SK4262002A3

SK4262002A3 - The use of a peptide coded by the prv-1 gene or by a fragment thereof in production of a medicament acting as a growth factor

Info

Publication number: SK4262002A3
Application number: SK426-2002A
Authority: SK
Inventors: Heike Pahl
Original assignee: Universitaetsklinikum Freiburg
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2002-09-10
Also published as: DE19947010A1; KR20020047191A; WO2001023554A1; NO20021498D0; HUP0203080A2; EA200200286A1; HRP20020269A2; BR0014444A; CZ20021094A3; EE200200168A; EP1220920A1; CN1377408A; MXPA02002800A; ZA200202379B; JP2003510077A; BG106554A; IL148770A0; CA2387702A1; PL354184A1; AU1132401A

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka nukleotidovej sekvencie, ktorá kóduje gén PRV-1, rekombinantnej DNA ktorá obsahuje túto nukleotidovú sekvenciu, vektorov ktoré obsahujú rekombinantnú DNA a buniek, ktoré sú transformované takýmito vektormi a tiež sa týka polypeptidu PRV-1. Vynález sa týka predovšetkým použitia polypeptidu, ktorý je kódovaný génom PRV-1, alebo jeho fragmentu a/alebo použitia nukleotidovej sekvencie génu PRV-1 na výrobu lieku, ktorý pôsobí ako rastový faktor. Vynález sa týka aj protilátok proti polypeptidu PRV-1, spôsobu detekcie polypeptidu PRV-1 a liekov, ktoré obsahujú polypeptid PRV-1, alebo protilátkok, ktoré sú namierené proti polypeptidu PRV-1.

Doterajší stav techniky

Polycythemia rubra vera (erytrémia), nazývaná aj polycythemia vera, alebo skrátene p. vera, je maligne hematologické ochorenie, pri ktorom dochádza ku zvýšenej tvorbe erytroidných buniek, granulocytov a megakaryocytov. Choroba má klonový pôvod a vzniká ako dôsledok mutácie jedinej hematopoetickej prekurzorovej bunky. V Nemecku je incidencia p. vera 4 až 6 prípadov na 1 milión obyvateľov. Pokial sa choroba nelieči, v priebehu 18 mesiacov končí smrťou. Liečba odberom krvi, alebo chemoterapiou predlžuje priemernú dĺžku doby prežitia na viac ako 13 rokov.

P. vera sa diagnostikuje na základe klinických kritérií. Do klinického obrazu patria bolesti hlavy, pruritus, splenomegália u dvoch tretín pacientov, krvácanie alebo trombózy, hypertenzia u tretiny pacientov, dna ktorú spôsobuje zvýšená tvorba kyseliny močovej, a v niektorých prípadoch aj septické vredy. Najdôležitejším laboratórnym nálezom je zvýšenie hodnôt hemoglobínu, hematokritu, počtu erytrocytov a celkového objemu erytrocytov, v mnohých prípadoch aj neutrofilná granulocytóza, alebo trombocytóza. Vzhľadom na to, že na jednej strane je väčšina kritérií značne difúzna a na druhej strane nie všetci pacienti spĺňajú tieto kritériá, často je veľmi ťažké odlíšiť p. vera od iných myeloproliferatívnych ochorení, ako je napr. chronická granulocytárna leukémia alebo esenciálna trombocytóza, a tak potvrdiť diagnózu. Molekulárne príčiny p. vera nie sú dodnes úplne známe. Ak sa však p. vera nelieči, má velmi ťažký priebeh, preto je velmi dôležité stanoviť presnú diagnózu.

Podstata vynálezu

Cieľom predkladaného vynálezu bolo nájsť molekulárnu príčinu ochorenia polycythemia rubra vera a nájsť vhodný spôsob na stanovenie diagnózy tejto choroby.

Tento ciel sa dosiahol izoláciou génu, ktorého expresia je špecificky asociovaná s p. vera a u zdravých jedincov k nej nedochádza. Tento gén bol nazvaný PRV-1 (polycythemia rubra vera).

Podobná nukleotidové sekvencia bola opísaná v medzinárodnej patentovej prihláške WO 98/50552.

Preto sa jedna časť predmetu predkladaného vynálezu týka polynukleotidu, ktorý kóduje gén PRV-1 a v podstate obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 1. Podľa predkladaného vynálezu polynukleotidy sú jednoreťazcové alebo dvojreťazcové DNA, alebo RNA. Odborníkovi je zrejmé, že ak ide o RNA, na mieste „T nukleotidov sa nachádzajú „U nukleotidy. Termín „polynukleotid v predkladanom opise znamená kyselinu, ktorá obsahuje 15 alebo viac nukleotidov.

Nukleotidové sekvencia podľa predkladaného vynálezu je znázornená na obr. 1. Vynález sa týka polynukleotidu, ktorý zodpovedá sekvencii na obr. 1 a tiež polynukleotidu, ktorého nukleotidová sekvencia vykazuje menšie odlišnosti. Pod termínom sekvencia, ktorá vykazuje „menšie odlišnosti sa v opise predkladaného vynálezu rozumie taká sekvencia, v ktorej je niekolko nukleotidov zmenených, výhodne nie viac ako 50 a zvlášť výhodne nie viac ako 25 nukleotidov, pričom sa neovplyvní funkcia génu, ktorý je kódovaný nukleotidovou sekvenciou. Odborníkovi je zrejmé, že triplet zásad, ktoré kódujú aminokyselinu, môže byť nahradený iným tripletom, ktorý kóduje rovnakú aminokyselinu. Naviac menej dôležité úseky môžu byť deletované a/alebo mutované na sekvencie, ktoré vykazujú menšie odlišnosti.

V jednom špecifickom uskutočnení vynálezu polynukleotid obsahuje nukleotidy 36 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1, čo je kódujúci úsek génu PRV-1. V iných prevedeniach vynálezu polynukleotid obsahuje nukleotidy 36 až 1262, alebo 36 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. Tento úsek sa považuje za úsek, ktorý kóduje aktívny úsek polypeptidu PRV-1. Napokon, polynukleotid podľa predkladaného vynálezu môže obsahovať tiež nukleotidy 39 až 1346, 39 až 1262, alebo 39 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1, takže chýba kodón, ktorý kóduje počiatočný metionín. Výhodným uskutočnením vynálezu je polynukleotid, ktorý obsahuje nukleotidy 99 až 1346, 99 až 1262, alebo 99 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. Výsledkom je neprítomnosť kodónov, ktoré na 5'konci kódujú signálny peptid polypeptidu PRV-1.

Polynukleotid podlá predpokladaného vynálezu môže . byť taktiež fragmentom génu PRV-1. Fragment obyčajne obsahuje viac než 100 nukleotidov, ale výhodne viac ako 300 nukleotidov. Fragmenty môžu byť použité ako priméry, alebo ako sondy hlavne pre PCR; v takom prípade sa môžu fragmenty skrátiť, aby vyhovovali požadovanému účelu. Dĺžka primérov je obyčajne 10 až 30 nukleotidov a sondy majú obyčajne dĺžku 15 až 50 nukleotidov.

Gén PRV-1 je endogénny gén, ktorého expresia u zdravých jedincov sa však obmedzuje na niekolko málo orgánov. Normálne sa exprimuje hlavne v orgánoch hematopoézy, t.j. v kostnej dreni a vo fetálnej pečeni, slabo sa exprimuje v slezine, ale v srdci, vo svaloch pankreasu alebo iadvinách sa neexprimuje. U pacientov trpiacich p. vera sa tento gén veľmi výrazne exprimuje hlavne v hematopoetických bunkách.

