JPH11505417A - ヒトケモカインベータ−８、ケモカインベータ−１、およびマクロファージ炎症性タンパク質−４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトＣｋβ−８、ＭＩＰ−４およびＣｋβ−１およびかかるケモカインポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）およびかかるポリペプチドを組換え技術により製造する方法を開示する。かかるポリペプチドを白血病、腫瘍、慢性感染症、自己免疫疾患、線維症、障害治癒および乾癬の処置のために利用する方法もまた開示する。かかるケモカインポリペプチドに対するアンタゴニスト、および慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、急性の炎症および感染疾患、アレルギー反応、プロスタグランジン依存性の発熱および骨髄不全を処置する治療剤としてのその使用も開示する。該核酸配列における変異に関連する疾患の検出のための診断アッセイおよび該ポリペプチドの変化した濃度を検出するための診断アッセイも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト ケモカインベータ−８、ケモカインベータ−１、 およびマクロファージ炎症性タンパク質−４ この申請書は、1995年5月5日米国特許商標局にて保留中の申請書ナンバー08 /446.661のファイルである。 この発明は、最近確認されたポリヌクレオヱドとコード化され、ポリヌクレ オヱドとポリペプヱドとして利用され、生産されているポリヌクレオヱドやポリ ペプヱドと関連している。さらに細かく述べると、ポリペプヱドの本発明は、推 定上にてヒトのケモカインベータ−8（ｃｋβ−8）と、マクロファージ炎症性タ ンパク質−4（MIP−4）、そしてケモカインベータ−1（ｃｋβ−1）と同一であ ることが確認された。この発明はさらに、ポリペプヱドなどの抑制にも関連して いる。 インタクリン細胞質***にも適用されているケモカインは、構造的にも機能 的にも細胞質***の亜科に関連している。これらの分子は、8−10ｋｄサイズで ある。一般的にケモカインは、20%−75%の相同性アミノ酸レベルにて示され、そ して2つのジスルフィル結合から成る4つの保存されたシステイン残基にて特徴づ けられる。最初の2つのシステイン残基の配列に基づき、ケモカインはアルファ とベータの2つの亜科に分類することができる。アルファ亜科において、最初の2 つのシステインは、1つのアミノ酸によって分離された。従って”C−X−C”亜科 と示される。ベータ亜科において、2つのシステインは隣あった位置にあり、従 って“C−C”亜科と示される。今までのところ、少なくても8つの異なった亜科 のメンバーがヒトの中で確認されている。 インタクリン細胞質***は、様々な機能がある。品質証明の特徴は、単球、 好中球、Tリンパ球、好塩基球、そして線維芽細胞を含む異なった細胞タイプの 走化性移動を誘い出す能力にある。多くのケモカインは前炎症性を持ち、炎症反 応中の数多くの段階に関わっている。これらの機能は、ヒスタミンリリース、リ ソノーム酵素とロイコトリエンのリリース、ターゲットの免疫細胞から、内皮細 胞の粘着性を増加し、補足タンパク質の結合を高め、か粒球接着分子、そして補 体受容体呼吸器官の破裂の発見を誘導する。それに加えて、炎症性との関係は、 確かなケモカインが他の活動を示すことで表わされる。例えば、マクロファージ 炎症性タンパク質−1（MIP−1）は、造血幹細胞の増殖を抑制することができ、 血小板因子−4（PF−4）は、内皮細胞成長の強力な阻害剤である。また、インタ ーロイキン−8（IL−8）は、KERATINOCYTESの増殖を促進し、GROは、メラノーマ 細胞の自己分泌成長因子である。 異なった生物学的な働きを考慮して、ケモカインが生理学的に、そしてリン パ細胞輸送、傷の癒し、血液学上の規定、及びアレルギー、喘息、関節炎などの 免疫学上の障害病状に多く関連しているということは決して驚くことではない。 血液学上の種族規定例として、MIP−1がある。MIP−1は、マクロファージから作 れた前炎症性細胞質***の菌体内毒素誘導として確認されていた。それに続いて の研究にて、MIP−1は2つの異なってはいるが関連しているタンパク質MIP−1∂ とMIP− 1βから成り立っていることが示された。MIP−1∂とMIP−1β両方ともマクロフ ァージ単球、そしてTリンパ球のための化学誘引剤である。興味探いことに多数 の効力のある幹細胞反応抑制剤（SCI）が、生化学的浄化と、続く配列からの分 析によりMIP−1と同一であることが明らかになった。そのうえ、MIP−1βはMIP −1∂の造血幹細胞増殖の抑制能力を中和する。この発見は、生理学上主要な役 割を果たすMIP−1が骨髄内の造血抑制をする、そして第二に炎症性機能があると いう仮説に達した。MIP−1∂の作用モードは、幹細胞抑制剤のようにG1/S静止期 において、細胞***周期をブロックする能力に関連している。そのうえ、MIP−1 の抑制効力は、未完成な前駆細胞に限られていて、か粒球マクロファージコロニ ー刺激因子（GM−CSF）の存在において、後前駆体に実際に刺激している。 いくつかのグループは、MIP−1∂とMIP−1βの人体相同器官に似せて、クロ ーン化されている。この場合、CDNAｓはT細胞RNAに反して、準備されているライ ブラリーから孤立している。 MIP−1タンパク質は、初期の傷ついた炎症細胞を見つけることができ、傷つ いた線維芽細胞からIL−1とIL−6の生産を引起することが示されている。加えて 、浄化した自然のMIP−1（MIP−1、MIP−1α、MIP−1β、ポリペプチドを含む） は、ねずみの足部の皮下や、うさぎの脳脊髄液体の腔内に注射した時、激しい炎 症を起こす。（Wolpe and Cerami,1989FASKB J 3:2565-73）。それに加えて、こ れらのMIP−1の前炎症性の特性は多分直接か間接であり、MIP−1は、無菌房で実 験用のねずみをモデルに使い、初期の炎症性の傷を治す間回復した。（Fahey,et al.,1990,Cytokine,2:92）。例えば、Chironコーポレーションにより申請された WO92/05198では、哺乳類のマクロファージ炎症性タンパク質（MIPｓ）をイース ト菌内で生産するの効性のDNA分子が発表された。ねずみのMIP−1αとMIP−1β は異なっているが、細胞***にとても関連している。部分的に浄化した2つのタ ンパク質の根号物は、好中球機能に作用し、局部炎症と発熱を起こす。MIP−1α は、イースト菌細胞内で作られ均一的に浄化された。構造的分析は、相同性連鎖 をわずかに分けるPF−4とIL−8の構造に第二次、第三次的にとても類似している ことが確認された。そして、MIP−1αは、試験管内でチミジンに殺されるねずみ の幹細胞を守るために生体内で活動する。MIP−1αはさらに、か粒球マクロファ ージコロニー刺激因子が確認できる。前駆細胞か粒球マクロファージコロニー形 成細胞の増殖をより高める働きをしていることが示された（Clemens,J.M.,etal. ,Cytokine,4:76-821992）。 基の特許申請書にてMIP−1と示されている本発明のポリペプチド、CKβ−1 は、アミノ配列相同性を基にしたβケモカイン族の新しいメンバーで る。 本発明の一様相と一致して、生物学的に有効で、病気の判断的、又治療学に 有効なことでそれについて相似引用された、ヒトCKβ−8、ヒトMIP−4、ヒトCK β−1などの発達した新種のポリペプチドが示された。 本発明の他の様相と一致して、ポリペプチドと記号化され生物学的に有効で 、病気の判断的、治療学的に有効なことでそれについて相似引用された、ｍRNA ｓ、DNAｓ、ｃDNAｓ、ゲノムDNAを含む核酸分子を分離することが示された。 本発明のさらなる様相に一致して、培養、再結合核生物からなる再結合テク ニックによる、そして、又は、真核生物、ホスト細胞、核酸配列を含むSAIDタン パク質の生産増進のポリペプチドの生産過程を示している。 本発明のさらなる様相に一致して、ポリペプチドと記号化され、治療目的で 使用されるポリヌクレオチドが示された。治療目的とは、例えば、ルケミック細 胞を取り除くため化学治療の間化学治療薬剤から骨髄幹細胞を守り、感応の低下 を刺激し、造血とリンパ球の輸送を規制し、乾せん固形腫瘍を治療し、慢性で激 しい伝染病への抵抗力を促進し、傷の回復を刺激する。 本発明のさらなる様相に一致して、ポリペプチドに対しての抗体を示してい る。 本発明の他の様相に一致して、ポリペプチドの抑制行動に使用されるだろう ポリペプチドの対立物を示している。抑制行動は、抑制剤IL−1とTNF−αの生産 、再生不良性貧血、脊髄形成異常症候群、喘息、関節炎の治療などである。 本発明の他の様相に一致して、CKβ−8、CKβ−1、MIP−4核酸配列の雑種を 作るために十分な核酸分子からなる核酸を示した。 本発明の他の様相に一致して、ポリペプチドと記号化された、核酸配列の変 化を見つけるためや、ポリペプチドの表現不足や過剰表現に関連した病気発見や 診断に役立つ試験を示した。 本発明の他の様相と一致して、化学的研究に関連した生体外目的のための試 薬の研究、治療法の発達のため、病気治療の診断法のため、DNAの合成と生産の ためのポリペプチドと記号化されている、ポリペプチドとポリヌクレオチドを使 うプロセスを示した。 本発明のこれらの又他の様相は、これらの事実の学習により、それぞれの機 能は示される。 図1は、CKβ−8と記号化されたｃDNA配列と、アミノ酸配列の一致の推定を 示している。イニシャル21アミノ酸は、推定上の代表配列として表わされる。す べてのシグナル連鎖は、バキュロウイルスエキスプレスタンパク質のN−ターミ ナルペプチド配列により決定された。 図2は、CKβ−1と記号化されたｃDNA配列とアミノ酸配列の一致の推定を示 している。イニシャル19アミノ酸は代表配列として表わされる。 図3は、MIP−4と記号化されたｃDNA配列とアミノ酸配列の一致の推定を示し ている。イニシャル20アミノ酸は代表配列として表わされる。 図4CKβ−8（上段）と人体MIP−1α（下段）のアミノ酸相同性を表わし、ケ モカインの4つのシステインの特徴が示されている。 図5は、2つのアミノ酸配列の中で上段配列は人体MIP−4アミノ酸配列、下段 配列は人体MIP−1αであると示している。（人体扁桃腺リンパ球、LD78ベータタ ンパク質） 図6は、CKβ−1（上段）と人体MIP−1α（下段）間のアミノ酸配列の整列を 表わしている。 図7は、COS細胞のHA−taggedCKβ−1を示した後、電気泳動されたCKβ−1ゲ ルが写されている。 図8は、バキュロウイルス発現システムで発現、浄化された後のCKβ−1のSD C−PAGEゲルが写されている。 図9は、バキュロウイルス発現システムで発現され、3段階で浄化された後の CKβ−8のSDC−PAGEゲルが写されている。 図10は、CKβ−8のキモアクトトラクタント行動が、46−WELLマイクロチェ ンバー装置（Neuro Probe INC.）を使った走化作用の実験により確認された。実 験の手順は製品手引きにて説明されている。それぞれのCKβ−8の濃縮は5つの高 パワー分野の移動にて実験された。結果は2つの独立した実験から獲得した平均 的結果が示されている。THP−（A）細胞とヒトPBMCｓ（B）のキモアクトトラク タント行動が示されている。 図11は、CKβ−8が細胞内カルシウムの濃縮の変化に応えていることが日立F −2000蛍光性の分光測光器を使い確認された。バクテリアエキスプレスCKβ−8 は50ｎMの最終濃縮のTHO−1細胞に詰めたIndo−1に加えられ、細胞内カルシウム 濃縮レベルは測定された。 図12単球細胞ラインTHP−1は16時間LPS（0.1−10ng/ml）か、CKβ−8（to50 ng/ml）で処理された。上清の組織培養は、TNF−αの分泌量を高めるためのELIS A分析の議題となった。 図13洗浄し浄化されたヒト末梢血液単球は、CKβ−8の数を増やすととまに 、16時間処理された。（バキュロウイルスにより生産された）上清の組織培養は 、TNF−α、IL−6、GM−CSFそして、か粒球コロニー刺激因子（G−CSE）の分泌 量はELISA分析の議題となった。 図14ねずみの骨髄細胞の低密集ポピュレーション（1500細胞/dish）は、寒 天培養基にケモカイン（100ng/ml）有り又は無で、しかし、IL−3（5ng/ml）、S CF（100ng/ml）、IL-1α（10ng/ml）、M-CSF（5ng/ml）とともに観察された。デ ータは2つの独立した実験（それぞれ2回試行）から平均的結果が示された。コロ ニーは培養後14日で確認された。ケモカインの存在で発生した数々のコロニーは 、加えたケモカインの欠如で低い割合が示された。 図15は、HPP−CFC（A）とLPP−CFC（B）によってねずみの骨髄コロニー発達 に影響があるCKβ−8とCKβ−1を示している。 図16は、バキュロウイルスエキスプレスCKβ−1とM−CFSのCKβ−8と新に分 離した骨髄細胞のSCF刺激コロニー組織の影響を示している。 図17は、CKβ−8とIL−3のCKβ−1とSCF刺激増殖と骨髄細胞のリンポピュレ ーション識別の影響を示している。 図18GR−1そして骨髄細胞のリンポピュレーションからの明白な細胞ポピュ レーションのMac−1（surfacemarkers）の発生にてCKβ−8とCKβ−1の影響と、 リン細胞がIL−3（5ng/ml）、SCF（100ng/ml）、単独（a）、CKβ−8（50ng/ml ）（b）かCKβ−1（50ng/ml）を追加し成長培養基で繁殖したことが示されてい る。細胞は、そらから骨髄の分化GP−1、Mac-1、Sca-1、そしてサーフェスアン チゲンCD45Rに反して、単クローン抗体とともに着色されFACSCanにより分析され た。データは、大（A）小（B）両方の細胞ポピュレーションでの有効な細胞の割 合を示している。 図19は、IL−3、M−CSF、そしてGM−CSFに反応する骨髄細胞コロニー組織の 抑制剤CKβ−8（+）の存在を示している。 図20骨髄細胞コロニー組織CKβ−8の服用量の反応。細胞は、図19のように 単離処理される。処理された細胞は、IL−3、GM−CSF、又は1、10、50、100ng/m lのCKβ−8有り又は無で、M−CSF（15ng/ml）の存在する中で1000細胞/dishの密 集度の寒天ベースコロニーにて観察された。データはコロニー組織の特殊因子単 独の幾つかのコロニー形成の割合を示している。データはエラーバーにより規定 から外れたものを示し、DISHの二重の平均を示している。 図21造血成長因子の存在、又は欠如のCKβ−8とCKβ−1によるアポトーシス の誘導を示している。ねずみの骨髄細胞は、両方の大腿骨からけい骨に接し、フ ィコール密度傾度で分かれ、単球はプラスチック付着により移動する。細胞ポピ ュレーションのはそれからIL−3（5ng/ml）、GM−CSF（5ng/ml）、M−CSF（10ng /ml）、そしてG−CSF（10ng/ml）の補助の上MEMベース培養基にて一晩培養され た。加えて細胞は、CKβ−8（50ng/ml）、又はCKβ−1（250ng/ml）有りか無で も培養された。24時間後Boehringer mannheim細胞死ELISAキットに使われるアポ トーシスのため収穫され加工された。データは各々成長因子の存在で培養し、ア ポトーシス発生の数の割合の増加を示している。 