGT TAATTGCGCG CGTAGGAGTAATGGCTCGCG
6061 GTAATGCCAT TACTTTGCCT GTATGTGGTC GGGATGTGAA GTTTACTCTTGAAGTGCTCC
6121 GGGGTGATAG TGTTGAGAAG ACCTCTCGGG TATGGTCAGG TAATGAACGTGACCAGGAGC
6181 TGCTTACTGA GGACGCACTG GATGATCTCA TCCCTTCTTT TCTACTGACTGGTCAACAGA
6241 CACCGGCGTT CGGTCGAAGA GTATCTGGTG TCATAGAAAT TGCCGATGGGAGTCGCCGTC
6301 GTAAAGCTGC TGCACTTACC GAAAGTGATT ATCGTGTTCT GGTTGGCGAGCTGGATGATG
6361 AGCAGATGGC TGCATTATCC AGATTGGGTA ACGATTATCG CCCAACAAGTGCTTATGAAC
6421 GTGGTCAGCG TTATGCAAGC CGATTGCAGA ATGAATTTGC TGGAAATATTTCTGCGCTGG
6481 CTGATGCGGA AAATATTTCA CGTAAGATTA TTACCCGCTG TATCAACACCGCCAAATTGC
6541 CTAAATCAGT TGTTGCTCTT TTTTCTCACC CCGGTGAACT ATCTGCCCGGTCAGGTGATG
6601 CACTTCAAAA AGCCTTTACA GATAAAGAGG AATTACTTAA GCAGCAGGCATCTAACCTTC
6661 ATGAGCAGAA AAAAGCTGGG GTGATATTTG AAGCTGAAGA AGTTATCACTCTTTTAACTT
6721 CTGTGCTTAA AACGTCATCT GCATCAAGAA CTAGTTTAAG CTCACGACATCAGTTTGCTC
6781 CTGGAGCGAC AGTATTGTAT AAGGGCGATA AAATGGTGCT TAACCTGGACAGGTCTCGTG
6841 TTCCAACTGA GTGTATAGAG AAAATTGAGG CCATTCTTAA GGAACTTGAAAAGCCAGCAC
6901 CCTGATGCGA CCACGTTTTA GTCTACGTTT ATCTGTCTTT ACTTAATGTCCTTTGTTACA
6961 GGCCAGAAAG CATAACTGGC CTGAATATTC TCTCTGGGCC CACTGTTCCACTTGTATCGT
7021 CGGTCTGATA ATCAGACTGG GACCACGGTC CCACTCGTAT CGTCGGTCTGATTATTAGTC
7081 TGGGACCACG GTCCCACTCG TATCGTCGGT CTGATTATTA GTCTGGGACCACGGTCCCAC
7141 TCGTATCGTC GGTCTGATAA TCAGACTGGG ACCACGGTCC CACTCGTATCGTCGGTCTGA
7201 TTATTAGTCT GGGACCATGG TCCCACTCGT ATCGTCGGTC TGATTATTAGTCTGGGACCA
7261 CGGTCCCACT CGTATCGTCG GTCTGATTAT TAGTCTGGAA CCACGGTCCCACTCGTATCG
7321 TCGGTCTGAT TATTAGTCTG GGACCACGGT CCCACTCGTA TCGTCGGTCTGATTATTAGT
7381 CTGGGACCAC GATCCCACTC GTGTTGTCGG TCTGATTATC GGTCTGGGACCACGGTCCCA
7441 CTTGTATTGT CGATCAGACT ATCAGCGTGA GACTACGATT CCATCAATGCCTGTCAAGGG
7501 CAAGTATTGA CATGTCGTCG TAACCTGTAG AACGGAGTAA CCTCGGTGTGCGGTTGTATG
7561 CCTGCTGTGG ATTGCTGCTG TGTCCTGCTT ATCCACAACA TTTTGCGCACGGTTATGTGG
7621 ACAAAATACC TGGTTACCCA GGCCGTGCCG GCACGTTAAC CGGGCTGCATCCGATGCAAG
7681 TGTGTCGCTG TCGACGAGCT CGCGAGCTCG GACATGAGGT TGCCCCGTATTCAGTGTCGC
7741 TGATTTGTAT TGTCTGAAGT TGTTTTTACG TTAAGTTGAT GCAGATCAATTAATAC GATA
7801 CCTGCGTCAT AATTGATTAT TTGACGTGGT TTGATGGCCT CCACGCACGTTGTGATATGT
7861 AGATGATAAT CATTATCACT TTACGGGTCC TTTCCGGTGA TCCGACAGGTTACGGGGCGG
7921 CGACCTCGCG GGTTTTCGCT ATTTATGAAA ATTTTCCGGT TTAAGGCGTTTCCGTTCTTC
7981 TTCGTCATAA CTTAATGTTT TTATTTAAAA TACCCTCTGA AAAGAAAGGAAACGACAGGT
8041 GCTGAAAGCG AGCTTTTTGG CCTCTGTCGT TTCCTTTCTC TGTTTTTGTCCGTGGAATGA
8101 ACAATGGAAG TCCGAGCTCA TCGCTAATAA CTTCGTATAG CATACATTATACGAAGTTAT
8161 ATTCGATCCA C
SEQ ID NO:28-pCC1FOS cut(pFOS)和弗氏志贺氏菌(S.flexneri)6O-抗原无
Z3206的核苷酸序列
基因座  pFOS cut和O-抗原cut(-Z3206)
定义具有MCS盒并用NheI和AscI切割的反向pCC1FOS连接到用galFNheI
和wzzAscI扩增并用NheI和AscI切割的弗氏志贺氏菌(S.flexneri)6O抗原簇
Figure BDA00001877727000821
Figure BDA00001877727000831
长度:20982bp
类型:DNA    环状UNA
序列:
1     CTAGCGGCAA  AACGTATGCC  GGGTGACCTC  TCTGAATACT  CCGTCATCCA  GACCAAAGAA
61    CCGCTGGATC  GCGAAGGTAA  AGTCAGCCGC  ATTGTTGAAT  TTATCGAAAAACCGGATCAG
121   CCGCAGACGC  TGGACTCAGA  CATCATGGCC  GTTGGTCGCT  ATGTGCTTTCTGCCGATATT
181   TGGCCGGAAC  TTGAACGTAC  TCAGCCTGGT  GCATGGGGAC  GTATTCAGCTGACTGATGCC
241   ATTGCCGAGC  TGGCGAAAAA  ACAGTCCGTT  GATGCAATGC  TGATGACCGGCGACAGCTAC
301   GACTGCGGTA  AAAAAATGGG  CTATATGCAG  GCGTTTGTGA  AGTATGGGCTGCGCAACCTG
361   AAAGAAGGGG  CGAAGTTCCG  TAAAGGTATT  GAGAAGCTGT  TAAGCGAATAATGAAAATCT
421   GACCGGATGT  AACGGTTGAT  AAGAAAATTA  TAACGGCAGT  GAAGATTCGTGGTGAAAGTA
481   ATTTGTTGCG  AATATTCCTG  CCGTTGTTTT  ATATAAACAA  TCAGAATAACAACGAGTTAG
541   CAATAGGATT  TTAGTCAAAG  TTTTCCAGGA  TTTTCCTTGT  TTCCAGAGCGGATTGGTAAG
601   ACAATTAGCT  TTTGAATTTT  TCGGGTTTAG  CGCGAGTGGG  TAACGCTCGTCACATCGTAG
661   GCATGCATGC  AGTGCTCTGG  TAGCTGTAAA  GCCAGGGGCG  GTAGCGTGCATTAATACTTC
721   TATTAATCAA  ACTGAGAGCC  GCTTATTTCA  CAGCATGCTC  TGAAGCAATATGGAATAAAT
781   TAGGTGAAAA  TACTTGTTAC  TGGTGGCGCA  GGATTTATTG  GTTTTGCTGTAGTTCGTCAC
841   ATTATAAATA  ATACGCAGGA  TAGTGTTGTT  AATGTCGATA  AATTAACGTACGCCGGAAAC
901   CTGGAATCAC  TTGCTGATGT  TTCTGATTCT  GAACGCTATG  TTTTTGAACATGCGGATATT
961   TGCGATGCAG  CTGCAATGGC  ACGGATTTTT  GCTCAGCATC  AGCCAGATGCAGTGATGCAC
1021  CTGGCTGCTG  AAAGCCATGT  TGACCGTTCA  ATTACAGGTC  CTGCGGCATTTATTGAAACC
1081  AATATTGTTG  GTACATATGT  CCTTTTGGAA  GCCGCTCGCA  ATTATTGGTCTGCTCTTGAT
1141  AGCGACAAGA  AAACTAGATT  CCGTTTTCAT  CATATTTCTA  CTGACGAAGTCTATGGTGAT
1201  TTGCCTCATC  CTGACGAGGT  AAATAATACA  GAAGAATTAC  CCTTATTTACAGAGACAACA
1261  GCTTACGCGC  CAAGCAGCCC  TTATTCCGCT  TCAAAAGCAT  CCAGCGATCATTTAGTCCGC
1321  GCGTGGAAAC  GTACCTATGG  TTTACCAACC  ATTGTGACTA  ATTGCTCTAATAATTATGGT
1381  CCTTATCATT  TCCCGGAAAA  ATTGATTCCA  TTGGTTATTC  TGAATGCTCTGGAAGGTAAG
1441  GCATTACCTA  TTTATGGCAA  AGGGGATCAA  ATTCGTGACT  GGCTGTATGTTGAAGATCAT
1501  GCGCGTGCGT  TATATACCGT  CGTAACCGAA  GGTAAAGCGG  GTGAAACTTATAACATTGGT
1561  GGACACAACG  AAAAGAAAAA  CATCGATGTA  GTGCTCACTA  TTTGTGATTTGCTGGATGAG
1621  ATTGTACCGA  AAGAGAAATC  TTACCGCGAG  CAAATTACTT  ATGTTGCCGATCGCCCGGGA
1681  CACGATCGCC  GTTATGCGAT  TGATGCAGAG  AAGATTAGCC  GCGAATTGGGCTGGAAACCG
1741  CAGGAAACGT  TTGAGAGCGG  GATTCGGAAG  ACATTGGAAT  GGTACCTGTCCAATACAAAA
1801  TGGGTTGATA  ATGTGAAAAG  TGGTGCTTAT  CAATCGTGGA  TTGAACAGAACTATGAGGGC
1861  CGCCAGTAAT  GAATATCCTC  CTTTTCGGCA  AAACAGGGCA  GGTAGGTTGGGAACTACAGC
1921  GTGCTCTGGC  ACCTTTGGGT  AATTTGATTG  CTCTTGATGT  TCACTCCACTGATTATTGTG
1981  GTGATTTTAG  TAATCCTGAA  GGTGTAGCTG  AAACAGTCAA  AAGAATTCGACCTGATGTTA
2041  TTGTTAATGC  TGCGGCTCAC  ACCGCAGTAG  ATAAGGCTGA  GTCAGAACCCGAATTTGCAC
2101  AATTACTCAA  TGCGACTAGT  GTTGAATCAA  TTGCAAAAGA  GGCTAATGAAGTTGGGGCTT
2161  GGGTAATTCA  TTACTCAACT  GACTACGTAT  TCCCTGGAAA  TGGCGACACGCCATGGCTGG
2221  AGACGGATGC  AACCGCACCG  CTAAATGTTT  ACGGTGAAAC  CAAGTTAGCCGGAGAAAAAG
2281  CGTTACAGGA  ACATTGCGCG  AAGCATCTTA  TTTTCCGTAC  CAGCTGGGTATACGCAGCTA
2341  AAGGAAATAA  CTTCGCCAAA  ACGATGTTGC  GTCTGGCAAA  AGAGCGCGAAGAACTGGCTG
2401  TGATAAATGA  TCAATTTGGT  GCGCCAACAG  GTGCTGAGCT  GCTGGCTGATTGTACGGCAC
2461  ATGCTATTCG  TGTGGCACTG  AATAAACCGG  AAGTCGCAGG  TTTGTACCATCTGGTAGCCA
2521  GTGGTACCAC  AACCTGGCAC  GATTATGCTG  CGCTGGTTTT  TGAAGAGGCGCGCAAAGCAG
2581  GTATTCCCCT  TGCACTCAAC  AAGCTCAACG  CAGTACCAAC  AACAGCCTATCCTACACCAG
2641  CTCGTCGTCC  ACATAACTCT  CGCCTTAATA  CAGAAAAATT  TCAGCAGAACTTTGCGCTTG
2701  TCTTGCCTGA  CTGGCAGGTT  GGTGTGAAAC  GAATGCTCAA  CGAATTAATTACGACTACAG
2761  CAATTTAATA  GTTTTTGCAT  CTTGTTCGTG  ATGGTGGAGC  AAGATGAATTAAAAGGAATG
2821  ATGAAATGAA  AACGCGTAAA  GGTATTATTT  TAGCGGGTGG  TTCTGGTACACGTCTTTATC
2881  CTGTGACTAT  GGCTGTCAGT  AAACAGCTAT TACCTATTTA  TGATAAGCCGATGATCTATT
2941  ACCCGCTCTC  TACACTGATG  TTGGCGGGTA  TTCGCGATAT  TCTGATTATTAGTACGCCAC
3001  AGGATACTCC  TCGTTTTCAA  CAACTGCTAG  GTGACGGTAG  CCAGTGGGGGCTAAATCTTC
3061  AGTACAAAGT  GCAACCGACT  CCAGATGGGC  TTGCGCAGGC  GTTTATTATCGGTGAAGAGT
3121  TTATCGGTGG  TGATGATTGT  GCTTTGGTTC  TTGGTGATAA  TATCTTCTACGGTCATGATC
3181  TGCCGAAGTT  AATGGATGTC  GCTGTTAACA  AAGAAAGTGG  TGCAACGGTATTTGCCTATC
3241  ACGTTAATGA  TCCTGAACGC  TACGGCGTCG  TTGAGTTTGA  TAAAAACGGTACGGCAATAA
3301  GCCTGGAAGA  AAAACCGCTA  CAACCAAAAA  GTAATTATGC  GGTAACCGGGCTTTATTTCT
3361  ATGATAACGA  CGTTGTCGAA  ATGGCGAAAA  ACCTTAAGCC  TTCTGCCCGTGGTGAACTGG
3421  AAATTACCGA  TATTAACCGT  ATTTATATGG  AACAGGGGCG  TTTATCCGTTGCCATGATGG
3481  GGCGTGGTTA  TGCATGGCTG  GATACGGGGA  CACATCAGAG  TCTTATTGAAGCAAGCAACT
3541  TCATTGCCAC  CATTGAAGAG  CGCCAGGGAC  TAAAGGTTTC  CTGCCCAGAAGAAATTGCTT
3601  ACCGTAAAGG  GTTTATTGAT  GCTGAACAGG  TGAAAGCATT  AGCGGAGCCGCTGAAAAAAA
3661  ATGCTTATGG  ACAGTATCTG  CTGAAAATGA  TTAAAGGTTA  TTAATAAAATGAACGTAATT
3721  AAAACAGAAA  TTCCTGATGT  GTTAATTTTC  GAGCCGAAAG  TTTTTGGTGATGAGCGTGGT
