SK287514B6 - Acylpseudodipeptid s pomocnou funkčnou vetvou, spôsoby jeho prípravy a farmaceutické prostriedky, ktoré ho obsahujú - Google Patents

Acylpseudodipeptid s pomocnou funkčnou vetvou, spôsoby jeho prípravy a farmaceutické prostriedky, ktoré ho obsahujú Download PDF

Info

Publication number
SK287514B6
SK287514B6 SK920-2002A SK9202002A SK287514B6 SK 287514 B6 SK287514 B6 SK 287514B6 SK 9202002 A SK9202002 A SK 9202002A SK 287514 B6 SK287514 B6 SK 287514B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
group
acid
amino
nhr
formula
Prior art date
Application number
SK920-2002A
Other languages
English (en)
Other versions
SK9202002A3 (en
Inventor
Jacques Bauer
Olivier Richard Martin
Sylvain Rodriguez
Original Assignee
Om Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Om Pharma filed Critical Om Pharma
Publication of SK9202002A3 publication Critical patent/SK9202002A3/sk
Publication of SK287514B6 publication Critical patent/SK287514B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/22—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/60—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton with the carbon atom of at least one of the carboxyl groups bound to nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/091—Esters of phosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu, ktorý má kyslú skupinu v neutrálnej alebo v nabitej forme na jednom konci pseudodipeptidu a ktorý má na druhom konci pomocnú funkcionalizovanú vetvu podporujúcu imunitu. Derivát môže byť na ovplyvnenie imunity naštepený na antigén alebo môže byť naštepený na farmakofór, na zlepšovanie terapeutickej účinnosti a/alebo jej cielenia. Derivát je vhodný pre humánnu a veterinárnu medicínu ako prostriedok na imunizáciu a diagnostiku.

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka odboru chémie a hlavne chémie peptidov. Ide o acylované peptidy, ktoré majú pomocnú funkčnú vetvu, ktorá môže byť prípadne naštepená v konjugovanej forme a ktorých pomocná vetva podporuje vlastnosti molekúl pôvodných, pokiaľ ide o biologickú aktivitu a fyzikálno-chemické vlastnosti. Chemická povaha pomocnej vetvy poskytuje doplňujúci rozmer acylovanému pseudopeptidu jemnou úpravou jeho pôvodných vlastností a dodávaním novej vlastnosti. Molekuly, ktoré majú pomocnú funkcionalizovanú vetvu, môžu byť konjugované na phamakofor, na antigén alebo na vektorovú molekulu. Biokonjugácia sa podieľa na kopulácii dvoch alebo niekoľkých chemických jednotiek za vytvorenia nového molekulového komplexu, ktorý má odlišné vlastnosti v porovnaní s vlastnosťami jednotlivých zložiek. Prírodné alebo syntetické produkty, so správnymi farmakologickými vlastnosťami tak môžu byť kombinované navzájom za vytvorenia nových jednotiek s fyzikálno-chemickými a farmakologickými vlastnosťami pôvodnými alebo zlepšenými v závislosti od východiskových zložiek. Aplikácia biokonjugácie sa dotýka všetkých oblastí humánnej aj veterinárnej medicíny a diagnostických spôsobov.
Doterajší stav techniky
Mnohé kopulačné činidlá homobifunkčného alebo heterobifunkčného typu boli už opísané a môžu byť využité na konjugáciu molekúl tak rozdielnych, ako sú aminokyseliny, peptidy, proteíny, cukry, oligosacharidy, polysacharidy, nukleové kyseliny, oligonukleotidy, polynukleotidy, lipidy a prakticky všetky molekuly nesúce funkčnú väzbotvomú skupinu. V poslednom čase bolo vynaložené veľké úsilie na syntézu antigénových konštruktov, pozostávajúcich z dvoch nosičových molekúl rôzneho určenia. Good a kol. (Science 235, str. 1059 až 1062, 1987) napríklad syntetizoval peptid obsahujúci epitopy tvorené jednak pomocnými lymfocytmi T a lymfocytmi B. Besser a Jung (Res. Immunol. 5, str. 548 až 553, 1992) opísali konjugáty, pozostávajúce z jedného peptidu a z jedného imunostimulantu. Hoffmann a kol. (FEMS Immunol. Med. Microbiol. Microbiology 17, str. 225 až 234, 1997) opísali konjugáty medzi lipopeptidom a syntetickým peptidom melitín. Ulrich a Myers (Vaccine Design, Plénum Press, New York str. 495 až 524, 1995) pozorovali, že imunitná odozva nie je účinná, keď sa haptén a adjuvant MPL (Monofosforyl Lipid A) vyskytovali v tom istom lipozóme. Pojednávali o možnosti kovalentnej väzby medzi adjuvantom MPL a hapténom. Konjugát haptén-adjuvant sa prejavil ako veľmi účinný adjuvant vakcinácie. Ikeda a kol. (Chem. Pharm. Bull. 47 (4), str. 563 až 568, 1999) opísali syntézu štruktúrneho analógu Lipidu A a tumorového antigénu peptidovej povahy a predviedol in vitro mitogenickú aktivitu.
Koncept konjugácie by mohol byť tiež hodnotný pre proteíny alebo pre samotné systémy proteín-polysacharid. Je známe, že polysacharidy, použité samotné ako vakcína, navodzujú iba slabú odozvu u detí mladších ako päť rokov, pretože odozva nezávisí od buniek T (Gotschlich a kol. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy 1977); Peltola a kol., Pediatrics 60, str. 730 až 737, 1977). Oproti tomu polysacharidy, viazané na proteínové vektory (nosiče), poskytujú imunologickú odozvu oveľa silnejšiu. Tento jav bol objavený v roku 1931 autormi Avery a Goebel (J. Exp. Med. 54, str. 437 až 447, 1931). Rôzne vakcíny, vyvinuté v posledných rokoch, potvrdzujú pokrok v tejto oblasti. Pripomínajú sa najmä vakcíny proti Haemophilus influenzae a rôzne sérotypy Streptococcus pneumoniae (Powell a Newman, Vaccine Design Plénum Press New York, 1995). Pre sérotypy Streptococcus pneumoniae bola vyvinutá multivalentná vakcína (Sood a Fattom, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (3), str. 333 až 347, 1998).
V prípade komplexu zloženého z adjuvantu viazaného na jednotku polysacharid-proteín sa otvárajú nové perspektívy. Technológia chemickej syntézy biokonjugátov je dobre vyvinutá a umožňuje dnes realizovať mnoho projektov, pred niekoľkými rokmi neriešiteľných, tým, že používa mnohé dostupné reakčné činidlá homobifunkčné alebo heterobifunkčné a postupy konjugácie opísané v rozsiahlej literatúre (Hermanson, Bioconjugate Techniques Academic Press, New York, 1996).
Napríklad sa pripomína spôsob redukčnej animácie (Roy a kol., Canad. J. Biochem. Celí. Biol. 62, str. 270 až 279, 1984; Hermanson str. 472, 1995) umožňujúci konjugáciu jednej molekuly, ktorá má aldehydovú skupinu s primárnou aminoskupinou na peptide alebo na proteíne s konjugátom proteín-polysacharid alebo s farmakofórom. Táto reakcia vedie k tvorbe veľmi stabilného dialkylamínu.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu sú N-acylované pseudodipeptidy, ktoré majú kyslú skupinu v neutrálnej alebo v nabitej forme na jednom konci pseudodipeptidu a nesú na druhom konci pomocnú funkcionalizovanú vetvu, všeobecného vzorca (I)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (I), 1 > 1 2
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, vybranými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n a m 0 až 10, p a q 1 až 10,
Y atóm kyslíka alebo skupinu NH,
X a Z funkcionalizovanú pomocnú vetvu alebo kyslú skupinu v neutrálnej alebo nabitej forme alebo vybratú zo súboru zahŕňajúceho skupinu
Karboxylovú, karboxy[(Ct-C5)alkoxy], karboxy [(C, -C5)alkyltio], fosfono[(C i -C5)alkoxy], fosfono [(C i -C5)alkyltio], dihydroxyfosforyloxy[(Ci-C5)alkoxy], dihydroxyfosforyloxy[(Ci-C5)alkyltio], dihydroxyfosforyloxy, hydroxysulfonyloxy, hydroxysulfonyl[(C|-C5)alkoxy], hydroxysulfonyl[(Ci-C5)alkyltio], hydroxysulfonyloxy [(C ] -C5)alkoxy], hydroxysulfonyloxy [(C! -C5)alkyltio], [karboxy/CrCíjalkyljaminokarbonyl, [dikarboxy(C|-C5)alkyl]aminokarbonyl, [amonio(C i -C5)alkyl] aminokarbonyl, {[karboxy [amino(C i -C5)alkyl]} aminokarbonyl pod podmienkou, že jeden symbol X alebo Z znamená funkcionalizovanú pomocnú vetvu.
Pomocná skupina X alebo Z má všeobecný vzorec (II)
A-(CO)r-(CH2)s-W (II), kde znamená
A atóm kyslíka, síry alebo skupinu NH, r 0 alebo 1, s 1 až 10,
W skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, brómacetamidoskupinu, jódacetamidoskupinu, acylamidoskupinu, diacylamidoskupinu, sulfhydrylovú skupinu, alkyltioskupinu, hydroxylovú skupinu, 1,2-dihydroxyetylovú skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, vinylovú skupinu, etinylovú skupinu, voľnú karboxylovú skupinu, esterifikovanú karboxylovú skupinu, karboxylovú skupinu vo forme zmesového anhydridu, amidu alebo hydrazidu, azidoskupinu alebo tiokyanoskupinu.
Vynález sa teda týka pseudodipeptidov odvodených z funkcionalizovaných aminokyselín, ktorých voľné aminoskupiny sú amidované mastnými kyselinami, ktorých jeden koniec pseudodipeptidu je nosičom pomocnej funkcionalizovanej vetvy.
Vynález sa najmä týka N-acylovaných pseudodipeptidov, ktoré majú kyslú skupinu v neutrálnej alebo v nabitej forme na jednom konci pseudodipeptidu a na druhom konci majú pomocnú funkcionalizovanú vetvu všeobecného vzorca (I)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (I),
I I
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 21 atómami uhlíka, n a m 0 až 10, p a q 1 až 10,
Y atóm kyslíka alebo skupinu NH,
X a Z funkcionalizovanú pomocnú vetvu alebo kyslú skupinu v neutrálnej alebo nabitej forme alebo volenú zo súboru zahŕňajúceho skupinu karboxylovú, karboxy[(CrC5)alkoxy], karboxy [(C i -Cjjalkyltio], fosfono[(C 1 -C5)alkoxy], fosfono[(Ci-C5)alkyltio], dihydroxyfosforyloxy [(C ] -C5)alkoxy], dihydroxyfosforyloxy, hydroxysulfonyloxy hydroxysulfonyl[(Ci-C5)alkoxy], hydroxysulfonyl[(C i -C5)alkyltio], hydroxy sulfonyloxy [(C i - C 5) alkoxy], hydroxysulfonyloxy[(Ci-C5)alkyltio] pod podmienkou, že jeden symbol X alebo Z znamená funkcionalizovanú pomocnú vetvu a pomocná skupina X alebo Z má všeobecný vzorec (II), kde jednotlivé symboly majú uvedený význam, s výnimkou dihydroxyetylovej skupiny.
Pokiaľ substituenty X alebo Z znamenajú kyslú skupinu v neutrálnej forme, je to skupina karboxylová, sulfónová, fosfónová alebo fosforečná vo voľnej forme. Pokiaľ je kyslá skupina v nabitej forme, je to skupina karboxylová, sulfónová, fosfónová alebo fosforečná vo forme soli, vytvorenej prídavkom minerálnej alebo organickej zásady, výhodne terapeuticky prijateľnej. Ak nie sú zásady terapeuticky prijateľné, môžu slúžiť aspoň na identifikáciu, čistenie alebo na ďalšie spracovanie.
Ako zásady pre terapeuticky prijateľné soli sa najmä uvádzajú napríklad alkalické zásady, ako je hydroxid sodný, draselný alebo lítny a soli amóniové, zásady kovov alkalických zemín, ako sú hydroxid vápenatý alebo strontnatý, zlúčeniny horčíka a železných kovov a organické zásady odvodené z primárnych, sekundárnych alebo terciámych aminov, z aminokyselín zásaditej povahy, ako je lyzín alebo omitín, alebo aminované cukry.
Zásadami terapeuticky neprijateľnými sú napríklad brucín, strychnín, N-metylglukozamín alebo N-metylmorfolín. Ako bolo uvedené, soli farmaceutický neprijateľné sú vhodné napríklad na delenie, identifikáciu alebo čistenie.
Pokiaľ znamená index ml a n 0, odvodzuje sa molekula hlavne od serínu alebo kyseliny asparágovej. Ak sa index m rovná 2 a n je 0, odvodzuje sa molekula hlavne od homoserínu alebo od kyseliny glutámovej.
Pokiaľ znamená Y skupinu NH, index p 3 a q 1, môže ísť o derivát citrulínu, omitínu alebo arginínu.
Ak sa index p rovná 4 a q 1, ide najmä o derivát homoarginínu alebo lyzínu.
Symboly X alebo Z môžu znamenať pomocnú skupinu všeobecného vzorca (III)
O-CO-(CH2)s-W (III), kde znamená s 1 až 10, najmä 4, 5 alebo 6,
W skupinu formylovú, aminoskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú alebo karboxylovú skupinu.
Ako pseudodipeptidy podľa vynálezu sa hlavne v súčasnej dobe uvádzajú najmä výhodné zlúčeniny všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV),
I I
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n a m 0 až 10, p a q 1 až 10, jeden z
X a Z skupinu karboxylovú, dihydroxyfosforyloxylovú, karboxylfCý-Csjalkoxy] skupinu, karboxy[(Ci-C5)alkyltio] skupinu, skupinu [karboxy(Ci-C5)alkyl]amino-karbonylovú, [dikarboxy(Ci-C5)alkyl]aminokarbonylovú, {[karboxy[amino(Ci-C5)alkyl]}aminokarbonylovú a druhý acyloxyskupinu zo súboru zahŕňajúceho 6-aminohexanoyloxyskupinu, skupinu 6-oxohexanoylovú, 6-hydroxyhexanoyloxyskupinu, 6,7-dihydroxyheptanoyloxyskupinu a 3-karboxypropanoyloxyskupinu.
Symboly R1 a R2 znamenajú acylové skupiny s rôznym počtom atómov uhlíka od 2 do 24, rovnaké alebo rôzne, s priamym alebo s rozvetveným reťazcom, nasýtené alebo nenasýtené, prípadne substituované jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu alkylovú, aminoskupinu, acylaminoskupinu, hydroxylovú skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu. Ako výhodné acylové skupiny sa uvádzajú skupiny odvodené od kyseliny laurovej, 2-hydroxyoktánovej, 3-hydroxymyristovej, 2-dekanoyl-oxyoktánovej, 3-lauryloxymyristovej, 3-myristyloxymyristovej, 3-palmityloxymyristovej.
Vynález sa týka najmä výhodných pseudodipeptidov obsiahnutých v nasledujúcej tabuľke.
* **
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z Z = OR3 alebo | | Z = A-(CO)r-(CH2)s-W
NHR1 NHR2
Pr. č. X * ** Y m, n, p, q R1 R2 R3 A r s W
1.2 HOOC R, R NH 1,0,3, 1 3^12Ο^14 3(HO)C14 H - - - -
1.3 HOOC R, R NH 1,0,3,1 3(C12O)C14 3(HO)Ci4 P(O)(OH)2 - - - -
2.1 (H0)2P(0)-0 R, R NH 2,0,3,1 3(Ci2O)C14 3(HO)C,4 O 1 4 CHOHCH2OH
2.2 (H0)2P(0)-0 R, R NH 2,0,3, 1 3(C12O)C14 3(HO)Ci4 O 1 4 CHO
2.3 HOOC R, R NH 1,0,3, 1 3(C12O)C14 3(HO)C14 O 1 4 CHOHCH2OH
2.4 HOOC R, R NH 1,0,3, 1 3(C12O)C,4 3(HO)C,4 O 1 4 CHO
2.5 HOOC R, R NH 1,0,3, 1 3(Cl2O)Ci4 3(HO)C14 O 1 5 OH
2.6 (HO)2P(O)-O RS, R NH 2,0,3, 1 3(c12ox:14 3(HO)C14 O 1 5 NH2
2.7 (H0)2P(0)-0 R, R NH 2, 0, 3, 1 3(C12O)C,4 3(HO)C14 O 1 5 nh2
2.8 (HO)2P(O)-O S, R NH 2,0,3, 1 3(C12O)C,4 3(HO)C14 O 1 5 nh2
2.9 (HO)2P(O)-O R, R NH 2,0,3, 1 3(C12O)C,4 3(HO)C14 0 1 5 OH
2.10 (HO)2P(O)-O RS, R O 2,0, 1,3, 3(C12O)C14 3(HO)C14 NH 0 5 CHO
2.11 hoocch2o R, R NH 1,0,3, 1 3(CI2O)CI4 3(HO)Ci4 O 1 4 CHO
2.12 hoocch2s S, R NH 1,0,3, 1 3(C12OXľ,4 3(HO)C,4 O 1 6 NH2
2.13 (HOOC)2CHCH2O R, R NH 1,0,3, 1 3(CI2O)CI4 3(HO)Ci4 O 1 4 CHO
2.14 (HO)2P(O)-O RS, R NH 2,0,3, 1 3(C12O)C,4 3(HO)Cl4 O 1 5 NHC(O)CH2Br
2.15 (HO)2P(O)-O RS, R NH 2, 0, 3, 1 3(HO)Ci4 3(Ci2O)Ci4 O 1 4 CHO
2.16 HOOC R, R NH 1,0,3, 1 3(C12O)C14 3(HO)Ci4 O 1 5 nh2
2.17 HOOC R, R NH 1,0,3, 1 3(C12O)C14 3(HO)Ci4 O 1 5 NHCO(CH2)2COOH
2.18 HOOC R, R NH 1,0,3, 1 3(C12O)Ci4 3(HO)Ci4 O 1 1 nh2
2.19 HOOC R, R NH 1,0,3, 1 3(Ci2O)Ci4 3(HO)Ci4 O 1 2 COOH
2.20 H2N(CH2)3NHCO R, R NH 1,0,3, 1 3(C12O)C,4 3(HO)C14 H - -
2.21 H2N(CH2)4CH(COOH) -NHCO R, R NH 1,0,3, 1 3(Ci2O)Ci4 3(HO)C,4 H - -
2.22 H2N(CH2)4CH(COOH) -NHCO R, R NH 1,0,3, 1 3(C12O)C,4 3(HO)Ci4 - 0 1 5 nh2
2.23 HOOCCH2CH(COOH) -NHCO R, R NH 1,0,3, 1 3^,,0^,4 3(HO)Ci4 H - -
2.24 HOOCCH2CH(COOH) -NHCO R, R NH 1,0,3, 1 3(C120jC14 3(HO)Ci4 - O 1 5 nh2
2.25 HOOC R, R NH 1,0,3, 1 c2 3(HO)Ci4 - 0 1 5 nh2
2.26 HOOC R, R NH 1,0,3, 1 2(C10O)Cs 3(HO)C,4 - O 1 5 nh2
Vynález sa týka hlavne aktuálne preferovaných zlúčenín, ako sú:
- a-N-{(4R)-5-hydroxy-4[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej, a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad Í.2),
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6,7-dihydroxyheptanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.1),
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-oxohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.2),
- o:-N-{(4R)-5-hydroxy-4[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-0-(6,7-dihydroxyheptanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.3),
- a-N-{(4R)-5-hydroxy-4[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-0-(6,7-oxohexanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.4),
- (3RS,9R), (3R,9R) a (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-aminohexanoát) a ich adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.6, 2.7 a 2.8)],
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-hydroxyhexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.9),
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(dihydroxyfosforyloxy)butanoát {2-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-5-(6-oxohexyl)amino}pentyl a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.10),
- a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.16),
- a-N-{(4R)-5-sukcinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.19),
- α-N- {(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl} amid 0-N-[( 1 S)-1 -karboxy-5-aminopentyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetra-dekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.22),
- a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl)amid /3-N-[( 1 S)- 1,2-dikarboxyetyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou (príklad 2.24).
Tieto zlúčeniny sa vyznačujú zaujímavými farmakologickými a originálnymi, hlavne imunomodulačnými vlastnosťami. Používajú sa najmä pri príprave vakcínových kompozícií vo formuláciách zmiešaných alebo kovalentné konjugovaných s antigénmi polypeptidovej alebo polysacharidovej povahy, alebo v prostriedkoch pozostávajúcich z polypeptidov konjugovaných s polysacharidmi. Môžu sa použiť hlavne na prevenciu infekcií vírusového, mikrobiálneho a protozoálneho pôvodu alebo na liečenie určitých autoimúnnych ochorení.
Taktiež sa používajú ako vektory molekúl terapeutického významu pre svoju schopnosť nekovalentnej asociácie podľa viac alebo menej hydrofilného alebo hydrofóbneho charakteru ich pomocných vetví. Ich chemické vlastnosti, ktoré umožňujú kopuláciu s molekulami terapeutického významu, rovnako ako ich amfifilný charakter podporuje ich formulácie a transport molekúl, ktoré sú s nimi asociované smerom k receptorovým membránam rovnako ako ku stenám bunkovej cytoplazmy.
Môžu sa používať samostatné aj ako asociované kovalentné alebo nekovalentne s molekulou terapeutického významu na podávanie orálne, parenterálne, rektálne, topické, perkutanné alebo permukózne.
Môžu sa používať samostatné aj ako asociované kovalentné alebo nekovalentne s molekulou terapeutického významu inkubáciou extratemporámou ex vivo s krvnými bunkami na dodanie bunkám imunokompetencie pred ich opätovným naočkovaním in vivo parenterálnou cestou.
Molekuly majú podobné vlastnosti ako adjuvanty imunitného systému použitého napríklad na vakcináciu kovalentné asociované alebo nekovalentne asociované s vhodnými antigénmi, proti ochoreniam vírusového, parazitového, mikrobiálneho a hubového pôvodu. Tieto molekuly, konjugované alebo nekonjugované, sa môžu používať pri terapii niektorých autoimunitných ochorení.
Niektoré zlúčeniny podľa vynálezu majú po kovalentnej asociácii alebo po nekovalentnej asociácii rozdielne vlastnosti v schopnosti vyvolávať produkciu cytokínov alebo zrenie molekúl imunokompetentných kmeňov pochádzajúcich z hematopoietických a lymfoidných orgánov.
Niektoré zlúčeniny podľa vynálezu sú schopné podporovať zrenie a diferenciáciu monocytov funkčných dendritických buniek v prítomnosti alebo v neprítomnosti vhodného antigénu a prispievajúcich tak k posilneniu humorálnej a bunkovej imunity.
Niektoré zlúčeniny podporujú diferenciáciu buniek hematopoietického systému hlavne kostnej drene a umožňujú zlepšovať alebo upravovať niektoré disfúnkcie imunitného systému. Majú hlavne protivírusové vlastnosti.
Zlúčeniny podľa vynálezu sú najmä zaujímavé svojou nízkou toxicitou. Používajú sa v kovalentnej asociácii alebo v nekovalentnej asociácii s antigénmi pri prevencii alebo terapii infekčných ochorení u ľudí a zvierat v dávkach 0,005 mg až 100 mg na jednotkovú dávku a 0,005 až 200 mg na deň podľa príznakov a v závislosti od hmotnosti subjektu.
Spôsob prípravy N-acylovaných pseudodipeptidov všeobecného vzorca (I), ktoré majú kyslú skupinu v neutrálnej forme alebo v nabitej forme na jednom svojom pseudodipeptidovom konci a ktoré majú na svojom druhom konci fúnkcionalizovanú pomocnú skupinu, spočíva podľa vynálezu v tom, že sa blokuje aminoskupina v polohe (q+1) a skupinu YH v polohe omega omega-funkcionalizovanej aminokyseliny reakčnými činiteľmi ortogonálneho blokovania, voľná karboxylová skupina sa redukuje za získania príslušného alkoholu, uvoľní sa aminoskupina v polohe (q+1) a acyluje sa funkčným derivátom karboxylovej kyseliny vzorca R2OH, kde R2 má uvedený význam a uvoľní sa koncová funkčná skupina za získania funkcionalizovaného aminoalkoholu všeobecného vzorca (V)
Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (V), l 2
NHR2 kde znamená
Y skupinu hydroxylovú alebo výhodne aminoskupinu NH2,
R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, p a q 1 až 10, ktorý sa kondenzuje za prítomnosti peptidického kondenzačného činidla v inertnom rozpúšťadle s derivátom omega-funkcionalizovanej aminokyseliny všeobecného vzorca (VI)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI),
I
NHR1 kde znamená
R1 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, m a n 0 až 10,
X kyslú definovanú skupinu prípadne v esterifikovanej forme, za vytvorenia pseudodipeptidu všeobecného vzorca (VII)
X-(CH2)m-CH-(CH2)„-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (VII),
I I
NHR1 NHR2 kde X, Y, R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam, a koncová voľná alkoholová skupina sa prípadne substituuje, alkyluje alebo acyluje substitučným, alkylačným alebo acylačným reakčným činidlom všeobecného vzorca (VIII)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII), kde znamená
A odstupujúcu skupinu, skupinu hydroxylovú, SH alebo NH2, r výhodne 1, ale tiež 0, s výhodne 2 až 6, ale tiež 1 až 10,
W výhodne skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, skupinu sulfhydrylovú, alkyltioskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, zmiešaného anhydridu, amidu alebo hydrazidu, azidoskupinu, tiokyanoskupinu alebo ich prekurzory, prípadne za prítomnosti kopulačného činidla a produkt sa katalytický hydrogenuje alebo sa inak odstraňuje chrániaca skupina za získania derivátu všeobecného vzorca
X-(CH2)m-CH(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (I),
I I
NHR1 NHR2 kde X, Y, Z, R1, R2, n, m, p a q majú uvedený význam.
Spôsob prípravy fosfopseudodipeptidov všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV),
I I
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n a m 0 až 10, p a q 1 až 10,
Y atóm kyslíka alebo skupinu NH,
X a Z kyslú skupinu v neutrálnej forme alebo nabitej forme, alebo pomocnej funkcionalizovanej vetve, spočíva podľa vynálezu v tom, že sa blokujú aminoskupiny v polohe (q+1) a v polohe omega diaminokyseliny všeobecného vzorca
H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH, kde p a q majú uvedený význam, reakčnými činidlami zavádzajúcimi chrániace skupiny odstrániteľné acidolýzou a hydrogenolýzou, voľná karboxylová skupina sa redukuje za vytvorenia zodpovedajúceho alkoholu, uvoľňuje sa aminoskupina v polohe (q+1) a acyluje sa funkčným derivátom karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca R2OH, kde R2 má uvedený význam, uvoľňuje sa koncová aminoskupina hydrogenolýzou za získania aminoalkoholu všeobecného vzorca (IX)
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)p-OH (IX),
I
NHR2 kde znamená
R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, p a q 1 až 10, ktorý sa kondenzuje za prítomnosti peptidického kondenzačného činidla v inertnom rozpúšťadle s derivátom aminokyseliny omega hydroxylovanej všeobecného vzorca (VI)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI),
I
NHR1 kde znamená
R1 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, m 1 až 10, n 0 až 10,
X dialkyloxyfosforyloxyskupinu alebo diaryloxyfosforyloxyskupinu všeobecného vzorca (RO)2P-O i
O na vytvorenie pseudodipeptidu všeobecného vzorca (X) (RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (X),
I I I
O NHR1 NHR2 kde R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou, a koncová voľná alkoholová skupina sa prípadne substituuje, alkyluje alebo acyluje substitučným, alkylačným alebo acylačným reakčným činidlom všeobecného vzorca (VIII)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII), kde znamená
A odstupujúcu skupinu, skupinu hydroxylovú, SH alebo NH2, r výhodne 1, ale tiež 0, s výhodne 2 až 6 ale tiež 1 až 10,
W výhodne skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, skupinu sulfhydrylovú, alkyltioskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, zmiešaného anhydridu, amidu alebo hydrazidu, azidoskupinu, tiokyanoskupinu alebo ich prekurzory, prípadne za prítomnosti kopulačného činidla a produkt sa katalytický hydrogenuje alebo sa inak odstraňuje chrániaca skupina za získania derivátu všeobecného vzorca (XI) (HO)2P-O-(CH2)m-CH-(CH2)„-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r-(CH2)s-W (XI), 'i i
O NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p, q, r a s majú uvedený význam
Spôsob prípravy fosfopseudodipeptidov všeobecného vzorca (XII)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-O-(CH2)q-CH-(CH2)p-Z (XII), 1 ! ' 2
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n 0 až 10, m, p, ql až 10,
X a Z kyslú skupinu alebo pomocnú funkcionalizovanú vetvu, spočíva podľa vynálezu v tom, že sa blokuje funkčná aminoskupina v polohe (q+1) a omega diaminokyseliny všeobecného vzorca
H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q.1COOH, kde p a q majú uvedený význam, zavedením chrániacej skupiny odstrániteľnej acidolýzou a hydrogenolýzou, voľná karboxylová skupina sa redukuje za získania zodpovedajúceho alkoholu, uvoľní sa aminoskupina v polohe (q+1) a acyluje sa funkčným derivátom karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca R2OH, kde R2 má uvedený význam, chrániaca skupina z koncovej aminoskupiny sa odstráni hydrogenolýzou a alkyluje sa koncová aminoskupina reaktívnym esterom omega-funkcionalizovaného alkylu ako triflátu za získania aminoalkoholu všeobecného vzorca (XIII)
W-(CH2)sNH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XIII),
I
NHR2 kde W má uvedený význam a kde znamená
R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, p a q 1 až 10, s 2 až 7, ale tiež 1 až 10, ktorý sa kondenzuje za prítomnosti peptidického kondenzačného činidla v inertnom rozpúšťadle s derivátom aminokyseliny omega hydroxylovanej všeobecného vzorca (VI)
X-(CH2)m-CH-(CH2)o-COOH (VI),
I
NHR1 kde znamená
R1 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, m 1 až 10, n 0 až 10,
X dialkyloxyfosforyloxyskupinu alebo diaryloxyfosforyloxyskupinu všeobecného vzorca (RO)2P-O
O na vytvorenie pseudodipeptidu všeobecného vzorca (XIV) (RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-O-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(CH2)s-W (XIV),
I I I
O NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p a q a s majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou, produkt sa katalytický hydrogenuje alebo sa odstraňuje chrániaca skupina za získania derivátu všeobecného vzorca (XV) (HO)2P-O-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-O-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(CH2)s-W (XV),
I I I
O NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p, q, r a s majú uvedený význam, pričom výhodne znamená
W skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, zmiešaného anhydridu, amidu alebo hydrazidu, azidoskupinu, tiokyanoskupinu alebo ich prekurzory.
Spôsob prípravy karboxypseudodipeptidov všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV),
I _ i 2 nhr' nhr2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n 0 až 10, m, p a q 1 až 10,
X a Z kyslú skupinu alebo pomocnú funkcionalizovanú vetvu, spočíva podľa vynálezu v tom, že sa blokujú aminoskupiny v polohe (q+1) a v polohe omega diaminokyseliny všeobecného vzorca
H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q.1COOH, kde p a q majú uvedený význam, zavedením chrániacej skupiny odstrániteľnej acidolýzou a hydrogenolýzou, karboxylová voľná skupina sa redukuje za vytvorenia zodpovedajúceho alkoholu, odstraňuje sa skupina chrániaca aminoskupinu v polohe (q+1) a acyluje sa funkčným derivátom karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca R2OH, kde R2 má uvedený význam, a uvoľňuje sa koncová aminoskupina hydrogenolýzou za získania aminoalkoholu všeobecného vzorca (IX)
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)p-OH (IX),
I
NHR2 kde znamená
R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, p a q 1 až 10, ktorý sa kondenzuje za prítomnosti peptidického kondenzačného činidla v inertnom rozpúšťadle s omegakarboxyaminokyselinou všeobecného vzorca (VI)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI),
I
NHR1 kde znamená
R1 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, m 1 až 10, n 0 až 10,
X je skupina RO-CO, za vytvorenia pseudodipeptidu všeobecného vzorca (XVI)
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI), 1 t ' 2
NHR1 NHR2 kde R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou, napríklad skupinu benzylovú, a koncová voľná alkoholová skupina sa prípadne substituuje, alkyluje alebo acyluje substitučným, alkylačným alebo acylačným reakčným činidlom všeobecného vzorca (VIII)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII), kde znamená
A odstupujúcu skupinu, skupinu hydroxylovú, SH alebo NH2, r výhodne 1, ale tiež 0, s výhodne 2 až 6, ale tiež 1 až 10,
W výhodne skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, skupinu sulfhydrylovú, alkyltioskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, zmiešaného anhydridu, amidu alebo hydrazidu, azidoskupinu, tiokyanoskupinu alebo ich prekurzory, prípadne za prítomnosti kopulačného činidla a produkt sa katalytický hydrogenuje alebo sa inak odstraňuje chrániaca skupina za získania derivátu všeobecného vzorca (XVII)
HO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r-(CH2)s-W (XVII),
I I
NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p, q, r a s majú uvedený význam.
Spôsob prípravy fosfodipeptidov všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV),
I I
NHR1 NHR2
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n 0 až 10, m, p a q 1 až 10,
X a Z kyslú skupinu alebo pomocnú funkcionalizovanú vetvu, spočíva podľa vynálezu v tom, že sa blokuje voľná hydroxylová skupina pseudodipeptidu všeobecného vzorca (XVI)
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI),
I I
NHR1 NHR2 kde R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou, ako napríklad skupinu benzylovú, labilnou chrániacou skupinou odstrániteľnou acidolýzou, uvoľňuje sa karboxylová skupina vo forme esteru, karboxylová skupina prípadne v aktivovanej forme sa redukuje za získania zodpovedajúceho primárneho alkoholu, ktorý sa prevádza na fosforečný ester spracovaním fosforylačným činidlom, skupina chrániaca hydroxylovú skupinu sa odstráni spracovaním kyselinou, a produkt sa podrobuje substitúcii, acylácii alebo alkylácii s použitím reakčného činidla všeobecného vzorca (VIII)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII), kde znamená
A odstupujúcu skupinu, skupinu hydroxylovú, SH alebo NH2, r výhodne 1, ale tiež 0, s výhodne 2 až 6, ale tiež 1 až 10,
W výhodne skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, skupinu sulfhydrylovú, alkyltioskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, zmiešaného anhydridu alebo iného derivátu, prípadne za prítomnosti kopulačného činidla a produkt sa katalytický hydrogenuje alebo sa inak odstraňuje chrániaca skupina za získania derivátu všeobecného vzorca (XI) (HO)2P-O-(CH2)m-CH-(CH2)„-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r-(CH2)s-W(XI),
I II
O NHR1NHR kde W, R1, R2, m, n, p, q, r, s majú uvedený význam.
Spôsob prípravy fosfodipeptidov všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z(IV),
II
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substi tuentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n OažlO, m, p a q 1 až 10,
X a Z kyslú skupinu alebo pomocnú funkcionalizovanú vetvu, spočíva podľa vynálezu v tom, že sa odstraňuje chrániaca skupina z karboxylovej skupiny vo forme esteru v pseudodipeptide všeobecného vzorca (XIV)
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI),
I I
NHR1 NHR2 kde R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou, napríklad skupinu benzylovú, takto vytvorená kyselina sa podrobuje peptidickej kopulácii s diaminoalkánom alebo s čiastočne chránenou aminokyselinou, ako je napríklad 3-benzyloxykarbonylamino-l-aminopropán, L-aspartát dibenzylu alebo benzylester e-N-benzyloxykarbonyl-L-lyzínu za prítomnosti peptidického kopulačného činidla a kopulačný produkt sa prípadne podrobí substitučnej reakcii, acylácii alebo alkylácii reakčným činidlom všeobecného vzorca (VIII)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII), kde znamená
A odstupujúcu skupinu, skupinu hydroxylovú, SH alebo NH2, r výhodne 1, ale tiež 0, s výhodne 2 až 6, ale tiež 1 až 10,
W výhodne skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, skupinu sulfhydrylovú, alkyltioskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, alebo iného derivátu, prípadne za prítomnosti aktivačného činidla a z produktu sa odstraňujú chrániace skupiny, napríklad hydrogenolýzou za získania produktu všeobecného vzorca (XVIII)
R3-NH-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r-(CH2)s-W (XVIII),
NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p, q, r a s majú uvedený význam a R3 znamená aminoalkylovú, karboxyalkylovú, dikarboxyalkylovú alebo aminokarboxyalkylovú skupinu.
Stereochémia centier nesúcich acylaminoskupinu je určovaná konfiguráciou východiskových aminokyselín a stereochémia acylaminoskupín je určovaná konfiguráciou východiskových mastných kyselín. Môže sa vychádzať z aminokyseliny konfigurácie L alebo D, alebo racemickej. Môže sa vychádzať z hydroxylovanej aminokyseliny konfigurácie L alebo D, alebo racemickej. Všetky enantioméry alebo diastereoizoméry zlúčenín všeobecných vzorcov (I), (IV), (XII) alebo (XVI) vynález zahŕňa.
Všeobecne sa zlúčeniny podľa vynálezu pripravujú kopuláciou kyslej skupiny N-acylovanej omega funkcionalizovanej aminokyseliny a aminoskupiny aminoalkoholu, získaného redukciou karboxylovej skupiny mono-N-acylovanej diaminokyseliny, následnou O-acyláciou alebo O-alkyláciou voľnej alkoholovej skupiny zavedením pomocnej funkcionalizovanej vetvy, ktorá môže byť prípadne modifikovaná po zakotvení a uvoľnením reaktívnej skupiny. Z konečného produktu sa odstráni skupina chrániaca kyslú skupinu.
Pri spôsobe, ktorému sa v súčasnosti dáva prednosť pri príprave zlúčenín podľa vynálezu (obr. 1), je omega funkcionalizovaňou aminokyselinou α-aminovaná omega-hydrolyzovaná kyselina, ako je serín alebo homoserín, ktorá sa podrobuje ďalším reakciám s cieľom chrániť dusík (napríklad vo forme terc-butoxykarbonylového derivátu), vytvorenie benzylesteru O-alkyláciou karboxylátu a fosforylácia hydroxylovej skupiny na zavedenie chránenej fosfátovej skupiny. Typickými skupinami, chrániacimi fosfátovú skupinu, môžu byť skupiny fenylová, benzylová alebo oxylylová. Prednosť sa dáva skupine fenylovej. Aminoskupina sa potom uvoľní odstránením chrániacej skupiny (napríklad spracovaním terc-butoxykarbonylového derivátu kyselinou trifluóroctovou), produkt sa acyluje aktivovaným derivátom mastnej kyseliny, výhodne derivátom kyseliny 3-hydroxytetradekánovej, ako je kyselina 3-dodekanoyloxytetradekánová. Aktívnou formou môže byť acylchlorid, aktivovaný ester, zmiešaný anhydrid alebo akákoľvek iná chemická forma umožňujúca vytvorenie amidovej väzby. Prípadne obsiahnutý benzylester sa odstráni selektívnou hydrogenolýzou za získania karboxylovej kyseliny nesúcej acylamidoskupinu v polohe a a skupinu (RO)2P(O)O- v polohe omega.