Gén PRV-1 kóduje proteín, ktorý má sekvenciu uvedenú na obr. 2. Signálny peptid, ktorý sa nachádza v proteínovej sekvencii všetkých povrchových molekúl a normálne býva odstránený v priebehu upravovania („processing) proteínu v bunke, je oddelený pomlčkou. Proteín tu má sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 2.

Ďalší aspekt predpokladaného vynálezu sa tiež týka v podstate čistého polypeptidu, ktorý má sekvenciu SEQ ID NO: 2, alebo polypeptidu, ktorý má sekvenciu SEQ ID NO: 2, ale chýba mu signálny peptid (t.j. aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2). K'ďalším uskutočneniam vynálezu patria polypeptidy, ktoré obsahujú aminokyseliny 1 až 409, 22 až 409, 1 až 401, alebo 22 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2 (čo sú pravdepodobne aktívne úseky proteínu).

Vzhladom na biologickú aktivitu polypeptid podľa predkladaného vynálezu je výhodne glykozylovaný; najvýhodnejšie je N-glykozylovaný. Môže byť glykozylovaný aspoň na jednej z aminokyselín Asn-46, Asn-189 a Asn-382 polypeptidu PRV-1 (čísla aminokyselín zodpovedajú číslovaniu v sekvencii SEQ ID NO: 2).

Vynález, sa týka aj fragmentov polypeptidu podlá predkladaného vynálezu, ktoré sú N-glykozylované. Fragmenty majú dĺžku aspoň 50 aminokyselín, výhodne aspoň 100 aminokyselín a najvýhodnejšie aspoň 150 aminokyselín. V inom uskutočnení vynálezu je polypeptid O-glykozylovaný.

Odborníkovi je zrejmé, že určité aminokyseliny sa môžu nahradiť inými aminokyselinami, bez toho aby bola poškodená biologická aktivita proteínu. Takéto modifikované formy polypeptidu podľa predkladaného vynálezu sú tiež predmetom predkladaného vynálezu (ide o varianty). V takom prípade náhrady aminokyselín sú také náhrady, ktoré nemajú negatívny účinok na biologickú aktivitu proteínu. Odborník lahko využije známe pravidlá na výber aminokyselín, ktoré budú nahradené.

Polypeptid PRV-1 môže v závislosti od spôsobu prípravy napr. obsahovať tiež glykozylfosfatidilinozitolovú (GPI) kotvu. Tá sa potom naviaže na aminokyseliny, ktoré zodpovedajú aminokyselinám 407 až 409 v sekvencii SEQ ID NO: 2. GPI kotva slúži na ukotvenie proteínu prostredníctvom lipidov na vonkajšej strane bunkovej membrány. Často sa však pozorovalo, že aj proteíny naviazané prostredníctvom GPI sa uvoľňujú do média, avšak doteraz pre tento jav nebolo predložené žiadne vysvetlenie. Tento jav sá nazýva „uvoľňovanie („shedding). Doteraz sa neobjasnilo, či ide o špecifický proces, t.j. či sa proteíny pomocou enzýmov odštepujú z membrány riadeným spôsobom, alebo či ide o nešpecifickú stratu kotvy.

Tiež je velmi pravdepodobné, že PRV-1 sa bude vyskytovať aj na bunkovej membráne, aj extracelulárne . Sekrečná forma, ktorá nie je viazaná na membránu, je pravdepodobne dôležitejšia pre pôsobenie peptidu ako rastového faktora a rastového inhibítora, lebo táto forma je schopná difúzie a tak môže zasahovať iné bunky.

Odborníkovi je zrejmé, že môže ovplyvniť pripojenie proteínu k bunkovej membráne manipuláciou s C-koncovými aminokyselinami. To sa týka hlavne prípravy definovaných DNA konštruktov, ktoré sú určené na expresiu polypeptidu PRV-1, alebo jeho fragmentov. Kodóny, ktoré kódujú tieto aminokyseliny môžu byť mutované, alebo deletované.

Gén kóduje povrchový receptor z rodiny uPAR/Ly6. Táto receptorová rodina prenáša mitogénne signály, t.j. signály ktoré stimulujú delenie buniek. Preto sa predpokladá, že nadmerná expresia génu. PRV-1, okrem iného prispieva k nadmernej proliferácii buniek v kostnej dreni u pacientov s p. vera.

Zistilo sa, že PRV-1 sa neexprimuje na granulocytoch zdravých jedincov alebo pacientov, ktorí majú iné myeloproliferatívne ochorenia, ako je napr. chronická granulocytárna leukémia, akútna granulocytárna leukémia, esenciálna trombocytóza alebo sekundárna erytrocytóza.

Aby sa mohol polypeptid kódovaný génom PRV-1 použiť pre analytické a detekčné metódy, je pohotovo pripravovaný pomocou rekombinantnej DNA, pričom rekombinantná DNA výhodne obsahuje nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 1, alebo aspoň kódujúci úsek génu PRV-1, t.j. nukleotidy 36 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1, alebo v iných prípadoch, aspoň nukleotidy 39 až 1262, alebo 39 až 1238, ktoré sú funkčne spojené s promótorom. Avšak rekombinantná DNA môže tiež obsahovať iba fragment sekvencie SEQ ID NO: 1.

Vynález sa ďalej týka vektora, ktorý obsahuje rekombinantnú DNA pre polypeptid PRV-1, alebo jeho fragment a hostiteľskej bunky, ktorá je transfekované, alebo transformovaná týmto vektorom. Hostiteľské bunky sú prokaryotické, ako napr. baktérie ako je E. coli. Avšak v takomto prípade exprimované polypeptidy sa neglykozyluj ú. Výhodné sú preto eukaryotické hostiteľské bunky, ktoré sú schopné potranslačne glykozylovať exprimovaný proteín a prípadne ho aj iným spôsobom modifikovať. K príkladom eukaryotických hostiteľských buniek patria hmyzie bunky, ako napr. Sf9 bunky, pre expresiu, ku ktorej dochádza po infekcii rekombinantnými bakulovírusmi, a bunky cicavcov, ako napr. 293 bunky, COS bunky, CHO bunky a HeLa bunky. Tieto príklady však rozsah vynálezu nijako neobmedzujú. Aj bunky kvasiniek sa môžu využiť ako hostiteľské bunky. Odborníkovi je zrejmé, že glykozylizačný profil sa môže líšiť v závislosti od typu hostiteľských buniek. Preto môže byť biologická aktivita výsledného produktu rôzna. Zvlášť výhodné sú hostiteľské bunky, ktoré glykozylyjú exprimovaný produkt takým spôsobom, ktorý zachová biologickú aktivitu proteínu.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu prípravy polypeptidu podľa predkladaného vynálezu. Tento spôsob spočíva v tom, že DNA, ktorá kóduje polypeptid podlá vynálezu, sa exprimuje v hostiteľskej bunke. Kultivačné médium, alebo bunky sa potom použijú na nasledovnú izoláciu polypeptidu v závislosti od toho, či exprimovaný polypeptid je sekretovaný hostiteľskými bunkami do kultivačného média, alebo či zostáva v bunke. Potom, podľa predkladaného vynálezu, sa polypeptid koncentruje a/alebo purifikuje postupmi, ktoré sú známe zo stavu techniky, napr. chromatografickými metódami. Metódy purifikácie boli popísané napr. v publikácii Scopes, R., Protein purification: Principles and Practice (3rd edition), Springer Verlag(1994). Jedným z výhodných uskutočnení vynálezu je spôsob, ktorý obsahuje krok, kedy je glykozylovaný polypeptid koncentrovaný a/alebo purifikovaný. Tento krok môže prebehnúť predtým, než sa polypeptid podľa predkladaného vynálezu v podstate purifikuje, alebo potom, čo sa už v podstate purifikoval. V tomto druhom prípade sa separuje a izoluje glykozylovaná časť purifikovaného polypeptidu. V najvýhodnejšom uskutočnení spôsobu podľa predkladaného vynálezu sa špecificky izoluje N-glykozylovaný polypeptid. V inom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sa izoluje polypeptid, ktorý je glykozylovaný na aspoň jednej z aminokyselín Asn-46, Asn-189 a Asn-382 zo sekvencie SEQ ID NO: 2.