3781  TTCTTTATGG  AAAGCTTTAA  TCAGAAAGTT  TTCGAAGAAG  CTGTAGGACGTAAGGTTGAA
3841  TTTGTTCAGG  ATAACCATTC  GAAGTCTAGT  AAAGGTGTTT  TACGCGGGCTGCATTATCAG
3901  TTAGAACCTT  ATGCGCAAGG  GAAACTGGTA  CGTTGCGTTG  TTGGTGAGGTTTTTGATGTA
3961  GCTGTTGATA  TTCGTAAATC  GTCGCCTACC  TTTGGTAAAT  GGGTTGGGGTGAATTTATCT
4021  GCTGAGAATA  AGCGGCAATT  GTGGATCCCT  GAGGGATTTG  CACATGGTTTTTTGGTGCTG
4081  AGCGAGACTG  CGGAATTTTT  ATATAAAACG  ACGAACTATT  ATCATCCTGATAGTGATAGA
4141  GGGATTGTAT  GGAATGATCC  TATTCTGAGC  ATAAAATGGC  CGACGATAGAACATAATAAT
4201  TATATTTTAT  CGATTAAAGA  TGCAAGGGCT  AAAGAATTGC  ATAACATGAAGGAATTATTT
4261  TTGTGAGTAT  TGTAAAGAAT  ACTTTATGGA  ATATAAGTGG  GTATATTATACCATCATTAA
4321  TAGCAATTCC  TGCGTTAGGT  ATACTGTCTA  GAATTCTAGG  GACCGAGCAATTTGGCCTTT
4381  TTACGTTAGC  TATTGCCTTA  GTTGGATATG  CAAGTATTTT  TGATGCTGGATTGACCAGAG
4441  CTGTTATAAG  AGAAGTATCA  ATATATAAAA  ATGTTCATAA  AGAATTAAGAGCGATCATTT
4501  CAACTTCAAC  GGTAATTCTA  ACTATATTGG  GCTTGATTGG  CGGTAGTGTACTATTTTTGA
4561  GTAGCAATGT  AATTGTTAAA  TTATTAAACA  TTAACGCGAA  TCATGTTGTAGAATCTGTCA
4621  AAGCAATATA  TATTATTTCA  GCTACCATAC  CCTTATACTT  GTTAAACCAAGTCTGGTTGG
4681  GGATTTTTGA  GGGGATGGAA  AAGTTCAGAA  AAGTAAATTT  AATAAAATCAATTAACAACT
4741  CTTTTGTGGC  TGGATTACCA  GTGATTTTCT  GTTTTTTTCA  TGGAGGATTACTAAGTGCTA
4801  TATATGGTTT  AGTTATGGCA  AGAGTCTTAT  CACTTATAGT  GACCTTTATATTTAGTCGAA
4861  AACTAATAAT  ATCATCTGGG  CTGTCTGTAA  AAATTGTAAC  AGTTAAAAGATTAATCGGCT
4921  TTGGAAGCTG  GATAACAGTT  AGCAATATTA  TTAGCCCTAT  TATGACATATATGGATCGTT
4981  TTATTCTTTC  ACACATTGTG  GGGGCTGATA  AAGTTTCTTT  TTATACTGCTCCGTCTGAAG
5041  GTATACAACG  CTTAACGATA  TTACCAAGTG  CGTTGTCCAG  AGCTATTTTTCCAAGATTAA
5101  GTTCAGAATT  GCAATCGGTA  AAGCAAACTA  AAATATTATC  ATATTTTATAATGGTTATTG
5161  GTATACTTCC  AATTGTAATG  TTGATAATTA  TTTTATCAGA  TTTTATAATGTCCGCTTGGA
5221  TGGGACCTAC  ATATCATGGG  ACGCCAGGTA  TAGTATTAAA  AATTCTTGCAATAGGTTTCT
5281  TTTTTAATTG  CATTGCACAA  ATCCCATTTG  TTTCAGTTCA  GGCTAGTGGAAGATCAAAAA
5341  TTACAGCTAT  TATTCATTTG  CTCGAAGTTA  TCCCATATTT  ATGCATATTATATATTTTTA
5401  TTTATCATTG  GGGAATTGTT  GGAGCCGCAA  TAGCATGGTC  TGTAAGAACATCGTTAGATT
5461  TTTTGATATT  ATTATTAATT  GATACGAAAT  ATTAATAGCG  AATTGATTTTAGGGATTACT
5521  TCCTCAAGCC  CATCTAATTA  GAGTGCAAAC  ATGACTTCTG  ATTTTTATAACTCAAAAGAC
5581  AAAAGTTTAA  GTGTTCTTTT  GTTTTTTGGG  TTTATATTTT  TCCTTACACGTAGCTTTCCA
5641  TTTATTCAAT  ATAGTTGGAT  TATGGAGGGG  TTTTTATGTC  TTTGTATCATGTCATTTACA
5701  AAGAAAATTG  CAAACGGAAT  ATATCACTAT  CCTGTTATTT  TAATATTTCTATTAGCTCTT
5761  TTTATAAATT  TTATTTATTC  CTATATCAAG  GGTAACGATA  TAGCGATAATAATTAGGTTT
5821  TATATTATCA  TATTATTTAT  ATTATGTGCT  TATTTCTGCT  CTTATGGAACCATCTCGATT
5881  GTTAAAATAT  TTTTATATTT  AATGGTATTA  CAGGCGGTTA  TTATATCCATCATTAGTATT
5941  TATATGACAA  AAACATATGG  TATTGGTGAT  TATTCAGCAC  TAAGACATTATTTTTTGGAG
6001  AATGATTATG  GTGATGTTTA  TACATATGGA  AGTGGTTTCT  ATAGAGTTCAAATTAAAGGA
6061  AATGCTCTCA  TTCCATTTGC  CTTTATGTTG  CATATAGTCA  TAAAAGATTATTTCTATTAT
6121  CGATTCAAAA  ATACAATAAC  CGTTATTCTG  GCTATAGGTA  CTATAGTGGCTGGTAATTTT
6181  GCATATTTTG  TTTCGATATG  CTTGTTTTTT  ATGTATATTA  TACTATGTTCTAAATCTAAC
6241  TCACGATACG  CTAAATTAAG  GAAAATTATT  TTTGGGGTTT  TTCTTACTGTGATTCTCCCT
6301  TTTTTTATTA  CATATTCAAT  TGAGTTGATA  ATCATGAAAT  CAAATGGAGCTGATTCTTCT
6361  TTAGGAGTTA  GATGGGATCA  GTTTACTGTA  TTAATTAATG  ATCTTACAGAGTCTGTATCA
6421  AATTTTGTTA  TAGGTTCTGG  TTTGGGTAAT  GTCATCAAAA  TTCAAACTCCTATCCGTGAT
6481  TATAGTGCAT  ATATATATTA  TGAATTGCAG  TCAGTTTATT  TTTTAAATCAACTTGGCGTT
6541  ATTTTATTTA  CTTTGTTTTT  ATTAATTAAT  CTCCTTCTCA  CGATTAAAATCATAAAATAC
6601  AGTGAGTTGT  GTGTGCTATA  TTTTCTATAT  GTTTCTTATG  CAATTACTAATCCTTATATT
6661  TTAGACTCTA  ACCATGTTGC  TGTAATAATT  GTATTAGTGA  CATTAAGTAATGTTCTAAAA
6721  AAGATGAAAG  CTAAATGAAG  GTTTTAAGGT  GAAGATGGAC  ACTGTATATGCCGTTTTGGT
6781  TGCTTACAAC  CCAGAACATA  ATGATTTAAA  AAATGCGGTT  GAATTATTGTTGAGACAAGT
6841  TACTAAAGTT  GTCGTTTGCA  ATAACTCTAC  AAATGGTTAT  AAATATGCTGAAAATTCTTC
6901  AGGCGATGTA  AAAATATTCA  ATTTCAATGA  TAATTTAGGC  ATAGCAGAAGCCCAAAGTAT
6961  AGGAATGAAA  TGGGCTTTTG  AAAATGGCGC  TGATTTTATA  TTGCAAATGGATCAGGATAG
7021  TATTCCTGAT  CCTAAGATGG  TAGAGCAGTT  ACTTACTTGT  TACAAAAAATTGCTTAAACA
7081  AAATGTCAAT  GTTGGTTTAG  TTGGTTCACA  AGATTTTGAT  AAAGTAACTGGTGAATTAAA
7141  TAAAGCAAGG  GTAAAAAAAG  GGAAACCACT  TACAGAAGTT  TATTATGAGGTAGATAGTAC
7201  ATTAAGTTCT  GGCAGTCTAA  TACCAAAAAA  TAGTTGGTTG  ATTGTTGGAGGAATGAAAGA
7261  TGAGCTTTTT  ATCGATGCGG  TAGACCATGA  ATATTGTTGG  AGATTAAGAGCTGCTGGGTT
7321  TAAAGTAATT  AGGAATAAAA  ATGCGTTACT  TGCACATAGA  CTTGGAGATGGGCGATTTAA
7381  GATCTTAAAT  ATTCTTTCTG  TCGGTTTGCC  AAGCCCATTT  CGTCATTATTATGCTACTCG
7441  AAATATCTTT  CTTTTATTAA  ATAAAAATTA  TGTACCCATC  TACTGGAAAATTTCTAGTCT
7501  GGTTAAATTA  ATTGGAAAGG  TTTTTTTATA  TCCTATTTTC  CTTCCAAATGGTAATAAAAG
7561  GTTATATTTT  TTTTTAAAAG  GCATTAATGA  CGGTTTAATG  GGTCGAAGTGGTAAAATGAA
7621  ATGAATCATA  GATTAGAAAA  ATTCTCAGTT  TTAATTAGCA  TTTATAAAAATGATCTACCG
7681  CAATTTTTTG  AGGTGGCTCT  ACGCTCTATT  TTTCACGATC  AAACACTTAAGCCAGATCAA
7741  ATAGTAATTG  TTGCAGATGG  AGAACTCCAT  CAAACACACA  TCGATATTATAAATTCATTC
7801  ATTGATGATG  TTGGCAATAA  AATAGTAACA  TTTGTACCTT  TACCTAGAAATGTTGGATTG
7861  GCTAATGCCT  TAAATGAAGG  ATTAAAGGCT  TGTAGGAATG  AGTTAGTGGCAAGAATGGAT
7921  GCTGATGATA  TTTCTTTGCC  TCATCGGTTT  GAGAAACAAA  TTTCTTTTATGATTAATAAT
7981  TCAGAAATAG  ATGTATGTGG  CAGTTTTATT  GATGAAATTG  AAACTGTTACTGAGGAGTTT
8041  ATTTCAACAC  GCAAAGTGCC  TCTCGAACAT  AGAGAAATAG  TTAAATTCGCGAGGAAACGA
8101  AGCGCAGTTA  GCCATCCTTC  TGTAATTTTT  AGAAAGAATA  CAGTATTAGCTGTTGGTGGT
8161  TATCCTCCAT  TCAGAAAATC  TCAAGATTTT  GCATTGTGGA  GCCTATTAATTGTACATAAT
8221  GCAAGATTTG  CAAATCTTCC  AGATATTTTA  TTAAAAATGC  GAACTGGTCGTAATCTTATG
8281  GCTCGACGTG  GATTGTCATA  TTTATTGTAC  GAGTATAAAG  TATTGTATTATCAATATAAA
8341  ATTGGTTTTA  TTCGAAAAAA  TGAATTAATA  AGTAATGCTA  TGTTGAGAACATTTTTTCGT
8401  ATAATGCCAT  CTAAATTAAA  GGAGCTGATG  TATTCAATCG  TTAGGAATCGATAATAATAA
8461  TTTTCTGATT  AAGTGTTATG  GATTTATTTT  TATTAGGCAT  ATTCTATAATTAAGCATAAC
8521  CCGCATACCA  CCCAGCGGTA  TCCTGACAGG  AGTAAACAAT  GTCAAAGCAACAGATCGGCG
8581  TCGTCGGTAT  GGCAGTGATG  GGGCGCAACC  TTGCGCTCAA  TATCGAAAGCCGTGGTTATA
8641  CCGTCTCTAT  TTTCAACCGT  TCCCGTGAAA  AGACCGAAGA  AGTGATTACCGAAAATCCAG
8701  GCAAGAAACT  GGTTCCTTAC  TATACGGTGA  AAGAATTTGT  TGAATCTCTGGAAACGCCTC
8761  GTCGCATCCT  GTTAATGGTG  AAAGCAGGTG  CTGGCACGGA  TGCTGCTATTGATTCCCTCA
8821  AGCCATACCT  CGATAAAGGT  GACATCATCA  TTGATGGTGG  TAACACCTTCTTCCATGACA
8881  CCATTCGTCG  TAACCGTGAG  CTTTCTGCAG  AAGGCTTTAA  CTTTATCGGTACCGGTGTTT
8941  CCGGTGGTGA  AGAAGGTGCG  CTGAAAGGTC  CTTCCATTAT  GCCTGGTGGGCAGAAAGAAG
9001  CTTATGAACT  GATTGCGCCG  ATCCTGACCA  AAATCGCCGC  TGTGGCTGAAGACGGCGAAC
9061  CGTGCGTTAC  CTATATTGGT  GCCGATGGTG  CAGGTCATTA  TGTGAAGATGGTTCACAACG
9121  GTATTGAATA  CGGTGATATG  CAGCTGATTG  CTGAAGCCTA  TTCTCTGCTTAAAGGTGGCT
9181  TGAACCTCAC  CAACGAAGAA  CTGGCGCAGA  CCTTTACCGA  GTGGAATAACGGTGAACTGA
9241  GCAGCTACCT  GATCGACATC  ACCAAAGATA  TCTTCACCAA  AAAAGATGAAGAGGGTAACT
9301  ACCTGGTTGA  TGTGATTCTG  GATGAAGCAG  CAAACAAAGG  TACGGGCAAATGGACCAGCC
9361  AGAGCGCGCT  GGATCTCGGC  GAACCGCTGT  CGCTGATTAC  CGAGTCTGTGTTTGCACGTT
9421  ATATCTCTTC  TCTGAAAGAG  CAGCGTGTTG  CCGCATCTAA  AGTTCTCTCTGGCCCGCAAG
9481  CGCAGCCAGC  TGGCGACAAT  GCTGAGTTCA  TCGAAAAAGT  TCGCCGTGCGCTGTATCTGG
9541  GCAAAATCGT  TTCTTACGCT  CAGGGCTTCT  CTCAGCTACG  CGCTGCGTCTGAAGAGTACA
9601  ACTGGGATCT  GAACTACGGT  GAAATCGCGA  AGATTTTCCG  TGCTGGCTGCATCATCCGTG
9661  CGCAGTTCCT  GCAGAAAATC  ACCGATGCTT  ATGCCGAAAA  TCCGCAGATCGCTAACCTGT
9721  TGCTGGCTCC  TTACTTCAAG  CAAATTGCCG  ATGACTACCA  GCAGGCGCTGCGCGATGTCG
