WO2007064037A1

WO2007064037A1 - サトイモ科植物の形質転換方法

Info

Publication number: WO2007064037A1
Application number: PCT/JP2006/324402
Authority: WO
Inventors: Naoyuki Umemoto; Kanji Mamiya
Original assignee: Kirin Holdings Kabushiki Kaisha
Priority date: 2005-12-01
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2007-06-07
Also published as: US20090288231A1; EP1955589A1; EP1955589A4; JPWO2007064037A1

Abstract

　本発明は、サトイモ科植物のエンブリオジェニック・カルスにアグロバクテリウム、またはアグロバクテリウムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、を感染させて外来遺伝子を導入し、これによって形質転換エンブリオジェニック・カルスを作製することを含む、サトイモ科植物の形質転換方法を提供する。

Description

サトイモ科植物の形質転換方法技術分野

本発明は、サトイモ科植物への遺伝子導入方法及び形質転換方法に関する。背景技術

明

サトイモ科（Araceae).植物として、食用とされるサトイモゃ熱帯性のタロイモ (Colocas ia) , コンニヤクイモなど食糧として重要な作物、スパティフィラム、書

アンスリゥム、力ラジウム、ァグラオネマ、アローカシア、ディエフェンバキァ、モンステラ、フイロデンドロン、ポトス、シンゴニュームなど観葉植物としても重要性および人気の高い植物、カラスビシャク、セキショウなどの薬用植物、などが知られている。

そのなかでもパティフィラム属（Spath i phyl l um) は、熱带アメリカに 3.0種ほど、南東マレーシァに 2種が分布しており、そのうち約 10種が観葉植物として鉢栽培され、熱帯 ·亜熱帯ではグランドカバーとしても用いられており、観葉植物の中で最も人気のある植物である。耐陰性もあり室内で開花することから室内での観賞による 'いやし'の他に、室内の環境を整える植物としての期待も高い。近年、植物バイオテクノロジーが進展する中で、組織培養、葯培養、細胞培養、細胞融合、変異処理などの技術を利用して多様な特性を有する品種が育成されてきた。更に遺伝子組換え D N A技術の発達により通常交配不可能な他の生物種の遺伝子を導入することにより、従来期待し得なかった特性を有する品種が育成されている。このような遺伝子組換え植物の栽培はアメリカ、カナダ、アルゼンチン、中国で耕地面積を拡大し広く利用されている。遺伝子組換えを利用した品種を育種するためには、求められる機能を持つ遺伝子を単離し対象植物に適合した遺伝子導入することが必要である。植物への外来遺伝子導入方法としては、ァグロバクテリウムによる方法、エレクト口ポレーシヨン法、パーティクルガン法、

P E G法、ウイスカ一法等が知られている。植物細胞中に外来遺伝子を導入するためのベクタ一や、形質転換細胞を選択し識別する各種のレポーターやマーカー遺伝子、導入した外来遺伝子を発現させる制御遺伝子（プロモーター等）等も試行錯誤を繰返しながらも開発が進められてきた。しかし上記のような方法や手段を用いても、スパティフィラムを含むサトイモ科植物は一般に形質転換が困難とされており、わずかな種類の植物でしか成功例が知られていない。

例えば、特許文献 1で報告されているものは、薬用植物サトイモ科カラスビシャクのカルス由来のプロトコ一ム様多芽体からの個体再生系とパーティクルガンによる遺伝子導入を組み合わせた系を報告している。得られた個体数 ·効率などの記述はなく、難易度が非常に高く、熟練した一部の研究者にのみ実施が可能であつたと思われる。また、当文献にはサトイモ科を含む単子葉植物でのァグロバクテリゥムによる植物形質転換は、ァグロパクテリゥムの感染を受けないため困難と断じている。

サトイモ科タロイモ（非特許文献 1 ) も同様にタロイモを含む単子葉植物でのァグロパクテリゥムによる植物形質転換は、ァグロバクテリウムの感染を受けないため困難と断じている。彼らは品種ェグイモの塊茎由来のカルス（非特許文献

2 )に対しパーティクルガンを使うことで形質転換体を得たことを報告している。しかし、非特許文献 1の中でも述べているようにカルス 2 gを使った実験を 96 回行い 2つの形質転換体を得たという極めて効率の低いものであった。 .

サトイモ科植物の中ではアンスリゥムの形質転換体がハワイ大学のグループから報告されてレ,、る。彼らの確立した形質転換の方法は非特許文献 3に、具体的な実施データは非特許文献 4と非特許文献 5に記載されている。彼らの最も良いとする材料は軟白化した節間で、ァグロパクテリゥムを感染させ 1〜2ヶ月でカルスを誘導する。 1ヶ月で弱光で薄く緑化、 9ヶ月で緑化したシユートを誘導し、 1〜2 ヶ月で発根し小植物体を得る。さらに開花まで 2年を要すると記述されている。根を材料としたものについては遺伝子導入効率が 1. 3%であると記載されているが、軟白化した節間を材料とした場合の遺伝子導入効率は不明で、数百の薬剤耐性の植物体を得た記述（非特許文献 4 ) があるが、 PCR などで実際遺伝子が導入されていることを確認しているのは 6系統、 mRNAの発現を確認しているのは 2系統、蛋白の発現を確認しているのは 1系統だけである。非特許文献 5では 13系統の取得を報告している。通算 21ヶ月かかったことが記述されており形質転換体を得るためには長期の培養が必要である。またキメラ率も 26〜62%と高率であり、さらに他の選抜方法が必要であるとしている（非特許文献 3)。