図22ヒト単球でCKβ−8と記号化されているRNAが示されている。新たに洗浄 された単球からなるトータルRNAは100U/mlhu rIFN-gか100ng/mlLPSで又は両方で 観察された。各々の観察からRNA（8μg）は、1.2%のアガロースゲルで電気泳動 的に分けられ、ナイロン細胞膜へ移された。CKβ−8ｎRNAは、32P−labeled cDN Aで調査、定量 化された。放射線写真に生じている群は濃度測定器にて定量化された。 本発明の様相に一致して図1、2、3（SEQ ID NO．2、4、6各々）のアミノ酸 配列を持ち、生成したポリヌクレオチドと記号化され、又1994年2月9日NO.75676 ATCCデポジットとして届けられたクローンのｃDNAと記号化される生成したCKβ −8ポリペプチドと、1994年2月9日NO.75675ATCCデポジットとして届けられたク ローンｃDNAと記号化される生成したMIP−4ポリペプチド、そして1993年10月13 日NO.75572ATCCデポジットとして届けられたクローンｃDNAと記号化される生成 したCKβ−1ポリペプチドなどの核酸（ポリヌクレオチド）の単離を示している 。 本発明にてポリペプヱドと記号化されるポリヌクレオヱドは、システインや ケモカインのファミリーのスーパー“インタークリン”に構造的に関連している 。CKβ−8とMIβ−4の両方ともMIP−1相同器官でMIP−1βよりMIP−1αがより相 同的である。CKβ−8と記号化されるポリヌクレオヱドは大動脈の内覆組織のｃD NAライブラリーから派生し、数々のケモカインの強力な相動性を提示する。120 のアミノ酸残基のポリペプヱドと記号化されるオープン読み枠をも含んでいる。 第一の合致は、36%の同一性と、66%の相似性（図4）で表わされれているヒトマ クロファージ炎症性タンパク質1アルファにある。 MIP−4と記号化されるポリヌクレオヱドは、成人の肺のｃDNAライブラリー で派生し数々のケモカインの強力な相動性を提示する。89のアミノ酸残基のポル ペプヱドと記号化されるオープン読み枠をも含んでいる。第一の合致は、60%の 同一性と、89%の相似性（図5）で表わされているヒト扁桃腺リンパ細胞LD78ベー タタンパク質である。さらに、特徴的モヱーフのすべてのケモカインに起こる4 つのシステイン残基は、2つのクローンで一定に保たれた。事実、遺淘子の中の 最初の2つのシステイン残基は、隣合った位置にあり、ケモカイン鼎ｘC煤A又は β亜科と分類される。他の亜科において、最初の2つのシステイン残基、鼎ｘC煤 A又α亜科は、1つのアミノ酸にて分けられる。 CKβ−1と記号化されるポリヌクレオヱド、そして最初の19の93アミノ酸ポ リペプヱドと記号化される読み枠は、74アミノ酸残基を含む成長したポリペプヱ ドのリーダー配列になる。CKβ−1は80アミノ酸に及ぶ48%の同一性と72%の相似 性を持つ、人体マクロファージ炎症性タンパク質との重要な相同性を表わしてい る。そして、特徴的モヱーフを含む4つのシステイン残基は保存された。 本発明のポリヌクレオヱドは、多分RNA、ｃDNA、ゲノムDNA、そして合成DNA を含むDNAフォームにある。DNAは、二重鎖か一本鎖フォームで、もし一本鎖なら ばコード要素かノンコード要素（反感覚）である。成長ポリペプヱドとコード化 されるコード配列は、図1、2、3（SEQ ID NO.1、3、5）に表わされるコード配列 か、届けられたクローンと同一であるか、コード配列の異なった配列か、成長し たポリペプヱドのDNA図1、2、3（SEQ ID NO.1、3、5）か、届けられたｃDNA（s ）同じ遺淘的コードの余剰性か、又は、退化性の結果としてのコード配列と異な っているかもしれない。 ポリヌクレオヱドは、図1、2、3（SEQ ID NO.2、4、6）で示されるように成 長したポリペプヱドと記号化される。そして届けられたｃDNA（s）とコード化さ れる成長したポリペプヱドを含む。成長したポリペプヱドのためのコード配列、 成長したポリペプヱドのコード配列、そして第一又は第二配列のようなコード配 列、プロタンパク質配列、成長したポリペプヱドコード配列のためのコード配列 （オプションとして加えられた）、イントロンなどのノンコード配列、ノンコー ド配列5、そして又は、3の成長したポリペプヱドのためのコード配列。 従って、塔|リペプチド唐 記号化するポリヌクレオチドの概念は、加えられ たコード、そして又は、ノンコード配列と同様、ポリペプチドのためのコード配 列 のポリヌクレオチドを含む。 Hereinaaboveの異倦とも関連している本発明は、図1、2、3（SEQ ID NO.2、 4、6）で推定するアミノ酸配列を持ち、断片的で、類似性があり、誘導体のポリ ペプヱドと記号化 され、届けられたクローンｃDNAと記号化されるポリベプチドのポリヌクレ オチドを説明している。ポリヌクレオチドの異形は、自然に起こったポリヌクレ オチドの対立形質異形か、自然ではなく起こったポリヌクレオチドの異形である 。 上に述べたように、本発明は、図1、2、3（SEQ ID NO.2、4、6）に表わされ ている同じ成長したポリペプチドと記号化され、ポリヌクレオチド又は、図1、2 、3（SEQ ID NO.2、4、6）の断片的に、誘導性又は、類似性のポリペプチドと記 号化される異形ののポリヌクレオチド同様、届けられたクローンのｃDNAと記号 化されるポリペプチドを含む。ヌクレオチドの異形は、遺伝子欠如の異形、構造 的異形、付加物又は、付着異形を含む。 上に述べたように、ポリヌクレオヱドは多分、図1、2、3（SEQ ID NO.1、3 、5）で表わされているコード配列、又は届けられたクローンのコード配列で自 然に起こった対立倦質異倦のコード配列を持っている。人文化学で知られている ように、対立倦質異倦は、ポリペプヱドの記号化機能を構造的に変えない、1つ 又はそれ以上のヌクレオヱドの代用、遺淘子の欠如、付加性を持つポリヌクレオ ヱド配列が交互に起きるフォームである。 また、本発明は、成熟したポリペプヱドのコード配列が、宿主細胞からのポ リペプヱドの発現および分泌を助長するポリヌクレオヱド配列に同じ読み枠で融 合されるポリヌクレオヱドも含むものとする。例えば、細胞からのポリペプヱド の移動を制御する分泌配列として機能するリーダー配列などである。リーダー配 列を持つポリペプヱドは、前酎白質であり、成熟したポリペプヱドを倦成するた めに、宿主細胞によって分割されたリーダー配列を持つことがある。 また、ポリヌクレオヱドは、成熟した酎白質と余分なS茶Aミノ酸残基である 後酎白質をコード化することもある。後配列を持った成熟した酎白質は、後酎白 質であり、不活性化状態にある酎白質である。いったん後配列が分割されると、 活性の成熟した酎白質が残る。 したがって、例えば、本発明のポリヌクレオヱドは、成熟した酎白質、また は後配列を持った酎白質、もしくは、後配列と前配列（リーダー配列）の両方を 持ち合わせた酎白質をコード化する。 また、本発明のポリヌクレオヱドは、コード配列を読み枠ごとにマーカー配 に融合し、ポリペプヱドの精製を可能にする。マーカー配列は、細菌性の宿主の 場合に、マーカーに融合された成熟したポリペプヱドを精製するためにpQE-9ベ クターによって供給されるヘキサヒスヱジンタグであるか、または、例えば、CO S-7細胞などの哺乳類の宿主細胞を使用した場合の血凝集素(HA)タグでもありえ る。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素酎白質から誘導されるエピトープに相 当する(Wilson,I.,etall.,Cell,37:767(1984))。 さらに本発明は、配列間の一致が最低50%、できれば70%である場合、前述の 配列に交雑するポリヌクレオチドにも関連する。特に本発明は、厳密な条件下に おいて前述のポリヌクレオチドに交雑するポリヌクレオチドに関連する。ここで 使われる“厳密な条件”とは、配列間の一致が最低でも95%、できれば最低97%の 場合にのみに起こる交雑を意味する。好ましい条件で前述のポリヌクレオチドに 交雑するポリヌクレオチドは、図1、2、および3(SEQ ID No.1、3、5)のcDNA、ま たは沈着したcDNAがコード化する成熟したポリペプチドと、実質的に同じ生物学 的機能または活性を保持するポリペプチドをコード化することができる。 代わりに、このポリヌクレオチドは、最低でも20の塩基、できれば30以上、 そしてさらにできれば最低でも50の塩基を持ち、本発明のポリヌクレオチドに交 雑し、また前述の通り同一性があり、したがって活性を保持しないポリヌクレチ ドでもよい。そのようなポリヌクレオチドは、例えばSEQ ID NO.1、3、5のポリ ヌクレオチドのプローブとして、ポリヌクレオチドの回収、または診断のための プローブ、あるいはPCRプライマーとして利用することができる。 ここで述べられている沈着物とは、特許手続きのために、International Re c-ognition of the Deposit of Micro-organisms(微生物の沈着の国際認識)に関 するブタペスト条約に基づくものとする。これらの沈着物は、この分野の専門家 のために便宜上提供されたものであって、35U.S.C.§112に沈着物が必要とされ ることを認めるものではない。沈着物質に含まれるポリヌクレオチドの配列、お よびそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸の配列は、言及により本 発明に含まれるものとし、配列の説明に関して論争が起きた際に優先される。沈 着物質の製造、使用、または販売には使用許可が必要であり、またそのような使 用許可は本発明では譲与しないものとする。 本発明は、さらに、図1、2、および3(SEQ ID No.2、4、および6)に推論され るアミノ酸配列、または沈着したcDNA、並びに断片、類似体、またそのようなポ リペプチドの誘導体によってコードされたアミノ酸の配列を持つ、CkB-b、MIP-4 、および“断片”、“誘導体”、および“類似体”とは、図1、2、3(SEQ ID NO. 2、4、6)のポリペプチドに関連して使用される場合、または沈着したcDNAによっ てコード化されたものである場合は、そのようなポリペプチドと基本的に同じ生 物学的機能と活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、類似体には、後 蛋白質部分の分割による活性化によって活性化・成熟化したポリペプチドを製造 できる後蛋白質が含まれる。 本発明のポリペプヱドは、組換えポリペプヱド、自然もしくは合成ポリペプ ヱドであるが、できれば組換えポリペプヱドがよい。 図1、2、および3(SEQ ID No.2、4、および6)のポリペプヱド、または沈着し たcDNAによってコードされたポリペプヱドの断片、誘導体、および類似体には、 (i)1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存、または非保存アミノ酸残基によっ て置換されており(できれば保存アミノ酸残基)、その置換されているアミノ酸残 基が、遺淘コードでコード化されている、まはたされていないもの、(ii)1つま たはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、(iii)成熟したポリペプヱド が、ポリペプヱドの半減期を増加する化合物など（例えば、ポリエヱレングリコ ール）、別の化合物に融合されているもの、もしくは(iv)付加的なアミノ酸が、 リーダー配列または分泌配列、あるいは成熟したポリペプヱドの精製に使われる 配列、あるいぱ後酎白質配列など、成熟したポリペプヱドに融合されているもの 、がある。このような断片、誘導体、および類似体は、この分野の専門家の範囲 内にあるものである。 本発明のポリペプヱドは、できれば単離された倦で提供され、また均質に精 製されたものがよい。 “遺伝子”または“シストロン”とは、ポリペプチド連鎖の生成に関連する DNA区域を意味する。これには、コード領域（リーダーおよびトレーラー）の前 後の領域、および、個々のコード区域(エクソン)間の介在配列(イントロン)が含 まれる。 “単離された”とは、物質がその元の環境（例えば、自然に発生するもので あれば、自然環境）から物質が取り除かれることを意味する。例えば、生きてい る動物に存在する自然発生のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離された も のではないが、自然体系に共存する物質の一部、またはすべてから分離した同じ ポリヌクレオチド、DNA、またはポリペプチドは、単離されたものである。この ようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部、またはそのようなポリヌクレオチ ド、あるいはポリペプチドは、組成の一部でもありえるが、それでもそのような ベクターや組成が自然環境の一部ではないという点で、単離されているとする また、本発明は、本発明のポリヌクレオヱドを含むベクター、本発明のベク ターで遺淘子工学的に作られた宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ ペプヱドの生成にも関連する。 宿主細胞は、本発明のベクター、例えばクローニングベクターまたは発現ベ クターなどで遺伝子工学的に作られた(形質導入、または形質転換、あるいはト ランスフェクションされた)細胞である。ベクターは、例えばプラスミド、ウィ ルス分子、ファージなどである。作られた宿主細胞は、プロモータを活性化した り、形質転換株を選択したり、また、CkB-8、MIP-4、およびCkB-1遺伝子を増幅 するために、適宜に修正した伝統的な培養基にて培養することができる。温度、 pHなどの培養基の諸条件は、前回発現に選ばれた宿主細胞に使用した条件であり 、通常技術のある専門家には明らかな条件である。 本発現のポリヌクレオヱドは、組換え技術によるポリペプヱドの生成に使用 できる。従って、例えば、ポリヌクレオヱド配列は、特にポリペプヱドを発現す るベクターまたはプラスミドなど、さまざまな発現媒体に含まれる。そのような ベクターには、染色体DNA、非染色体DNA、または合成DNA配列、例えば、SV40の 誘導体、細菌性プラスミド、ファージDNA、酵母プラスミド、プラスミドおよび ファージDNAの組み合わせから誘導されたベクター、そして痘疹、アデノウイル ス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病などのウイルスDNAなど、が含まれる しかし、その他のどのプラスミドまたはベクターでも、宿主細胞において再 製可能であり、生存可能であれば使用することができる。 適切なDNA配列は、さまざまな方法によってベクターに挿入することができ る。一般的には、DNA配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に通常の手順 で挿入される。そのような手順およびその他の手順は、この分野の専門家の範囲 内のものである 発現ベクターのDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモータ）に人工的に リンクされ、mRNA合成を指示する。