9781  TCGCTTACGC  AGTACAGAAC  GGTATCCCGG  TGCCGACCTT  CGCCGCTGCGGTTGCCTATT
9841  ACGACAGCTA  CCGCGCCGCT  GTTCTGCCTG  CGAACCTGAT  CCAGGCACAGCGTGACTATT
9901  TCGGTGCGCA  TACTTATAAG  CGCATTGATA  AAGAAGGTGT  GTTCCATACCGAATGGCTGG
9961  ATTAATCTGA  TTTAAATCAA  TTAATCAAAG  CAAGGCCCGG  AGAAACCCTCCGGGCTTTTT
10021 TATTATACAA  AGCGGCAGGT  TAGGGCCTTT  TTTTATAATT  TATAGTTAAAAACGCGATAT
10081 AATACAGCGC  CGCACAGCAG  GATCGCTGCC  TTGACAGTTC  ATCTACATCAGCGTTAAAAA
10141 TCCCGCAGTA  GATGAAGCTG  TGGTGGTGGA  TTAATGACCA  CTCTAAATGTTTAACCGGAA
10201 GAAGTCAGAG  CTAATGAAAA  TAACAATTTC  AGGAACAGGT  TATGTTGGTCTTTCAAATGG
10261 TATTCTGATT  GCGCAAAACC  ACGAAGTGGT  TGCACTGGAT  ATCGTTCAGGCCAAAGTGGA
10321 CATGCTTAAC  AAGAGGCAGT  CACCGCTTGT  TGATAAGGAG  ATTGAAGAGTATCTGGCGAC
10381 TAAAGATCTC  AATTTCCGCG  CTACGACAGA  TAAGTATGAC  GCGTATAAAAATGCCGATTA
10441 CGTTATTATT  GCCACACCTA  CCGATTATGA  TCCGAAAACA  AATTATTTTAATACCTCAAG
10501 CGTGGAAGCG  GTCATTCGTG  ATGTGACAGA  AATTAATCCC  AACGCGGTAATGATTATAAA
10561 ATCAACTATC  CCTGTTGGTT  TTACAGAGTC  CATTAAAGAA  CGTTTTGGTATTGAAAATGT
10621 GATCTTTTCG  CCTGAGTTTT  TGCGTGAAGG  TAAAGCACTT  TATGATAACTTACACCCATC
10681 ACGCATTGTG  ATTGGCGAGC  AGTCTGAACG  CGCTAAACGT  TTTGCTGCGTTATTACAGGA
10741 AGGCGCCATT  AAGCAAGACA  TACCAACATT  GTTTACTGAC  TCAACCGAGGCTGAGGCGAT
10801 TAAACTTTTT  GCGAACACTT ATCTGGCGAT  GCGTGTAGCG  TATTTCAATGAACTTGATAG
10861 TTATGCTGAA  AGCCTGGGAC  TTAATTCACG  CCAGATTATT  GAGGGCGTATGCCTTGACCC
10921 GCGTATCGGT  AATCACTACA  ACAACCCGTC ATTCGGTTAT  GGTGGTTATTGTCTGCCGAA
10981 AGATACTAAG  CAGTTACTGG  CAAATTACCA  GTCTGTGCCG  AATAACCTGATCTCGGCAAT
11041 TGTTGACGCC  AACCGCACGC  GCAAAGATTT TATTGCCGAT  TCTATCCTTGCACGTAAACC
11101 GAAAGTTGTT  GGCGTCTATC  GTTTGATTAT  GAAGAATGGT  TCAGACAATTTTCGTGCTTC
11161 CTCGATTCAG  GGTATTATGA  AGCGAATCAA  GGCGAAAGGT  GTGCCTGTAATCGTTTATGA
11221 GCCAGCTATG  AAAGAGGACG  ATTTTTTCCG  GTCGCGCGTG  GTACGTGATCTGGATGCGTT
11281 CAAACAAGAA  GCTGATGTTA  TTATTTCTAA  CCGTATGTCT  GCCGATCTGGCTGATGTAGC
11341 AGATAAAGTT  TATACGCGCG  ACTTGTTTGG  CAATGATTAA  TTATTTTGTTTCATTCTAAG
11401 AAAAGGCCCT  AATAAATTAG  GGCCTTTTCT  TATGGTTTTG  TAAAATCAAACTTTATAGAA
11461 GTTACGATAC  CATTCTACAA  AGTTCTTTAC  CCCTTCTTTA  ACTGACGTTTCAGGTTTGAA
11521 TCCTATTACG  TCATACAGTG  CTTTTGTATC  AGCACTGGTT  TCCAGTACATCACCGGGTTG
11581 GAGAGGCATC  ATATTTTTGT  TGGCTTCAAT  ACCCAGAGCC  TCTTCTAACGCATTGATATA
11641 GTCCATCAAC  TCCACAGGCG  AACTATTACC  AATGTTATAG  ACACGATATGGTGCTGAACT
11701 TGTTGCAGGC  GAGCCTGTTT  CTACAGCCCA  CTGTGGGTTT  TTTTCTGGAATAACATCCTG
11761 TAAGCGAATA  ATAGCTTCGG  CAATATCATC  AATGTAAGTA  AAGTCACGCTTCATTTTGCC
11821 GAAGTTGTAA  ACATCAATGC  TTTTACCTTC  CAGCATGGCT  TTAGTGAATTTAAATAATGC
11881 CATATCCGGA  CGTCCCCATG  GACCATAAAC  CGTAAAGAAA  CGCAGCCCTGTGGTCGGTAA
11941 GCCATACAAA  TGAGAATATG  TATGGGCCAT  GAGTTCATTC  GCTTTTTTAGTTGCTGCATA
12001 AAGCGAAACA  GGATGATCTA  CAGAGTCATC  TGTAGAGAAA  GGCATCTTGCGGTTCATGCC
12061 ATAAACAGAA  CTGGAGGAAG  CGTAAAGTAG  ATGCTGAACA  TTATTATGGCGACATCCTTC
12121 TAGTATGTTC  AGGAATCCAA  TCAGGTTTGC  ATCTGCATAT  GCATTGGGATTTTCAAGAGA
12181 GTAACGTACA  CCGGCTTGCG  CAGCGAGGTT  TATTACGCGT  TCGAACCGCTCGTCTGCAAA
12241 CAGTGCCGCC  ATTTTCTCAC  GATCGGCCAG  GTCAATTTTA  TAAAAACTGAAGTTGTCGTG
12301 CTTGAGTAAA  TCAAGTCGTG  CTTGTTTGAG  GTTGACATCG  TAATAATCATTTAAGTTGTC
12361 AATGCCTACA  ACCTGATGAC  CAGCTGCAAG  AAGCCGTTTA  CTTAGATAGAAACCGATAAA
12421 GCCAGCAGCT  CCCGTAACCA  GAAATTTCAT  TTATAATCCT  CGCTCAGGCTAGAATATAGC
12481 CAATCTTCAT  CTGGCATAAC  TGAAAGTTAA  ATTATACCGT  TAGACAAGAAAAAAAGATAA
12541 TCGGTATCAG  TTCTAAACTT  GGCTGTTTTT  TCTGGTAACG  TGCTCATTTTACAATCAAAG
12601 CTGTTCTAAG  CTGACTATAC  AAGCCGACGT  CATTATCTCC AACCGTATGGCAGAAGAGCT
12661 TAAGGATGTG  GCAGACAAAG  TCTACACCCG  CGATCTCTTT  GGCAGTGACTAACATCCTGT
12721 TATCATGGCG  ATTTTCGCCC  TGATTCTCTT  ATGTTCCCTT  TGTAATAATTCATTATTTTT
12781 ATCATTTATC  CTATAGCATT  CATGGCGATT  ATCGCTAAAC  TATGGCGGCGCGCCACGTGG
12841 GATCCCCGGG  TACCGAGCTC  GAATTCGCCC  TATAGTGAGT  CGTATTACAATTCACTGGCC
12901 GTCGTTTTAC  AACGTCGTGA  CTGGGAAAAC  CCTGGCGTTA  CCCAACTTAATCGCCTTGCA
12961 GCACATCCCC  CTTTCGCCAG  CTGGCGTAAT  AGCGAAGAGG  CCCGCACCGATCGCCCTTCC
13021 CAACAGTTGC  GCAGCTGAAT  GGCGAATGGC  GCCTGATGCG  GTATTTTCTCCTTACGCATC
13081 TGTGCGGTAT  TTCACACCGC  ATATGGTGCA  CTCTCAGTAC  AATCTGCTCTGATGCCGCAT
13141 AGTTAAGCCA  GCCCCGACAC  CCGCCAACAC  CCGCTGACGC  GAACCCCTTGCGGCCGCATC
13201 GAATATAACT  TCGTATAATG  TATGCTATAC  GAAGTTATTA  GCGATGAGCTCGGACTTCCA
13261 TTGTTCATTC  CACGGACAAA  AACAGAGAAA  GGAAACGACA  GAGGCCAAAAAGCTCGCTTT
13321 CAGCACCTGT  CGTTTCCTTT  CTTTTCAGAG  GGTATTTTAA  ATAAAAACATTAAGTTATGA
13381 CGAAGAAGAA  CGGAAACGCC  TTAAACCGGA  AAATTTTCAT  AAATAGCGAAAACCCGCGAG
13441 GTCGCCGCCC  CGTAACCTGT  CGGATCACCG  GAAAGGACCC  GTAAAGTGATAATGATTATC
13501 ATCTACATAT  CACAACGTGC  GTGGAGGCCA  TCAAACCACG  TCAAATAATCAATTATGACG
13561 CAGGTATCGT  ATTAATTGAT  CTGCATCAAC  TTAACGTAAA  AACAACTTCAGACAATACAA
13621 ATCAGCGACA  CTGAATACGG  GGCAACCTCA  TGTCCGAGCT  CGCGAGCTCGTCGACAGCGA
13681 CACACTTGCA  TCGGATGCAG  CCCGGTTAAC  GTGCCGGCAC  GGCCTGGGTAACCAGGTATT
13741 TTGTCCACAT  AACCGTGCGC  AAAATGTTGT  GGATAAGCAG  GACACAGCAGCAATCCACAG
13801 CAGGCATACA  ACCGCACACC  GAGGTTACTC  CGTTCTACAG  GTTACGACGACATGTCAATA
13861 CTTGCCCTTG  ACAGGCATTG  ATGGAATCGT  AGTCTCACGC  TGATAGTCTGATCGACAATA
13921 CAAGTGGGAC  CGTGGTCCCA  GACCGATAAT  CAGACCGACA  ACACGAGTGGGATCGTGGTC
13981 CCAGACTAAT  AATCAGACCG  ACGATACGAG  TGGGACCGTG  GTCCCAGACTAATAATCAGA
14041 CCGACGATAC  GAGTGGGACC  GTGGTTCCAG  ACTAATAATC  AGACCGACGATACGAGTGGG
14101 ACCGTGGTCC  CAGACTAATA  ATCAGACCGA  CGATACGAGT  GGGACCATGGTCCCAGACTA
14161 ATAATCAGAC  CGACGATACG  AGTGGGACCG  TGGTCCCAGT  CTGATTATCAGACCGACGAT
14221 ACGAGTGGGA  CCGTGGTCCC  AGACTAATAA  TCAGACCGAC  GATACGAGTGGGACCGTGGT
14281 CCCAGACTAA  TAATCAGACC  GACGATACGA  GTGGGACCGT  GGTCCCAGTCTGATTATCAG
14341 ACCGACGATA  CAAGTGGAAC  AGTGGGCCCA  GAGAGAATAT  TCAGGCCAGTTATGCTTTCT
14401 GGCCTGTAAC  AAAGGACATT  AAGTAAAGAC  AGATAAACGT  AGACTAAAACGTGGTCGCAT
14461 CAGGGTGCTG  GCTTTTCAAG  TTCCTTAAGA  ATGGCCTCAA  TTTTCTCTATACACTCAGTT
14521 GGAACACGAG  ACCTGTCCAG  GTTAAGCACC  ATTTTATCGC  CCTTATACAATACTGTCGCT
14581 CCAGGAGCAA  ACTGATGTCG  TGAGCTTAAA  CTAGTTCTTG  ATGCAGATGACGTTTTAAGC
14641 ACAGAAGTTA  AAAGAGTGAT  AACTTCTTCA  GCTTCAAATA  TCACCCCAGCTTTTTTCTGC
14701 TCATGAAGGT  TAGATGCCTG  CTGCTTAAGT  AATTCCTCTT  TATCTGTAAAGGCTTTTTGA
14761 AGTGCATCAC  CTGACCGGGC  AGATAGTTCA  CCGGGGTGAG  AAAAAAGAGCAACAACTGAT
14821 TTAGGCAATT  TGGCGGTGTT  GATACAGCGG  GTAATAATCT  TACGTGAAATATTTTCCGCA
14881 TCAGCCAGCG  CAGAAATATT  TCCAGCAAAT  TCATTCTGCA  ATCGGCTTGCATAACGCTGA
14941 CCACGTTCAT  AAGCACTTGT  TGGGCGATAA  TCGTTACCCA  ATCTGGATAATGCAGCCATC
15001 TGCTCATCAT  CCAGCTCGCC  AACCAGAACA  CGATAATCAC  TTTCGGTAAGTGCAGCAGCT
15061 TTACGACGGC  GACTCCCATC  GGCAATTTCT  ATGACACCAG  ATACTCTTCGACCGAACGCC
15121 GGTGTCTGTT  GACCAGTCAG  TAGAAAAGAA  GGGATGAGAT  CATCCAGTGCGTCCTCAGTA
15181 AGCAGCTCCT  GGTCACGTTC  ATTACCTGAC  CATACCCGAG  AGGTCTTCTCAACACTATCA
15241 CCCCGGAGCA  CTTCAAGAGT  AAACTTCACA  TCCCGACCAC  ATACAGGCAAAGTAATGGCA
15301 TTACCGCGAG  CCATTACTCC  TACGCGCGCA  ATTAACGAAT  CCACCATCGGGGCAGCTGGT
15361 GTCGATAACG  AAGTATCTTC  AACCGGTTGA  GTATTGAGCG  TATGTTTTGGAATAACAGGC
15421 GCACGCTTCA  TTATCTAATC  TCCCAGCGTG  GTTTAATCAG  ACGATCGAAAATTTCATTGC
15481 AGACAGGTTC  CCAAATAGAA  AGAGCATTTC  TCCAGGCACC  AGTTGAAGAGCGTTGATCAA
15541 TGGCCTGTTC  AAAAACAGTT  CTCATCCGGA  TCTGACCTTT  ACCAACTTCATCCGTTTCAC
15601 GTACAACATT  TTTTAGAACC  ATGCTTCCCC  AGGCATCCCG  AATTTGCTCCTCCATCCACG
15661 GGGACTGAGA  GCCATTACTA  TTGCTGTATT  TGGTAAGCAA  AATACGTACATCAGGCTCGA
15721 ACCCTTTAAG  ATCAACGTTC  TTGAGCAGAT  CACGAAGCAT  ATCGAAAAACTGCAGTGCGG
15781 AGGTGTAGTC  AAACAACTCA  GCAGGCGTGG  GAACAATCAG  CACATCAGCAGCACATACGA