以上から、サトイモ科植物の効率的な形質転換を実現するためには、培養材料へのより効率的な形質転換および当該形質転換し易い培養材料の選択と作出が求められる。

'スパティフィラムでは形質転換を目的として花糸から不定胚を得ている（非特許文献 6)。し力し、その手法においては、ェンブリオジェニック ·カルスを誘導して増殖するものではな,く、花糸から直接不定胚を誘導する方法であり 1つの外植片からの増殖率は極限られる（増殖率の記載はない）。また、不定胚が花糸と分離せず誘導され、その後の植物体再生には好ましい条件ではないと指摘されている。加えて、花糸を外植片として用いる場合には、その部位を採取する時期が開花期に限られ、増殖を目的とした場合には初期の材料の数も限られているという点において適切ではない。実際、彼らは、その後、その材料を含めて形質転換に成功したことは報告していない。

本発明者らは、母株として維持しているスパティフィラム培養苗の種々め組織を用いェンプリオジェニック 'カルスの誘導に適した部位を検討したところ、葉鞘、特にその基部またはその基部に近い部分が最も高いカルス誘導率を示し、それらカルスの中にェンブリオジェニック · カルスが高い頻度で存在することを見出した。さら葉鞘から不定胚誘導効率の極めて高いカルス（すなわち、ェンブリオジェニック · カルス）を培養材料として用いることでァグロパクテリゥム、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、を介した飛躍的に効率のよい遺伝子組換え方法を開発することに成功した。.

特許文献 1 日本国特開平 10-75673号公報

非特許文献 1 Fukino, N, Hanada, Κ· , Ajisaka, Η. , Sakai, J.， Hirochika, II. , Hirai, Μ. , Hagio, Τ. , Enomoto, S. (2000) jpn Agri. Res. Quarterly, 34 ( 3 ), 159-165

非特許文献 2 Karube, M.， Shimonishi, K. , Kukimura, Η. (1992) Jpn. j. Breed. , 42 (1)， 58-59 非特許文献 3 Kuehnlc, A. R. , Chen F. - C.， Sugii N. C. (2001) Biotechnology in Agriculture and Forestry, 48, 3 - 15

非特許文献 4 Chen F. -C. , uehnle A. R. (1996) J. Amer. Soc. Hort. Sci.， 121 (1), 47-51

非特許文献 5 Kuehnle, A. R. , Fujii, T. , Chen, F. - C. , Alvarez, A. , Sugii, N. , Fukui, R. , Aragon, S. L. , Jaynes. J. M. (2004) HortSci. , 39 (6), 1327-1331 非特許文献 6 Werbrouck, S. P.0. , Eeckhaut, T. G. R， Debergh, P. C. (2000) Acta Horticulturae, 520, 263-269

発明の開示

本発明の目的は、食糧や観葉植物、薬用植物として遺伝子操作の対象として期待されるサトイモ科植物に対して高効率の遺伝子導入方法及び形質転換植物の作出方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた実験を行った結果、個体への再分化能に優れる葉鞘、特に葉鞘の基部またはその基部に近い部分からェンブリオジェニック · カルスを得たのち、これにァグロパクテリゥム（ァグロパクテリゥム属に属する微生物）、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、を感染させて共存培養し、抗生物質によって選抜を行い、さらに、得られた形質転換ェンプリオジェニック · カルスを再分化させ不定胚から幼植物体を誘導することで、サトイモ科植物への遺伝子導入効率、形質転換植物の作出効率が顕著に向上することを見出し、本発明を完成させるに至つた。

すなわち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。

本発明は、その態様において、サトイモ科植物のェンプリオジェニック ' カルスにァグロパクテリゥム、またはァグロバタテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、を感染させて外来遺伝子を導入し、これによつて形質転換ェンブリォジ-ニック · カルスを作製することを含む、サトイモ科植物の形質転換方法を提供する。

その実施形態において、ェンブリオジヱニック 'カルスが、葉鞘を外植片として得られるェンブリオジェニック ' カルスである。

本明細書中で使用される「葉鞘」とは、茎を鞘状に包むような形になった葉の基部をいう。

その別の実施形態において、サトイモ科植物がスパティフィラム属植物である。その別の実施形態において、本発明の方法はさらに、形質転換ェンプリオジェニック ' カルスから不定胚を誘導し発芽、発根させて形質転換植物を作出することを含む。.

本明細書中で使用される「不定胚」なる用語は、培養された植物体細胞（組織）から生ずる胚であって、更に正常な植物体へと発達することができる胚を指す。本発明により、従来困難であると考えられてきたサトイモ科植物のァグロバタテリゥム、またはァグロパクテリゥムど同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、による形質転換が可能となったため、この植物に外来遺伝子を容易に導入可能となり、これによつて形質転換サトイモ科植物を効率よく作出することができる、という格別の利点が提供される。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-348259号の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、形質転換に利用したベクターの構造を示す。ここで、 pKTl l は基本べクタ一を、また. pKT152および pKT167は本発明の植物形質転換用べクタ一をそれぞれ示す。 RBはライトボーダー配列、 LBはレフトボーダー配列、 35SP- Gus- nosT はカルフラヮーモザィクウィルス 35Sプロモーターで駆動される βダルク口ニダ —ゼ遺伝子、 Km耐性遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子、 UbiP_I- Luc- nosTはトウモロコシ · ュビキチンプロモーターで駆動されるィントロンを含むルシフェラーゼ遺伝子、 35SP- hyg- nosTは力リフラヮーモザィクウィルス 35S プロモーターで駆動されるハイグロマイシン耐性遺伝子、 Ubi P- hyg- nosT はトウモロコシ 'ュビキチンプロモーターで駆動されるハイグロマイシン耐性遺伝子をそれぞれ示す。図 2は、カルス選択培地に置床した後、 7日目のェンブリオジェニック ' カルスとルシフェラーゼ発光活性を示す。各ベクターを持つァグロパクテリァで処理後， 7日目のェンブリオジェニック · カルス塊の明視野（pKT152 : A、 pKT165 : C)と喑視野での発光測定（ARGUS50測定レベル 0〜3、 pKT152 : B、 pKT165： D)の結果を示す。発光測定では発光量が多いほど明るくなるよう画像処理されている。それぞれ 10個のェンブリオジェニック ·カルス塊を測定に供した。ェンブリオジェニック · カルスにはァグロバクテリァが効率よく感染しルシフェラーゼ遺伝子導入した後、ェンプリオジェニック ' カルスで発現していることがわかる。

