SU652216A1 - Nutritive medium for obtaining microorganism cultures - Google Patents

Description

, 1 . Изобретение относитс  к ветеринар ной и медицинской микробиологии, в частности к получению питательной среды дл  культивировани  анаэробных микроорганизмов при изготовлении био npehapatOB. Известно, что анаэробные Микроортаниз1ИЫ культивируютс  на питательных средах, изготовленных на основе Мартеновского бульона и бульона Хоттингера , ферментативных и кислотных гидролизатах м са-, казеина и печени. Микроорганизмь Clastridium perfringens типа С и D при изготовлении полнёалентной гидрокисьалюминиевой вак цины против бралзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного оте ка овец и дизентерии  гн т, а также при изготовлении квасцовых концентрированных анатоксинов против инфекционной энтеротоксемии овец, культивируютс  на известной м со-ка еинопеченочной питательной среды (МПК), содержащей гидролизаты м са, казеина и печени, вз тые в соотношении 2:2:1 (ч.) {. 1зготовленные квасцовые концентрированные анатоксины на этой питательной среде обуславливают выработку антитоксина в сыворотке крови иммунизированных овец в титре 0,10 ,76 АЕ/мл по типу С И 0,2-1,4 АЕ/мл по типу D. Недостатком известной питательной среды  вл 1етс  слаба  антигенна  активность изготовленных на ней анатоксинов . Кроме того, большинство примен емых питательных сред готовитс  из первосортного обезжиренного м с-. ного фарша и печени, которых необходимо 8-15 кг на 100 л среды. Технологи  изготовлени  их преду,сматрив ет неполный гидролиз в течение0, час Или водные выт жки - отвары компонентов , содержани  которых в различных сери х питательных сред, приготовленных по одной прописи, резко отличаютс  и во многом завис т от качества сырь . Недостатком существующих питательных сред  вл етс  также отсутствие визуального контрол  окончани  процесса вырагдивани  культуры . Это особенно необходимо при высоких температурных режимах инкуезировани  CI, perfringens 40-42 С. Микроскопи  кулйтуры, активирование прототоксина и груба  титраци  на белых мышах требуют времени до 1 час и 5-10 белых Mijuieft на каждое определение . Такой способ определени  срока максимального накоплени  токсина в культуральной жидкости нередко приводит к перерасфанию культуры, разложению токсина и потере иммуногенных свойств, так как оптимальное врем  вырагцивани  при указанном режиме составл ет 4-8 час., one . The invention relates to veterinary and medical microbiology, in particular to the preparation of a nutrient medium for the cultivation of anaerobic microorganisms in the manufacture of bio npehapatOB. It is known that anaerobic MikroortaniizIyI cultivated on nutrient media, made on the basis of open-hearth broth and Hottinger broth, enzymatic and acidic hydrolyzates of saa, casein and liver. The Clastridium perfringens type C and D microorganism in the manufacture of a full-fold hydroxyl alumina permafrost, infectious enterotoxemia, ovarian malignant edema and dysentery, as well as in the manufacture of alum concentrated anatoxins against ovine enterotoxemia, culture, ovine, and in the manufacture of alum concentrated anatoxins against infectious ovine enterotoxaemia, and in the manufacture of aluminous ointment toxins against infectious ovine enterotoxemia, and in the manufacture of alum concentrated anatoxins against ovarian infection of ovine, and in the manufacture of aluminous toxins against infectious ovine enterotoxemia, culture and ovarian tissue. (IPC) containing hydrolyzed meat, meat, casein and liver, taken in a ratio of 2: 2: 1 (h). 1 prepared alum concentrated toxoids on this nutrient medium cause the production of antitoxin in the serum of immunized sheep in titers of 0.10, 76 AU / ml in type C and 0.2-1.4 AU / ml in type D. The disadvantage of the known nutrient medium is 1ts the antigenic activity of toxoids produced on it is weak. In addition, most of the nutrient media used are prepared from top-grade skimmed meat. minced meat and liver, which need 8-15 kg per 100 liters of medium. Manufacturing techniques prevent them from seeing incomplete hydrolysis within 0, an hour. Or, water extracts - decoctions of components, the contents of which in different series of nutrient media prepared according to one recipe, differ sharply and largely depend on the quality of the raw materials. A disadvantage of existing nutrient media is the lack of visual control of the end of the process of cultivation of the culture. This is especially necessary during high temperature regimes of CI incubation, perfringens 40-42 C. Microscopic culture, activation of prototoxin and crude titration on white mice take up to 1 hour and 5-10 white Mijuieft for each determination. Such a method for determining the period of maximum accumulation of the toxin in the culture fluid often leads to re-grafting of the culture, decomposition of the toxin and loss of immunogenic properties, since the optimum time of planting out at the indicated mode is 4-8 hours.