Partner reakcie peptidickej kopulácie sa získa výhodne z α,ω-diaminokyseliny, ako je omitín alebo lyzín, postupom reakcií s cieľom selektívneho chránenia aminoskupiny v polohe omega, napríklad vo forme benzyloxykarbonylového derivátu vytvorením komplexu s meďou spôsobom opísaným v literatúre (Organic Preparations, Organic Preparations and Procedures Intemational 23, str. 191 až 194, 1992) elimináciou kom plexu s meďou a chránením aminoskupiny v polohe a, napríklad vo forme terc-butoxykarbonylového derivátu. Môžu sa použiť aj iné chrániace skupiny. Voľná karboxylová skupina sa redukuje za získania primárneho alkoholu napríklad borán-sírovým komplexom dimetylu alebo spracovaním vopred pripraveného zmesového anhydridu bórhydridom sodným spôsobom opísaným v literatúre (Tetrahedron Letters 32, str. 923 až 92, 1991). Aminoskupina v polohe a sa uvoľní v kyslom prostredí (napríklad spracovaním kyselinou trifluóroctovou), a N-acyluje sa aktivovaným derivátom mastnej kyseliny, výhodne derivátom kyseliny 3-hydroxytetradekánovej, ako je kyselina 3-benzyloxytetradekánová. Prípadne sa chráni v tomto štádiu voľná hydroxylová skupina napríklad vo forme benzyloxymetyléteru. Omega-aminoskupina sa uvoľňuje spracovaním inertným reakčným činidlom proti ostatným obsiahnutým chrániacim skupinám, ako napríklad selektívnou hydrogenolýzou v hydroxylovom rozpúšťadle obsahujúcom trietylamín, pokiaľ je chrániacou skupinou benzyloxykarbonylová skupina.
Pri spôsobe prípravy, ktorému sa v súčasnosti dáva prednosť, sa takto získaný amín kopuluje s a-acylaminovanou omega-fosforylovanou karboxylovou kyselinou pripravenou uvedeným spôsobom v prítomnosti IIDQ alebo iného reakčného kopulačného peptidického činidla za získania chráneného fosforylovaného pseudodipeptidu. Tento produkt sa O-acyluje na hydroxylovej voľnej skupine s použitím omegaíunkcionalizovanej kyseliny, ako je kyselina 6-hepténová v prítomnosti EDCI alebo iného esterifikačného činidla (obr. 5). Alkenylová skupina tohto esteru sa dihydroxyluje za prítomnosti oxidu osmičelého v katalytickom alebo stechiometrickom množstve, odstraňujú sa skupiny chrániace fosfátovú skupinu a prípadnú hydroxylovú skupinu vo forme benzyléteru hydrogenolýzou za prítomnosti vhodného katalyzátora (príklad 2.1). V poslednom stupni sa susediaci diol podrobí oxidácii napríklad kyselinou jodistou za vytvorenia reaktívnej aldehydovej skupiny (príklad 2.2). Redukciou aldehydovej skupiny na primárnu alkoholovú skupinu sa získa derivát s omega-hydroxyacylovou skupinou (príklad 2.9).
Vo variante spôsobuje produkt peptidickej kopulácie O-acylovaný derivátom omega-aminoalkánovej kyseliny, ako je kyselina 6-benzyloxykarbonylaminohexánová (obr. 11). Z takto získaného produktu sa úplne odstránia chrániace skupiny hydrogenolýzou za prítomnosti katalyzátora za získania pseudodipeptidu, ktorý má pomocnú aminoalkanoylovú vetvu (príklad 2.6).
Podľa druhého výhodného spôsobuje kyslým partnerom peptidickej kopulačnej reakcie derivát D alebo L asparágovej kyseliny alebo prípadne kyseliny D- alebo L-glutámovej (obr. 2). Derivát kyseliny asparágovej sa získa N-acyláciou aminoskupiny β-benzylesteru tejto aminokyseliny mastnou kyselinou odvodenou výhodne z 3-hydroxylovanej mastnej kyseliny, ako je kyselina 3-dodekanoyloxytetradekánová. Tento produkt sa kopuluje s aminoalkoholom opísaného typu, pseudodipeptid takto získaný sa podrobí hydrogenolýze za prítomnosti katalyzátora, ako je paládium na uhlí alebo platina na nosiči, na vytvorenie pseudodipeptidu nesúceho skupinu karboxylovej kyseliny (príklad 1.2), alebo sa podrobí fosforylácii napríklad reakciou s fosforamiditom nasledovanou hydrogenolýzou za získania pseudodipeptidu, ktorý má karboxylovú a fosforečnú skupinu (príklad 1.3).
Podľa variantu spôsobu je hydroxylová skupina vopred získaného pseudodipeptidu (obr. 2) acylovaná omega-funkcionalizo vaňou kyselinou. Výhodne je omega-funkcionalizo vaňou kyselinou kyselina omegaalkénová alebo kyselina omega-aminoalkánová. V prípade kyseliny hepténovej (obr. 8) vedie pseudodipeptid k derivátu O-heptenoylu, ktorý sa podrobuje postupne dihydroxylačnej reakcii za prítomnosti oxidu osmičelého, odstráneniu chrániacej skupiny (príklad 2.3) a jodistanovej oxidácii (príklad 2.4); redukcii takto vytvorenej aldehydovej skupiny redukčným činidlom napríklad bórhydridom sodným za získania pseudodipeptidu, ktorý má omega-hydroxyalkanoylovú skupinu (príklad 2.5). V prípade kyseliny omega-aminoalkanoylovej, ako je derivát N-benzyloxykarbonylu kyseliny 6-aminohexánovej alebo glycínu (obr. 24) sa acyláciou pseudodipeptidu získajú O-aminoacylové deriváty s chrániacou skupinou, ktorá sa následne odstráni hydrogenolýzou (príklad 2.16 a 2.18).
V druhom variante spôsobu prípravy (obr. 13) sa chráni voľná hydroxylová skupina pseudodipeptidu ako medziproduktu opísaného na obr. 2, výhodne vo forme tetrahydropyranyléteru, karboxylová skupina vo forme esteru sa zbavuje chrániacej skupiny hydrogenolýzou alebo iným vhodným spôsobom, redukuje sa výhodne po aktivácii na formu zmiešaného anhydridu redukčným činidlom, ako je bórhydrid sodný; takto vytvorená hydroxylová skupina sa podrobí fosforylácii, výhodne s použitím fosforamiditu, tetrahydropyranyléter sa hydrolyzuje v kyslom prostredí a takto regenerovaná hydroxylová skupina sa acyluje reakciou s omega-funkcionalizovanou karboxylovou kyselinou. Výhodne je omega-funkcionalizovanou kyselinou omega-alcenová kyselina alebo omega-aminoalkánová kyselina. V prípade kyseliny 6-benzyloxykarbonylaminohexánovej vedie pseudodipeptid k získaniu chráneného O-aminoacylderivátu, ktorý sa potom podrobí hydrogenolýze (príklad 2.7, príklad 2.8). Alternatívne môže byť monofosforylovaný medziprodukt z predchádzajúceho odseku získaný (obr. 15) peptidovou kopuláciou N-acylderivátu /3-benzylesteru asparágovej kyseliny (obr. 2) v chránenej forme, napríklad vo forme benzyloxymetyléteru, tetrahydropyranylu, alebo silylaminoalkoholu odvodeného z omitínu (obr. 1), nasledovaným uvoľnením kyslej skupiny obsiahnutej vo forme benzylesteru, jej redukciou na primárny alkohol, fosforyláciou tejto skupiny a odstránením chrániacej skupiny z alkoholovej skupiny chránenej vo forme benzyloxymetyléteru, tetrahydropyranylu alebo silylu.
SK 287514 Β6
Podľa tretieho variantu sa pseudodipeptid, ako medziprodukt (opísaný na obr. 2,) O-acyluje (obr. 27) derivátom dikarboxylovej kyseliny, výhodne sukcínanhydridom, za prítomnosti zásady alebo kopulačného činidla a z novovytvoreného esteru sa odstráni chrániaca skupina hydrogenolýzou (príklad 2.19). Spracovaním O-aminoacylových derivátov po odstránení chrániacej skupiny sukcínanhydridom poskytuje pseudodipeptidy, ktoré majú sukcinylaminoacylovú skupinu (príklad 2.17).
Podľa tretieho výhodného spôsobu sa aminoalkohol, získaný z omitínu alebo z lyzínu, ako je opísané, alkyluje omega-alkenyltriflátom, ako je hept-6-enyltriflát (obr. 17). Kopulácia tohto aminoalkoholu majúceho sekundárnu aminoskupinu s uvedenou a-acylaminokyselinou omega-fosforylovanou za prítomnosti EDC1 alebo iného acylačného činidla, poskytuje ester. Alkenylová skupina sa dihydroxyluje za prítomnosti oxidu osmičelého, pričom sa chrániace skupiny odstránia hydrogenolýzou za prítomnosti vhodných katalyzátorov a diol vicinálna skupina sa oxiduje jodistanom sodným za získania reaktívnej aldehydovej skupiny (príklad 2.10).
Podľa štvrtého výhodného spôsobu (obr. 19) sa N-chránený derivát serínu, napríklad derivát p-metoxybenzyloxykarbonylu, pripravený spôsobom opísaným v literatúre (Synthesis str. 36 až 37, 1989), O-alkyluje benzylbrómacetátom. Chrániaca skupina amínu sa odstráni, napríklad spracovaním kyselinou trifluóroctovou v dichlórmetáne a aminoskupina sa N-acyluje výhodne 3-hydroxylovaným derivátom mastnej kyseliny, ako je kyselina 3-dodekanoyloxytetradekánová za prítomnosti acylačného činidla alebo s použitím chloridu kyseliny alebo akýchkoľvek iných aktivovaných foriem mastnej kyseliny. Takto získaný N-acyl O-alkyl derivát serínu sa kopuluje s opísaným aminoalkoholom (obr. 1) za prítomnosti peptidického kopulačného činidla, ako je IIDQ, a potom sa voľná hydroxylová skupina acyluje alkánovou omega-funkcionalizovanou kyselinou za prítomnosti aktivačného činidla, ako je karbodiimid. Výhodne je touto funkcionalizovanou kyselinou omega-alkénová kyselina alebo derivát kyseliny omega-aminoalkánovej. Napríklad použitím kyseliny hept-6-énovej sa získa pseudodipeptid alebo derivát O-(6-heptenoylu), ktorý sa postupne podrobí dihydroxylácii za prítomnosti oxidu osmičelého, odstráneniu chrániacej skupiny hydrogenolýzou a oxidácii jodistanom (príklad 2.11).
Podľa piateho, v súčasnej dobe preferovaného, spôsobu je východiskovou aminokyselinou cystein alebo homocysteín (obr. 20). Cystein sa napríklad S-alkyluje p-metoxybenzylbrómacetátom. N-acyluje sa výhodne derivátom 3-hydroxylovej mastnej kyseliny, ako je kyselina 3-tetradekanoyloxytetradekánová, za prítomnosti acylačného činidla alebo použitím halogenidu alebo inej aktivovanej formy mastnej kyseliny. Takto získaný
S-alkylovaný alebo N-acylovaný derivát cysteínu sa kopuluje s 5-amino-2-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentán-l-olom za prítomnosti IIDQ alebo iného kopulačného peptidického činidla. Primáme voľná hydroxylová skupina sa O-acyluje omega-funkcionalizovanou alkánovou kyselinou, použitou vo forme aktivovaného esteru, napríklad ako je O-benzotriazolylester. Touto kyselinou je výhodne kyselina omegaaminoalkánová, ako je kyselina 7-(p-metoxy-benzyloxykarbonylamino)heptánová. Z takto získaného produktu sa odstránia všetky chrániace skupiny vo vodnom kyslom prostredí za získania pseudodipeptidu nesúceho pomocnú 7-aminoheptanoylovú vetvu (príklad 2.12).
Pri inom výhodnom spôsobe (obr. 21) sa N-p-metoxybenzyloxykarbonylderivát serínu O-alkyluje dibenzylmetylénmalonátom v alkalickom prostredí. Chrániaca skupina amínu sa odstráni spracovaním kyselinou, takto uvoľnená aminoskupina sa N-acyluje, výhodne derivátom 3-acylhydroxylovanej mastnej kyseliny, ako je kyselina 3-dodekanoyloxytetradekánová, za prítomnosti acylačného činidla alebo použitím funkčného derivátu mastnej kyseliny, ako je chlorid kyseliny alebo všetky ostatné aktivované formy mastnej kyseliny. Takto získaný N-acylovaný O-alkylovaný derivát serínu sa kopuluje s opísaným aminoalkoholom (obr. 1), za prítomnosti IIDQ alebo iného kopulačného peptidického činidla. Pseudodipeptid sa O-acyluje na voľnej hydroxylovej skupine omega-funkcionalizovanou alkánovou kyselinou. Výhodne je touto kyselinou kyselina omega-alkénová alebo derivát kyseliny omega-aminoalkánovej, napríklad kyselina hept-6-énová a takto získaný pseudodipeptid alebo derivát O-(6-heptenoylu) sa postupne dihydroxyluje za prítomnosti oxidu osmičelého, odstránia sa chrániace skupiny hydrogenolýzou a oxiduje sa jodistanom za získania derivátu nesúceho pomocnú 6-oxohexanoylovú vetvu a malonylovú skupinu (príklad 2.13).
Pri ďalšom, taktiež výhodnom spôsobe (obr. 22) sa opísaný derivát 6-aminohexanoylu (obr. 11) N-acyluje brómacetaminoskupinou použitím napríklad O-sukcínimidylesteru brómctovej kyseliny ako acylačného činidla. Touto reakciou sa získa derivát nesúci pomocnú 6-(brómacetamido)hexanoylovú vetvu (príklad 2.14).
Podľa ôsmeho výhodného spôsobu (obr. 23) sa benzylester O-fosforylovaného homoserínu (obr. 1) N-acyluje výhodne kyselinou 3-benzyloxytetradekánovou s použitím zmesového anhydridu pripraveného z kyseliny 3-benzyloxytetradekánovej a izobutylchlórmravčanu. Benzylester sa selektívne hydrogenolyzuje opísaným spôsobom. Derivát omega-N-benzyloxykarbonylu diaminoalkoholu odvodený z omitínu (obr. 1) sa Να-acyluje kyselinou 3-dodekanoyloxytetradekánovou za prítomnosti kopulačného činidla alebo s použitím aktivovaného esteru, alebo inej aktivovanej formy mastnej kyseliny a omega-aminoskupina sa uvoľní selektívnou hydrogenolýzou. Tento amín sa kopuluje s N-(3-benzyloxytetradekanoyl)-O-(difenyl-oxyfosforyl)de rivátom homoserínu za prítomnosti IIDQ alebo iného kopulačného peptického činidla. Takto získaný pseudodipeptid je O-acylovaný omega-funkcionalizovaňou alkánovou kyselinou napríklad za prítomnosti karbodiimidu. Výhodne je touto kyselinou omega-alkénová kyselina alebo derivát omega-aminoalkánovej kyseliny. Napríklad s kyselinou hept-6-énovou sa získaný pseudodipeptid alebo O-(6-heptenoyl)derivát postupne dihydroxyluje za prítomnosti oxidu osmičelého, chrániaca skupina sa odstráni hydrogenolýzou za prítomnosti vhodných katalyzátorov a oxiduje sa jodistanom za získania derivátu nesúceho pomocný 6-oxohexanoyl (príklad 2.15).
Podľa deviateho výhodného spôsobu (obr. 29, 31 a 34) sa z pseudodipeptidu, ako medziproduktu opísaného na obr. 2, odstraňuje skupina chrániaca karboxylovú skupinu obsiahnutú vo forme esteru a táto karboxylová skupina sa kopuluje s funkcionalizovaným aminoalkánom za prítomnosti kopulačného činidla. Funkcionalizovaným aminoalkánom je výhodne derivát apmega-diaminoalkánu alebo aminokyseliny. V prípade l-amino-3-benzyloxykarbonylaminopropánu (obr. 29) sa kopulačný produkt následne hydrogenolyzuje (príklad 2.20). V prípade benzylesteru Nepsilon-Z-lyzínu (obr. 31) a α,/3-dibenzylaspartátu (obr. 34) sa buď z kopulačného produktu odstráni chrániaca skupina, výhodne hydrogenolýzou (príklad 2.21 a 2.23), alebo sa produkt O-acyluje omega-funkcionalizovanou alkánovou kyselinou, výhodne N-benzyloxykarbonylderivátom kyseliny 6-aminohexánovej. Z takto získaného esteru sa odstraňujú chrániace skupiny hydrogenolýzou alebo iným vhodným spôsobom na odstraňovanie chrániacich skupín (príklad 2.22 a 2.24).
Vynález sa týka tiež medziproduktov všeobecných vzorcov (V), (VI), (IX), (XIII), (XVI) vo forme enantioméme a/alebo stereoizomérne čistej alebo vo forme zmesi stereoizomérov.
Vynález sa týka tiež farmaceutických prostriedkov obsahujúcich ako účinnú látku aspoň jednu zlúčeninu všeobecného vzorca (I) v neutrálnej alebo nabitej forme spolu so zmesou s excipientom alebo s inertným, netoxickým, farmaceutický prijateľným nosičom.
Najmä sa vynález týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich ako účinnú látku aspoň jednu soľ zlúčeniny všeobecného vzorca (I) s minerálnou alebo s organickou terapeuticky prijateľnou zásadou.
Vynález sa týka tiež farmaceutických prostriedkov obsahujúcich zlúčeniny všeobecného vzorca (I) vo forme enantioméme čistej alebo vo forme zmesi stereoizomérov spolu alebo v zmesi s farmaceutickým excipientom alebo nosičom.
Ako farmaceutické formy sa uvádzajú formy na podanie orálne, parenterálne, inhalačné, topické, transdermálne alebo sliznicové, ako sú napríklad tablety, dražé, želé, injektovateľné roztoky alebo suspenzie, aerosóly, gély, náplasti alebo penetračné masti.
Výhodne môžu byť zlúčeniny podľa vynálezu naočkované na antigén na úpravu imunitnej odozvy, alebo môžu byť tiež naočkované na farmakofér na zlepšenie jeho terapeutického účinku alebo jeho zamerania a môžu byť použité výhodne injekčné v konjugovanej forme vo forme vodných roztokov alebo suspenzií, prípadne neutralizovaných jedným amínom alebo hydroxylamínom. Ako príklad je možné uviesť antigén H1N1, antigén nonapeptidu SYVPSAEQI Plasmodia a farmakofóry, ako sú AZT, d4T, rovnako ako antibiotiká, ako makrolides a látky, ktoré majú účinok na SNC.
Nasledujúce príklady vynález ilustrujú pomocou obr. 1 až 86 bez toho, aby ho akokoľvek obmedzovali.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 Spôsob prípravy l-(difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetra-dekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]dekán-10-olu
Obr. 2 Spôsob prípravy a-N-{(4R)-5-dihydroxyfosforyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]pentyl}amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej, (= OM-197-MC-MP)
Obr. 3 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC
Obr. 4 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-MP
Obr. 5 Spôsob prípravy 3-[(dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-dekán-l,10-diol 1-dihydrogenfosfátu 10-(6,7-oxohexanoát)u (= OM-197-FV6) a
3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-oxohexanoát)u (= OM-197-FV7)
Obr. 6 Spektrum ES/MS m/z OM-197-FV6 Obr. 7 Spektrum ES/MS m/z OM-197-FV7
Obr. 8 Spôsob prípravy a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid 5-0-(6,7-dihydroxyheptanoát)u kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (= OM-197-MC-FV5), a-N-{(4R)-5-hydroxy-4~[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-O-(6-oxohexanoát)u kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (= OM-197-MC-FV6) a a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-0-(6-hydroxyhexanoát)u kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (= OM-197-MC-FV7)
Obr. 9 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-FV5
Obr. 10 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-FV6
Obr. 11 Spôsob prípravy (3RS,9R)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-aminohexanoát)u (= OM-197-MP-AC-RS, R)
Obr. 12 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MP-AC (R/S, R)
Obr. 13 Spôsob prípravy (3R,9R)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-dihydrogen-fosfát 10-(6-aminohexanoát)u (= OM-197-MP-AC-R, R)
Obr. 14 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MP-AC (R, R)
Obr. 15 Spôsob prípravy 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekán-l,10-diol l-(dihydrogenfosfát) 10-(6-aminohexanoát)u (= OM-197-FV8)
Obr. 16 Spektrum ES/MS m/z OM-197-FV8
Obr. 17 Spôsob prípravy 2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(dihydroxy-fosforyloxy)butanoát {2- [(R)-3-hydroxytetradekanoylamino] -5-(6-oxohexyl)-amino} pentylu (= OM-144-FP9)
Obr. 18 Spektrum ES/MS m/z OM-144-FP8
Obr. 19 Spôsob prípravy (2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]nonán-l,9-diol 1-O-karboxymetyl-éter 9-O-(6-oxohexanoát)u (= OM-112-FV7)
Obr. 20 Spôsob prípravy (2S,8R)-l-(karboxymetyl)tio-2-[(R)-3-tetradekanoyloxy-tetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-nonán-9-ol 9-O-(7-aminoheptanoátu (= OM-212-AH1)
Obr. 21 Spôsob prípravy (2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]nonán-l,9-diol 1-0-(2,2-dikarboxyetyl)éter 9-O-(6-oxohexanoát)u (= OM-312-FV7)
Obr. 22 Spôsob prípravy 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-l,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-bróm-acetamidohexanoátu (= OM-412-BA7)
Obr. 23 Spôsob prípravy (3RS,9R)-3-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-O-(6-oxohexanoát)u (= OM-512-FV7)
Obr. 24 Spôsob prípravy a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]pentyl}amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-MC-AC), a-N- {(4R)-5-(6-sukcinylamidohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoyl-amino]pentyl} amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-MC-AC-Succ) a α-N- {(4R)-5-glycinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl} amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-MC-Gly)
Obr. 25 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-AC
Obr. 26 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-Gly
Obr. 27 Spôsob prípravy a-N-{(4R)-5-sukcinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoyl-amino]pentyl}amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej, (= OM-197-MC-Succ)
Obr. 28 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-Succ
Obr. 29 Spôsob prípravy a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl} amid β-Ν-(3-aminopropyl)amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxy-tetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-AP) (obr. 29)
Obr. 30 Spektrum ES/MS m/z OM-197-AP
Obr. 31 Spôsob prípravy a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amidu β-Ν-[(lS)-l-karboxy-5-aminopentyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= = ΟΜ-197-Lys) a a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid /3-N-[(lS)-l-karboxy-5-aminopentyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= ΟΜ-197-Lys-AC)
Obr. 32 Spektrum ES/MS m/z ΟΜ-197-Lys
Obr. 33 Spektrum ES/MS m/z ΟΜ-197-Lys-AC
Obr. 34 Spôsob prípravy a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid β-Ν-[(lS)-l,2-dikarboxyetyl]amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-Asp) a a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid /3-N-[(lS)-l,2-dikarboxyetyl]amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyl-oxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= ΟΜ-197-Asp-AC)
Obr. 35 Spektrum ES/MS m/z ΟΜ-197-Asp
Obr. 36 Spektrum ES/MS m/z ΟΜ-197-Asp-AC
Obr. 37 Spôsob prípravy zlúčenín podľa vynálezu
Obr. 38 Spektrum ES/MS m/z OM-197-N' C2-MC-AC
Obr. 39 Spôsob prípravy a-N-{(4R)-5-[6-(aminohexanoyloxy]-4-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]pentyl} amidu kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej (= OM-197-N' C10-20C8)-Ac)
Obr. 40 Spektrum ES/MS m/z OM-197-N' (C10-20C8)-MC-AC
Obr. 41 Spôsob prípravy zlúčeniny OM-197-FV-FGFG zo zlúčenín OM-197-FV7 a FGFG
Obr. 42 Spektrum ES/MS m/z FGFG
Obr. 43 Spektrum ES/MS m/z OM-197-FV-FGFG@LH 4
Obr. 44 Spektrum ES/MS m/z (NANP)6P2P20 ua znamená zmluvnú jednotku
Obr. 45 Spektrum ES/MS m/z (NANP)6P2P20
Obr. 46 Spektrum ES/MS m/z OM-197-FV-(NANP)6P2P20
Obr. 47 Spektrum ES/MS m/z (OM-197-F V)2-(NANP)6P2P30
Obr. 48 Spektrum ES/MS m/z P2P30
Obr. 49 Spektrum ES/MS m/z OM-197-FV-P2P30
Obr. 50 Spektrum ES/MS m/z (OM-197-FV)2-P2P30
Obr. 51 Vplyv konjugácie na časť epitopu-T peptidu MR99B
MW znamená molekulovú hmotnosť
Obr. 52 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-FV-MR99B
Obr. 53 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-FV-MR99B
Obr. 54 Trypsínová digescia OM-197-MC-FV-MR99B, analýza LC/ES-MS
Trace LC/MS = stopa LC/MS single ion trace = stopa jediného iónu
Obr. 55 Spektrum ES/MS m/z fragmentu SYVPSAEQI
Obr. 56 Spektrum ES/MS m/z fragmentu OM-197-MC-FV-SER
Obr. 57 Spektrum ES/MS m/z (OM-197-MC-FV)3-MR99A
Obr. 58 Spektrum ES/MS m/z (OM-197-MC-FV)3-MR99A
Obr. 59 Spektrum ES/MS m/z (OM-197-MC-FV)4-MR99A
Obr. 60 Spektrum ES/MS m/z (OM-197-MC-FV)4-MR99 A
Obr. 61 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-FV-MRlOO
Obr. 62 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-FV-MRlOO
Obr. 63 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-FV-OM-197-MC-AC
Obr. 64 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-FV-OM-197-MC-AC
Obr. 65 Konjugácia syntetického peptidu MR99B na OM-197-MC-AC
MW znamená molekulovú hmotnosť
Obr. 66 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-AC-MR99B
Obr. 67 Spektrum ES/MS m/z OM-197-MC-AC-MR99B
Obr. 68 Analýzy SDS-PAGE konjugátu ovalbumínu
Obr. 69 Spôsob prípravy konjugátu podľa príkladu 3.12
Obr. 70 Aktivita rôznych acylovaných pseudodipeptidov a vplyv funkcionalizovanej pomocnej vetvy na vyvolanie proliferácie kmeňových buniek opičej kostnej drene.
—□— LPS E. coli
-4— OM-197-MC
OM-197-MP-AC (R/S, R)
OM-197-F V6 —®— OM-197-MC-FV7 — ΟΜ-197-Lys
-T&- ΟΜ-197-Lys-AC
-+ - slepá
- H— - slepá + 3 x odchýlka
Obr. 71 Aktivita rôznych acylovaných pseudodipeptidov kopulovaných na drogu OM-197-MC-AC
-O- OM-197-MC-Succ
-b~ OM-197-MC-AC-Succ-AZT
-O- OM-197-MC-AC-Succ-d4T —X— OM-197-MC-AC-Succ
---+·- slepá
- - slepá + 3 x odchýlka
Obr. 72 Aktivita rôznych acylovaných pseudodipeptidov a vplyv funkcionalizovanej pomocnej vetvy na vyvolanie proliferácie kmeňových buniek kostnej drene myší —O— LPS E. coli
OM-197-MP-AC (R/S, R)
OM-197-F V6 —ár—
--4--Obr. 73
OM-197-MC-FV7
ΟΜ-197-Lys
ΟΜ-197-Lys-AC slepá slepá + 3 x odchýlka
Aktivita rôznych acylovaných pseudodipeptidov kopulovaných na drogu
OM-197-MC-AC —O- OM-197-MC-Succ —Δ— OM-197-MC-AC-Succ-AZT —O— OM-197-MC-AC-Succ-d4T
-X- OM-197-MC-AC-Succ ·-+· slepá
- -+- - slepá + 3 x odchýlka
Obr. 74 Začlenenie Dextránu-FITC v nestimulovaných bunkách
-O— OM-197-MC
-O- OM-197-FV6 “Ú“ OM-197-MP-AC “O“ LPS
Obr. 75 Zvýšenie expresie povrchových molekúl “O“ OM-197-MC —O- OM-197-FV6 ~ú~ OM-197-MP-AC
-O“ LPS
Obr. 76 Zvýšenie expresie CD83 a CD86
-O“ OM-197-MC “O— OM-197-FV6
-Δ- OM-197-MP-AC
-O- LPS
Obr. 77 Pruhy Westem blot zvýšenie produkcie proteínu MxA vyvolané produktmi OM-197-MC5 a OM-197-FV6 po 24 hodinách
Obr. 78 Pruhy Westem blot zvýšenie produkcie proteínu MxA vyvolané produktmi OM-197-AC5 a OM-197-FV6 po 48 hodinách
Obr. 79 Špecifická produkcia protilátok lgG anti-(NANP)6P2P30 zistená spôsobom ELISA
NaCl (NANP)6P2P30
IFA + (NANP)6P2P30
OM-197-FV6 + (NANP)6P2P30
OM-197-MC + (NANP)6P2P30 (OM-197-FV)1j2j3-(NANP)6P2P30
OM-197-FV-(NANP)6P2P30
OM-197-FV-(NANP)6P2P30 + OM-197-MP
Obr. 80 Hodnotenie vlastností acylovaných pseudodipeptidov s pomocnou funkcionalizovanou vetvou NaCl (NANP)6P2P30
IFA + (NANP)6P2P30
OM-197-FV6 + (NANP)6P2P30
OM-197-MC + (NANP)6P2P30 (OM-197-FV)1,2,3-(NANP)6P2P30
OM-197-F V-(NANP)6P2P30
OM-197-FV-(NANP)6P2P3o + OM-197-MP
Obr. 81 Ovalbumínové imunizácie: stanovenie Špecifických protilátok vytváraných pri myšiach
u.a. znamená zmluvnú jednotku
Obr. 82 Ovalbumínové imunizácie: stanovenie špecifických protilátok vytváraných pri myšiach
u.a. znamená zmluvnú jednotku
Obr. 83 Ovalbumínové imunizácie: stanovenie špecifických protilátok vytváraných pri myšiach
u.a. znamená zmluvnú jednotku
Obr. 84 Zvyšovanie špecifickej protilátky anti-ovalbumínu konjugátom ΟΜ-197-FV-ovalbumín
-o o
-O-Cl·-o-O18
u.a. znamená zmluvnú jednotku
Obr. 85 Vyhodnotenie v modeli imunizácie myší (2 týždne po druhej injekcii) Obr. 86 Vyhodnotenie v modeli imunizácie myší (2 týždne po tretej injekcii)
Príklady uskutočnenia vynálezu
Prvá séria príkladov: príprava medziproduktov syntézy
Príklad 1.1.
l-(Difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]dekán-10-ol (obr. 1).
1.1.1. Kyselina 4-(difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-butánová
a. N-Terc-butyloxykarbonyl-DL-homoserín
Do roztoku brómhydrátu homoserínu (2 g, 16,78 mmol) vo vode (20 ml) sa pridá roztok hydroxidu sodného IM (16,78 ml) a potom uhličitan cézny (3,01 mg, 9,23 mmol). Mieša sa počas 5 minút, roztok sa ochladí v ľadovom kúpeli. Pridá sa dioxán (60 ml) a terc-butylpyrokarbonát. Reakčná zmes sa mieša 1 hodinu v ľadovom kúpeli, potom 5 hodín pri teplote okolia. Rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu a suchý zvyšok sa použije priamo v ďalšom stupni.
b. Benzyl-N-terc-butyloxykarbonyl-DL-homoserinát
Do získaného zvyšku sa pridá dimetylformamid (20 ml) a odparí sa do sucha. Do reakčnej zmesi sa pridá dimetylformamid (60 ml) a benzylbromid (4,5 ml, 20,13 mmol). Vytvorí sa biela zrazenina. Zmes sa mieša 16 hodín. Rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu a zvyšok sa vyberie do etylacetátu (2 x 20 ml). Organická fáza sa premyje vodou (20 ml), potom soľankou (20 ml). Po vysušení síranom horečnatým sa rozpúšťadlo odparí a zvyšok sa použije v ďalšom stupni.
c. Benzyl-N-terc-butyloxykarbonyl-O-(difenyloxyfosforyl)-DL-homoserinát
Do roztoku suchého zvyšku zo stupňa b) v dichlórmetáne (60 ml) sa pridá 4-(N,N-dimetylamino)pyridín (DMAP) (4,11 g, 33,56 mmol). Reakčná zmes sa mieša 10 minút. Pridá sa pyridín (12 ml) a difenylchlórfosfát (6,95 ml, 33,56 mmol). Roztok sa mieša 18 minút pri teplote miestnosti, premyje sa kyselinou chlorovodíkovou IN (5 x 20 ml), vodou (30 ml) a nakoniec soľankou (30 ml). Organická fáza sa suší síranom horečnatým a rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu. Po čistení okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém hexán/etylacetát 4 : 1) sa získa fosforylovaný produkt (7,49 g, 82,4 % teórie) v pevnej kryštalickej forme. Teplota topenia 63,5 až 64,0 °C.
d. Benzyl-O-(difenyloxyfosforyl)-DL-homoserinát, trifluóroctová soľ
Roztok fosforylovaného produktu zo stupňa c) (7,88 g, 15,4 mmol) v trifluóroctovej kyseline (15 ml) sa mieša 2,5-hodiny pri teplote okolia. Rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu a čistenie okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém metanol/dichlórmetán 10:1) poskytuje soľ trifluóroctového nechráneného amínu (7,17 g, 88,9 % teórie) v pevnej kryštalickej forme. Teplota topenia 73,0 až 73,5 °C.
e. 2-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(difenyloxyfosforyloxy)benzyl-butanoát
Pripraví sa roztok kyseliny (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovej (4,284 g, 10,07 mmol, 1 ekv.), získanej spôsobom opísaným v literatúre (Bull, Chem. Soc. Jpn 60, str. 2205 až 2214, 1987), v tetrahydrofuráne (30 ml) a ochladí sa na teplotu -15 °C. Pridá sa N-metylmorfolín (1,108 ml, 10,07 mmol), 1 ekv.) a izobutylchlórmravčan (1,31 ml, 10,07 mmol, 1 ekv.) Reakčná zmes sa mieša 30 minút, pri teplote -15 °C. Pridá sa roztok benzyl-O-(difenyloxyfosforyl)-DL-homoserinátu, (5,724 g, 10,07 mmol, 1 ekv.) v systéme tetrahydrofurán/trietylamín (30 ml/ 5 ml). Mieša sa počas 18 hodín pri teplote okolia, rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu. Zvyšok sa zriedi vodou (20 ml) a extrahuje sa etylacetátom (2 x 30 ml). Organické fázy sa spoja, premyjú sa postupne vodou (20 ml) a soľankou (20 ml) a pred odparením sa vysušia síranom horečnatým. Po čistení okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo hexán/etylacetát 2 : 1) sa získa žiadaný benzylester (7,455 g, 87 % teórie) v pevnej kryštalickej forme. Teplota topenia 31,0 až 32,1 °C.
'H-RMN (CDClj, 250 MHz), δ ppm: 7,4-7,1 (m, 15H); 6,90 (2d, 1H, 3J= 7,6 Hz, NH); 5,3-5,1 (m, 3H); 4,7 (m, 1H); 4,35 (m, 2H); 2,45 (m, 2H); 2,4-2,1 (m, 4H); 1,6 (m, 4H); 1,4-1,1 (m, 34H); 0,9 (t, 6H). 13C-RMN (CDClj, 63 MHz), δ ppm: 173,01; 171,08; 169,66; 150,18 (d, 2JP,c = 7,1 Hz); 135,01; 129,60; 128,33; 128,14; 127,96; 125,21; 119,80 (d, 3JP,c = 5,0 Hz); 70,69; 67,05; 65,19 (d, 2JP,c = 5,6 Hz); 49,13; 40,97; 40,77 (2 diast.); 34,20; 33,98; 33,82; 31 *70; 29,42; 29,34; 29,14; 28,94; 25,01; 24,77; 22,47; 13,91.
f. Kyselina 4-(difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-butánová
Roztok benzylesteru získaného v stupni e) (2,23 g, 2,6 mmol) v metanole kvality HPLC (300 ml) v trojhrdlovej banke sa hydrogenuje vodíkom jednu hodinu za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (1 g) pri teplote okolia a za tlaku okolia. Katalyzátor sa odfiltruje a filtrát sa odparí za získania bezfarebného sirupu. Sirup sa homogenizuje chromatografiou na tenkej vrstve a RMN a použije sa bez ďalšieho čistenia priamo v ďalšom stupni.
Rf = 0,75 (CH2Cl2/MeOH/Et3N 10/1/0,5).
'H-RMN (CDC13, 250 MHz), δ ppm: 7,4-7,1 (m, 10H); 6,85 (d, 1H, NH); 5,15 (m, 1H); 4,6 (m, 1H); 4,35 (m, 2H); 2,45 (m, 2H); 2,4-2,15 (m, 4H); 1,6 (m, 4H); 1,4-1,1 (m, 34H); 0,9 (t, 6H). 13C-RMN (CDC13, 63 MHz), δ ppm: 173,35; 173,30 (2 diast.); 172,75; 170,37; 150,0 (d, 2JPC = 7,5 Hz); 129,55; 125,28; 119,71 (d, 3Jp,c = 4,4 Hz); 70,78; 65,65 (d, VP.c = 5,9 Hz); 49,00; 40,77; 40,63 (2 diast.); 34,13; 33,86; 33,76; 31,59; 29,31; 29,25; 29,03; 28,82; 24,88; 24,68; 22,36; 10,76.