'図 3は、. カルス選択培地に置床した後、 3ヶ月目の形質転換されたェンブリオジエニック ·カルスとルシフェラーゼ発光活性を示す。ベクタ一 ρΚΤ165を持つァグロバクテリァで処理後,， 1月毎継代し 3ヶ月目のェンブリオジェニック ·カルス塊の暗視野での発光測定（ARGUS50測定レベル 0〜5) の結果を示す。発光測定では発光量が多いほど明るくなるよう画像処理されている。本写真は 2つの実験区の 1つを示したものである。 2つの実験区の総数 42個置床されているェンプリオジェユック 'カルス塊のうち、強く発光するものが 22個、弱く発光するものが 5 個確認できた。強く発光するェンブ 'リオジェニック ' カルスはキメラ性のない均一な形質転換体である。

図 4は、再分化した植物体の葉片におけるルシフヱラーゼ発光活性を示す。再分化した個体のうち PCRで遺伝子導入されていることが確認できた個体の葉片の喑視野での発光測定（ARGUS50測定レベル 0〜5) の結果を示す。発光測定では発光量が多いほど明るくなるよう画像処理されている。試薬の吸収による理由で発光していない、もしくはムラのある葉片もあるが発光しているもの（16片）はほぼ全面で発光が観察できキメラ性はとても低い。発明を実施するための最良の形態

( 1 ) 宿主と植物部位

形質転換のための植物宿主の例としては、サトイモ科植物の細胞が挙げられ、特に好ましい具体例としては、サトイモ、タロイモ、コンニヤク、スパティフィラム、アンスリウム、力ラジウム、アグラォネマ、アローカシア、デイエフェンバキア、モンステラ、フイロデンドロン、ポトス、シンゴニュ一ム、カラー、ミズバショウ、ザゼンソゥ、ショウブ等の植物細胞などが挙げられる。その中で最も好ましいスパティフィラムは品種に特に制限はなく、巿贩品種（ペティ一ト「Pet i te」、米国トワイフオード社のダブルテイク「Doubl e TakeJ やクラウディァ「Claud i a」等）を用いることができる。

具体的な植物材料としては、葉鞘、生長点、苗条原基、 ***組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等が挙げられる。好ましい具体例としてこれら材料の基部に近い部分が挙げられる。更に好ましくは、葉鞘の基部またはその基部に近い部分が挙げられる。ここで葉鞘の基部とは葉鞘長片の下 1 / 4部分を指し、葉鞘基部に近い部分とは当該葉鞘.基部を除いた葉鞘長片の下 1 / 2部分を指す。

( 2 ) ェンブリオジェニック ' カルスの誘導

本発明において、ェンプリオジェニック · カルスとは個体までに分化できる能力があり、形態は柔らかく（力を加えることで崩れやすい）、個々の径が 1mm未満の大きさを持ち、クリーム色を呈する粒状の脱分化した細胞または組織である。サトイモ科の組織片を培養して作製したもので遺伝子導入後、個体レベルにまで分化できる能力があり、ァグロバクテリゥムに感染性を有するものであればどのようなものでもよい。好ましくは、 i n v i troの組織片をカルス誘導用培地 (こ置床し、培養してカルス誘導を行ったェンプリオジェニック · カルスでよい。

材料の好ましい 1例である葉鞘は、必ずしも培養苗から採取する必要はない。温室などの開放条件で維持されている植物から採種してもよい。その場合は常法によって表面殺菌をして外植片とする。培養苗を用いる場合は表面殺菌の必要はない。葉鞘であればどの部位を用いても良いが、好ましくは基部に近い部分が良い。更に好ましくはその基部、例えば葉鞘を植物苗から採取する際に、メスなどで切断するのではなく、葉鞘を植物苗から剥がす様に採取し、その剥離した部分を含む部位を用いる。葉や根からもカルスが得られる場合があるが、葉鞘に比して頻度は著しく低くまた次工程でのェンブリオジェニック · カルスも誘導されにくいので好ましくない。