このようなプロモータの代表例としては、LT RまたはSV40プロモータ、大腸菌、ラクトースオペロン、またはトリプトファン 、ファージラムダPプロモータ、そして、原核または有核細胞、あるいはそのウ ィルスの遺伝子発現を制御するとされるその他のプロモータなどが挙げられる。 また、発現ベクターには、翻訳開始領域および転写終止領域のためのリボソーム 結合部位が含まれている。また、ベクターには、発現の増輻に適切な配列が含ま れている。 さらに、発現ベクターには、できれば、ジヒドロ葉酸還元酵素や有核細胞培 {のネオマイシン抵抗性、または、大腸菌におけるテトラサイクリン抵抗性やア ンピシリン抵抗性などの、形質変換された宿主細胞を選択するための表現型形質 を与える遺伝子が含まれているほうがよい。 前述のような適切なDAN配列や、適切なプロモータ、あるいは制御配列を含 むベクターは、適当な宿主細胞の形質転換を行い、宿主細胞に蛋白質を発現させ るのに使用することができる 適当な宿主細胞の代表例としては、大腸菌のような細菌細胞、ストレプトミ セス属の放線菌、ネズミチフス菌、酵母などの真菌細胞、キイロショウジョウバ エ属S2、Sf9などの昆虫細胞、アデノウィルス、CHO、COS、Bowes黒色腫、植物細 胞な どが挙げられる。 適切な宿主細胞の選択は、ここに述べられる分野の専門家の範囲内で行われ る。 さらに特定すれば、本発明はまた、前述の1つまたはそれ以上の配列で構成 される組換え構造を含むものとする。このような組換え構造は、本発明の配列を 正方向、または逆方向に挿入したプラスミドやウィルスベクターなどのベクター から成る。さらに、組換え構造は、例えば配列に人工的にリンクされたプロモー タを含む、調節塩基配列から成る。数多くの適当なベクターおよびプロモータが 専門家の間で知られており、また市販されている。次に挙げるベクターおよびプ ロモータはその例である。細菌性：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、 phagescript、psiX174、pbluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH4 6A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、 有核生物：PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）pSVK3、pBPV、pM SG、pSVL(Pharmacia)。ただし、その他のどのプラスミドまたはベクターでも、 宿主細胞において再製可能であり、生存可能であれば使用してもよい。 プロモータ領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクタ ー、または選択できるマーカーのあるその他のベクターを使って、好みの遺伝子 から選び出すことができる。このような適切なベクターには、PKK232-8およびPC M7の2つがある。特定の名の付いた細菌性プロモータには、lacI、lacZ、T3、T7 、gpt、ラムダP[ilegible]、Pl、およびtrpなどがある。有核プロモータには、C MV(即時および初期)、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイ ルスからのLTR、およびマウスメタロチオネイン-Iなどがある。適切なベクター およびプロモータの選択は、通常レベルの専門家の範囲内で行うことができるも のである。 本発明はさらに、前述の組換え構造を持つ宿主細胞にも関連する。宿主細胞 は、哺乳類細胞などの高度な有核細胞、または酵母細胞のような低度の有核細胞 もあり、あるいは、宿主細胞には細菌細胞のような原核細胞もある。組換え構造 の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキス トランを媒介としたトランスフェクション、またはエレクトロポレーション(Dav is,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Bassic Methods in Molecular Biology,(1986))に よって達成される。 宿主細胞内の構成は、伝統的な方法によって組換え配列でコード化された遺 伝子生成物の生成に使用できる。また、本発明のポリペプチドは、従来のペプチ ド合成機によって合成することもできる 成熟した酎白質は、適切なプロモータの制御のもと、哺乳類、酵母、細菌、 まはたその他の細胞で発現できる。セルフリートランスレーションシステムもま た、本発明のDNA構成から誘導されたRNAを使うことによって、そのような酎白質 の生成に使用することができる。原核および有核細胞の宿主に使用される適当な クローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrook,etall.,Molecular Clon ing;A Laboratory manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)の 中で述べられており、その言及により、本発明に含まれるものとする 高度な有核生物による本発明のポリペプチドをコード化するDNAの転写は、 ベクターにエンハンサー配列を挿入することで増加できる。エンハンサーは、DN Aのシスアクティングエレメントで、通常約10〜300bpの長さで、プロモータに作 用しその転写を増加する。複製源bp100〜270の後期でのSV40エンハンサー、巨細 胞ウィルス初期プロモータエンハンサー、複製源の後期でのポリオーマウィルス エンハンサー、そしてアデノウイルスエンハンサーなどが例として挙げられる 一般的に、組換え表現ベクターには、例えば、大腸菌のアンピシリン抵抗性 遺 伝子やs.cerevisiaeTRP1遺伝子など、宿主細胞の形質転換を可能にする複製源と 選択できるマーカーが含まれており、また、下流側の構造配列の転写を指示する 高度な発現遺伝子から誘導されたプロモータが含まれている。 そのようなプロモータは、中でも3-ホスホグリセリン酸塩キナーゼ(PGR)、 アルファファクター、酸性ホスファターゼ、またはヒートショック蛋白質などの 糖分解酵素をコード化するオペロンから抽出できる。異種構造配列は、翻訳開始 および終止配列、できれば翻訳された蛋白質の分泌をプラズマ周囲のスペースま たは細胞外の媒介に振り向けることができるリーダー配列などの、適切な段階を 踏まえて組み立てられる。またオプションとして、異種構造配列は、好みの性質 、例えば安定化または発現組換え生成物の簡素化された精製などを伝えるN-term inal identificationペプチドを含む融合蛋白質をコードできる 細菌使用に役に立つ発現ベクターは、好みの酎白質と適切な翻訳開始および 終止シグナルをコード化する構造DNA配列を、機能的なプロモータを使って、操 作できる読取り段階で挿入することによって組み立てることができる。ベクター は、1つまたはそれ以上の表現型選択可能マーカー、および複製起点から成り、 ベクターの維持、そして望ましい場合は、宿主中で増幅を提供する。倦質転換の ための適切な源核生物宿主には、大腸菌、枯草菌、ネズミヱフス菌、およびさま ざまな種類のシュードモナス属、ストレプトミセス属、ブドウ球菌属などが含ま れるが、その他も好みにより使用できる。 限定的でない代表例としては、細菌使用に役立つ発現ベクターには、良く知 られているクローニングベクターであるpBR322(ATCC3717)の遺伝因子を構成する 、市販プラスミドから誘導された選択できるマーカー、および細菌性の複製起点 がある。このような市販されているベクターには、例えばpKK22303(Pharmacia F ine Chemi-cals,Uppsala,Sweden)やGEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)など が挙げられる。これらのpBR322のバックボーン的な部分は、適切なプロモータと 発現されるべき構造配列と組合わされる。 適切な宿主株が形質転換し、宿主株が適切な密度に増殖した後で、選択した プロモータを適切な手段で導入し（例えば、温度の変換や化学導入）、細胞をさ らに一定期間培養する 細胞は、通常遠心分離法により取り入れ、物理的または化学的手段により分 し、その抽出物そのものをさらに精製する。 酎白質の発現に使用された細菌細胞は、凍結・解凍サイクル、超音波処理、 機械的な***、または細胞融解剤の使用など、都合のよい方法で***することが できる。そのような方法は、この分野の専門家に良く知られているものである。 また、組換え蛋白質の発現には、さまざまな哺乳類細胞の培養システムを使 pすることができる。哺乳類の発現システムの例には、Gluzman,Cell,23:175に説 明される猿腎臓繊維芽細胞のCOS-7系や、同等のベクターの発現能力を有するそ の他の細胞、例えばC127、3T3、CHO、HeLa、BHK細胞系が挙げられる。哺乳類発 現ベクターは、複製起点、適当なプロモータおよびエンハンサー、そして、必要 とされるリボソーム結合部位、ポリA部位、接合ドナーおよびアクセプター部位 、転写終止配列、および、S 側面非転写配列で構成される。SV40接合で導入され たDNA配列およびポリA部位は、必要とされる非転写遺伝子要素の提供に使用する ことができる。 CkB-B、MIP-4、およびCkB-1は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、 酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、燐酸セルロースクロマ トグラフィ、速水性インターアクションクロマトグラフィ、アフィニティクロマ トグラフィ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマ トグ ラフィなどの方法によって組換え細胞培養から取り出し、精製される。 酎白質のリフォルディングは、成熟した酎白質の構成の完了に必要に応じて 使用できる。最後に、最終的な精製段階には、高性能液体クロマトグラフィ(HPL C)を使うことができる。 本発明のポリペプヱドは自然精製した生成物、または化学合成物、あるいは 原核または有核生物宿主（例えば、溶媒した細菌、酵母、高等植物、昆虫、およ び哺乳動物細胞など）から組換え操作によって生成された生成物である。組換え 生成法に使用された宿主細胞に寄って、本発明のポリペプヱドは哺乳類またはそ の他の有核炭水化物による糖酎白質であるか、または非糖酎白質であることもあ る。本発明のポリペプヱドにはまた、最初のメヱオニンアミノ酸残基が含まれる 。 本発明のポリペプヱドは、さまざまな免疫調節および炎症機能、また、数多 くの疾病症状に使用することができる。CkB-8、MIP-4、およびCkB-1は、chemoki ne族に属し、そのため白血球（単核白血球、中性好性白血球、Tリンパ球、エオ シン好性白血球、好塩基性白血球など）に対して化学的な誘因物質である。 NorthernBlot分析では、CkB-8、MIP-4、およびCkB-1は、優勢的に造血組織 に発現される。 CkB-8は、免疫反応および炎症の調整に重要な役割を果たすことが判明して いる。図22では、リポ多糖類がヒトの単核白血球からCkB-8の発現を誘発するこ とを示している。従って、エンドトキシンの存在に対する反応として、CkB-8が 単核白血球から発現されるため、宿主細胞の免疫反応を調節するのに、CkB-8の 投与を採用することができる。 図１０で示されるとおり、THP-1細胞内(A)及びPBMCs(B)におけるCkβ-Bの化 学誘引物質活動は、非常に重要である。また、Ckβ-Bは、THP-1細胞内のカルシ ウ動員を誘引する(図11)。これにより、Ckβ-Bが、単球に生物学的影響を持って いることが分かる。さらに、Ckβ-Bは、ヒトの単球に服用依存化学向性とカルシ ウム動員反応を引き起こす。 従って、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1は、ターゲットとなる免疫細胞が創傷部位 にもたらす湿潤をコントロールすることによって、傷の回復を促進するのに利用 することができる。これと同じく、今回発明されたポリペプチドは、殺菌性白血 球の誘引や活性化によって、慢性の炎症(微小細菌性など)に対するホスト防御を 強化する。さらに、今回発明されたポリペプチドは、坑腫瘍療法として利用でき るのではないかとされている。というのも、カーポシ(Karposi)肉腫の治療に見 られるように、ケモカインの細胞を腫瘍に注入したことによって、腫瘍が退行し た実証例があるからだ。図12及び図13の分析によると、Ckβ-BはTHP-1細胞から 、腫瘍後退を促す抑制性作用薬として知られる、TNF-αを分泌させることが明ら かになっている。250ng/ml分のCkβ-Bは、1200ピコグラム／ml分のTNF-αを生産 ・分泌する。またCkβ-Bは、単球からIL-6、IL-1、G-CSFなどの、他の腫瘍・癌 の抑制性作用薬を分泌させる。さらに、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1は、ホスト防御( 殺腫瘍性)細胞(細胞障害性Ｔ細胞、マクロファージなど)の侵入や活性化を刺激 する。この方法は、固形腫瘍の治療にも利用できる。 ポリペプヱドは、造血性細胞の増殖や分化を抑制するのに利用できる。とい うことは、化学療法が行われる間、骨髄基部細胞を作用薬から保護するのに利用 できる。図14及び図15は、Ckβ-BとCkβ-1が、細胞を倦成している低増殖性潜在 コロニーを抑制していること、そしてCkβ-BがLPP-CFCコロニーの増殖に有効・ 最適な抑制剤であることを明らかにしている。図16は、Ckβ-1がM-CSF-に触発さ れるコロニー倦成を、非常に良く抑えること、またCkβ-Bがここでは作用しない ことを明ら かにしている。しかし、すでに示されたとおり、Ckβ-Bと-Ckβ-1はどちらも、 骨髄基部細胞の増殖や分化を効果的に抑制する。この坑増殖効果は、化学療法作 用薬の増量投与を可能にし、従って化学療法をさらに効果的なものにする。 委託前駆体細胞の分集団(顆粒球及びマクロファージ細胞／単球細胞)におけ るCkβ-B及びCkβ-1ポリペプチドの抑制効果は、白血球細胞の増殖を抑制する治 療に利用できる。図17、図18及び図19では、利用された細胞系列の委託細胞を取 り出し、その結果できた細胞の集合をCkβ-B及びCkβ-1と接触させている。Ckβ -1はMac-1陽性集合細胞を50パーセント近く減少している。これは、Ckβ-1がM-C SF反応性コロニー形成細胞の抑制を促していることを示す、図16の結果と一致し ている。図19で示されているとおり、Ckβ-Bは委託前駆体細胞がIL-3、GM-CSF、 M-CSFに反応し、コロニーを形成する能力を抑制する。さらに、図20で示される とおり、Ckβ-Bの服用反応は、コロニー形成を抑制する。この抑制効果は、これ らの要因に仲介された分化シグナルの特定妨害物、または前駆体細胞における細 胞障害性効果によるものである。 ポリペプヱドのもうひとつの利用法として、IL-2生合成の抑制によってT細 胞増殖(自己免疫性疾病、リンパ性白血病など)を抑制することもできる。 また、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1は、皮膚内のランゲルハンス細胞がMIP-1aを 生産することから、乾癬(ケラチノサイト過剰増殖)の原因となる、表皮性ケラチ ノサイトの増殖を抑制するのに利用できる。 Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1は、細片の除去及び炎症細胞への連続的な組織促進 の両方によって、また過剰なTGPβ媒介線維をコントロールすることによって、 損傷治癒の間に起こる瘢痕を防ぐのに利用できる。さらに、Ckβ-B、MIP-4、Ck β-1は血管の透過性を高めるので、これらのポリペプチドは、発作、血小板増多 症、塞栓、骨髄増殖性障害を治療するのに利用できる。Ckβ-Bは、アプトーシス を誘引することによって、白血病や異常な細胞増殖(腫瘍細胞など)の治療に利用 できる。図21で示されるとおり、Ckβ-Bは造血性前駆体細胞集合でアプトーシス を誘引する。今回発明された、ポリペプチドと、これをコード化するポリヌクレ オチドは、科学研究、DNA合成、DNAベクターの生産などの生体外目的に関連する 試薬や、疾病処置の治療や診断方法を開発するための研究試薬として利用できる 。例えば、Ckβ-B及びCkβ-1は、分化を一時的に抑えることによって、未成熟の 造血前駆体細胞(顆粒球、マクロファージ、単球など)の拡張に利用できる。これ らの骨髄細胞は、生体外で培養できる。 全長のCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1遺伝子は、全長の遺伝子を隔離し、その遺伝 子と配列が非常に似かよっている、または生物学的な活動が似かよっている遺伝 子を隔離する、cDNAライブラリのためのハイブリッド形成プローブとして使用で きる。プローブは少なくとも30の塩基を、できれば50以上の塩基を含んでいるの が理想的である。プローブは、全長の転写及びゲノムクローン、または法則領域 、プロモータ領域、エクソン、イントロンを持つ、完全遺伝子を含むクローンと 一致する、cDNAクローンを識別するのに使用できる。スクリーニングの例として は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するのに、既に分かっているDNA配列を 使うことによって、遺伝子のコード領域を隔離する方法がある。 今回発明された遺伝子への配列相補を持つラベル化オリゴヌクレオチドは、 ヒトのcDNA、ゲノムDNA、mRNAのライブラリをスクリーンし、どのライブラリ群 にプローブをハイブリッド形成するかを決定するのに使われる。 また、この発明は、核酸配列における変異に関連する疾病や、それに対する 敏感性を探知する診断分析の一部としての、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1遺伝子の使 用にも関連している。これらの疾病は、ケモカイン・ポリペプチドの発現不足に 関連 している。 Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1に含まれる、ヒトが持つ変異は、あらゆる方法によ ってDNAレベルで探知することができる。診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組 織、生検、剖検などの患者の細胞から得ることができる。ゲノムDNAは、直接発 見に使用したり、分析前にPCRを使って酵素学的に増幅したりすることができる 。(Saiki etal.,Nature,324:163-166(1986))またRNA及びcDNAも同じ目的に使う ことができる。例えば、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1をコード化する核酸に対して相 補的なPCRプライマーは、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1変異を識別・分析するのに使用 することができる。例えば、遺伝子の欠失及び挿入は、通常の遺伝子型と比較し た増幅生産物のサイズ変化から探知することができる。点変異は、増幅DNAを放 射能標識化されたCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1RNA、または放射能標識化されたCkβ-B 、MIP-4、Ckβ-1アンチセンスDNA配列にハイブリッド形成することによって識別 することができる。完全に一致した配列は、RNaseA消化や溶解温度の違いから不 一致二重鎖と見分けることができる。 DNAの配列差違に基づいた遺伝子テストは、変性作用薬を含む、または含ま ないジェルの中で、DNAフラグメントの電気泳動可動性の変化を探知することで 完遂することができる。遺伝子配列の小さな欠失や挿入は、高分解能ジェル電気 泳動によって見ることができる。異なる配列を持つDNAフラグメントは、変性ホ ルムアミド・グラジェント・ジェル(ここでは、異なるDNAフラグメントの可動性 が、特定の溶解温度や部分溶解温度によって、あらゆる位置で遅延する)上で、 見分けることができる。(e.g.,Myersetal,Science,230:1242(1985)) 特定の場所で変化する配列は、RNase保護やSL保護または化学剤分割法など の酵素ヌクレアーゼ保護分析によって明らかにすることができる。(e.g.，Cotto n et al.,PNA.USA.85:4397-4401(1985)) したがって、特定のDNA配列探知は、ハイブリッド形成法、RNase保護、化学 剤分割、DNA直接配列、または制限酵素(例:制限フラグメント長さ多形性(RFLP)) やゲノムDNAのサザンブロット法の使用などの方法によって完遂することができ る。 通常のジェル-電気泳動法及びDNA配列に加え、異変は生体内原位置での分析 によって探知することもできる。 正常にコントロールされた組織のサンプルと比らべて蛋白質が発現過剰であ るいことによって、疾病(腫瘍など)や疾病への敏感性の存在を探知する場合もあ ることから、今回の発明は、あらゆる組識内のCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1蛋白質の 変化レベルを探知する診断分析にも関連している。ホストから取り出されたサン プル内のCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1蛋白質のレベルを探知する分析は、この分野に 詳しい人々に良く知られている。これらの分析には、ラジオイムノ分析、競合結 合分析、ウェスタンブロット分析、エリサ(ELISA)分析、「サンドイッチ」分析 などがある。エリサ(ELISA)分析(Coligan,et al.,Current Prolocols in Immuno logy,1(2).Chapter6,(1991))は、まず始めにCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1抗原に対す る抗体(単クローン抗体が理想的)を準備する。そして単クローン抗体に対してレ ポーター抗体を準備する。レポーター抗体には、放射能、蛍光、特にここでは西 洋わさびペルオキシターゼ酵素などの、検出可能な試薬が付着している。サンプ ル中の蛋白質を結合するために、サンプルはホストから取り出され固定したサポ ート(ポリエチレン皿など)の上でインキュベートされる。そして、皿の上の自由 な蛋白質結合サイトは、BSAなどの不特定の蛋白質とインキュベートすることに よって覆われる。次に、単クローン抗体がポリエチレン皿に付着したCkβ-B、MI P-4、Ckβ-1蛋白質に結合する間に、単クローン抗体が皿上でインキュベートさ れる。非結合の単クローン抗体は、全てバッファーによって洗い流される。西洋 わさびペルオキシターゼとリン クしたレポーター抗体は、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1と結びついたあらゆる単クロ ーン抗体と結合し、皿上に残る。そして、非結合のレポーター抗体は洗い流され る。それから、ペルオキシターゼ基質が皿に加えられる。そして制限時間内の色 の変わり具合で、患者のサンプル内に含まれるCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1蛋白質を 測り、標準曲線と比較する。 競合分析は、固定したサポート及びラベル化したCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1に 付着したCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1に対する抗体や、固定したサポートに乗せられ たホストから取り出されたサンプルに利用することができる。探知されたラベル の量は（液体シンチレーション・クロマトグラフィーなど）、サンプル内の蛋白 質の量と相関している。 「サンドイッチ」分析は、エリサ(ELISA)分析と類似している。「サンドイ ッチ」分析では、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1は固定したサポートに乗せられ、サポ ートに付着した抗体と結合する。そして第2の抗体がCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1と結 合する。それから、ラベル化された、第2抗体用の第3抗体は、固定したサポート にのせられ第2抗体と結合し、それから数量化が可能となる。 今回の発明は、ケモカイン・ポリペプチドのためのレセプターの識別方法を 提供している。レセプターをコード化する遺伝子は、リンガド・パニングやFACS 選別などの、この分野に詳しい人々に良く知られているあらゆる方法で識別する ことができる。(Coligan et al.,Current Protocols in Immu..1(2),Chapter5.( 1991))発現クローニングは、ポリアデニアル酸基を細胞反応からポリペプチドに 準備し、このRNAから創られたcDNAライブラリをプールに分化し、COS細胞または 他のポリペプチドに反応しない細胞を形質移入するのに利用することができる。 ガラスのスライド上で成長した形質移入細胞は、ラベル化したポリペプチドへさ らされる。ポリペプチドは、ヨウ素化、及び特定部位蛋白質キナーゼの認識サイ トの封入などの、あらゆる方法でラベル化することができる。次の固定化及びイ ンキュベーションでは、スライドはオートラジオグラフィー分析の対象となる。 陽性プールが識別され、相互作用のサブプーリング過程及び再スクリーニング過 程を使用することによってサブプールが生産・再形質移入され、結果として推定 上のレセプターをコード化する単一クローンを産出することによって識別される 。 レセプター識別へのもうひとつのアプローヱとして、ラベル化されポリペプ ヱドを、レセプター分子を表す細胞メンブランまたは抽出生産物と光親和性リン クすることができる。クロスリンクした素材は、PAGE分析によって分解され、Ｘ 線フィルムにさらされる。ポリペプヱドのレセプターを含むラベル化された複合 物は、切除したり、ペプヱド・フレグメントに分解したり、酎白質小配列にさら したりすることができる。小配列から得たアミノ酸配列は、推定上のレセプター をコード化する遺淘子を識別するcDNAライブラリをスクリーンするための、変性 オリゴヌクレオヱド・プローブのセットを設計するのに使用することができる。 この発明は、今回発明されたケモカイン・ポリペプチドに対するアゴニスト 及びアンタゴニストをスクリーンする、化合物のスクリーニング法を提供してい る。アゴニストは、ポリペプチドと生物学的に類似した機能を持つ化合物である 。また、アンタゴニストは、こうした機能を妨害する。化学向性は、今回発明さ れたポリペプチドのどれかによって、科学的に誘引された細胞を、それを許容す るだけの十分な直径(5μm)を持つ多孔性フィルタの上に配置することによって分 析することができる。潜在アゴニストのソリューションは、チャンバー上部にあ る適当なコントロール媒体と共に、チャンバーの底に配置する。こうしてアゴニ ストの濃縮グラジェントは、一定時間の後、多孔性メンブランを通って移動する 細胞を数えることによって測定することができる。 アンタゴニストを分析する際は、今回発明されたケモカイン・ポリペプチド をチャンバーの底に配置し、潜在アンタゴニストを加え、化学向性が抑制されて いるかどうかを見る。 別の方法として、哺乳類の細胞またはポリペプチドのレセプターを発現する メンブラン標本を、化合物と共にラベル化されたケモカイン・ポリペプチド(放 射能など)とインキュベートすることもできる。こうして、化合物がこの相互作 用を妨害する能力を測ることができる。この方法でアゴニストを分析すると、ケ モカインがなくなり、アゴニストそのものがレセプターと相互作用する能力を測 定することができる。 CK-β、MIP-4、CK-1潜在アンタゴニストの例としては、抗体、及びある例で はポリペプチドと結びついているオリゴヌクレオチドに含まれているものがある 。もうひとつの潜在アンタゴニストの例としては、ポリペプチドのネガティブ優 性変異がある。ネガティブ優性変異は、あらゆるタイプのポリペプチドのレセプ ターに結合していながら、生物学的活動を保持することのできないポリペプチド である。 また、アンチセンス・テクノロジーを使って生産されたアンチセンス構成も 潜在アンタゴニストである。アンチセンス・テクノロジーは、三重螺旋形成及び アンチセンスDNA‐RNA(どちらの方法もポリヌクレオチドをDNAまたはRNAに結合 することを基本としている)を通して、遺伝子発現を管理するのに使用すること ができる。例えば、今回発明された熟成ポリペプチドをコード化する、ポリヌク レオチド配列のS茶Rード・ポーションは、長さとして約10から40塩基ペアの、ア ンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するのに使用されている。DNAオリゴヌ クレオチドは、転写に関わる遺伝子部位に相補的であるように設計されている。 (triple-helix,Lee et al.,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979);Cooney et al Scien ce,241:456(1988);及びDervan et al.,Science.251:1360(1991)参照)これによっ てケモカイン・ポリペプチドの転写、及び生産が抑えられている。アンチセンス RNAオリゴヌクレオチドは生体内で、mRNAとハイブリッド形成し、mRNA分子がポ リペプチドに変化するのを防ぐ。(antisense-Okano,J.Neurochem.,56:560(1991) ;Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,B oca Raton,FL(1988))また、前述のオリゴヌクレオチドは、ケモカイン・ポリペ プチドの生産を抑制するアンチセンスRNAまたはDNAが生体内で発現するに従って 細胞に配達される。別の潜在ケモカイン・アンタゴニストとしては、自然に、合 成的に変更された類似体、ポリペプチドのペプチド誘導体がある。これは、生物 学的機能を無くしたが、ポリペプチドのレセプターを認識し、これと結合し、よ ってレセプターを効果的に妨害するポリペプチドの類似体である。ペプチド誘導 体の例としては、小ペプチドまたは類似ペプチド分子、その他がある。 アンタゴニストは、MIP誘引・増強の障害(自己免疫、慢性の炎症、感染疾病 など)を治療するのに使用することができる。