Polypeptid PRV-1, ktorý sa izoloval z granulocytov alebo sa pripravil rekombinantným spôsobom, môže byť využitý ako na diagnostiku polycythemia vera, tak aj na liečení tejto choroby. Jednou z terapeutických možností je tzv. „antisense terapia. Pri tomto liečení sa využíva molekula antisense RNA, čo je RNA, ktorá je· komplementárna k PRV RNA. Nakoľko PRV-1 RNA má na svojom začiatku sekvenciu 5'-AAAAGCAGAAAGAGATTACCAGCC-3'(sekvencia SEQ ID NO: 3), príslušná „antisense RNA namierená proti tejto sekvencii by mala mať nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu: 5'-GGCTGGTAATCTCTTTCTGCTTTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 4). Antisense RNA sa vloží do vektora a vnesie do buniek s p. vera. Táto

RNA sa napr. vnesie transfekciou, prostredníctvom vektora na transfekciu, kde vektor je výhodne tak konfigurovaný, aby špecificky vstupoval do buniek s p. vera. Expresia antisense RNA vedie k tomu, že PRV-1 mRNA sa ďalej netranslatu j e do polypeptidu. Bunky ktoré sa liečia týmto spôsobom potom nevytvárajú proteín PRVÍ.

Vynález sa taktiež týka spôsobu detekcie p. vera, ktorý spočíva v tom, že sa deteguje polypeptid PRV-1, alebo jeho epitop a stanoví sa rozsah jeho expresie.

Nadmerná expresia („overexpression) tohto receptoru na zrelých bunkách mimo kostnej drene, napr. na granulocytoch, je silnou indikáciou prítomnosti choroby p. vera. Nadmerná expresia sa pohotovo deteguje pomocou imunotestu s využitím protilátok, ktoré sú namierené proti PRV-1 receptoru. K vhodným testovacím metódam patria odborníkom známe varianty imunotestov, kde sa využívajú protilátky špecifické pre polypeptid PRV-1 spoločne s ďalšími značenými protilátkami, ktoré sú buď imobilizované, alebo sú v roztoku.

Značenie sa robí odborníkom známymi metódami, napr. pomocou rádioaktívnych izotopov, využitím fluoroscencie, alebo luminiscencie, využitím enzýmov, pomocou reakcií vytvárajúcich farebný produkt, alebo využitím iných skupín, ktoré sú vhodné na detekciu. Tieto varianty odborníci dobre poznajú a netreba ich tu podrobne vysvetľovať. Pre predkladaný vynález je zvlášť výhodný test ELISA.

Protilátky, ktoré sú potrebné na špecifickú detekciu PRV-1 receptora sa pripravujú spôsobmi, ktoré odborníci poznajú. Pre realizáciu predkladaného vynálezu sú vhodné monoklonové, aj polyklonové protilátky, pričom výhodnejšie sú monoklonové protilátky.

Na prípravu protilátok môžu byť využité aj peptidy získané z proteínu. Podľa predkladaného vynálezu sa dosiahol úspech s peptidmi, ktoré majú sekvenciu:

a) KVSDLPRQWTPKN (aminokyseliny 34 až 46) [sekvencia SEQ ID

NO: 5], a

b) SAREKRDVQPPASQH (aminokyseliny 391 až 405) [sekvencia SEQ

ID NO: 6].

Polyklonové protilátky sa normálne pripravujú imunizáciou vhodného príjemcu (napr. králika) polypeptidom PRV-1, ktorý sa v prípade potreby naviaže na imunologický nosič (adjuvans), a ktorý vyvolá imunitnú reakciu. Monoklonové protilátky sa pripravujú technikami hybridómov, ktoré sú odborníkom známe. Protilátky sa purifikujú pomocou afinitnej purifikácie. Príprava a purifikácia' protilátok boli popísané v odborných publikáciách, napr. v Antibodies: A Laboratory Manual, Halow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Naviac takéto polyklonové, alebo monoklonové protilátky, ktoré sú namierené proti PRV-1, sa môžu využiť aj na liečbu ochorenia.

V inom uskutočnení vynálezu sa môže PRV-1 receptor detegovať pomocou metódy RT-PCR. Pri tejto metóde sa najskôr izoluje RNA z buniek, ktoré exprimujú PRV-1, obyčajne sú to granulocyty. Reverzná transkripcia sa uskutočňuje spôsobom, ktorý odborníci poznajú, a to použitím tzv. RT priméru. RT primér je výhodný primér ktorý má nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu (sekvencia SEQ ID NO: 7):

ATTAGGTTATGAGGTCAGAGGGAGGTT.

Týmto spôsobom sa PRV-1 RNA špecificky prepíše do DNA. Táto DNA sa potom amplifikuje v reakcii PCR spôsobom, ktorý je odborníkom známy. Pre amplifikačné cykly sa výhodne použijú nasledujúce priméry, a to ako sense primér (sekvencia SEQ ID NO: 8):

GCAGAAAGAGATTACCAGCCACAGACGG.

A ako antisense primér (sekvencia SEQ ID NO: 9):

GAATCGTGGGGGTAATAGAGTTAGCAGG.

Odborník je schopný okamžite a lahko využiť sekvenciu predkladaného vynálezu na to, aby našiel sekvenciu pre iné priméry, ktoré budú tiež vhodné na realizáciu vynálezu.

Nakoľko ako východiskový materiál sa v tomto postupe používa RNA, PCR signál je pozitívny iba vtedy, keď sa exprimuje gén PRV-1. Ako sa už vyššie vysvetlilo, je to iba v prípade, že pacient má ochorenie p. vera. V granulocytoch zdravých jedincov sa PRV neexprímuje. Taktiež neprítomnosť RT-PCR signálu znamená neprítomnosť p. vera. Metóda RT-PCR sa s výhodou uskutočňuje s použitím TagMan® technológie. Kvantifikácia vyžaduje použiť k primérom ešte jednu sondu. Výhodná sekvencia sondy je nasledujúca (sekvencia SEQ ID NO: 10):

5'-TTCTTGTTGAACCACACCAGACAAATCGG-3'

Kvantitatívna RT-PCR na detekciu transkriptu PRV-1 je preto tiež predmetom predkladaného vynálezu.

Inou alternatívou diagnostiky p. vera je použitie metódy prenosu otlačkov („blotting) a hybridizácie, výhodne metódy Northern prenosu („Northern blotting). Pri tejto metóde sa z granulocytov izoluje RNA a potom sa vyšetruje na expresiu PRV-1 metódou prenosu otlačkov, napr. metódou severného prenosu otlačkov (Northern blotting). Ako sonda sa môže použiť cDNA sekvencia, ktorá má sekvenciu SEQ ID NO: 1, alebo segment z tejto sekvencie. K hybridizácii so sondou môže dôjsť iba v takom prípade, keď granulocyty pochádzali od pacienta chorého na p. vera, lebo iba v takom prípade je nejaká expresia v granulocytoch. Absencia hybridizácie indikuje, že jedinec, z ktorého pochádzali testované granulocyty, nemá ochorenie p.

vera.