次に調製した葉鞘外植片を培地に置床し、ェンプリオジェニック ' カルスを製造する方法について説明する。

前述のように得られた葉鞘外植片をカルス誘導培地に置床することによって先ずカルスを誘導する。その培地は MS培地（Physi0l. Plant. , 15， ρ143, 1962) など通常組織培養に用いる培地を基本培地とし、糖^として蔗糖 1〜6% (重量ノ体積。 /₀、以下同じ）、望ましくは 2〜4%、植物生長調節物質のオーキシン類として望ましくは 2, 4-ジク口口フエノキシ酢酸（2， 4-D)を l〜8ppm、望ましく 3〜5ppm、その他のオーキシン類としてインドール- 3-酢酸（IAA)、インドール- 3-酪酸（IBA)、 1 -ナフタレン酢酸（NAA)、 4-クロロフエノキシ酢酸 (CPA) , クロロメチノレフエノキシ酢酸（MCPA)、 2, 4， 5-トリクロ口フエノキシ酢酸（2， 4， 5-T)、ジクロロメトキシ安息香酸（DICAMBA)、トリクロ口アシノピコリン酸（PICR0LAM) を、サイトカィニン類として望ましくは 6-ベンジルアデニン（BA) を 0. 05〜2ppm、望ましく 0. 1〜0. 3ppm、その他のサイトカイニン類として.ゼァチン（ZEA)、力イネチン（KN)、 6- (ベンジルァミノ）- 9- (2-テトラヒドロビラ二ル）- 9H -プリン（PBA)、 2-ィソペンテニルアデニン（2ip)、チジァズロン（TDZ)等.を用いる。最も良好な結果は 2，4_D と BAを組合せた条件で得られる。 2，4-Dが lppm未満の場合、カルスと共に植物体が発生しやすく、 8_PPmを超えると組織が褐変しゃすい。また、カゼイン酸加水分解物を 50〜200ppm、ノくッファーとして MESを 0. 1〜 10mMを加えても良い。培地の p Hは 5〜7 とする。 p H調整後に寒天（0. 8〜1. 2% ) またはゲルライト（0. 1 〜0. 3%) を用いて培地を固形化する。容器は植物組織培養に用いられるものであれば特に限定はない（例えばプラントボックス、旭テクノグラス社（東京、日本国）製、内容積 300ml)。光環境は喑所、温度は 20°C〜30°C、望ましくは 23°Cから 27°Cとする。，培養期間は 4〜12週、望ましくは 5〜8週とする。

誘導されたカルスを同じ培地に継代培養し、生じてくるェンブリオジヱニック · カルスを選抜し同じ培地に移植してェンブリオジェニック · カルスのみの増殖を行う。以後、同様の操作にてェンブリオジヱニック ' カルスを維持、増殖する。光、温度条件はカルス誘導時と同じとし、培養期間は 4〜6週とする。

すなわち一旦、ェンブリオジヱニック ' カルスが得られると形質転換材料として、毎回、ェンブリオジェニック ' カルスを誘導する必要が無く、ェンブリオジエニック ·カルスを必要量だけ増殖し、形質転換実験に供することが可能となる。 ( 3 ) ァグロバタテリゥム感染方法

本発明の方法において、外来遺伝子の導入は、目的遺伝子を含有するァグロバクテリゥム、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、の感染液にェンプリオジェニック ' カルスを浸潰し、浸漬後の組織片を共存培養培地で共存培養することを含む。近年、ァグロバグテリゥム属以外のリゾビゥム属でも植物での遺伝子導入が、同様の機構で起こることが報告されており（Ch i l ton, M. D. (2005) Nat. Biotechnol . , 23 (3) , 309-10)、導入効率もァグロバクテリゥムに遜色なく積極的に共同利用が図られている（We ir, B. J.， Mi tchel l, H. J. , Broothaerts, W. , Jefferson, R. A. (2005) Pl ant Biology 2005 Final Program, 93)。このことでも明らかなように、遺伝子導入に際しては、ァグロバクテリゥムだけでなく、ァグロバタテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物（例えばリゾビゥム属の微生物、シノリゾビゥム属の微生物、メソリゾビゥム属の微生物等）も用いることができる。なおァグロパクテリゥム.ッメファシエンスは Ameri can Type Cul ture Col l ect ion (ATCC) (米国）ではリゾビゥム属として登録されている。

ァグロパクテリゥムとしては、ァグロバタテリゥム · ッメファシエンス (Agrobacterium tumefac i ens)が好ましく、具体的には AGL0 株、 LBA4404 株、 CIB542/A136株、 EHA101株等を用いることができるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する「ァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする」とは、ァグロパクテリゥムだけでなく、ァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物（例えばリゾビゥム属の微生物、シノリゾビゥム属の微生物、メソリゾビゥム属の微生物等）で形質転換することを意味する。外来遺伝子は、特に限定されないが、公知のものを目的に応じて適宜使用することができる。例えば、アントシァニンやカロテノイド色素の生合成遺伝子や色素合成を調節する遺伝子、形態形成（開花や草丈等）を調節する遺伝子、耐病性を付与する遺伝子、乾燥耐性を付与する遺伝子などを含む。

ァグロパクテリゥム、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、に的とする遺伝子を導入するベクターとしては、 pBI 121 (DDBJAccess i on No. AF485783)等を用いることができる。さらに改良型である pKTl l (日本国特開 2001-161373号公報）を用いることもできる。またべクタ一は、目的とする遺伝子の他に、例えばレポーター遺伝子、選抜マーカー遺伝子、プロモーター遺伝子等の他の遺伝子を含有していてもよい。レポーター遺伝子としては、例えばルシフェラーゼ遺伝子、 GFP遺伝子、 GUS遺伝子等が挙げられる。ルシフェラ一ゼ遺伝子としてはィントロンを含むものを用いることができる (DDBJ Accession No. U84006)。これは、ァグロバクテリゥム、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、の残存によるァグロバクテリゥム、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、が持つルシフヱラ一ゼ遺伝子の影響を排除して、植物での発現のみを確認することができる。

選抜マーカー遺伝子と.しては、例えばカナマイシン耐性遺伝子、 G418耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。

また、プロモーター遺伝子としては、 '例えばトウモロコシ 'ュビキチンプロモータ一 [Plant Mol Biol. 1994； 26 (3)： 1007- 12..]や力リフラヮーモザィクウィルス 35Sプロモーター（日本国特許第 2645217号）等が挙げられる。

公知のものを適宜組み合わせて翻訳ェンハンサー、ターミネーター等の構成要素を含むことができる。ウィルス起源の翻訳ェンハンサ一としては、例えば、タバコモザイクウイノレス、ァノレファノレファモザイクウィルス RNA4、ブロモモザイクウィルス RNA3、ポテトヴィルス X、タバコエッチウィルスなどの配列が挙げられる [Gallie ら、 Nuc. Acids Res. , 15 (1987) 8693 - 8711]。また、植物起源の翻訳ェンハンサ一として、ダイズの /3- 1,3 ダルカナーゼ（G]u) 由来の配列 [石田功、三沢典彦著、講談社サイェンティフイク編、細胞工学実験操作入門、講談社（東京、日本国）、 p.119, 1992]やタバコのフェレドキシン結合性サブュニット（PsaD b ) 由来の配列 [Yamamotoら、 J. Biol. Chem. , 270 (1995) 12466-12470]などが挙げられる。ターミネータ一としては、例えば、 nos 遺伝子のターミネータ一、 ocs遺伝子のターミネータ一などが挙げられる [Annu. Rev. Plant Physiol. Plant

