RU2301256C1 - Liquid nutrient medium for culturing cholera vibrio - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, microbiology.

SUBSTANCE: invention proposes a nutrient medium containing soybean enzymatic hydrolyzate with the content of amine nitrogen 0.08%, sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium sulfite and distilled water. Invention provides preparing qualitative and inexpensive nutrient medium for culturing cholera vibrio. Invention can be used in preparing nutrient media used for isolation and culturing cholera vibrio.

EFFECT: improved and valuable properties of nutrient medium.

3 ex

Description

Изобретение относится к микробиологии, именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для выделения и культивирования холерного вибриона.The invention relates to microbiology, namely to obtain nutrient media that create optimal conditions for the isolation and cultivation of cholera vibrio.

При бактериологическом исследовании на холеру используют различные питательные среды: жидкие среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические среды и набор сред для идентификации (Лабинская А.С., 1978; Методически указания, МУ 44.22.11097-02). Основой известных питательных сред являются продукты животного происхождения - пептон, мясная вода, экстракт молодого мяса др.In bacteriological research on cholera, various nutrient media are used: liquid enrichment media, elective, differential diagnostic media and a set of media for identification (Labinskaya A.S., 1978; Methodological guidelines, MU 44.22.11097-02). The basis of known nutrient media are products of animal origin - peptone, meat water, extract of young meat, etc.

Недостатком данной среды является ее дороговизна.The disadvantage of this environment is its high cost.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда для культивирования холерного вибриона, содержащая, г/л: панкреатический гидролизат казеина 4,0; панкреатический гидролизат кормовых дрожжей 4,0; в качестве питательной основы - натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,4; натрий пиросернистокислый (мета-бисульфит) 0,5; и дистиллированную воду до литра. (Справочник по микробиологическим питательным средам. Под ред. Меджидова М.М. Махачкала, 1989. с.66.).Closest to the proposed nutrient medium is a medium for the cultivation of cholera vibrio, containing, g / l: pancreatic hydrolyzate of casein 4.0; pancreatic hydrolyzate of feed yeast 4.0; as a nutrient base - sodium chloride 5.0; disubstituted sodium phosphate 0.4; sodium pyrosulphate (meta-bisulfite) 0.5; and distilled water to a liter. (Handbook of microbiological culture media. Edited by M. Medzhidov, M. Makhachkala, 1989. p.66.).

Недостатком данной среды является ее высокая себестоимость, сложность приготовления.The disadvantage of this environment is its high cost, the complexity of the preparation.

Целью изобретения является получение качественной, дешевой питательной среды для культивирования холерного вибриона.The aim of the invention is to obtain high-quality, cheap nutrient medium for the cultivation of cholera vibrio.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда содержит питательную основу - ферментативный гидролизат соевых бобов и стимулирующую добавку - натрий сернистокислый.The essence of the invention lies in the fact that the nutrient medium contains a nutrient base - an enzymatic hydrolyzate of soybeans and a stimulating additive - sodium sulfite.

В качестве исходного сырья используют сою, плоды которой - бобы содержат в среднем 40% белка, кроме того, соя богата микроэлементами и витаминами. Как известно (Y.P.Yupta, 1987), соевые белки характеризуются повышенным содержанием глутаминовой и аспарагиновой кислот, поставляющих макроэргические связи. Соевые белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот, как лизин, лейцин, аргинин. Имеются также сведения о способности лейцина как аминокислоты с разветвленной белковой цепью инициировать синтез белка (Е.И.Чазов, X.С.Морган, /США/ 1989).Soy is used as a raw material, the fruits of which - beans contain an average of 40% protein, in addition, soy is rich in trace elements and vitamins. As is known (Y.P. Yupta, 1987), soy proteins are characterized by an increased content of glutamic and aspartic acids, which supply macroergic bonds. Soy proteins also contain a large number of essential amino acids such as lysine, leucine, arginine. There is also information about the ability of leucine as a branched chain amino acid to initiate protein synthesis (E.I. Chazov, H.S. Morgan, / USA / 1989).