1.1.2. (2R)-5-Amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentán-l-ol
a. Meďnatá soľ D-omitinu
Do roztoku D-omitínu (5,25 g, 30 mmol) v hydroxide sodnom IN (30 ml) sa pridá roztok pentahydrátu síranu meďnatého (3,814 g, 15,3 mmol) vo vode (50 ml). Mieša sa počas dvoch hodín pri teplote okolia, rozpúšťadlo sa odparí a zmes sa vysuší. Do zvyšku sa pridá metanol (60 ml) za vytvorenia pevnej látky purpurovej farby, ktorá sa oddelí, premyje sa postupne dioxánom a metanolom na priame použitie v ďalšom stupni.
b. (2R)-2-Amino-5-(benzyloxykarbonylamino)pentanoát meďnatý
Pevná látka purpurovej farby sa rozpustí v zmesi roztoku hydroxidu sodného IN (40 ml) a dioxánu (70 ml). Reakčná zmes sa ochladí v ľadovom kúpeli a pridá sa benzylmravčan (5,14 ml, 36 mmol). Mieša sa počas troch hodín v ľadovom kúpeli, potom 15 minút pri teplote okolia, purpurová zrazenina sa rekuperuje filtráciou a premyje sa postupne 95 % etanolom (40 ml), vodou (50 ml) a etanolom (60 ml). Zrazenina sa vysuší v peci (T < 45 °C vo vákuu); výťažok z dvoch stupňov je 8,27 g, 93 % teórie. (Organic Preparation and Procedures Intemational 2, str. 191 až 194, 1992).
c. Kyselina (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-(terc-butyloxykarbonylamino)-pentánová
Meďnatá soľ, získaná v stupni b) sa rozpustí v roztoku kyseliny chlorovodíkovej 2N (400 ml), a pridá sa kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA) (8,15 g, 27,8 mmol). Mieša sa počas 2,5-hodiny, hodnota pH sa upraví na 7 pridaním roztoku hydroxidu sodného 5N (približne 160 ml). Vytvorí sa biela zrazenina. Zmes sa potom mieša 2,5-hodiny v ľadovom kúpeli. Zrazenina sa odfiltruje, premyje sa studenou vodou až do odfarbenia výtoku, potom sa vysuší pri teplote pod 60 °C. Pevná látka sa rozpustí v roztoku hydroxidu sodného IN (156 ml) a roztok sa ochladí v ľadovom kúpeli. Do tohto roztoku sa pridá terc-butylpyrokarbonát (7,7 g,
35,2 mmol) v dioxáne (160 ml). Reakčná zmes sa mieša 45 minút pri teplote 0 °C a 16 hodín pri teplote okolia. Organické rozpúšťadlo sa odparí a zvyšok sa rozpustí v etylacetáte (70 ml). Vodná fáza sa okyslí kyselinou chlorovodíkovou 2N až na hodnotu pH približne 3, premyje sa etylacetátom (100 ml). Organické fázy sa spoja a premyjú sa vodou (30 ml) a soľankou (30 ml), potom sa odparia vo vákuu. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetánu/metanol 20 : 1) sa získa žiadaný produkt v podobe bezfarebného oleja (výťažok: 8,42 g v dvoch stupňoch, 76,7 % teórie) (Rf = 0,19 systém dichlórmetán/metanol 20 : 1).
d. (2R)-5-(Benzyloxykarbonylamino)-2-(terc-butyloxykarbonylamino)pentán-1 -ol
Do studeného roztoku (-15 °C) derivátu v stupni c) získanej kyseliny diaminopentánovej (5,45 g, 14,8 mmol) v tetrahydrofuráne (60 ml) sa pridá N-metylmorfolín (1,65 ml, 14,8 mmol) a izobutylchlórmravčan (9,6 mol,
14,8 mmol). Reakčná zmes sa mieša pri teplote -15 °C počas jednej minúty, pridá sa bórhydrid sodný (5,1 g,
44,6 mmol) v 10 ml vody. Mieša sa počas 10 minút pri teplote -15 °C, do zmesi sa pridá voda (400 ml) na ukončenie reakcie. Roztok sa premyje etylacetátom (2 x 100 ml). Organické fázy sa spoja a premyjú sa vodou (50 ml) a soľankou (60 ml) a vysušia sa síranom horečnatým. Rozpúšťadlo sa odparí a zvyšok sa nechá vykryštalizovať zo zmesi etylacetátu a hexánu, čím sa získa žiadaný kryštalický produkt (4,94 g, 94,9 % teórie). Teplota topenia 47,5 až 48 °C.
e. Trifluóroctová soľ (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-aminopentán-l-olu
Pripraví sa roztok získaného (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-(terc-butyloxykarbonylamino)pentán-l-olu (6,32 g, 18 mmol) v trifluóroctovej kyseline (25 ml) a mieša sa 2,5-hodiny pri teplote okolia. Rozpúšťadlo sa odparí a čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém metanol/dichlórmetán 10 : 1) sa získa trifluóroctová soľ ako olej (5,45 g, 82,7 % teórie). Chlórhydrát má teplotu topenia pri teplote 133,0 až 134 °C (rekryštalizácia z metanolu).
f. (2R)-5-(Benzyloxykarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylaniino]-pentán-1 -ol
Do studeného roztoku (-15 °C) kyseliny (R)-3-benzyloxytetradekánovej (5,27 g, 15,8 mmol) (Bull. Chem. Soc. Jpn. 60, str. 2197 až 2204, 1987) v tetrahydrofúráne (30 ml) sa pridá N-metylmorfolín (1,89 ml,
15,8 mmol) a izobutylchlórmravčan (2,21 ml, 15,8 mmol). Mieša sa počas 30 minút pri teplote -15 °C, pridá sa získaný roztok trifluóroctovej soli (15,25 g, 14,4 mmol) v systéme tetrahydrofurán/trietylamín (30 ml/
1,44 ml). V miešaní sa pokračuje 16 hodín pri teplote okolia, reakčná zmes sa zriedi vodou (30 ml) a etylacetátom (60 ml). Organické fázy sa oddelia a vodná fáza sa premyje etylacetátom (60 ml). Organické fázy sa spoja a premyjú sa vodou (30 ml) a soľankou (30 ml) a pred odparením vo vákuu sa vysušia síranom horečnatým. Zvyšok sa nechá vykryštalizovať zo systému etylacetát/hexán, čím sa získa žiadaný produkt v kryštalickej forme (5,8 g, 71,2 % teórie). Teplota topenia 117,5 až 118 °C. Rf = 0,32, systém etylacetát/petroléter 3 : 1.
'H-RMN (CDClj, 250 MHz), δ ppm: 7,4-7,2 (m, 10H); 6,5 (d, 1H, NH); 5,1 (s, 2H); 4,9 (m, 1H, NH); 4,5 (2d, AB, 2H); 3,8 (m, 2H); 3,5 (m, 2H); 3,1 (m, 2H); 2,4 (m, 2H); 1,6-1,4 (m, 6H); 1,4-1,2 (m, 18H); 0,9 (t, 3H). 13C-RMN (CDCIj, 63 MHz), δ ppm: 172,24; 156,49; 138,06; 136,53; 128,46; 128,04; 127,87; 76,76; 71,39; 66,60; 65,44; 51,54; 41,43; 40,65; 33,76; 31,87; 29,61; 29,30; 28,01; 26,47; 25,05; 22,65; 14,09.
g. (2R)-5-Amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentán-l-ol
V trojhrdlovej banke sa do roztoku (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentán-l-olu (3,0 g, 5,27 mmol) v zmesi etanolu pre HPLC/trietylamín (300 ml/6 ml) pridá katalyzátor (20 % teórie paládium na uhlí, 150 ml). Vzduch sa odsaje vo vákuu a banka sa naplní vodíkom. Reakčná zmes sa hydrogenuje dve hodiny pri teplote okolia. Katalyzátor sa odfiltruje a filtrát sa koncentruje za získania žiadaného produktu v podobe bielej pevnej látky. Rf = 0,2, systém dichlórmetán/metanol/trietylamín 5/1/0,5. Teplota topenia 47 až 48 °C.
‘H-RMN (CDC13, 250 MHz), δ ppm: 7,4-7,2 (m, 5H); 6,75 (d, 1H, NH); 4,5 (2d, AB, 2H); 3,9 (m, 2H); 3,5 (m, 2H); 2,3-2,6 (m, 7H); 1,7-1,2 (m, 24H); 0,9 (t, 3H).
13C-RMN (CDC13, 63 MHz), δ ppm: 171,86; 138,13; 128,37; 127,87; 127,75; 76,81; 71,50; 64,57; 51,38; 41,51; 41,17; 33,89; 31,82; 29,26; 28,57; 28,03; 25,07; 22,60; 14,04.
1.1.3. l-(Difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylaminojdekán-10-ol
2-Izobutoxy-l-izobutoxykarbonyl-l,2-dihydrochinoleín (IIDQ) (364 mg, 1,2 mmol, 1,2 ekv.) sa pridá do roztoku kyseliny (2RS)-4-(difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]butánovej (850 mg, 1,0 mmol, 1 ekv.) v bezvodom dichlórmetáne (20 ml) pri teplote okolia v prostredí argónu. Reakčná zmes sa mieša počas 15 minút a pridá sa roztok (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloxy-tetradekanoylamino]pentán-l-olu (757 mg, 1,0 mmol, 1 ekv.) v bezvodom dichlórmetáne (10 ml). Mieša sa počas štyroch hodín a roztok sa odparí do sucha. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 5/2) sa získa fosforylovaný pseudopeptid (620 mg, 53 % teórie) v podobe amorfnej pevnej látky (Rf = 0,49, systém dichlórmetán/metanol/trietylamín 10/1/0,5).
‘H-RMN (CDCls, 250 MHz), δ ppm: 7,40-7,15 (m, 15H), 7,00 (m, 1H), 6,90-6,80 (2d, 2 diast, 1H), 6,65 (d, 1H) (3 xNH), 5,15 (m, 1H), 4,50 (m, 3H), 4,30 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,15 (m, 2H), 2,41-2,14 (m, 8H), 1,6-1,4 (m, 8H), 1,4-1,1 (m, 54H), 0,9 (t, 9H, 3CH}). 13C-RMN (CDC13, 63 MHz), δ ppm: 173,11, 171,68, 170,52 (2 diast.), 169,94 (2 diast.), 150,0 (d, VP>C = 7,2 Hz), 138,20 (2 diast.), 129,58, 127,99, 127,49 127,26, 125,24, 119,73 (t, 3JP,c = 5,0 Hz), 76,48, 71,12, 70,71, 65,86 (široké), 64,22, 50,96, 49,71 (široké), 41,46, 41,05, 39,07, 34,13, 34,00, 32,70, 31,61, 29,34, 29,06, 28,87, 27,98, 25,25, 24,92, 24,72, 22,38, 13,80.
Príklad 1.2.
a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-MC) (obr. 2)
1.2.1. /3-Benzylester kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej
Do roztoku kyseliny (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovej (3,35 g, 7,85 mmol) v bezvodom tetrahydrofuráne (25 ml) sa pri teplote -15 °C v prostredí argónu pridá postupne N-metylmorfolín (0,86 ml, 7,85 mmol, 1 ekv.) a izobutylchlórmravčan (1,03 ml, 7,85 mmol, 1 ekv.). Rýchlo sa vyzráža chlórhydrát N-metylmorfolínu. Mieša sa počas 30 minút pri teplote -15 °C, pridá sa obchodne dostupný roztok H-D-Asp(OBn)-OH (Senn Chemicals AG, CH-Dielsdorf) (1,75 g, 7,85 mmol, 1 ekv.) v systéme acetonitril/ voda 3,5/1 (85 ml) obsahujúci trietylamín (3,7 ml). Reakčná zmes sa mieša cez noc pri teplote okolia. Organické rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu, vodná fáza sa ochladí na teplotu 0 °C, okyslí sa vodným roztokom kyseliny citrónovej 10 % na hodnotu pH 3 a extrahuje sa 2x etylacetátom. Organické fázy sa sušia síranom horečnatým, prefiltrujú sa a odparia. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém petroléter/etylacetát 2/1 obsahujúci 2 % kyseliny octovej) nasledovaným spoločným odparením s toluénom sa získa /3-benzylester ky seliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (4,00 g, 81 % teórie) vo forme bielej kryštalickej pevnej látky (Rf = 0,42 v systéme petroléter/etylacetát 1/1 obsahujúcom 2 % octovej kyseliny: vývojka U .V. a fosfomolybdénová). Teplota topenia 67 až 69 °C.
1.2.2. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid 0-benzylester kyseliny N- [(R)-3 -dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (ASM-1)
Do roztoku získaného 0-benzylesteru (363 mg, 0,57 mmol) a (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoyl]aminopentán-l-olu (odsek 1.1.2) (250 mg, 0,57 mmol, 1,0 ekv.) v bezvodom dichlórmetáne (6 ml) pri teplote 0 °C (v ľadovom kúpeli) a v prostredí argónu sa postupne pridá obchodný l-hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) (94 mg, 0,69 mmol, 1,2 ekv.) a obchodne dostupný N,N'-diizopropylkarbodimid (109 μΐ, 0,69 mmol, 1,2 ekv.). Reakčná zmes sa mieša jednu hodinu pri teplote 0 °C, potom cez noc pri teplote okolia. Reakčná zmes sa premyje vodou, IN roztokom kyseliny chlorovodíkovej a nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, potom sa fázy oddelia. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí sa. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 3/1 sa získa kopulačný produkt (436 mg, 72 % teórie) vo forme bielej kryštalickej pevnej látky (Rf = 0,27, systém dichlórmetán/acetón 5:1, vývojka U.V. a fosfomolybdénová). Teplota topenia 106 až 108 °C, ’3C-RMN (62,89 MHz, CDC13),Ó ppm: 173,66; 172,09; 171,73; 170,33; 170,12; 138,23; 135,28; 128,53; 128,37; 128,13; 127,81; 127,71; 125,81; 76,71; 71,40; 71,16; 66,77; 65,01; 51,36; 49,39; 41,66; 39,25; 34,40; 33,98; 31,85; 29,58; 29,47; 29,29; 29,11; 28,00; 25,57; 25,17; 25,08; 24,94; 22,62; 14,05.
1.2.3. a-N-{(R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-benzylester kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-MC)
Roztok a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}-amid /3-benzylesteru kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (417 mg, 0,40 mol) v zmesi metanol/etylacetát 1/1 (36 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (20 mg) pri teplote okolia a v prostredí vodíka počas troch hodín. Katalyzátor sa odfiltruje, premyje sa zmesou dichlórmetánu/metanol 4/1 (50 ml), filtrát sa odparí do sucha a suší lopatkovým čerpadlom za získania voľnej kyseliny (345 mg, 100 % teórie) vo forme pevnej kryštalickej látky (Rf = 0,30, systém dichlórmetánu/metanol 9/1 obsahujúci 0,5 % kyseliny octovej, vývojka fosfomolybdénová). Teplota topenia 135 až 137 °C. ES/MS m/z 868,7 [M+H1+, 890,7 [M+Na]+,
868,7 [M+K]+, 912,7 [M-H+2Na]+ (obr. 3).
1.2.4. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-L-asparágovej
Rovnaká sekvencia reakcií aplikovaná na obchodne získaný H-L-Asp(OBn)-OH (Fluka, Buchs, Švajčiarsko) vedie k epimemému produktu v L- asparágovej sérii.
Príklad 1.3.
a-N-{(4R)-5-Dihydroxyfosforyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej, (= OM-197-MC-MP) (obr. 2)
1.3.1. Cŕ-N-{(4R)-5-Dibenzyloxyfosforyloxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-pentyl}amid /3-benzylester kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej
Do roztoku a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-pentyl}amid /3-benzylesteru kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej získaného v predchádzajúcom stupni (300 mg, 0,29 mmol) a lH-tetrazolu (60 mg, 0,86 mmol) v bezvodom tetrahydrofuráne (12 ml) pri teplote okolia a v prostredí argónu sa pridá 85 % dibenzyl-dietylfosforamidit (231 μΐ, 0,66 mmol). V reakčnom prostredí sa rýchlo vykryštalizujú biele kryštály. Mieša sa počas 30 minút, reakčná zmes sa ochladí na teplotu -20 °C, potom sa pridá roztok mCPBA (57 až 86 %, 183 mg, 1,06 mmol) v dichlórmetáne (8 ml). Kryštály zmiznú. Mieša sa počas 45 minút pri teplote okolia, pridá sa nasýtený roztok tiosíranu sodného a reakčná zmes sa mieša 10 minút. Roztok sa potom zriedi éterom, organická fáza sa oddelí a premyje sa nasýteným roztokom tiosíranu sodného (5x), nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2x) a roztokom kyseliny chlorovodíkovej IM (lx). Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí sa. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 5/1) sa získa fosfotriester (294 mg, 79 % teórie vo forme bielej pevnej látky (Rf = 0,27, systém dichlórmetán/acetón 5/1) vývojka U. V. a fosfomolybdénová.
13C-RMN (62,89 MHz, CDC13), δ ppm: 173,26; 171,37; 171,01; 170,60; 170,03; 138,22; 135,50; 135,40; 135,28; 128,40; 128,33; 128,16; 128,08; 127,94; 127,82; 127,76; 127,53; 127,41; 76,43; 71,03; 70,90; 69,28; 66,47; 49,09; 48,37; 41,62; 41,35; 41,24; 39,02; 38,88; 25,05; 24,94; 24,82; 22,48; 13,90.
1.3.2. o-N-{(4R)-5-Dihydroxyfosforyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-MC-MP)
Roztok dibenzylfosfátu, pripraveného skôr, (249 mg, 190 gmol) v etanole kvality HPLC (12 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti paládia na uhlí 10 % teórie (30 mg) pri teplote okolia a v prostredí vodíka počas štyroch hodín. Katalyzátor sa odfiltruje s použitím milipóru. Filtrát sa odparí do sucha a suší sa lopatkovým čerpadlom za získania voľnej surovej kyseliny (180 mg, 100 % teórie). ES/MS m/z 850,7 [M+H-P(O)(OH)3]+,
948,5 [M+K]+, 970,5 [M+Na]+ (obr. 4).
Príklad 1.4.
Stanovenie stupňa epimerizácie medziproduktov syntézy
Stereochémia nosičových centier aminoskupín sa stanoví konfiguráciou východiskových aminokyselín. Peptidické kopulácie realizované s použitím derivátu asparágovej alebo glutámovej kyseliny a aminoalkoholu, získaných z omitínu alebo z lyzínu, môže viesť za určitých podmienok k javu epimerizácie C-a. východiskovej kyseliny, použitej na kopulačnú reakciu. Na dôkaz stupňa epimerizácie tejto reakcie sa používa nasledujúci spôsob pre deriváty kyseliny asparágovej.
Vzorka (30 pg) sa odparí v mikroskúmavke, načo sa znovu rozpustí v 40 pl kyseliny chlorovodíkovej 6M. Hydrolýza sa uskutočňuje ďalších 24 hodín pri 110 °C v prostredí argónu. Vzorka sa odparí do sucha, znovu sa rozpustí v 100 ml tetraborátového pufra 0,1 M, hodnota pH 9,2. Prestĺpcová derivatizácia sa uskutoční s použitím o-ftaldialdehyd-N-izobutyl-L-cysteínu (OPA-IBLC) v nasledujúcich proporciách: 5 pl roztoku pufra tetraborátu sodného 0,1 M, hodnota pH 9,2, 2 pl metánového roztoku 170 ml OPA, 260 mM IBLC, pl analyzovaného roztoku.
Delenie HPLC na stĺpci Hypersil ODS /250 x 4,6 mm, 5 pm, Supelco) umožňuje kvantifikovať obidva deriváty foriem L a D asparágovej kyseliny obsiahnutej vo východiskových vzorkách (Briickner a kol., J. Chromatogr. A 711, str. 201 až 215, 1995). Podmienky HPLC: Stĺpec: Hypersil ODS (250 x 4,6 mm, 5 pm, Supelco)
Mobilná fáza: A. 23 mM octanu sodného, hodnota pH 5,9
B: metanol-acetonitril (12 : 1)
Injekcia: 5 pl
Množstvo: 1 ml/min.
Elučné činidlo: gradient A : B 96 : 4 až 80 : 20 v 25 minútach Detekcia: UV: 338 nm
Za týchto podmienok chromatografie je retenčný čas 16,1 a 17,2 minút pre deriváty kyseliny L- a D-asparágovej.
Druhá séria príkladov: Príprava pseudopeptidov s pomocnou funkcionalizovanou vetvou
Príklad 2.1.
3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-1,10-diol-l-dihydrogenfosfát 10-(6,7-dihydroxyheptanoát (= OM-197-FV6) (obr. 5)
2.1.1.
l-(Difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylaminojdekán-10-ol (6-heptenoát)
Do roztoku l-(difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-10-olu (príklad 1.1) (875 mg, 0,74 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (25 ml) sa pridá kyselina 6-hepténová (141 pl, 1,04 mmoí, 1,4 ekv.). Roztok sa ochladí na teplotu 0 °C. Pridá sa EDC1 (64 mg, 0,33 mmol, 1,4 ekv.) a DMAP (41 mg, 0,33 mmol, 0,14 ekv.). Reakčná zmes sa mieša 30 minút pri teplote 0 °C, potom 3 hodiny pri teplote okolia. Po zriedení dichlórmetánom sa organická fáza premyje postupne vodou, 1 N roztokom kyseliny chlorovodíkovej a vodou. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, odparí sa pri teplote 40 °C vo vákuu. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém petroléter/etylacetát 1/1) sa získa l-(difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoyl-amino]-10-ol 6-heptenoát (820 mg, 85 % teórie) vo forme bielej peny (Rf = 0,18, systém petroléter/etylacetát 1/1, vývojka kyselina fosfomolybdénová). !3C-RMN (62,89 MHz, CDC13), δ ppm: 173,30; 171,18; 170,42; 169,91; 169,73; 150,10; 138,21; 138,14; 129,77; 128,25; 127,49; 125,44; 119,88; 114,56; 76,48; 71,11; 70,90; 66,01; 65,52; 49,90; 47,80; 41,34; 39,07; 33,92; 33,76; 33,69; 33,61; 33,17; 31,75; 29,47; 29,19; 29,00; 28,46; 28,11; 25,34; 25,05; 24,85; 22,52; 13,96.
2.1.2. 1 -(Difenyloxyfosforyloxy)-3 - [(R)-3 -dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5 -aza-9-[(R)-3 -benzyloxytetradekanoylamino]-10-ol (6,7-dihydroxyheptanoát)
Do roztoku hexakyanoželeznatanu tridraselného (373 mg, 1,13 mmol, 3 ekv.), uhličitanu draselného (157 mg,
1,13 mmol, 3 ekv.) a 1,4- diazabicyklo[2.2.2.]oktánu (DABCO) (10,7 mg, 0,095 mmol, 0,25 ekv.) v zmesi terc-butanolu a vody (5 ml/5 ml) sa pridá získaná zlúčenina (486 mg, 0,38 mmol) a oxid osmičelý v 2,5 % terc-butanolovom roztoku (48 μΐ, 4,75 μηιοί, 0,0125 ekv.). Reakčná zmes sa intenzívne mieša 16 hodín pri teplote okolia (27 °C). Pridá sa pentaoxodisiričitan sodný (60 mg) a v miešaní sa pokračuje približne 1 hodinu, pričom zmes zhnedne, potom zozelená a nakoniec zmodrie. Reakčná zmes sa zriedi éterom a organická fáza sa oddelí. Vodná fáza sa bohato premyje éterom. Anorganické fázy sa zhromaždia, vysušia sa síranom horečnatým, odparia sa vo vákuu pri teplote 40 °C. Získaný surový diol je v podobe zeleného oleja. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučný systém dichlórmetán/acetón 5/2) sa získa čistý l-(difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyl-oxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-10-ol (6,7-dihydroxyheptanoát) (198 mg, 40 % teórie) vo forme amorfnej pevnej látky (Rf = = 0,24, systém dichlórmetán/acetón 5/2), vývojka fosfomolybdénová kyselina.
13C-RMN (62,89 MHz, CDCI3), δ ppm: 173,46; 173,33; 171,34; 170,58; 170,02; 150,13; 138,23; 129,80; 128,26; 127,87; 127,54; 125,50; 120,01; 119,80; 71,79; 71,23; 70,97; 66,63; 66,03; 65,54; 49,93; 47,90; 41,46; 39,17; 33,98; 33,79; 32,86; 32,45; 31,77; 29,49; 29,21; 29,03; 28,51; 25,50; 25,07; 24,87; 24,77; 24,66; 22,54; 13,99. HPLC (210 nm): TR = 32,535 min.
ES/MS. m/z 1343,0 (M+Na+); 1321,0 (M+H+); 1071,0 (M+H+) (monofenylfosfát)
2.1.3. l-(Difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-10-ol (6,7-dihydroxyheptanoát)
Roztok získaného diolu (198 mg, 0,15 mmol) v systéme etanol kvality HPLC (20 ml)/etylacetát (1,4 ml) sa hydrogenuje 2,5-hodiny v prítomnosti 10 % paládia na uhlí (70 mg) pri teplote okolia v prostredí vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a suší sa lopatkovým čerpadlom za získania surového debenzylovaného produktu (168 mg, 91 % teórie) vo forme amorfnej pevnej látky.
13C-RMN (62,89 MHz, CDC13), δ ppm: 173,15; 173,51; 172,82; 171,04; 170,49; 170,35; 150,05; 129,79; 129,42; 125,53; 119,91; 119,83; 119,72; 71,80; 70,93; 68,58; 66,47; 65,94; 65,52; 50,02; 48,12; 42,59; 41,26; 39,13; 36,92; 34,29; 33,85; 32,32; 31,74; 29,50; 29,18; 29,00; 28,15; 25,47; 25,07; 24,85; 24,73; 24,56; 22,51; 13,99. HPLC (210 nm): TR = 30,7 min.
ES/MS: m/z 1253,0 [M+Na]+; 1231,0 [M+H]+.
2.1.4. 3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylamino]dekán-1,10-diol-l-dihydrogenfosfát 10-(6,7-dihydroxyheptanoát) (= OM-197-FV6)
Do roztoku oxidu platičitého (91 mg) v etanole (kvality HPLC) (1 ml) (predbežne aktivovaného v platinovej černi 10 minút v prostredí vodíka) sa pridá roztok získaného triolu (168 mg, 0,14 mmol) v systéme etanol kvality HPLC (8 ml)/etylacetát (8 ml). Roztok sa hydrogenuje 24 hodín pri teplote okolia (27 °C) v prostredí vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a suší sa lopatkovým čerpadlom za získania surového fosfátu (130 mg, 88 % teórie). HPLC (210 nm). TR = 23,6 minút. ES/MS: m/z 1078,9. [M+H]+,
1100,8 [M+Na]+, 1116,8 [M+K]+ (obr. 6).
Príklad 2.2.
3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-1,10-diol-l-dihydrogenfosfát 10-(6-oxohexanoát) (= OM-197-FV7) (obr. 5)
2.2.1. 3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylamino]dekán-1,10-diol-l-dihydrogenfosfát 10-(6-oxohexanoát) (= OM-197-FV7)
Uskutoční sa oxidácia jodistanom pridaním 1,86 ml jodistanu sodného 0,1 M (39,62 mg, 20 ekv.), 10 mg (9,28 pmol, 1 ekv.) chrániacej skupiny zbaveného triolu pripraveného v systéme izopropanol/voda (1 : 1). Reakcia sa sleduje LC/UV a doloží sa kvantitatívnou premenou diolovej skupiny na aldehydovú po dvoch hodinách. Molekulový ión m/z 1046,8, pozorovaný v spektre ES/MS po jodistanovej oxidácii (obr. 7), potvrdzuje očakávanú reakciu. V tomto spektre sú zjavné adukty sodíka pri m/z 1068,8 [M+Na]+ a draslíka pri m/z
1084,8 [M+K]+, rovnako ako fragment zodpovedajúci strate fosforylovej skupiny pri m/z 948,8. Reakcia sa ukončí pridaním jednej až dvoch kvapiek etylénglykolu. Produkt sa môže čistiť SPE na nosiči C18 (5 mg diolu, 90 % teórie).
Príklad 2.3 a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-O-(6,7-dihydroxyheptanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (= OM-197-MC-FV5) (obr. 8)
2.3.1. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid-0-benzylester 5-O-(6-heptanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej
Roztok a-N-{(R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-benzylesteru kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (odsek 1.2.2) (122 mg, 0,116 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (5 ml) sa pridá do kyseliny 6-hepténovej (22 μΐ, 0,160 mmol, 1,4 ekv.). Roztok sa ochladí na teplotu 0 °C, pridá sa EDC1 (49,3 mg, 0,25 mmol, 2,1 ekv.) a DMAP (5,6 mg, 0,046 mmol, 0,4 ekv.). Reakčná zmes sa mieša 30 minút pri teplote 0 °C, potom šesť hodín pri teplote okolia. Po zriedení dichlórmetánom sa organická fáza premyje postupne vodou, 1 N kyselinou chlorovodíkovou (2x), roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2x) a vodou (2x). Žiadaný ester kyseliny hepténovej sa získa čistý (119 mg, 89 % teórie) vo forme bielej pevnej látky (Rf = 0,62, systém dichlórmetán/acetón 5/1, vývojka kyselina fosfomolybdénová).
13C-RMN (62,89 MHz, CDC13), δ ppm: 173,63; 173,38; 171,72; 171,11; 170,08; 138,14; 135,28; 128,46; 128,34; 128,24; 128,05; 127,64; 127,53; 114,62; 76,49; 71,14; 71,02; 66,66; 65,49; 49,17; 47,79; 41,69; 41,35; 39,09; 35,46; 34,33; 33,80; 33,65; 33,21; 31,79; 29,52; 29,23; 29,06; 28,46; 28,16; 22,56; 14,00. HPLC (210 nm). TR = 36,9 min. ES/MS: m/z 1159,0 [M+H]+; 1176,0 [M+NH4]+ T.t. = 81,5 - 84 °C. [a]D 20 = = +7,3 (CHClj).
2.3.2. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid-/3-benzylester 5-0-(6,7-dihydroxyheptanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetra-dekanoylamino]-D-asparágovej
Do získaného roztoku esteru kyseliny hepténovej (60 mg, 0,052 mmol) v systéme voda/acetón (5/3 ml) sa pridá oxid N-metylmorfolínu (9 mg, 0,076 mmol, 1,5 ekv.), potom sa prikvapká 2,5 % roztok oxidu osmičelého v terc-butanole (123 μΐ, 0,012 mmol, 0,23 ekv.). Reakčná zmes sa mieša 24 hodín pri teplote okolia. Do roztoku sa pridá pentaoxodisiričitan sodný (20 mg) a roztok sa mieša jednu až dve hodiny pri teplote okolia. Roztok sa extrahuje niekoľkokrát éterom, organické fázy sa zhromaždia, vysušia sa síranom horečnatým, potom sa skoncentrujú. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 5/2 ) sa získa čistý žiadaný diol (35 mg, 57 % teórie) vo forme bielej pevnej látky (Rf = 0,15, systém dichlórmetán/acetón 5/1, vývojka kyselina fosfomolybdénová).
,3C-RMN (62,89 MHz, CDC13), δ ppm: 173,67; 173,39; 171,81; 171,34; 170,27; 170,01; 138,18; 135,27; 128,56; 128,42; 128,18; 127,50; 127,68; 76,68; 71,82; 71,37; 71,17; 66,85; 66,74; 65,66; 49,27; 47,99; 41,88; 41,51; 39,31; 35,60; 34,42; 33,95; 33,51; 31,80; 29,60; 29,49; 29,30; 28,55; 25,65; 25,60; 25,19; 25,12; 24,97; 24,77; 24,14; 22,65; 14,08; HPLC (210 nm): TR = 34,16 min. ES/MS: m/z 1193,0 [M+H]+; 1212,0 [M+NH4]+.
2.3.3. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-O-(6,7-dihydroxyheptanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (= OM-197-MC-FV5)
Roztok získaného diolu (35 mg, 0,029 mmol) v systéme metanol kvality HPLC (2 ml)/etylacetát (2 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (10 mg) pri teplote a tlaku okolia 2,5-hodiny za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa potom suší lopatkovým čerpadlom za získania surového a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}-amid 5-O-(6,7-dihydroxyheptanoát)u kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl-amino]-D-asparágovej (26 mg, 88 % teórie) vo forme bielej pevnej látky. HPLC (210 nm). TR = 2690 min. t.t. = 94-97 °C; [oí]d20 ~ = +11,1 (systém trichlórmetán/metanol = 1 : 0,1). ES/MS m/z 1012,7 [M+H]+, 1034,7, [M+Na]+, 1050,7 [M+K]+ (obr. 9).
Príklad 2.4 a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-0-(6-oxohexanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (= OM-197-MC-FV6) (obr. 8)
2.4.1. α-N- {(4R)-5 -Hydroxy-4-[(R)-3 -hydroxytetradekanoylaminojpentyl} amid 5 -O-(6-oxohexanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (= OM-197-MC-FV6)
Pridá sa 1,98 ml jodistanu sodného 0,1 M (42,25 mg, 20 ekv.) do 10 mg (9,88 pmol, 1 ekv.) pripraveného, chrániacej skupiny zbaveného triolu (odsek 2.3.3) v systéme izopropanol/voda (1 : 1). Roztok sa mieša dve hodiny pri teplote okolia. Reakcia sa ukončí pridaním jednej až dvoch kvapiek etylénglykolu. Jodistanová oxidácia je zjavná v spektre ES/MS (obr. 10) iónmolekuly [M+H]+ pri m/z 980,6, potvrdzuje prítomnosť aldehydovej skupiny. Taktiež sú zjavné aj piky zodpovedajúce aduktom sodíka pri m/z 1002,8 [M+Na]+ a draslíka [M+K]+ pri m/z 1018,6. Čistením SPE na nosiči C18 sa získa produkt OM-197-MC-FV6 (90 % teórie).
Príklad 2.5.
a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-O-(6-hydroxyhexanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (= OM-197-MC-FV7) (obr. 8)
2.5.1. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-0-(6-hydroxyhexanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (= OM-197-MC-FV7)
Do roztoku pripraveného 6-oxohexánového derivátu 4,5 mg, 0,0043 mmol v 90 % izopropanole (20 ml) sa pridá roztok (0,2 ml) nátriumbórhydridu sodného v metanole (1 mg/ml). Zmes sa mieša 3 minúty pri teplote 25 °C, pridá sa prebytok kyseliny octovej (0,2 ml). Čistením preparatívnou HPLC na stĺpci C18 sa získa produkt OM-197-MC-FV7 (2,3 mg, 51 % teórie) v roztoku 90 % izopropanolu.
Príklad 2.6.
(3RS,9R)-3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylamino]dekán-l, 10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-aminohexanoát) (= OM-197-MP-AC-RS,R) (obr. 11).
2.6.1. l-(Difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylaminojdekán-10-ol (6-benzyloxykarbonylamino-hexanoát)
Do roztoku l-(difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]dekán-10-olu (obr. 1) (230 mg, 0,20 mmoí) v bezvodom dichlórmetáne (8 ml) sa pridá kyselina 6-benzyl-oxykarbonylaminohexánová (88 mg, 0,33 mmol, 0,65 ekv.). Roztok sa ochladí na teplotu 0 °C. Pridajú sa EDC1 (200 mg, 1,04 mmol, 5,2 ekv.) a DMAP (13 mg, 0,10 mmol, 0,5 ekv). Reakčná zmes sa mieša 30 minút pri teplote 0 °C, potom štyri hodiny pri teplote okolia. Po zriedení dichlórmetánom sa organická fáza oddelí a premyje sa postupne vodou, kyselinou chlorovodíkovou IN a vodou. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, odparí sa vo vákuu pri teplote 40 °C. Čistením okamžitou HPLC na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 7/1,2) sa získa čistý ester (115 mg, 41 % teórie) v podobe amorfnej pevnej látky Rf = 0,77, systém dichlórmetán/acetón 5/2, vývojka fosfomolybdénová.
13C-RMN (62,89 MHz, CDClj), δ ppm: 173,27; 171,20; 170,34; 169,88; 156,36; 150,16; 150,13; 138,28; 136,56; 129,80; 128,35; 128,26; 127,90; 127,51; 125,45; 119,97; 119,83; 71,05; 66,37; 65,97; 65,61; 49,94; 47,81; 41,39; 40,66; 39,09; 34,32; 34,25; 33,95; 33,65; 31,78; 29,50; 29,38; 29,22; 29,03; 28,55; 28,44; 25,95; 25,06; 24,87; 24,26; 22,55; 14,00. HPLC (210 nm): TR = 33,497 min. ES/MS: m/z 1424,0 [M+H]+; 1174,0 [(M+H-(PhO)2OPOH]+.
2.6.2. l-(Difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino] dekán-10-ol 10-(6-aminohexanoát)
Hydrogenuje sa roztok získaného produktu (114 mg, 81 pmol) v systéme etanol kvality HPLC (15 ml/ľadová kyselina octová) (0,4 ml) za prítomnosti paládia (10 %) na uhlí (80 mg) štyri hodiny pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania debenzylového produktu (90 mg, 97 % teórie) vo forme amorfnej pevnej látky, HPLC (210 nm): TR = 29,185 min. ES/MS: m/z 1200,0 [M+H]+, 952,0 [M+H-(PhO2)OPOH]+.
2.6.3. 3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylaminoJ-
-1,10-diol- 1-dihydrogenfosfát 10-(6-aminohexanoát) (= OM-197-MP-AC)
Do roztoku oxidu platičitého (30 mg) v etanole (kvalita HPLC) (1 ml) (predbežne aktivovaného v platinovej černi 10 minút v prostredí vodíka) sa pridá roztok pripraveného aminoalkoholu (90 mg, 75 pmol) v systéme etanol kvality HPLC (5 ml)/kyselina chlorovodíková IN (0,1 ml). Roztok sa hydrogenuje 24 hodín pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania žiadaného fosfátu (60 mg, 79 % teórie), HPLC (210 nm) TR = = 28,51 min. ES/MS m/z 1047,5 [M+H]+, 1069,6 [M+Na]+, 949,6 [M+H+(HO)2OPOH]+ (obr. 12).
Príklad 2.7. (3R,9R)-3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylamino]dekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-aminohexanoát) (= OM-197-MP-AC-R,R) (obr. 13).
2.7.1. o-N- {(4R)-5-(2-Tetrahydropyranyl)oxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-pentyl} amid /3-benzylester kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (ASM-l-O-THP)
Do roztoku a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}-amid /3-benzylesteru kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (1,5 g, 1,43 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (30 ml) sa pri teplote okolia a v prostredí argónu pridá postupne 3,4 dihydro-2-H-pyrán (DHP) (327 μΐ,
3,58 mmol) a pyridínium-p-toluénsulfonát (PPTS) (108 mg, 429 μηιοί). Mieša sa počas 18 hodín pri teplote okolia, znovu sa pridá 3,4-dihydro-2-H-pyrán (DHP) (130 μΐ, 1,43 mmol). Roztok sa mieša ďalších deväť hodín pri teplote okolia, potom sa zriedi dichlórmetánom, premyje sa 5 % roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Organická fáza sa suší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou HPLC na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 7/1 potom 6/1) sa získa a-N-{(4R)-5-(2-tetrahydropyranyl)oxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoyl-amino]pentyl}amid /3-benzylester kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (1,45 g, 90 % teórie) vo forme bielej kryštalickej látky. Rf = 0,57, systém dichlórmetán/acetón 5/1, vývojka U.V. a fosfomolybdénová).
2.7.2. a-N-{(4R)-5-(2-Tetrahydropyranyl)oxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylarmno]-pentyl}amid kyseliny N- [(R)-3 -dodekanoyloxytetradekanoyl] -D-asparágovej
Dve hodiny sa hydrogenuje roztok pripravenej zlúčeniny (250 mg, 0,22 mmol) v systéme etanol/etylacetát 1/1 (16 ml) obsahujúcom trietylamín (0,4 ml) za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (10 mg) pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania žiadanej kyseliny vo forme trietylamóniovej soli (260 mg).
2.7.3. 3 -[(R)-3 -Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5 -aza-9-[(R)-3 -benzyloxy-tetradekanoylamino]-10-(2-tetrahydropyranyl)oxydekán-1 -ol
Do roztoku pripravenej kyseliny (približne 250 mg) v zmesi dichlórmetán/ bezvodý tetrahydrofurán 2/1 (3 ml) pri teplote 0 °C sa v prostredí argónu pridá N-metylmorfolín (72 μΐ, 0,66 mmol, 3 ekv.) a izobutylchlórmravčan (86 μΐ, 0,66 mmol, 3 ekv.). Rýchlo sa vyzráža chlórhydrát N-metylmorfolínu. Nasleduje CCM (Rf = 0,90, systém dichlórmetán/acetón 2/1). Mieša sa počas 30 minút pri teplote okolia, reakčná zmes sa ochladí na teplotu 0 °C a rýchlo sa pridá roztok natriumbórhydridu sodného (33 mg, 0,88 mmol, 4 ekv.) vo vode (1 ml). Po odohnaní plynov (5 minút) sa roztok zriedi vodou (1 ml) a tetrahydrofuránom (1 ml), mieša sa počas 5 minút pri teplote okolia. Roztok sa čiastočne skoncentruje, načo sa zriedi dichlórmetánom a vodou. Fázy sa oddelia. Organická fáza sa suší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou HPLC na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 2/1 sa získa alkohol (138 mg, 61 % teórie) v dvoch etapách v podobe bielej kryštalickej látky. (Rf = 0,33, systém dichlórmetán/acetón 3/1, vývojka U.V. a fosfomolybdénová).
2.7.4. 3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxy-tetradekanoylamino]-10-(2-tetrahydropyranyl)oxydekán-1 -ol dibenzylfosfát
Do roztoku pripraveného alkoholu (120 mg, 0,12 mmol) a lH-tetrazolu (25 mg, 0,35 mmol, 3 ekv.) v bezvodom tetrahydrofuráne (5 ml) sa pri teplote okolia pridá v prostredí argónu 85 % dibenzyldietylfosforamidit (95 μΐ, 0,27 mmol, 2,3 ekv.). V reakčnom prostredí sa rýchlo tvoria biele kryštáliky. Po 30 minútach miešania sa reakčná zmes ochladí na teplotu -20 °C, potom sa pridá roztok mCPBA (57 až 86 %), 75 mg, 0,43 mmol, 3,7 ekv. v dichlórmetáne (3 ml). Kryštáliky zmiznú. Po 45 minútach miešania pri teplote okolia sa pridá nasýtený roztok tiosíranu sodného (3 ml), reakčná zmes sa mieša 10 minút. Roztok sa zriedi éterom, organická fáza sa oddelí, premyje sa (5x) nasýteným roztokom tiosíranu sodného a (2x) nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného. Organická fáza sa suší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou HPLC na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 4/1) sa získa dibenzylfosfát (126 mg, 84 % teórie) vo forme amorfnej pevnej látky (Rf = 0,53, systém dichlórmetán/acetón 3/1, vývojka U.V. a fosfomolybdénová).