15841 CATTAATCGT  GCCGATACCC  AGGTTAGGCG  CGCTGTCAAT  AACTATGACATCATAGTCAT
15901 GAGCAACAGT  TTCAATGGCC  AGTCGGAGCA  TCAGGTGTGG  ATCGGTGGGCAGTTTACCTT
15961 CATCAAATTT  GCCCATTAAC  TCAGTTTCAA  TACGGTGCAG  AGCCAGACAGGAAGGAATAA
16021 TGTCAAGCCC  CGGCCAGCAA  GTGGGCTTTA  TTGCATAAGT  GACATCGTCCTTTTCCCCAA
16081 GATAGAAAGG  CAGGAGAGTG  TCTTCTGCAT  GAATATGAAG  ATCTGGTACCCATCCGTGAT
16141 ACATTGAGGC  TGTTCCCTGG  GGGTCGTTAC  CTTCCACGAG  CAAAACACGTAGCCCCTTCA
16201 GAGCCAGATC  CTGAGCAAGA  TGAACAGAAA  CTGAGGTTTT  GTAAACGCCACCTTTATGGG
16261 CAGCAACCCC  GATCACCGGT  GGAAATACGT  CTTCAGCACG  TCGCAATCGCGTACCAAACA
16321 CATCACGCAT  ATGATTAATT  TGTTCAATTG  TATAACCAAC  ACGTTGCTCAACCCGTCCTC
16381 GAATTTCCAT  ATCCGGGTGC  GGTAGTCGCC  CTGCTTTCTC  GGCATCTCTGATAGCCTGAG
16441 AAGAAACCCC  AACTAAATCC  GCTGCTTCAC  CTATTCTCCA  GCGCCGGGTTATTTTCCTCG
16501 CTTCCGGGCT  GTCATCATTA  AACTGTGCAA  TGGCGATAGC  CTTCGTCATTTCATGACCAG
16561 CGTTTATGCA  CTGGTTAAGT  GTTTCCATGA  GTTTCATTCT  GAACATCCTTTAATCATTGC
16621 TTTGCGTTTT  TTTATTAAAT  CTTGCAATTT  ACTGCAAAGC  AACAACAAAATCGCAAAGTC
16681 ATCAAAAAAC  CGCAAAGTTG  TTTAAAATAA  GAGCAACACT  ACAAAAGGAGATAAGAAGAG
16741 CACATACCTC  AGTCACTTAT  TATCACTAGC  GCTCGCCGCA  GCCGTGTAACCGAGCATAGC
16801 GAGCGAACTG  GCGAGGAAGC  AAAGAAGAAC  TGTTCTGTCA  GATAGCTCTTACGCTCAGCG
16861 CAAGAAGAAA  TATCCACCGT  GGGAAAAACT  CCAGGTAGAG  GTACACACGCGGATAGCCAA
16921 TTCAGAGTAA  TAAACTGTGA  TAATCAACCC  TCATCAATGA  TGACGAACTAACCCCCGATA
16981 TCAGGTCACA  TGACGAAGGG  AAAGAGAAGG  AAATCAACTG  TGACAAACTGCCCTCAAATT
17041 TGGCTTCCTT  AAAAATTACA  GTTCAAAAAG  TATGAGAAAA  TCCATGCAGGCTGAAGGAAA
17101 CAGCAAAACT  GTGACAAATT  ACCCTCAGTA  GGTCAGAACA  AATGTGACGAACCACCCTCA
17161 AATCTGTGAC  AGATAACCCT  CAGACTATCC  TGTCGTCATG  GAAGTGATATCGCGGAAGGA
17221 AAATACGATA  TGAGTCGTCT  GGCGGCCTTT  CTTTTTCTCA  ATGTATGAGAGGCGCATTGG
17281 AGTTCTGCTG  TTGATCTCAT  TAACACAGAC  CTGCAGGAAG  CGGCGGCGGAAGTCAGGCAT
17341 ACGCTGGTAA  CTTTGAGGCA  GCTGGTAACG  CTCTATGATC  CAGTCGATTTTCAGAGAGAC
17401 GATGCCTGAG  CCATCCGGCT  TACGATACTG  ACACAGGGAT  TCGTATAAACGCATGGCATA
17461 CGGATTGGTG  ATTTCTTTTG  TTTCACTAAG  CCGAAACTGC  GTAAACCGGTTCTGTAACCC
17521 GATAAAGAAG  GGAATGAGAT  ATGGGTTGAT  ATGTACACTG  TAAAGCCCTCTGGATGGACT
17581 GTGCGCACGT  TTGATAAACC  AAGGAAAAGA  TTCATAGCCT  TTTTCATCGCCGGCATCCTC
17641 TTCAGGGCGA  TAAAAAACCA  CTTCCTTCCC  CGCGAAACTC  TTCAATGCCTGCCGTATATC
17701 CTTACTGGCT  TCCGCAGAGG  TCAATCCGAA  TATTTCAGCA  TATTTAGCAACATGGATCTC
17761 GCAGATACCG  TCATGTTCCT  GTAGGGTGCC  ATCAGATTTT  CTGATCTGGTCAACGAACAG
17821 ATACAGCATA  CGTTTTTGAT  CCCGGGAGAG  ACTATATGCC  GCCTCAGTGAGGTCGTTTGA
17881 CTGGACGATT  CGCGGGCTAT  TTTTACGTTT  CTTGTGATTG  ATAACCGCTGTTTCCGCCAT
17941 GACAGATCCA  TGTGAAGTGT  GACAAGTTTT  TAGATTGTCA  CACTAAATAAAAAAGAGTCA
18001 ATAAGCAGGG  ATAACTTTGT  GAAAAAACAG  CTTCTTCTGA  GGGCAATTTGTCACAGGGTT
18061 AAGGGCAATT  TGTCACAGAC  AGGACTGTCA  TTTGAGGGTG  ATTTGTCACACTGAAAGGGC
18121 AATTTGTCAC  AACACCTTCT  CTAGAACCAG  CATGGATAAA  GGCCTACAAGGCGCTCTAAA
18181 AAAGAAGATC  TAAAAACTAT  AAAAAAAATA  ATTATAAAAA  TATCCCCGTGGATAAGTGGA
18241 TAACCCCAAG  GGAAGTTTTT  TCAGGCATCG  TGTGTAAGCA  GAATATATAAGTGCTGTTCC
18301 CTGGTGCTTC  CTCGCTCACT  CGACCGGGAG  GGTTCGAGAA  GGGGGGGCACCCCCCTTCGG
18361 CGTGCGCGGT  CACGCGCACA  GGGCGCAGCC  CTGGTTAAAA  ACAAGGTTTATAAATATTGG
18421 TTTAAAAGCA  GGTTAAAAGA  CAGGTTAGCG  GTGGCCGAAA  AACGGGCGGAAACCCTTGCA
18481 AATGCTGGAT  TTTCTGCCTG  TGGACAGCCC  CTCAAATGTC  AATAGGTGCGCCCCTCATCT
18541 GTCAGCACTC  TGCCCCTCAA  GTGTCAAGGA  TCGCGCCCCT  CATCTGTCAGTAGTCGCGCC
18601 CCTCAAGTGT  CAATACCGCA  GGGCACTTAT  CCCCAGGCTT  GTCCACATCATCTGTGGGAA
18661 ACTCGCGTAA  AATCAGGCGT  TTTCGCCGAT  TTGCGAGGCT  GGCCAGCTCCACGTCGCCGG
18721 CCGAAATCGA  GCCTGCCCCT  CATCTGTCAA  CGCCGCGCCG  GGTGAGTCGGCCCCTCAAGT
18781 GTCAACGTCC  GCCCCTCATC  TGTCAGTGAG  GGCCAAGTTT  TCCGCGAGGTATCCACAACG
18841 CCGGCGGCCG  GCCGCGGTGT  CTCGCACACG  GCTTCGACGG  CGTTTCTGGCGCGTTTGCAG
18901 GGCCATAGAC  GGCCGCCAGC  CCAGCGGCGA  GGGCAACCAG  CCGAGGGCTTCGCCCTGTCG
18961 CTCGACTGCG  GCGAGCACTA  CTGGCTGTAA  AAGGACAGAC  CACATCATGGTTCTGTGTTC
19021 ATTAGGTTGT  TCTGTCCATT  GCTGACATAA  TCCGCTCCAC  TTCAACGTAACACCGCACGA
19081 AGATTTCTAT  TGTTCCTGAA  GGCATATTCA  AATCGTTTTC  GTTACCGCTTGCAGGCATCA
19141 TGACAGAACA  CTACTTCCTA  TAAACGCTAC  ACAGGCTCCT  GAGATTAATAATGCGGATCT
19201 CTACGATAAT  GGGAGATTTT  CCCGACTGTT  TCGTTCGCTT  CTCAGTGGATAACAGCCAGC
19261 TTCTCTGTTT  AACAGACAAA  AACAGCATAT  CCACTCAGTT  CCACATTTCCATATAAAGGC
19321 CAAGGCATTT  ATTCTCAGGA  TAATTGTTTC  AGCATCGCAA  CCGCATCAGACTCCGGCATC
19381 GCAAACTGCA  CCCGGTGCCG  GGCAGCCACA  TCCAGCGCAA  AAACCTTCGTGTAGACTTCC
19441 GTTGAACTGA  TGGACTTATG  TCCCATCAGG  CTTTGCAGAA  CTTTCAGCGGTATACCGGCA
19501 TACAGCATGT  GCATCGCATA  GGAATGGCGG  AACGTATGTG  GTGTGACCGGAACAGAGAAC
19561 GTCACACCGT  CAGCAGCAGC  GGCGGCAACC  GCCTCCCCAA  TCCAGGTCCTGACCGTTCTG
19621 TCCGTCACTT  CCCAGATCCG  CGCTTTCTCT  GTCCTTCCTG  TGCGACGGTTACGCCGCTCC
19681 ATGAGCTTAT  CGCGAATAAA  TACCTGTGAC  GGAAGATCAC  TTCGCAGAATAAATAAATCC
19741 TGGTGTCCCT  GTTGATACCG  GGAAGCCCTG  GGCCAACTTT  TGGCGAAAATGAGACGTTGA
19801 TCGGCACGTA  AGAGGTTCCA  ACTTTCACCA  TAATGAAATA  AGATCACTACCGGGCGTATT
19861 TTTTGAGTTA  TCGAGATTTT  CAGGAGCTAA  GGAAGCTAAA  ATGGAGAAAAAAATCACTGG
19921 ATATACCACC  GTTGATATAT  CCCAATGGCA  TCGTAAAGAA  CATTTTGAGGCATTTCAGTC
19981 AGTTGCTCAA  TGTACCTATA  ACCAGACCGT  TCAGCTGGAT  ATTACGGCCTTTTTAAAGAC
20041 CGTAAAGAAA  AATAAGCACA  AGTTTTATCC  GGCCTTTATT  CACATTCTTGCCCGCCTGAT
20101 GAATGCTCAT  CCGGAATTTC  GTATGGCAAT  GAAAGACGGT  GAGCTGGTGATATGGGATAG
20161 TGTTCACCCT  TGTTACACCG  TTTTCCATGA  GCAAACTGAA  ACGTTTTCATCGCTCTGGAG
20221 TGAATACCAC  GACGATTTCC  GGCAGTTTCT  ACACATATAT  TCGCAAGATGTGGCGTGTTA
20281 CGGTGAAAAC  CTGGCCTATT  TCCCTAAAGG  GTTTATTGAG  AATATGTTTTTCGTCTCAGC
20341 CAATCCCTGG  GTGAGTTTCA  CCAGTTTTGA  TTTAAACGTG  GCCAATATGGACAACTTCTT
20401 CGCCCCCGTT  TTCACCATGG  GCAAATATTA  TACGCAAGGC  GACAAGGTGCTGATGCCGCT
20461 GGCGATTCAG  GTTCATCATG  CCGTTTGTGA  TGGCTTCCAT  GTCGGCAGAATGCTTAATGA
20521 ATTACAACAG  TACTGCGATG  AGTGGCAGGG  CGGGGCGTAA  TTTTTTTAAGGCAGTTATTG
20581 GTGCCCTTAA  ACGCCTGGTT  GCTACGCCTG  AATAAGTGAT  AATAAGCGGATGAATGGCAG
20641 AAATTCGATG  ATAAGCTGTC  AAACATGAGA  ATTGGTCGAC  GGCCCGGGCGGCCGCAAGGG
20701 GTTCGCGTTG  GCCGATTCAT  TAATGCAGCT  GGCACGACAG  GTTTCCCGACTGGAAAGCGG
20761 GCAGTGAGCG  CAACGCAATT  AATGTGAGTT  AGCTCACTCA  TTAGGCACCCCAGGCTTTAC
20821 ACTTTATGCT  TCCGGCTCGT  ATGTTGTGTG  GAATTGTGAG  CGGATAACAATTTCACACAG
20881 GAAACAGCTA  TGACCATGAT  TACGCCAAGC  TATTTAGGTG  AGACTATAGAATACTCAAGC
20941 TTGCATGCCT  GCAGGTCGAC  TCTAGAGGAT  CCCACGACGT CG
SEQ ID NO:29-pCC1FOS cut(pFOS)和弗氏志贺氏菌(S.flexneri)6O-抗原(有Z3206)的核苷酸序列
基因座 pFOS cut和O-抗原cut(Z3206+)
定义用Z3206Nhe和wzzAscI扩增并用NheI和AscI切割的反向弗氏志贺氏菌(S.flexneri)6 O抗原簇连接到具有MCS盒并用NheI和AscI切割的pCC1FOS
Figure BDA00001877727001071
Figure BDA00001877727001081
长度:22887bp
类型:DNA    环状UNA
序列:
1    GCGGCCGCAA  GGGGTTCGCG  TCAGCGGGTG  TTGGCGGGTG  TCGGGGCTGG  CTTAACTATG
61   CGGCATCAGA  GCAGATTGTA  CTGAGAGTGC  ACCATATGCG  GTGTGAAATACCGCACAGAT
121  GCGTAAGGAG  AAAATACCGC  ATCAGGCGCC  ATTCGCCATT  CAGCTGCGCAACTGTTGGGA
181  AGGGCGATCG  GTGCGGGCCT  CTTCGCTATT  ACGCCAGCTG  GCGAAAGGGGGATGTGCTGC
241  AAGGCGATTA  AGTTGGGTAA  CGCCAGGGTT  TTCCCAGTCA  CGACGTTGTAAAACGACGGC
301  CAGTGAATTG  TAATACGACT  CACTATAGGG  CGAATTCGAG  CTCGGTACCCGGGGATCCCA
361  CGTGGCGCGC  CGCCATAGTT  TAGCGATAAT  CGCCATGAAT  GCTATAGGATAAATGATAAA
421  AATAATGAAT  TATTACAAAG  GGAACATAAG  AGAATCAGGG  CGAAAATCGCCATGATAACA
481  GGATGTTAGT  CACTGCCAAA  GAGATCGCGG  GTGTAGACTT  TGTCTGCCACATCCTTAAGC
541  TCTTCTGCCA  TACGGTTGGA  GATAATGACG  TCGGCTTGTA  TAGTCAGCTTAGAACAGCTT
601  TGATTGTAAA  ATGAGCACGT  TACCAGAAAA  AACAGCCAAG  TTTAGAACTGATACCGATTA