自己免疫疾病の例としては、あら ゆる硬化症やインシュリン依存の糖尿病がある。 アンタゴニストは、単核貧食細胞の補充や活発化を防ぐことによって、ケイ 肺病、サルコイドーシス、特発性の肺線維病などの感染疾病の治療に利用するこ とができる。またアンタゴニストは、好酸の生産・移動を防ぐことによって、特 発性の過好酸症の治療に利用することができる。また内毒素ショックも、アンタ ゴニストがマクロファージの移動を防いだり、今回発明されたケモカインポリペ プチドを生産することによって治療することができる。 アンタゴニストは、動脈の壁で単球湿潤を防ぐことによって、アテローム性 動脈硬化症を治療するのに使用することができる。 また、アンタゴニストは、ケモカイン誘引マスト細胞、好塩基球脱顆粒、ヒ スタミンの開放を抑制することによって、遅延相アレルギー反応、慢性じんま疹 、アトピー性皮膚炎などの、ヒスタミン媒介のアレルギー反応、及びヒスタミン 媒介の免疫学的障害を治療するのに利用することができる。また、アレルギー性 喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎などのIgE媒介アレルギー反応を 治療することができる。 またアンタゴニストは、単球が創傷に入り込むのを防ぐことによって、慢性 ・急性の炎症を治療するのに使用することができる。また、慢性・急性の炎症性 肺疾患は、肺の単球貧食細胞配列に関係していることから、アンタゴニストは正 常な肺のマクロファージ集団を規制するのに使用することができる。 また、アンタゴニストは、単球が患者の関節内の滑液に入り込むのを防ぐこ とによって、リウマトイド関節炎を治療するのに使用することができる。単球の 流入及び活性化は、退行性関節症及び炎症性関節症の両方の病原に重要な役割を 果たしている。 またアンタゴニストは、IL−1及びTNFに主に属する有害カスケードを妨害し 、他の炎症サイトカインの生合成を防ぐのに利用することができる。この方法に よって、アンタゴニストは、炎症を防ぐのに利用することができる。また、 アンタゴニストは、ケモカインに誘引されるプロスタグランジン非依存性熱 を抑制するのに利用することができる。 また、アンタゴニストは、再生不良性喘息や脊髄形成異常症などの骨髄不全 のケースを治療するのに利用することができる。 また、アンタゴニストは、肺内の好酸球の蓄積を防ぐことによって、喘息や アレルギーの治療に利用することができる。また、アンタゴニストは、喘息の肺 の顕著な特徴である、副上皮性基底メンブラン線維症を治療するのに利用するこ とができる。 アンタゴニストは、下記の例のように、薬剤的認容キャリアの成分に利用す ることができる。 ケモカインポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニストは、適切な薬剤キャ リアを以って成分として利用することができる。これらの成分は、治療として効 果的な量のポリペプチド及び薬剤的容認キャリア、またはエクスシピエント で構成されている。これらのキャリアは、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブ ドウ糖、水、グリセロール、エタノール、上記の成分を組み合わせたもの、その 他を含む。製剤は、薬剤投与の方法に副うものでなければならない。 またこの発明は、今回発明された薬剤成分、ひとつまたは複数で満たされた 容器をひとつまたは複数持つ薬剤パックまたは薬剤キットを提供している。これ らの容器には、薬剤・生体関係製品の生産、売買を規制する行政機関による処方 形式の、注意書きが付いている。この注意書きには、政府機関がヒトへの薬剤投 与に向けた生産、売買を許可したことを示している。加えて、ポリペプチド、ア ゴニスト、アンタゴニストは、その他の治療向け化合物の結合に利用することが できる。薬剤成分は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内などのルート で、好都合な方法で投与することができる。薬剤成分は、治療及び／または特定 の兆侯の予防に効果的な量を投与する。一般的には、ポリペプチドは一日当たり 最低10μg／kg体重を、最高では約８mg／kg体重未満の量を投与する。ほとんど の場合、投与、症状、その他のルートを考慮し、投与量は一日毎に約10μg／kg 体重から1mg／kg体重である。 また、今回の発明によると、ケモカイン・ポリペプチド、ポリペプチドであ るアゴニスト、アンタゴニストは、体内のポリペプチドなどを発現するのに利用 することができる。これは「遺伝子療法」としてしばしば取り上げられる。 これによって、例えば患者から取り出した細胞は、生体外でポリペプチドを コード化するポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）や、設計細胞と設計し、それか ら治療対象の患者にポリペプチドと共に提供することができる。このような方法 は、この分野ではよく知られている。例えば、細胞はこの分野で知られている手 順で設計することができる。それは、今回発明されたポリペプチドをコード化す るRNAを含む、レトロウィルス粒子を使用する方法である。 これと類似した倦で、細胞は生体内でポリペプヱドを発現させるために設計 される。生体内で、というのは、例えばこの分野で知られている手順である。こ の分野で知られているように、今回発明されたポリペプヱドをコード化するRNA を含む、レトロウィルス粒子を生産する生産株細胞は、生体内で細胞を設計した り、生体内でポリペプヱドを発現したりするために、患者に投与することができ る。今回発明されたポリペプヱドを投与する方法は他にもある。これらの方法は 、今回の発明を教授することによって、この分野に詳しい人々に明白になるはず である。例えば、設計細胞のための発現浴媒は、レトロウィルス以外の、例えば 適切な配達浴媒と組み合わせた後、生体内で細胞を設計するのに利用することの できる、アデノウィルスでもよい。 レトロウィルス・プラスミド・ベクターは、モロニー、マウス肉腫ウィルス 、モロニーマウス白血病ウィルス、脾臓壊死ウィルス、ラウス肉腫ウィルス、ハ ーベイ肉腫ウィルス、その他などを含むレトロウィルスから取り出すことができ る。好ましい具体物として、レトロウィルスの発現ベクター、pMV-7は、モロニ ーマウス肉腫ウィルスの末端反復配列（LTPs）に隣接し、単純ヘルペスウィルス （HSV）チミジンキナーゼ(tk)の規制下にある、選択可能な薬剤抵抗性遺伝子ネ オを含んでいる。 ユニークなBcoRI及びHindIIIサイトは、配列コードの挿入を促進する。(Kir schmeier,P.T.et al.,DNA,7:219-25(1988)) ベクターは、レトロウィルスLTR;SV40プロモーター;ヒトのサイトメガロウ ィルス（CMV）プロモーター（CMV）（Miller,et al.,Biolechniques,Vol.7,No.9 ,980-990(1989)で舞写）またはその他の細胞プロモーター（ヒストミン、polIII 、βアクヱンプロモーター、その他を含む真核生物細胞プロモーター）などを含 む、適切なプロモーターを持つ。適当なプロモーターの選択は、ここで示される 教授によってこの分野に詳しい人々に明白にされる。 今回発明された、ポリペプヱドをコード化する核酸配列は、単純ヘルペスヱ ミジンキナーゼ、レトロウィルスLTRs、βアクヱンプロモーター、ポリペプヱド をコード化する遺淘子を統制する、自然のプロモーターなどの、ウィルス性ヱミ ジンキナーゼプロモーター、その他を含む適当なプロモーターの統制下にある。 レトロウィルス・プラスミド・ベクターは、パッケージング細胞系統を形質 導入し、過程細胞系統を形作るのに利用することができる。形質移入される可能 性のあるパッケージング細胞の例としては、PR501、PA317、GP+am12、その他が ある。ベクターは、この分野で知られるいかなる方法によって形質導入してもよ い。これらの方法には、電気穿孔法、リポソームや沈殿CaPO４の使用、その他が ある。 生産者細胞系列は、感染性のレトロウィルスのベクター粒子を生成し、それ は、ポリペプヱドを符号化する核酸連続体(sequesnce)を含む。このレトロウィ ルスのベクター粒子は、eukaryotic細胞を変換するために生体外または生体内で 使用することができる。変換されたeukaryotic細胞は、ポリペプヱドを符号化す る核酸連続体を発現する。変換されるeukaryotic細胞には、繊維芽細胞および内 皮細胞を含 むが、これらに限定されるわけではない。 当発明の連続体は、染色体の識別にも貴重なものである。その連続体は特に 個人の染色体の特定の場所をターゲットにし、それとかけ合わせることができる 。それ以上に、染色体の特定の場所を識別することに対するニーズが、今あると いうことだ。実際の連続体データに基づく染色体マーク試剤で、染色体の場所を マークできるものは現在ほとんどない。当該発明に従って染色体に対してＤＮＡ を並べる[mapping]ことは、それらの連続体を病気に関連する遺伝子と相関させ ることにおける重要な最初のステップである。 簡単に言えば、連続体は、cDNAからPCRプライマー(primers)（１５−２５ｂ ｐが望ましい）を準備することによって、染色体上に並べることができる。拡大 プロセスを複雑化しないように、ゲノム状DNAにおいて１エクソン以上広がらな いプライマーを素早く選ぶために、cDNAをコンピュータで分析する。それから、 これらのプライマーは、個人の染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリー ニングに使われる。そのプライマーに符号する人間の遺伝子を含むハイブリッド のみが拡大された小片を生産することになる。 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に 素早く割り当てるための方法である。当該発明を同じオリゴヌクレオチドに使用 し、特定の染色体からの小片がパネル状になったもの、または、大きなゲノム状 (genomic)クローンの集まりについても、類似の方法で、副次的位置測定(subloc alization)ができる。同様の染色体に対する位置決めに使えるその他のマッピン グ戦略としては、正常位置での雑種形成、標識付けされ、フロー分類された染色 体の事前スクリーニング、および、染色体特定のｃＤＮＡのライブラリーを作る ための雑種形成による事前選択がある。 ｃＤＮｑクローンの中期染色体展性に対する蛍光性の正常位置での雑種倦成 （ＦＩＳＨ）は、一ステップで、正確な染色体の位置を提供するために、使用す ることができる。このテクニックは、５００から６００ベーシスといった短いｃ ＤＮｑにまで、使うことができる。このテクニックについては、Verma et al.,H uman Chromsomes:a Manual of Basic Techniques（人間の染色体：基本テクニッ クのマニュアル）ペルガモン・プレス、ニューヨーク（１９８８）を参照のこと 。 一旦連続体が正確な染色体の場所に位置づけられると、その連続体の染色体 上の物理的位置は、遺伝学的地図のデータと相関させることができる。 そうい ったデータは、例えば、Ｖ．McKusick,Mendelian Inheritance in Man(人間にお けるメンデル学的遺伝)（ジョーンズ・ホプキンズ大学ウェルチ医学図書館から オンラインで入手できる）の中で見つけることができる。 同じ染色体の部位に 位置づけられた遺伝子と病気は、次には連鎖分析（物理的に隣接した遺伝子の共 同継承）を通して識別される。 次に、桝された個人と桝されていない個人との間にあるｃＤＮｑまたはゲノ ム連続体における違いを決定する必要がある。 もし、突然変異が桝された個人 の何人かまたはすべてに観察され、正常な個人のいずれにも見られない場合、そ の突然変異はその病気の原因となるものであると思われる。 現在の物理的マッピングおよび遺伝学的マッピングのテクニックによる解明 においては、病気に関連する染色体部位に正確に局部化されたｃＤＮＡは、５０ から５００の潜在的な起因遺伝子のうちの一つであることが考えられる。 ポリペプヱド、その小片またはその他の派生物、または、その類似物、また はそれを示している細胞は、それに対する抗体を生産するための免疫源として、 使用することができる。これらの抗体は、例えば、多クローンまたは単クローン 抗体であることができる。この発明には、また、キメラの、単一連鎖の、そして 、人 体に適応された抗体、同時に、Ｆａｂ小片、または、Ｆａｂ発現ライブラリーの 産物が含まれる。そのような抗体および小片の生産には、この分野で知られてい るさまざまな方法が使用できる。 当発明の連続体に符号するポリペプチドに対して生成された抗体またはその 生体内の受容器官は、ポィペプチドを動物の体内に直接注入することによって、 または、ポリペプチドを動物、できれば人間以外の動物、に投与することによっ て得ることができる。そのようにして入手した抗体は、ポリペプチド自体を凝結 させるだろう。この方法で、ポリペプチドの一片のみを符号化している連続体で さえも、元々のポリペプチド全体を凝結させる抗体を生成するために使用するこ とができる。例として、ハイプリドーマのテクニック(Kchler and Milsteirn,19 75,Nature,256:495-497)、トリオーマのテクニック、人間のＢ細胞ハイブリドー マのテクニック(Kozbor et al.,1983,Immunology Today4;72)、および、人間の 単クローン抗体生産のためのＲＢＶ−ハイブリドーマ・テクニック(Cole,et al. ,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy（単クローン抗体とガンの治 療）,AlanR.Lize,Inc.,pp.77-96)がある。 単一連鎖抗体（米国特許4,946,778）産出のために述べられているテクニッ クは、当発明の免疫源ポリペプチド産物に対する単一連鎖抗体を産出するために 適応させることができる。また、トランスジェニックのマウスを使って、人間に 適応された抗体をこの発明の免疫源ポリペプチド産物に発現させることもできる 。 当発明は、さらに、以下の例に関連してさらに深く述べられるだろう。しか しながら、当発明はこれらの例に限られたものではないということを理解する必 要がある。すべての割合または量は、他に表示がなければ、重さとする。以下の 例に関する理解を促進するために、頻繁に出てくる方法、および/または、用語 を述べることにしよう。 「プラスミド」は、小文字のｐの前および/または後に大文字の文字および/ または数字を付けて表される。本書にある当初のプラスミッドは、商業的に入手 できるか規制なしで一般に入手できるか、または、公表されている方法に合った やり方で、入手可能なプラスミッドから形成できる。加えて、述べられているプ ラスミッドと同等のプラスミッドはこの分野では周知のことで、通常の技能を持 った職人であれば明白なことである。 ＤＮｑの「消化」とは、ＤＮｑ内にある特定の連続体に対してのみ活動する 限定的酵素を持つＤＮｑの触媒***を意味する。本書で使われているいろいろな 限定的酵素は、商業的に入手でき、その反応条件、補助要因およびその他の必要 条件は、通常の技能を持った職人には周知の方法で使用した。分析的目的のため に、通常、約２０μｌの緩衝液に約２ユニットの酵素を入れたものといっしょに １μｇのプラスミッドまたはＤＮｑ小片を使用する。