2.7.5. 3[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxy-tetradekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-(dibenzylfosfát)
Do 1 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej v metanole (25 ml) sa pri teplote 0 °C pridá pripravený roztok (700 mg, 0,54 mmol) v dichlórmetáne (25 ml). Po 45 minútach miešania pri teplote 0 °C sa reakčná zmes neutralizuje 5 % roztokom hydrogenuhličitanu sodného zriedeného dichlórmetánom a organická fáza sa oddelí. Výsledná vodná fáza sa extrahuje dichlórmetánom (3x) a organické fázy sa spoja. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí, čím sa získa surový alkohol (640 ml, 98 % teórie). (Rf = = 0,50, systém dichlórmetán/acetón 3/1, vývojka U.V. a fosfomolybdénová).
2.7.6. 3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxy-tetradekanoylamino]dekán-1,10-diol 1 -(dibenzylfosfát) 10-(6-benzyloxykarbonyl-aminohexanoát)
Do roztoku pripravenej zlúčeniny (640 mg, 0,53 mmol) a kyseliny (benzyloxykarbonylamino)hexánovej (423 mg, 1,60 mmol) v suchom dichlórmetáne (25 ml) pri teplote 0 °C sa v prostredí argónu postupne pridá chlórhydrát l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (obchodný) (306 mg, 1,60 mmol) a 4-dimetylaminopyridín (20 mg, 160 pmol). Reakčná zmes sa mieša 30 minút pri teplote 0 °C a cez noc pri teplote okolia. Reakčné prostredie sa potom premyje vodou, potom 1 N roztokom kyseliny chlorovodíkovej a fázy sa oddelia. Organická fáza sa suší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou HPLC na si likagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 4/1, potom 2/1) sa získa kopulačný produkt (537 mg 71 % teórie).
13C-RMN (62,89 MHz, CDC13), δ ppm: 173,18; 171,16; 170,38; 169,60; 156,30; 138,23; 136,50; 135,38; 135,28; 128,42; 128,26; 128,17; 127,79; 127,74; 127,44; 76,48; 71,15; 70,84; 69,47; 69,39; 69,31; 66,25; 65,62; 64,43; 64,37; 49,78; 47,76; 41,41; 41,34; 40,57; 38,97; 34,22; 34,16; 33,96; 33,57; 32,95; 31,70; 29,43; 29,15; 28,95; 28,32; 25,87; 25,46; 25,02; 24,80; 24,18; 22,49; 13,94.
2.7.7. 3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylamino]dekán-l,10-diol l-(dihydrogenfosfát) 10-(6-aminohexanoát) (= OM-197-MP-AC-R,R) (obr. 13)
Roztok pripravenej zlúčeniny (500 mg, 0,35 mmol) v zmesi dichlórmetán/etanol 5/2 (70 mg) obsahujúci kyselinu octovú (10 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 10 % paládia na uhlí pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka 10 až 24 hodín. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom, čím sa získa 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekán-l,10-diol l-(dihydrogenfosfát) 10-(6-aminohexanoát) (368 mg, kvantitatívny výťažok).
ES/MS m/z 1047,9 [M+H]+, 1069,8 [M+Na]+ (obr. 14).
Príklad 2.8. (3S,9R)-3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylamino]dekán-l,10-diol l-(dihydrogenfosfát) 10-(6-aminohexanoát) (= OM-197-MP-AC-S,R) a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid β-benzylester kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-L-asparágovej (odsek 1.2.4.) sa spracuje tým istým sledom reakcií, ktorým sa získa produkt 2.8.
Príklad 2.9.
3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-l,10-diol l-(dihydrogenfosfát) 10-(6-aminohexanoát) (= OM-197-FV8) (obr. 15)
2.9.1. (2R)-5-(Amino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentán-l-ol benzyl-metyléter
Do roztoku (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoyl-amino]pentán-1 -olu (odsek 1.1.2) (2,05 g, 3,60 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (40 ml) sa pri teplote okolia v prostredí argónu pridá postupne benzylchlórmetyléter (BOMC1) (technickej kvality 60 %), (1,25 ml, 5,41 mmol, 1,5 ekv.) a diizopropyletylamín (924 μΐ, 5,41 mmol, 1,5 ekv.). Reakčná zmes sa mieša cez noc pri teplote okolia a odparí sa do sucha. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo petroléter/etylacetát 2/1) sa získa derivát O-benzyloxymetyl (2,28 g, 92 % teórie) vo forme bielej kryštalickej látky. (Rf = 0,70, systém petroléter/etylacetát 1/3, vývojka U.V. a kyselina fosfomolybdénová), teplota topenia 97 až 100 °C. Roztok tohto produktu (2,00 g, 2,90 mmol) v etanole kvality HPLC (220 ml) obsahujúcom trietylamín (4 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 20 % hydroxidu paladnatého na uhlíku (200 mg) tri hodiny pri teplote a tlaku okolia a za prítomnosti vodíka. Filtrát sa odparí do sucha, zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania voľného amínu (1,58 g, 98 % teórie) vo forme amorfnej pevnej látky.
[a]D-l° (C = 1,20; CHC13); 'H-RMN (250 MHz, CDC13), δ ppm: 7,45-7,21 (m, 10H, Ar), 6,52 (d, 1H, NH), 4,80-4,45 (m, 6H, 2 x C772-ph, O-C/7,-O), 4,10 (m, 1H, H-3'), 3,83 (m, 1H, H-2), 3,62 (dd, 1H, H-l), 3,47 (dd, 1H, H-l), 2,65 (t, 2H, 2 x H-5), *2,40 (m, 2H, 2 x H-2'), 1,80-1,40 (m, 8H, 2 x H-4,2 x H-3,2 x H-4', NH2), 1,40-1,20 (m, 18H, 9 x CH2), 0,88 (t, 3H, CH3); 13C-RMN (62,89 MHz, CDC13), δ ppm: 170,78; 138,24; 137,63; 128,38; 128,32; 127,66; 127,62; 94,82; 76,70; 71,26; 69,63; 69,44; 48,48; 41,82; 41,47; 33,83; 31,84; 29,88; 29,58; 29,56; 29,51; 29,27; 29,04; 25,11; 22,62; 14,06.
2.9.2. α-N-{(4R)-5-(Benzyloxymetoxy)-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}-amid /3-benzylester kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-L-asparágovej
Pripravený amín sa kopuluje s β-benzylesterom kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-L-asparágovej pripravenej z /S-benzylesteru kyseliny L-asparágovej (odsek 1.2.1) za prítomnosti IIDQ za podmienok opísaných v odseku 1.2.2. Čistením na silikagéli (elučné činidlo systém petroléter/etylacetát 2/1, potom 1/1) sa získa zodpovedajúci amid vo výťažku 65 % teórie). ES/SM m/z 1169,7 [M+H]+.
2.9.3. (3S,9R)-3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino] dekán-1,10-diol 1 -dibenzylfosfát
Roztok kopulačného produktu pripraveného (1,05 g, 0,90 mmol) v systéme etanol/etylacetát 1/1 (65 ml) obsahujúceho trietylamín (1,5 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (50 mg) pri teplote a tlaku okolia jednu hodinu za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje a filtrát odparený do sucha sa suší lopatkovým čerpadlom. Zvyšok sa rozpustí v systéme izopropanol/dichlórmetán 1/1 (50 ml) a mieša sa 10 minút pri teplote okolia so živicou Amberlit IR-120 (H+) (3 ml). Živica sa odfiltruje, filtrát sa odparí do sucha za získania voľnej kyseliny (956 mg, 99 % teórie) vo forme bielej kryštalickej pevnej látky.
Do roztoku získanej kyseliny (855 mg, 0,79 mmol) v bezvodom tetrahydrofúráne (5 ml) pri teplote 0 °C sa v prostredí argónu pridá N-metylmorfolín (87 μΐ, 0,79 mmol, 1 ekv.), potom izobutylchlórmravčan (103 μΐ, 0,79 mmol, 1 ekv.). Rýchlo sa vyzráža chlórhydrát N-metylmorfolínu. Mieša sa počas 30 minút pri teplote okolia, reakčná zmes sa ochladí na 0 °C a rýchlo sa pridá natriumbórhydrid sodný (60 mg,
1,58 mmol, 2 ekv) vo vode (2 ml). Po odstránení plynov (5 minút) sa roztok zriedi vodou (2 ml) a tetrahydrofúránom (2 ml), mieša sa 5 minút pri teplote okolia. Roztok sa skoncentruje, zriedi sa dichlórmetánom a vodou, neutralizuje sa roztokom 1 M kyseliny chlorovodíkovej a fázy sa oddelia. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetánu/acetón 4/1) sa získa redukčný produkt (387 mg, 46 % teórie) vo forme bielej pevnej kryštalickej látky.
Do roztoku tohto alkoholu (313 mg, 0,29 mmol) a lH-tetrazolu (62 mg, 0,88 mmol, 3 ekv.) v bezvodom tetrahydrofúráne (12 ml) pri teplote okolia sa v prostredí argónu pridá 85 % dibenzyldietylfosforamidit (267 μΐ, 0,67 mmol, 2,3 ekv.). V reakčnom prostredí rýchlo vykryštalizujú biele kryštály. Mieša sa počas 30 minút., reakčná zmes sa ochladí na teplotu -20 °C a pridá sa roztok mCBA (57 až 86 %), 187 mg, 1,08 mmol, 3,7 ekv.) v dichlórmetáne (8 ml). Kryštály zmiznú. Mieša sa počas 45 minút pri teplote okolia, pridá sa nasýtený roztok (5 ml) tiosíranu sodného a reakčná zmes sa mieša 10 minút. Roztok sa zriedi éterom, organická fáza sa oddelí a premyje sa nasýteným roztokom tiosíranu sodného (5x), nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2x) a roztokom kyseliny chlorovodíkovej IM (lx). Organická fáza sa suší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí sa. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 8/1, potom 5/1) sa získa fosfotriester (361 mg, 93 % teórie) vo forme pevnej amorfnej látky. Tento produkt sa hydrolyzuje benzyloxymetylacetálom vo vodnom prostredí tetrahydrofurán/kyselina chlorovodíková, čím sa získa (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoyl-amino]dekán-l, 10-diol 1 -dibenzylfosfát.
2.9.4. (3S,9R)-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylaminojdekán-1,10-diol 1 -dihydrogenfosfát 10-(6,7-dihydroxy-heptanoát)
Získaný produkt sa O-acyluje v polohe 10 kyselinou hept-6-énovou za prítomnosti EDC1 v dichlóretáne pri teplote 0 °C za prítomnosti DMAP (odsek 2.3.1). Tento hepténový ester sa hydroxyluje reakciou za prítomnosti oxidu osmičelého (katalytického) a oxidu N-metylmorfolínu (odsek 2.3.2) za získania zodpovedajúceho diolu (ester kyseliny 6,7-dihydroxyheptánovej). Z produktu sa odstránia chrániace skupiny hydrogenolýzou v etanole za prítomnosti vodíka a za prítomnosti paládia na uhlí (2.3.3.).
2.9.5. (3S,9R)-3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylaminojdekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-oxohexanoát)
Získaný diol, zbavený chrániacej skupiny, sa oxiduje jodistanom v systéme izopropanol/voda (spôsob prípravy odsek 2.2.1.)
2.9.6. (3S,9R)-3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylaminojdekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-hydroxy-hexanoát) (= OM-197-FV8)
Do roztoku získaného derivátu 6-oxohexánového (4,5 mg, 0,0043 mmol) v 90 % izopropanole (20 ml) sa pridá roztok (0,2 ml) natriumbórhydridu sodného v metanole (1 mg/ml). Zmes sa mieša 3 minúty pri teplote 25 °C, pridá sa nadbytok kyseliny octovej (0,2 ml). Čistením preparatívnou chromatografiou na stĺpci C18 sa získa produkt OM-197-FV8 (2 mg, 44 % teórie) v roztoku 90 % izopropanolu, ES/MS m/z 1048,5 [M+H]+,
950,5 [M+H-(HO)2OPOH]+ (obr. 16).
Príklad 2.10
2-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(dihydroxyfosforyloxy)butanoát {2-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-5-(6-oxohexyl)amino}pentylu (= OM-144-FP9) (obr. 17)
2.10.1. Trifluórmetánsulfonát hept-6-enylu
Triflikanhydrid Tf2O ((CF3SO2)2O, 11 ml, 6,76 mmol) sa prikvapká pri teplote -15 °C do roztoku hept-6-én-l-ol (515 mg, 4,51 mmol) a trietylamín (627 μΐ, 4,51 mmol) v dichlórmetáne (10 ml) a zmes sa mieša 30 až 45 minút pri teplote -15 °C až do vymiznutia alkoholu. Po návrate na teplotu okolia sa reakčná zmes zriedi dichlórmetánom a premyje sa postupne vodou, vodným nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, nasýteným roztokom chloridu sodného. Takto získaná organická fáza sa suší síranom horečnatým a skoncentruje sa vo vákuu a zvyšok sa vyberie do systému etylacetát/petroléter 1/2, prefiltruje sa cez silikagél (odstránenie trietylamínovej soli vytvorenej počas reakcie). Po odparení filtrátu sa získa žiadaný triflát (956 mg, 87 % teórie) a použije sa v ďalšom stupni bez čistenia.
Rf: 0,8 Ή-RMN (CDC13, 250 MHz); óppm: 5,7; 5,0; 4,45; 2,0; 1,8; 1,4; 13C-RMN (CDC13), 62,89 MHz); δ ppm: 138,21; 114,95; 77,68; 33,40; 29,13; 28,10; 24,53.
2.10.2. (2R)-2-[(R)-3-Benzyloxytetradekanoylamino]-5-(hept-6-enyl)aminopentán-l-ol
Čerstvo pripravený roztok triflátu (956 mg, 3,88 mmol) v dichlórmetáne (10 ml) sa prikvapká do roztoku (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentán-l-olu (odsek 1.1.2) (1,69 g, 3,88 mmol) v dichlórmetáne (10 ml) a zmes sa mieša 4 hodiny pri teplote okolia v prostredí argónu. Po zriedení dichlórmetánom sa reakčná zmes premyje nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Takto získaná organická fáza sa suší síranom horečnatým a koncentruje sa vo vákuu. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/metanol 15/1) sa získa sekundárny amín (862 mg, 43 % teórie).
Rf: 0,3 (CH2Cl2/MeOH 8/1). ES/MS: m/z 532,0 [M+H]+. RMH *H (CDC13, 250 MHz); ôppm: 7,2-7,4; 7,1; 5,8; 5,0; 4,6; 3,95; 3,5; 2,9; 2,5; 2,1; 1,9-1,5; 1,5-1,2; 0,9. RMN 13C (CDC13, 62,89 MHz); δ ppm: 172,17; 138,28; 138,21; 128,39; 127,96; 127,71; 114,82; 76,80; 71,40; 63,81; 50,87; 48,30; 47,75; 41,57; 34,10; 33,39; 31,89; 29,66; 29,62; 29,33; 28,19; 28,03; 25,21; 26,11; 25,78; 22,82; 22,66; 14,10. RMN ’H (CDC13, 250 MHz); δ ppm: 7,2-7,4; 6,75; 5,8; 5,0; 4,5; 3,9; 3,5; 2,5; 2,0; 2,1; 1,7-1,2; 0,9. RMN l3C (CDC13, 62,89 MHz); δ ppm: 171,77; 138,68; 138,14; 128,23; 127,72; 127,56; 114,22; 76,64; 71,37; 64,58; 51,45; 49,79; 49,37; 41,53; 33,90; 33,53; 31,77; 29,65; 29,20; 28,64; 28,57; 25,00; 26,68; 25,93; 22,53; 13,98 (spektrá amónnej soli alebo voľnej zásady).
2.10.3. 2-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(difenyloxyfosforyloxy)butanoát {2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-5-(hept-6-enyl)amino}pentylu
Do roztoku pripraveného sekundárneho amínu (163 mg, 0,307 mmol, 1 ekv.) a kyseliny 4-(difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-butánovej (odsek 1. 1.1) (278 mg, 0,368 mmol, 1,2 ekv.) v dichlórmetáne (25 ml) sa pridá Ν,Ν-diizopropyletylamín (DIEA) (54 μΐ, 1 ekv.). Zmes sa ochladí na teplotu 0 °C a pridá sa EDC1 (71 mg, 1,2 ekv.) a l-hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) (41 mg, 1 ekv.). Reakčná zmes sa mieša 2 hodiny pri teplote 0 °C a 90 hodín pri teplote okolia. Roztok sa premyje vodou a organická fáza sa suší síranom horečnatým, odparí sa vo vákuu pri teplote 40 °C. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/metanol 15/1) sa získa O-acylačný produkt (126 mg, 32 % teórie).
2.10.4. 2-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(difenyloxyfosforyloxy)butanoát {2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-5-(6,7-dihydroxyheptyl)amino}pentylu
Čerstvo pripravený 2,5 % roztok oxidu osmičelého v pyridíne (1,1 ml, 1,9 ekv.) sa prikvapká pri teplote 25 °C do získaného O-acylačného produktu (70 mg, 0,055 mmol) v bezvodom pyridíne (5 ml). Zmes sa mieša 24 až 48 hodín pri teplote okolia, spracuje sa pentaoxodisiričitanom sodným, nakoniec sa zriedi dichlórmetánom, premyje sa postupne vodou, vodným roztokom 1 N kyseliny chlorovodíkovej a znovu vodou. Výsledná organická fáza sa suší síranom horečnatým, prefiltruje sa, odparí sa a získaný zvyšok sa podrobí okamžitej chromatografii na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/metanol 15/1 až 10/1), čím sa získa žiadaný diol (27 mg, 38 % teórie). HPLC (210 nM): TR = 37,25 min. ES/MS: m/z 1307 [M+H]+.
2.10.5. 2-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(dihydroxyfosforyloxy)butanoát {2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-5-(6,7-dihydroxyheptyl)amino}pentylu (= OM- 144-FP8)
a. Debenzylácia
Do roztoku pripraveného diolu (50 mg, 0,038 mmol) v systéme metanol kvality HPLC/kyselina octová (5/0,2 ml) sa pridá katalyzátor (10 %) paládium na uhlí (10 mg). Reakčná zmes sa mieša 4 hodiny v prostredí vodíka (pri tlaku okolia) pri teplote okolia. Katalyzátor sa odfiltruje na filtri milipore a filtrát sa odparí za získania debenzylovaného produktu bez ďalšieho čistenia (46 mg, 99 % teórie). HPLC (210 nm): TR = = 35,13 a ES/MS: m/z 1217,0 [M+H]+.
b. Defenylácia
Katalyzátor (oxid platičitý) (25 mg, 3,8 ekv.) v suspenzii etanolu kvality HPLC (0,5 ml) sa predbežne aktivuje 10 minút v prostredí vodíka. Do suspenzie katalyzátora sa pridá predbežne v argóne plynu zbavený roztok získaného debenzylového produktu (35 mg, 0,029 mmol) v etanole kvality HPLC (2 ml). Reakčná zmes sa mieša dve hodiny za prítomnosti vodíka pri teplote okolia. Katalyzátor sa odfiltruje na filtri milipore a filtrát sa odparí za získania žiadaného fosfátesteru bez ďalšieho čistenia (26 mg, 87 % teórie). HPLC (210 nm): TR = 29,3 a 30,9 min. (pozorovanie dvoch diastereoizomérov). ES/MS: m/z 1064,8 [M+H]+, 1086,8 [M+Na]+, 1108,8 [M-H+2Na]+ (obr. 18).
2.10.6. 2-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(dihydroxyfosforyloxy)butanoát {2-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-5-(6-oxohexyl)amino}pentylu (= OM-144-FP9)
Pridá sa 1,87 ml jodistanu sodného 0,1 M (40,17 mg, 20 ekv.) do 10 mg (9,39 pmol, 1 ekv.) chrániacej skupiny zbaveného pripraveného produktu v systéme izopropanol/voda (1 : 1). Roztok sa mieša 2 hodiny pri teplote okolia. Reakcia sa ukončí pridaním jednej až dvoch kvapiek etylénglykolu. TR = 30,0 a 31,5 min. (pozorovanie dvoch diastereoizomérov).
ES/MS: m/z 1032,8 [M+H]+, 1054,8 [M+Na]+.
Príklad 2.11. (2R,8R)-2-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylaminojnonán-l,9-diol 1-O-karboxymetyléter 9-O-(6-oxohexanoát) (= OM-112-FV7) (obr. 19)
D-serín je chránený vo forme N-(p-metoxybenzyloxykarbonyl)derivátu (Chen a Wang, Synthesis, str. 36 až 37, 1989), hydroxylová skupina sa alkyluje benzylbrómacetátom za prítomnosti hydridu sodného (2 ekv.). Aminoskupina sa uvoľní spracovaním trifluóroctovou kyselinou v dichlórmetáne a acyluje sa chloridom kyseliny (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovej za prítomnosti trietylamínu. Takto získaný derivát sa kopuluje s amínom 2-[(R)-5-amino-2(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentán-l-olu (odsek 4.1.1) za prítomnosti IIDQ za získania (2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-benzyloxytetradekanoyl-amino]nonán-l,9-diol 1-O-benzyloxykarbonylmetyléteru. Tento produkt sa O-acyluje kyselinou hept-6-énovou za prítomnosti EDC1. Dvojitá väzba pomocného esteru sa hydroxyluje oxidom osmičelým (katalytickým, za prítomnosti N-metylmorfolín-N-oxidu), chrániaca skupina sa z diolu odstráni hydrogenolýzou za prítomnosti paládia na uhlí v etanole. Produkt OM-112-FV7 sa získa spracovaním jodistanom sodným v systéme izopropanol-voda.
C65H103N3O12, molekulová hmotnosť: 1010,45.
Príklad 2.12. (2S,8R)-l-(Karboxymetyl)tio-2-[(R)-3-tetradekanoyloxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]nonán-9-ol 9-0-(7-aminoheptanoát (= OM-212-AH1) (obr. 20)
D-cysteín sa S-alkyluje p-metoxybenzylbrómacetátom za prítomnosti uhličitanu sodného v systéme tetrahydrofurán/voda. Takto pripravený S-benzyloxykarbonyl-metylcysteín sa N-acyluje chloridom kyseliny (R)-3-tetradekanoyloxytetradekánovej, potom sa S-alkylovaný N-acylovaný derivát D-cysteínu kopuluje s amínom (2R)-5-amino-2-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentán-l-olu (získaným hydrogenolýzou (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentán-l-olu, odsek 4.1.1.) za prítomnosti IIDQ. Takto získaný produkt sa selektívne O-acyluje v primárnej polohe esterom odvodeným z HOBt a z kyseliny 7-(p-metoxybenzyloxykarbonylaminoj-heptánovej. Obidve p-metoxybenzylové skupiny sa odstránia spracovaním esteru vodnou kyselinou trifluóroctovou. C56Hii2N4O10S, molekulová hmotnosť: 1069,64.
Príklad 2.13. (2R,8R)-2-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylamino]nonán-l,9-diol l-O-(2,2-dikarboxyetyl)éter 9-O-(6-oxohexanoát) (= OM-312-FV7) (obr. 21)
Derivát N-(p-metoxybenzyloxykarbonyl)-D-serínu sa O-alkyluje dibenzyl-metylénmalonátom za prítomnosti hydridu sodného. Aminoskupina sa uvoľní spracovaním kyselinou trifluóroctovou v dichlórmetáne a acyluje sa chloridom kyseliny (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovej za prítomnosti trietylamínu. Takto získaný derivát serínu sa kopuluje s amínom (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-pentán-l-olu (odsek 4.1.1) za prítomnosti IIDQ, čím sa získa (2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-benzyloxytetradekanoyl-amino]nonán-1,9-diol 1 -O-[2,2-bis-(benzyloxykarbonyl) etyljéter. Produkt sa O-acyluje kyselinou hept-6-énovou za prítomnosti EDC1, potom sa heptenoylester hydroxyluje oxidom osmičelým. Benzylové skupiny sa odstránia hydrogenolýzou za prítomnosti paládia na uhlí v etanole. Produkt OM-312-FV-7 sa získa spracovaním debenzylovaného produktu s jodistanom sodným v systéme izopropanol/voda.
C58H105N3Oi4, molekulová hmotnosť: 1068,49.
Príklad 2.14.
3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]-1,10-diol-1-dihydrogenfosfát 10-(6-brómacetamidohexanoát (= OM-412-BA7) (obr. 22)
3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylamino]-l,10-diol-1-dihydrogenfosfát 10-(6-aminohexanoát) (odsek 4.2.3.3.) sa brómacetyluje reakciou sukcínimidyloxyesterom kyseliny brómctovej v systéme voda-dimetylformamid za prítomnosti trietylamínu. Konečný produkt sa čistí HPLC.
C57H10sBrN4Oi3P, molekulová hmotnosť: 1168,4.
Príklad 2.15. (3RS,9R)-3-[(R)-3-Hydroxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoyl-oxytetradekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-O-(6-oxohexanoát) (= OM-512-FV7) (obr. 23)
Kyselina 2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-4-difenyloxyfosforyloxy-butánová (získaná N-acyláciou trifluóroctovou soľou benzyl-O-(difenyloxyfosforyl)-DL-homoserinátu chloridom kyseliny (R)-3-benzyloxytetradekánovej, oddelením benzylesteru hydrogenolýzou v etanole za prítomnosti trietylamínu a paládia na uhlí) sa kopuluje s (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]pentán-l-olom (získaným N-acyláciou trifluóroctovej soli (2R)-5-benzyloxykarbonylamino)-2-aminopentán-l-olu chloridom kyseliny (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovej, potom odstránením skupiny chrániacej aminoskupiny v C-5 hydrogenolýzou v etanole za prítomnosti trietylamínu a paládia na uhlí za prítomnosti IIDQ. Takto vytvorený amid sa O-acyluje na voľnej hydroxylovej skupine kyselinou 6-heptánovou za prítomnosti EDC1 za získania zodpovedajúceho esteru. Dvojitá väzba pomocného esteru sa hydroxyluje oxidom osmičelým; benzylová skupina sa odstráni hydrogenolýzou za prítomnosti paládia na uhlí a fosfát sa uvoľňuje hydrogenolýzou na platinovej černi. Diolová skupina sa oxiduje jodistanom za vytvorenia derivátu 6-oxohexanoylu OM-512-FV7. C55Hi04N3Oi3P, molekulová hmotnosť: 1046,42.
Príklad 2.16. a-N-{(4R)-5-(6-Aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-MC-AC) (obr. 24)
2.16.1. a-N-{(4R)-5-[6-(Benzoylkarbonylamino)hexanoyloxy]-4-[(R)-3-benzyloxytetra-dekanoylamino]pentyl} amid 0-benzylester kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetra-dekanoyl]-D-asparágovej
Do roztoku a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}-amid 0-benzylesteru kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (400 mg, 0,38 mmol) a kyseliny 6-(benzyloxykarbonylamino)hexánovej (220 mg, 0,83 mmol) v suchom dichlórmetáne (15 ml) sa pri teplote 0 °C v prostredí argónu pridá postupne chlórhydrát obchodnej akosti l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (162 mg, 0,85 mmol) a 4-dimetylaminopyridín (12 mg, 98 pmol). Reakčná zmes sa mieša 30 minút pri teplote 0 °C, potom cez noc pri teplote okolia. Reakčná zmes sa premyje vodou, 1 N roztokom kyseliny chlorovodíkovej a fázy sa oddelia. Organická fáza sa suší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou chromatografiou (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 9/1, potom (4/1)) sa získa kopulačný produkt (395 mg, 81 % teórie) vo forme bielej pevnej látky.
13C-RMN (62,89 MHz, CDC13), δ ppm: 173,46; 173,29; 171,83; 171,14; 170,12; 156,38; 138,19; 136,60; 133,30; 128,51; 128,42; 128,31; 127,99; 127,70; 127,58; 119,97; 76,49; 71,23; 71,06; 66,73; 66,47; 49,21; 47,83; 41,42; 40,73; 39,14; 35,46; 34,38; 33,86; 33,70; 31,84; 29,57; 29,46; 29,28; 29,10; 26,01; 25,54; 25,17; 25,08; 24,94; 24,31; 22,61; 14,05
2.16.2. a-N-{(4R)-5-(6-Aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej
Roztok pripravenej zlúčeniny (340 mg, 0,26 mmol) v zmesi dichlórmetán/ metanol 5/1 (24 ml) obsahujúci kyselinu octovú (2 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (40 mg) 12 až 24 hodín pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Odparený filtrát do sucha sa suší lopatkovým čerpadlom za získania a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)4-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]pentyl jamidu kyseliny N-ľ(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyll-D-asparágovej, (238 mg, výťažok kvantitatívny), C55H1o4N401o, ES/MS m/z 981,9 [M+H]+ (obr. 25).
Príklad 2.17. a-N-{(4R)-5-(6-Sukcinylamidohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= ΟΜ-197-AC-Succ) (obr. 24)
Do roztoku produktu z príkladu 2.16 (odsek 2.16.2) (50 mg, 0,051 mmol) v pyridíne (3 ml) sa pridá postupne anhydrid kyseliny jantárovej (11 mg, 0,11 mmol) a 4-N,N-dimetylaminopyridín (7 mg, 0,57 mmol). Mieša sa počas 6 hodín pri teplote 50 °C, v prostredí argónu sa pridá metanol (2 ml) a reakčná zmes sa znovu mieša 15 minút pri teplote okolia. Rozpúšťadlo sa odparí a produkt sa čistí okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/metanol 7/1, potom (5/1), čím sa získa produkt vo forme bielej pevne látky (42 mg, 74 % teórie). C59Hio8N4Oi3. ES/MS m/z 1082 [M+H]+.
(Rf = 0,1, systém dichlórmetán/metanol 4/1).
Príklad 2.18.
a-N-{(4R)-5-Glycinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágová, (= OM-197-MC-Gly) (obr. 24)
2.18.1. α-Ν- {(4R)-5-Benzyloxykarbonylaminoacetoxy-4-[(R)-3-benzyloxytetra-dekanoylamino]pentyl}amid /3-benzylester kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxy-tetradekanoyl]-D-asparágovej
Do roztoku a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-pentyl}amid /3-benzylesteru N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej kyseliny (300 mg, 0,29 mmol) a N-benzyloxykarbonylglycínu obchodnej akosti (101 mg, 0,49 mmol) v suchom dichlórmetáne (10 ml) sa pri teplote 0 °C a v prostredí argónu postupne pridá chlórhydrát l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu obchodnej akosti (93 mg, 0,48 mmol) a 4-dimetylaminopyridm (6 mg, 49 pmol). Reakčná zmes sa mieša 30 minút pri teplote °C, potom cez noc pri teplote okolia. Reakčná zmes sa premyje vodou, potom 1 N roztokom kyseliny chlorovodíkovej a fázy sa oddelia. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 8/1, potom (6/1) sa získa kopulačný produkt (313 mg, 88 % teórie) vo forme bielej pevnej látky.
13C-RMN (62,89 MHz, CDClj), δ ppm: 173,71; 173,49; 171,80; 171,68; 171,21; 170,21; 170,06; 169,94; 169,84; 156,41; 138,18; 136,16; 135,26; 128,46; 128,40; 128,33; 128,26; 128,04; 127,93; 127,65; 127,55; 76,49; 71,14; 71,07; 70,93; 66,90; 66,67; 66,38; 66,26; 49,21; 49,03; 47,72; 47,66; 42,58; 41,83; 41,68; 41,32; 39,02; 35,58; 35,39; 34,34; 33,84; 31,80; 29,52; 29,24; 29,06; 28,31; 28,13; 25,34; 25,12; 25,03; 24,89; 22,57; 14,01.
2.18.2.O!-N-{(4R)-5-Glycinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágová, (= OM-197-MC-Gly) (obr. 24)
Roztok pripravenej zlúčeniny (268 mg, 0,22 mmol) v zmesi dichlórmetán/ etanol 5:1(12 ml) obsahujúci octovú kyselinu (2 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (30 mg) 12 až 24 hodín pri teplote a tlaku okolia a za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania a-N-{(4R)-5-glycinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]-pentyl}amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej, (200 mg, kvantitatívny výťažok). C5iH96N4O10. ES/MS m/z 925,7 [M+H]+, 947,8 ([M+Na]+) (obr. 26).
Príklad 2.19. a-N-{(4R)-5-Sukcinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej, (= OM-197-MC-Succ) (obr. 27)
2.19.1. α-N-{(4R)-5-Sukcinyloxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-benzylester kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej
Do roztoku kyseliny jantárovej (25 mg, 0,25 mmol) v suchom dichlórmetáne (2 ml) za prítomnosti trietylamínu (40 μΐ, 0,29 mmol) sa pri teplote 0 °C pridá roztok a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-benzylesteru kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (odsek 1.2.2) (150 mg, 0,14 mmol) v suchom dichlórmetáne (5 ml). Reakčná zmes sa mieša 10 minút pri teplote 0 °C, potom cez noc pri teplote okolia. Reakčná zmes sa zriedi dichlórmetánom, premyje sa IN roztokom kyseliny chlorovodíkovej, fázy sa oddelia. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 9/1 obsahujúci 2 % kyseliny octovej) sa získa kyselina (148 mg, 90 % teórie) vo forme bielej pevnej látky. 13C-RMN (62,89 MHz, CDClj), δ ppm 175,03; 173,55; 173,35; 171,92; 171,72; 171,36; 170,97; 170,60; 170,46; 170,41; 138,05; 135,24; 128,85; 128,76; 128,41; 128,27; 128,20; 128,03; 127,59; 76,48; 71,31; 70,77; 66,67; 65,08; 49,20; 48,11; 41,48; 41,31; 39,02; 35,80; 34,26; 34,13; 33,84; 31,77; 29,50; 29,21; 29,03; 25,05; 24,99; 24,83; 22,54; 13,98.
2.19.2. a-N-{(4R)-5-Sukcinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-MC-Succ) (obr. 27)
Roztok pripravenej zlúčeniny (124 mg, 0,11 mmol) sa rozpustí za horúca v etanole (kvality HPLC) (12 ml) obsahujúcom kyselinu octovú (1 ml) a hydrogenuje sa za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (15 mg) 10 hodín pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania dikyseliny (102 mg, 97 % teórie). C53H97N3O12. ES/MS m/z 968,6 [M+H]+ 990,7 [M+Na]+ (obr. 28).
Príklad 2.20 a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-N-(3-amino-propyl)amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágo vej (= OM-197-AP) (obr. 29)
2.20.1. α-Ν-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl] -D -asparágo vej
Roztok a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}-amid 0-benzylesteru kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej (odsek 1.2.2) (2,53 g 2,4 mmol) v systéme etanol/etylacetát 1/1 (150 ml) obsahujúci trietylamín (4 ml) a hydrogenuje sa za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (120 mg) dve hodiny pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom. Zvyšok sa rozpustí v systéme izopropanol/dichlórmetán 1/1 (100 ml) a zmes sa mieša 10 minút pri tepote okolia so živicou Amberlit IR-120 (H+) (5 ml). Živica sa odfiltruje a filtrát sa odparí do sucha, čím sa získa voľná kyselina (2,25 g, 97 % teórie) vo forme bielej kryštalickej látky. (Rf = 0,45, systém dichlórmetán/metanol 9/1 obsahujúci 1 % kyseliny octovej. Vývojka U.V. a fosfomolybdénová). Teplota topenia 115 až 117 °C.
2.20.2. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-N-(3-benzyloxytetradekanoylaminojpropylamid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxy-tetradekanoyl]-D-asparágovej
Roztok 2-izobutyl-l-izobutoxykarbonyl-l,2-dihydrochinoleínu (IIDQ) (98 mg, 0,32 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (3 ml) sa pridá do roztoku pripravenej zlúčeniny (250 mg, 0,26 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (15 ml) pri teplote 0 °C v prostredí argónu. Reakčná zmes sa mieša 15 minút pri teplote 0 °C, potom sa pridá chlórhydrátový roztok 3-benzyloxykarbonylaminopropylamínu obchodnej akosti (70 mg, 0,29 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (7 ml) obsahujúcom trietylamín (40 μΐ, 0,29 mmol). Mieša sa počas 18 hodín, zmes sa odparí do sucha. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/metanol 20/1) sa získa kopulačný produkt (217 mg, 78 % teórie) vo forme bielej pevnej látky.
2.20.3. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid /?-N-(3-amino)propylamid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-AP)
Roztok pripravenej zlúčeniny (50 mg, 44 μ mol) v zmesi dichlórmetán/izopropanol 1/1 (8 ml) obsahujúci kyselinu octovú (1 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (10 mg) 6 až 8 hodín pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]pentyl}amid /3-N-(3-amino)propylamidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (32 mg, 80 % teórie). C52HKHN5O8.
ES/MS: m/z 924,8 [M+H]+, 1848,8 [2M+H]+. (Obr. 30).
Príklad 2.21.
a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-N-[(lS-l-karboxy-(5-ammopentyljamid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= ΟΜ-197-Lys) (obr. 31)
2.21.1. o-N- {(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl} amid /3-N-[( 1 S-1 -benzyloxykarboxy-5-benzyloxykarbonylaminopentyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej
Roztok 2-izobutoxy-l-izobutoxykarbonyl-l,2-dihydrochinoleínu (IIDQ) (114 mg, 0,38 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (5 ml) sa pridá do roztoku a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylaminojpentyl}amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (odsek 2.20.1) (300 mg, 0,31 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (20 ml) pri teplote okolia a v prostredí argónu. Reakčná zmes sa mieša 15 minút pri teplote okolia, pridá sa obchodne dostupný roztok chlórhydrátu e-N-benzyloxykarbonyl-L-lyzínbenzylesteru (140 mg, 0,34 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (5 ml) obsahujúcom trietylamín (48 μΐ, 0,34 mmol). Mieša sa počas 18 hodín a roztok sa odparí do sucha. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/metanol 30/1, potom 20/1) sa získa kopulačný produkt (317 mg, 77 % teórie) vo forme bielej pevnej látky.
13C-RMN (62,89 MHz, CDCI3), δ ppm: 173,68; 172,35; 171,92; 170,74; 170,62; 170,54; 156,75; 156,52; 138,31; 136,54; 135,12; 128,54; 128,40; 128,28; 128,21; 127,96; 127,577; 127,59; 76,67; 71,40; 71,18; 67,20; 67,09; 66,48; 64,67; 52,30; 51,19; 41,64; 40,34; 39,24; 37,58; 34,40; 34,10; 31,83; 29,58; 29,27; 29,09; 25,16; 25,11; 24,93; 22,60; 14,04.
2.21.2. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylammo]pentyI}amid /3-N-[(lS)-l-karboxy-5-aminopentyljamid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= ΟΜ-197-Lys)
Roztok pripravenej zlúčeniny (93 mg, 71 pmol) v zmesi dichlórmetán/etanol 1/1 (20 ml) obsahujúci kyselinu octovú (0,5 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (17 mg) 12 až 24 hodín pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]pentyl}amid /3-N-( 1 S)-1 -karboxy-5-aminopentyl]amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej, (71 mg, výťažok je kvantitatívny). C55H105N5Oio. ES/MS: m/z 996,9 [M+H]+, 1018,9 [M+Na]+. (Obr. 32).