661  TCTTTTTTTC  TTGTCTAACG  GTATAATTTA  ACTTTCAGTT  ATGCCAGATGAAGATTGGCT
721  ATATTCTAGC  CTGAGCGAGG  ATTATAAATG  AAATTTCTGG  TTACGGGAGCTGCTGGCTTT
781  ATCGGTTTCT  ATCTAAGTAA  ACGGCTTCTT  GCAGCTGGTC  ATCAGGTTGTAGGCATTGAC
841  AACTTAAATG  ATTATTACGA  TGTCAACCTC  AAACAAGCAC  GACTTGATTTACTCAAGCAC
901  GACAACTTCA  GTTTTTATAA  AATTGACCTG  GCCGATCGTG  AGAAAATGGCGGCACTGTTT
961  GCAGACGAGC  GGTTCGAACG  CGTAATAAAC  CTCGCTGCGC  AAGCCGGTGTACGTTACTCT
1021 CTTGAAAATC  CCAATGCATA  TGCAGATGCA  AACCTGATTG  GATTCCTGAACATACTAGAA
1081 GGATGTCGCC  ATAATAATGT  TCAGCATCTA  CTTTACGCTT  CCTCCAGTTCTGTTTATGGC
1141 ATGAACCGCA  AGATGCCTTT  CTCTACAGAT  GACTCTGTAG  ATCATCCTGTTTCGCTTTAT
1201 GCAGCAACTA  AAAAAGCGAA  TGAACTCATG  GCCCATACAT  ATTCTCATTTGTATGGCTTA
1261 CCGACCACAG  GGCTGCGTTT  CTTTACGGTT  TATGGTCCAT  GGGGACGTCCGGATATGGCA
1321 TTATTTAAAT  TCACTAAAGC  CATGCTGGAA  GGTAAAAGCA  TTGATGTTTACAACTTCGGC
1381 AAAATGAAGC  GTGACTTTAC  TTACATTGAT  GATATTGCCG  AAGCTATTATTCGCTTACAG
1441 GATGTTATTC  CAGAAAAAAA  CCCACAGTGG  GCTGTAGAAA  CAGGCTCGCCTGCAACAAGT
1501 TCAGCACCAT  ATCGTGTCTA  TAACATTGGT  AATAGTTCGC  CTGTGGAGTTGATGGACTAT
1561 ATCAATGCGT  TAGAAGAGGC  TCTGGGTATT  GAAGCCAACA  AAAATATGATGCCTCTCCAA
1621 CCCGGTGATG  TACTGGAAAC  CAGTGCTGAT  ACAAAAGCAC  TGTATGACGTAATAGGATTC
1681 AAACCTGAAA  CGTCAGTTAA  AGAAGGGGTA  AAGAACTTTG  TAGAATGGTATCGTAACTTC
1741 TATAAAGTTT  GATTTTACAA  AACCATAAGA  AAAGGCCCTA  ATTTATTAGGGCCTTTTCTT
1801 AGAATGAAAC  AAAATAATTA  ATCATTGCCA  AACAAGTCGC  GCGTATAAACTTTATCTGCT
1861 ACATCAGCCA  GATCGGCAGA  CATACGGTTA  GAAATAATAA  CATCAGCTTCTTGTTTGAAC
1921 GCATCCAGAT  CACGTACCAC  GCGCGACCGG  AAAAAATCGT  CCTCTTTCATAGCTGGCTCA
1981 TAAACGATTA  CAGGCACACC  TTTCGCCTTG  ATTCGCTTCA  TAATACCCTGAATCGAGGAA
2041 GCACGAAAAT  TGTCTGAACC  ATTCTTCATA  ATCAAACGAT  AGACGCCAACAACTTTCGGT
2101 TTACGTGCAA  GGATAGAATC  GGCAATAAAA  TCTTTGCGCG  TGCGGTTGGCGTCAACAATT
2161 GCCGAGATCA  GGTTATTCGG  CACAGACTGG  TAATTTGCCA  GTAACTGCTTAGTATCTTTC
2221 GGCAGACAAT  AACCACCATA  ACCGAATGAC  GGGTTGTTGT  AGTGATTACCGATACGCGGG
2281 TCAAGGCATA  CGCCCTCAAT  AATCTGGCGT  GAATTAAGTC  CCAGGCTTTCAGCATAACTA
2341 TCAAGTTCAT  TGAAATACGC  TACACGCATC  GCCAGATAAG  TGTTCGCAAAAAGTTTAATC
2401 GCCTCAGCCT  CGGTTGAGTC  AGTAAACAAT  GTTGGTATGT  CTTGCTTAATGGCGCCTTCC
2461 TGTAATAACG  CAGCAAAACG  TTTAGCGCGT  TCAGACTGCT  CGCCAATCACAATGCGTGAT
2521 GGGTGTAAGT  TATCATAAAG  TGCTTTACCT  TCACGCAAAA  ACTCAGGCGAAAAGATCACA
2581 TTTTCAATAC  CAAAACGTTC  TTTAATGGAC  TCTGTAAAAC  CAACAGGGATAGTTGATTTT
2641 ATAATCATTA  CCGCGTTGGG  ATTAATTTCT  GTCACATCAC  GAATGACCGCTTCCACGCTT
2701 GAGGTATTAA  AATAATTTGT  TTTCGGATCA  TAATCGGTAG  GTGTGGCAATAATAACGTAA
2761 TCGGCATTTT  TATACGCGTC  ATACTTATCT  GTCGTAGCGC  GGAAATTGAGATCTTTAGTC
2821 GCCAGATACT  CTTCAATCTC  CTTATCAACA  AGCGGTGACT  GCCTCTTGTTAAGCATGTCC
2881 ACTTTGGCCT  GAACGATATC  CAGTGCAACC  ACTTCGTGGT  TTTGCGCAATCAGAATACCA
2941 TTTGAAAGAC  CAACATAACC  TGTTCCTGAA  ATTGTTATTT  TCATTAGCTCTGACTTCTTC
3001 CGGTTAAACA  TTTAGAGTGG  TCATTAATCC  ACCACCACAG  CTTCATCTACTGCGGGATTT
3061 TTAACGCTGA  TGTAGATGAA  CTGTCAAGGC  AGCGATCCTG  CTGTGCGGCGCTGTATTATA
3121 TCGCGTTTTT  AACTATAAAT  TATAAAAAAA  GGCCCTAACC  TGCCGCTTTGTATAATAAAA
3181 AAGCCCGGAG  GGTTTCTCCG  GGCCTTGCTT  TGATTAATTG  ATTTAAATCAGATTAATCCA
3241 GCCATTCGGT  ATGGAACACA  CCTTCTTTAT  CAATGCGCTT  ATAAGTATGCGCACCGAAAT
3301 AGTCACGCTG  TGCCTGGATC  AGGTTCGCAG  GCAGAACAGC  GGCGCGGTAGCTGTCGTAAT
3361 AGGCAACCGC  AGCGGCGAAG  GTCGGCACCG  GGATACCGTT  CTGTACTGCGTAAGCGACGA
3421 CATCGCGCAG  CGCCTGCTGG  TAGTCATCGG  CAATTTGCTT  GAAGTAAGGAGCCAGCAACA
3481 GGTTAGCGAT  CTGCGGATTT  TCGGCATAAG  CATCGGTGAT  TTTCTGCAGGAACTGCGCAC
3541 GGATGATGCA  GCCAGCACGG  AAAATCTTCG  CGATTTCACC  GTAGTTCAGATCCCAGTTGT
3601 ACTCTTCAGA  CGCAGCGCGT  AGCTGAGAGA  AGCCCTGAGC  GTAAGAAACGATTTTGCCCA
3661 GATACAGCGC  ACGGCGAACT  TTTTCGATGA  ACTCAGCATT  GTCGCCAGCTGGCTGCGCTT
3721 GCGGGCCAGA  GAGAACTTTA  GATGCGGCAA  CACGCTGCTC  TTTCAGAGAAGAGATATAAC
3781 GTGCAAACAC  AGACTCGGTA  ATCAGCGACA  GCGGTTCGCC  GAGATCCAGCGCGCTCTGGC
3841 TGGTCCATTT  GCCCGTACCT  TTGTTTGCTG  CTTCATCCAG  AATCACATCAACCAGGTAGT
3901 TACCCTCTTC  ATCTTTTTTG  GTGAAGATAT  CTTTGGTGAT  GTCGATCAGGTAGCTGCTCA
3961 GTTCACCGTT  ATTCCACTCG  GTAAAGGTCT  GCGCCAGTTC  TTCGTTGGTGAGGTTCAAGC
4021 CACCTTTAAG  CAGAGAATAG  GCTTCAGCAA  TCAGCTGCAT  ATCACCGTATTCAATACCGT
4081 TGTGAACCAT  CTTCACATAA  TGACCTGCAC  CATCGGCACC  AATATAGGTAACGCACGGTT
4141 CGCCGTCTTC  AGCCACAGCG  GCGATTTTGG  TCAGGATCGG  CGCAATCAGTTCATAAGCTT
4201 CTTTCTGCCC  ACCAGGCATA  ATGGAAGGAC  CTTTCAGCGC  ACCTTCTTCACCACCGGAAA
4261 CACCGGTACC  GATAAAGTTA  AAGCCTTCTG  CAGAAAGCTC  ACGGTTACGACGAATGGTGT
4321 CATGGAAGAA  GGTGTTACCA  CCATCAATGA  TGATGTCACC  TTTATCGAGGTATGGCTTGA
4381 GGGAATCAAT  AGCAGCATCC  GTGCCAGCAC  CTGCTTTCAC  CATTAACAGGATGCGACGAG
4441 GCGTTTCCAG  AGATTCAACA  AATTCTTTCA  CCGTATAGTA  AGGAACCAGTTTCTTGCCTG
4501 GATTTTCGGT  AATCACTTCT  TCGGTCTTTT  CACGGGAACG  GTTGAAAATAGAGACGGTAT
4561 AACCACGGCT  TTCGATATTG  AGCGCAAGGT  TGCGCCCCAT  CACTGCCATACCGACGACGC
4621 CGATCTGTTG  CTTTGACATT  GTTTACTCCT  GTCAGGATAC  CGCTGGGTGGTATGCGGGTT
4681 ATGCTTAATT  ATAGAATATG  CCTAATAAAA  ATAAATCCAT  AACACTTAATCAGAAAATTA
4741 TTATTATCGA  TTCCTAACGA  TTGAATACAT  CAGCTCCTTT  AATTTAGATGGCATTATACG
4801 AAAAAATGTT  CTCAACATAG  CATTACTTAT  TAATTCATTT  TTTCGAATAAAACCAATTTT
4861 ATATTGATAA  TACAATACTT  TATACTCGTA  CAATAAATAT  GACAATCCACGTCGAGCCAT
4921 AAGATTACGA  CCAGTTCGCA  TTTTTAATAA  AATATCTGGA  AGATTTGCAAATCTTGCATT
4981 ATGTACAATT  AATAGGCTCC  ACAATGCAAA  ATCTTGAGAT  TTTCTGAATGGAGGATAACC
5041 ACCAACAGCT  AATACTGTAT  TCTTTCTAAA  AATTACAGAA  GGATGGCTAACTGCGCTTCG
5101 TTTCCTCGCG  AATTTAACTA  TTTCTCTATG  TTCGAGAGGC  ACTTTGCGTGTTGAAATAAA
5161 CTCCTCAGTA  ACAGTTTCAA  TTTCATCAAT  AAAACTGCCA  CATACATCTATTTCTGAATT
5221 ATTAATCATA  AAAGAAATTT  GTTTCTCAAA  CCGATGAGGC  AAAGAAATATCATCAGCATC
5281 CATTCTTGCC  ACTAACTCAT  TCCTACAAGC  CTTTAATCCT  TCATTTAAGGCATTAGCCAA
5341 TCCAACATTT  CTAGGTAAAG  GTACAAATGT  TACTATTTTA  TTGCCAACATCATCAATGAA
5401 TGAATTTATA  ATATCGATGT  GTGTTTGATG  GAGTTCTCCA  TCTGCAACAATTACTATTTG
5461 ATCTGGCTTA  AGTGTTTGAT  CGTGAAAAAT  AGAGCGTAGA  GCCACCTCAAAAAATTGCGG
5521 TAGATCATTT  TTATAAATGC  TAATTAAAAC  TGAGAATTTT  TCTAATCTATGATTCATTTC
5581 ATTTTACCAC  TTCGACCCAT  TAAACCGTCA  TTAATGCCTT  TTAAAAAAAAATATAACCTT
5641 TTATTACCAT  TTGGAAGGAA  AATAGGATAT  AAAAAAACCT  TTCCAATTAATTTAACCAGA
5701 CTAGAAATTT  TCCAGTAGAT  GGGTACATAA  TTTTTATTTA  ATAAAAGAAAGATATTTCGA
5761 GTAGCATAAT  AATGACGAAA  TGGGCTTGGC  AAACCGACAG  AAAGAATATTTAAGATCTTA
5821 AATCGCCCAT  CTCCAAGTCT  ATGTGCAAGT  AACGCATTTT  TATTCCTAATTACTTTAAAC
5881 CCAGCAGCTC  TTAATCTCCA  ACAATATTCA  TGGTCTACCG  CATCGATAAAAAGCTCATCT
5941 TTCATTCCTC  CAACAATCAA  CCAACTATTT  TTTGGTATTA  GACTGCCAGAACTTAATGTA
6001 CTATCTACCT  CATAATAAAC  TTCTGTAAGT  GGTTTCCCTT  TTTTTACCCTTGCTTTATTT
6061 AATTCACCAG  TTACTTTATC  AAAATCTTGT  GAACCAACTA  AACCAACATTGACATTTTGT
6121 TTAAGCAATT  TTTTGTAACA  AGTAAGTAAC  TGCTCTACCA  TCTTAGGATCAGGAATACTA
6181 TCCTGATCCA  TTTGCAATAT  AAAATCAGCG  CCATTTTCAA  AAGCCCATTTCATTCCTATA
6241 CTTTGGGCTT  CTGCTATGCC  TAAATTATCA  TTGAAATTGA  ATATTTTTACATCGCCTGAA
6301 GAATTTTCAG  CATATTTATA  ACCATTTGTA  GAGTTATTGC  AAACGACAACTTTAGTAACT
6361 TGTCTCAACA  ATAATTCAAC  CGCATTTTTT  AAATCATTAT  GTTCTGGGTTGTAAGCAACC
6421 AAAACGGCAT  ATACAGTGTC  CATCTTCACC  TTAAAACCTT  CATTTAGCTTTCATCTTTTT
6481 TAGAACATTA  CTTAATGTCA  CTAATACAAT  TATTACAGCA  ACATGGTTAGAGTCTAAAAT
6541 ATAAGGATTA  GTAATTGCAT  AAGAAACATA  TAGAAAATAT  AGCACACACAACTCACTGTA
6601 TTTTATGATT  TTAATCGTGA  GAAGGAGATT  AATTAATAAA  AACAAAGTAAATAAAATAAC
6661 GCCAAGTTGA  TTTAAAAAAT  AAACTGACTG  CAATTCATAA  TATATATATGCACTATAATC