Pre hybridizáciu severných otlačkov (Northern blot hybridisation) je možné použiť aj fragmenty génu. Takéto fragmenty sú obyčajne dlhšie ako 100 báz, s výhodou sú dlhšie ako 300 báz. Alternatívne, naštiepením génu pomocou reštrikčných endonukleáz sa môžu pripraviť rôzne fragmenty génu, ktoré sa použijú ako sondy pre severný prenos otlačkov (Northern blot). Pokial fragmenty pochádzajú z cDNA, sú vo forme dvojreťazca a pre hybridizáciu musia byť separované na jednotlivé reťazce. K vhodným príkladom patrí fragment BamHI-PstI, ktorý obsahuje 420 až 831 párov báz, alebo fragment Psrl-Pstl, ktorý obsahuje 831 až 1900 párov báz.

PRV-1 mRNA, a teda aj expresia PRV-1, sa môže detegovať v RT-PCR najprv reverznou transkripciou mRNA a potom amplifikáciou cDNA a amplifikovanú DNA potom detegovať sondou metódou hybridizácie.

V prípade pozitívnej diagnózy treba ochorenie liečiť, inak v krátkom čase končí smrťou. Na liečbu je možné použiť špecifické protilátky, ktoré sú namierené proti PRV-1, na ktoré v prípade potreby môže byť naviazaná cytotoxická zložka.

Vynález sa ďalej týka aj lieku, ktorý okrem obvyklých vehikúl obsahuje protilátky, ktoré sú namierené proti receptoru PRV-1.

Keďže pri p. vera sa receptor PRV-1 nadmerne exprimuje, mnohé protilátky, keď sa dostanú do kontaktu s protilátkou anti-PRV-1, sa naviažu na povrch postihnutých granulocytov. Naviazanie množstva protilátok na tieto bunky stimuluje imunologické bunky k likvidácii týchto granulocytov. Takýmto spôsobom je možné špecificky eliminovať bunky p. vera.

S prekvapením sa tiež zistilo, že polypeptid PRV-1 vykazuje hematopoetickú aktivitu. Polypeptid PRV-1 je schopný stimulovať určité hematopoetické prekurzorové bunky k tvorbe erytroidných kolónií. Ide najmä o N-glykozylovaný polypeptid PRV-1, ktorý prejavuje túto funkciu. Polypeptidy podlá predkladaného vynálezu, ktoré sú preto výhodné, sú teda N-glykozylované polypeptidy PRV-1 a ich fragmenty, ktoré vykazujú aktivitu rastového faktora.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa teda týka lieku, ktorý okrem farmaceutický tolerovaných vehikúl, obsahuje polypeptid PRV-1, alebo jeho biologicky aktívny fragment. Polypeptid PRV-1 je výhodne glykozylovaný polypeptid, výhodnejšie N-glykozylovaný polypeptid PRV-1, alebo jeho biologicky aktívny fragment. Vynález sa týka aj liečiv, ktoré obsahujú aspoň jeden polynukleotid podľa predkladaného vynálezu.

Predkladaný vynález sa ďalej týka použitia polypeptidu PRV-1, alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu, alebo jeho biologicky aktívneho variantu ako rastového faktora in vivo a ex vivo. Polypeptid PRV-1, alebo jeho biologicky aktívny fragment, alebo jeho biologicky aktívny variant môže byť použitý pri všetkých typoch pancytopénií a pancytopatií kostnej drene a krvného obehu (hlavne bunkových zložiek periférnej krvi a kostnej drene). Polypeptidy podľa predkladaného vynálezu sa použijú napr. pri liečbe anémií, v prípadoch zlyhania ľadvín, chemoterapie alebo ožarovania celého tela, pri liečení neutropénií a trombocytopénií počas chemoterapie alebo ožarovania celého tela, pre ex vivo ošetrenie buniek periférnej krvi, alebo kmeňových buniek kostnej drene pre expanziu (multiplikáciu) a retransfúz'iu pacientovi, a tiež pri liečení sepsy, syndrómu systémovej zápalovej reakcie (SIRS), alebo pri lokálnych zápalových reakciách. Polypeptidy podľa predkladaného vynálezu, alebo lieky, ktoré ich obsahujú sa môžu podávať rôznymi spôsobmi. K vhodným spôsobom podávania patria napr. intravenózne, intramuskulárne,· subkutánne, intraperitoneálne, perorálne, transdermálne a transmukozálne.

Polynukleotidy podľa predkladaného vynálezu môžu byť tiež použité pri liečbe pancytopénií a pancytopatií. V takom prípade cielom je exprimovať polypeptid PRV-1 alebo jeho funkčný frag13 ment v bunkách postihnutého pacienta. V tejto súvislosti sa predovšetkým a najčastejšie používajú metódy génovej terapie. Bunky môžu byť izolované z pacienta a transfekované polynukleotidom podľa prekladaného vynálezu (manipulácia ex vivo), a potom zase vrátené pacientovi. Je možné si tiež predstaviť metódu, keď polynukleotidy podlá predkladaného vynálezu budú zavedené prostredníctvom vírusových buniek do cieľových buniek. Expresia vložených nukleových kyselín potom bude viesť k hematopoetickej aktivite.

Prekvapujúco bolo tiež zistené, že pri vyšších koncentráciách má polypeptid PRV-1 inhibičný účinok na rast buniek. Tak napr. sa pozorovalo, že pridaním zvýšeného množstva proteínu PRV-1 sa skutočne úplne zastavilo vytváranie kolónií erytroidných buniek a granulocytov/monocytov. Tento účinok pripomína pôsobenie interf erónu-α, ktorý sa okrem iného terapeuticky využíva pri liečbe chronickej myeloidnej leukémie (CML) a p. vera. Endogénna inhibičná látka má veľkú výhodu v porovnaní s chemickými cytostatikami, ako je napr. hydroxymočovina, ktorá sa používala, kým nebol dostupný interferón-α a do určitej miery sa používa dodnes. Nevýhodou interferónu-α je že táto účinná látka má veľmi silné vedľajšie účinky. Pacienti sa cítia ako keby mali chrípku. Predkladaný vynález tak poskytuje látku, ktorá inhibuje hematopoézu a inhibičný účinok závisí od jej koncentrácie.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa preto týka použitia polypeptidu PRV-1, ako je opísaný v tejto prihláške, na inhibíciu rastu buniek, hlavne jeho použitia ako cytostatika. Výhodne sa polypeptid podlá vynálezu používa na inhibíciu rastu hematopoetických buniek. Vynález sa tiež týka použitia polypeptidu podľa predkladaného vynálezu na výrobu liekov na liečbu proliferatívnych ochorení. K takýmto ochoreniam patria hlavne myeloproliferatívne ochorenia, p. vera, esenciálna trombocytémia, myelofibróza, CML a tiež leukémia, lymfómy a pevné nádory.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka použitia polynukleotidu, ako je opísaný v tejto prihláške, jeho biologicky aktívneho fragmentu alebo jeho biologicky aktívneho variantu, na inhibíciu rastu buniek. Polynukleotid môže byť vložený do vhodného vektora a transfekovaný do vhodnej cieľovej bunky. Po tom, čo sa polypeptid PRV-1, alebo jeho biologicky aktívny fragment alebo jeho biologicky aktívny variant exprimoval vo vhodnej koncentrácii, dostaví sa účinok inhibujúci rast. Podobne, polynukleotid sa môže vložiť do vírusového vektora, ktorým sú potom infikované vhodné cieľové bunky, čo vedie ku expresii PRV-1. Vynález sa tiež týka použitia nukleotidu podľa vynálezu na výrobu liekov na liečbu proliferatívnych ochorení, ako sú napr. .myeloproliferatívne ochorenia, p. vera, esenciálna trombocytémia, myelofibróza, CML a tiež leukémia, lymfómy a pevné nádory.