Príklad 2.22 α-N- {(4R)-5-(6-Aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl} amid /3-N-[( 1 S)-1 -karboxy-5-aminopentyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetra-dekanoyl]-D-asparágovej (= ΟΜ-197-Lys-AC) (obr. 31)
2.22.1. α-N- {(4R)-5-(6-Benzyloxykarbonylaminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-benzyloxytetra-dekanoylamino]pentyljamid /3-N-[(lS)-l-benzyloxykarbonyl-5-benzyloxykarbonyl-aminopentyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej
Do roztoku a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}-amid /?-N-[(lS)-l-benzyloxykarboxy-5-benzyloxykarbonylaminopentyl]amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej, (odsek 2.21.1.) (317 mg, 0,24 mmol) a kyseliny 6-(benzyloxykarbonylamino)hexánovej (128 mg, 0,48 mmol) v suchom dichlórmetáne (15 ml) pri teplote 0 °C a v prostredí argónu sa postupne pridá obchodne dostupný chlórhydrát l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (93 mg, 0,48 mmol) a 4-dimetylaminopyridín (12 mg, 98 pmol). Reakčná zmes sa mieša 30 minút pri teplote 0 °C, potom cez noc pri teplote okolia. Reakčné prostredie sa premyje vodou, 1 N roztokom kyseliny chlorovodíkovej a fázy sa oddelia. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 5/1) sa získa kopulačný produkt (266 mg, 71 % teórie) vo forme bielej pevnej látky.
2.22.2. a-N-{(4R)-5-(6-Aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid, N-[(1S)-1-karboxy-5-aminopentyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= OM-197-Lys-AC)
Hydrogenuje sa 12 až 24 hodín roztok pripravenej zlúčeniny (260 mg, 207 pmol) v systéme dichlórmetán/izopropanol 1/1 (20 ml) obsahujúcom 1 ml kyseliny octovej za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (100 mg) pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania kyseliny (108 mg, 88 % teórie). C53H98N5O12. ES/MS: m/z 983,7 [M+H]+, 1005,8 [M+Na]+. (obr. 35).
Príklad 2.23.
a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-N-[(lS)-l,2-dikarboxyetyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= ΟΜ-197-Asp) (obr. 34)
2.23.1. α-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-N-[( 1 S)-1,2-bis(benzyloxykarbonyl)etyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetra-dekanoyl]-D-asparágovej
Roztok 2-izobutoxy-l-izobutoxykarbonyl-l,2-dihydrochinoleínu (IIDQ) (96 mg, 0,32 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (5 ml) sa pridá do roztoku a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylaminojpentyl}amidu kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (odsek 2.20.1) (252 mg, 0,26 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (20 ml) pri teplote okolia a v prostredí argónu. Reakčná zmes sa mieša 15 minút pri teplote okolia, pridajú sa para-toluénsulfonátové soli dibenzylesteru kyseliny L-asparágovej (obchodne dostupný produkt) (141 mg, 0,29 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (5 ml) obsahujúcom trietylamín (40 pl, 0,29 mmol). Mieša sa počas 18 hodín a roztok sa odparí do sucha. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/metanol 20/1) sa získa kopulačný produkt (260 mg, 78 % teórie).
13C-RMN (62,89 MHz, CDClj), δ ppm: 173,68; 171,92; 171,17; 170,60; 170,46; 170,37; 170,18; 170,06; 138,31; 138,19; 135,20; 135,12; 134,87; 128,48; 128,26; 128,18; 127,75; 127,63; 127,56; 76,66; 71,40; 71,19; 70,98; 68,79; 67,59; 66,85; 65,14; 64,73; 51,25; 50,17; 48,78; 48,67; 41,70; 39,37; 39,21; 37,50; 35,94; 34,48; 34,38; 34,10; 31,81; 29,54; 29,25; 29,08; 27,93; 25,56; 25,14; 25,09; 24,91; 22,58; 14,02.
2.23.2. α-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3 N-[( 1 S)-l,2-dikarboxyetyljamid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= ΟΜ-197-Asp)
Roztok pripravenej zlúčeniny (260 mg, 207 pmol) sa hydrogenuje štyri hodiny v systéme dichlórmetán/izopropanol 1/1 (20 ml) za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (50 mg) pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania dikyseliny (108 mg, 88 % teórie).
C53H98N4O12. ES/MS: m/z 983,7 [M+H]+, 1005,8 [M+Na]+. (Obr. 35).
Príklad 2.24.
α-Ν-{(4R)-5-(6-Aminohexanoyloxy}-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}arnidu, /3-N-[( 1 S)-1,2-dikarboxyetyljamid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej (= ΟΜ-197-Asp-AC) (obr. 34)
2.24.1. α-N- {(4R)-5-(6-Benzyloxykarbonylaminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-benzyloxytetra-dekanoylamino]pentyl}amid /3-N-[(lS)-l,2-bis(benzyloxykarbonyl)etyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej
Do roztoku a-N-{(4R)-5-hydroxy)-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-pentyl}amid /3-N-[(lS)-l,2-bis(benzyloxykarbonyl)etyl]amidu N-[(R)-3-dodekanoyloxy-tetradekanoyl]-D-asparágovej kyseliny (odsek
2.23.1. ) (158 mg, 0,13 mmol) a kyseliny 6-(benzyloxykarbonylamino)hexánovej (84 mg, 0,32 mmol) v suchom dichlórmetáne (6 ml) pri teplote 0 °C a v prostredí argónu sa postupne pridá obchodne dostupný chlórhydrát l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (61 mg, 0,32 mmol) a 4-dimetylaminopyridín (4 mg, 33 pmol). Reakčná zmes sa mieša 30 minút pri teplote 0 °C, potom cez noc pri teplote okolia. Reakčná zmes sa premyje vodou, 1 N roztokom kyseliny chlorovodíkovej a fázy sa oddelia. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 6/1) sa získa kopulačný produkt (83 mg, 44 % teórie).
13C-RMN (62,89 MHz, CDC13), δ ppm: 173,69; 173,53; 173,26; 171,21; 171,11; 170,61; 170,38; 170,31; 170,22; 156,36; 138,26; 136,58; 135,20; 134,87; 128,48; 128,38; 128,31; 128,27; 128,19; 127,95; 127,55; 76,50; 71,24; 71,10; 67,58; 67,48; 66,79; 66,42; 65,69; 49,99; 48,77; 47,86; 41,70; 41,49; 40,70; 39,15; 37,50; 35,94; 34,44; 34,37; 33,97; 33,67; 31,80; 29,54; 29,24; 29,07; 28,37; 25,98; 25,55; 25,13; 25,08; 24,91; 24,28; 22,58; 14,02.
2.24.2. a-N-{(4R)-5-(6-Aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid /3-N-[(lS)-l,2-dikarboxyetyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetra-dekanoyl]-D-asparágovej (= ΟΜ-197-Asp-AC)
Roztok pripravenej zlúčeniny (80 mg, 0,053 mmol) sa hydrogenuje 12 až 24 hodín v systéme dichlórmetán/etanol 1/4 (10 ml) obsahujúci kyselinu octovú (1 ml) za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (50 mg) pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania dikyseliny (61 mg, výťažok kvantitatívny), SM: Vypočítané pre CjsHjosNsOb 1095,8. Nájdené m/z 1097,0 [M+H]+. (Obr. 36).
Príklad 2.25. a-N-{(4R)-5-(6-Aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylaminolpentyl}amid kyseliny N-acetyl-D-asparágovej (= OM-197-N'C2-AC) (obr. 37)
2.25.1. /3-Benzylester kyseliny N-acetyl-D-asparágovej
Do roztoku acetanhydridu (85 μΐ, 0,90 mmol) v acetonitrile (1 ml) sa pridá obchodne dostupný roztok H-D-Asp(OBn)-OH (Senn Chemicals AG, CH-Dielsdorf) (200 mg, 0,90 mmol) v systéme acetonitril/voda/trietylamín (3,5/1,0/0,4 ml). Reakčná zmes sa mieša 18 hodín pri teplote okolia. Organické rozpúšťadlo sa odparí a zvyšná vodná fáza, ochladená na teplotu 0 °C, sa okyslí vodným 10 % roztokom kyseliny citrónovej až na hodnotu pH 3 a extrahuje sa (2x) etylacetátom. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. /3-Benzylester kyseliny N-acetyl-D-asparágovej, získaný vo forme bielej kryštalickej látky (192 mg, 81 % teórie) sa použije bez ďalšieho čistenia v nasledujúcom stupni. (Rf = 0,30, systém dichlórmetán/ metanol 20/1 s 2 % kyseliny octovej. Vývojka U.V. a fosfomolybdénová).
2.25.2. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-benzylester kyseliny N-acetyl-D-asparágovej
Roztok 2-izobutoxy-l-izobutoxykarbonyl-l,2-dihydrochinoleínu (IIDQ) (254 mg, 0,84 mmol, 1 ekv.) v bezvodom dichlórmetáne (5 ml) sa pridá do roztoku /3-benzylesteru kyseliny N-acetyl-D-asparágovej, pripraveného skôr (185 mg, 0,70 mmol), v bezvodom dichlórmetáne (15 ml) pri teplote okolia a v prostredí argónu. Reakčná zmes sa mieša 15 minút, pridá sa roztok (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloxy-tetradekanoylamino]pentán-l-olu (odsek 1.1.2.) (334 mg, 0,77 mmol, 1 ekv.) v bezvodom dichlórmetáne (10 ml). Mieša sa počas 3 hodín, rozpúšťadlo sa odparí. Čistením zvyšku okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 5/3, potom acetón) sa získa kopulačný produkt (369 mg, 78 % teórie). (Rf = 0,22, systém dichlórmetán/acetón 5/2, vývojka U.V. a fosfomolybdénová).
13C-RMN (62,89 MHz, CDCI3), δ ppm: 171,92; 171,23; 171,07; 170,61; 170,35; 138,11; 135,24; 128,40; 128,24; 128,02; 127,69; 127,59; 71,25; 67,57; 64,56; 51,03; 49,41; 41,51; 39,21; 35,90; 33,88; 31,73; 29,46; 29,17; 28,32; 28,02; 25,35; 25,24; 24,97; 22,83; 22,51; 13,97; SM: vypočítané pre C39H59N3O7 681,4; m/z
682,5 ([M+H]+), 704,5 ([M+Na]+).
2.25.3. a-N-{(4R)-5-[6-(Benzyloxykarbonylamino)hexanoyloxy]-4-[(R)-3-benzyloxy-tetradekanoylamino]pentyljamid /3-benzylester kyseliny N-acetyl-D-asparágovej
Do roztoku a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-pentyl}amid β-benzylesteru kyseliny N-acetyl-D-asparágovej, (200 mg, 0,29 mmol) a kyseliny 6-(benzyloxykarbonylamino)hexánovej (156 mg, 0,59 mmol) v suchom dichlórmetáne (8 ml) sa pri teplote 0 °C v prostredí argónu pridá postupne obchodne dostupný chlórhydrát l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (112 mg, 0,59 mmol) a 4-dimetylaminopyridín (7 mg, 59 gmol). Reakčná zmes sa mieša 30 minút pri teplote 0 °C, potom cez noc pri teplote okolia. Reakčná zmes sa premyje vodou a 1 N kyselinou chlorovodíkovou a fázy sa oddelia. Organická fáza sa suší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 6/1) sa získa kopulačný produkt (200 mg, 73 % teórie) vo forme bielej pevnej látky.
13C-RMN (62,89 MHz, CDC13), δ ppm: 173,65; 171,71; 171,26; 170,30; 156,41; 138,16; 136,60; 135,33; 128,57; 128,46; 128,38; 128,20; 128,04; 127,76; 127,62;
71,21; 66,80; 66,53; 65,72; 65,63; 49,36; 47,80; 41,36; 40,76; 39,22; 39,13; 35,79; 33,75; 31,88; 29,61; 29,31; 28,58; 28,52; 26,04; 25,48; 25,11; 24,36; 23,13; 22,64; 14,09.
2.25.4. a-N-{(4R)-5-[6-(Aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid kyseliny N-acetyl-D-asparágovej (OM = 197-NO2-AC)
Roztok pripravenej zlúčeniny (200 mg, 0,22 gmol) v zmesi dichlórmetán/ etanol 1/1 (16 ml) obsahujúci kyselinu octovú (2 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (40 mg) 12 až 24 hodín pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyljamidu kyseliny N-acetylasparágovej (132 mg, výťažok kvantitatívny). SM, vypočítané pre C3iH5RN4O8 614,43: nájdené m/z 615,5 [M+H]+, 629,5 [M+NH4]+, 637,5 [M+Na]+, (obr. 38).
Príklad 2.26 a-N-{(4R)-5-[6-(Aminohexanoyloxy]-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej (= OM-197-N'(C10-20C8)-AC) (obr. 39)
2.26.1. Benzyl-2-hydroxyoktanoát
Do roztoku obchodne dostupnej racemickej kyseliny 2-hydroxyoktánovej (1,00 g, 6,2 mmol) v etylacetáte kvality HPLC (30 ml) sa pridajú postupne benzylbromid (2,22 ml, 18,7 mmol), trietylamín (2,6 ml, 18,7 mmol) a tetrabutylamóniumjodid (1,15 g, 3,12 mmol). Roztok sa mieša 18 hodín pri teplote okolia a rozpúšťadlo sa odparí. Zvyšok sa vyberie do éteru a organická fáza sa potom premyje nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou (2x). Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí, čím sa získa surový benzyl-2-hydroxyoktanoát (Rf = 0,57, systém petroléter/etylacetát 3/1, vývojka U.V. a fosfomolybdénová).
2.26.2. Benzyl-2-dekanoyloxyoktanoát
Do roztoku získaného esteru (780 mg, 3,12 mmol) v suchom dichlórmetáne (15 ml) sa pri teplote 0 °C prikvapká pyridín (0,9 mol), potom dekanoylchlorid (654 mg, 3,43 mmol). Reakčná zmes sa mieša 20 hodín pri teplote okolia a vleje sa do ľadovej vody obsahujúcej hydrogenuhličitan sodný (5 %). Organická fáza sa oddelí, premyje sa 1 N roztokom kyseliny chlorovodíkovej a vodou (2x), vysuší sa síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém petroléter/etylacetát 30/1 sa získa čistý benzyl-2-dekanoyloxyoktanoát.
2.26.3. Kyselina 2-dekanoyloxyoktánová
Získaný benzyl-2-dekanoyloxyoktanoát (515 mg, 1,27 mmol) v etanole kvality HPLC (40 ml) sa hydrogenuje dve hodiny za prítomnosti 10 % paládia na uhlí pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania kyseliny
2-dekanoyloxyoktánovej (výťažok je kvantitatívny).
2.26.4. /S-Benzylester kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej
Do roztoku kyseliny 2-dekanoyloxyoktánovej (317 mg, 1,01 mmol) v bezvodom tetrahydrofuráne (2 ml) pri teplote -15 °C sa postupne v prostredí argónu pridá N-metylmorfolín (111 gl, 1,01 mmol, 1 ekv.) a izobutylchlórmravčan (131 gl, 1,01 mmol, 1 ekv.). Rýchlo sa vyzráža chlórhydrát N-metylmorfolínu. Mieša sa počas 30 minút pri teplote -15 °C, pridá sa obchodne dostupný roztok H-D-Asp(OBn)-OH (Senn Chemicals AG, CH-Dielsdorf (225 mg, 1,01 mmol, 1 ekv.) v systéme acetonitril/voda 3,5/1 (9 ml) obsahujúci trietylamín (0,4 ml). Reakčná zmes sa mieša cez noc pri teplote okolia. Organická fáza sa odparí a vodná fáza sa ochladí na teplotu 0 °C, okyslí sa vodným 10 % roztokom kyseliny citrónovej na hodnotu pH 3 a extrahuje sa etylacetátom (2x). Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém petroléter/etylacetát 2/1, obsahujúcom 2 % kyselinu octovú) nasledovaným spoločným odparením s toluénom sa získa /3-benzylester kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej (140 mg, 27 % teórie).
2.26.5. a-N-{(4R)-5-Hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-benzylester kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej
Pridá sa IIDQ (98 mg, 0,32 mmol, 1,2 ekv.) do roztoku /3-benzylesteru kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej (140 mg, 0,27 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (15 ml) pri teplote okolia v prostredí argónu. Reakčná zmes sa mieša 15 minút a pridá sa roztok (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]-pentán-l-olu (odsek 1.1.2) (129 mg, 0,30 mmol, 1,1 ekv.) v bezvodom dichlórmetáne (5 ml). Mieša sa počas 16 hodín a roztok sa odparí do sucha. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 5/1, potom (1/1) sa získa kopulačný produkt (197 mg, 78 % teórie) (Rf = 0,30, systém dichlórmetán/acetón 5/1, vývojka U.V. a fosfomolybdénová).
2.26.6. a-N-{(4R)-5-(6-(Benzyloxykarbonylamino)hexanoyIoxy]-4-[(R)-3-benzyloxy-tetradekanoylamino]pentyljamid /3-benzylester kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej
Do roztoku a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentyl}-amid /3-benzylesteru kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej (197 mg, 0,21 mmol) a kyseliny 6-(benzyloxykarbonylamino)hexánovej (112 mg, 0,42 mmol) v suchom dichlórmetáne (8 ml) sa pri teplote 0 °C v prostredí argónu pridá postupne obchodne dostupný chlórhydrát l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (81 mg, 0,42 mmol) a 4-dimetylaminopyridín (6 mg, 42 pmol). Reakčná zmes sa mieša 30 minút pri teplote 0 °C cez noc pri teplote okolia. Reakčná zmes sa premyje vodou a 1 N kyselinou chlorovodíkovou a fázy sa oddelia. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí. Čistením okamžitou chromatografiou na silikagéli (elučné činidlo systém dichlórmetán/acetón 6/1) sa získa kopulačný produkt (170 mg, 68 % teórie).
2.26.7. o'-N-{(4R)-5-(6-Aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej
Roztok pripravenej zlúčeniny (150 mg, 0,13 mmol) v zmesi dichlórmetán/ etanol 1/1 (16 ml) obsahujúci kyselinu octovú (2 ml) sa hydrogenuje za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (40 mg) 12 až 24 hodín pri teplote a tlaku okolia za prítomnosti vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje. Filtrát sa odparí do sucha a zvyšok sa suší lopatkovým čerpadlom za získania a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amidu kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej (110 mg, výťažok kvantitatívny). SM, vypočítané pre C47H88N4Oio 868,65 nájdené m/z 870,0 [M+H]+, 884,0 [M+NH4]+, 891,5 [M+Na]+. (obr. 40)
Príklad 2.27
Čistenie a analýza zlúčenín podľa vynálezu
Produkty syntézy a acylované pseudodipeptidy nesúce funkcionalizovanú pomocnú vetvu sa rozpustia v systéme voda/izopropanol (objemovo 1 : 1). Na dosiahnutie koncentrácie 50 mM sa pridá potrebné množstvo 2 M hydrogenuhličitanu amónneho.
2.27.1 Čistenie
Čistí sa inverznou fázovou preparatívnou chromatografiou HPLC za nasledujúcich podmienok:
Stĺpec:Bondapack C18PrepPak, 40 x 200 mm, 15 až 20 pm, 30 nm, Waters
Mobilná fáza: A: Izopropanol/voda (objemovo 9 : 1), 50 mM hydrogenuhličitanu amónneho
B. izopropanol/voda (objemovo 2 : 8), 50 mM hydrogenuhličitanu amónneho Prietok: 40 ml/min.
Elúcia: izokratická adsorpcia na stĺpci: 40 % B (60 % A), 10 minút
Gradient: A : B : 40 až 80 % B v 10 minútach
Izokratická elúcia: 80 % B, 30 minút
Premytie: 100 % B, 10 minút
Detekcia: UV, 210 nm
V prípade, že sa pozoruje prítomnosť aromatických produktov (neúplné odstránenie chrániacej skupiny), uskutoční sa jemnejšie čistenie. Toto doplňujúce čistenie prebieha za nasledujúcich podmienok: Stĺpec: Kromasil C18, 21 x 250 mm, 5 pm, 10 nm
Macherey-Nagel
Mobilná fáza: A: izopropanol-voda (objemovo 9 : 1), 50 mM hydrogenuhličitanu amónneho B: izopropanol-voda (objemovo 2 : 8), 50 mM hydrogenuhličitanu amónneho
Prietok: 5 ml/min.
Elúcia: Izokratická adsorpcia na stĺpci: 40 % B (60 % A), 10 minút Izokratická elúcia: 80 % B, 30 minút Premytie: 100 % B, 10 minút
Detekcia: UV, 210 nm
Systém: Waters 2000
Frakcia, obsahujúca sledované zlúčeniny vo forme amóniovej soli, sa zhromaždí a skoncentruje sa adsorpciou na fáze C18 Bondapack 15-20 pm, 30 nm, Waters: Protiión môže byť vymenený premytím aspoň jedným vodným roztokom soli alkalického kovu (ako je napríklad chlorid sodný alebo chlorid draselný) po 10 g/1 v systéme voda/izopropanol (objemovo 9 : 1). Po odstránení prebytku soli priechodom 5 objemov systému voda/izopropanol (objemovo 9 : 1) cez stĺpec, sa eluuje zlúčenina čistým izopropanolom.
2.27.2. Stupne po čistení
Po každom stupni sa frakcie analyzujú inverznou fázovou analytickou chromatografiou HPLC za nasledujúcich podmienok:
Stĺpec: Supelcosil C18, 3 pm, 4,6 x 150 mm 10 nm
Supelco
Mobilná fáza: A: voda/acetonitril (objemovo 1 : 1), 5 mM TBAP B: voda/izopropanol (objemovo 1 : 9), 5 mM TBAP TBAP: tetrabutylamóniumfosfát
Prietok: 1 ml/min.
Elúcia: Gradient A : B (75 : 25 až 0 : 100 37,5 minút)
Detekcia: UV, 210 a 254 nm
Chromatografia: K týmto analýzam sa použijú rôzne chromatografie HPLC (HP 1050 Ti séria, HP 1090 séria M, LabChrom-Shimadzu). Retenčné časy podľa použitého systému sa môžu líšiť približne v 1 minúte pre danú zlúčeninu.
2.27.3 Dávkovanie a analýza čistoty konečných produktov
Dávkovanie a analýza čistoty získaných produktov sa uskutočňujú HPLC/UV za opísaných chromatografíckých podmienok. Podľa týchto analýz sú získané čistoty produktov 97 až 100 %. Na uvedenie prítomnosti nečistôt aktívnych na UV sa uskutočňujú analýzy LC/ES-MS (ionizácia typu electrospray, móde positif). Na vyhovenie ionizačným podmienkam sa použijú nasledujúce chromatografické podmienky: Stĺpec: Vydac C 4,5 pm, 4,6 x 150 mm 30 nm
Mobilná fáza: A. voda/acetonitril (objemovo 1 : 1), 0,005 % TFA
B: voda/izopropanol (objemovo 1 : 9), 0,005 % TFA Prietok: 1 ml/min.
Elúcia: Gradient A : B (80 : 20 až 0 : 100) 20 minút
Teplota: 40 °C
2.27.4 Spektrálna analýza Hmotnostná spektrometria
Spektrá ES/MS (druhy kladné a záporné) sa merajú hmotnostnými spektrometrami rôznych typov (Finnigan LCQ, ión trap: Micromass Quattro II, triple stage quadrupol: Micromass Z-Bio-Q, triple stage quadrupol). Taktiež sa uskutočňujú doplnkové analýzy MS/MS.
Nukleová magnetická rezonancia
Spektrá 'H-RMN a 13C-RMN sa merajú na prístrojoch typu Bruker DPX po 250.13 a 62.89 Mhz.
3. Séria príkladov: Príprava konjugátu
Príklad 3.1
Konjugáty s peptidom FGFG
Ako ukazujú schémy syntéz na obr. 5, 8, 15, 17, 19, 21 a 23, uskutočňuje sa vicinálna dihydroxylácia acylovaných pseudodipeptidov nesúcich pomocnú vetvu olefinického typu na tvorbu skupiny stabilného diolu. Nasleduje oxidácia jodistanom na vytvorenie aldehydovej skupiny na pomocnej vetve. Aldehydová skupina umožňuje redukčnou amináciou kopuláciu napríklad peptidu malého tvaru, ako je FGFG (fenylalanín-glycín-fenylalanín-glycín, Sigma). Tento stupeň čistenia aldehydu je v každom prípade nutný na odstránenie solí obsiahnutých v roztoku. Toto čistenie aldehydu sa uskutočňuje na fáze Bondapack C18 (Waters) 15 až 20 pm, 30 nm nasledujúcim postupom:
- adsorpcia po zriedení systémom izopropanol/voda (1 : 3),
- elúcia solí systémom izopropanol/voda (1 : 9),
- elúcia aldehydu minimálnym objemom izopropanolu.
Kopulačná reakcia redukčnej aminácie sa uskutočňuje vo vodnom roztoku za rovnakej stechiometrie aldehydovej skupiny (pomocná vetva acylovaného pseudodipeptidu) a aminoskupiny peptidu alebo proteínu na kopuláciu.
V prípade čisteného peptidu FGFG sa pridajú 2 mg OM-197-VF7 (1,86 μηιοί, 1 ekv.) do roztoku 0,8 mg FGFG (1,86 μηιοί, 1 ekv.) rozpusteného v 1 ml systému voda/acetonitril (1 : 1). Roztok sa mieša 30 minút pri teplote okolia do vytvorenia imínu. Redukcia sa uskutoční pridaním 92 μΐ nátriumkyanobórhydridu (NaBH3CN) 1 M (5,77 mg, 50 ekv.) na vytvorenie zvlášť stabilnej väzby uhlík-dusík (obr. 41). Konjugát sa čistí najskôr na stĺpci Vydac C4 na odstránenie nezreagovaného peptidu, potom na fáze Bondapack C18 (Waters) na získanie sodnej soli (odsek Čistenie a analýza zlúčenín podľa vynálezu). Konjugát sa potom znova rozpustí v sterilnej vode obsahujúcej 0,01 % trietanolamínu (TEoA) na splnenie podmienok testov biologickej aktivity. Hmotnostné spektrum ES/MS zaznamenané po čistení je na obr. 43 a má molekulový ión [M+H]+ pri m/z 1457,4, znamenajúci očakávanú kopuláciu. Viditeľné ióny medzi m/z 400 a 900 sa identifikujú analýzami MS/MS ako fragmenty pochádzajúce z molekulového piku konjugovaného peptidu. Ióny zodpovedajúce peptidu počiatočného FGFG (m/z 427,1 [M+H]+, m/z 853,0 [2M+H]+, (obr. 42) neboli zistené.
Príklad 3.2
Konjugáty s peptidom (NANP)6P2P30
Zlúčenina OM-197-FV7, získaná spôsobom podľa schémy na obr. 5, sa môže kopulovať napríklad na farmaceutický zaujímavý peptid (NANP)6P2P30 (Valmori a kol., J. Immunol. 149, str. 717 až 721. (1992)), ktorý má nasledujúcu sekvenciu:
(NANP)2QYIKANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSAESHLE.
Peptid (NANP)6P2P3o má štyri možné miesta konjugácie (koncový amín + 3 lyzíny). Pridá sa 5 mg čisteného OM-197-FV7 (4,64 μηιοί, 4 ekv.) do roztoku 7,49 mg (NANP)6P2P30 (1,16 μηιοί, 1 ekv.) rozpusteného v 1 ml systému voda/izopropanol (1 : 1). Roztok sa mieša 30 minút pri teplote okolia, uskutoční sa redukcia pridaním 230 μΐ nátriumkyanobórhydridu 1 M (14,43 mg, 50 ekv.). Roztok sa mieša dve hodiny pri teplote okolia. Reakčná zmes sa 24 hodín dialyzuje proti vode (dialyzačná kazeta 3,5 Kd, Slide-A-lyzer. Pierce). Analýzou LC/ES-MS reakčnej zmesi zistená prítomnosť troch typov molekúl ako ukazujú chromatogramy na obr. 44: zodpovedajúce piky prináležia voľnému peptidu (pík A) monokonjugovanému peptidu (pík B) a bikonjugovanému peptidu (pík C), ktoré sú zreteľne jasné. Zaznamenané iónové obálky pre každý z nich sú znázornené na obr. 45, 46 a 47 a potvrdzujú kovalentnú konjugáciu s jednou alebo dvoma molekulami OM197-FV pre monokonjugát a pre bikonjugát.
Obr. 45: Peptid (NANP)6P2P30 (voľný peptid), PM: 6451 ióny pri m/z 1076,2 (Α6, 1291,2 (A5), 1613,7 (A4)
Obr. 46: Monokonjugát OM-197-FV (NANP)6P2P30 PM: 7481 ióny pri m/z 1247,8 (B6, 1497,7 (B5), 1871,2 (B4)
Obr. 47: Bikonjugát (OM-197-FV)2- (ΝΑΝΡ)6Ρ2Ρ30 PM:8511 ióny pri m/z 1419,6 (C6,1703,3 (C5), 2129,1 (C4).
Analýza SDS-PAGE konjugátov OM-197-FV-(NANP)6P2P30 ukazuje rozdielne oddelené pruhy zodpovedajúce peptidu nezreagovanému, monokonjugovanému a bikonjugovanému. Pri použitých elektroforetických podmienkach (gradient 10-20 % polyakrylamidu, tristricínového pufra, Bio Rad #161-1108) umožňujú súčasné štandardy vyhodnotiť približne tisíc uma rozdielov medzi sledovanými pruhmi, potvrdzujúcich kopuláciu jednej z molekúl OM-197-FV na peptid.
Príklad 3.3
Konjugáty s peptidom P2P30
Taktiež môžu byť kopulované iné peptidy redukčnou amináciou na zlúčeniny nesúce pomocnú vetvu typu aldehydu. Uvádza sa napríklad kopulácia OM-197-FV7 na peptid P2P3o- Zodpovedá epitopnej časti T toxínu tenanus toxoid a má nasledujúcu sekvenciu: KQYIKANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE.
Peptid P2P3O má 5 možných konjugačných miest (koncová aminoskupina + štyri lyzíny) a hmotnosť 4200 uma. Ide o päť ekvivalentov OM-197-FV7. Použijú sa opísané reakčné podmienky. Po dialýze proti vode (dialyzačná kazeta 3,5 Kd, Slide-A-lyzer, Pierce) sa hmotnostné spektrá získaných konjugátov merajú LC/ES-MS a porovnajú sa so spektrami zaznamenanými pre voľný peptid P2P30, ktorý má ióny s niekoľkými nábojmi m/z 840,9 (A5), 1050,9 (A4), 1401,0 (A3), ktoré tvoria iónovú obálku (obr. 48) peptidu s molekulovou hmotnosťou 4200 uma. Spektrum ES/MS monokonjugovaného OM-197-FV-P2P30 má ióny s niekoľkými nábojmi m/z 872,8 (A6), 1047,1 (A5), 1308,6 (A4) a 1744,4 (A3) (obr. 49), ktoré tvoria iónovú obálku konjugátu s molekulovou hmotnosťou 5230 uma, čo zodpovedá naočkovaniu molekuly OM-197-FV na molekulu peptidu P2P30 redukčnou amináciou.
Rovnako hmotnostné spektrum získané pre bikonjugát (OM-197-FV)2-P2P3o nezanecháva pochybnosti, pokiaľ ide o dve molekuly OM-197-FV na peptidovú jednotku. Iónová obálka pozostáva z iónov m/z 1044,5 (A6), 1253,1 (A5), 1566,3 (A4) a 2088,4 (A3) (obr. 50), ktoré po transformácii potvrdzujú očakávanú molekulovú hmotnosť pre bikonjugát (6261 uma).
Príklad 3.4
Konjugáty s peptidom (NANP)3CS.T3
Podobná kopulácia sa môže uskutočniť na peptid (NANP)3CS.T3 (TNO, PM 3527 uma), ktorého sekvencia je nasledujúca: MAMPNANPNANPDIEKKIAKMEKASSVFNVVNS
Po dialýze proti vode majú ióny pozorované na spektrách ES/MS molekulové hmotnosti 4557 a 5587 uma, čo zodpovedá očakávaným hodnotám pre zlúčeniny monokonjugované a bikonjugované.
Príklad 3.5
Konjugáty s peptidom MR99B
Zlúčenina OM-197-FV6 získaná syntézou, znázornenou na obr. 8, môže byť kopulovaná napríklad na peptid zaujímavý z farmaceutického hľadiska, ako je PyCS245-253. Tento peptid zodpovedajúci epitopu T Plasmodium yielii (Franke E.D. a kol., J. Immunol. 159, str. 3424 až 3433, 1997), má nasledujúcu sekvenciu: SYVPSAEQI (PyCF 245-253).
Aby sa nemodifikovala epitopová časť T, pri konjugácii sa pridávajú aminokyseliny SER na vytváranie peptidu naviazaného MR99B so sekvenciou
SERSYVPSAEQI (MR99B).
Vzhľadom na sekvenciu pochádzajúcu z lyzínu, predstavuje MR99B jedinečné miesto pre konjugáciu redukčnou amináciou (na koncovom amíne). Pridajú sa 2 mg čisteného OM-197-MC-FV6 (2,04 pmol, 1,4 ekv.) do roztoku 2 mg MR99B (1,47 pmol, 1 ekv.) rozpusteného v 1 ml systému voda/izopropanol (1 : 1). Roztok sa mieša 30 minút pri teplote okolia a na účely redukcie sa pridá 29,4 μΐ nátriumkyanobórhydridu 1 M (29,4 μπιοί, 20 ekv.). Roztok sa mieša dve hodiny pri teplote okolia. Analýza LC/ES-MS reakčnej zmesi potvrdzuje vytvorenie konjugátu OM-197-MC-FV-MR99B s očakávanou molekulovou hmotnosťou (2330,4 uma, obr. 51), ako dokazujú spektrá na obr. 52 (iónová obálka) a 53 (transformované spektrum).
Konjugát OM-197-MC-FV-MR99B sa čistí semiprepratívnou kvapalinovou chromatografiou na fáze C4 za nasledujúcich podmienok:
Stĺpec: Vydac C4, 250 x 10 mm, 5 pm, 30 nm (Vydac)
Mobilná fáza: A: voda-acetonitril (objemovo 9 : 1), 0,05 % TFA
B: izopropanol-voda (objemovo 9:1) 0,05 % TFA Prietok: 2,5 ml/min.
Elúcia: Elúcia izokratická: 65 % B, 20 minút
Premytie: 100 % B, 10 minút
Detekcia: UV, 210 nm.
Systém: HPLC 1050
Na dokumentovanie, že antigénová časť peptidu nie je ovplyvnená konjugáciou, sa uskutoční tripsínová digescia konjugátu OM-197-MC-FV-MR99B. Inkubuje sa 0,5 mg konjugátu 24 hodín pri teplote 25 °C s 83 pg trypsínu (Roche, #109819) (pomer substrát/enzým 6 : 1) v 1 ml pufra 50 mM Tris HCI, 2 mM CaCl2, pH 8.
Analýza LC/ES-MS po reakcii je na obr. 54 a dokladá dva fragmenty, ktorých spektrá ES-MS sú na obr. 55 a 56. Prvý fragment má ióny pri m/z 993,5 [M+H]+ a 1015,6 [M+Na]+ a zodpovedá peptidu CSPy 245 až 253 (obr. 55). Druhý fragment má ióny pri m/z 678,1 [M+H]+2 a 1355,0 [M+H]+, čo naznačuje prítomnosť štruktúry typu OM-197-MC-FV-SER (obr. 56). Tretí pík je taktiež zjavný. Zodpovedá dvom fragmentom SYVPS a AEQI (koeluáty za týchto chromatografických podmienok). Táto reakcia je tiež zjavná po digescii samotného MR99B.
Tieto výsledky zreteľne dokladujú, že konjugácia nemení časť epitopu-T peptidu MR99B (schéma na obr. 51).
Príklad 3.6
Konjugáty s peptidom MR99A
Na zvýšenie stupňa konjugácie OM-197-MC-FV peptidu a na zvýšenie pomeru adjuvant/antigén bez modifikovania časti epitopu T, môžu byť sekvencie typu KGG naočkované na peptid určený na konjugovanie. Tak môže byť naočkovaná sekvencia KGGKGGK napríklad na peptid MR99B, na získanie nasledujúceho peptidu MR99A:
KGGKGGKSERSYVPSAEQ MR99A.
Ten má teda štyri miesta možnej konjugácie pre redukčnú amináciu (tri lyzíny a koncový amín). Pridá sa 12 mg OM-197-MC-FV6 čisteného (12,2 pmol, 12 ekv.) do roztoku 2 mg MR99A (1,01 pmol, 1 ekv.) rozpusteného v 1 ml systému voda/izopropanol (1 : 1). Roztok sa mieša 30 minút pri teplote okolia, načo sa uskutoční redukcia pridaním 242 pl nátriumkyanobórhydridu 1 M (244 pmol, 242 ekv.). Roztok sa mieša dve hodiny pri teplote okolia. Analýzou LC/ES-MS reakčného systému sa prejavia rôzne piky zodpovedajúce rôznym stupňom konjugácie molekúl OM-196-MC-FV na peptide MR99A. Hmotnostné spektrá zodpovedajúce trikrát konjugovanému (OM-197-MC-FV)3 MR99A (4870 urna) sú na obr. 57 (iónová obálka) a 58 (transformované spektrum), podobne spektrá na obr. 59 (iónová obálka) a na obr. 60 (transformované spektrá) a potvrdzujú vytvorenie štvornásobne konjugovaného (OM-197-MC-FV)4-MR99A (5834 uma). Ióny zodpovedajúce päťkrát konjugovanej forme sú tiež zjavné. Tento výsledok dokladá, že lyzín za niektorých reakčných podmienok (prebytok OM-197-MC-FV) nie je jedinou aminokyselinou, ktorá môže reagovať redukčnou amináciou.
Trikrát a štyrikrát konjugované (OM-197-MC-FV)3.4 MR99A sa čistí semipreparatívnou kvapalnou chromatografiou na fáze C4 za nasledujúcich podmienok: Stĺpec: Vydac C4, 250 x 10 mm, 5 pm, 30 nm (Vydac)
Mobilná fáza: A: voda/acetonitril (objemovo 9:1), 0,05 % TFA
B: izopropanol/voda (objemovo 9 : 1), 0,05 % TFA Prietok: 2,5 ml/min.
Elúcia: Elúcia izokratická: 85 %, 20 minút
Premytie: 100 % B, 10 minút
Detekcia: UV, 210 nm,
Systém: HPLC 1050
Rovnako ako v prípade monokonjugovaného (OM-197-MC-FV)-MR99B sa uskutočňuje trypsínová digescia polykonjugovaných (OM-197-MC-FV)n-MR99A na zistenie, či antigénová časť (CSPy 245-253) nie je ovplyvnená konjugáciou. Inkubuje sa 1 mg polykonjugátu 24 hodín pri teplote 25 °C s 166 pg trypsínu (Roche #109819) (pomer substrát/enzým (6 : 1)) v 1 ml pufŕa 50 nM tris HCI, 2 mM CaCl2, hodnota pH 8.
Analýza LC/ES-MS po reakcii umožňuje ukázať mnohé fragmenty zodpovedajúceho štiepenia v rôznych miestach peptidu MR99A. Pripomína sa fragment majúci ióny pri m/z 993,5 [M+H]+ a 1015,6 [M+Na]+ a zodpovedá peptidu CSPy 245 až 253. Obsah tohto druhého peptidu potvrdzuje integritu časti epitopu-T samotného peptidu po niekoľkonásobnej konjugácii. Obzvlášť zaujímavé sú dva fragmenty svojimi trojnásobne nabitými iónmi pri m/z 1621,4 [M+H]+3 a 1942,8 [M+H]+3. V skutočnosti zodpovedajú fragmentom (OM-197-MC-FV)4-KGGKGGKSER a (OM-197-MC-FV)s-KGGKGGKSER. Rôzne molekuly OM-197-MC-FV sú teda účinne naočkované na pridanú sekvenciu CSPy 245 až 253 i v prípade, keď aminokyseliny iné ako lyzín reagujú po redukčnej aminácii. Zdôrazňuje sa tiež, že prítomnosť mnohých molekúl OM-197-MC-FV stericky významných pre peptid neovplyvňuje proteázovú aktivitu ako trypsín. Tento výsledok je zvlášť dôležitý napríklad pre prípad uvoľňovania konjugácie na prodrogu alebo na aktívnu časť po selektívnom štiepení oddeliteľnej väzby.