6721 ACGGATAGGA  GTTTGAATTT  TGATGACATT  ACCCAAACCA  GAACCTATAACAAAATTTGA
6781 TACAGACTCT  GTAAGATCAT  TAATTAATAC  AGTAAACTGA  TCCCATCTAACTCCTAAAGA
6841 AGAATCAGCT  CCATTTGATT  TCATGATTAT  CAACTCAATT  GAATATGTAATAAAAAAAGG
6901 GAGAATCACA  GTAAGAAAAA  CCCCAAAAAT  AATTTTCCTT  AATTTAGCGTATCGTGAGTT
6961 AGATTTAGAA  CATAGTATAA  TATACATAAA  AAACAAGCAT  ATCGAAACAAAATATGCAAA
7021 ATTACCAGCC  ACTATAGTAC  CTATAGCCAG  AATAACGGTT  ATTGTATTTTTGAATCGATA
7081 ATAGAAATAA  TCTTTTATGA  CTATATGCAA  CATAAAGGCA  AATGGAATGAGAGCATTTCC
7141 TTTAATTTGA  ACTCTATAGA  AACCACTTCC  ATATGTATAA  ACATCACCATAATCATTCTC
7201 CAAAAAATAA  TGTCTTAGTG  CTGAATAATC  ACCAATACCA  TATGTTTTTGTCATATAAAT
7261 ACTAATGATG  GATATAATAA  CCGCCTGTAA  TACCATTAAA  TATAAAAATATTTTAACAAT
7321 CGAGATGGTT  CCATAAGAGC  AGAAATAAGC  ACATAATATA  AATAATATGATAATATAAAA
7381 CCTAATTATT  ATCGCTATAT  CGTTACCCTT  GATATAGGAA  TAAATAAAATTTATAAAAAG
7441 AGCTAATAGA  AATATTAAAA  TAACAGGATA  GTGATATATT  CCGTTTGCAATTTTCTTTGT
7501 AAATGACATG  ATACAAAGAC  ATAAAAACCC  CTCCATAATC  CAACTATATTGAATAAATGG
7561 AAAGCTACGT  GTAAGGAAAA  ATATAAACCC  AAAAAACAAA  AGAACACTTAAACTTTTGTC
7621 TTTTGAGTTA  TAAAAATCAG  AAGTCATGTT  TGCACTCTAA  TTAGATGGGCTTGAGGAAGT
7681 AATCCCTAAA  ATCAATTCGC  TATTAATATT  TCGTATCAAT  TAATAATAATATCAAAAAAT
7741 CTAACGATGT  TCTTACAGAC  CATGCTATTG  CGGCTCCAAC  AATTCCCCAATGATAAATAA
7801 AAATATATAA  TATGCATAAA  TATGGGATAA  CTTCGAGCAA  ATGAATAATAGCTGTAATTT
7861 TTGATCTTCC  ACTAGCCTGA  ACTGAAACAA  ATGGGATTTG  TGCAATGCAATTAAAAAAGA
7921 AACCTATTGC  AAGAATTTTT  AATACTATAC  CTGGCGTCCC  ATGATATGTAGGTCCCATCC
7981 AAGCGGACAT  TATAAAATCT  GATAAAATAA  TTATCAACAT  TACAATTGGAAGTATACCAA
8041 TAACCATTAT  AAAATATGAT  AATATTTTAG  TTTGCTTTAC  CGATTGCAATTCTGAACTTA
8101 ATCTTGGAAA  AATAGCTCTG  GACAACGCAC  TTGGTAATAT  CGTTAAGCGTTGTATACCTT
8161 CAGACGGAGC  AGTATAAAAA  GAAACTTTAT  CAGCCCCCAC  AATGTGTGAAAGAATAAAAC
8221 GATCCATATA  TGTCATAATA  GGGCTAATAA  TATTGCTAAC  TGTTATCCAGCTTCCAAAGC
8281 CGATTAATCT  TTTAACTGTT  ACAATTTTTA  CAGACAGCCC  AGATGATATTATTAGTTTTC
8341 GACTAAATAT  AAAGGTCACT  ATAAGTGATA  AGACTCTTGC  CATAACTAAACCATATATAG
8401 CACTTAGTAA  TCCTCCATGA  AAAAAACAGA  AAATCACTGG  TAATCCAGCCACAAAAGAGT
8461 TGTTAATTGA  TTTTATTAAA  TTTACTTTTC  TGAACTTTTC  CATCCCCTCAAAAATCCCCA
8521 ACCAGACTTG  GTTTAACAAG  TATAAGGGTA  TGGTAGCTGA  AATAATATATATTGCTTTGA
8581 CAGATTCTAC  AACATGATTC  GCGTTAATGT  TTAATAATTT  AACAATTACATTGCTACTCA
8641 AAAATAGTAC  ACTACCGCCA  ATCAAGCCCA  ATATAGTTAG  AATTACCGTTGAAGTTGAAA
8701 TGATCGCTCT  TAATTCTTTA  TGAACATTTT  TATATATTGA  TACTTCTCTTATAACAGCTC
8761 TGGTCAATCC  AGCATCAAAA  ATACTTGCAT  ATCCAACTAA  GGCAATAGCTAACGTAAAAA
8821 GGCCAAATTG  CTCGGTCCCT  AGAATTCTAG  ACAGTATACC  TAACGCAGGAATTGCTATTA
8881 ATGATGGTAT  AATATACCCA  CTTATATTCC  ATAAAGTATT  CTTTACAATACTCACAAAAA
8941 TAATTCCTTC  ATGTTATGCA  ATTCTTTAGC  CCTTGCATCT  TTAATCGATAAAATATAATT
9001 ATTATGTTCT  ATCGTCGGCC  ATTTTATGCT  CAGAATAGGA  TCATTCCATACAATCCCTCT
9061 ATCACTATCA  GGATGATAAT  AGTTCGTCGT  TTTATATAAA  AATTCCGCAGTCTCGCTCAG
9121 CACCAAAAAA  CCATGTGCAA ATCCCTCAGG  GATCCACAAT  TGCCGCTTATTCTCAGCAGA
9181 TAAATTCACC  CCAACCCATT  TACCAAAGGT  AGGCGACGAT  TTACGAATATCAACAGCTAC
9241 ATCAAAAACC  TCACCAACAA  CGCAACGTAC  CAGTTTCCCT  TGCGCATAAGGTTCTAACTG
9301 ATAATGCAGC  CCGCGTAAAA  CACCTTTACT  AGACTTCGAA  TGGTTATCCTGAACAAATTC
9361 AACCTTACGT  CCTACAGCTT  CTTCGAAAAC  TTTCTGATTA  AAGCTTTCCATAAAGAAACC
9421 ACGCTCATCA  CCAAAAACTT  TCGGCTCGAA  AATTAACACA  TCAGGAATTTCTGTTTTAAT
9481 TACGTTCATT  TTATTAATAA  CCTTTAATCA  TTTTCAGCAG  ATACTGTCCATAAGCATTTT
9541 TTTTCAGCGG  CTCCGCTAAT  GCTTTCACCT  GTTCAGCATC  AATAAACCCTTTACGGTAAG
9601 CAATTTCTTC  TGGGCAGGAA  ACCTTTAGTC  CCTGGCGCTC  TTCAATGGTGGCAATGAAGT
9661 TGCTTGCTTC  AATAAGACTC  TGATGTGTCC  CCGTATCCAG  CCATGCATAACCACGCCCCA
9721 TCATGGCAAC  GGATAAACGC  CCCTGTTCCA  TATAAATACG  GTTAATATCGGTAATTTCCA
9781 GTTCACCACG  GGCAGAAGGC  TTAAGGTTTT  TCGCCATTTC  GACAACGTCGTTATCATAGA
9841 AATAAAGCCC  GGTTACCGCA  TAATTACTTT  TTGGTTGTAG  CGGTTTTTCTTCCAGGCTTA
9901 TTGCCGTACC  GTTTTTATCA  AACTCAACGA  CGCCGTAGCG  TTCAGGATCATTAACGTGAT
9961 AGGCAAATAC  CGTTGCACCA  CTTTCTTTGT  TAACAGCGAC  ATCCATTAACTTCGGCAGAT
10021 CATGACCGTA  GAAGATATTA  TCACCAAGAA  CCAAAGCACA ATCATCACCACCGATAAACT
10081 CTTCACCGAT  AATAAACGCC  TGCGCAAGCC  CATCTGGAGT  CGGTTGCACTTTGTACTGAA
10141 GATTTAGCCC  CCACTGGCTA  CCGTCACCTA  GCAGTTGTTG  AAAACGAGGAGTATCCTGTG
10201 GCGTACTAAT  AATCAGAATA  TCGCGAATAC  CCGCCAACAT  CAGTGTAGAGAGCGGGTAAT
10261 AGATCATCGG  CTTATCATAA  ATAGGTAATA  GCTGTTTACT  GACAGCCATAGTCACAGGAT
10321 AAAGACGTGT  ACCAGAACCA  CCCGCTAAAA  TAATACCTTT  ACGCGTTTTCATTTCATCAT
10381 TCCTTTTAAT  TCATCTTGCT  CCACCATCAC  GAACAAGATG  CAAAAACTATTAAATTGCTG
10441 TAGTCGTAAT  TAATTCGTTG  AGCATTCGTT  TCACACCAAC  CTGCCAGTCAGGCAAGACAA
10501 GCGCAAAGTT  CTGCTGAAAT  TTTTCTGTAT  TAAGGCGAGA  GTTATGTGGACGACGAGCTG
10561 GTGTAGGATA  GGCTGTTGTT  GGTACTGCGT  TGAGCTTGTT  GAGTGCAAGGGGAATACCTG
10621 CTTTGCGCGC  CTCTTCAAAA  ACCAGCGCAG  CATAATCGTG  CCAGGTTGTGGTACCACTGG
10681 CTACCAGATG  GTACAAACCT  GCGACTTCCG  GTTTATTCAG  TGCCACACGAATAGCATGTG
10741 CCGTACAATC  AGCCAGCAGC  TCAGCACCTG  TTGGCGCACC  AAATTGATCATTTATCACAG
10801 CCAGTTCTTC  GCGCTCTTTT  GCCAGACGCA  ACATCGTTTT  GGCGAAGTTATTTCCTTTAG
10861 CTGCGTATAC  CCAGCTGGTA  CGGAAAATAA  GATGCTTCGC  GCAATGTTCCTGTAACGCTT
10921 TTTCTCCGGC  TAACTTGGTT  TCACCGTAAA  CATTTAGCGG  TGCGGTTGCATCCGTCTCCA
10981 GCCATGGCGT  GTCGCCATTT  CCAGGGAATA  CGTAGTCAGT  TGAGTAATGAATTACCCAAG
11041 CCCCAACTTC  ATTAGCCTCT  TTTGCAATTG  ATTCAACACT  AGTCGCATTGAGTAATTGTG
11101 CAAATTCGGG  TTCTGACTCA  GCCTTATCTA  CTGCGGTGTG  AGCCGCAGCATTAACAATAA
11161 CATCAGGTCG  AATTCTTTTG  ACTGTTTCAG  CTACACCTTC  AGGATTACTAAAATCACCAC
11221 AATAATCAGT  GGAGTGAACA  TCAAGAGCAA  TCAAATTACC  CAAAGGTGCCAGAGCACGCT
11281 GTAGTTCCCA  ACCTACCTGC  CCTGTTTTGC  CGAAAAGGAG  GATATTCATTACTGGCGGCC
11341 CTCATAGTTC  TGTTCAATCC  ACGATTGATA  AGCACCACTT  TTCACATTATCAACCCATTT
11401 TGTATTGGAC  AGGTACCATT  CCAATGTCTT  CCGAATCCCG  CTCTCAAACGTTTCCTGCGG
11461 TTTCCAGCCC  AATTCGCGGC TAATCTTCTC  TGCATCAATC  GCATAACGGCGATCGTGTCC
11521 CGGGCGATCG  GCAACATAAG  TAATTTGCTC  GCGGTAAGAT  TTCTCTTTCGGTACAATCTC
11581 ATCCAGCAAA  TCACAAATAG  TGAGCACTAC  ATCGATGTTT  TTCTTTTCGTTGTGTCCACC
11641 AATGTTATAA  GTTTCACCCG  CTTTACCTTC  GGTTACGACG  GTATATAACGCACGCGCATG
11701 ATCTTCAACA  TACAGCCAGT  CACGAATTTG  ATCCCCTTTG  CCATAAATAGGTAATGCCTT
11761 ACCTTCCAGA  GCATTCAGAA  TAACCAATGG  AATCAATTTT  TCCGGGAAATGATAAGGACC
11821 ATAATTATTA  GAGCAATTAG  TCACAATGGT  TGGTAAACCA  TAGGTACGTTTCCACGCGCG
11881 GACTAAATGA  TCGCTGGATG  CTTTTGAAGC  GGAATAAGGG  CTGCTTGGCGCGTAAGCTGT
11941 TGTCTCTGTA  AATAAGGGTA  ATTCTTCTGT  ATTATTTACC  TCGTCAGGATGAGGCAAATC
12001 ACCATAGACT  TCGTCAGTAG  AAATATGATG  AAAACGGAAT  CTAGTTTTCTTGTCGCTATC
12061 AAGAGCAGAC  CAATAATTGC  GAGCGGCTTC  CAAAAGGACA  TATGTACCAACAATATTGGT
12121 TTCAATAAAT  GCCGCAGGAC  CTGTAATTGA  ACGGTCAACA  TGGCTTTCAGCAGCCAGGTG
12181 CATCACTGCA  TCTGGCTGAT  GCTGAGCAAA  AATCCGTGCC  ATTGCAGCTGCATCGCAAAT
12241 ATCCGCATGT  TCAAAAACAT  AGCGTTCAGA  ATCAGAAACA  TCAGCAAGTGATTCCAGGTT
12301 TCCGGCGTAC  GTTAATTTAT  CGACATTAAC  AACACTATCC  TGCGTATTATTTATAATGTG
12361 ACGAACTACA  GCAAAACCAA  TAAATCCTGC  GCCACCAGTA  ACAAGTATTTTCACCTAATT
12421 TATTCCATAT  TGCTTCAGAG  CATGCTGTGA  AATAAGCGGC  TCTCAGTTTGATTAATAGAA
12481 GTATTAATGC  ACGCTACCGC  CCCTGGCTTT  ACAGCTACCA  GAGCACTGCATGCATGCCTA
12541 CGATGTGACG  AGCGTTACCC  ACTCGCGCTA  AACCCGAAAA  ATTCAAAAGCTAATTGTCTT
12601 ACCAATCCGC  TCTGGAAACA  AGGAAAATCC  TGGAAAACTT  TGACTAAAATCCTATTGCTA
12661 ACTCGTTGTT  ATTCTGATTG  TTTATATAAA  ACAACGGCAG  GAATATTCGCAACAAATTAC
12721 TTTCACCACG  AATCTTCACT  GCCGTTATAA  TTTTCTTATC  AACCGTTACATCCGGTCAGA