Целью изобретени   вл етс  полу«1ение ;;ешевой стабильной питательной среды, при культивировании на которой возможно посто нно получать культуральные жидкости, обладающие иммуногенными свойствами, а окончание процесса выращивани  культуры контролировать визуально.The aim of the invention is a semi "1; 1; cheap, stable nutrient medium, upon cultivation on which it is possible to continuously obtain culture liquids with immunogenic properties, and to monitor the end of the culture growing process visually.

Дл  достижени  этой цели в среду введены (г/л) дрожжева  вода 190210; пептон (сухой) 3,5-5,5; шиено 8,0-12,0; среда Эндо (суха ) 1,5-2,5; ёдкиГ; натр {до рН среды 8,0-8,3} 1,0-1,5; гидролизаты вываренного м сного фарша и казеина в равных соотношени х по аминному азоту (250 мг%) до 1 л. V-; ::;;- -- - ; .- . / -/ .To achieve this goal, yeast water 190210 was introduced into the medium (g / l); peptone (dry) 3.5-5.5; Shieno 8.0-12.0; Wednesday Endo (dry) 1,5-2,5; Gypsy; natr {until pH 8.0-8.3} 1.0-1.5; hydrolyzed boiled minced meat and casein in equal ratios for amine nitrogen (250 mg%) to 1 liter. V-; :: ;; - - -; .-. / - /.

Гидролиэаты казеина и вываренного м сного файла получает ПОЛНЫМ Ферментативным гидролизом в течение 510 дней. Дополнительно введены рос .Тйвыё вещества из дрбжжёй. Среда Эндо имеет в своём составе гидролкэат китовой или рыбной муки, лактозу, сулЬфиТ натри , агар-агар и индикатор фуксин, т.е. вещества, способст-т вующие хорошему росТу, размножений и индикаций микробов. Значительное содержание белковых и амино-азйТйстых веществ создает буферность И стабильность при культивировании. .Casein and digested meat file hydrolates are FULLED by enzymatic hydrolysis for 510 days. Additionally, growing materials are introduced. Tyvae substances from drbzhzhy. The Endo medium contains whale or fish meal hydrolkeeta, lactose, sodium sulfate, agar-agar and fuchsin indicator, i.e. substances that contribute to good growth, reproduction and indications of microbes. A significant content of protein and amino-azyTysty substances creates buffering and stability during cultivation. .

ВыращййайИё С1. perfrlngens HdЭТОЙ питательной среде позвол ет визуально контролировать процесс инкубировани , стабильно получать анатоксины , обладающие иммуногенными свойствами/в 10-20 раз более высокими по сравнению с данными активности, предусмотренными инструкцией. Сокращаетс  расход белых коошей, снИжаетсй на 30% бебестоимость питательной среды, упрощаетс  технологический процесс изготовлени препарата.Grow up C1. perfrlngens HD THIS nutrient medium allows you to visually monitor the incubation process, to consistently produce toxoids with immunogenic properties / 10-20 times higher than the activity data provided by the instructions. The consumption of white coos reduces, the cost of the nutrient medium decreases by 30%, the manufacturing process of the preparation is simplified.

П р ИМ ер. Дл  приготовлени  предлагаемой питательной среды сначала готов т гидролизаты из казеина и вываренного м сного фарша (продукты отхода после получени  м сной водил). Гидролизаты готов т раздельно ао следующей прописи: на 1 кг сухого ка.зеина (ГОСТ 1211-41) и 3 кг вываренного м сного фарша добавл ют по 100-150 г панкреатина (МРТУ-.42 W5046-65), по 10 мл деминерализованной воды и 100-200 мл хлороформа. Содержимое хорс но перемешивают, плотно закрывают (чтобы не улетучилс  хлороформ) и ведут гидролиз при 3740 С 5-10 сут , периодически перемешива  2-3 раза в сутки в первые три дн  и однократно в последующие. В конце гидролиза на дне образуетс PR RI er. To prepare the proposed nutrient medium, hydrolyzates are first prepared from casein and boiled minced meat (waste products after the meat pillow has been obtained). The hydrolysates are prepared separately for the following prescription: for 1 kg of dry ka.zein (GOST 1211-41) and 3 kg of boiled minced meat, 100-150 g of pancreatin (MPTU-.42 W5046-65) are added, 10 ml of demineralized water and 100-200 ml of chloroform. The contents of the horse are mixed, tightly closed (so that chloroform does not evaporate) and hydrolyze at 3740 C for 5-10 days, stirring occasionally 2-3 times a day for the first three days and once for the next. At the end of the hydrolysis at the bottom is formed