Príklad 3.7
Konjugáty s peptidom Ag85c
Viazané štruktúry pomocnej vetvy formylvalerylového typu môžu byť konjugované na početné farmaceutický zaujímavé peptidy. Napríklad sa uvádza očkovanie redukčnou amináciou molekúl OM-197-MC-FV na koncový amín syntetických peptidov, ktorých sekvencie sa odlišujú od antigénového proteínu Mycobacterium tuberculosis. Pôvodnými peptidmi sú:
MRI 00 YLQVPSASMGR 1208,4 uma,
MRI 01 MVQIPRLVANNTRIWVYC 2176,6 uma,
LR72 PYAASLSGFLNPSEGWWPTLIGLAM 2676,1 uma.
Po reakcii s OM-197-MC-FV sa zisťujú nasledujúce konjugáty analýzou LC/ES-MS: napríklad OM-197-MC-FV-MR100, ktorý má molekulovú hmotnosť 2171,0 uma (ua znamená „zmluvná jednotka,,) (obr. 61 a 62). Alternatívne sa tiež získajú konjugáty OM-197-MC-FV-MR 101, 3140,0 uma a OM-197-MC-FV-LR72, 3643,0 uma.
Príklad 3.8
Dimér štruktúr typu OM-197
Technika aminačnej redukcie môže byť aplikovaná tiež na syntézu diméru štruktúr OM-197.
Napríklad môže byť dimér vytvorený dvoma zlúčeninami, ktoré majú funkcionalizované pomocné vetvy, ako sú OM-197-MC-FV a OM-197-MC-AC. Pridá sa 1 mg čisteného OM-197-MC-FV6 (0,98 pmol, 1 ekv.) do roztoku 1 mg OM-197-MC-AC (0,98 pmol, 1 ekv.) rozpusteného v 1 ml systému voda/izopropanol (1 : 9). Roztok sa mieša jednu hodinu pri teplote okolia, uskutočňuje sa redukcia počas jednej hodiny prida ním 19,6 μΐ nátriumkyanobórhydridu 1 M (19,6 pmol, 20 ekv.). Roztok sa mieša 12 hodín pri teplote okolia. Analýza LC/ES-MS reakčnej zmesi umožňuje doložiť tvorbu diméru OM-197-MC-FV-OM-197-MC-AC očakávanej molekulovej hmotnosti (1945,5 uma), ako dokladá spektrum znázornené na obr. 63. Táto molekula tak má dve skupiny karboxylovej kyseliny na okraji nosnej kostry acylových reťazcov.
V štruktúre predstavenej na obr. 63 môže byť jedna z karboxylových skupín nahradená napríklad fosforylovou skupinou pri realizácii tejto syntézy zo zlúčeniny typu OM-197-MP-AC alebo OM-197-MP-FV. Podobnou redukčnou aminačnou reakciou, ako je práve opísaná reakcia medzi dvoma zlúčeninami s pomocnou íunkcionalizovanou vetvou (OM-197-MP-AC a OM-197-MP-FV) môže byť získaný dimér OM-197-MPFV-OM-197-MC-AC. Spektrum ES/MS na obr. 64 dokladá očakávanú molekulovú hmotnosť tejto zlúčeniny (2011,9 uma).
Príklad 3.9
Konjugácia zlúčenín s pomocnou vetvou amínového typu
Zlúčeniny s pomocnou vetvou amínového typu môžu byť tiež konjugované na peptidové antigény aminačnou redukciou. Je možné využívať napríklad prítomnosť koncového serínu v sekvencií peptidov ku konjugácii. Najskôr sa uskutoční jodistanová oxidácia na peptide, vedúca k vytvoreniu veľmi reaktívnej glyoxylovej skupiny (-CO-CHO), ktorá sa môže nechať reagovať redukčnou amináciou s primárnym amínom prítomným na pomocnej funkcionalizovanej vetve zlúčenín typu OM-197.
Napríklad syntetický peptid MR99B môže byť konjugovaný na zlúčeninu OM-197-MC-AC podľa schémy syntézy na obr. 65. Pridá sa 147 μΐ jodistanu sodného 0,1 M (14,6 pmol, 20 ekv.) do roztoku 1 mg peptidu MR99B (0,73 pmol, 1 ekv.) rozpusteného v 1 ml vody. Roztok sa mieša dve hodiny pri teplote okolia. Takto získaný aldehyd sa čistí na fáze C18 a zhromaždí sa do 1 ml systému izopropanol/ voda (1 : 1). Pridá sa 0,72 mg zlúčeniny OM-197-MC-AC (0,73 pmol, 1 ekv.) a 1 ml borátového pufra 0,2 M, hodnota pH 9,2. Mieša sa počas 30 minút pri teplote okolia a uskutoční sa redukcia pridaním 14,6 pl nátriumkyanobórhydridu 1 M (14,6 pmol, 20 ekv.). Roztok sa mieša 24 hodín pri teplote okolia.
Analýza LC/ES-MS reakčnej zmesi dokladuje vytvorenie konjugátu OM-197-MC-AC-MR99B s očakávanou molekulovou hmotnosťou (2299,1 uma, obr. 65) podľa spektra na obr. 66 (iónová obálka) a 67 (transformované spektrum).
Podobným spôsobom môžu byť konjugované ostatné zlúčeniny, ktoré majú pomocnú vetvu amínového typu. Ako príklad sa uvádza OM-197-MC-AP, OM-197-MP-AC, OM-212-AH1, OM-197-MC-Gly, OM-197-MC-Lys, ΟΜ-197-Lys-AC alebo ΟΜ-197-Asp-AC.
Príklad 3.10
Konjugáty s ovalbumínom
Proteíny, ako napríklad ovalbumín, sú obzvlášť vhodné ku kopulácii redukčnou amináciou. Početné lyzíny obsiahnuté v sekvencií (20 lyzínov na ovalbumín) sú navyše miesta možnej konjugácie pre pseudodipeptidy nesúce pomocnú funkcionalizovanú vetvu s aldehydovou skupinou. Menením stechiometrie redukčnej aminácie (pomerov acylovaného pseudodipeptidu k proteínu) možno získať rôzne stupne konjugácie.
Pridá sa 1 mg čisteného OM-197-FV7 (0,928 pmol, 10 ekv.) do roztoku 4 mg ovalbumínu (0,09 pmol, 1 ekv.) rozpusteného v 5 ml vody. Roztok sa mieša 30 minút pri teplote okolia, potom sa uskutoční redukcia pridaním 46 pl nátriumkyanobórhydridu 1 M (2,89 mg, 50 ekv.). Roztok sa mieša dve hodiny pri teplote okolia. Reakčná zmes sa dialyzuje 24 hodín proti vode (dialyzačná kazeta 3,5 Kd, Slide-A-Lyzer, Pierce).
Vzhľadom na svoj tvar a vlastnú heterogenitu predstavuje ovalbumín mnohé analytické problémy. V dôsledku toho sa javí charakterizácia konjugátu ΟΜ-197-FV-ovalbumín hmotnostnou spektrometriou ako obzvlášť chúlostivá. Na zviditeľnenie konjugačnej reakcie sa uskutočnia analýzy SDS-PAGE na rôznych dávkach konjugátu ΟΜ-197-FV-ovalbumín. Ako ukazuje gél na obr. 68 (B) (gradient 4 až 20 % polyakrylamidu), je zjavná vysoká hmotnosť približne 3000 uma východiskového ovalbumínu (čiara 2) pre konjugáty OM-197- FV-ovalbumín (čiary 3, 4 a 5). Tento rozdiel hmotnosti tak vysvetľuje prítomnosť mnohých molekúl OM-197-FV na molekulu ovalbumínu. Analýzy LC/UV na fáze C4 potvrdzujú tento výsledok. Za týchto podmienok sa javí počiatočný ovalbumín zreteľne pri Rt = 11,3 min. a po konjugačnej reakcii pík zodpovedajúci východiskovému ovalbumínu úplne zmizne, čo potvrdzuje kvantitatívnu reakciu ovalbumínu. Konjugát ΟΜ-197-FV-ovalbumín nie je naopak eluovaný. Toto chromatografické správanie naznačuje taktiež prítomnosť viacerých molekúl OM-197-FV na ovalbumíne brániacich tak elúcii konjugátu za týchto podmienok.
Príklad 3.11
Konjugáty s hemaglutinínom H1N1
Proteín hemaglutinínu H1N1 je taktiež vybratým príkladom na uskutočnenie kopulácie medzi molekulami typu OM-197 a antigénom proteínového typu.
Pridá sa 1 mg čisteného OM-197-FV7 (0,928 pmol, 15 ekv.) do roztoku 5 mg H1N1 (hemaglutinín A/Beijing 262/95, Solvay Duphar, Weesp, HL) (0,06 μηιοί, 1 ekv.) rozpusteného v 8 ml vody. Roztok sa mieša 30 minút pri teplote okolia, potom sa uskutoční redukcia pridaním 46 μΐ nátriumkyanobórhydridu 1 M (2,89 mg, 50 ekv.). Roztok sa mieša dve hodiny pri teplote okolia. Reakčná zmes sa dialyzuje proti vode počas 24 hodín (dialyzačná kazeta 3,5 Kd).
Konjugát OM-197-FV-H1N1 sa analyzuje SDS-PAGE za podmienok použitých pre konjugát OM-197-FV-ovalbumín (gradient 4 až 20 % polyakrylamidu). Elektroforetické profily, získané pre východiskový proteín (čiara 6) a konjugát pred a po dialýze (čiary 8 a 7), sú na obr. 68 (C). Proteín H1N1 sa javí vo forme troch pruhov, z ktorých dva zodpovedajú podjednotkám HA1 a HA2 opísaným v literatúre (Swiss-Prot. Swiss Inštitúte of Bionformatics, Geneva). V prípade konjugátu OM-197-FV-H1N1 je zjavný rozdiel v hmotnosti pri každom pruhu, naznačujúci kopuláciu molekúl OM-197-FV na proteín H1N1.
Príklad 3.12
Konjugáty s AZT (obr. 69)
Do roztoku AZT (200 mg, 0,749 mmol) v pyridíne (4 ml) sa pridajú postupne anhydrid kyseliny jantárovej (150 mg, 0,5 mmol) a 4-dimetylaminopyridín (50 mg, 0,41 mmol). Mieša sa počas 12 hodín pri teplote 50 °C, pridá sa metanol (2 ml) a reakčná zmes sa ďalej mieša 15 minút pri teplote okolia. Reakčná zmes sa skoncentruje a produkt sa čistí okamžitou chromatografiou na silikagéli s použitím ako elučného činidla systému dichlórmetán/metanol 5:1. Získa sa produkt v podobe bielej pevnej látky (266 mg, 97 %) C14Hi7N5O7 (M = 367 g/mol), Rf = 0,25 (dichlórmetán/metanol 4/1).
Do roztoku takto získaného sukcinylderivátu AZT (60 mg, 0,163 mmol) v tetrahydrofúráne (3 ml) sa pri teplote 0 °C v prostredí argónu postupne pridá trietylamín (24 μΐ, 0,172 mmol) a etylchlórmravčan (14 μΐ, 0,172 mmol). Rýchlo sa vyzráža trietylamínchlórhydrát. Po 40 minútach miešania sa pridá pri teplote 0 °C roztok aminokaproylderivátu (príklad 2.16) (160 mg, 0,163 mmol) v systéme dimetylformamid/voda 9 : 1 (10 ml) obsahujúcom trietylamín (24 μΐ, 0,172 mmol). Reakčná zmes sa mieša 15 minút pri teplote 0 °C, potom cez noc pri teplote okolia pred odparením za zníženého tlaku. Surový produkt sa vyberie do dichlórmetánu (15 ml a vody (5 ml). Organická fáza sa oddelí. Vodná fáza sa okyslí 10 % kyselinou citrónovou a extrahuje sa dichlórmetánom (2x). Organické fázy sa spoja, sušia sa síranom horečnatým, prefiltrujú sa a skoncentrujú. Čistením chromatografiou na silikagéli s použitím systému dichlórmetán/metanol 9 : 1 ako elučného činidla, potom 7 : 1, sa zhromaždí zlúčenina konjugovaná s AZT (123 mg, 57 %) v podobe bielej pevnej látky. Rf = 0,2 (dichlórmetán/metanol 4:1).
CôsHngNgOie (M = 1329 g/mol), nájdené m/z = 1330,9 ([M+H]+).
Analytická HPLC: Tr = 24,437 min., stĺpec C18 Supelcosil (15 cm x 4,6 mm, 3 pm, 10 nm). Rozpúšťadlo A = 50 % acetonitril, 5 mM TBAP, rozpúšťadlo B = 90 % 2-propanol, 5 mM TBAP. Gradient: 25 až 100 % B v 37,5 min., detekcia U V pri 210 nm.
Preparatívna HPLC: na stĺpci C18 Kromasil (25 cm x 21 mm, 5 pm, 10 nm), rozpúšťadlo A = 50 % acetonitril, 5 mM TBAP, rozpúšťadlo B = 90 % 2-propanol, 5 mM TBAP. Elúcia produktu pri 80 % B. Konečná fáza: prechod na sodnú soľ Na+ SPE, fáza C18 Bondapack 15 pm, elúcia s 90 % 2-propanolom.
Konjugát s d4T (obr. 69)
Do roztoku d4T (200 mg, 0,89 mmol) v pyridíne (4 ml) sa pridajú postupne anhydrid kyseliny jantárovej (179 mg, 0,786 mmol) a 4-dimetylaminopyridín (109 mg, 0,89 mmol). Po 12 hodinách miešania pri teplote okolia sa pridá metanol (2 ml) a reakčné prostredie a ďalej mieša 15 minút pri teplote okolia, pričom sa odparí. Surový produkt sa čistí okamžitou chromatografiou na silikagéli s použitím systému dichlórmetán/metanol 5 : 1 ako elučného činidla. Získa sa produkt v podobe bielej pevnej látky (280 mg, 97 % teórie) Ci4Hi6N2O7 (M = 324 g/mol), Rf = 0,25 (dichlórmetán/metanol 4 : 1).
Do roztoku takto získaného sukcinylderivátu d4T (60 mg, 0,185 mmol) v tetrahydrofúráne (3 ml) sa pridá pri teplote 0 °C v prostredí argónu postupne trietylamín (27 μΐ, 0,194 mmol) a etylchlórmravčan (16 μΐ, 0,194 mmol). Rýchlo sa vyzráža trietylamínchlórhydrát. Po 40 minútach miešania sa pridá pri teplote 0 °C roztok aminokaproylderivátu (príklad 2.16) (181 mg, 0,185 mmol) v systéme dimetylformamid/voda 9 : 1 (10 ml) obsahujúcom trietylamín (27 μΐ, 0,194 mmol). Reakčná zmes sa mieša 15 minút pri teplote 0 °C, potom cez noc pri teplote okolia pred odparením za zníženého tlaku. Surový produkt sa vyberie do dichlórmetánu (15 ml) a vody (5 ml). Organická fáza sa oddelí. Vodná fáza sa okyslí 10 % kyselinou citrónovou a extrahuje sa dichlórmetánom (2x). Organické fázy sa spoja, vysušia sa síranom horečnatým, prefiltrujú sa a skoncentrujú. Čistením chromatografiou na silikagéli s použitím systému dichlórmetán/metanol 9:1, potom : 1 ako elučného činidla, sa zhromaždí zlúčenina konjugovaná s d4T (107 mg, 45 %) v podobe bielej pevnej látky, Rf = 0,2 (dichlórmetán/metanol 4:1).
C69H118N6O16, M = 1287 g/mol, nájdené m/z = 1288 (MH+), 1310-(Na).
Analytická HPLC: Tr = 24,455 min., stĺpec C18 Supelcosil (15 cm x 4,6 mm, 3 pm, 10 nm. Rozpúšťadlo A = = 50 % acetonitril, 5 mM TBAP, rozpúšťadlo B = 90 % 2-propanol, 5 mM TBAP. Gradient: 25 až 100 % B v
37,5 min., detekcia UV pri 210 nm.
Preparatívna HPLC: na stĺpci C18 Kromasil (25 cm x 21 mm, 5 pm, 10 nm), rozpúšťadlo A = 50 % acetonitril, 5 mM TBAP, rozpúšťadlo B = 90 % 2-propanol, 5 mM TBAP. Elúcia produktu pri 80 % B.
Konečná fáza: prechod na sodnú soľ Na+ SPE, fáza C18 Bondapack 15 pm, elúcia s 90 % 2-propanolom.
4. Séria príkladov: farmakologické štúdie zlúčenín podľa vynálezu (in vitro)
Príklad 4.1
Test stanovenia endotoxicity
Endotoxicita sa stanoví chromogénnym kinetickým testom Limulus Amoebocyte Lysatu (Charles River Endosafe produkt R1708K lot EK2251E). Test LAL sa používa na predvedenie slabej endotoxicity zlúčenín podľa vynálezu.
Biologický princíp tohto testuje založený na iniciácii bakteriálnymi endotoxínmi proenzýmu obsiahnutého v lyzáte amoebocytov Limulu (LAL), ktorý aktivuje kaskádu serínových proteáz. Za prítomnosti bezfarebného substrátu (peptid S-2834 kopulovaný na p-nitroanilín) vedie štiepenie chromofóru k uvoľňovaniu p-nitroanilínu (pNA) a k vývinu žltého zafarbenia, ktoré je možné sledovať spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 405 nm.
endotoxín
1. proenzým > enzým enzým
2. substrát > peptid + p-nitroanilín
Chromogénny kinetický test je založený na skutočnosti, že množstvo endotoxínu je nepriamo úmerné času, potrebnému na dosiahnutie optickej hustoty (D.O.) 0,2, Koncentrácia sa potom stanoví z kalibračnej krivky 0,005 až 50 EU/ml.
Produkty sa testujú v zriedení (5x, lOx, 50x, lOOx, 500x alebo lOOOx) roztoku produktu po 0,1 mg/ml. Výsledok LAL zodpovedá prvému zriedeniu, ktoré už nevyvoláva znovuzakrytie prebytku LPS.
Výsledky sa vyjadrujú v jednotkách EU (jednotka endotoxínu) v závislosti od medzinárodného štandardného etanolového roztoku (EC-6). Pre túto sériu predstavuje 1 EU približne 0,08 ng LPS E. coli 055:B5.
Tabuľka - Výsledky LAL pre rôzne acylované pseudodipeptidy, ktoré majú pomocné funkcionalizované vetvy zodpovedajúce všeobecnému vzorcu (I)
Produkt Zriedenie EU/mg produktu ng. ekvivalent LPS na mg produktu
OM-197-MC 50 88,6 7,4
OM-197-MC-MP 50 210,5 16,8
OM-197-FV6 50 540 43
OM-197-FV8 50 1820 145,6
OM-197-MC-FV5 50 49,3 3,9
OM-197-MC-FV7 10 <0,05 <0,004
OM-197-MP-AC (R/S,R) 25 0,14 0,011
OM-197-MP-AC (R,R) 25 0,15 0,012
OM-197-MP-AC (S,R) 25 <0,125 <0,01
OM-197-MC-AC 25 6,0 0,48
OM-197-N'C2-MC-AC 10 <0,5 <0,04
OM-197-N '(C 10-2OC8)-MC-AC 10 <0,5 <0,04
OM-197-MC-Succ 25 5,3 0,42
ΟΜ-197-Lys 25 3,0 0,24
OM-197-AP 10 <0,5 <0,04
OM-197-Asp 50 <2,5 <0,2
ΟΜ-197-Asp-AC 50 2307 184,6
Produkt Zriedenie EU/mg produktu ng. ekvivalent LPS na mg produktu
ΟΜ-197-Lys-AC 50 <2,5 <0,2
OM-197-MC-AC-Succ-AZT 10 1,34 0,11
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 10 1,05 0,08
OM-197-MC-AC-Succ 10 <0,05 <0,004
Všetky testované pseudodipeptidy majú slabú endotoxicitu. Pri väčšine produktov je táto endotoxicita pod prahom zistiteľnosti testom. Kvantitatívne zisťovanie endotoxicity je obmedzené skutočnosťou, že je nutné riediť vzorky na nájdenie naddávky. Aj tie najaktívnejšie zlúčeniny v tomto teste LAL majú endotoxickú aktivitu 5000-krát nižšiu ako LPS.
Testované pseudodipeptidy podľa vynálezu sú zaujímavé pre svoju slabú endotoxicitu a svoje biologické účinky.
Tabuľka - Výsledky LAL pre rôzne produkty so skúsenosťou imunizácie produktov konjugovaných na ovalbumín
Zloženie testovaných zmesí EU/mg ng. ekvivalent LPS na mg produktu
Ovalbumín <0,8 <0,064
Ovalbumín + OM-197-MP 5,8 0,480
OM-197 -FV-ovalbumín 99 8,210
Zdalo by sa, že kopulácia OM-197-FV na ovalbumín vyvolá zvýšenie zistenej aktivity LAL. Toto zvýšenie je možno spôsobené zmenou spôsobu, akým je molekula OM-197-FV podaná. Ostatné produkty ovalbumínovej série majú všetky rovnocenné aktivity LAL. Výsledky LAL sú veľmi premenlivé a rozdiely medzi skupinami 3 až 4 x nie sú významné. Maximálna aktivita LAL je 2,4 ng ekvivalent LPS na injekciu (25 pg/injekcia) pre kopulačné produkty, pre ostatné skupiny je maximálna aktivita LAL 0,012 ng ekvivalentu LPS na injekciu.
Tabuľka - Výsledky LAL pre rôzne produkty so skúsenosťou imunizácie produktov konjugovaných na hemaglutinín H1N1
Testovaná zlúčenina alebo zmes EU/mg ng.ekvivalent LPS na mg produktu
H1N1 2 0,17
ΝΙΝΙ +OM-197-MP 20 1,67
OM-197-FV-H1N1 15,6 1,30
Produkty série H1N1 majú všetky aktivity LAL rovnocenné. Výsledky LAL sú veľmi premenlivé a rozdiely medzi skupinami 3 až 4 x nie sú významné. Kopulácia nemá účinok na aktivitu LAL. Maximálna aktivita LAL je 0,008 ng ekvivalentu LPS na injekciu (5 pg/injekcia).
Tabuľka - Výsledky LAL pre rôzne produkty so skúsenosťou imunizácie produktov konjugovaných na peptid (NANP)6P2P30
Testovaná zlúčenina alebo zmes EU/mg ng. ekvivalent LPS na mg produktu
(NANP)6P2P30 16 1,33
(NANP)6P2P30 + IFA n.d.* n.d.*
(NANP)6P2P30 + MO-197-FV6 13 1
(NANP)6P2P30 + OM-197-MC 12 1
(OM-197-F V) i.2,3-(NANP)6P2P30 2 0,17
OM-197-F V-(NANP)6P2P30 9,4 0,78
OM-197-FV-(NANP)6P2P30 + OM-197-MP 17,4 1,45
* n.d. nedávkovateľné v LAL, ide o emulziu
Produkty série (NANP)6P2P30 majú všetky aktivity LAL rovnocenné. Výsledky LAL sú veľmi premenlivé a rozdiely medzi skupinami 3 až 4 x nie sú významné. Kopulácia nemá účinok na aktivitu LAL. Maximálna aktivita LAL je 0,03 ng ekvivalentu LPS na injekciu (20 pg/injekcia).
Príklad 4.2
Stanovenie proliferácie kmeňových buniek kostnej drene myší stimulované produktmi podľa vynálezu
4.2.1 Skúška proliferácie
Samce myší C57/BL6 vo veku 6 týždňov sa usmrtia inhaláciou oxidu uhličitého. Vyberú sa kosti končatín, bedrová kosť, stehenná kosť a holenná kosť. Dreň sa extrahuje z kostí injekciou prostredia Eagle modifikovaného Dulbeccom (prostredie DH) z končatín, ktoré boli predbežne odrezané. Kmeňové bunky sa premyjú a zavedú sa do suspenzie v prostredí DH doplneného 20 % zárodočného teľacieho séra (SVF). Koncentrácia buniek sa upraví na 500 000 buniek na ml.
Produkty v roztoku DH s prídavkom 20 % SVF, aminokyselín a antibiotík sa riedia v sériách priamo na mikrodoštičke. Produkty sa testujú trojnásobne a na každej mikrodoštičke sa urobí negatívna kontrola pozostávajúca zo samotného prostredia. Konečný objem v každej jamke je 100 μΐ.
Do zriedenia produktov sa pridá 100 μΐ bunkovej suspenzie a bunky sa inkubujú 7 dní v parnom kúpeli pri teplote 37 °C v prostredí s 8 % oxidu uhličitého. Proliferácia sa stanoví mierou oxidácie chromogénneho substrátu XTT (2,3-bis[2-metoxy-4-nitro-5-sulfofenyl]-2H-tetrazólium-5-karboxanilid) v mitochondriách živých buniek.
Ku koncu inkubácie sa do každej jamky pridá 50 μΐ roztoku substrátu XTT (1 mg/ml XTT + 0,008 mg/ml fenazinmetosulfátu). Inkubuje sa osem hodín pri teplote 37 °C v parnom kúpeli obsahujúcom 8 % oxidu uhličitého, mikrodoštičky sa presvietia na spektrofotometri pri 492 nm proti referenčnej vlnovej dĺžke 690 nm.
Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± smerodajná odchýlka vo forme krivky odozvy na dávku. Graficky sú tiež znázornené hodnoty negatívnej kontroly zložené z prostredia DF (stred ± smerodajná odchýlka).
Z krivky odozvy na dávku sú vypočítané 3 jednotlivé body:
Max: maximálna amplitúda krivky a zodpovedajúca koncentrácia
EC50: koncentrácia zodpovedajúca 50 % maximálnej amplitúdy
Min: prvá koncentrácia spôsobujúca významnú proliferáciu zodpovedajúcu slepá + 3x odchýlka
Koncentrácia zodpovedajúca EC50 a min sa stanoví zo segmentov vpravo týkajúcich sa rôznych bodov krivky. Ak krivka nedosiahne maximum, ale trvalo stúpa pre vyššie testované koncentrácie, je pred hodnotami „Max“ a „ECO“ uvedená značka „>“.
Ak krivka neklesne pod medzu slepá + 3x odchýlka, je minimálna koncentrácia udaná ako „<“ najnižšia testovaná koncentrácia.
4.2.2 Prezentácia výsledkov
Proliferácia kmeňových buniek kostnej drene vyvolaná acylovanými pseudodipeptidmi s pomocnou funkcionalizovanou vetvou
Obr. 70 ukazuje aktivitu rôznych acylovaných pseudodipeptidov a ukazuje vplyv funkcionalizovanej pomocnej vetvy na kapacitu vyvolania proliferácie kmeňových buniek kostnej drene myší.
Niektoré acylované pseudodipeptidy sú schopné vyvolať vyššiu proliferáciu, ako je proliferácia vyvolaná kladnou kontrolou, zloženou z LPS a E. coli. Minimálna koncentrácia produktu, schopná vyvolať významnú proliferáciu, je významnejšia ako proliferácia kladnej kontroly. Táto minimálna koncentrácia produktu je silno ovplyvnená funkcionalitou pomocnej vetvy.
Obr. 71 ukazuje aktivitu acylovaných pseudodipeptidov kopulovaných na drogu. Táto aktivita dokazuje, že cez kopuláciu si zachovávajú produkty časť svojej aktivity. Nie je možné rozlíšiť medzi aktivitou vlastnou a aktivitou pochádzajúcou z kopulácie väzby esteru intracelulámymi esterázami. Protivírusové pôsobenie týchto produktov má sklon dokázať, že aspoň časť esterových väzieb je rozštiepená. Nech už je mechanizmus akýkoľvek, konzervácia biologickej aktivity dokazuje celý záujem tejto asociácie —> protivírusová aktivita + aktivita produktu.
Tabuľka - Výsledky ukazujúce vyvolanie proliferácie kmeňových buniek kostnej drene rôznymi acylovanými pseudodipeptidmi s funkcionalizovanou pomocnou vetvou všeobecného vzorca (I)
Produkt Maximálna amplitúda kone. D.O./pg/ml EC50 amplitúda kone. D.O./pg/ml Minimálna amplitúda kone D.O./pg/ml
Milieu DH (kontrola negatívna) 0,67 ± 0,04
LPS E. coli (kontrola pozitívna) 1,72/16 1,19/1,2 0,80 / 0,06
OM-197-MC 1,75/64 1,21 /19,4 0,80 /1,25
OM-197-MC-MP > 1,60/> 160 > 1,13/>6,5 0,80 / 0,77
OM-197-FV6 1,52/50 1,10/5,7 0,80/1,60
OM-197-FV8 1,07/25 0,87/1,8 0,80/1,24
Produkt Maximálna amplitúda kone. D.O./pg/ml EC50 amplitúda kone. D.O./pg/ml Minimálna amplitúda kone D.O./pg/ml
OM-197-MC-FV5 1,75/50 1,21/32,0 0,80/8,20
OM-197-MC-FV7 > 1,83/>100 >1,25/>33,1 0,80 / 6,58
OM-197-MP-AC (R/S,R) 2,12/25 1,39/3,1 0,80/0,71
OM-197-MP-AC (S,R) 1,22/6,25 0,94/2,62 0,80/1,17
OM-197-MC-AC 1,62/50 1,15/31,0 0,80 / 0,92
OM-197-N'C2-MC-AC 0,75/1,56 0,71 / nd 0,80/nd
OM-197-N '(C 10-2OC8)-MC-AC 0,75 / 6,25 0,71 / nd 0,80 / nd
OM-197-MC-Succ 2,16/50 1,41/24,7 0,80 / 2,95
ΟΜ-197-Lys 1,56/25 1,11/3,3 < 0,86 / < 0,39
OM-197-AP 1,49/25 1,08/2,2 0,80/0,41
ΟΜ-197-Asp 1,22/25 0,94 / 5,0 0,80/1,89
ΟΜ-197-Asp-AC 1,33/50 0,10/2,8 0,80/1,27
ΟΜ-197-Lys-AC > 2,02 / > 50 >1,34/>14,6 0,80 / 0,90
OM-197-MC- AC-Succ-AZT 1,08/12,5 0,87/3,3 0,80/2,11
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 1,40/50 1,03/25,2 0,80/2,81
OM-197-MC-AC-Succ > 1,65/> 100 > 1,16/33,7 0,80/2,04
nd = nestanoviteľné
Všetky acylované pseudodipeptidy podľa vynálezu zo zlúčenín so skrátenými reťazcami sú schopné vyvolávať významnú proliferáciu kmeňových buniek kostnej drene.
Príklad 4.3
Stanovenie produkcie oxidu dusíka myšími makrofágami stimulovanými produktmi podľa vynálezu
4.3.1 Skúška produkcie oxidu dusíka
Samce myší C57/BL6 vo veku 6 týždňov sa usmrtia inhaláciou oxidu uhličitého. Vyberú sa kosti končatín, panva, stehenná kosť a holenná kosť. Dreň sa extrahuje z kosti injekciou prostredia Eagle modifikovaného Dulbeccom (prostredie DH) z končatín, ktoré boli predbežne odrezané. Kmeňové bunky sa premyjú a suspendujú (koncentrácia buniek približne 40 000 buniek/ml) v prostredí DH, doplnenom 20 % konského séra (SH) a 30 % supematantu L929. L929 sú líniou myších fibroblastov, ktorých supematant je bohatý na rastový faktor pre makrofágy (M-CSF). Bunková suspenzia sa rozdelí do Petriho misiek, ktoré sa inkubujú 8 dní pri teplote 37 °C v prostredí s 8 % oxidu uhličitého v parnom kúpeli.
Po 8 dňoch sa z kmeňových buniek vydelia zrelé makrofágy. Makrofágy sa oddelia priechodom za studená, premyjú sa a resuspendujú sa v prostredí DH, doplnenom 5 % teľacieho zárodočného séra (SFV), aminokyselinami a antibiotikami. Koncentrácia buniek sa upraví na 70 000 buniek na ml.
Produkty, rozpustené v prostredí DH, doplnenom 5 % SFV, aminokyselinami a antibiotikami, sa zriedia v sériách priamo na mikrodoštičkách. Produkty sa testujú trojnásobne a každá mikrodoštička obsahuje negatívnu kontrolu, ktorou je samotné prostredie. Konečný objem jamiek je 100 μΐ. Pridá sa 100 μΐ bunkovej suspenzie do zriedenia produktov a bunky sa inkubujú 22 hodín pri teplote 37 °C v prostredí obsahujúcom 8 % oxidu uhličitého v parnom kúpeli. Ku koncu inkubácie s produktmi, 100 ml supematantu sa vyberie a koncentrácia dusitanu sa stanoví Griessovou reakciou. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ Griessovho reakčného činidla (5 mg/ml sulfanilamidu + 0,5 mg/ml N-(l-naftyletylénu diamín)chlórhydrátu v 2,5 % vodnom roztoku kyseliny fosforečnej. Mikrodoštičky sa presvietia na spektrofotometri pri 562 nm proti referenčnej vlnovej dĺžke 690 nm. Koncentrácia dusitanu je úmerná koncentrácii produkovaného oxidu dusíka. Koncentrácia nitrátu sa stanoví z kalibračnej krivky.
Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± smerodajná odchýlka vo forme kriviek závislosti dávka/odozva.
Z kriviek odozvy na dávku sú vypočítaní 3 jednotlivé body: Max: maximálna amplitúda krivky a zodpovedajúca koncentrácia EC50: koncentrácia zodpovedajúca 50 % maximálnej amplitúdy Min: prvá koncentrácia spôsobujúca významnú proliferáciu zodpovedajúca slepá + 3x odchýlka.
Koncentrácia zodpovedajúca EC50 a min sa stanoví zo segmentov vpravo týkajúcich sa rôznych bodov krivky. Ak krivka nedosiahne maximum, ale trvalo stúpa pri vyšších testovaných koncentráciách, je pred hodnotami „Max“ a „ECO“ uvedená značka „>“. Ak krivka neklesne pod medzu slepá + 3x odchýlka, je minimálna koncentrácia udaná ako „<“ najnižšia testovaná koncentrácia.
4.3.2 Prezentácia výsledkov
Produkcia oxidu dusíka myšími makrofágmi, vyvolaná acylovanými pseudodipeptidmi s funkcionalizovanou pomocnou vetvou
Obr. 72 ukazuje aktivity rôznych acylovaných pseudodipeptidov a objasňuje vplyv funkcionalizovaných pomocných vetiev na kapacitu vyvolania proliferácie kmeňových buniek kostnej drene myší.
OM-197-MP-AC (R/S,R) je schopný vyvolať proliferáciu vyššiu, ako je vyvolaná pozitívnou kontrolou zloženou z LPS a E. coli.
Minimálna koncentrácia produktu, schopná vyvolať významnú proliferáciu, je však významnejšia ako pozitívna kontrola. Produkcia oxidu dusíka stimulovanými myšími makrofágmi, acylovanými pseudodipeptidmi, je silno ovplyvnená funkcionalitou pomocnej vetvy.
Obr. 73 ukazuje aktivity rôznych acylovaných pseudodipeptidov kopulovaných na drogu. Táto aktivita ukazuje, že napriek kopulácii si zlúčeniny zachovávajú časť svojej aktivity. Nie je možné rozlíšiť medzi aktivitou vlastnou a aktivitou pochádzajúcou z kopulácie väzby esteru intracelulámymi esterázami. Protivírusové pôsobenie týchto produktov má sklon dokázať, že aspoň časť esterových väzieb je rozštiepených. Nech už je mechanizmus akýkoľvek, konzervácia biologickej aktivity dokazuje celý záujem tejto asociácie -> protivírusová aktivita + aktivita produktu.
Tabuľka
Výsledky ukazujúce vyvolanie produkcie oxidu dusíka myšími makrofágmi prostredníctvom rôznych acylovaných pseudodipeptidov s funkcionalizovanou pomocnou vetvou všeobecného vzorca (I)
Produkt Maximálna amplitúda kone. μΜ dusitanu/ μg/ml EC50 amplitúda kone. μΜ dusitanu/ pg/ml Minimálna amplitúda kone. μΜ dusitanu/ pg/ml
Milieu DH (kontrola negatívna) 0,29 ± 0,09
LPS E. coli (kontrola pozitívna) >10,37/>50 >5,33/>0,01 < 1,41 /<0,001
OM-197-MC 7,16/51 3,73/1,23 0,57/0,15
OM-197-MC-MP 7,94/51 4,12/1,18 0,57/0,11
OM-197-FV6 7,48/25,6 3,89 /1,49 0,57 / 0,20
OM-197-FV8 8,00/51 4,15/7,89 0,57/1,45
OM-197-MC-FV5 5,64/16 2,97/2,56 0,57 / 0,67
OM-197-MC-FV7 6,17/>25,6 3,23/>3,70 0,57/0,36
OM-197-MP-AC (R/S,R) > 14,09/> 100 > 7,19/> 10,69 0,57 /1,04
OM-197-MP-AC (S,R) 7,56/40 3,93/3,28 0,57/0,59
OM-197-MP-AC (R,R) >8,31/>100 > 4,3/> 15,32 0,57/3,35
OM-197-MC-AC 7,08/25 3,69/4,91 0,57/0,91
OM-197-N'C2-MC-AC > 0,24 / 200 nd nd
OM-197-N '(C 10-2OC8)-MC-AC > 0,96/> 100 0,63/61,05 0,57 / 54,3
OM-197-MC-Succ 5,84/16 3,07 / 0,89 0,57 / 0,22
ΟΜ-197-Lys 5,50/40 2,90 / 2,23 0,57 / > 0,47
OM-197-AP > 9,64 / > 100 >4,97/> 13,69 0,57/1,87
ΟΜ-197-Asp 8,26/51 4,28 / 0,95 0,57/0,086
ΟΜ-197-Asp-AC > 7,97/> 100 >4,13/>7,04 0,57 / 2,00
ΟΜ-197-Lys-AC > 7,04 / > 50 > 3,67/> 11,06 0,57 /1,46
OM-197-MC-AC-Succ-AZT > 2,53/> 100 > 1,41/>74,89 0,57/55,98
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 4,17/12,5 2,23/1,15 0,57/0,56
OM-197-MC-AC-Succ 6,17/> 16 3,23 / 0,72 0,57 / 0,28
nd = nestanoviteľné
Všetky acylované pseudodipeptidy podľa vynálezu zo zlúčenín so skrátenými reťazcami (okrajová produkcia pre OM-197-N'(C10-2OC8)-MC-AC) sú schopné vyvolávať významnú produkciu oxidu dusíka myšími makrofágmi.
Príklad 4.4
Test diferenciácie dendritických buniek
Vyhodnocuje sa kapacita produktu podľa vynálezu vyvolávať zrenie predendritických buniek na bunky dendritické. Merajú sa nasledujúce parametre: začlenenie Dextránu-FITC a expresia povrchových buniek CD83.CD86.
4.4.1 Protokol pokusov
Mononukleové bunky periférnej krvi sa izolujú z nárazníkového povlaku („buffy coats,,) zdravých darcov. Monocyty vyčistené adhéziou sa vnesú do suspenzie v prostredí RPMI-1640, obsahujúcom 10 % teľacieho zárodočného séra (SVF), GM-CSF a IL-4 po 10 ng/ml v pomere 1 x 106 buniek/ml. Bunky sa rozdelia do Petriho misiek po 10 x 106 buniek na misku a kultivujú sa šesť dni pri výmene prostredia po troch dňoch. Takto získané bunky sú pomenované predendritické (DC-6). Zrenie predendritických buniek na bunky dendritické sa uskutočňuje inkubáciou s riedením produktov alebo LPS (pozitívna vzorka) počas ďalších troch dní (pozri podprodukty). Deviaty deň (DC-9) sa bunky zhromaždia a vyhodnotia sa rôzne indikatívne parametre zrelosti dendritických buniek: expresia povrchových buniek CD83, CD86 a kapacita začlenenia Dextrán-FITC. Všetky tieto parametre sa analyzujú FACS EPICS-XL-MCL (Coulter Immunology, Hialeah, Fínsko).