12781 TTTTCATTAT  TCGCTTAACA  GCTTCTCAAT  ACCTTTACGG  AACTTCGCCCCTTCTTTCAG
12841 GTTGCGCAGC  CCATACTTCA  CAAACGCCTG  CATATAGCCC  ATTTTTTTACCGCAGTCGTA
12901 GCTGTCGCCG  GTCATCAGCA  TTGCATCAAC  GGACTGTTTT  TTCGCCAGCTCGGCAATGGC
12961 ATCAGTCAGC  TGAATACGTC  CCCATGCACC  AGGCTGAGTA  CGTTCAAGTTCCGGCCAAAT
13021 ATCGGCAGAA  AGCACATAGC  GACCAACGGC  CATGATGTCT  GAGTCCAGCGTCTGCGGCTG
13081 ATCCGGTTTT  TCGATAAATT  CAACAATGCG  GCTGACTTTA  CCTTCGCGATCCAGCGGTTC
13141 TTTGGTCTGG  ATGACGGAGT  ATTCAGAGAG  GTCACCCGGC  ATACGTTTTGCCAGCACCTG
13201 GCTACGGCCC  GTTTCATTGA  AGCGCGCAAT  CATGGCAGCA  AGGTTGTAGCGTAGCGGGTC
13261 GGCGCTGGCG  TCGTCGATCA  CAACGTCTGG  CAGCACCACG  ACAAATGGATTGTCACCAAT
13321 GGCGGGTCGT  GCACACAAAA  TGGAGTGACC  TAAACCTAAA  GGTTCGCCCTGACGCACGTT
13381 CATAATAGTC  ACGCCCGGCG  GGCAGATAGA  TTGCACTTCC  GCCAGTAGTTGACGCTTCAC
13441 GCGCTGCTCA  AGGAGAGATT  CTAATTCATA  AGAGGTGTCG  AAGTGGTTTTCGACCGCGTT
13501 CTTGGACGCA  TGAGTTACCA  GGAGGATTTC  TTTGATCCCT  GCAGCCACAATCTCGTCAAC
13561 AATGTACTGA  ATCATTGGCT  TGTCGACGAT  CGGTAGCATC  TCTTTGGGTATCGCCTTAGT
13621 GGCAGGCAAC  ATATGCATCC  CAAGACCCGC  TACCGGTATA  ACTGCTTTTAAATTCGTCAT
13681 TATTTTCCTA  CCTCTAAGGG  GCTGATAGTG  CGTAAATTAT  TGTCATAGGTTAGCCAAACG
13741 GTATGGCTAT  ATACCAAGCA  TAACTTTGAT  TAAACCTTAC  GATAACACTACACACCATCA
13801 GCATCTGGGT  TACTCGGATT  ACTCGGAAAT  CCACATACTG  ATAATTTAATCAGTACCTCT
13861 TTCCGAATAA  TCGTAGTCCA  ACCTGGTCCT  TTTTTCTCTG  ACTCGTCTGCATTACTCAGA
13921 AACAAACGTT  ATGTCGTCTT  TTTTGGCATG  GACGAATTCA  TACTGCAGAGTTCGATCCAG
13981 ACCTTGCGAC  AGCGTATACG  GTGCAACAAA  ACCTGAAGAA  TGCACTTTCGTTGCGTCAAA
14041 CTGTGTTGTT  GCGCAGAATT  TTTTCACGCG  CACAGAGCTG  ACAGCGTATTTTTTGCCCGT
14101 AATTTTGCTC  AGGATATCAA  AGCAATATCC  ACCCAGCATT  CCTAGTGGGTAAGGCAAGTG
14161 CATAGAAGGG  ATCTTTTTGT  TCAGGCTTTG  TTCAACTTCA  GCAACCAACTGGTTCATGTT
14221 CAGGTCTGGC  TTATCAACAT  AGTTATAAAC  CTCATAACCT  GCGGCAACATTCTTCAGTTT
14281 GTACTTGATA  AACTCAACAA  TGTTTCCAAC  ATAAGCCATG  GACTTATAGTTAGTCCCTGC
14341 GCCCACCATC  ATAAACTTGC  CGCCAGCGAT  CTGTTTCAGC  AAGTTATAGACGTTACCGCG
14401 GTTGCGTTCA  CCGAAGATAA  CGGTAGGACG  GATGATGGTT  AATGAACGTTCTGTTGGTGC
14461 TTTGTTATAC  CATTCACGCA  GCACTTCCTC  TGCCTGCCAC  TTACTTTTGCCGTAGTGGTT
14521 GAAAGGGTCG  TGTGGATGGT  TTTCGTCAGG  GTTGTGTTTG  TTCAAACCATAAACAGCAAC
14581 GGAACTGGTA  AAGATGATAT  TTTTAACGCC  ATTTTTTTCC  ATGGCCGCCAGCACATTGCG
14641 GGTACCCTGA  ACGTTGACAT  CATAATAGAG  AGAAGTAGGG  CTGACGTCATCGCGGTGTTC
14701 CGCTGCCAGT  AGTACAACAG  TGTCAAAACC  GGCTAACGCC  TGGTCGAGTGCCTGTTGATC
14761 ACGAACATCA  CCAATCTGTG  TGATTTCTGG  ATAAAAGTGG  CTCTGCCGTTTGTCCAGGTT
14821 CTTGATATTA  AAGTCAGCAA  TTGCCGTTTC  AAGTAGTCGG  GTTCCTACGAATCCGGAAGC
14881 TCCTATGAGC  AAAACGTTAT  TGTTCATAAA  TCACTTTAGT  CTGGTTGTTACGTAAGAAAC
14941 ACAAGATAAA  GATGAGTACC  TTCCCTGAGT  AGTCAATGCT  GCCCAGCCCCAGCTTTAACA
15001 GTTAGTGTGA  GGATTATAAT  CTTTTAGAAC  ATTATATCCA  GTAAGTTTATGAATGGTCGC
15061 AAATCTACTC  TCTCCGTTCC  GGCAATCTAA  AGTTAATGCT  AGCGACGTCGTGGGATCCTC
15121 TAGAGTCGAC  CTGCAGGCAT  GCAAGCTTGA  GTATTCTATA  GTCTCACCTAAATAGCTTGG
15181 CGTAATCATG  GTCATAGCTG  TTTCCTGTGT  GAAATTGTTA  TCCGCTCACAATTCCACACA
15241 ACATACGAGC  CGGAAGCATA  AAGTGTAAAG  CCTGGGGTGC  CTAATGAGTGAGCTAACTCA
15301 CATTAATTGC  GTTGCGCTCA  CTGCCCGCTT  TCCAGTCGGG  AAACCTGTCGTGCCAGCTGC
15361 ATTAATGAAT  CGGCCAACGC  GAACCCCTTG  CGGCCGCCCG  GGCCGTCGACCAATTCTCAT
15421 GTTTGACAGC  TTATCATCGA  ATTTCTGCCA  TTCATCCGCT  TATTATCACTTATTCAGGCG
15481 TAGCAACCAG  GCGTTTAAGG  GCACCAATAA  CTGCCTTAAA  AAAATTACGCCCCGCCCTGC
15541 CACTCATCGC  AGTACTGTTG  TAATTCATTA  AGCATTCTGC  CGACATGGAAGCCATCACAA
15601 ACGGCATGAT  GAACCTGAAT  CGCCAGCGGC  ATCAGCACCT  TGTCGCCTTGCGTATAATAT
15661 TTGCCCATGG  TGAAAACGGG  GGCGAAGAAG  TTGTCCATAT  TGGCCACGTTTAAATCAAAA
15721 CTGGTGAAAC  TCACCCAGGG  ATTGGCTGAG  ACGAAAAACA  TATTCTCAATAAACCCTTTA
15781 GGGAAATAGG  CCAGGTTTTC  ACCGTAACAC  GCCACATCTT  GCGAATATATGTGTAGAAAC
15841 TGCCGGAAAT  CGTCGTGGTA  TTCACTCCAG  AGCGATGAAA  ACGTTTCAGTTTGCTCATGG
15901 AAAACGGTGT  AACAAGGGTG  AACACTATCC  CATATCACCA  GCTCACCGTCTTTCATTGCC
15961 ATACGAAATT  CCGGATGAGC  ATTCATCAGG  CGGGCAAGAA  TGTGAATAAAGGCCGGATAA
16021 AACTTGTGCT  TATTTTTCTT  TACGGTCTTT  AAAAAGGCCG  TAATATCCAGCTGAACGGTC
16081 TGGTTATAGG  TACATTGAGC  AACTGACTGA  AATGCCTCAA  AATGTTCTTTACGATGCCAT
16141 TGGGATATAT  CAACGGTGGT  ATATCCAGTG  ATTTTTTTCT  CCATTTTAGCTTCCTTAGCT
16201 CCTGAAAATC  TCGATAACTC  AAAAAATACG  CCCGGTAGTG  ATCTTATTTCATTATGGTGA
16261 AAGTTGGAAC  CTCTTACGTG  CCGATCAACG  TCTCATTTTC  GCCAAAAGTTGGCCCAGGGC
16321 TTCCCGGTAT  CAACAGGGAC  ACCAGGATTT  ATTTATTCTG  CGAAGTGATCTTCCGTCACA
16381 GGTATTTATT  CGCGATAAGC  TCATGGAGCG  GCGTAACCGT  CGCACAGGAAGGACAGAGAA
16441 AGCGCGGATC  TGGGAAGTGA  CGGACAGAAC  GGTCAGGACC  TGGATTGGGGAGGCGGTTGC
16501 CGCCGCTGCT  GCTGACGGTG  TGACGTTCTC  TGTTCCGGTC  ACACCACATACGTTCCGCCA
16561 TTCCTATGCG  ATGCACATGC  TGTATGCCGG  TATACCGCTG  AAAGTTCTGCAAAGCCTGAT
16621 GGGACATAAG  TCCATCAGTT  CAACGGAAGT  CTACACGAAG  GTTTTTGCGCTGGATGTGGC
16681 TGCCCGGCAC  CGGGTGCAGT  TTGCGATGCC  GGAGTCTGAT  GCGGTTGCGATGCTGAAACA
16741 ATTATCCTGA  GAATAAATGC  CTTGGCCTTT  ATATGGAAAT  GTGGAACTGAGTGGATATGC
16801 TGTTTTTGTC  TGTTAAACAG  AGAAGCTGGC  TGTTATCCAC  TGAGAAGCGAACGAAACAGT
16861 CGGGAAAATC  TCCCATTATC  GTAGAGATCC  GCATTATTAA  TCTCAGGAGCCTGTGTAGCG
16921 TTTATAGGAA  GTAGTGTTCT  GTCATGATGC  CTGCAAGCGG  TAACGAAAACGATTTGAATA
16981 TGCCTTCAGG  AACAATAGAA  ATCTTCGTGC  GGTGTTACGT  TGAAGTGGAGCGGATTATGT
17041 CAGCAATGGA  CAGAACAACC  TAATGAACAC  AGAACCATGA  TGTGGTCTGTCCTTTTACAG
17101 CCAGTAGTGC  TCGCCGCAGT  CGAGCGACAG  GGCGAAGCCC  TCGGCTGGTTGCCCTCGCCG
17161 CTGGGCTGGC  GGCCGTCTAT  GGCCCTGCAA  ACGCGCCAGA  AACGCCGTCGAAGCCGTGTG
17221 CGAGACACCG  CGGCCGGCCG  CCGGCGTTGT  GGATACCTCG  CGGAAAACTTGGCCCTCACT
17281 GACAGATGAG  GGGCGGACGT  TGACACTTGA  GGGGCCGACT  CACCCGGCGCGGCGTTGACA
17341 GATGAGGGGC  AGGCTCGATT  TCGGCCGGCG  ACGTGGAGCT  GGCCAGCCTCGCAAATCGGC
17401 GAAAACGCCT  GATTTTACGC  GAGTTTCCCA  CAGATGATGT  GGACAAGCCTGGGGATAAGT
17461 GCCCTGCGGT  ATTGACACTT  GAGGGGCGCG  ACTACTGACA  GATGAGGGGCGCGATCCTTG
17521 ACACTTGAGG  GGCAGAGTGC  TGACAGATGA  GGGGCGCACC  TATTGACATTTGAGGGGCTG
17581 TCCACAGGCA  GAAAATCCAG  CATTTGCAAG  GGTTTCCGCC  CGTTTTTCGGCCACCGCTAA
17641 CCTGTCTTTT  AACCTGCTTT  TAAACCAATA  TTTATAAACC  TTGTTTTTAACCAGGGCTGC
17701 GCCCTGTGCG  CGTGACCGCG  CACGCCGAAG  GGGGGTGCCC  CCCCTTCTCGAACCCTCCCG
17761 GTCGAGTGAG  CGAGGAAGCA  CCAGGGAACA  GCACTTATAT  ATTCTGCTTACACACGATGC
17821 CTGAAAAAAC  TTCCCTTGGG  GTTATCCACT  TATCCACGGG  GATATTTTTATAATTATTTT
17881 TTTTATAGTT  TTTAGATCTT  CTTTTTTAGA  GCGCCTTGTA  GGCCTTTATCCATGCTGGTT
17941 CTAGAGAAGG  TGTTGTGACA  AATTGCCCTT  TCAGTGTGAC  AAATCACCCTCAAATGACAG
18001 TCCTGTCTGT  GACAAATTGC  CCTTAACCCT  GTGACAAATT  GCCCTCAGAAGAAGCTGTTT
18061 TTTCACAAAG  TTATCCCTGC  TTATTGACTC  TTTTTTATTT  AGTGTGACAATCTAAAAACT
18121 TGTCACACTT  CACATGGATC  TGTCATGGCG  GAAACAGCGG  TTATCAATCACAAGAAACGT
18181 AAAAATAGCC  CGCGAATCGT  CCAGTCAAAC  GACCTCACTG  AGGCGGCATATAGTCTCTCC
18241 CGGGATCAAA  AACGTATGCT  GTATCTGTTC  GTTGACCAGA  TCAGAAAATCTGATGGCACC
18301 CTACAGGAAC  ATGACGGTAT  CTGCGAGATC  CATGTTGCTA  AATATGCTGAAATATTCGGA
18361 TTGACCTCTG  CGGAAGCCAG  TAAGGATATA  CGGCAGGCAT  TGAAGAGTTTCGCGGGGAAG
18421 GAAGTGGTTT  TTTATCGCCC  TGAAGAGGAT  GCCGGCGATG  AAAAAGGCTATGAATCTTTT
18481 CCTTGGTTTA  TCAAACGTGC  GCACAGTCCA  TCCAGAGGGC  TTTACAGTGTACATATCAAC
18541 CCATATCTCA  TTCCCTTCTT  TATCGGGTTA  CAGAACCGGT  TTACGCAGTTTCGGCTTAGT
18601 GAAACAAAAG  AAATCACCAA  TCCGTATGCC  ATGCGTTTAT  ACGAATCCCTGTGTCAGTAT
18661 CGTAAGCCGG  ATGGCTCAGG  CATCGTCTCT  CTGAAAATCG  ACTGGATCATAGAGCGTTAC
18721 CAGCTGCCTC  AAAGTTACCA  GCGTATGCCT  GACTTCCGCC  GCCGCTTCCTGCAGGTCTGT
18781 GTTAATGAGA  TCAACAGCAG  AACTCCAATG  CGCCTCTCAT  ACATTGAGAAAAAGAAAGGC