Vynález sa tiež týka súpravy (kitu) na detekciu buď polycythemia vera, alebo ochorenia hematopoetického systému. Súpravy podlá predkladaného vynálezu obsahujú polynukleotid podľa vynálezu a/alebo polypeptid podľa vynálezu a/alebo jednu alebo viac protilátok podľa vynálezu. Naviac tieto súpravy môžu obsahovať nádobu, alebo prípravky vhodné na uskutočňovanie detekčných reakcií. K príkladom takýchto prípravkov patria pufrovacie roztoky, reagencie na blokovanie membrán, hybridizačné roztoky, sekundárne protilátky, roztoky substrátu na detekčné reakcie atď. Súprava podlá vynálezu sa s výhodou používa na uskutočňovanie reakcií typu PCR, RT-PCR, severných otlačkov (Northern blots), západných otlačkov (Western blots), ELISA, RIA alebo podobných reakcií.

Nasledujúce príklady slúžia na podrobnejšie vysvetlenie predkladaného vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Charakterizácia génu PRV

Na charakterizovanie génu PRV sa urobili nasledujúce experimenty :

Na izoláciu granulocytov z uskladnenej krvi alebo z čerstvej krvi, ktorá bola odobratá pacientom s p. vera sa použil nasledujúci postup:

- ku krvi sa pridal rovnaký objem 3% roztoku dextránu v 0,9% NaCl a zmes sa nechala stáť 20 minút pri izbovej teplote (RT),

- zmes sa rozdelila na dve fázy. Horná, slabo zafarbená fáza sa odstránila 10 minútovou centrifugáciou pri 1800 g, pri izbovej teplote,

- supernatant sa odstránil a bunkový pelet sa resuspendoval v rovnakom objeme 0,9% NaCl,

- v každom prípade sa 35 ml buniek v NaCl navrstvilo na 15 ml Ficoll-Hypaque,

- bunky na vrstve Ficoll-Hypaque sa potom 60 minút bez brzdenia centrifugovali pri 1800 g, pri izbovej teplote,

- tak vzniklo rozvrstvenie na bunkový pelet a dve vrstvy s medzifázou,

- vrstvy a medzifázy sa odsali, bunkový pelet sa 30 sekúnd resuspendoval v 10 ml ľadového 0,2% NaCl a hneď po 30 sekundách sa pridal 1,6% NaCl,

- bunky sa 10 minút centrifugovali pri 1800 g, pri izbovej teplote,

- potom ' sa raz premyli v 10 ml PBS a znova sa centrifugovali,

- bunkový pelet obsahoval 95 až 99% čistých granulocytov,

- z týchto buniek sa štandardnými metódami izolovala RNA,

- 10 mg tejto RNA sa potom testovalo na expresiu PRV-1 metódou Northern blot . Celá cDNA šekvencia, tu uvedená ako SEQ ID NO: 1, sa použila ako sonda.

Tento experiment sa robil na vzorkách 39 pacientov s p. vera a na 29 kontrolných vzorkách z uskladnenej krvi. Zistilo sa, že na vzorkách u pacientov s p. vera sonda PRV-1 silne hybridizovala. Nepozorovala sa žiadna hybridizácia v kontrolných vzorkách zdravých jedincov.

Príklad 2

PRV-1 prejavuje aktivitu rastového faktora

13. deň po fertilizácii sa vybrali embryá z pregnantných myší. Z nich sa odobrala fetálna pečeň. Bunky, ktoré sa v nej nachádzali .sa zafarbili pomocou protilátok a pomocou chromatografie na kolóne boli obohatené o bunky konkrétneho bunkového typu, a naopak zbavené buniek iných typov. Tak sa získala zmes obohatená o určité hematopoetické prekurzorové bunky (erytroidná progenitorová/prekurzorová bunka vytvárajúca kolónie, CFU-E). Takže kým CFU-E predstavujú asi 2% fetálnej pečene, obohatená zmes obsahovala 30 až 40% buniek CFU-E.

Bunky CFU-E sa transfekovali pomocou retrovírusu. Zbalovacia bunková línia, označená 293-T, sa transfekovala 48 h. vopred. Bunky 293-T boli bunky používanej bunkovej línie humánnych embryonálnych, ladvín. Bunky 293-T boli stabilne transfekované niekolkými génmi z retrovírusu. Ak sa teraz tieto bunky 293-T transfekovali dvoma plazmidmi označenými pOS a pKAT, potom bunky 293-T produkovali retrovírus, ktorý bol schopný infikovať bunky myšej fetálnej pečene. Ak sa tieto bunky 293-T transfekovali prázdnym vektorom pOS a pKAT, bol produkovaný retrovírus divého typu, ktorý exprimoval iba retrovírusové proteíny. Na druhej strane, klonovanie humánneho génu, napr. PRV-1, do vektora pOS, vedie k produkcii retrovírusu, ktorý exprimuje tento proteín po infekcii buniek. Bunky 293—T sekretovali retovírus do kultivačného média.

Po dvoch dňoch sa bunkové kultivačné médium z transfekovaných buniek 293-T, ktoré obsahujú retrovírus, zozbieralo (harvestovalo) a raz prefiltrovalo cez 0,45 gm filter. Na transfekciu fetálnych pečeňových buniek sa tieto bunky zmiešali s prefiltrovaným bunkovým kultivačným médiom, ktoré obsahovalo retrovírus a centrifugovali sa 2 hodiny pri 1800 rpm a 20 °C v prítomnosti pridaného činidla Polybren. Transfekované fetálne pečeňové bunky sa potom kultivovali v médiu (Methodcult, od firmy Celí Systems), ktoré obsahovalo okrem obvyklých solí a aminokyselín fetálne teľacie sérum, 0,0001 až 0,4’ IU erytropoetínu (EPO)/ml a metylcelulózu (8,8%). Na tvorbu hematopoetických kolónií bunky CFU-E potrebujú EPO. Metylcelulóza stužuje médium do gélovej podoby, a tým fixuje jednotlivé bunky v tomto géli, takže sa nemôžu pohybovať na rozdiel od tekutého média. Možno tiež sledovať, či sa z jednotlivých buniek vytvárajú alebo nevytvárajú hematopoetické kolónie. CFU-E tvorili erytroidné kolónie, t.j. kolónie, ktoré obsahujú červené krvinky a ich prekurzorové bunky.

Po troch dňoch sa spočítali vytvorené hematopoetické kolónie. Pritom sa porovnávali rôzne zmesi. Všetky zmesi neboli vyšetrované vo všetkých experimentoch, zmesi 1 až 3 boli velmi podobné kontroly a každá z nich bola individuálne porovnaná so zmesou 4.