рыхлый сероватый осадок. Аминный азот 360-600 мг%, пептон Г-2% в гидролизате м сного фарша и 4-8% в гидролизате казеина. Отсто вшуюс  надосадочную жидкость декантируют, фильру  через ват11о-марлевый фильтр, определ ют основные биохимически показатели и используют по мере надобности . Гидролизаты пригодны к применению в течение года при хранении в герметически закрытой емкости при 10-15С.loose grayish sediment. Amine nitrogen 360-600 mg%, peptone G-2% in meat hydrolyzate of meat and 4-8% in casein hydrolyzate. The supernatant supernatant was decanted, filtered through a cotton-gauze filter, basic biochemical parameters were determined and used as needed. Hydrolysates are suitable for use during the year when stored in a hermetically sealed container at 10-15 ° C.

Дрожжева  вода готовитс  накануне или в день составлени  питательной среды: 20 г сухих пекарских дрожжей заливают 1 л воды, кип т т 20 мин, отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый, бумажный фильтр или фильтрующие пластины Ф.Yeast water is prepared on the eve or on the day of preparation of the nutrient medium: 20 g of dry baker's yeast is poured over 1 liter of water, boiled for 20 minutes, settled and filtered through a cotton-gauze, paper filter or filter plates F.

Составление среды. Берут по 2 ч. гидролизатов казеина и вываренного. м сного фарша с аминным азотом 56 мг% и добавл ют 1ч. дрожжевой воды. Устанавливают ЬН 8,2-8,35 (1030%-ным раствором щёлочи), определ ют аминный азот, который должен составл ть 210-230 мг% и пептон (1,5 ,5%). Дбвод т до кипейи  и разливают по емкост м, добавл   в зависимости от объёма 0,5% сухого ферментативного пептона, rpQT 13805-68 (если сфдержан ие его менее 3,5 %), 0,2 % сух(Эй среды Эндо и 0,8-1% пшена (проikfcJTofо j можно и мешочках) . Приготовленна  среда стерилизируетс  автоклавированиём при 115-120 С 35-45 мин.Drafting environment. Take 2 parts of casein and boiled hydrolysates. minced meat with amine nitrogen 56 mg% and add 1 h. yeast water. An LH of 8.2-8.35 (1030% alkali solution) is established, the amine nitrogen is determined, which should be 210-230 mg% and peptone (1.5, 5%). Dbvod to boil and poured into containers, depending on the volume of 0.5% dry enzymatic peptone, rpQT 13805-68 (if it is less than 3.5%), 0.2% dry (Hey, Endo and 0 , 8-1% of millet (about ikfcJTof j can also be sacks). The prepared medium is sterilized by autoclaving at 115-120 C for 35-45 minutes.

После стерилизации среда приобретает Малиново-красный цвет и имеет следующие показатели:After sterilization, the medium acquires a crimson-red color and has the following characteristics:

мг% mg%

420-570 , 210-230420-570, 210-230

300-406 0,9-1,5 1,5-3,5.300-406 0.9-1.5 1.5-3.5.

60-80 г% 8,15-8,3560-80 g% 8.15-8.35

Готовую среду охлаждают до 3740с и засевают матрицевой куль турой . Культивирование провод т при 37-42°С до начала обесцвечивани  среды (переход малиново-красного цвета в.желтый). Рост приостанавливают охлаждением и доведением рН.The prepared medium is cooled to 3740 s and sown with a matrix culture. Cultivation was carried out at 37-42 ° C until the medium began to discolor (a crimson-red to yellow transition). Growth is suspended by cooling and adjusting the pH.

Индикатор среды , в процессе метаболизма микроорганизма способствует хорсйнему росту и делению клеток , увеличива  концентрацию бактериальной массы в 2-2,5 раза по сравнению с бактериальной массой, полученной на известных питательных средах , при этом усиливаютс  и иммуногенные свойства изготовленных на ней антигенов.The indicator of the medium, in the process of metabolism of the microorganism, contributes to the growth and division of cells, increasing the concentration of the bacterial mass by 2-2.5 times in comparison with the bacterial mass obtained on known nutrient media, and the immunogenic properties of the antigens manufactured on it are also enhanced.