Приготовление питательной основы для выращивания микроорганизмов заключается в следующем. Плоды сои-бобов в количестве 0,5 кг, пятикратно вымачивают в 5 л горячей воды в течение 1 суток, причем последний настой с бобами кипятят в течение 40 мин. Затем настой сливают в 10 л баллон, охлаждают, бобы измельчают мясорубкой и помещают в настой. Добавляют поджелудочную железу КРС из расчета 20,0 на 1 л, устанавливают рН до 8,2 20% раствором натрия гидроокиси в количестве 3 мл, добавляют 1% хлорофома. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 37°С в течение 3 сут. Первые 2 ч смесь перемешивают через каждые 15 мин, по 5 мин в последующем смесь перемешивают через каждые 6 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота, который на 3 сутки составил 0,6±0,05%.The preparation of a nutrient base for growing microorganisms is as follows. Fruits of soybeans in an amount of 0.5 kg are soaked five times in 5 l of hot water for 1 day, and the last infusion with beans is boiled for 40 minutes. Then the infusion is poured into a 10 liter cylinder, cooled, the beans are minced with a meat grinder and placed in the infusion. The cattle pancreas is added at the rate of 20.0 per 1 liter, the pH is adjusted to 8.2 with a 20% sodium hydroxide solution in an amount of 3 ml, and 1% chlorophoma is added. Hydrolysis is carried out in a heat chamber at a temperature of 37 ° C for 3 days. For the first 2 hours, the mixture is stirred every 15 minutes, for 5 minutes; thereafter, the mixture is stirred every 6 hours. The level of amine nitrogen is measured daily, which was 0.6 ± 0.05% on day 3.

Питательную среду на основе соевого ферментативного гидролизата для выращивания микроорганизмов готовят следующим способом. Ферментативный гидролизат из соевых бобов, разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,08% 110 мл, натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 4,0; дистиллированная вода - до 1 литра.A nutrient medium based on soy enzymatic hydrolyzate for growing microorganisms is prepared in the following way. An enzymatic hydrolyzate from soybeans, diluted with distilled water to an amine nitrogen reading of 0.08% 110 ml, sodium chloride 5.0; disubstituted sodium phosphate 4.0; distilled water - up to 1 liter.

Среду кипятят до полного растворения ингредиентов, фильтруют через полотно и фильтровальную бумагу, затем устанавливают рН 7,8±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, добавляют стимулятор: натрий сернокислый в концентрации 0-4 г/л. Готовую среду разливают в градуированные флаконы по 100 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 30 мин. Согласно методических указаний по определению качества питательных сред для выращивания холерного вибриона (Инструкция по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для холерного вибриона) готовят культуру авирулентного штамма НАГ - вибрион Р-9741. Для чего культуру, хранящуюся на полужидком агаре, высевают в 1% пептонную воду или бульон Мартена (рН 7,6-7,8). Через 18-20 ч роста с агара отбирают гладкие колонии НАГ вибриона Р-9741, пересевают их на агаровые пластинки (2-пассаж). Культуру выращивают 3-6 ч при 37°С, после чего используют для контроля. Из суточной культуры готовили взвесь 4 м.т., равной 5 ед. по оптическому стандарту мутности по ГИСК им.Л.А.Тарасевича. Затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 и 100 м.к. Из данных разведении взвеси культур высевали по 0-1 мл стерильной бактериологической пипеткой по 3 флакона опытной и контрольной среды. В качестве последней используется заранее проверенная высококачественная 1% пептонная вода, приготовленная на дистиллированной воде. Посевы инкубируют при 37°С 6 ч, после чего из каждого флакона с поверхности высевают петлей №5 по Чаплевскому на чашку Петри с заранее поверенной высококачественной плотной средой. Выращивание производят при 37°С. Питательная среда жидкая считается пригодной в том случае, если при посеве 100 м.к. тест-штамма в 100 мл через 6 ч выращивания и последующего высева на агаровые пластинки вырастают соответственно не менее 10 и 1 колонии. Оценку ростовых свойств питательной среды поводят путем подсчета количества выросших колоний холерного вибриона при посеве содержимого флаконов на пластинки с плотной питательной средой.The medium is boiled until the ingredients are completely dissolved, filtered through a cloth and filter paper, then the pH is adjusted to 7.8 ± 0.1 using a 20% sodium hydroxide solution, and a stimulant is added: sodium sulfate at a concentration of 0-4 g / l. The finished medium is poured into graduated 100 ml vials and sterilized in an autoclave at 0.5 atm for 30 minutes. According to the guidelines for determining the quality of nutrient media for growing cholera vibrio (Instructions for bacteriological control of diagnostic nutrient media for cholera vibrio), a culture of avirulent strain NAG - vibrio R-9741 is prepared. Why culture stored on semi-liquid agar, seeded in 1% peptone water or Marten broth (pH 7.6-7.8). After 18-20 hours of growth, smooth colonies of the NAG vibrio R-9741 were selected from the agar, and they were transferred to agar plates (2-passage). The culture is grown for 3-6 hours at 37 ° C, after which it is used for control. A 4 bw suspension equal to 5 units was prepared from the daily culture. according to the optical turbidity standard according to the GISK named after L.A. Tarasevich. Then, serial ten-fold dilutions in physiological saline in a volume of 4.5 ml were adjusted to a content of 1 ml of 1000 and 100 MK From the dilution data, suspension of cultures was sown in 0-1 ml sterile bacteriological pipette in 3 bottles of experimental and control medium. As the latter, a pre-tested high-quality 1% peptone water prepared using distilled water is used. Crops are incubated at 37 ° C for 6 hours, after which from each bottle the Chaplevsky loop No. 5 is sown from the surface onto a Petri dish with a pre-calibrated high-quality solid medium. Cultivation is carried out at 37 ° C. A nutrient medium liquid is considered suitable if, when sowing 100 m.k. 100 ml of the test strain after 6 hours of cultivation and subsequent plating on agar plates grow at least 10 and 1 colonies, respectively. Assessment of the growth properties of the nutrient medium is carried out by counting the number of grown colonies of cholera vibrio when sowing the contents of the vials on plates with a dense nutrient medium.