Zmes 1: Bunky, ktoré neboli transfekované retrovírusom;

Zmes 2: Bunky,· ktoré boli transf ekované prázdnym vektorom pOS;

Zmes 3: Bunky, ktoré boli transfekované génom GFP pre zelený fluoreskujúci proteín („green fluorescent proteín), t.j. proteín, ktorý nie je hematopoeticky účinný,

Zmes 4: Bunky, ktoré boli transfekované pOSPRV-1 (vektor + gén podlá predkladaného vynálezu).

Tabulka 1: zhŕňa výsledky získané v troch vyššie opísaných experimentoch. Čísla udávajú množstvo vytvorených kolónií pre každú možnosť.

	Zmes 1	Zmes 2	Zmes 3	Zmes 4
	Netransfekované	Prázdny vektor (pOS)	GFP (pOS-GFP)	PRV-1 (pOS-PRV-1)
Experiment 1	116	156	80	326
Experiment 2		271	273	410
Experiment 3	120		131	291

Experiment ukázal, že bunky CEU-E, ktoré boli transfekované PRV-1 vytvárajú omnoho viac kolónií (až trikrát viac) ako rôzne kontrolné bunky. Výsledok ukazuje, že PRV-1 je rastovým faktorom pre CFU-E.

Príklad 3

Rozpustnosť rastového faktora PRV-1

Ďalší experiment sa uskutočnil na dôkaz toho, či je PRV-1 rozpustný rastový faktor, alebo či je potrebný kontakt medzi bunkami (kontakt bunka-bunka). V zbalovacej bunkovej línii 293-T po transfekcii vektormi pOS a PKAT sa neprodukoval iba retrovírus. Bunky 293-T tiež syntetizovali proteín kódovaný génom klonovaným do pOS, t.j. v danom prípade génom PRV-1. Ak je génovým produktom rozpustný proteín, je vylučovaný do média, v ktorom je zbalovacia bunková línia 293-T. Ak sú bunky 293-T transfekované iba vektorom pOS bez vektora pKAT, žiaden retrovírus sa nevytvára. Potom bunkové kultivačné médium obsahuje iba rozpustný proteín produkovaný bunkami. Médium, ktoré pochádza z kultivácie buniek transfekovaných pOS-PRV-1 a neobsahuje retrovírus, sa zmieša s CEU-E a zmes sa nanesie na metylcelulózové médium, potom sa spočítajú vzniknuté kolónie.

V tomto pokuse boli získané nasledujúce výsledky:

Tabulka 2: Rozpustnosť PRV-1. Uvádzané čísla predstavujú množstvo kolónií.

	Zmes 1	Zmes 2	Zmes 3	Zmes 4
	Netransfekované	Prázdny vektor (pOS)	GFP (pOS-GFP)	PRV-1 (pOS-PRV-1)
Experiment 4		137	187	557

V tomto experimente bunky CFU-E, ktoré boli ošetrené médiom, ktoré obsahovalo PRV-1 vytvárali omnoho viac hematopoetických kolónií ako kontrolné bunky. Z tohto výsledku možno usudzovať, že PRV-1 je rozpustný rastový faktor.

Príklad 4

PRV-1 má tiež inhibičný, cytostatický účinok

Experiment sa uskutočnil na bunkách periférnej krvi. Keďže u zdravých jedincov cirkuluje malé množstvo prekurzorových buniek aj v periférnej krvi, vo vhodnom médiu (s metylcelulózou) sa dajú vykultivovať hematopoetické kolónie z buniek periférnej krvi. Zdravým darcom sa odobralo 40 ml krvi z periférnej žily (pričom ako antikoagulačné činidlo bol použitý heparín alebo EDTA). Ku krvi sa pridalo 15 ml Ficoll/Hypaque a táto zmes sa 40 minút bez brzdenia centrifugovala pri 1600 rpm. Výsledkom bol hustotný gradient, ktorý frakcionoval krv na bunkové zložky. Po centrifugácii sa v medzifáze medzi sérom a Ficollom nachádzali bunky nazývané mononukleárne bunky, sem patria aj kmeňové bunky. Táto medzifáza sa odobrala a premyla v PBS (izotonický roztok soli). Tak sa získali purifikované mononukleárne bunky, z nich asi 0,1% tvorili hematopoetické kmeňové bunky.

Mononukleárne bunky sa preniesli do obohateného média (IMDM), ktoré obsahovalo prídavok 3% FCS (fetálneho teľacieho séra). Toto médium 3% FCS/IMDM bolo potom modifikované, t.j. bolo použité s, alebo bez pridania PRV-1.

Mononukleárne bunky v IMDM s hustotou 7x 10⁵ buniek/ml sa pridali ku komerčne dostupnému médiu od firmy Stem Cells Technologies (Methocult) , ktoré obsahovalo IMDM a 30% FCS, 1% BSA (hovädzí sérový albumín), merkaptoetanol, 2 mM L-glutamín, 3UI EPO (erytropoetin)/ml a 1,0% metylcelulózy. V tomto médiu bunky rástli 14 dní. Z niekolkých kmeňových buniek, ktoré sa nachádzali v tejto zmesi sa vyvinuli hematopoetické kolónie. Zvyčajne sa na každých 7 x 10⁵ sa vyvinulo 100 až 200 hematopoetických kolónii.

Skonštruovala sa tiež bunková línia, ktorá exprimovala veľmi vysoké množstvo PRV-1. PRV-1, ktorý bol produkovaný týmito bunkami sa tak zmenil, že už neobsahoval lipidovú kotvu. Produkt expresie sa skladal z aminokyselín 1 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2, teda chýbali aminokyseliny 402 až 437. Takto zmenený PRV1 sa preto, na rozdiel od PRV-1 divého typu, neinkorporuj e lipidovou kotvou do bunkovej membrány, ale sa úplné vylúči z bunky. Rovnako ako v príklade 3 sa bunková línia skladala z buniek 293, tieto neprodukovali žiaden retrovirus, ale exprimovali proteín (PRV-1).

Na testy.hematopoetických kolónií sa preniesli mononukleárne krvné bunky do média IMDM, ktoré sa inkubovalo 48 hodín s netransfekovanými bunkami (293), alebo do média, ktoré sa inkubovalo 48 hodín s bunkami ktoré exprimovali zmenený PRV-1 (označené „293-GPI-less-PRV-l). Potom sa sledovala schopnosť týchto buniek tvoriť hematopoetické kolónie. Po 14 dňoch sa spočítalo množstvo kolónií erytroidných (červených) a myeloidných (bielych) krvných buniek. Experiment sa zopakoval trikrát a robil sa v rôznych dňoch s rôznymi darcami krvi. Opakovania boli vyhodnotené v rámci tohto pokusu. Boli získané nasledujúce výsledky:

Experiment 1

Bunkový

Darca 1

Darca 2

supernatant
	Červené kolónie	Biele kolónie	Červené kolónie	Biele kolónie
293	248/221	70/14	127/161	25/66
293-GPI- -less-PRV-1	7/3	0/0	31/19	0/0

Experiment 2

Bunkový	Darca 1	Darca 2
supernatant
	Červené kolónie	Biele kolónie	Červené kolónie	Biele kolónie
293	99/91	20/19	49/33	8/1
293-GPI- -less-PRV-1	0/0	0/0	4/0	0/0

Experiment 3

Bunkový	Darca 1	Darca 2
supernatant
	Červené kolónie	Biele kolónie	Červené kolónie	Biele kolónie
293	107/207	22/30	24/32	5/8
293-GPI- -less-PRV-1	4/3	0/6	0/1	3/0

Z týchto údajov možno usudzovať, že dávka PRV-1, vyššia ako dávka použitá v príklade 3, prejavuje cytostatický účinok.