Mol. Biol. , 44 (1993) 985-994、「Plant genetic transformation and gene expression ; a laboratory manualj、 Draper, J. et. al.編, Blackwell Scientific

Publication, 1988]。また、プロモーター中の転写ェンハンサ一として、 35S 遺伝子のェンハンサ一部分が同定され、それらを複数個並べて繋げることにより、活性を高めることが報告されており（Plant Cell, 1 (1989) 141- 150)、この部分を D N A鎖の一部として用いることも可能である。これらの各種構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形で D N A鎖中に組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。

上記べクタ一は、遺伝子工学の分野で慣用されている手法を用いることにより、当業者であれば容易に製造することができる。また、本発明のベクターは、天然の供給源から単離されたものに限定されるものではなく、上記のような構造を有するものであれば、人工的な構築物であってもよい。該 D N A鎖は、周知慣用されている核酸合成の方法に従って合成する事により、得ることができる。

目的とする遺伝子及び他の遺伝子を組み込んだ前記ベクターのァグロパクテリゥム、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、への導入は、エレクトロポレーシヨン法、 freeze- thaw 法等の当業者に公知の手法により実施することができる。

感染液（接種用培地）としては、 LB、 YEP, YMB等の液体培地で前培養し、遠心分離により集菌したァグロバクテリゥム、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、を同培地又は M Sや B 5等の植物培養用培地等にて希釈したものを用いることができるが、これらに限定されない。 ― 感染液における前記微生物の濃度は、組織片に十分に遺伝子導入が行われる濃度であれば特に限定されないが、例えば、感染液 lmLあたり 10， 000〜10， 000， 000 個の微生物菌体とすることができる。感染を確実なものとするためには高濃度の菌体へ長時間浸漬すればよいが、植物体へのダメージが大きいので望ましくなレ、。

次に、ァグロパクテリゥム、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、の感染を確実にするため、浸漬処理の終わった組織片を共存培養用培地で培養する。共存培養用培地は、植物の組織片の培養に必要な成分、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、固化剤等を含むものであればどのようなものでもよレ、。炭素源としては、例えば、シュクロース、グルコース等を用いることができ、無機塩類としては、 MS無機塩、 B5無機塩等を用いることができ、固化剤としては、寒天、ゲルライト等を用いることができる。また、共存培養後のカルス誘導を促進するために植物生長調節物質が添加されてもよい。

共存培養期間は、例えば 1 〜14 日、好ましくは 1 〜 5日行うとよい。共存培地にはァセトシリンゴンを入れることが好ましく、濃度は lOOmMとするのが好ましい。共存培養の P Hや温度は、植物の組織片に悪影響を及ぼさない範囲であれば特に制限はないが、例えば p Hは 5〜8とするのが好ましく、温度は 20〜28°Cとするのが好ましい。また光条件は喑所とするのが好ましい。

( 4 ) 形質転換ェンブリオジヱエック · カルスの選択

共存培養したェンプリオジェニック · カルスに付着しているァグロバタテリゥム、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、を除菌し、その後カルス選択培地を用いて、遺伝子導入したェンプリオジェニック ·カルスを選択する。 '除菌は、例えば、前記の共存培養用培地をセフオタキシム等の抗生物質を含んだ培地に置床することで行う。

ここで用いるカルス選択用培地は、カルス増殖用培地に除菌用抗生物質及び形質転換細胞選抜用物質を添加する。除菌用抗生物質としては、セフォタキシム、モキサラクタム、メロぺネム等が挙げられる。除菌用抗生物質の濃度は、例えばセフォタキシムの場合は 100〜300 g/mlの範囲が好ましい。

形質転換細胞選抜用として抗生物質や除草剤、アミノ酸アナログを用いることができる。抗生物質を用いる場合は、前記選抜用マーカ一遺伝子に応じた抗生物質であれば特に限定はないが、ハイグロマイシンが好ましい。形質転換細胞選抜用抗生物質の濃度は、例えばハイグロマイシンの場合 3〜100 z g/ml の範囲が好ましい。

光条件は喑所とするのが好ましい。

上記の培地条件、光条件を採用し、ェンブリオジヱニック · カルスを通常の植物細胞の培養条件、例えば 20〜28°Cで 7 日から 4力月培養することにより、形質転換したェンプリオジェニック · カルスを得ることができる。

( 5 ) 形質転換ェンプリオジェニック · カルスから不定胚の誘導

形質転換ェンプリオジェニック ·カルスを不定胚誘導用培地に置床し、培養して不定胚誘導を行う。ここで用いる不定胚誘導用培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含むものであればどのようなものでもよい。炭素源としては、例えば、シュクロース、グルコース等を用いることができ、無機塩類としては、 MS無機塩、

B5無機塩等の基本培地を用いることができ、さらに固化剤としては、寒天、ゲルライト等を用いることができるが液体培地で誘導することも可能である。さらに植物生長調節物質を添加することが好ましい。