プラスミッド倦成のために ＤＮｑ小片を分離させるには、通常、５から５０μｇのＤＮｑが２０から２５０ ユニットの酵素といっしよにより大きな容量の中で消化される。特定の限定的酵 素に適した緩衝器および基質の量は、製造者によって特定される。３７°Cで約 １時間という培養時間が、通常、使われるが、仕入先の指示に従って変化するか もしれない。消化の後、その反応は、望みの小片を分離するため、ポィアクリル アミドのゲル上で、直接電気泳動にかけられる。***した小片の大きさの分離が 、Goeddel,D.et al.,Nucleic Acids Res.,8-4057(1980)によって述べられている ８パーセントのポィアクリルアミドのゲルを使って行われる。 「オリゴヌクレオヱド」とは、単一のラセン構造のポリデオクシヌクレオヱ ドまたは二つの相補性ポリデオクシヌクレオヱドのストランドを示し、それらは 化学的に合成可能である。そのような合成オリゴヌクレオヱドは、５’亜燐酸塩 を持たないので、キナーゼがあるところでATPと共に亜燐酸塩を加えないと、も う一つのオリゴヌクレオヱドと結合しない。 合成オリゴヌクレオヱドは、脱燐 酸化されなかった小片と結合する「結合(Ligation)」とは、二つの二重ラセン上 の核酸小片間にホスホジェスターの結束を形成する過程を意味する(Maniatis,T. ,et al.,Id.,p.146)。 他に表示がなければ、結合は周知の緩衝器と、およそ等モル濃度の結合され るべきDNA小片０．５μｇ当たりT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）に対し１０ユ ニットという条件をつかって達成することができる。 他に表示がなければ、変換は、Graham,F.とVan der Eb,A.,Virology（ウイ ルス学）(1973)の方法の中で述べられているやり方で実施した。 例１ バクテリアの発現とCkβ-8の浄化 Ckβ-8を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５６７６、は、Ckβ-8遺伝子 に対し、処理されたCkβ-8タンパク質の５’と３’限度の連続体（マイナス、シ グナル・ペプチド連続体）に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド・プリマーとベ クター連続体３’を使って、増幅した。Ｂａｍ ＨＩとＸｂａＩに対応するヌク レオチドを、５’と３’の連続体にそれぞれに追加した。５’のオリゴヌクレオ チド・プリマーは、連続体５’TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA３’(SEQ ID No.7) を持ち、ＢａｍＨＩ限定的酵素サイトとそれに続く処理済みタンパク質の最終と されるアミノ酸から始まるCkβ-8暗号のついた連続体の１８のヌクレオチドを含 む。３’連続体５’CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT３’(SEQ ID No.8)は、Ｘｂａ Ｉサイトに対する相補的連続体を含む。限定的酵素のサイトは、バクテリアの発 現ベクターＰＱＥ-9(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)上の限定的酵素と対応する。 ＰＱＥ-9は、抗生抵抗（Ａｍｐ１）、複製のバクテリアの源(ori)、ＩＰＴＧ規 制の可能なプロモーター・オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合サイト（Ｒ ＢＳ）、６−Ｈｉｓ標識と限定的酵素のサイトを符号化する。pQE-9が、次ぎに 、ＢａｍＨＩとＸｂａＩに消化される。増幅された連続体は、ＰＱＥ-9の中に結 合され、ヒスヱジン標識とＲＢＳのために符号化している連続体といっしよにフ レームに挿入される。 その結合ミックスは、次に、Ｏｉａｇｅｎから入手できるＥコライ菌株Ｍ１ ５／ｒｅｐ４を変換するために使用される。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プラシミッド pREP4の複数のコピーを含み、それは、lacIリプレッサーを発現し、また、カナ マイシン耐性(Kanl)をも与える。ＬＢプレート上で成長する能力によって、変換 物質が識別され、アンピシリン/カナマイシン耐性群体が選択される。プラシミ ッドＤＮＡが限定分析によって、分離され、確認される。Ａｍｐ(100ug/ml)とＫ ａｎ(25ug/ml)の両方を追加したＬＢメディアの培養液の中で、望みの構成物を 含むクローンが、一晩（Ｏ／Ｎ）で、培養された。そのＯ／Ｎ培養物が、１：１ ００対１：２５０の比率で、大きな培養を植え付けるために使われた。細胞は０ ．４から０．６の間の光学濃度６００(Ｏ．Ｄ．[illegible])まで、成長させた 。次に、ＩＰＴＧ(的sopropyl-B-D-thiogalactopyranoside)が、最終濃度１ｍＭ まで、加えられた。ＩＰＴＧは、lacIリプレッサーを不活性化し、遺伝子発現の 増加につながるＰ／Ｏを除去することによって、誘導する。細胞は、さらに余分 に３から４時間培養される。細胞は、次に、遠心分離によって採取される。細胞 のペレットはケーオトロピック(chaotropic)剤６モル・グアニダインＨＣ１の中 で、溶解される。浄化の後、溶解されたCkβ-8は、６-Ｈｉｓ標識を含むタンパ ク質による堅い結合が許される条件の下でニッケル-キレート柱上で、クロマト グラフィーによって、この溶液から精製される(Hochuli,E.et al.,J.クロマトグ ラフィー411:177-184 (1984))。 Ckβ-8（９５％純粋）が、６モル・グアニダインＨＣ１ ５．０ペ ーハーから抽出され、そして、復元のために、３モル・グアニダインＨＣ１、１ ００ｍＭ燐酸ナトリウム、１０モル・グルタチオン（還元された）、および、２ モル・グルタチオン（酸化された）に調整された。この溶液に１２時間定温放置 された後、タンパク質は１０モル・燐酸ナトリウムに透析される。 例２ バクテリアの発現とＭＩＰ-4の浄化 ＭＩＰ-4を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５６７５は、ＭＩＰ-4遺伝 子に対し、処理されたＭＩＰ-4タンパク質の５’と３’限度の連続体（マイナス 、シグナル・ペプチド連続体）に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド・プリマー を使って増輻した。Ｂａｍ ＨＩとＸｂａＩに対応するヌクレオチドを、５’と ３’の連続体にそれぞれに追加した。５’のオリゴヌクレオチド・プリマーは、 連続体５’TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC３’(SEQ ID No.9)を持ち、ＢａｍＨＩ 限定的酵素サイトとそれに続く処理済みタンパク質の最終とされるアミノ酸から 始まるＭＩＰ-4暗号の付いた連続体の１８のヌクレオチドを含む。３’連続体５ ’CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT３’(SEQ ID No.10)は、ＸｂａＩサイトに対する 相補的連続体を含む。限定的酵素のサイトは、バクテリアの発現ベクターＰＱＲ -9(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)上の限定的酵素と対応する。ＰＱＥ-9は、抗生 抵抗（Ａｍｐ１）、複製のバクテリアの源(ori)、ＩＰＴＧ規制の可能なプロモ ーター・オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）、６−Ｈｉ ｓ標識と限定的酵素のサイトを符号化する。pQE-9が、次ぎに、ＢａｍＨＩとＸ ｂａＩに消化される。増幅された連続体は、ＰＱＥ-9の中に結合され、ヒスヱジ ン標識とＲＢＳのために符号化している連続体といっしょにフレームに挿入され た。その結合ミックスは、次に、Ｏｉａｇｅｎから入手できるＥコライ菌株を変 換するために使用される。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プラシミッドpREP4の複数のコ ピーを含み、それは、lacIリプレッサーを発現し、また、カナマイシン耐性(Kan 1)をも与える。ＬＢプレート上で成長する能力によって、変換物質が識別され、 アンピシリン/カナマイシン耐性群体が選択される。プラシミッドＤＮｑが限定 分析によって、分離され、確認された。ｑｍｐ(100ug/ml)とＫａｎ(25ug/ml)の 両方を追加したＬＢメディアの培養液の中で、望みの構成物を含むクローンが、 一晩（Ｏ／Ｎ）で、培養された。そのＯ／Ｎ培養物が、１：１００対１：２５０ の比率で、大きな培養を植え付けるために使われた。細胞は０．４から０．６の 間の光学濃度６００(Ｏ．Ｄ．[illegible])まで、成長させた。次に、ＩＰＴＧ( 的sopropyl-B-D-thiogalactopyranoside)が、最終濃度１ｍＭまで、加えられた 。 ＩＰＴＧは、lacIリプレッサーを不活性化し、遺伝子発現の増加につながる Ｐ／Ｏを除去することによって、誘導する。細胞は、さらに余分に３から４時間 培養された。細胞は、次に、遠心分離によって採取された。細胞のペレットはケ ーオトロピック(chaotropic)剤６モル・グアニダインＨＣ１の中で、溶解された 。浄化の後、溶解されたＭＩＰ-4は、６-Ｈｉｓ標識を含むタンパク質による堅 い結合が許される条件の下でニッケル-キレート柱上で、クロマトグラフィーに よって、この溶液から精製された(Hochuli,E.et al.,J.クロマトグラフィー411: 177-184(1984))。ＭＩＰ-4（９５％純粋）が、６モル・グアニダインＨＣ１ ５ ．０ペーハーから抽出され、そして、復元のために、３モル・グアニダインＨＣ １、１００ｍＭ燐酸ナトリウム、１０モル・グルタチオン（還元された）、およ び、２モル・グルタチオン（酸化された）に調整された。この溶液に１２時間定 温放置された後、タンパク質は１０モル・燐酸ナトリウムに透析された。 例３ バクテリアの発現とCkβ-1の浄化 Ckβ-1を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５572、は、Ckβ-1遺伝子に対 し、処理されたCkβ-1タンパク質の５’と３’限度の連続体（マイナス、シグナ ル・ペプチド連続体）に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド・プリマーを使って 増幅した。Ｂａｍ ＨＩとＸｂａＩに対応するヌクレオチドを、５’と３’の連 続体にそれぞれに追加した。５’のオリゴヌクレオチド・プリマーは、連続体５ ’GCCCGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC３’(SEQ ID No.11)を持ち、ＢａｍＨＩ限定 的酵素サイトとそれに続く処理済みタンパク質コドンの最終とされるアミノ酸か ら始まるCkβ-1暗号の付いた連続体の１５のヌクレオチドを含む。３’速続体５ ’GCCTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG３’(SBQ ID No.12)は、ＸｂａＩサイトに 対する相補的連続体、翻訳停止コドン、および、Ckβ-1暗号のついた連続体の最 後の２０のヌクレオチドをを含む。限定的酵素のサイトは、バクテリアの発現ベ クターＰＱＥ-9(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)上の限定的酵素と対応する。ＰＱ Ｅ-9は、抗生抵抗（Ａｍｐ１）、複製のバクテリアの源(ori)、ＩＰＴＧ規制の 可能なプロモーター・オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ ）、６−Ｈｉｓ標識と限定的酵素のサイトを符号化する。ＰＱＥ-9が、次ぎに、 ＢａｍＨＩとＸｂａＩと共に消化された。増幅された連続体は、ＰＱＥ-9の中に 結合され、ヒスチジン標識とＲＢＳのために符号化している連続体といっしょに フレームに挿入された。その結合ミックスは、次に、ＯｉａｇｅｎからＭ１５／ ｒｅｐ４という商標名で入手できるＥコライ菌株を変換するために使用された。 Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プラシミッドpREP4の複数のコピーを含み、それは、lacI リプレッサーを発現し、また、カナマイシン耐性(Kan1)をも与える。ＬＢプレー ト上で成長する能力によって、変換物質が識別され、アンピシリン/カナマイシ ン耐性群体が選択された。プラシミッドＤＮＡが限定分析によって、分離され、 確認された。Ａｍｐ(100ug/ml)とＫａｎ(25ug/ml)の両方を追加したＬＢメディ アの培養液の中で、望みの構成物を含むクローンが、一晩（Ｏ／Ｎ）で、培養さ れた。 そのＯ／Ｎ培養物が、１：１００対１：２５０の比率で、大きな培養を 植え付けるために使われた。細胞は０．４から０．６の間の光学濃度６００(Ｏ ．Ｄ．600)まで、成長させた。次に、ＩＰＴＧ(的sopropyl-B-D-thiogalactopyr anoside)が、最終濃度１ｍＭまで、加えられた。ＩＰＴＧは、lacIリプレッサー を不活性化し、遺伝子発現の増加につながるＰ／Ｏを除去することによって、誘 導する。細胞は、さらに余分に３から４時間培養された。 細胞は、次に、遠心 分離によって採取された。細胞のペレットはケーオトロピック(chaotropic)剤６ モノレ・グアニダインＨＣ１の中で、溶解される。浄化の後、溶解されたCkβ-1 は、６-Ｈｉｓ標識を含むタンパク質による堅い結合が許される条件の下でニッ ケル-キレート柱上で、クロマトグラフィーによって、この溶液から精製された( Hochuli,E.et al.,J.クロマトグラフィー411:177-184(1984))。Ckβ-1（９５％ 純粋）が、６モル・グアニダインＨＣ１ ５．０ペーハーから抽出され、そして 、復元のために、３モル・グアニダインＨＣ１、１００ｍＭ燐酸ナトリウム、１ ０モル・グルタチオン（還元された）、および、２モル・グルタチオン（酸化さ れた）に調整された。 この溶液に１２時間定温放置された後、タンパク質は１０モル・燐酸ナトリ ウムに透析される。 例４ ＣＯＳ細胞内における組み換えCkβ-8の発現 プラスミッド、ＣＭＶ-Ckβ-8Ｈｑの発現は、次ぎのものを含むベクターｐ ｃＤＮｑＩ／ｑｍｐ（生体外因子）から導かれる：１）複製のＳＶ４０源、２） アンピシリンに耐性のある遺淘子、３）Ｅ．コライ複製源、４）ＣＭＶプロモー ターとそれに続くポリリンカー部位、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニレー ション・サイト。Ckβ-8先駆物質のすべて、および、フレームの３’の終わりに 融合されたＨｑ標識を符号化したＤＮｑの小片が、ベクターのポリリンカー部位 にクローンされ、それによって、組み換えタンパク質の発現がＣＭＶプロモータ ーの下で指図される。Ｈｑ標識は、前に述べられている通り(I.Wilson,et.al.,C ell（細胞）,37:767(1984)),インフルエンザの血球凝集素タンパク質から導き出 されたエピトープに対応する。