Токсичность культуральной жидкости проверенна  на белых мшиах при внутpивeннo l введении, в среднем составл ет 4000 DLM/мл.The toxicity of the culture fluid tested on white mice with intravenous l administration is, on average, 4000 DLM / ml.

Активность анатоксина определ ли по накоплению титра эпсилон антитоксина (АЕ/мл) в сыворотке крови вакцинированных овец и кроликов. Овец вакцинируют дважды с интервалом 20 дней в дозе по 5,0 мл, при этом после первой вакцинации образование антитоксина в сыворотке крови наблюдалось в титре 0,5-2,0 АЕ/мл, после повторной вакцинации 3,3-8,0 и более АЕ/мл.Toxoid activity was determined by the accumulation of a titer of epsilon antitoxin (AE / ml) in the serum of vaccinated sheep and rabbits. Sheep are vaccinated twice at an interval of 20 days at a dose of 5.0 ml, while after the first vaccination, the formation of antitoxin in serum was observed in a titer of 0.5-2.0 AU / ml, after re-vaccination 3.3-8.0 and more than AE / ml.

У КРОЛИКОВ, вакцинированных в дозе 2,О и 3,0 мл с интервалом в 14 дней, средний титр антитоксина в сыворотке крови после повторной вакцинации составл ет в среднем 2,1 АЕ/мл Контролем служат анатоксины, изготовленные на изве.стных питательных средах панкреатического перевара м са (ППМ), изготовлено 5 серий анатоксина типа Р в количестве 39 л, на Питательной среде МПК (м со-печеночноказеинова ) изготовлено 4 серии в количестве 26,5 л.In RABBITS vaccinated at a dose of 2, O and 3.0 ml with an interval of 14 days, the average serum antitoxin titer after re-vaccination is an average of 2.1 AU / ml As control, toxoids made on well-known nutrient media are used. pancreatic meat preparations (PPM); 5 series of anatoxin type P in the amount of 39 liters were manufactured; 4 series in the amount of 26.5 liters were prepared on the nutrient medium IPC (M-hepatocellular casein).

Изготовленные анатоксины.на этих питательных средах обусловили выработку эпсилон антитоксина в сыворотк крови вакцинированных овец поеде двукратйой вакцинации в дозе по 5,0 мл соответственно в среднем в 0,4 и 1,5 АЁ/мл; у кроликов 0,2 и 1,7 АЕ/мл.Manufactured toxoids. On these nutrient media led to the production of epsilon antitoxin in the serum of vaccinated sheep by eating double vaccination at a dose of 5.0 ml, respectively, on average, 0.4 and 1.5 AU / ml; in rabbits, 0.2 and 1.7 AU / ml.

Преимущество питaтieльнoй среды в сравнении с питательной средой, nt Hготовленной на основе перевара Хоттин г ера, примен емой в нэсто щее врем  биопромышленйОстыо дл  выращивани  С1. perfringens типа С и D при изготовлении поливалентной гидрокисьалюмнниевой вакцины против брадзота, злокачественного отека; инфекционной энтеротоксемии овец и дизентерии  гн т, бьшо проверено при изготовлении квасцовых кЪнцентри-The advantage of the nutrient medium in comparison with the nutrient medium, nt Prepared on the basis of Hottin grager, currently used in the bioindustrial industry, is used for growing C1. perfringens type C and D in the manufacture of polyvalent hydroxyaluminum vaccine against bradzot, malignant edema; Infectious enterotoxemia in sheep and dysentery is adverse, tested in the manufacture of alumina

рованных анатоксинов против инфекционной энтеротоксемии овец, промышленным реакторным методом.toxoids against infectious enterotoxemia of sheep, industrial reactor method.

Предлагаема  питательна  среда дл  культивировани  CI perfringens типа С и D стабильна в изготовлении по биохимическим показател м по сравнению с известншии питательными средами , повышает активность изготовленных на ней препаратов, позвол ет визуально контролировать процесс культивировани  (по изменению цвета среды), упрощает технологию изготовлени  антигенов.The proposed nutrient medium for cultivating CI perfringens of type C and D is stable in production according to biochemical parameters as compared with the known nutrient media, increases the activity of the preparations made on it, allows visual control of the cultivation process (by changing the color of the medium), and simplifies the technology of manufacturing antigens.

Claims (1)

1. Ургуев К.Р. Ветеринари , , 1974, с. 4б-47.1. Urguev K.R. Veterinary medicine, 1974, p. 4b-47.