具体的には不定胚誘導培地は MS 培地などを基本培地とし、糖源として蔗糖を 0. 5〜4%、望ましくは 1〜2%、フラクトースを 0. 5〜4%、望ましぐは 0. 5〜2% を添加する。また、その他の糖類としてソルビトール又はマンニトールを 1〜6%、望ましくは 2〜4%を添加しても良い。植物生長調節物質のオーキシン類として望ましくは 2， 4-ジクロロフエノキシ酢酸（2, 4 -ひ）を 0〜2ppm、望ましくは 0· 01〜 0. 05ppm、その他のオーキシン類としてィンドール- 3-酢酸（IAA)、ィンドール- 3- 酪酸（I BA)、 1 -ナフタレン酢酸（NAA)、 4 -クロロフヱノキシ酢酸（CPA)、クロ口メチルフエノキシ酢酸（MCPA)、 2， 4， 5-トリクロ口フエノキシ酢酸（2, 4， 5-T)、ジクロロメトキシ安息香酸（DICAMSA)、ドリクロ口アシノピコリン酸（PICR0LAM) を、サイトカイニン類として望ましくは 6-ベジルアデニン（BA) を 0〜0. 5ρριη、望ましく 0. 05〜0. 2ppm、その他のサイトカイニン類としてゼァチン（ZEA)、カイネチン（KN)、6- (ベンジルァミノ）- 9- (2-テトラヒドロピラエル） - 9H-プリン（PBA)、 2-イソペンテニルアデニン（2 ip)、チジァズロン（TDZ) 等を用いる。また、グルタミン酸及び/またはプロリンを夫々 1〜10mM、望ましくは 2〜5mM添加する。バッファーとして MESを 0. l〜10mMを加えても良い。培地の p Hは 5〜7 とする。光環境は明条件（12〜16時間日長、光合成光量子束密度 5. 7〜34. 2 mol_e/m²Z secが望ましいが、喑条件でも良い。温度は 20°C〜30°C、望ましくは 23°C〜27°C とする。培養期間は 4〜12週、望ましくは 5〜10週とする。

( 6 ) 不定胚の発芽、発根

不定胚は固体培地上でも液体培地中でも高効率で発芽する。発芽に用いる培地は MS培地などを基本培地とし、糖源として蔗糖を 1〜6%、望ましくは 2〜4%添加する。発芽に比し発根が著しい場合は、それを抑えるためにその他の糖類としてソルビトール又はマンニトールを 1〜6%、望ましくは 2〜4%を添加しても良い , 植物生長調節物質は特に添加する必要はないが、オーキシン類やサイトカイニン類を添加して発芽を促進させても良い。培地の p Hは 5〜7 とする。光環境は明条件、 12〜16時間日長、光合成光量子束密度 1. 1〜34. 2 / m₀l e/m7se_C、望ましくは

2. 3〜1 1. /x mol e/mVsec とする。温度は 20°C〜30°C、望ましくは 23°Cから 27°C とする。固体培地の場合は寒天 - (0. 8〜1. 2 %) またはゲルライト（0. 1〜0. 3%) を用いて培地を固形化する。容器は植物組織培養に用いられるものであれば特に限定されるものではないが、固体培地の場合は前述のプラントボックス、液体培地の場合は前述の攪拌式もしくはェアーリフトタイプの培養槽を用いる。培養期間は、固体培地の場合は 4〜12週間、液体培地の場合は 3〜6週間とする。その期間中に、不定胚は発根もして数枚の葉を展開するサイズの植物体となる。

( 7 ) 温室への移植 ' '

不定胚から再分化した植物体は、温室にて正常に生育する。移植に用いる土は特に限定されるものでは,なく、育苗用に市販されている培養土で良い。植物体を移植した後、 1〜3週間程度、適度の加湿と遮光を行うことが望ましい。

( 8 ) 遺伝子導入植物体における遺伝子の導入及び発現の確認

上記の操作により得られた遺伝子導入カルスや植物体における遺伝子の導入及び発現の確認は、当業者に公知のレポーター遺伝子を用いる方法、例えばルシフエラーゼの発光、緑色蛍光タンパク質（GFP) の蛍光、 β—グルグロニダーゼ（GUS) の青色呈色にて行うことができる。また、当業者に公知の手法に従い、該遺伝子の配列を基に作製したプライマーを用いて、 PCR 法、サザンハイブリダィゼ一ション法又はノーザンハイブリダイゼ一ション法により行ってもよレ、。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではない。

〔実施例 ].〕スパティフィラムのェンブリオジェニック · カルスの取得

スパティフィラム（品種 Pet i te) の培養苗の各種組織から、カルス誘導及びそれらカノレスからのェンブリオジェニック · カルスの誘導を行った。

同培養苗は、 MS培地に蔗糖 3%、寒天（和光純薬社） 0. 8%を添加し pHを 5. 8に調整した固体培地上にて、明所（光合成光量子束密度 5. 7 /i _mol _e/m7_SeC、 16時間日長）、 25°Cの条件下にて継代維持されているものである。培養容器には旭テクノグラス社（東京、日本国）製のプラントボックスを用いた（内容積 300m l)。培養 4週目の培養苗から、葉鞘を株から剥がす様に採取し、剥離部分を含む約

2cmの切片（葉鞘基部）を外植片とした。その外植片を、蔗糖 3%、 2, 4-D 4ppm、

BA 0. 2ppm、カゼイン酸加水分解物 100ppm、 MES 5mMを添加し 0. 8%寒天にて固化した MS培地（pH5. 8、以下「カルス誘導 ·増殖培地」）に 6切片/容器ずつ置床した（容器はプラントボックス、培地量は 50ml)。全部で 4個の容器を使用した。 25°C、喑所条件にて 8週間培養しカルスの誘導状況を調査した。

その結果、置床切片の 92% (カルス誘導切片数 Z置床切片数 = 22/24) においてその剥離部分にカルスが誘導された。それらカルスを 0. 2gZ容器ずつ同一培地に継代し 1 ヶ月培養することによって、ェンブリオジェニック · カルスが選抜された。このようなェンブリオジェニック ' カルスは、 50%の率（ェンブリオジェニック · カルス誘導容器数 Z処理容器 = 4/8) にて誘導された。