ターゲットとなるタンパク質にＨｑ標識を注入す ることによって、Ｈｑエピトープを認識する抗体で、組み換えタンパク質が簡単 に検知できるようになる。 プラスミッドの構築戦略は、以下に述べる通り： Ckβ-8を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５６７６、は、２つのプリマ ーを使ってＰＣＲによって構築される：５’プリマー５’GGAAAGCTTATGAAGGTCTC CGTGGCT３’(SEQ ID No.13)は、ＨｉｎｄＩＩＩサイトとそれに続く始動コドン から始まるCkβ-1暗号の付いた連続体の１のヌクレオチドを含む：３’連続体５ ’CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC３’(SEQ ID No.14)は、ＸｂａＩサイトに対する相補的連続体、翻訳停止コドン、ＨＡ標識 、および、Ckβ-8を暗号化した連続体（停止コドンは含まない）の最後の２０の ヌクレオチドをを含む。それゆえ、PCR生成物は、HindIIIサイト、Ckβ-8を暗号 化した連続体とそれに続くフレームに融合されたHA標識、HA標識のとなりにある 終了停止コドン、および、XbaIサイトを含む。PCR増幅されたDNA小片およびベク ター、ｐｃDNAI/Amp、はHindIIIおよびXbaI限定的酵素と共に消化され、結合さ れる。結合ミックスは、Eコライ菌株に変換される。SURE(Strategene Cloning S ystems,La Jolla,CA)、変換された培養組織が、アンピシリンのメディア・プレ ートの上で培養され、耐性群体が選択される。プラスミッドDNAが変換物質から 分離され、正確な小片の存在が、限定分析によって検査される。組み換えCkβ-8 発現のため、COS細胞が発現ベクターによってDRAE[illegible]-DEXTRAN方法(J.S ambrook,E.Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloneing（分子のクローニング）:A Laboratory Manual,cold Spring Laboratory Press,(1989))を使ってトランスフ ェクトされる。 Ckβ-8-HAタンパク質が放射性同位元素識別および免疫沈降法( E.Harlow,D.Lane,Antibodies（抗体）:A Laboratory Manual,Cold spring Harbo r Laboratory Press,(1988))によって検出される。細胞は、トランスフェクショ ンの２日後、35S-システインで、８時間にわたって標識付けされる。次に、培養 メディアが集められ、細胞が洗浄剤（RIPA緩衝(NaCl 150mM,NP-40 1%,SDS 0.1%, NP-40 1%,DOC 0.5%,Tris 50mM,7.5ペーハー）（Wilson,I.et.al.,Id.37:767(198 4))によって溶解される。細胞溶解物と培養メディアの両方が、HA特定モノクロ ナル抗体と共に沈殿される。沈殿したタンパク質が、SDS-PAGE 15%のゲル上で分 析される。 例５ ＣＯＳ細胞内における組み換えMIP-4の発現 プラスミッド、ＣＭＶ-MIP-4Ｈｑの発現は、次ぎのものを含むベクターｐｃ ＤＮｑＩ／ｑｍｐ（生体外因子）から導かれる：１）複製のＳＶ４０源、２）ア ン ピシリンに耐性のある遺淘子、３）Ｅ．コライ複製源、４）ＣＭＶプロモーター とそれに続くポリリンカー部位、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニレーショ ン・サイト。 MIP-4先駆物質のすべて、および、フレームの３’の終わりに融 合されたＨｑ標識を符号化したＤＮｑの小片が、ベクターのポリリンカー部位に クローンされ、それによって、組み換えタンパク質の発現がＣＭＶプロモーター の下で指図される。 Ｈｑ標識は、前に述べられている通り(I.Wilson,et.al.,C ell（細胞）,37:767(1984)),インフルエンザの血球凝集素タンパク質から導き出 されたエピトープに対応する。 ターゲットとなるタンパク質にＨｑ標識を注入 することによって、Ｈｑエピトープを認識する抗体で、組み換えタンパク質が簡 単に検知できるようになる。 プラスミッドの構築戦略は、以下に述べる通り： MIP-4を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５６７５、は、２つのプリマー を使ってＰＣＲによって構築される：５’プリマー５’GGAAAGCTTATGAAGGGCCTTG CATGCTGCC３’(SEQ ID No.15)は、ＨｉｎｄＩＩＩサイトとそれに続く始動コド ンから始まるMIP-4暗号の付いた連続体の１のヌクレオチドを含む：３’連続体 ５’CGCTCTAGATCAABCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCAGGTC３’(SEQ ID No.16)は、ＸｂａＩサイトに対する相補的連続体、翻訳停止コドン、ＨＡ標識 、および、MIP-4を暗号化した連続体（停止コドンは含まない）の最後の19のヌ クレオチドをを含む。それゆえ、PCR生成物は、HindIIIサイト、MIP-4を暗号化 した連続体とそれに続くフレームに融合された時標識、HA標識のとなりにある終 了停止コドン、および、XbaIサイトを含む。PCR増幅されたDNA小片およびベクタ ー、ｐｃDNAI/Amp、はHindIIIおよびXbaI限定的酵素と共に消化され、結合され る。 結合ミックスは、Eコライ菌株に変換される。SURE(Strategene Cloning S ystems,La Jolla,CA)、変換された培養組織が、アンピシリンのメディア・プレ ートの上で培養され、耐性群体が選択される。プラスミッドDNAが変換物質から 分離され、正確な小片の存在が、限定分析によって検査される。組み換えMIP-4 発現のため、COS細胞が発現ベクターによってDRAE[illegible]-DEXTRAN方法(J.S ambrook,E.Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloneing（分子のクローニング）:A Laboratory Manual,cold Spring Laboratory Press,(1989))を使ってトランスフ ェクトされる。MIP-4-HAタンパク質が放射性同位元素識別および免疫沈降法(E.H arlow,D.Lane,Antibodies（抗体）:A Laboratory Manual,Cold spring Harbor L aboratory Press,(1988))によって検出される。細胞は、トランスフェクション の２日後、35S-システインで、８時間にわたって標識付けされる。次に、培養メ ディアが集められ、細胞が洗浄剤（RIPA緩衝(NaCl 150mM,NP-40 1%,SDS 0.1%,NP -40 1%,DOC 0.5%,Tris50mM,7.5ペーハー）(Wilson,I.et.al.,Id.37:767(1984)) によって溶解される。細胞溶解物と培養メディアの両方が、HA特定モノクロナル 抗体と共に沈殿される。沈殿したタンパク質が、SDS-PAGE 15%のゲル上で分析さ れる。 例６ ＣＯＳ細胞内における組み換えCkβ-1の発現 プラスミッド、ＣＭＶ-Ckβ-1Ｈｑの発現は、次ぎのものを含むベクターｐ ｃＤＮｑＩ／ｑｍｐ（生体外因子）から導かれる：１）複製のＳＶ４０源、２） アンピシリンに耐性のある遺淘子、３）Ｅ．コライ複製源、４）ＣＭＶプロモー ターとそれに続くポリリンカー部位、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニレー ション・サイト。Ckβ-1先駆物質のすべて、および、フレームの３’の終わりに 融合されたＨｑ標識を符号化したＤＮｑの小片が、ベクターのポリリンカー部位 にクローンされ、それによって、組み換えタンパク質の発現がＣＭＶプロモータ ーの 下で指図される。Ｈｑ標識は、前に述べられている通り(I.Wilson,et.al.,Cell （細胞）,37:767(1984)),インフルエンザの血球凝集素タンパク質から導き出さ れたエピトープに対応する。ターゲットとなるタンパク質にＨｑ標識を注入する ことによって、Ｈｑエピトープを認識する抗体で、組み換えタンパク質が簡単に 検知できるようになる。 プラスミッドの構築戦略は、以下に述べる通り： Ckβ-1を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５572、は、２つのプリマーを 使ってＰＣＲによって構築された：５’プリマー５’GGAAAGCTTATGAAGATTCCGTGG CTGC３’(SEQ ID No.17)は、ＨｉｎｄＩＩＩサイトとそれに続く始動コドンから 始まるCkβ-1暗号の付いた連続体の１のヌクレオチドを含む；３’連続体５’CG CTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG３’(SEQ ID No.1 8)は、ＸｂａＩサイトに対する相補的連続体、翻訳停止コドン、ＨＡ標識、およ び、Ckβ-1を暗号化した連続体（停止コドンは含まない）の最後の19のヌクレオ チドをを含む。それゆえ、PCR生成物は、HindIIIサイト、Ckβ-1を暗号化した連 続体とそれに続くフレームに融合されたHA標識、HA標識のとなりにある終了停止 コドン、および、XbaIサイトを含む。PCR増幅されたDNA小片およびベクター、ｐ ｃDNAI/Amp、はHindIIIおよびXbaI限定的酵素と共に消化され、結合される。結 合ミックスは、Eコライ菌株に変換される。SURE(Strategene Cloning Systems,L a Jolla,CA)、変換された培養組織が、アンピシリンのメディア・プレートの上 で培養され、耐性群体が選択された。プラスミッドDNAが変換物質から分離され 、正確な小片の存在が、限定分析によって検査された。組み換えCkβ-1発現のた め、COS細胞が発現ベクターによってDRAE[illegible]-DEXTRAN方法(J.Sambrook, B.Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloneing（分子のクローニング）:A Laborato ry Manual,cold Spring Laboratory Press,(1989))を使ってトランスフェクトさ れる。Ckβ-1-HAタンパク質が放射性同位元素識別および免疫沈降法(E.Harlow,D .Lane,Antibodies（抗体）:A Laboratory Manual,Cold spring Harbor Laborato ry Press,(1988))によって検出された。細胞は、トランスフェクションの２日後 、35[illegible]S-システインで、８時間にわたって標識付けされた。次に、培 養メディアが集められ、細胞が洗浄剤（RIPA緩衝(NaCl 150mM,NP-40 1%,SDS 0.1 %,NP-40 1%,DOC 0.5%,Tris50mM,7.5ペーハー）(Wilson,I.et.al.,Id.37:767(198 4))によって溶解される。細胞溶解物と培養メディアの両方が、HA特定モノクロ ナル抗体と共に沈殿された。沈殿したタンパク質が、SDS-PAGE 15%のゲル上で分 析された。 例７ ヒトの組織におけるCkβ-8の発現パターン ノーザーン(Northern)のプロット分析は、ヒトの組織内でのCkβ-8の発現レ ベルを検査するために実施された。全部の細胞RNAサンプルが、RNAzol(TM)Bシス テム(Biotecx Labortories,Inc.,Houston,TX77033)で分離された。特定されたそ れぞれの人組織から分離された総RNAから約１０ugが、１％のアガローズ・ゲル 上で分離され、５０ngのDNA小片が付いているストラタジーン・プライム-イット のキットに従って、ナイロン・フィルター(Sambrook,Fritsch,and Maniatis,Mol ecular Cloning（分子のクローニング）,Cold Spring Harbor Press,(1989))の 上に塗りつぶされる。標識がつけられたDNAは、セレクト-G-50柱で清浄される。 （5Prime-3Prime,Inc.Boulder,CO)そのフィルターは、次に、NaPO4 0.5M,7.4ペ ーハー,SDS 7％の中で1,000.000cpm/mlで放射性ラベルが付けられたCkβ-8遺伝 子全体と６５℃で一晩置き、雑種形成さ れる。0.5倍(0.5x)のSSC,SDS 0.1%で室温で２回、６０℃で２回洗浄した後、そ のフィルターは、増強スクリーンで、一晩、-70℃にさらされる。 例８ 人間の細胞におけるMIP-4の発現パターン ノーザーン(Northern)のプロット分析は、ヒトの細胞内でのMIP-4の発現レ ベルを検査するために実施された。全部の細胞RNAサンプルが、RNAzol(TM)Bシス テム(Biotecx Labortories,Inc.,Houston,TX)で分離された。特定されたそれぞ れの人組織から分離された総RNAから約１０ugが、１％のアガローズ・ゲル上で 分離され、５０ngのDNA小片が付いているストラタジーン・プライム-イットのキ ットに従って、ナイロン・フィルター(Sambrook.Fritsch,and Maniatis,Molecul ar Cloning（分子のクローニング）,Cold Spring Harbor Press,(1989))の上に 塗りつぶされた。標識がつけられたDNAは、セレクト-G-50柱で清浄された。(5Pr ime-3Pri1e,Inc.Boulder,CO)そのフィルターは、次に、NaPO4 0.5M,7.4ペーハー ,SDS 7%の中で1,000,000cpm/mlで放射性ラベルが付けられたMIP-4遺伝子全体と ６５℃で一晩置き、雑種形成された。0.5倍(0.5x)のSSC,SDS0.1％で室温で２回 、６０℃で２回洗浄した後、そのフィルターは、増強スクリーンで、一晩、-70 ℃にさらされた。 例９ 人間の組織におけるCkβ-１の発現パターン ノーザーン(Northern)のプロット分析は、人間の組織内でのCkβ-1の発現レ ベルを検査するために実施された。 全部の細胞RNAサンプルが、RNAzol(TM)Bシ ステム(Biotecx Labortories,Inc.,Houston,TX)で分離された。 特定されたそ れぞれの人組織から分離された総RNAから約１０ugが、１％のアガローズ・ゲル 上で分離され、５０ngのDNA小片が付いているストラタジーン・プライム-イット のキットに従って、ナイロン・フィルター(Sambrook,Fritsch,and Maniatis,Mol ecular Cloning（分子のクローニング）,Cold Spring Harbor Press,(1989))の 上に塗りつぶされた。標識がつけられたDNAは、セレクト-G-50柱で清浄される。 (5Prime-3Prime,Inc.Boulder,CO)そのフィルターは、次に、NaPO4 0.5M,7.4ペー ハー,SDS 7%の中で1,000.000 cpm/mlで放射性ラベルが付けられたCkβ-1遺伝子 全体と６５℃で一晩置き、雑種形成された。