Пример 1. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат сои (бобы) 60,0; натрий хлористый 4,0; кислый фосфорнокислый натрий двузамещенный 3,0; натрий сернистокислый 0,3; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для холерного вибриона высеянных из флаконов при посевной дозе 100 и 10 м.к., составило соответственно 10 и 1 колонии.Example 1. The test strain was grown on a nutrient medium containing, g / l: soy enzymatic hydrolyzate (beans) 60.0; sodium chloride 4.0; disubstituted acid phosphate sodium 3.0; sodium sulfite 0.3; distilled water up to 1 liter. With this ratio of ingredients, the number of colonies grown on dense agar plates for cholera vibrio seeded from vials at a sowing dose of 100 and 10 mk was 10 and 1 colonies, respectively.

Пример 2. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат сои (бобы) - 110,0; натрий хлористый 5,0; кислый фосфорнокислый натрий двузамещенный 4,0; натрий сернистокислый 0,4; дистиллированная вода - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для холерного вибриона высеянных из флаконов при посевной дозе 100 и 10 м.к., составило соответственно 39 и 8 колонии.Example 2. The test strain was grown on a nutrient medium containing, g / l: enzymatic soy hydrolyzate (beans) - 110.0; sodium chloride 5.0; disubstituted acid phosphate sodium 4.0; sodium sulfide 0.4; distilled water - up to 1 liter. With this ratio of ingredients, the number of colonies grown on dense agar plates for cholera vibrio seeded from vials at a sowing dose of 100 and 10 m.k., amounted to 39 and 8 colonies, respectively.

Пример 3. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л; ферментативный гидролизат сои (бобы) 160,0; натрий хлористый 6,0; кислый фосфорнокислый натрий двузамещенный 5-0; натрий сернистокислый 0,5; дистиллированная вода - до 1 л. При таком соотношение ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинах агара, для холерного вибриона высеянных из флаконов при посевной дозе 100 и 10 м.к., составило соответственно 13 и 1 колоний.Example 3. The test strain was grown on a nutrient medium containing, g / l; soybean enzymatic hydrolyzate (beans) 160.0; sodium chloride 6.0; sodium phosphate disubstituted 5-0; sodium sulfite 0.5; distilled water - up to 1 liter. With this ratio of ingredients, the number of colonies grown on dense agar plates for cholera vibrio seeded from vials at a sowing dose of 100 and 10 m.k. was 13 and 1 colonies, respectively.

Таким образом, заявленная питательная среда жидкая для культивирования холерного вибриона, пример 2, приготовленная на основе ферментативного гидролизата сои (бобы), может применяться для культивирования холерного вибриона как экономически выгодная.Thus, the claimed nutrient medium liquid for the cultivation of cholera vibrio, example 2, prepared on the basis of an enzymatic hydrolyzate of soybeans (beans), can be used for the cultivation of cholera vibrio as cost-effective.

Claims (1)

Питательная среда жидкая для культивирования холерного вибриона, содержащая питательную основу, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит в качестве стимулирующей добавки натрий сернистокислый, а в качестве питательной основы - ферментативный гидролизат бобов сои с содержанием аминного азота 0,08% при следующем соотношении компонентов, г/л:Liquid nutrient medium for the cultivation of cholera vibrio, containing a nutrient base, sodium chloride, sodium phosphate disubstituted and distilled water, characterized in that it additionally contains sodium sulfite as a stimulating additive, and an enzymatic hydrolyzate of soybeans with an amine nitrogen content as a nutrient base 0.08% in the following ratio of components, g / l: ферментативный гидролизатenzymatic hydrolyzate   бобов сои с содержаниемsoybeans with content   аминного азота 0,08%amine nitrogen 0.08% 60,0-160,060.0-160.0 натрий хлористыйsodium chloride 4,0-6,04.0-6.0 натрий фосфорнокислыйsodium phosphate   двузамещенныйdisubstituted 3,0-5,03.0-5.0 натрий сернистокислыйsodium sulfite 0,3-0,50.3-0.5 дистиллированная водаdistilled water остальноеrest