このェンブリオジェ二.ック . カノレスを、蔗糖 1%、ソノレビトーノレ 3%、 MES 5mM を含む MS液体培地（pH5. 8) を 160ml添加した 500ml の三角フラスコに各 0. 05g ずつ置床し、 °C、明所（16時間日長、光合成光量子束密度 ZZ. S / mole/mVsec) にて 6週間浸とう培養を行った（80rpm) ところ、不定胚が形成された。それら不定胚を、蔗糖 3%を含み寒天 0. 8%にて固化した MS培地（_PH5. 8、以下「発芽培地」） 50mlを添加したプラントボックスに 0. 2gずつ置床し、 25°C、明所（16時間日長、光合成光量子束密度 5. 7 /i mol e/_m ²/_{S ec}) にて 8週間培養を行ったところ、不定胚は発芽し完全な植物が得られた。ェンブリオジェニック ' カルスは、 4 週間毎にカルス誘導 ·増殖培地へ継代することにより、不定胚誘導能を保持したまま 2年間の維持が可能であった。

さらに品種 Pet i teの手法と同様に、他のスパティフィラム品種である Doubl e Take , Claudi a ,の in vi tro の葉鞘から葉を切り取った基部をそれぞれ、 70、 68 切片ずつカルス誘導培地に置床した。 25°C喑所で 4〜 8ヶ月培養することでェンブリオジェニック ·カルスが誘導できた。誘導率：％ ( (ェンブリオジェニック · カルス誘導基部切片数 //置床基部切片数） X 100)はそれぞれ 80%、 88%であった（それぞれの（ェンプリオジェニック · カルス誘導基部切片数/置床基部切片数）は、 56/70, 60/68)。これらのェンブリオジェニック 'カルスをカルス誘導 .増殖培地で増殖した。以降の実験では温室での栽培特性に優れる Double Takeのェンブリオジェニック · カルスを使用した。

〔実施例 2〕植物形質転換用ベクターの作製

選抜マーカーとして使用したハイグロマイシン耐性（hyg) 遺伝子は、力リフラヮ一モザィクウィルス 35S RNA プロモーターと大腸菌由来の hyg遺伝子は pIG121 (特開平 1 1- 69979号公報）から利用した。トウモロコシ由来のュビキチン 'プロモーター [Plant Mol Biol . 1994； 26 (3) ： 1007- 12. ]、カリフラワーモザイクウイノレス 35S RNA プロモーターとァグロパクテリァ由来の nosターミネーターはク口ンテック社製ベクター PBI 121を利用した。これらの発現カセットを、ァグロバクテリアと大腸菌で増幅可能なバイナリー型ベクターである pKTl l (特許文献 2 ) を基本ベクターとして、 Gus遺伝子、 Nptll遺伝子と置き換えることにより、 pKT152 と pKT163を構築した。（図 1 )

〔実施例 3〕遺伝子導入ァグロパクテリァの調製

実施例 2で作製されたベクターをエレクトロポレ一シヨン法（Plant Molecular Biology Manual, C2 ( 1994) 1-32 (Ed. ) Gelv in t Schi lperoort, Kluwer Academic Publ ishers)により、ァグロパクテリゥム ' ッメファシエンス AGL0 株（ATCC No. BAA-100)に導入した。

〔実施例 4〕遺伝子導入ァグロパクテリァのェンブリオジェニック · カルスへの感染 '

各ベクターを含むァグロバクテリウム .ッメファシエンス AGL0株を、 50ppmのカナマイシンを含む YEB液体培地（5g/l ビーフエキス、 lg/1 酵母エキス、 5g/l ペプトン、 5g/l蔗糖、 2mM硫酸マグネシウム（pH7. 2) ) で 28°C、 12時間振とう培養した。培養液 1 ml を 10， OOOrpm, 3分間遠心して集菌後、 10 mlの minA培地

(2. lg/1 リン酸水素二力リウム、 0. 9g リン酸ニ水素力リウム、 0. 2g 硫酸ァンモニゥム、 0. lg/1タエン酸ナトリゥム 2水和物、 0. 02% 硫酸マグネシウム 7水和物、 0. 2% ブドウ糖）に再懸濁し感染用菌液とした。

〔実施例 2〕で得られたェンブリオジ-ニック ' カルスを一回の形質転換実験当たり卜 7g (7gの場合は、ェンブリオジェニック ·カルスを 20- 50個含むェンブリオジェニック ' カルス塊が約 500個）を上記のァグロバクテリウムの菌液内に

1分間浸漬した後、滅菌済みの濾紙上にェンプリオジェニック 'カルスを置いて過剰のァグロバクテリゥムを除いた。その後、シャーレ内の共存培地（MS無機塩、

3% 蔗糖、 lOOppm カゼイン酸加水分解物、 4ppm 2. 4- D、 0. 2ppm BA、 5mM MES、 lOOmM ァセトシリンゴン、 0. 8% 寒天 pH5. 6) へ置床し喑所 . 25°Cで 4ないし 5 日間培養した。

〔比較例 1〕ェンプリオジェニック •カルスから不定胚誘導を行う朥の選抜

共存培地にあるェンブリオジェニック 'カルスを不定胚誘導選択培地（MS無機塩、 1% 蔗糖、 1% フルクトース、 3mM プロリン、 3mM グルタミン、 0.'2ppm 2. 4- D、 0. lppm BA, 5mM MES、 6ppm ハイグロマイシン、 250ppm セフォタキシム、 0. 8% 寒天 pH5. 6) へ置床し形質転換体がえられるかどうかを検証した。