Expresia povrchových buniek je vyjadrená percentom strednej fluorescencie buniek stimulovaných LPS (kladná vzorka): začlenenie Dextránu je vypočítané ako pomer k bunkách ponechaným v prostredí, vyjadrený v percentách.
Produkty: materské roztoky OM-197-MC, OM-197-FV6 a OM-197-MP-AC (R/S,R) sa pripravia z 0,5 mg/ml v 0,9 % roztoku chloridu sodného vo vode, doplneného 0,1 % trietanolamínu. Roztoky sa inkubujú 20 minút pri teplote 37 °C, intenzívne sa miešajú 3 minúty, potom sa zriedia na 100 pg/ml v kultivačnom prostredí RPMI 1640 a použijú sa v zriedení od 10 pg/ml až 0,03 pg/ml.
Referenčný produkt: lipopolysacharid E. coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI, USA) zásobný roztok 5 mg/ml v PBS. Medziproduktový roztok sa pripraví po 100 pg/ml v kultivačnom prostredí RPMI 1640. Testované koncentrácie sú zriedenie od 1 pg/ml až 0,03 pg/ml.
V inej sérii skúšok sa lyofilizujú všetky acylové pseudodipeptidy a rozpustia sa priamo v apyrogénnej vode. Rôzne produkty, ako je kontrolná LPS, sa testujú pri koncentrácii 10 pg/ml. Výsledky sú vyjadrené v percentách dendritických buniek a priemerom fluorescencie pre fagocyt dextránu alebo expresiou signálneho znaku povrchu CD86. Tieto výsledky sú stredom dvoch až šiestich skúšok podľa produktov.
4.4.2 Vyhodnotenie výsledkov
Nezrelé dendritické bunky (DC-6) pochádzajúce z diferenciácie monocytov, konjugovaným účinkom GM-CSF a IL-4, sú schopné začleniť Dextrán-FITC. Počas zrenia strácajú bunky schopnosť začleňovať Dextrán-FITC. Analýzy sa uskutočňujú v štádiu diferenciácie DC-9.
Výsledky (obr. 74) sú vyjadrené v percentách začlenenia Dextránu-FITC, pozorovaného v nestimulovaných bunkách inkubovaných so samotným prostredím. Bunky spracované s LPS alebo OM-197-MP-AC (R/S,R) nekonzervujú iba 15 % až 22 % fagocytózy, je potrebné aspoň 1 pg/ml OM-197-MP-AC (RJS,R) na zavedenie maximálneho zmenšenia začlenenia Dextránu, takže 0,1 pg/ml LPS vyvolávajú ekvivalentné zníženie. Nutné sú 10 pg/ml OM-197-MC na zavedenie 22 % zmenšenia fagocytózy. Okrem toho pre koncentráciu nižšiu ako 3 pg/ml nie je žiadny účinok OM-197-MC na fagocytózu. OM-197-FV8 nemá, ako sa zdá, žiadny vplyv na zrenie dendritických buniek.
Expresia kostimulačných povrchových molekúl je ďalším kritériom zrelosti DC. Testuje sa zvýšenie expresie CD83 a CD86 (obr. 75 a 76). Výsledky sú vyjadrené v percentách strednej fluorescencie v pomere k expresii týchto signálnych znakov zavedených LPS. Tieto výsledky dokonale zosilňujú výsledky získané fagocytózou. OM-197-MP-AC (R/S,R) indukuje zvýšenie expresie povrchových molekúl od 0,1 pVml, zatiaľ čo OM-197-MC je potrebné najmenej 1 pg/ml na začiatok zvyšovania expresie CD83 a CD86. OM-197-FV6 nemá vplyv na expresiu povrchových molekúl charakteristických pre dendritické bunky.
Tieto výsledky ukazujú veľmi rôzne správanie acylovaných pseudodipeptidov v závislosti od ich pomocnej vetvy. OM-197-MP-AC (R/S,R) majú mimoriadnu kapacitu na zavádzanie diferenciácie buniek DC-6 a DC-9 už od 0,1 pg/ml, zatiaľ čo potrebné sú koncentrácie vyššie ako 1 pg/ml, aby OM-197-MC začal indukovať túto diferenciáciu, ktorú OM-197-FV6 vôbec nemá.
Fagocytóza dextránu vyznačená fluoresceínom a expresiou CD86 po stimulácii predendritických buniek (DC6) acylovanými pseudodipeptidmi s funkcionalizovanou pomocnou vetvou všeobecného vzorca (I). Diferenciácia predendritických buniek oproti zrelým dendritickým bunkám.
Produkt Dextrán % CD/fluorescencia CD86 % CD/fluorescencia
37 °C 18,3/0,9 33,5/2,9
LPS E. coli 100 / 7,3 100/7,3
OM-197-FV6 84,5 / 6,3 62,9/4,9
OM-197-MC-FV5 86,5 / 6,4 74,5 / 5,6
OM-197-MP-AC (R/S,R) 84,6 / 6,3 80,0 / 6,0
OM-197-MC-AC 68,3 / 5,2 67,4 / 5,2
OM-197-MC-Succ 35,5/3,0 34,9 / 3,0
Produkt Dextrán % CD/fluorescencia CD86 % CD/fluorescencia
ΟΜ-197-Lys 12,1/0,5 21,2/2,1
OM-197-AP 56,1 /4,4 62,0 / 4,8
ΟΜ-197-Asp 26,4 / 2,4 29,0 / 2,6
ΟΜ-197-Asp-AC 22,0/22,1 26,7 / 2,4
ΟΜ-197-Lys-AC 92,2 / 6,8 93,5 / 6,9
OM-197-MC-AC-Succ-AZT 62,2/4,8 81,4/6,1
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 11,6/0,5 25,9/2,4
Pri koncentrácii 10 pg/ml sú mnohé acylované pseudodipeptidy schopné zaviesť diferenciáciu predendritických buniek oproti bunkám dendritickým. Funkcionalita prinášaná pomocnými vetvami moduluje tieto kapacity k aktivovaniu predendritických buniek.
Acylované pseudodipeptidy OM-197-MC-AC-Succ-AZT kopulované na drogu predstavujú významnú kapacitu na zavádzanie diferenciácie dendritických buniek. Účinok tvorenia acylovaných pseudodipeptidov je obzvlášť významný pre kapacitu zavádzania diferenciácie predendritických buniek od dendritických. Niektoré produkty majú veľmi rozdielne aktivity po rozpustení za prítomnosti alebo za neprítomnosti 0,1 % TEOA.
Príklad 4.5
Analýza indukcie proteínu MxA v dendritických bunkách
Vyhodnocuje sa kapacita produktov podľa vynálezu zavádzať produkciu protivírusového proteínu MxA predendritickými bunkami. Produkcia MxA bunkami sa meria po elektroforetickom oddelení SDS-PAGE spôsobom Westem Blotting.
4.5.1 Protokol pokusov
Dendritické bunky v štádiu DC-6, získané ako je opísané, sa stimulujú IFN-a(500 U/ml), LP (1 pg/ml), TRANCE (100 ng/ml) CD40L (1 pg/ml), OM-197-MC-AC (1 pg/ml) alebo OM-197-FV6 (1 pg/ml) počas 48 hodín. Extrakcia a analýza proteínov sa uskutoční takto: bunky sa rekuperujú, potom sa 3x premyjú PBS (fosfátom pufrovaná soľanka) a lyžujú sa v pufre 100 mM Tris-HCl, 150 mM chloridu sodného, 5 mM EDTA, 1 % Triton-100 obsahujúceho 1 mM PMSF (fenylmetyl-sulfonylfluorid) a 1 pg/ml pepstatínu ako inhibítora proteáz. Lýza sa uskutočňuje v pomere 106 buniek na 100 pl pufra, 5 x koncentrovanom obsahujúcom 60 mM Tris-HCl (hodnota pH 6,8), 10 % glycerolu, 2 % SDS, 14,4 mM 2-merkaptoetanolu a 0,1 % brómfenolu. Vzorky sa zahrejú na teplotu 95 °C počas 5 minút v uzavretých Ependorfových bankách. Elektroforéza sa uskutoční na minigéli 10 cm x 10 cm pri 12 % akrylamidu s množstvom vzorky ekvivalentnom s rovnakým počtom buniek. Migrácia sa uskutočni nasledujúcim pufrom: 25 mM Tris, 192 mM glycínu, 0,1 % SDS, hodnota pH 8,3.
Prenos na membránu: proteiny sa prenesú gélom SDS-PAGE na nitrocelulózovú membránu (prenášači pufor: 25 mM Tris, 192 mM glycínu, 20 % metanolu, pH 8,3).
Inkubácia s protilátkami: prenos sa overí vyfarbením membrány červeňou Ponceau. Nešpecifické miesta na membráne sa blokujú 5 % odstredeného mlieka v TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM chloridu sodného, hodnota pH 7,4) počas jednej hodiny pri teplote okolia. Membrána sa inkubuje v roztoku monoklonálnych protilátok anti-MXA (kloň 143) zriedenom 1 : 100 (objemovo) v systéme TBS-mlieko. Membrána sa premyje 3 x TBS-0,1 % Tween 20. Membrána sa inkubuje druhou protilátkou anti-myšou spojenou s peroxidázou (HRP, Sigma) zriedenou 1 : 1000 (objemovo). Membrána sa premyje 3 x TBS-Tweenom. Pásy, obsahujúce MxA, sa po inkubácii membrány vyberú chemiluminiscenčnými reagenciami (ECL, Amerham Pharmacia). V tomto systéme katalyzuje HRP chemiluminiscenčnú reakciu založenú na luminole, ktorý je možné zistiť na filme.
4.5.2 Výsledky
DC-6 sa stimulujú počas 0, 2,4, 24 hodín (obr. 77) alebo 48 hodín (obr. 78) takto: (poloha vo Westem Blot)
obr. 77 obr. 78
Vzorka skúška: kultivačné prostredie GMCSF/IL-4 0 2 4 24 48 hodín
1 + NaCl (negatívna kontrola) 1 2 3 4 1
2 + LPS (1 pg/ml) 5 6 7 2
3 + IFN-a (500 U/ml) (kladná kontrola) pre indukciu proteínu MxA 8 9 10 3
4 + TRANCE (100 ng/ml) 4
5 + CD40L (1 pg/ml) 5
6 + OM-197-MP-AC (1 pg/ml) 1 1 1 2 13 6
7 + OM-197-FV6 (1 pg/ml) 1 4 1 5 16 7
Pruhy Westem Blot, znázornené na obr. 77 a 78, ukazujú produkciu MxA počas času: významné zvýšenie proteínu MxA je vyvolané produktmi OM-197-AC5 a OM-197-FV6 po 24 hodinách (obr. 77) a po 48 hodinách (obr. 78). Táto produkcia MxA je ekvivalentná s produkciou vyvolanou kladnou kontrolou LPS alebo IFN-α. Táto produkcia je väčšia ako produkcia vyvolaná negatívnou kontrolou, TRANCE (cytokín rodiny TNF-α, ktorý vyvoláva tiež zrenie dendritických buniek) alebo CD40L (iné činidlo zrenia dendritických buniek). Zlúčeniny podľa vynálezu OM-197-MP-AC a OM-197-FV6 majú protivírusové vlastnosti v dôsledku svojej schopnosti vyvolávať proteín MxA.
Príklad 4.6
Stanovenie kapacity zlúčenín podľa vynálezu aktivovať produkciu TNF-α mononukleovými bunkami ľudskej periférnej krvi
4.6.1 Protokol
Mononukleové bunky periférnej krvi sa izolujú z nárazníkového povlaku („buffy coats,,) zdravých darcov. Bunky nárazníkového povlaku sa vnesú do suspenzie a mononukleové bunky sa oddelia odstredením na gradiente Ficol-Pague (Amersham Pharmacie). Vyčistené mononukleové bunky sa resuspendujú v prostredí RPMI-1640 doplnenom 10 % teľacieho zárodočného séra (SVF), antibiotikami, merkaptoetanolom a L-glutamínom. Koncentrácia buniek sa nastaví na 2 x 106 živých buniek./ml.
Na mikrodoštičky sa vnesie 100 μΐ každého roztoku acylovaných pseudodipeptidov s funkcionalizo vaňou pomocnou vetvou za zriedenia 100, 10 a 1 pg/ml v prostredí RPMI 1640. Podmienky sa testujú na 3 vzorkách a každá doštička má zápornú (slepú) vzorku so samotným prostredím. Zriedenie LPS E. coli (1 až 0,00001 pg/ml) slúži ako kladná vzorka.
Do každej jamky, obsahujúcej zriedenie produktov alebo slepú vzorku, sa pridá 100 μΐ bunkovej suspenzie. Bunky sa inkubujú s produktmi 18 hodín v parnom kúpeli pri teplote 37 °C v prostredí obsahujúcom 5 % oxidu uhličitého.
Ku koncu inkubácie sa mikrodoštičky odstredia a supematanty sa zhromaždia a zmrazia sa na -80 °C vo forme podielov až do testu ELISA. Koncentrácia TNF-σ, produkovaná mononukleovými bunkami, sa stanoví chemiluminiscenciou ELISA (kit R&D QuantiGlo # QTA00). Štyrikrát zriedené supematanty sa vnesú do každej jamky mikrodoštičky, v ktorej sú uložené ľudské protilátky anti-TNF-σ. Mikrodoštičky sa inkubujú 4 hodiny pri teplote okolia. Po premytí sa ľudské protilátky anti-TNF-σ konjugujú na pridanú peroxidázu. Po dvojhodinovej inkubácii a intenzívnom premývaní sa pridá chemiluminiscenčný substrát a luminiscencia sa zaznamená počas 20 minút. Koncentrácia TNF-σ, obsiahnutého v supematante, sa stanoví z kalibračnej krivky zahŕňajúcej 7000 až 0,7 pg/ml.
Výsledky sú vyjadrené v pg/ml TNF-α Predkladané výsledky sú z reprezentatívnych skúšok aktivity acylovaných pseudodipeptidov.
4.6.2 Výsledky
Produkcia TNF-α vyvolaná acylovanými pseudodipeptidmi s funkcionalizovaňou pomocnou vetvou všeobecného vzorca (I) mononukleovými bunkami ľudskej periférnej krvi
Produkt 100 pg/ml 10 pg/ml 1 pg/ml
OM-197-MC 12 0 0
OM-197-MC-MP 72 0 0
OM-197-FV6 88 104 0
OM-197-FV8 252 100 12
OM-197-MC-FV5 116 104 0
OM-197-MC-FV7 76 80 0
OM-197-MP-AC (R/S,R) 160 156 244
OM-197-MP-AC (R,R) 84 88 0
OM-197-MP-AC (S,R) 80 124 488
OM-197-MC-AC 144 140 12
OM-197-N'C2-MC-AC 0 0 0
OM-197-N '(Cl 0-2OC8)-MC-AC 0 0 0
OM-197-MC-Succ 176 96 0
ΟΜ-197-Lys 20 164 284
SK 287514 Β6
Produkt 100 pg/ml 10 pg/ml 1 pg/ml
OM-197-AP 84 116 428
ΟΜ-197-Asp 80 28 0
ΟΜ-197-Asp-AC 132 172 20
ΟΜ-197-Lys-AC 256 184 232
OM-197-MC-AC-Succ-AZT 64 224 108
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 52 40 0
OM-197-MC-AC-Succ 40 32 0
Negatívna kontrola zložená z prostredia RPMI vyvoláva základnú produkciu TNF-apod medzou zistiteľnosti 0,7 pg/ml.
Produkcia TNF-α vyvolaná LPS E. coli mononukleovými bunkami ľudskej periférnej krvi
KPS E. coli v pg/ml
Produkt 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001
TN F-a (pg/ml) 404 436 346 276 132 0
Kladná kontrola zložená z LPS E. coli vyvoláva silnú produkciu TNF-α aj pri najnižších skúšaných koncentráciách.
Väčšina acylovaných pseudodipeptidov vyvoláva významnú produkciu TNF-α, aj keď táto produkcia zostáva nižšia ako produkcia kladnou kontrolou. Na vyvolanie významnej produkcie TNF-α sú tiež potrebné vyššie koncentrácie ako LPS.
Niektoré zlúčeniny, OM-197-MC a OM-197-MC-MP, vyvolávajú významnú produkciu, menovite pri 100 μ/ml. Aminoskupiny sú obzvlášť zaujímavé na vyvolanie produkcie TNF-α jednak zvyšovaním amplitúdy, jednak znižovaním minimálnej koncentrácie produktu potrebnej na vyvolanie významnej odozvy. Acylované pseudodipeptidy so skráteným reťazcom, OM-197-N'C2-MC-AC a OM-197-N'(C10-20C8)-MC-AC, produkciu TNF-α nevyvolávajú vôbec ani pri koncentrácii 100 pg/ml.
Príklad 4.7
Stanovenie kapacity zlúčenín podľa vynálezu inhibovať produkciu TNF-α mononukleovými bunkami ľudskej periférnej krvi lipopolysacharidom E. coli (LPS)
4.7.1 Protokol
Mononukleové bunky periférnej krvi sa izolujú z nárazníkového povlaku („buffy coats,,) zdravých darcov. Bunky nárazníkového povlaku sa vnesú do suspenzie a mononukleové bunky sa oddelia odstredením na gradiente Ficol-Pague (Amersham Pharmacie). Vyčistené mononukleové bunky sa resuspendujú v prostredí RPMI-1640 doplnenom 10 % teľacieho zárodočného séra (SVF), antibiotikami, merkaptoetanolom a L-glutamínom. Koncentrácia buniek sa nastaví na 2 x 106 živých buniek/ml.
Inhibícia produktmi sa stanoví preinkubáciou produktov s mononukleovými bunkami a prísadou po 1 hodine zriedenia v sériách LPS, vyvolávajúcich produkciu TNF-α. Inhibičná koncentrácia rôznych acylovaných pseudodipeptidov s íunkcionalizovanou pomocnou vetvou je 10 pg/ml. E. coli sa zriedi v sérii 1 až 0,00001 pg/ml (10-násobok).
Na mikrodoštičky sa vnesie 50 μΐ produktov zriedených na 10 pg/ml v prostredí RPMI 1640. Každá podmienka (produkt po 10 pg/ml + LPS zriedené E. coli) sa testuje na troch vzorkách a každá doštička má zápornú (slepú) vzorku so samotným prostredím. Zistenie TNF-α vyvolaného samotným LPS (bez inhibície) sa získa pridaním zriedenia LPS E. coli do prostredia RPMI.
Pridá sa 100 μΐ bunkovej suspenzie do každej jamky obsahujúcej zriedenie produktov alebo kontrol. Bunky sa inkubujú s produktmi počas jednej hodiny v hmlovej komore pri teplote 37 °C v prostredí obsahujúcom 5 % oxidu uhličitého.
Ku koncu inkubácie sa pridá 50 μΐ zriedenia v sérii LPS E. coli. Inkubácia mononukleových buniek produktom LPS sa sleduje počas 18 hodín. Na konci stimulácie buniek sa mikrodoštičky odstredia a supematanty sa zhromaždia a zmrazia sa na -80 °C vo forme podielov až do testu ELISA.
Koncentrácia TNF-α, produkovaná mononukleovými bunkami, sa stanoví chemiluminiscenciou ELISA (kit R&D QuantiGlo # QTA00). Štyrikrát zriedené supematanty sa vnesú do každej jamky mikrodoštičky, v ktorej sú uložené ľudské protilátky anti-TNF-α. Mikrodoštičky sa inkubujú štyri hodiny pri teplote okolia. Po premytí sa ľudské protilátky anti-TNF-α konjugujú na pridanú peroxidázu. Po dvojhodinovej inkubácii a intenzívnom premytí sa pridá chemiluminiscenčný substrát a luminiscencia sa zaznamená počas 20 minút. Koncentrácia INF-α obsiahnutého v supematante sa stanoví z kalibračnej krivky zahŕňajúcej 7000 až 0,7 pg/ml.
Inhibícia sa vyjadrí koncentráciou LPS E. coli, ktorá v koinkubácii s produktmi vyvolá produkciu 50 % TNF-α v porovnaní so vzorkou inkubovanou s iba RPMI. Čím väčšia je koncentrácia, tým viac je produkt inhibítorom. Táto koncentrácia sa vypočíta z hodnôt inhibície produkcie TNF-a = 100 - (produkcia TNF-α vyvolaná produktom a LPS)/(produkcia TNF-a vyvolaná samotným LPS) x 100. Na základe týchto údajov inhibície sa koncentrácia extrapoluje cez pravý úsek, ktorý spojuje dve zriedenia LPS obklopujúce 50 % inhibíciu.
Kapacita produktov na vyvolanie inhibície produkcie TNF-α prostredníctvom LPS je tiež charakterizovaná maximálnou inhibíciou. Koncentrácia LPS zodpovedajúca koncentrácii maximálnej inhibície (inhibícia >95 % je tiež reprezentatívna pre inhibičnú možnosť produktov). Výsledky sú vypočítané z jednej reprezentatívnej skúšky obsahujúcej všetky produkty.
4.7.2 Výsledky
Inhibícia vyvolaná acylovanými pseudodipeptidmi s funkcionalizovanou pomocnou vetvou všeobecného vzorca (I) produkcie TNF-α vyvolanej na mononukleových bunkách ľudskej periférnej krvi prostredníctvom LPS.
Produkt Inhibícia 50 % LPS v pg/ml Inhibícia max. v(%) Inhibícia max. LPS v pg/m
OM-197-MC 1 100 0,0043
OM-197-MC-MP 0,19 100 0,001
OM-197-FV6 > 1 100 0,014
OM-197-FV8 > 1 100 0,0033
OM-197-MC-FV5 > 1 100 0,016
OM-197-MC-FV7 > 1 100 0,00035
OM-197-MP-AC (R/S,R) > 1 100 0,00002
OM-197-MP-AC (R,R) 0,68 100 0,0013
OM-197-MP-AC (S,R) > 1 100 0,00002
OM-197-MC-AC 0,88 100 0,00003
OM-197-N'C2-MC-AC 0,0003 100 0,00001
OM-197-N '(C 10-2OC8)-MC-AC 0,0009 85 < 0,00001
OM-197-MC-Succ 1 100 0,018
ΟΜ-197-Lys 0,70 100 0,0055
OM-197-AP > 1 100 0,016
OM-197-Asp > 1 100 0,00036
ΟΜ-197-Asp-AC 0,29 100 0,0058
ΟΜ-197-Lys-AC > 1 100 0,001
OM-197-MC-AC-Succ-AZT 0,45 100 0,0005
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 0,64 100 0,00016
OM-197-MC-AC-Succ > 1 100 0,044
Negatívna kontrola zlúčenín prostredia RPMI vyvoláva základnú produkciu TNF-apod medzou zistiteľnosti 0,7 pg/ml.
Všetky acylované pseudodipeptidy sú schopné vyvolávať inhibíciu produkcie TNF-α indukovanú LPS E. coli. Koncentrácia produktu potrebná na túto inhibíciu je funkciou funkcionality pomocnej vetvy a dĺžky reťazcov mastnej kyseliny. Dokonca aj acylované pseudodipeptidy kopulované na drogu esterovou väzbou sú schopné vyvolať túto inhibíciu.
Príklad 4.8
Stanovenie schopnosti zlúčenín podľa vynálezu aktivovať cytotoxicitu buniek NK proti cieľovým bunkám línie K562
4.8.1 Protokol
Bunky PBMC sa izolujú z nárazníkového povlaku podľa protokolu opísaného v príklade 4.6. Po odstredení na Ficoll a po troch premytiach sa PBMC rozdelí do doštičky so šiestimi jamkami v pomere 3 x 106 buniek/ml v 3 ml prostredia RPMI obsahujúcom 10 % FCS a inkubujú sa jednak so samotným prostredím, jednak sa stimulujú IFNg-,η,., (1000 U/ml), LPS (1 pg/ml), OM-197-AC5 (1 pg/ml) alebo OM-197-FV6 (1 pg/ml). Bunky sa tak inkubujú počas 24 hodín. Bunky K562 (leukemická línia ľudských buniek, ATCC #CCL 243,
20110-2209 Manassas (VA), USA) sa udržujú v prostredí RPMI obsahujúcom 10 % FCS s 2 priechodmi za týždeň.
Na meranie cytotoxicity sa PBMC a bunky K562 premyjú 2x HBSS a resuspendujú sa do prostredia RPMI bez fenolovej červene, obsahujúceho 5 % FCS. PBMC sa prevedú na doštičku s 96 jamkami s kruhovým dnom na získanie pomeru PBMC: cieľ 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1 v objeme v 50 μΐ. Postupne sa pridá 5000 buniek K562 (cieľových) na jamku v 50 μΐ RPMI bez fenolovej červene. Konečný objem je 100 μΐ. Doštička sa odstredí na podporu kontaktu, načo sa inkubuje štyri hodiny pri teplote 37 °C. Cytotoxicita sa stanoví s použitím súpravy kit CytoTox 96 nerádioaktívnej založenej na meraní uvoľnenej LDH počas lýzy buniek (kit #G1780, šarža #124100, Promega, Madison, WI) podľa protokolu dodávateľa. Percento cytotoxicity sa vypočíta podľa vzorca
DOr562+PBMC OOpBMC DOk562 samotných % cytotoxicity -----------------------------------------------x 100.
DOiý2a t0;a| K562 ~ DOk562 samotných
4.8.2 Výsledky
Zlúčeniny OM-197-AC5 a OM-197-FV6 vyvolávajú aktivitu NK podobnú alebo mieme menšiu ako je vyvolaná testovanou LPS pri rovnakej koncentrácii (1 Mg/ml).
Absorbancia pri 490 nm
Stimuli pomer PBMC K562 + PBMC % toxicity
PBMC:K562 samotné
Milieu 20 : 1 0,141 1,5 0,5
10 : 1 0,073 1,55 7,7
5 : 1 0,055 1,4 0
IFN-γ 20 : 1 0,101 2,1 39,3
10: 1 0,064 1,9 29,4
5 : 1 0,035 1,68 17,9
LPS 20 : 1 0,170 2,2 42
10: 1 0,122 1,9 26
5 : 1 0,035 1,7 19
OM-197-MP-AC 20 : 1 0,084 1,8 22
10 : 1 0,084 1,66 13,7
5 : 1 0,027 1,5 7,4
OM-197-MC-FV6 20 : 1 0,110 2,1 38,8
10 : 1 0,087 1,65 12,9
5 : 1 0,079 1,4 0
kontroly kultivačné prostre- K562 samotné Totálna lýza
die samotné K562
Absorbancia pri 490 nm 0,408 1,35 3
Príklad 4.9
Stanovenie schopnosti zlúčenín podľa vynálezu na vyvolanie proliferácie myšacích lymfocytov
4.9.1 Opis skúšky
Slezinové bunky skupiny štyroch myší CBA sa zhromaždia, kultivujú sa za prítomnosti alebo za neprítomnosti adjuvantu OM-197-MP-AC (0,1 až 10 gg/ml). Proliferačná odozva týchto buniek sa vyhodnocuje podľa miery začlenenia tríciovaného tymidínu (3H-TdR) po jednom alebo dvoch dňoch kultivácie. Hodnoty uvedené v tabuľke predstavujú aritmetický priemer ± smerodajná odchýlka zo štyroch kultúr.
Adjuvant: materský roztok OM-197-MP-AC sa pripraví z 0,9 mg/ml vo vode na injekciu s prídavkom 0,1 % trietanolamínu.
Výsledky:
Produkt OM-197-MP-AC podporuje proliferáciu slezinových buniek in vivo. Tento jav, maximálny po 1 dni kultivácie, zvyšuje začleňovanie tymidínu 5 x pri koncentrácii 1 gg/ml a 12 x pri koncentrácii 10 gg/ml. Po jednodennej kultivácii vytvára produkt OM-197-MP-AC pri koncentrácii 1 gg/ml mitogénny efekt pôsobiaci rovnako silno ako Concavalin A pri 5 gg/ml (tabuľka I).
Tabuľka I - Miera proliferačnej odozvy slezinových myších buniek na adjuvant OM-197-MP-AC
Ajduvant Začlenenie 3H-TdR (CPM x 103)
Trvanie kultivácie (dni)
1 2
Bez adujvantu 6,4 ± 1,0 14,3 ± 0,8
OM-197-MP-AC (pg/ml) 0,1 8,7 ± 0,7 21,1 ± 1,3
1,0 34,3 ± 2,6 55,6 ± 5,2
10,0 79,0 ± 12,0 92,7 ± 8,8
Hodnoty uvedené v tabuľke sú aritmetickým stredom ± smerodajná odchýlka miery začlenenia štvornásobných kultúr. Concavalin A (5 pg/ml), použitý ako kladná kontrola, dáva hodnotu začlenenia tymidínu
37,5 ± 6,2 x 103 CPM po 1 dni kultivácie.
Príklad 4.10
Stanovenie protivírusového pôsobenia konjugátu zlúčenín podľa vynálezu na AZT a na d4T ako prodrogy
4.10.1 Protokol
Na testovanie protivírusového pôsobenia (anti-VIH) zlúčenín podľa vynálezu konjugovaných na AZT a prípadne na d4T sa použijú lymfocytové línie T MT-4 umŕtvené infikovaním HTLV, vírusu, ktorý vyvoláva formu leukémie. Tieto bunky majú tú vlastnosť, že neprežívajú infekciu HIV. Test je založený na ochrane produktom (ako je AZT) proti tomuto zničujúcemu pôsobeniu vírusu.
Produkty sa testujú sériami zriedenia produktu na doštičke s 96 jamkami. V hornej časti mikrodoštičiek sú testované produkty v rôznych koncentráciách s bunkami vírusu (trojnásobne), čo umožňuje stanoviť koncentráciu produktu, ktorý chráni bunky pred zničujúcim pôsobením vírusu. Koncentrácia, pri ktorej sa pozoruje 50 % zníženie počtu živých buniek, je IC50 produktu. Kvantifikácia živých buniek sa uskutočňuje pomocou MTT, čo je zlúčenina žltého tetrazolínu, ktorý je enzymaticky znížený (v mitochondriách živých buniek) proti formazánu, ktorý je červený. Jamky, ktoré obsahujú bunky v dobrom stave, majú farbu červenú, ak sú bunky mŕtve, žlté zafarbenie pretrváva. Miera optickej hustoty (OD) umožňuje kvantifíkovať tento jav.
Cytotoxicita produktov sa vyhodnocuje rovnakým spôsobom v spodnej časti doštičky, kde sa test uskutočňuje riedením inkubovaných produktov na bunkách bez vírusu, čo umožňuje stanoviť toxický účinok produktov na bunky. Udáva sa vo forme CC50, čo je koncentrácia, pri ktorej 50 % buniek umiera toxickým pôsobením produktu. Selektivita (údaj selektivity je SI) produktu je definovaná ako CC50/IC50. Tento parameter je významný pre dobrý produkt a zvýšené indikácie selektivity.
4.10.2 Výsledky
Produkty podľa vynálezu konjugované na AZT (OM-197-MC-Succ-AZT) alebo d4T majú protivírusové vlastnosti proti VIH 1IIIB a VIH 2 ROD. Výsledky dvoch experimentov (trojnásobných) na bunkách MT-4
Produkt Kmeň VIH IC50 (μΜ) CC50 (μΜ)
AZT VIH-1 IIIB 0,0029 187
OM-197-MC-Succ-AZT VIH-1 IIIB 0,0519 >94
D4T VIH-1 IIIB 0,107 321
OM-197-MC-Succ-d4T VIH-1 IIIB 0,963 +/-97
AZT VIH-2 ROD 0,0018 187
OM-197-MC-Succ-AZT VIH-2 ROD 0,061 >94
D4T VIH-2 ROD 0,22 321
OM-197-MC-Succ-d4T VIH-2 ROD 0,51 +/-97
Zlúčeniny podľa vynálezu konjugované s AZT alebo d4T majú protivírusové pôsobenie v modeli buniek MT-4. Jedna z výhod týchto prodrog je založená na lipidovej povahe konjugátov, ktoré umožňujú jednak zameranie zlúčenín proti infikovaným bunkám pri uvoľňovaní protivírusových zlúčenín do rezervoárov na vírus, jednak upravovať imunologickú aktivitu cieľových buniek.
Príklad 4.11
Stanovenie schopnosti zlúčenín podľa vynálezu aktivovať zrenie predendritických myších buniek na bunky dendritické
4.11.1 Protokol
Získavanie dendritických buniek: Z holenných a stehenných kostí myší (C57BI/6 vo veku 8 až 10 týždňov) sa odstráni kostná dreň. Suspenzia kostnej drene sa nechá prejsť bunkovým sitom 70 pm na získanie jednobunkovej suspenzie. Bunky kostnej drene resuspendované v prostredí Dulbeko modifikovanom Iscove 5 (IMDM) doplnenom 10 % (SVFi) teľacieho zárodočného séra inaktivovaného teplom a antibiotikami. Bunky sa inkubujú cez noc pri teplote 37 °C v prostredí oxidu uhličitého v parnom kúpeli v šesťjamkových mikrodoštičkách. Nasledujúci deň (deň 0) sa nepriľnuté bunky zhromaždia a premyjú. Živé bunky sa spočítajú vylúčením trypánovej modrej. Koncentrácia buniek sa nastaví na 2 x 105 buniek/ml v IMDM obsahujúcom 20 ng/ml GM-CSF myšieho rekombinantu (rmGM-CSF) a 20 ng/ml IL-4 myšieho rekombinantu (rmlL-4) a 10 inkubácia pokračuje. Tretí deň sa pridá čerstvý rmGM-CSF a rmlL-4 v koncentrácii 10 ng/ml. Šiesty deň sa nepriľnuté bunky zhromaždia, premyjú a spočítajú sa s vylúčením trypánovej modrej. Koncentrácia buniek sa nastaví na 2 x 105 buniek/ml v IMDM obsahujúcom rmGM-CSF a rmlL-4 10 ng/ml a inkubácia pokračuje. Na ôsmy deň sa nepriľnuté bunky pozostávajúce z nezrelých a zrelých dendritických buniek (CD-DM) zhromaždia a použijú sa na inkubáciu s produktmi.
Inkubácia s produktmi podľa vynálezu: bunky CD-DM sa inkubujú pri koncentrácii 5 x 105 buniek/ml v mikrodoštičkách s 24 jamkami za prítomnosti nasledujúcich aktivátorov: Kladné kontroly LPS Escherichia coli 0111:B4 po 100 ng/ml, záporné kontroly IMDM, a dve zlúčeniny podľa vynálezu OM-197-MC-FV5 a OM-197-MP-AC v koncentráciách 0,1, 1 a 10 pg/ml. Po 48-hodinovej inkubácii sa bunky zhromaždia a konzervujú sa pre analýzy tokovou cytometriou.
Analýza tokovou cytometriou: Bunky CD-DM sa premyjú PBS obsahujúcom 2 % SVFi a 0,01 % natriumazidu (pufor FACS). Inkubujú sa 30 minút na ľade s optimálnou koncentráciou anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII konjugovaných na FITC a anti-CD80 konjugovaným na peroxidázu. Bunky sa 3 x premyjú. Značenie anti-CD86 a anti-CD40 sa uskutoční inkubáciou buniek na ľade počas 30 minút s protilátkami osla anti-lg krýs konjugovanými na peroxidázu. Po inkubácii sa bunky premyjú a resuspendujú sa do pufra FACS.
Fluorescencia sa meria na tokovom cytometri FACScan™. Na vzorke sa analyzuje 15 000 prípadov.
4.11.2 Výsledky Expresia buniek
Povrchové znaky
CD40 CD80 CD86 MHCII
pg/ml MFI % buniek MFI % buniek MFI % buniek MFI % buniek
OM-197-MC-FV5 10 630 54 97 48 4097 51 1681 48
1 517 44 84 45 3888 43 1691 43
0,1 442 33 66 42 3437 37 1689 40
OM-197-MC-AC 10 605 55 97 53 4162 52 1622 49
1 493 48 73 47 3791 45 1607 45
0,1 446 34 66 41 3504 37 1597 38
LPS 0,1 539 51 95 51 3445 50 1546 51
Kontrola negatívna 0 431 29 74 41 3011 34 1553 41
MFI: stredná intenzita fluorescencie
Produkty podľa vynálezu sú schopné vyvolať zrenie predendritických buniek na bunky dendritické. Tieto výsledky získané in vitro súhlasia s pozorovaním in vivo na myšiach.
In vivo vyvolávajú ošetrenie i.v. a s.c. OM-197-MP-AC, 20 pg a 5 pg na myš zrenie a migráciu dentritických buniek v pomere marginálnej zóny (umiestnenie medzi pulpami červenými a bielymi) k bielej pulpe, 35 kde sú umiestnené bunky T. Imuno zafarbenie histologických rezov zo zvierat spracovaných produktmi podľa vynálezu ukazujú zafarbenie zrelých dendritických buniek a buniek T v bielej pulpe ako pri spracovaní LPS, zatiaľ čo pri neošetrených zvieratách sa nepozoruje ani migrácia, ani zrenie.
5. séria príkladov: farmakologické štúdie zlúčenín podľa vynálezu
Príklad 5.1
Vyhodnocovanie vlastností acylovaných pseudodipeptidov s funkcionalizovaňou pomocnou vetvou zmiešaných alebo kopulovaných s (NANP)6P2P30 na modeli imunizácie myší
5.1.1 Protokol skúšok
Antigén: Peptid (NANP)6P2P30 obsahuje opakovanú sekvenciu (NANP) Plasmodium falciparum a dve sekvencie toxínu tetanu (P2: 830-843 a P30: 947-967). O tomto peptide je známe, že je epitopom T-helperu a má schopnosť vyvolávať zvýšenú imunitnú dlhodobú odozvu za prítomnosti klasických adjuvantov. Peptid sa získa spôsobom opísaným v literatúre (Valmori a kol., J. Immunol. 149, str. 717 až 721, 1992). Materský roztok antigénu sa pripraví na 0,4 mg/ml v 0,9 % vodnom roztoku chloridu sodného, hodnota pH 8,0.
Adjuvanty: Materské roztoky acylovaných pseudodipeptidov (OM-197-MP, OM-197-FV6 a OM-197-MC) sa pripravia po 1 mg/ml v 0,9 % vodnom roztoku chloridu sodného s 0,1 % trietanolamínu. Kladná vzorka pozostáva z neúplného adjuvantu Freund (IFA de Difco, Detroit, MI, Sp. St. A.) a zápornou vzorkou je 0,9 % vodný roztok chloridu sodného.
V rámci tohto experimentálneho protokolu sú adjuvant a antigén formulované ako zmes alebo opísané konjugáty. Testujú sa dva typy konjugátov (OM-197-FV)n-(NANP)6P2P3o). Zodpovedajú rozdielnym stupňom konjugácie, buď 1, 2 alebo 3 molekuly OM-197-FV na molekulu peptidu (zmes monokonjugátov, bikonjugátov a trikonjugátov, n = 1, 2 a 3), alebo 1 molekuly OM-197-FV na molekulu peptidu (monokonjugát, n= 1).
Imunizácia: Myšie samice BALB/c vo veku 6 týždňov (6 myší v skupine) sa imunizujú vo dvoch opakovaniach, subkutánnymi injekciami do konca chvosta 0,1 ml. Pridané množstvá sú 20 pg antigénu a 50 pg adjuvantu po prvej injekcii a 10 pg antigénu a 50 pg adjuvantu po druhej. V prípade konjugátov je antigénová časť určujúca pre výpočet injektovanej dávky.