Príklad 5

Rastový faktor PRV-1 je glykolyzovaný

Od pacientov, ktorý mali ochorenie p. vera boli izolované granulocyty a z týchto buniek sa štandardnými postupmi pripravili proteínové extrakty. Proteínové extrakty sa ďalej spracovali podľa protokolu pre súpravu „N-Glycoidase F

Deglycosylation Kit od firmy Boehringer Mannheim. To znamená, že „denaturačný pufor zo súpravy sa pridal k proteínovým extraktom a zmesi sa potom zohriali na 95°C na 3 minúty a potom sa použil alebo „reakčný pufor” alebo „reakčný pufor” s N-glykozidázou. Každá zmes sa cez noc inkubovala pri 37°C a proteíny sa potom analyzovali PAGE gélovou elektroforézou, po ktorej nasledoval Western blot. Proteín PRV-1 sa detegoval pomocou protilátky namierenej proti proteínu, ktorý mal sekvenciu SEQ ID NO: 5. Výsledky ukázali, že kým proteín PRV-1, ktorý bol purifikovaný z granulocytov, má veľkosť 60 až 65 kDa, po naštiepení N-glykozidázou má veľkosť iba 40 kDa. Toto jasne dokazuje, že PRV-1 je glykozylovaný na asparagínovom zvyšku (asparagín = N).

Zoznam sekvencií <110> Univerzitná klinika Freiburg <120> ^G®n ^a použitie <130> E980930 <140> PCT/EP00/09594 <141> 2000-09-29 <150> DE 199 47 010.3 <151> 1999-09-30 <160> 10 <170> PADAŤ Sequenzmodul, Version 1.0 <210> 1 <211> 1600 <212> DNA <213> homo sapiens <220>

<223>

<400> 1

aaaagcagaa	agagattacc	agccacagac	gggtcatgag	cgcggtatta	ctgctggccc	60
tcctggggtt	catcctccca	ctgccaggag	tgcaggcgct	gctctgccag	tttgggacag	120
ttcagcatgt	gtggaaggtg	tccgacctgc	cccggcaatg	gacccctaag	aacaccagct	180
gcgacagcgg	cttggggtgc	caggacacgt	tgatgctcat	tgagagcgga	ccccaagtga	240
gcctggtgct	ctccaagggc	tgcacggagg	ccaaggacca	ggagccccgc	gtcactgagc	300
accggatggg	ccccggcctc	tccctgatct	cctacacctt	cgtgtgccgc	caggaggact	360
tctgcaacaa	cctcgttaac	tccctcccgc	tttgggcccc	acagccccca	gcagacccag	420
gatecttgag	gtgcccagtc	tgcttgtcta	tggaaggctg	tctggagggg	acaacagaag	480
agatctgccc	caaggggacc	acacactgtt	atgatggcct	cctcaggctc	aggggaggag	540
gcatcttctc	caatctgaga	gtccagggat	gcatgcccca	gccaggttgc	aacctgctca	600
atgggacaca	ggaaattggg	cccgtgggta	tgactgagaa	ctgcaatagg	aaagattttc	660
tgacctgtca	tcgggggacc	accattatga	cacacggaaa	cttggctcaa	gaacccactg	720
attggaccac	atcgaatacc	gagatgtgcg	aggtggggca	ggtgtgtcag	gagacgctgr	780
tgctcataga	tgtaggactc	aca tcaaccc	tggtggggac	aaaaggctgc	agcactgttg	840

gggctcaaaa	ttcccagaag	accaccatcc	actcagcccc	tcctggggtg	cttgtggcct	900
cctataccca	cttctgctcc	tcggacctgt	gcaatagtgc	cagcagcagc	agcgttctgc	960
tgaactccct	ccctcctcaa	gctgcccctg	tcccaggaga	ccggcagtgt	cctacctgtg	1020
tgcagcccct	tggaacctgt	tcaagtggct	ccccccgaat	gacctgcccc	aggggcgcca	1080
ctcattgtta	tgatgggtac	a ttcatctct	caggaggtgg	gctgtccacc	aaaatgagca	114 0
ttcagggctg	cgtggcccaa	ccttccagct	tcttgttgaa	ccacaccaga	caaatcggga	1200
tcttctctgc	gcgtgagaag	cgtgatgtgc	agcctcctgc	ctctcagcat	gagggaggtg	1260
gggctgaggg	cctggagtct	ctcacttggg	gggtggggct	ggcactggcc	ccagcgctgt	1320
ggtggggagt	ggtttgccct	tcctgctaac	tctattaccc	ccacgattct	tcaccgctgc	1380
tgaccaccca	cactcaacct	cccCctgacc	tcataaccta	atggccttgg	acaccaga 11	1440
ctttcccatt	ctgtccatga	atcatcttcc	ccacacacaa	tcattcatat	ctactcacct	1500
aacagcaaca	ctggggagag	cctggagcat	ccggacttgc	cctatgggag	aggggacgct	1560
ggaggagtgg	ctgcatgtat	ctgataatac	agaccctgtc			1600

<210	2
<211>	437
<212>	PRT
<213>	homo
<400	2

Met 1

Ser

Ala Val Leu 5

Leu

Ala

Leu

Leu 10

Gly

Phe

íle

Leu

Pro 15

Leu

Pro

Gly

Val

Gľn

Ala

Leu

Cys

Gin

Phe

Gly

Thr

Val

Gin

His

Val

20

25

30

Trp

Lys

Val

Ser

Asp

Leu

Pro

Arg

Gin

Trp

Thr

Pro

Lys

Asn

Thr

Ser

35

40

45

cys

Asp

Ser

Gly

Leu

Gly

Cys

Gin

Asp

Thr

Leu

Met

Leu

íle

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Pro

Gin

Val

Ser

Leu

Val

Leu

Ser

Lys

Gly

cys

Thr

Glu

Ala

Lys

65

70

75

80

Asp

Gin

Glu

Pro

Arg

Val

Thr

Glu

His

Arg

Met

Gly

Pro

Gly

Leu

Ser

85

90

95

Leu

íle

Ser

Tyr

Thr

Phe

Val

Cys

Arg

Gin

Glu

Asp

Phe

Cys

Asn

100

105

110

Leu

Val

Asn

Ser

Leu

Pro

Leu

Trp

Ala

Pro

Gin

Pro

Ala

Aa p

Pre

115

120

125

Gly

Ser

Leu

Arg

Cys

Pro

Val

Cys

Leu

Ser

Met

Glu

Gly

Cys

Leu

Glu

130

135

140

Gly

Thr

Glu

íle

Cys

Pro

Lys

Gly

Thr

His

cys

Tyr

Asp

145

150

155

160

Gly

Leu

Arg

Leu

Arg

Gly

íle

Phe

Ser

Asn

Leu

Arg

Val

165

170

175

Gin

Gly Cys

Met 180

Pro

Gin

Pro

Gly

Cys 185

Asn

Leu

Asn

Gly 190

Thr

Gin

Glu

íle

Gly

Pro

Val

Gly

Met

Thr

Glu

Asn

Cys

Asn

Arg

Lys

Asp

Phe

195

200

205

Leu

Thr

Cys

His

Arg

Gly

Thr

íle

Met

Thr

His

Gly

Asn

Leu

Ala

210

215

220

Gin

Glu

Pro

Thr

Asp

Trp

Thr

Ser

Asn

Thr

Glu

Met

cys

Glu

Val

225

230

235

240

Gly

Gin

Val

Cys

Gin

Glu

Thr

Leu

íle

Asp

Val

Gly

Leu

Thr

245

250

255

Ser

Thr

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Gly

Cys

Ser

Thr

Val

Gly

Ala

Gin

Asn

260

265

270

Ser

Gin

Lys

Thr

íle

His

Ser

Ala

Pro

Gly

Val

Leu

Val

Ala

275

280

285

Ser

Tyr

Thr

His

Phe

Cys

Ser

Asp

Leu

Cys

Asn

Ser

Ala

Ser

290

295

300

Ser

Val.