18841 CGCCAGACGA  CTCATATCGT  ATTTTCCTTC  CGCGATATCA  CTTCCATGACGACAGGATAG
18901 TCTGAGGGTT  ATCTGTCACA  GATTTGAGGG  TGGTTCGTCA  CATTTGTTCTGACCTACTGA
18961 GGGTAATTTG  TCACAGTTTT  GCTGTTTCCT  TCAGCCTGCA  TGGATTTTCTCATACTTTTT
19021 GAACTGTAAT  TTTTAAGGAA  GCCAAATTTG  AGGGCAGTTT  GTCACAGTTGATTTCCTTCT
19081 CTTTCCCTTC  GTCATGTGAC  CTGATATCGG  GGGTTAGTTC  GTCATCATTGATGAGGGTTG
19141 ATTATCACAG  TTTATTACTC  TGAATTGGCT  ATCCGCGTGT  GTACCTCTACCTGGAGTTTT
19201 TCCCACGGTG  GATATTTCTT  CTTGCGCTGA  GCGTAAGAGC  TATCTGACAGAACAGTTCTT
19261 CTTTGCTTCC  TCGCCAGTTC  GCTCGCTATG  CTCGGTTACA  CGGCTGCGGCGAGCGCTAGT
19321 GATAATAAGT  GACTGAGGTA  TGTGCTCTTC  TTATCTCCTT  TTGTAGTGTTGCTCTTATTT
19381 TAAACAACTT  TGCGGTTTTT  TGATGACTTT  GCGATTTTGT  TGTTGCTTTGCAGTAAATTG
19441 CAAGATTTAA  TAAAAAAACG  CAAAGCAATG  ATTAAAGGAT  GTTCAGAATGAAACTCATGG
19501 AAACACTTAA  CCAGTGCATA  AACGCTGGTC  ATGAAATGAC  GAAGGCTATCGCCATTGCAC
19561 AGTTTAATGA  TGACAGCCCG  GAAGCGAGGA  AAATAACCCG  GCGCTGGAGAATAGGTGAAG
19621 CAGCGGATTT  AGTTGGGGTT  TCTTCTCAGG  CTATCAGAGA  TGCCGAGAAAGCAGGGCGAC
19681 TACCGCACCC  GGATATGGAA  ATTCGAGGAC  GGGTTGAGCA  ACGTGTTGGTTATACAATTG
19741 AACAAATTAA  TCATATGCGT  GATGTGTTTG  GTACGCGATT  GCGACGTGCTGAAGACGTAT
19801 TTCCACCGGT  GATCGGGGTT  GCTGCCCATA  AAGGTGGCGT  TTACAAAACCTCAGTTTCTG
19861 TTCATCTTGC  TCAGGATCTG  GCTCTGAAGG  GGCTACGTGT  TTTGCTCGTGGAAGGTAACG
19921 ACCCCCAGGG  AACAGCCTCA  ATGTATCACG  GATGGGTACC  AGATCTTCATATTCATGCAG
19981 AAGACACTCT  CCTGCCTTTC  TATCTTGGGG  AAAAGGACGA  TGTCACTTATGCAATAAAGC
20041 CCACTTGCTG  GCCGGGGCTT  GACATTATTC  CTTCCTGTCT  GGCTCTGCACCGTATTGAAA
20101 CTGAGTTAAT  GGGCAAATTT  GATGAAGGTA  AACTGCCCAC  CGATCCACACCTGATGCTCC
20161 GACTGGCCAT  TGAAACTGTT  GCTCATGACT  ATGATGTCAT  AGTTATTGACAGCGCGCCTA
20221 ACCTGGGTAT  CGGCACGATT  AATGTCGTAT  GTGCTGCTGA  TGTGCTGATTGTTCCCACGC
20281 CTGCTGAGTT  GTTTGACTAC  ACCTCCGCAC  TGCAGTTTTT  CGATATGCTTCGTGATCTGC
20341 TCAAGAACGT  TGATCTTAAA  GGGTTCGAGC  CTGATGTACG  TATTTTGCTTACCAAATACA
20401 GCAATAGTAA  TGGCTCTCAG  TCCCCGTGGA  TGGAGGAGCA  AATTCGGGATGCCTGGGGAA
20461 GCATGGTTCT  AAAAAATGTT  GTACGTGAAA  CGGATGAAGT  TGGTAAAGGTCAGATCCGGA
20521 TGAGAACTGT  TTTTGAACAG  GCCATTGATC  AACGCTCTTC  AACTGGTGCCTGGAGAAATG
20581 CTCTTTCTAT  TTGGGAACCT  GTCTGCAATG  AAATTTTCGA  TCGTCTGATTAAACCACGCT
20641 GGGAGATTAG  ATAATGAAGC  GTGCGCCTGT  TATTCCAAAA  CATACGCTCAATACTCAACC
20701 GGTTGAAGAT  ACTTCGTTAT  CGACACCAGC  TGCCCCGATG  GTGGATTCGTTAATTGCGCG
20761 CGTAGGAGTA  ATGGCTCGCG  GTAATGCCAT  TACTTTGCCT  GTATGTGGTCGGGATGTGAA
20821 GTTTACTCTT  GAAGTGCTCC  GGGGTGATAG  TGTTGAGAAG  ACCTCTCGGGTATGGTCAGG
20881 TAATGAACGT  GACCAGGAGC  TGCTTACTGA  GGACGCACTG  GATGATCTCATCCCTTCTTT
20941 TCTACTGACT  GGTCAACAGA  CACCGGCGTT  CGGTCGAAGA  GTATCTGGTGTCATAGAAAT
21001 TGCCGATGGG  AGTCGCCGTC  GTAAAGCTGC  TGCACTTACC  GAAAGTGATTATCGTGTTCT
21061 GGTTGGCGAG  CTGGATGATG  AGCAGATGGC  TGCATTATCC  AGATTGGGTAACGATTATCG
21121 CCCAACAAGT  GCTTATGAAC  GTGGTCAGCG  TTATGCAAGC  CGATTGCAGAATGAATTTGC
21181 TGGAAATATT  TCTGCGCTGG  CTGATGCGGA  AAATATTTCA  CGTAAGATTATTACCCGCTG
21241 TATCAACACC  GCCAAATTGC  CTAAATCAGT  TGTTGCTCTT  TTTTCTCACCCCGGTGAACT
21301 ATCTGCCCGG  TCAGGTGATG  CACTTCAAAA  AGCCTTTACA  GATAAAGAGGAATTACTTAA
21361 GCAGCAGGCA  TCTAACCTTC  ATGAGCAGAA  AAAAGCTGGG  GTGATATTTGAAGCTGAAGA
21421 AGTTATCACT  CTTTTAACTT  CTGTGCTTAA  AACGTCATCT  GCATCAAGAACTAGTTTAAG
21481 CTCACGACAT  CAGTTTGCTC  CTGGAGCGAC  AGTATTGTAT  AAGGGCGATAAAATGGTGCT
21541 TAACCTGGAC  AGGTCTCGTG  TTCCAACTGA  GTGTATAGAG  AAAATTGAGGCCATTCTTAA
21601 GGAACTTGAA  AAGCCAGCAC  CCTGATGCGA  CCACGTTTTA  GTCTACGTTTATCTGTCTTT
21661 ACTTAATGTC  CTTTGTTACA  GGCCAGAAAG  CATAACTGGC  CTGAATATTCTCTCTGGGCC
21721 CACTGTTCCA  CTTGTATCGT  CGGTCTGATA  ATCAGACTGG  GACCACGGTCCCACTCGTAT
21781 CGTCGGTCTG  ATTATTAGTC  TGGGACCACG  GTCCCACTCG  TATCGTCGGTCTGATTATTA
21841 GTCTGGGACC  ACGGTCCCAC  TCGTATCGTC  GGTCTGATAA  TCAGACTGGGACCACGGTCC
21901 CACTCGTATC  GTCGGTCTGA  TTATTAGTCT  GGGACCATGG  TCCCACTCGTATCGTCGGTC
21961 TGATTATTAG  TCTGGGACCA  CGGTCCCACT  CGTATCGTCG  GTCTGATTATTAGTCTGGAA
22021 CCACGGTCCC  ACTCGTATCG  TCGGTCTGAT  TATTAGTCTG  GGACCACGGTCCCACTCGTA
22081 TCGTCGGTCT  GATTATTAGT  CTGGGACCAC  GATCCCACTC  GTGTTGTCGGTCTGATTATC
22141 GGTCTGGGAC  CACGGTCCCA  CTTGTATTGT  CGATCAGACT  ATCAGCGTGAGACTACGATT
22201 CCATCAATGC  CTGTCAAGGG  CAAGTATTGA  CATGTCGTCG  TAACCTGTAGAACGGAGTAA
22261 CCTCGGTGTG  CGGTTGTATG  CCTGCTGTGG  ATTGCTGCTG  TGTCCTGCTTATCCACAACA
22321 TTTTGCGCAC  GGTTATGTGG  ACAAAATACC  TGGTTACCCA  GGCCGTGCCGGCACGTTAAC
22381 CGGGCTGCAT  CCGATGCAAG  TGTGTCGCTG  TCGACGAGCT  CGCGAGCTCGGACATGAGGT
22441 TGCCCCGTAT  TCAGTGTCGC  TGATTTGTAT  TGTCTGAAGT  TGTTTTTACGTTAAGTTGAT
22501 GCAGATCAAT  TAATACGATA  CCTGCGTCAT  AATTGATTAT  TTGACGTGGTTTGATGGCCT
22561 CCACGCACGT  TGTGATATGT  AGATGATAAT  CATTATCACT  TTACGGGTCCTTTCCGGTGA
22621 TCCGACAGGT  TACGGGGCGG  CGACCTCGCG  GGTTTTCGCT ATTTATGAAAATTTTCCGGT
22681 TTAAGGCGTT  TCCGTTCTTC  TTCGTCATAA  CTTAATGTTT  TTATTTAAAATACCCTCTGA
22741 AAAGAAAGGA  AACGACAGGT  GCTGAAAGCG  AGCTTTTTGG  CCTCTGTCGTTTCCTTTCTC
22801 TGTTTTTGTC  CGTGGAATGA  ACAATGGAAG  TCCGAGCTCA  TCGCTAATAACTTCGTATAG
22861 CATACATTAT ACGAAGTTAT ATTCGAT

Claims (32)

1.一种重组N-糖基化蛋白，其包含：
引入的共有序列D/E–X–N–Z–S/T中的一个或多个，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸；和
在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的聚糖，其与至少所述一个或多个引入的共有序列通过N-糖苷键连接。
2.权利要求1的重组N-糖基化蛋白，其中所述蛋白是铜绿假单胞菌胞外蛋白。
3.权利要求1的重组N-糖基化蛋白，其中所述聚糖包含来自革兰氏阴性菌的寡糖或多糖。
4.权利要求3的重组N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌。
5.权利要求4的重组N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌6。
6.权利要求1的重组N-糖基化蛋白，其中所述聚糖包含寡糖或多糖，其包含以下结构：
7.权利要求3的重组N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌。
8.权利要求7的重组N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌O157。
9.权利要求1的重组N-糖基化蛋白，其中所述聚糖包含寡糖或多糖，其包含结构α-D-PerNAc-α-L-Fuc-β-D-Glc-α-D-GalNAc。
10.一种生物缀合物疫苗，其包含权利要求1的重组N-糖基化蛋白和佐剂。
11.一种重组原核生物合成***，其包含编码以下酶和蛋白的核酸：
在十一异戊二烯基焦磷酸上合成N-乙酰基半乳糖胺的差向异构酶；
在脂质载体上装配寡糖或多糖的糖基转移酶；
寡糖基转移酶；和
包含引入的共有序列D/E–X-N–Z–S/T中的一个或多个的蛋白，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸。
12.权利要求11的重组原核生物合成***，其中编码差向异构酶的所述核酸包含SEQ ID NO.1。
13.权利要求11的重组原核生物合成***，其中所述寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌。
14.权利要求11的重组原核生物合成***，其中所述蛋白是铜绿假单胞菌胞外蛋白。
15.权利要求11的重组原核生物合成***，其中所述寡糖或多糖是来自革兰氏阴性菌。
16.权利要求15的重组原核生物合成***，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌。
17.权利要求16的重组原核生物合成***，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌6。
18.权利要求11的重组原核生物合成***，其中所述寡糖或多糖包含以下结构：
Figure FDA00001877726900021
19.权利要求15的重组原核生物合成***，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌。
20.权利要求19的重组原核生物合成***，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌O157。
21.权利要求11的重组原核生物合成***，其中所述寡糖或多糖包含结构α-D-PerNAc-α-L-Fuc-β-D-Glc-α-D-GalNAc。
22.一种产生N-联糖基化蛋白的方法，包括：
a.)将编码i.)～iv.)的核酸导入宿主生物中：
i.)在十一异戊二烯基焦磷酸上合成N-乙酰基半乳糖胺的差向异构酶；
ii.)在脂质载体上装配寡糖或多糖的糖基转移酶；
iii.)寡糖基转移酶；和
iv.)包含引入的共有序列D/E–X-N–Z–S/T中的一个或多个的蛋白质，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸；和
b.)培养所述宿主生物直到至少一种N-糖基化蛋白产生。
23.权利要求22的方法，其中编码差向异构酶的所述核酸包含SEQ IDNO.1。
24.权利要求22的方法，其中所述寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌。
25.权利要求22的方法，其中所述蛋白是铜绿假单胞菌胞外蛋白。
26.权利要求22的方法，其中所述寡糖或多糖是来自革兰氏阴性菌。
27.权利要求26的方法，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌。
28.权利要求27的方法，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌6。
29.权利要求22的方法，其中所述寡糖或多糖包含以下结构：
30.权利要求26的方法，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌。
31.权利要求30的方法，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌O157。
32.权利要求22的方法，其中所述寡糖或多糖包含结构α-D-PerNAc-α-L-Fuc-β-D-Glc-α-D-GalNAc。
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