0.5倍(0.5x)のSSC,SDS 0.1%で室温 で２回、６０℃で２回洗浄した後、そのフィルターは、増強スクリーンで、一晩 、-70℃にさらされた。Ckβ-1のためのメッセージRNAは、脾臓内に豊富に存在す る。 例１０ バキュロウィルス(baculovirus)発現システムを使用したキモキン(Chemokine)Ck β-8の発現と純化 SF9細胞が、Ckβ-8ｃDNAを発現するようにデザインされた組み換えバキュロ ウィルスで感染された。細胞は、２のMOIで感染され、２８℃で、７２−９６時 間培養された。感染した培養物から細胞の破片が、低速遠心分離によって取り除 かれた。プロテアーゼ抑圧剤の混合物が、ペファブロック(Pefabloc)SC20μg/ml 、ロイペプチン1μg/ml、E-64 1μg/ml、EDTA 1mMの最終濃縮時に上清に加えら れた。20-30μlの上清のみの15%SDS-PAGEゲルを加えることによって、上清中のC kβ-8のレベルが、監視された。Ckβ-8が、リットル当たり数mgという発現レベ ルに対応したに見える９Kdの帯状組織として検知された。Ckβ-8は、３段階浄化 方法：ヘパリン結合親和性クロマトグラフィーを通してさらに清浄された。バキ ュロウィルスの培養は、100mM HRPES/MES/NaOAc6ペーハーを含む緩衝剤３分の１ の量とミックスさ れ、0.22μm膜を通してろ過された。そのサンプルは、次ぎに、ヘパリン結合柱( HE1poros 20,Bio-Perceptive System Inc.)にかけられた。Ckβ-08は、6ペーハ ーの50mM HEPES/MES/NaOAcに、50-100mM NaClの直線傾斜で、およそ300mM NaCl で抽出された：陽イオン交換クロマトグラフィー。ヘパリン・クロマトグラフィ ーで濃縮されたCkβ8は、50MM NEPES/MES/NaOAc 6ペーハーを含む緩衝剤で５倍 希釈溶液にさらされた。合成された混合物は、次ぎに、陽イオン交換柱(S/Mporo s 20,Bio-Perceptive System Inc.)に塗り付けられた。Ckβ-8は、6ペーハーの5 0mM HEPES/MES/NaOAcに、25-300mM NaClの直線傾斜で、およそ250mM NaClで抽出 された：サイズ除外クロマトグラフィー。陽イオン交換コロマトグラフィーに続 いて、Ckβ-8は、サイズ除外柱(HW50,TOSOHARS,1.4x45cm)にかけることによって 、さらに清浄された。Ckβ-8は、二重体のタンパク質に対応する13.7Kd分子量基 準(RNaseA)に近いところで分別された。 上述の３段階浄化に続いて、結果として得られたCkβ-8は、SDS[illegible] -PAGBゲルのコマシー(commassie)ブルーの変色から決定されるように９０％以上 の純度であると判断された。（図９） 清浄されたCkβ-8は、また、エンドトキシン/LPSの汚染について、テストさ れた。LALの分析評価(Bio Whittaker)によると、LPS含有量は0.1ng/ml以下であ った。 例１１ M-CSF 上におけるバキュロウィルス発現Ckβ-1とCkβ-8の影響および新しく分離 された骨髄細胞のSCFに刺激された群体形成 低密度のマウス骨髄細胞の個体群が、単核細胞、マクロファージ、および、 プラスチィックの表面に付着するその他の細胞を取り除くため、処理された組織 培養ディッシュの中で、37℃で１時間培養された。非付着性の細胞個体群が、次 ぎに、第１６図で示された要素が存在または不在する状況で、寒天を含んだ培養 基の中で培養された（10,000細胞/ディッシュ）。培養基は、37℃で１０日間開 培養され(N2 88%,CO2 5%およびO2 7%)、群体は転化顕微鏡の下で採点された。デ ータは、群体の中央値で表示されており、それは、三重に実施された分析評価か ら得られた。 例１２ IL-3 上におけるCkβ-8とCkβ-1の影響および骨髄細胞リン群体(lin-population) のSCFに刺激された核酸および差別化 一次的血液形成原種の中で強化されたマウス骨髄細胞の群体が、ネガティブ ・セレクション方法、つまり、ほとんどの直系に関わっている細胞が、単クロー ン抗体(抗cdllb,CD4,CD8,CD45R,Gr-1抗原)および磁気ビードを使って取り除かれ た。その結果として得られた細胞群体（リン細胞(Lin cells)）が、IL-3(5ng/ml )とSCF(100ng/ml)が補填された培養基の中で、示されたキモキン(chemokine)(50 ng/ml)の存在または不在する状況で、培養された(5ｘ10の４乗 細胞/ml)。過湿 された培養器(CO2 5%,O2 7%,N2 88%の環境)の中で、３７℃で７日間培養された 後、細胞が採取され、HPP-CPC、未分化原種の分析をされた。加えて、細胞は、 ファクスキャン(FACScan)によって特定の差別化抗原発現について分析された。 群体のデータは、数群体の中央値で表示されており、それは、各細胞母集団につ いて６個のディッシュで実施された分析評価から得られた。（第１７図） 例１３ Ck β-8は、IL-3,M-CSF,GM-CSFに反応し、群体形成を抑制する マウス骨髄細胞が、微量密度のグラヂエントの上で分離された大腿骨および けい骨の両方からおよびプラスチック付着によって取り除かれた単核細胞から押 し流された。結果として得られた細胞集団は、IL-3(5ng/ml),GM-CSF(5ng/ml),M- CSF(10ng/ml),G-CSF(10ng/ml)が補填されたMEMベースの培養基の中で一晩培養さ れた。これらの細胞は、50ng/mlレベルのCkβ-8と共にまたはそれなしに、IL-3( 5ng/ml),GM-CSF(5ng/ml),M-CSF(10ng/ml)が存在する寒天ベースの群体形成分析 物の中で1,000細胞/ディッシュで培養された。データは、特定の要因のみで形成 された群体の数に対するパーセントとしてその群体形成が表示された。２つの複 製ディッシュの平均として描写されたデータと共に、各試みに対する標準偏差を 示す誤差棒グラフを付けて、２つの試みが示されている。（第１９図） 例１４ 遺伝子治療による発現 皮膚生検によって、対象から繊維芽細胞が得られた。その結果として得られ た組織が、組織培養基の中に置かれ、小片に分けられる。組織の小さな塊が、組 織培養フラスコの湿らせた表面に置かれ、およそ１０片が各フラスコに置かれる 。フラスコは裏返され、密閉した状態で、室温で一晩置かれる。室温で２４時間 置かれた後、フラスコは逆にされ、組織の塊はフラスコの底にくっついたまま、 新しい培養基（例えば、Ham痴F12media,FBS 10%,ペニシリン、ストレプトマイシ ン）が加えられる。そして、それは、３７℃で、およそ一週聞放置される。この 時点で、新しい培養基が加えられ、その後数日毎に換えられる。培養組織の中に さらに２週間置いた後、単層の繊維芽細胞が出現する。その単層がトリプシン化 され、その薄片が大きなフラスコに入れられる。 モロニー(Moloney)・ハツカネズミ肉腫ウィルスの長い、一定期間の繰り返 しによって側面に作られたpKV-7(Kirschmeier,P.T.et al.,DNA,7:219-25(1988)) は、EcoRI HindIII,といっしょに消化され、引き続いて、子牛の腸内ホスファタ ーゼで処理される。その一次ベクターはアガロース・ゲルの上で分別され、ガラ スのビードを使って清浄される。 当発明のポリペプチドを符号化したcDNAは、５’と３’で終わる連続体のそ れぞれに対応するPCRプリマーを使って増幅される。５’プリマーはEcoRIサイト を含み、３’プリマーはHindIIIサイトを含む。T4DNAリガーゼが存在するところ で、同量のモロニー(Moloney)・ハツカネズミ肉腫ウイルス一次(linear)背骨お よびEcoRIとHindIIIの小片がいっしょに加えられる。結果として得られた混合物 は、２つの小片の結合に適した条件の下で維持される。 その結合ミックスは、バクテリアHB101を変換するために使われ、それは、 次に、ベクターが適切に挿入された対象遺伝子を持っていたことを確認するため に、寒天を含むカナマイシンの上に培養(plate)される。 アンフォトロピック(amphotropic)pA317およびGP+am12が一群となった一括 細胞が、ダルベッコー(Dulbecco)のモディファイド・イーグルズ・ミディアム（ ＤＭＥＭ）にある融合密度になるまで組織培養の中で、子牛の血清(CS)10%、ペ ニシリンおよびストレプトマイシンと共に、生育される。遺伝子を含むMSVベク ターが、次に、基に加えられ、一括細胞がベクターと共に形質導入される。その 一括細胞は、今や、その遺伝子をふくむ感染ウィルス粒子を生産する。（この一 括細胞は、今や、生産者細胞として、引用される。） 新しい培養基が倦質導入された生産者細胞に加えられ、その結果、融合性生 産者細胞の１０ｃｍのプレートから、培養基が収穫される。感染ウィルス粒子を 含む使用された培養基は、分離した生産者細胞を取り除くためにミリ孔のフィル ターを通してろ過され、この培養基が、次ぎに、繊維芽細胞を感染させるために 使われる。繊維芽細胞の亜融合性プレートから取り除かれた基は、素早く、生産 者細胞からの培養基と交換される。この培養基は取り除かれ、新しい基と取り換 えられる。もし、ウィルスの滴定濃度が高ければ、事実上、すべての繊維芽細胞 が感染するので、選択の必要が全くなくなる。もし、滴定濃度が非常に低ければ 、neoとかhisのような選択可能なマーカーを持つレトロウィルスのベクターを使 用する必要がある。その工作された繊維芽細胞は、次ぎに、それのみ、または、 シトデックス(cytodex)３マイクロキャリアー・ビード上で、融合点まで成長さ せた後で、ホストに注入される。その繊維芽細胞は、今や、タンパク質産物を生 産する。 上述の教えに鑑み、当発明に対する数多くの修正や変形が可能であり、それ ゆえ、特にそれ以外の指摘がされていない限り、当発明は、付録に添付された申 請の範囲内で実施されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＢＡ Ｃ０７Ｋ 14/52 ＡＢＧ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ＡＢＹ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ０７Ｋ 14/52 33/50 Ｔ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ Ｇ０１Ｎ 33/15 ＡＢＦ 33/50 ＡＢＸ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ルーベン，スティーブン・エム アメリカ合衆国20832メリーランド州 オ ルニー、ヘリティッジ・ヒルズ・ドライブ 18528番 (72)発明者 リー，ハオドン アメリカ合衆国20878メリーランド州 ゲ イザーズバーグ、ラトリッジ・ドライブ 11033番 (72)発明者 アダムズ，マーク・ディ アメリカ合衆国20878メリーランド州 ノ ース・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下から成るグループから選ばれたメンバーから成る分離されたプリヌクレ オチド： (a)SEQ ID No.2のアミノ酸-21からアミノ酸99から成るポリペプヱドを符号 化したポリヌクレオヱド； (b)SEQ ID No.2のアミノ酸1からアミノ酸99から成るポリペプヱドを符号化 したポリヌクレオヱド； (c)雑種倦成の能力があり、そして、(a)および(b)のポリヌクレオヱドと少 なくとも７０％同一であるポリヌクレオヱド；および (d)(a)または(b)のポリヌクレオヱドの小片であるポリヌクレオヱド。 ２．ポリヌクレオヱドがＤＮｑである範囲内での申請内容１のポリヌクレオヱド 。 ３．ポリヌクレオヱドがＲＮｑである範囲内での申請内容１のポリヌクレオヱド 。 ４．ポリヌクレオヱドがゲノム上ＤＮｑである範囲内での申請内容１のポリヌク レオヱド。 ５．SEQ ID No.2のアミノ酸-21からアミノ酸99から成るポリペプヱドを符号化し た申請内容２のポリヌクレオヱド。 ６．SEQ ID No.2のアミノ酸1からアミノ酸99から成るポリペプヱドを符号化した 申請内容２のポリヌクレオヱド。 ７．以下から成るグループから選ばれたメンバーから成る分離されたプリヌクレ オチド： (a)ATCCDeposit No.75676に含まれるＤＮｑによって発現されたアミノ酸連 続体をもつポリヌクレオヱドを符号化したポリヌクレオヱド。 (b)雑種倦成の能力があり、そして、(a)のポリヌクレオヱドと少なくとも７ ０％同一であるポリヌクレオヱド。 (c)(a)または(b)のポリヌクレオヱドの小片であるポリヌクレオヱド。 ８．SEQ ID No.1に述べられたヌクレオヱド1からヌクレオヱド363の連続体から 成る申請内容１のポリヌクレオヱド。 ９．申請内容２のＤＮＡを含むベクター。 １０．申請内容９のベクターで遺伝子工学的に工作されたホスト細胞。 １１．以下から成るポリペプヱドを生産するためのプロセス： 申請内容１０のホスト細胞から発現した当該ＤＮＡによって符号化されたポリペ プチド。 １２．申請内容９のベクターで遺伝子工学的に工作されたポリペプチドを発現す る能力がある細胞を生産するためのプロセス。 １３．(i)SEQ ID No.2から導き出されたアミノ酸連続体を持つポリペプチドおよ びその小片；および(ii)ATCCDeposite No.75676のｃＤＮＡによって符号化され たポリペプチドとそのポリペプチドの小片、類事物、および、派生物。 から成るグループから選ばれたポリペプチド。 １４．SEQ ID No.2から導き出されたアミノ酸連続体を持つポリペプチドである 申請内容１３のポリペプチド。 １５．申請内容１３のポリペプチドに対する作動物質。 １６．申請内容１３のポリペプチドに対する拮抗物質。 １７．以下から成るCkβ-8を必要とする患者の治療に対する方法： 治療上有効 な量の申請内容１３のポリペプチドを患者に投与すること。 １８．治療上有効な量の当該ポリペプチドを、当該ポリペプチドを符号化したＤ ＮＡを患者に投与することおよび当該ポリペプチドを生体内で発現することによ って、投与するという申請内容１７の方法。 １９．以下から成るCkβ-8ポリペプヱドを抑制する必要のある患者の治療に対す る方法： 治療上有効な量の申請内容１６の拮抗物質を患者に投与すること。 ２０．以下から成る申請内容１３のポリペプチドの発現不足(under-expression) に関して、病気または病気に対する感受性を診断するためのプロセス： 当該ポリペプチドを符号化した核酸連続体における突然変異を決定すること 。 ２１．以下から成る診断プロセス： ホストから取り出されたサンプルにおいて、申請内容１３のポリペプチド存 在を分析すること。 ２２．以下から成る申請内容１３のポリペプチドの拮抗物質および作動物質を識 別するプロセス： スクリーンされる細胞、複合物と当該ポリペプチドの中で細胞が当該ポリペ プチドから多孔性フィルターによって分離されるような当該ポリペプチドとを合 成すること；および その複合物が有効な拮抗物質または作動物質であるかどうかを決定するため に、その細胞の移行の程度を決定すること。