Leu

Asn

Ser

Leu

Pro

Gin

Ala

Pro

Val

Pro

305

310

315

320

Gly

Asp

Arg

Gin

Cys

Pro

Thr

Cys

Val

Gin

Pro

Leu

Gly

Thr

cys

Ser

325

330

335

Ser

Gly

Ser

Pro

Arg

Met

Thr

Cys

Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

His

cys

Tyr

340

345

350

Asp

Gly

Tyr

íle

His

Leu

Ser

Gly

Leu

Ser

Thr

Lys

Met

Ser

355

360

365

íle

Gin

Gly

Cys

Val

Ala

Gin

Pro

Ser

Phe

Leu

Asn

His

Thr

370

375

380

Arg

Gin

íle-

Gly

íle

Phe

Ser

Ala

Arg

Glu

Lys

Arg

Asp

Val

Gin

Pro

385

390

395

400

Pro

Ala

Ser

Gin

His

Glu

Gly

Ala

Glu

Gly

Leu

Glu

Ser

Leu

405

410

415

Thr

Trp

Gly

Val

Gly

Leu

Ala

Leu

Ala

Pro

Ala

Leu

Trp

Gly

Val

420

425

430

Val

Cys

Pro

Ser

Cys

435

<210> 3 <211> 24 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220> _ρ. , <223> ⁵ “koniec sekvencie PRV-1 <400> 3 aaaagcagaa agagattacc agcc 24 <210> 4 <211> 24 <212> RHA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Antisense molekula <400> 4 ggctggtaat ctctttctgc tttt <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> A^iHokyseliny 34 až 46 z PRV-1 <400> 5

Lys Val Ser Asp Leu Pro Arg Gin Trp Thr Pro Lys Asn 15 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Aminokyseliny 391 až 405 z PRV-1 <400> 6

Ser Ala Arg Glu Lys Arg Asp Val Gin Pro Pro Ala Ser Gin His <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223>

RT-primér <400> 7 attaggttat gaggtcagag ggaggtt <210> 8 <211> 28 <212> DMA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Sense primér <400> 8 gcagaaagag attaccagcc acagacgg <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> ^anti^sense-P^ri^mér <400> 9 gaatcgtggg ggtaatagag ttagcagg <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> sonda <400> 10 ttcttgttga accacaccag acaaatcgg

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie N-glykozylovaného polypeptidu, ktorý v podstate obsahuje jednu z nasledujúcich aminokyselinových sekvencii:

aminokyseliny 1 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje najmenej 50 aminokyselín, alebo polypeptidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich aminokyselinových sekvencii:

aminokyseliny 1 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu, alebo jeho biologicky aktívneho variantu na výrobu lieku, ktorý pôsobí ako rastový faktor.
2. Použitie N-glykozylovaného polypeptidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich aminokyselinových sekvencii:

aminokyseliny 1 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2 ; aminokyseliny 22 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje najmenej 50 aminokyselín, alebo polypeptidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich aminokyselinových sekvencií:

aminokyseliny 1 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu alebo jeho biologicky aktívneho variantu, na výrobu lieku na liečbu pancytopénií a pancytopatií v kostnej dreni a v krvnom obehu.

3. Použitie polynukleotidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich nukleotidových sekvencií:

nukleotidy 1 až 1600 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 36 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 36 až 1262 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 36 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 39 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 39 až 1262 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 39 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 99 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 99 až 1262 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 99 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1;

alebo jeho fragmentu alebo jeho variantu na výrobu liekov na liečenie pancytopénií a pancytopatií v kostnej dreni a v krvnom obehu.

4. Použitie N-glykozylovaného polypeptidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich aminokyselinových sekvencii:

aminokyseliny 1 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: : 2; aminokyseliny 22 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: : 2; aminokyseliny 22 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: : 2;

alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje najmenej 50 aminokyselín, alebo polypeptidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich aminokyselinových sekvencii:

aminokyseliny 1 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 401 so sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: : 2; aminokyseliny 22 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: : 2;

alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu alebo jeho biologicky aktívneho variantu, na výrobu lieku na liečbu a/alebo zmnoženie buniek, ktoré sú vlastné telu a/alebo buniek zavedených bunkovou líniou ex vivo alebo in vitro.
5. Použitie N-glykozylovaného polypeptidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich aminokyselinových sekvencii:

aminokyseliny 1 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 a ž 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje najmenej 50 aminokyselín alebo polypeptidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich amínokyselinových sekvencii:

aminokyseliny 1 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 401 so sekvencie SEQ ID NO: 2;

aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu alebo jeho biologicky aktívneho variantu na výrobu lieku na inhibíciu rastu buniek.
6. Použitie podlá nároku 5, vyznačujúce sa tým, že sa polypeptid použije ako cytostatikum.
7. Použitie N-glykozylovaného polypeptidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich amínokyselinových sekvencii:

aminokyseliny 1 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny. 1 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny, 22 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje najmenej 50 aminokyselín alebo polypeptidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich amínokyselinových sekvencii:

aminokyseliny 1 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 1 až 401 so sekvencie SEQ ID NO: 2;

aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 409 zo sekvencie SEQ ID NO: 2; aminokyseliny 22 až 401 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu alebo jeho biologicky aktívneho variantu, na výrobu lieku na liečenie proliferatívnych ochorení.
8. Použitie podlá nároku 7, vyzná že proliferatívne ochorenia sú vybrané myeloproliferatívne ochorenia, p. vera, miu, myelofibrózu, CML, všetky leukémie, čujúce sa tým, zo skupiny obsahujúcej esenciálnu trombocytélymfómy a pevné nádory.

9. Použitie polynukleotidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich nukleotidových sekvencii:

nukleotidy 1 až 1600 zo sekvencie SEQ ID NO: 1;

nukleotidy 36 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 36 . až 1262 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 36 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 39 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 39 až 1262 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 39 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 99 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 99 až 1262 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 99 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1;

alebo jeho fragmentu alebo jeho variantu na výrobu lieku na potlačenie rastu buniek.

10. Použitie polynukleotidu, ktorý obsahuje v podstate jednu z nasledujúcich nukleotidových sekvencií:

nukleotidy 1 , až 1600 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 36 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 36 až 1262 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 36 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 39 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 39 až 1262 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 39 až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 99 až 1346 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 99 až 1262 zo sekvencie SEQ ID NO: 1; nukleotidy 99 . až 1238 zo sekvencie SEQ ID NO: 1;

alebo jeho fragmentu alebo jeho variantu na výrobu lieku na liečenie proliferatívnych ochorení.

11. Použitie podľa nároku 10, vyznačujúce sa tým, že proliferatívne ochorenia sú vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje myeloproliferatívne ochorenia, p. vera, esenciálnu trobocytémiu, myelofibrózu, CML, všetky leukémie, lymfómy a pevné nádory.