SU652216A1 - Питательна среда дл культивировани микроорганизмов - Google Patents

Description

, 1 . Изобретение относитс  к ветеринар ной и медицинской микробиологии, в частности к получению питательной среды дл  культивировани  анаэробных микроорганизмов при изготовлении био npehapatOB. Известно, что анаэробные Микроортаниз1ИЫ культивируютс  на питательных средах, изготовленных на основе Мартеновского бульона и бульона Хоттингера , ферментативных и кислотных гидролизатах м са-, казеина и печени. Микроорганизмь Clastridium perfringens типа С и D при изготовлении полнёалентной гидрокисьалюминиевой вак цины против бралзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного оте ка овец и дизентерии  гн т, а также при изготовлении квасцовых концентрированных анатоксинов против инфекционной энтеротоксемии овец, культивируютс  на известной м со-ка еинопеченочной питательной среды (МПК), содержащей гидролизаты м са, казеина и печени, вз тые в соотношении 2:2:1 (ч.) {. 1зготовленные квасцовые концентрированные анатоксины на этой питательной среде обуславливают выработку антитоксина в сыворотке крови иммунизированных овец в титре 0,10 ,76 АЕ/мл по типу С И 0,2-1,4 АЕ/мл по типу D. Недостатком известной питательной среды  вл 1етс  слаба  антигенна  активность изготовленных на ней анатоксинов . Кроме того, большинство примен емых питательных сред готовитс  из первосортного обезжиренного м с-. ного фарша и печени, которых необходимо 8-15 кг на 100 л среды. Технологи  изготовлени  их преду,сматрив ет неполный гидролиз в течение0, час Или водные выт жки - отвары компонентов , содержани  которых в различных сери х питательных сред, приготовленных по одной прописи, резко отличаютс  и во многом завис т от качества сырь . Недостатком существующих питательных сред  вл етс  также отсутствие визуального контрол  окончани  процесса вырагдивани  культуры . Это особенно необходимо при высоких температурных режимах инкуезировани  CI, perfringens 40-42 С. Микроскопи  кулйтуры, активирование прототоксина и груба  титраци  на белых мышах требуют времени до 1 час и 5-10 белых Mijuieft на каждое определение . Такой способ определени  срока максимального накоплени  токсина в культуральной жидкости нередко приводит к перерасфанию культуры, разложению токсина и потере иммуногенных свойств, так как оптимальное врем  вырагцивани  при указанном режиме составл ет 4-8 час.

Целью изобретени   вл етс  полу«1ение ;;ешевой стабильной питательной среды, при культивировании на которой возможно посто нно получать культуральные жидкости, обладающие иммуногенными свойствами, а окончание процесса выращивани  культуры контролировать визуально.

Дл  достижени  этой цели в среду введены (г/л) дрожжева  вода 190210; пептон (сухой) 3,5-5,5; шиено 8,0-12,0; среда Эндо (суха ) 1,5-2,5; ёдкиГ; натр {до рН среды 8,0-8,3} 1,0-1,5; гидролизаты вываренного м сного фарша и казеина в равных соотношени х по аминному азоту (250 мг%) до 1 л. V-; ::;;- -- - ; .- . / -/ .

Гидролиэаты казеина и вываренного м сного файла получает ПОЛНЫМ Ферментативным гидролизом в течение 510 дней. Дополнительно введены рос .Тйвыё вещества из дрбжжёй. Среда Эндо имеет в своём составе гидролкэат китовой или рыбной муки, лактозу, сулЬфиТ натри , агар-агар и индикатор фуксин, т.е. вещества, способст-т вующие хорошему росТу, размножений и индикаций микробов. Значительное содержание белковых и амино-азйТйстых веществ создает буферность И стабильность при культивировании. .

ВыращййайИё С1. perfrlngens HdЭТОЙ питательной среде позвол ет визуально контролировать процесс инкубировани , стабильно получать анатоксины , обладающие иммуногенными свойствами/в 10-20 раз более высокими по сравнению с данными активности, предусмотренными инструкцией. Сокращаетс  расход белых коошей, снИжаетсй на 30% бебестоимость питательной среды, упрощаетс  технологический процесс изготовлени препарата.

П р ИМ ер. Дл  приготовлени  предлагаемой питательной среды сначала готов т гидролизаты из казеина и вываренного м сного фарша (продукты отхода после получени  м сной водил). Гидролизаты готов т раздельно ао следующей прописи: на 1 кг сухого ка.зеина (ГОСТ 1211-41) и 3 кг вываренного м сного фарша добавл ют по 100-150 г панкреатина (МРТУ-.42 W5046-65), по 10 мл деминерализованной воды и 100-200 мл хлороформа. Содержимое хорс но перемешивают, плотно закрывают (чтобы не улетучилс  хлороформ) и ведут гидролиз при 3740 С 5-10 сут , периодически перемешива  2-3 раза в сутки в первые три дн  и однократно в последующие. В конце гидролиза на дне образуетс 

рыхлый сероватый осадок. Аминный азот 360-600 мг%, пептон Г-2% в гидролизате м сного фарша и 4-8% в гидролизате казеина. Отсто вшуюс  надосадочную жидкость декантируют, фильру  через ват11о-марлевый фильтр, определ ют основные биохимически показатели и используют по мере надобности . Гидролизаты пригодны к применению в течение года при хранении в герметически закрытой емкости при 10-15С.