• 〔実施例 4〕の一回の実験で得られたェンプリオジェニック 'カルス約 7_gを不定胚誘導選択培地へ置床した。しかし、すべてのェンブリオジェニック ' カルスは置床後 1一 2ヶ月の間.に褐色になり死滅した。よって、この方法では形質転換されたェンブリオジヱニック · カルスならびに不定胚は得られず結果として形質転換植物は得ちれなかった。

〔実施例 5〕ェンブリオジェニック · カルスを増殖する培地での選抜

〔実施例 4〕で得られたァグロパクテリゥムにて感染したェンブリオジェニック · カルスをカルス選択培地（MS無機塩、 3% 蔗糖、 lOOppm カゼイン酸加水分解物、 4ppm 2. 4-D、 0. 2ppm BA、 5mM MES、 3または 6ppm ノヽィグロマイシン、 250ppm セフォタキシム、 0. 8% 寒天 pH5. 6ルシフェリン溶液： 5mM ルシフェリン、 0. 1% トリトン X-100) に置床した。 1ヶ月ごと培地を新しくして継代を繰り返した。形質転換カルスの確認はマーカ一遺伝子であるルシフェラーゼ活性を測定し確認した。

方法は培地ルシフヱリン溶液をカルスに 5-10 1添加し 15分間喑所に放置する。その後、発光したカルスから出る光子を ARGUS50 (浜松ホトニクス社（静岡、日本国）製）で 50分間検出 ·積算し画像解析を行った。

カルス選択培地に置床した後、 7日目にルシフェラーゼ活性を測定した結果を図 2に示す。褐色に変色せず黄色で生育しているベクター pKT152、 ρΚΤ165を導入したァグロバクテリアで処理した任意の 10個のェンブリオジェニック'カルス塊すべてで、導入されたルシフヱラーゼ遺伝子による発光が観察できた。このことからェンブリオジェニック · カルスにはァグロバクテリゥムが効率よく感染しルシフェラ一ゼ遺伝子導入した後、ェンブリオジェニック ' カルスで発現していることがわかる。 1ヶ月毎継代し 2〜4ヶ月目のェンブリオジェニック ·，カルス塊を不定胚誘導培地へ移した。図 3では pKT165を導入したァグロバタテリゥムで処理した 3ヶ月目のルシフェラ一ゼ活性を測定した結果を示す。生育の良かったこの区では 42 個置床されているカルスのうち、強く発光するものが 22個、弱く発光するものが 5 個確認できた。強く発光するェンプリオジェニック · カルスはキメラ性のない均一な形質転換体であることがわかる。

〔実施例 6〕形質転換ェンブリオジ'エニック ' カルスの不定胚の形成、発芽から個体再生

〔実施例 5〕で得られ.た形質転換ェンプリオジェニック · カルスを不定胚誘導培地（MS 無機塩、 1% 蔗糖、 1% フルクト一ス、 3mM プロリン、 3mM グルタミン、 0. 2ppm 2. 4-D , 0. l ppm BA、 5mM MES , 250ppm セフォタキシム、 · 0. 8% 寒天 pH5. 6) に置床した。明所 · 25°Cで培養したところ、置床後 1〜 2ヶ月の間に緑色になり不定胚を形成した。

さらに、この不定胚を個体再生培地（MS無機塩、 1% 蔗糖、 0. 8% 寒天 pH5. 6) に置床し再分化個体を得た。

再分化した個体が確かに遺伝子を含有することを確認するため再分化した植物体の中から外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含有する個体を、 PCR を行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換体であることを確認した。ここで、ルシフェラーゼ遺伝子特有の配列を特異的に増幅するプライマーとして、 5' -AGAGATACGCC.CTGGTTCCT-3' (配列番号 1 )、及び 5' - ATAAATAACGCGCCCAACAC- 3' (配列番号 2 ) を用いた。 PCR の反応条件は、 94°Cで 5分間の加熱後、 94°C (30 秒）、 55°C ( 1分）及び 72°C ( 1分）のサイクルを 30回行い、最後に 72°Cで 10 分間反応させた。この反応では、酵素として Taqポリメラーゼ（宝酒造社（京都、日本国）製）を用いた。反応産物をァガロース電気泳動で分離し増幅産物をェチジゥムプロマイドで染色し紫外線下で観察した。

上記の手法によって、表 1 に示すように、各遺伝子を含むベクター（pKT152，

PKT 165)が別個に導入されたェンブリオジェニック ·カルス計、およそ 21. 9 g (生体重）から、それぞれ別個の形質転換体であるスパティフィラム植物体計 33個体を取得できた。また、 PCR で遺伝子導入が確認できた再分化した個体の葉片でのルシフェラ一ゼ活性の結果を図 4に示す。発光しているものはほぼ全面で発光が確認できることからキメラ性はとても低いことがわかった。

表 1 得られた形質転換体スパティフィラム

産業上の利用可能性

本発明により、サトイモ科植物に外来遺伝子を容易に導入可能となり、これによって形質転換サトイモ科植物の効率的作出が可能になり産業上有用である。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1 . サトイモ科植物のェンブリオジェニック'カルスにァグロバタテリゥム、またはァグロパクテリゥムと同様の機構で遺伝子導入を可能にする微生物、を感染させて外来遺伝子を導入し、これによつて形質転換ェンプリオジェニック '力ルスを作製することを含む、サトイモ科植物の形質転換方法。

2 . ェンプリオジェニック ' カルスが、葉鞘を外植片として得られるェンブリオジェニック · カルスである請求項 1に記載の形質転換方法。

3 . サトイモ科植物がスパティフイラム属植物である請求項 1に記載の形質転換方法。

4 . 形質転換ェンプリオジェニック · カルスから不定胚を誘導し発芽、発根させて形質転換植物を作出することをさらに含む請求項 1に記載の形質転換方法