Дрожжева  вода готовитс  накануне или в день составлени  питательной среды: 20 г сухих пекарских дрожжей заливают 1 л воды, кип т т 20 мин, отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый, бумажный фильтр или фильтрующие пластины Ф.

Составление среды. Берут по 2 ч. гидролизатов казеина и вываренного. м сного фарша с аминным азотом 56 мг% и добавл ют 1ч. дрожжевой воды. Устанавливают ЬН 8,2-8,35 (1030%-ным раствором щёлочи), определ ют аминный азот, который должен составл ть 210-230 мг% и пептон (1,5 ,5%). Дбвод т до кипейи  и разливают по емкост м, добавл   в зависимости от объёма 0,5% сухого ферментативного пептона, rpQT 13805-68 (если сфдержан ие его менее 3,5 %), 0,2 % сух(Эй среды Эндо и 0,8-1% пшена (проikfcJTofо j можно и мешочках) . Приготовленна  среда стерилизируетс  автоклавированиём при 115-120 С 35-45 мин.

После стерилизации среда приобретает Малиново-красный цвет и имеет следующие показатели:

мг%

420-570 , 210-230

300-406 0,9-1,5 1,5-3,5.

60-80 г% 8,15-8,35

Готовую среду охлаждают до 3740с и засевают матрицевой куль турой . Культивирование провод т при 37-42°С до начала обесцвечивани  среды (переход малиново-красного цвета в.желтый). Рост приостанавливают охлаждением и доведением рН.

Индикатор среды , в процессе метаболизма микроорганизма способствует хорсйнему росту и делению клеток , увеличива  концентрацию бактериальной массы в 2-2,5 раза по сравнению с бактериальной массой, полученной на известных питательных средах , при этом усиливаютс  и иммуногенные свойства изготовленных на ней антигенов.

Токсичность культуральной жидкости проверенна  на белых мшиах при внутpивeннo l введении, в среднем составл ет 4000 DLM/мл.

Активность анатоксина определ ли по накоплению титра эпсилон антитоксина (АЕ/мл) в сыворотке крови вакцинированных овец и кроликов. Овец вакцинируют дважды с интервалом 20 дней в дозе по 5,0 мл, при этом после первой вакцинации образование антитоксина в сыворотке крови наблюдалось в титре 0,5-2,0 АЕ/мл, после повторной вакцинации 3,3-8,0 и более АЕ/мл.

У КРОЛИКОВ, вакцинированных в дозе 2,О и 3,0 мл с интервалом в 14 дней, средний титр антитоксина в сыворотке крови после повторной вакцинации составл ет в среднем 2,1 АЕ/мл Контролем служат анатоксины, изготовленные на изве.стных питательных средах панкреатического перевара м са (ППМ), изготовлено 5 серий анатоксина типа Р в количестве 39 л, на Питательной среде МПК (м со-печеночноказеинова ) изготовлено 4 серии в количестве 26,5 л.

Изготовленные анатоксины.на этих питательных средах обусловили выработку эпсилон антитоксина в сыворотк крови вакцинированных овец поеде двукратйой вакцинации в дозе по 5,0 мл соответственно в среднем в 0,4 и 1,5 АЁ/мл; у кроликов 0,2 и 1,7 АЕ/мл.

Преимущество питaтieльнoй среды в сравнении с питательной средой, nt Hготовленной на основе перевара Хоттин г ера, примен емой в нэсто щее врем  биопромышленйОстыо дл  выращивани  С1. perfringens типа С и D при изготовлении поливалентной гидрокисьалюмнниевой вакцины против брадзота, злокачественного отека; инфекционной энтеротоксемии овец и дизентерии  гн т, бьшо проверено при изготовлении квасцовых кЪнцентри-

рованных анатоксинов против инфекционной энтеротоксемии овец, промышленным реакторным методом.

Предлагаема  питательна  среда дл  культивировани  CI perfringens типа С и D стабильна в изготовлении по биохимическим показател м по сравнению с известншии питательными средами , повышает активность изготовленных на ней препаратов, позвол ет визуально контролировать процесс культивировани  (по изменению цвета среды), упрощает технологию изготовлени  антигенов.

Claims (1)

1. Ургуев К.Р. Ветеринари , , 1974, с. 4б-47.