Tabuľka - Experimentálne skupiny
Skupina Adjuvant Antigén Počet myší
1 NaCl 6
2 — (NANP)6P2P30 6
3 IFA 4 (NANP)6P2P30 6
4 OM-197-FV6 4 (NANP)6P2P30 6
5 OM-197-MC 4 (NANP)6P2P30 6
6 (OM-197-FV)1,2,3-(NANP)6P2P30 6
7 OM-197-FV-(NANP)6P2P30 6
8 OM-197-MP + OM-197-FV-(NANP)6P2P30 6
Schéma imunizácie a odbery
Týždeň 0 3 5
Imunizácia (N°) t (D Ť (2)
Odozva špecifických protilátok Ť Ť
Odbery krvi
Získané séra: Krv sa odoberie v 0 až 5 týždni. Krv sa nechá usadiť 60 min. pri teplote 37 °C, potom sa ponechá cez noc na teplote 4 °C. Sérum sa zmrazí na teplotu -80 °C až do pridania protilátok.
5.1.2 Stanovenie protilátok lgG anti-(NANP)6P2P30
Dávka protilátok lgG zameraných špecificky proti antigénu (NANP)6P2P30 sa uskutoční cez ELISA. Fixácia antigénu je uskutočnená na mikrodoštičkách s 96 jamkami (Maxisorp F 96, Nunc, DK) inkubáciou cez noc v parnom kúpeli pri teplote 4 °C s 0,1 ml PBS (fosfátom pufrovaná soľanka) v každej jamke obsahujúcej 0,001 mg/ml antigénu (NANP)6P2P30. Nasýtenie mikrodoštičky sa uskutoční PBS obsahujúcom 1 % albumínu hovädzieho séra (BSA, Fluka, CH). Doštičky sa premyjú PBS obsahujúcom 0,05 % Tweenu 20 (Sigma, Saint Luis, MO, Sp. st. a.). Odobraté séra sa po 5 týždňoch zriedia v sérii riediacim pufrom (PBS obsahujúce
2,5 % práškového odstredeného mlieka a 0,05 % Tweenu 20), potom sa prenesú na mikrodoštičky a nechajú sa 1 hodinu pri teplote okolia. Doštičky sa premyjú PBS. Roztok zriedenia obsahujúci protilátky polyklonálny myší anti-imunoglobulín G konjugovaný na alkalickú fosfatázu (sigma, Saint-Louis, MO. Sp. st. a.), a pridajú sa na doštičky inkubované jednu hodinu pri teplote okolia. Doštičky sa premyjú PBS a špecifické protilátky sa prejavia kolorimetrickou reakciou so substrátom alkalickej fosfatázy, p-nitrofenylfosfát (Sigma, Saint-Louis, MO, Sp. st. a.). Absorbancia pri 405 nm sa meria čítaním mikrodoštičky (Dynatech 25 000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), každý stav sa stanoví dvakrát. Uvedené výsledky sú priemerom absorbancií nameraných pri 405 nm získaných pre myši každej skupiny.
5.1.3 Výsledky: špecifická odozva
Špecifická produkcia protilátok lgG anti-(NANP)6P2P30 zistená spôsobom ELISA je znázornená graficky pre myši, ktoré dostali dve imunizácie (obr. 79).
Dve injekcie zmesi antigén + adjuvant (OM-197-FV6 a OM-197-MC) vyvolávajú sérologickú odozvu viditeľne väčšiu, ako sa pozoruje po injekcii samotného antigénu. Imunizácia monokonjugovaným OM-197
-FV-(NANP)6P2P3o vyvoláva odozvu protilátok lgG mierne vyššiu, ako je získaná zmesou antigén + OM-197-FV6. Zvýšený stupeň konjugácie (OM-197-FV)lj2;3-(NANP)6P2P30 nezlepšuje sérologickú odozvu proti tomuto antigénu. Zmes adjuvantu OM-197-MP a monokonjugátu OM-197-FV-(NANP)6P2P30 zvyšuje podstatným spôsobom sérologickú odozvu na tento antigén a predstihuje hodnoty získané s kladnou kontrolou tvorenou zmesou (NANP)6P2P30 + IFA.
Podobné výsledky sa dosahujú, keď sa zachycovanie protilátok uskutočňuje spôsobom ELISA s využitím peptidu (NANP)eNA ako antigénu (obr. 80).
Príklad 5.2
Skupina ovalbumínovej imunizácie: stanovenie špecifických protilátok vytváraných pri myšiach po jednom a dvoch subkutánnych podaniach
5.2.1 Opis skúšky
Cieľom tejto štúdie je porovnať sérologickú odozvu vyvolanú injekciou zmesou adjuvant + antigén (OM197-MP + ovalbumín) pri tomto stave konjugátom s rovnakým antigénom (ΟΜ-197-FV-ovalbumín). Na to sa rozdelí 30 myší BALB/c (samice vo veku osem týždňov od začiatku ošetrovania) do troch nasledujúcich skupín:
Skupiny adjuvant-antigén 25 pg prot/zviera/injekcia adjuvant (neviazaný) 50 pg/zviera/injekcia Injektovaný objem pl
A ovalbumín - 200
B ovalbumín OM-197-MP 200
C OM-197 -F V-ovalbumín - 200
Roztoky
Skupina A: materský roztok samotného antigénu (ovalbumínu, Fluka, AG, Buchs, Suisse) sa oddelí v koncentrácii 125 pg/ml vo vode + 0,01 % thiomersalu.
Skupina B: materský roztok zmesi antigén + adjuvant (ovalbumín + OM-197-MP) obsahujúci 125 pm/ml ovalbumínu a 250 pg/ml vo vode + 0,01 % thiomersalu. OM-197-MP.
Skupina C: materský roztok konjugátu ΟΜ-197-FV-ovalbumín je pri koncentrácii 125 pg/ml proteínu vo vode + 0,01 % thiomersalu.
Príprava roztokov na injektovanie: Každý materský roztok sa inkubuje 15 minút pri teplote 37 °C, potom v každom prípade sa pridá príslušný objem roztoku chloridu sodného (14 %) do každého roztoku na získanie izotonického roztoku (0,9 % roztok chloridu sodného). Zmes sa mieša tri minúty.
Imunizácia: Injektuje sa v dňoch 0 až 14. Roztoky sa injektujú subkutánnym spôsobom (100 pl vo dvoch rôznych miestach, celkovo 200 pl na zviera). Krv sa odoberá 14 až 28 deň (retro-orbitálna punkcia).
Dávkovanie anti-ovalbumínových imunoglobulínov: Špecifické sérové imunoglobulíny pre nasledujúci ovalbumín sa stanovia dvojito spôsobom ELISA: IgGl, lG2a a lgM. Doštičky s mikrojamkami (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) sa inkubujú (povlak cez noc) pri teplote 4 °C so 100 pl ovalbumínu (0,5 pg) v pufŕe hydrogenuhličitanu sodného (hodnota pH 9,6). Po premytí 0,5 % Tweenom-20 (Merck, Hohenbrunn, Nemecko) sa séra zriedia 50, 200 a 800-násobne (riediaci roztok: fosfátom puftovaná soľanka (PBS) + 1 % albumínu hovädzieho séra (BSA, Sigma, St. Louis, Mo, Sp. st. a.) + 0,02 % Tweenu-20). Pridá sa 100 pl každého zriedeného séra do jamiek. Táto inkubácia trvá 45 minút pri teplote 37 °C.
Po druhom premytí IgGl, lG2a a lgM, špecifických pre ovalbumín, sú inkubované 30 minút pri teplote 37 °C so 100 pl protilátok (krysie anti-myšie) anti-lgGl konjugovaných na peroxidázu (Serotec, Oxford, UK), lG2a konjugovaného na peroxidázu (Pharmingen, San Diego, CA, Sp. st. a.) a lgM konjugovaného na biotín (Pharmingen, San Diego, CA, Sp. st. a.), zriedenými predbežne pufrom PBS/NSA/Tween (zriedenie 250, 1000 a 500). Pri lgM je potrebná po dodatočnom premytí 3. inkubácia (30 minút pri teplote 37 °C) s roztokom 1/100 streptavidínu konjugovaného na peroxidázu (Dáko, Glostrup, DK).
Po premytí sa pridá 100 pl roztoku 1,2 fenyléndiamínu (OPD, Merck, Darmstadt, Nemecko) na detekciou peroxidázy konjugovanej na sekundárne protilátky anti-lgGl, zatiaľ čo pre lG2a a lgM je použitým reakčným činidlom 3',3',5',5'-tetrametylbenzidín (TBM, Sigma, St. Louis, Mo, Sp. st. a.). Inkubuje sa počas 20 minút pri teplote okolia, reakcia sa ukončí pridaním 100 pl 2 N kyseliny sírovej. Absorbancia sa meria pri 490 nm čítačom doštičiek BioRad 3550.
5.2.2 Výsledky
Výsledky každého merania pri 490 nm sú vyjadrené zmluvnými jednotkami (u. a.) na ml. To je možné porovnaním každej vzorky s referenčnou vzorkou pripravenou zriedením súboru vzoriek pri 28 dňoch pochádzajúcich zo skupiny A (zvieratá injektované samotným ovalbumínom). Podľa definície je súbor vzoriek zriedený 50x pri koncentrácii 1 000 u. a./ml. Jednotlivé výsledky sú potom opravené podľa zodpovedajúceho násobku zriedenia (50, 200 alebo 800x) a sú na obr. 81, 82 a 83: prázdne krúžky zodpovedajú priemeru pri 14 dňoch a plné krúžky zodpovedajú priemeru pri 28 dňoch, skratka Ova = ovalbumín.
Tieto výsledky naznačujú, že konjugát OM-197-FV-ovalbumín je obzvlášť imunogénny v študovanom modeli, pretože zvyšuje významným spôsobom po druhej injekcii špecifické protilátky anti-ovalbumínu produkované myšou, nezávisle od analyzovaného imunoglobulínu (lgGl, lgG2a a lgM). Je potrebné zvlášť zdôrazniť významné zvýšenie ovalbumínu lgG2a (obr. 84), čo naznačuje imunitu predovšetkým orientovanou TH1. Zmes nekovalentného ovalbumínu + OM-197-MP dáva odozvu lgG2a nižšiu ako zistenú s konjugátom.
Príklad 5.3
Skupina hemaglutinínovej H1N1 imunizácie: určenie špecifických protilátok vytvorených myšou po jednom a dvoch podaniach subkutánnou cestou
5.3.1 Opis skúšky
Cieľom štúdie je porovnať sérologickú odozvu vyvolanú injekciou zmesi adjuvant + antigén (OM-197-MP + H1N1) s odozvou spôsobenou konjugátom s rovnakým antigénom (OM-197-FV-H1N1). K tomu bolo rozdelených 30 myší BALB/c (samice vo veku 8 týždňov na začiatku štúdie) do 3 nasledujúcich skupín:
Skupiny Adjuvant-antigén H1N1 25 pg zviera/injekcia Adjuvant (neviazaný) 50 pg zviera/injekcia Injektovaný Objem μΐ
A H1N1 - 100
B H1N1 OM-197-MP (50 pg) 100
C OM-197-FV-H1N1 - 100
5.3.2 Príprava injektovaných roztokov
Skupina A: materský roztok H1N1 (hemaglutinín A/Beijing 262/95 Solvay Duphar, Weespm NL) sa pripraví v koncentrácii 25 pg/ml vo vode.
Skupina B: materský roztok H1N1 + OM-197-MP obsahujúci 25 pg/ml H1N1 a 500 pg/ml OM-197-MP vo vode.
Skupina C: materský roztok OM-197-FV-H1N1. (H1N1 kovalentne viazaného na OM-197-FV v koncentrácii 25 pg/ml vo vode).
Každý materský roztok sa inkubuje 15 minút pri teplote 37 °C a pridá sa 135 μΐ roztoku chloridu sodného (14 %) do 2 ml každého roztoku. Všetko sa mieša 3 minúty.
5.3.3 Injekcie a dávky imunoglobulínov anti-HINl
Injektuje sa v dňoch 0 až 14. Roztoky sa injektujú subkutánnym spôsobom (50 μΐ v dvoch rôznych miestach, celkovo 100 μΐ na zviera). Krv sa odoberá 14. deň (retro-orbitálna punkcia).
Špecifické lgM pre H1N1 sa stanoví dvojmo spôsobom ELISA. Doštičky s mikrojamkami (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) sa inkubujú (povlak cez noc) pri teplote 4 °C so 100 μΐ H1N1 (0,5 pg) v pufri hydrogenuhličitanu sodného (hodnota pH 9,6). Po premytí 0,5 % Tweenom-20 (Merck, Hohenbrunn, Nemecko) sa séra zriedia 50, 200 a 800-násobne (riediaci roztok: fosfátom pufrovaná soľanka (PBS) + 1 % albumínu hovädzieho séra (BSA, Sibna, St. Louis, Mo, Sp st. a.) + 0,02 % Tween-20). Pridá sa 100 μΐ každého zriedeného séra do jamiek. Táto inkubácia trvá 45 minút pri teplote 37 °C.
Po druhom premytí lgM špecifickom pre H1N1 sa inkubujú 30 minút pri teplote 37 °C so 100 μΐ protilátok (krysie anti-myšie) anti-lgM konjugovaných na biotín (Pharmingen, San Diego, CA, Sp. st. a.), zriedenými predbežne 500 x pufrom Tween. Po dodatočnom premytí sa uskutoční tretia inkubácia (30 minút pri teplote 37 °C) roztokom 1/100 streptavidínu konjugovaného na peroxidázu (Dáko, Glostrup, DK).
Po premytí sa pridá 100 μΐ roztoku 3',3',5',5'-tetrametylbenzidínu (TBM, Sigma, St. Louis, Mo, Sp. st. a.) na detekciu peroxidázy konjugovanej na sekundárne protilátky anti lgM. Inkubuje sa počas 20 minút pri teplote okolia, reakcia sa ukončí pridaním 100 μΐ 2 N kyseliny sírovej. Absorbancia sa meria pri 490 nm čítačom doštičiek BioRad 3550.
5.3.4 Výsledky
Výsledky každého merania pri 490 nm sa vyjadrujú zmluvnými jednotkami (u. a.) na ml. Každá vzorka sa porovnáva s referenčnou vzorkou pripravenou zriedením súboru vzoriek pri 28 dňoch pochádzajúcich zo skupiny A (zvieratá injektované samotným H1N1). Podľa definície je skupina vzoriek zriedená 50 x pri koncentrácii 1 000 u. a./ml. Jednotlivé výsledky sú potom opravené podľa zodpovedajúceho násobku zriedenia (50, 200 alebo 800 x) a sú na obr. 84: plné krúžky zodpovedajú priemeru pri 28 dňoch.
Myši imunizované konjugátom OM-197-FV-H1N1 majú protilátky lgM anti-HINl vyššie ako protilátky kontroly s antigénom H INÍ samotným, rovnako ako pri zmesi OM-197-MP + H1N1.
Príklad 5.4
Vyhodnocovanie vlastností adjuvantu OM-197-MP-AC na myšom modeli imunizácie cestou s.c. antigénom
Leishmania LmCPb
5.4.1 Opis skúšky
Myšiam CBA sa injektuje do chvosta jediná subkutánna injekcia (100 pl) antigénu parazita Leishmania LmCPb (3 pg na myš) ± adjuvant. Utvoria sa dve skupiny po šiestich myšiach ošetrených takto: samotný antigén (slepá skúška) a prípadne antigén + 50 pg OM-197-MP-AC. Jedenásť dní po injekcii sa vnesú trojmo do kultúry lymfatické uzliny jazyka a periaorty (dve skupiny troch myší) za prítomnosti čisteného antigénu LmCPb alebo celkový extrakt parazita (amastigote).
Štvrtý deň sa supematant vyberie a konzervuje sa pri teplote -20 °C pre dávku IL-4 a IFNganu. Nakoniec sa do kultúry pridá tríciovaný tymidín (3H-TdR) pre mieru proliferácie.
Dávka cytokínov sa prevedie sendvičom ELISA (kit OptEIA™-IFNgama a IL-4, BD PharMingen, Basel, Švajčiarsko) a proliferačná odozva sa vyhodnotí meraním začlenenia timidínu (3H-TdR). Miera začlenenia 3H-TdR, vyjadrená v CPM vo forme aritmetického stredu ± smerodajná odchýlka 82 skupín troch myší a koncentrácia IL-4 v pg/ml sa udá jednotlivo pre každú skupinu troch myší vo forme aritmetického stredu dvoch meraní (dávky cytokínov).
Antigén: materský roztok LmCPb sa pripraví v koncentrácii 150 pg/ml v PBS.
Adjuvanty: materský roztok OM-197-MP-AC sa pripraví v 0,9 mg/ml vo vode na injektovanie s prídavkom 0,1 % trietanolamínu.
Zmes antigén-adjuvant: Pripravený adjuvant (4 objemy), predbežne nastavený na primeranú konečnú koncentráciu v sterilnom PBS, sa zmieša tesne pred injektovaním s materským roztokom antigénu (1 objem).
5.4.2 Výsledky
Pri myšiach CBA, imunizovaných antigénom Leishmania LmCPb, stačí jediná dávka 50 pg adjuvantu OM-197-MP-AC na vyvolanie zvýšenia (2 až 6-násobné) proliferácie ganglionálnych buniek merané in vitro na odozvu na čistený antigén (0,6 až 15 pg/ml) alebo na celkový extrakt formy amastigotu parazita (medzi 2 a 50 x 10'6/ml). Tieto výsledky sú uvedené v tabuľke 1. Okrem toho sa objavujú pri ošetrení myší OM-197-MP-AC v supematante ganglionálnych buniek, stimulovaných parazitným antigénom, významné množstvá IL-4 (tabuľka II), pričom produkcia IFNgama nebola zistená (<100 pg/ml).
Tabuľka I
Proliferatívna odozva in vitro ganglionálnych lymfocytov myší CBA imunizovaných LmCPb: Vplyv adjuvantu OM-197-MP-AC samotného alebo v kombinácii s CpG-DNA
Stimulant in vitro Začlenenie tríciovaného tymidínu (CPM)
Bez adjuvantu OM-197-MP-AC
Žiadny stimulant 0,7 ± 0,2 0,7 ±0,1
LmCPb (pg/ml) 15,0 2,8 ± 0,8 7,0 ± 0,7
5,0 1,6 ± 0,4 3,0 ± 1,1
1,7 1,1 ±0,3 1,9 ±0,5
0,6 0,9 ± 0,2 1,3 ±0,5
Amastigoty 50,0 5,1 ± 1,4 32,6 ±5,2
(x 10‘6/ml) 17,0 2,8 ±1,0 12,6 ±2,5
6,0 1,1 ±0,6 5,3 ±1,5
2,0 0,9 ± 0,4 1,6 ±0,3
Con A (pg/ml) 5 124,3 ±48,9 208,5 ± 56,0
Uvedené hodnoty v tabuľke I predstavujú aritmetický stred ± smerodajná odchýlka miery začlenenia spôsobenej dvoma skupinami lymfatických ganglií (tri myši na skupinu: kultivácia každej skupiny je trojitá).
Tabuľka II
Produkcia IL-4 in vitro lymfocytov myší CBA imunizovaných LmCPb: Vplyv adjuvantu OM-197-MP-AC samotného alebo v kombinácii s CpG-DNA
Stimulant in vitro Produkcia IL-4 (pg/ml)
Bez adjuvantu OM-197-MP-AC
bez stimulantu a <8 <8
b <8 <8
Stimulant in vitro Produkcia IL-4 (pg/ml)
Bez adjuvantu OM-197-MP-AC
LmCPb (pg/ml) 15 a <8 12
b <8 13
Amastigoty 50 a <8 55
(x 10'6/ml) b <8 70
17 a <8 29
b <8 28
Con A (pg/ml) 5 a 117 103
b 168 102
Uvedené hodnoty v tabuľke predstavujú aritmetický stred dvoch meraní cytokínov ovplyvnených v supematantoch 2 skupín (a a b 3 myši v skupine) ganglionálnych buniek kultivovaných trojmo.
Záver
Produkt OM-197-MP-AC vyvoláva pri imunizovanej myši CBA s LmCPb (proteáza bohatá vo fáze amastigotu parazita Leishmania) odozvu T špecifickú vyhodnotenú in vitro mierou lymfocytovej proliferácie. Okrem toho podporuje tento adjuvant vývoj lymfocytov anti-LmCPb, uchovávajú významné množstvá IL-4.
Príklad 5.5
Vyhodnotenie vlastností acylovaných pseudodipeptidov s funkcionalizovanou pomocnou vetvou kopulovanou alebo miešanou so syntetickými peptidmi proteínu cirkumsporozoitu Plasmodium yoelii v modeli imunizácie myší (PyCS 252-260).
Cieľom tejto štúdie je vyhodnotiť schopnosť acylovaných pseudodipeptidov s funkcionalizovanou pomocnou vetvou naočkovaných alebo zmiešaných so syntetickými peptidmi (PyCS 252-260) proteínu cirkumsporozoitu Plasmodium yoelii na vyvolanie odozvy imunitnej bunkovej a humorálnej špecifickej proti peptidu.
5.5.1 Protokol skúšok
Formulácia antigénov adjuvantami: syntetický peptid PyCS 252-260, zodpovedajúci epitopu T proteínu cirkumsporozoitu Plasmodium yoelii sekvencie SYVPSAEQI (tabuľka I). Peptid 2 MR99B (SERSYVPAEQI) sa získa napojením aminokyselín SER na N-zakončení a peptid 1 MR99A (KGGKGGKSERSYVPSAQI) sa získa napojením aminokyselín lyzín-glycín-glycín pripojených k opísanému N-zakončeniu peptidu MR99B. Peptidy sa získajú syntézou pevnej fázy (F-moc, podľa Merifíelda a Athertona (Atherton a kol., Bioorg. Chem. 8, str. 350 až 351, 1979) s reakčnými činidlami a solvátmi (obchodné produkty spoločnosti Bachem Feinchemikalien, Buddendorf, Švajčiarsko), Novabiochem (Laufelfingen, Švajčiarsko) a Fluka (Buchs, Švajčiarsko). Peptidy sa čistia inverznou fázovou HPLC. Monokonjugáty a polykonjugáty peptidov s acylovaným pseudodipeptidom s pomocnou vetvou (OM-197-MC-FV) sa získajú, ako je opísané v príklade 3.6 ([OM197-MC-FV]n-peptid 1) a v príklade 3.5 (OM-197-MC-FV-peptid 2). Konečné sterilné roztoky konjugovaných peptidov sa lyofílizujú.
Imunizácia myší: Dávka antigénu zodpovedá 20 pg peptidu 2 na myš a injekciu (tabuľka II). Pred injekciou sa lyofilizované prostriedky zmiešajú s 0,9 % roztokom chloridu sodného, zmes sa mieša tri minúty a prezvučňuje sa 10 min. pri teplote 50 °C. Prostriedky s IFA sa pripravia zmiešaním objemu antigénu (14,5 pg peptidu PyCS 252-260 plus 50 pg P30 (epitop T univerzálny v PBS)) a objemu adjuvantu.
Myši BALB/c vo veku štyroch týždňov (Harlan, Zeist, NL) dostanú subkutánnu injekciu do spodiny chvosta. Injekcia prostriedkov sa urobí ihlami 23“ v konečnom objeme 50 pl. Zvieratá dostanú druhú dávku antigénu na začiatku piateho týždňa a tretiu injekciu v priebehu deviateho týždňa.
Tabuľka I - Antigény
syntetické peptidy sekvencie molekulová hmotnosť Dávka/injekcia (pg)
peptid 1 KGGKGGKSERSYVPSAEQI 1978,2 29,0
peptid 2 SERSYVPSAEQI 1365,5 20,0
PyCS 252-260 SYVPSAEQI 993,1 14,5
Tabuľka II - Experimentálne skupiny, imunizácia a odbery
Imunizácia peptidmi
skupiny adjuvanty antigény počet myší
1 IFA - 7
2 IFA PyCS 252-260 + P30 7
3 OM-197 peptid 1 7
4 OM-197 peptid 2 7
5 ΟΜ-197+peptid 1 7
6 ΟΜ-197+peptid 2 7
7 OM-197 ΟΜ-197+peptid 2 7
8 OM-197 - 7
4· 4 4
0 5 7 9 11 týždňov
Ť Ť
Vyhodnotenie
Odozva protilátok (ELISA) Odozva CTL (ELISPOT)
Odbery krvi a lymfoidných orgánov
Získanie séra: krv sa odoberá pri všetkých myšiach po siedmich a jedenástich týždňoch. Krv sa nechá usadiť 60 minút pri teplote 37 °C, potom sa nechá cez noc pri teplote 4 °C. Sérum sa zmrazí na -80 °C až do dodania protilátok.
Odber slabinových ganglií krysy: dve zvieratá z každej skupiny sa usmrtia po siedmich a pripadne jedenástich týždňoch. Dve slabinové ganglie krysy sa odoberú chirurgicky a bunky sa kultivujú na vyhodnotenie aktivity CTL ELISPOT (odozva interferón-gama).
Stanovenie miery protilátok anti-peptidu 1:
Dávka protilátok zameraných proti peptidu 1 (KGGKGGKSERSYVPSAEQI) sa realizuje spôsobom ELISA. Fixácia antigénu sa uskutoční na 96-jamkovej mikrodoštičke (Maxisorp F 96, Nunc, DK) inkubáciou počas noci v parnom kúpeli pri teplote 4 °C 0,05 ml PBS (fosfátom pufrovanej soľanky) do každej jamky obsahujúcej 0,001 mg peptidu L Doštičky sa premyjú PBS-0,05 % Tweenu 20 (Sigma, St. Luis, MO. Sp. st. a.) (PBS-T) a saturácia mikrofágu sa uskutoční 5 % odstredeným mliekom v PBS-T počas jednej hodiny pri teplote okolia. Jednotlivé séra (A, B, C, D, E, F, G) myší odobraté v deviatom a jedenástom týždni sa zriedia v sérii riediacim pufrom (PBS s obsahom 2,5 % odstredeného práškového mlieka a 0,05 % Tweenu 20), prenesú sa na mikrodoštičku a ponechajú sa jednu hodinu pri teplote okolia (TA). Doštičky sa premyjú PBS a riediaci roztok, obsahujúci polyklonálne kozie protilátky myšieho anti-imunoglobulínu konjugovaného na alkalickú fosfatázu (Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.), sa pridá na doštičky a inkubuje sa jednu hodinu pri teplote okolia. Doštičky sa premyjú PBS a špecifické protilátky sa zistia kolorimetrickou reakciou so substrátom alkalickej fosfatázy, p-nitrofenylfosfát (Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.). Absorbancia pri 405 nm sa meria čítacím zariadením mikrodoštičiek (Dynatech 25000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), každé sérum sa testuje dvakrát. Uvedené výsledky sú priemerom hodnôt získaných pre myši každej skupiny. Miera protilátok je určená posledným zriedením, vyvolávajúcim významnú kladnú odozvu, teda hodnotou optickej hustoty vyššou, ako je hodnota šumu pozadia pridaná ku trom typom rozpätia.
Dávky ELISPOT-interferongama
Špecifické protilátky anti-interferongama myší (01E703B2) sa fixujú inkubáciou počas jednej noci pri teplote 4 °C v parnom kúpeli jedným roztokom protilátky po 50 gg/ml v mikrodoštičke ELISPOT, kde dná jamiek sú pokryté nitrocelulózou (Millipore, Molsheim, F). Etapa saturácie sa uskutočni pridaním DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, Sp. st. a.) obsahujúcom 10 % teľacieho zárodočného séra (FCS, Fakola, CH) počas dvoch hodín pri teplote 37 °C. Získané bunky z lymfoidných orgánov (krysie slabinové gangliómy) sa vnesú do kultúry mikrodoštičiek pri 200 000 alebo 400 000 buniek na jamku, potom sa spoločne kultivujú 24 hodín pri teplote 37 °C s 100 000 bunkami, predstavujúcimi antigén (predbežne pretrepávané s peptidom PyCS 252-260 pri teplote 37 °C počas 1 hodiny a ožiarené (10 K rad) a premyté 3 x, alebo za prítomnosti Concavalínu A ako kontroly. Po inkubácii sa bunky vyberú a po premytí sa počas dvoch hodín pridá druhá protilátka IFNgama biotinylovaných myší (ANI, 2 gg/ml v PBS s 1 % BSA). Pridá sa streptavidín konjugovaný na alkalickú fosfatázu (Boehringer, Mannheim, Nemecko) zriedený 1 : 1 000 a inkubuje sa jednu hodinu pri teplote 37 °C, uskutoční sa trojnásobné premytie PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20, nasledované trojnásobným premytím PBS. Prítomnosť imunitných komplexov anti-IFNgama sa zistí pridaním substrátu BCIP/NBT (Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.). Reakcia sa ukončí premytím prúdiacou vodou. Kladné stopy IFNgama sa spočítajú automatickým čítacom Biosys GmbH (Karben, Nemecko). Špecifické stopy zodpovedajú rozdielu medzi počtom stôp sčítaných v prítomnosti buniek pretrepávaných s peptidom a počtom stôp sčítaných v neprítomnosti peptidu. Uvedené výsledky sú priemerom získaným pre myši každej skupiny. Sú vyjadrené počtom stôp na milión buniek v kultúre.
Výsledky
Humorálna odozva je vyjadrená na obr. 85 (dva týždne po druhej injekcii) a na obr. 86 (dva týždne po tretej injekcii). Po dvoch imunizáciách sú kladné odozvy pozorované pri piatich až siedmich zvieratách skupiny 5 (zvieratá boli imunizované peptidom 1 konjugovaným pomocnou vetvou po 4 jednotkách acylovaného pseudodipeptidu). V tejto skupine percento zodpovedajúcich myší sa zvyšuje s treťou injekciou, pretože myši B a D majú významnú mieru protilátok, ale nízku. Skupina 3 imunizovaná rovnakým peptidom zmiešaným s rovnakým adjuvantom nevytvára významnú mieru protilátok. Zjavná odozva je pozorovaná po 3 imunizáciách v skupine 7 (monokonjugované peptidom 2 doplneným voľným adjuvantom OM-197). Ostatné skupiny, ktoré dostali krátky alebo vôbec akýkoľvek peptid, nemajú protilátkovú odozvu. Tetrakonjugovaný OM197-peptid 2 je teda schopný vyvolať protilátkovú odozvu pri všetkých myšiach imunizovaných mierou strednou až nízkou. Vyhodnotenie bunkovej aktivity je určené frekvenciou CTL sekretujúcou interferóngama, špecifickú pre epitop PyCS 252-260. Výsledky sú uvedené v tabuľke III. Kladná kontrola je predstavovaná skupinou 2 a záporná kontrola predstavovaná samotnými adjuvantmi (skupma 1 a 8). Kontrola stimulácie buniek Concavalinom A je kladná pri všetkých myšiach. Skupiny 5 (tetrakonjugovaná) a 7 (monokonjugovaná + adjuvant) majú kladné odozvy CTL. Peptid konjugovaný na 4 molekuly acylovaného pseudodipeptidu (ΟΜ-197-peptidu 1) je účinný, zatiaľ čo monokonjugovaný (ΟΜ-197-peptid 2) CTL nevyvoláva. Naopak monokonjugovaný doplnený samotným OM-197 CTL vyvoláva, zatiaľ čo nevyvoláva produkciu protilátok, čo je pravdepodobne spôsobené malou veľkosťou peptidu 2(12 aminokyselín).
Tabuľka III - Odozva CTL na peptid PyCX 252-260
skupina adj uvant... antigén Počet CTL na milión slezinových buniek
po 2. injekcii po 3. injekcii
1 IFA (adjuvant nedoplnený Freundom) 0,0 ± 0,0 0,2 ± 0,2
2 IFA + PxCS 252-260 + P30 36,9 ± 2,7 4,4 ± 6,2
3 OM-197 + peptid 1 0,0 ± 0,0 0,7 ± 1,0
4 OM-197 + peptid 2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
5 OM-197 + peptid 1 11,3 ± 12,4 36,9 ± 25,6
6 OM-197 + peptid 2 0,0 ± 0,0 0,6 ± 0,9
7 OM-197 + ΟΜ-197-peptid 2 28,8 ±7,1 20,0 ± 14,1
8 OM-197 0,0 ± 0,0 0,6 ± 0,9
Príklad 5.6
Vyhodnotenie pyrogenicity acylovaných pseudodipeptidov na králičom modeli
Cieľom tejto štúdie je určiť najväčšiu koncentráciu naočkovaného acylovaného pseudopeptidu nosiča pomocnej vetvy, ktorý nevyvoláva horúčku v intravenózne injektovanom králikovi.
Protokol
Pätnásť králikov (New Zeelands White Rabbits) sa rozdelí do nasledujúcich skupín: skupina 1: 1,0 mg/kg, skupina 2: 0,1 mg/kg, skupina 3: 0,01 mg/kg, skupina 4: 0,001 mg/kg, skupina 5: voda na injektovanie.
V deň testu sa králiky vážia a umiestnia do škatúľ určených na tento účel. Teplomery sa zavedú do konečníkov. Jednu hodinu po zavedení teplomerov (preinjekcia) sa zaznamenajú teploty počas 90 minút a stanoví sa priemer.
Každý králik dostane intravenóznu injekciu produktu alebo kontroly (sterilizovanej vody s 0,9 % roztokom chloridu sodného) žilou v uchu (laterálna). Teplota sa meria každých 30 minút počas troch hodín. Vypočíta sa a zaznamená sa rozdiel medzi priemerom preinjekcie a maximálnej teploty.
Pri troch králikoch zo skupiny je test považovaný za nepyrogénny, ak súčet troch odoziev neprekročí
1,15 °C a pyrogénny, ak prekročí súčet 2,65 °C. Ak sa získaná hodnota nachádza medzi dvoma, uskutoční sa test znova s tromi ďalšími králikmi.
Výsledky
Výsledky testu pyrogenity zlúčenín OM-197-MC-MP a OM-197-MC-Asp sú uvedené v tabuľkách:
Dávka OM-197-MC-MP Odozva v °C Výsledky
stredná (jednotlivo)
1 mg/kg 3,40 (1,50; 0,60; 1,30) pyrogénny
0,1 mg/kg 2,00 (1,45; 0,05; 0,50) nepyrogénny (1 zvýšená)
0,01 mg/kg 0,65 (0,00; 0,45; 0,20) nepyrogénny
0,001 mg/kg 0,35 (0,10; 0,05; 0,20) nepyrogénny
Kontrola 0,20 (0,20; 0,00; 0,00) nepyrogénny
Dávka OM-197-MC-Asp Odozva v °C Výsledky
stredná (jednotlivo)
1 mg/kg 3,25 (1,25; 1,45; 0,55) pyrogénny
0,1 mg/kg 2,85 (1,10; 1,20; 0,55) pyrogénny
0,01 mg/kg 0,35 (0,20; 0,15; 0,00) nepyrogénny
0,001 mg/kg 0,25 (0,00; 0,10; 0,15) nepyrogénny
Kontrola 0,40 (0,25; 0,05; 0,10) nepyrogénny
Zlúčeniny podľa vynálezu nie sú pyrogénne pri dávkach menších ako 0,1 mg/kg.
Priemyselná využiteľnosť
Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu, ktorý má kyslú skupinu v neutrálnej alebo v nabitej forme, na výrobu farmaceutických prostriedkov zvlášť na úpravu imunity a na zlepšovanie terapeutickej účinnosti a/alebo jej cielenia a na diagnostiku.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (43)

1. Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu, ktorý má kyslú skupinu v neutrálnej alebo v nabitej forme na jednom konci pseudodipeptidu a ktorý má na druhom konci pomocnú íunkcionalizovanú vetvu, všeobecného vzorca (I)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (I),
I I
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n a m 0 až 10, p a q 1 až 10,
Y atóm kyslíka alebo skupinu NH,
X a Z funkcionalizovanú pomocnú vetvu alebo kyslú skupinu v neutrálnej alebo nabitej forme, alebo volenú zo súboru zahŕňajúceho skupinu karboxylovú, karboxy [(C ] -C5) alkoxy], karboxy [(C,-C5)alkyltio], fosfono [(C i-C5)alkoxy], fosfono [(C i-C5)alkyltio], dihydroxyfosforyloxy[(C i-C5)alkoxy], dihydroxyfosforyloxy [(C, -C5)alkyltio], dihydroxyfosforyloxy, hydroxysulfonyloxy, hydroxysulfonyl[(Ci-C5)alkoxy], hydroxysulfonyl[(Ci-C5)alkyltio], hydroxysulfonyloxy[(Ci-C5)alkoxy], hydroxysulfonyloxy[(C1-Cs)alkyltio], [karboxy(C1-C5)alkyl]aminokarbonyl, [dikarboxy(Ci-C5)alkyl]aminokarbonyl, [amonio(C, -C5)alkyl] aminokarbonyl, {[karboxy[amino(C i-C5)alkyl]} aminokarbonyl za podmienky, že jeden symbol X alebo Z znamená funkcionalizovanú pomocnú vetvu.
2. Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu podľa nároku 1, ktorého pomocná skupina X alebo Z má všeobecný vzorec (II)
A-(CO)r-(CH2)s-W (II), kde znamená
A atóm kyslíka, síry alebo skupinu NH, r 0 alebo 1, s 1 až 10,
W skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, brómacetamidoskupinu, jódacetamidoskupinu, acylamidoskupinu, diacylamidoskupinu, sulfhydrylovú skupinu, alkyltioskupinu, hydroxylovú skupinu, 1,2-dihydroxyetylovú skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, vinylovú skupinu, etinylovú skupinu, voľnú karboxylovú skupinu, esterifíkovanú karboxylovú skupinu, karboxylovú skupinu vo forme zmesového anhydridu, amidu alebo hydrazidu, azidoskupinu alebo tiokyanoskupinu.
3. Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu, ktorý má kyslú skupinu v neutrálnej alebo v nabitej forme na jednom konci pseudodipeptidu a ktorý má na druhom konci pomocnú funkcionalizovanú vetvu, všeobecného vzorca (I)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (I),
I I
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, na m Oaž 10, p a q 1 až 10,
Y atóm kyslíka alebo skupinu NH,
X a Z funkcionalizovanú pomocnú vetvu alebo kyslú skupinu v neutrálnej alebo nabitej forme, alebo volenú zo súboru zahŕňajúceho skupinu karboxylovú, karboxy [(C i -C5)alkoxy], karboxy[(C i -C5)alkyltio], fosfono [(C i -C5)alkoxy], fosfono[(Ci-C5)alkyltio], dihydroxyfosforyloxy[(Ci-C5)alkoxy], dihydroxyfosforyloxy, hydroxysulfonyloxy, hydroxysulfonyl[(C i -C5)alkoxy], hydroxysulfonyl[(C ] -C5)alkyltio], hydroxysulfonyloxy[(C i-Csjalkoxy], hydroxysulfonyloxy [(C! -C5)alkyltio] za podmienky, že jeden symbol X alebo Z znamená funkcionalizovanú pomocnú vetvu a pomocná skupina X alebo Z má všeobecný vzorec (II), kde jednotlivé symboly majú uvedený význam, s výnimkou dihydroxyetylovej skupiny.
4. Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), kde pokiaľ X alebo Z znamenajú kyslú skupinu v neutrálnej forme, je to skupina karboxylová, sulfónová, fosfónová alebo fosforečná vo voľnej forme.
5. Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), kde pokiaľ X alebo Z znamenajú kyslú skupinu v nabitej forme, je to skupina karboxylová, sulfónová, fosfónová alebo fosforečná vo forme soli, vytvorenej prídavkom minerálnej alebo organickej zásady, výhodne terapeuticky prijateľnej.
6. Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu podľa nároku 1 až 4 všeobecného vzorca (I), kde znamená X alebo Z pomocnú skupinu všeobecného vzorca (III)
O-CO-(CH2)s-W (III), kde znamená s 1 až 10, najmä 4, 5 alebo 6.
W skupinu formylovú, aminoskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú alebo karboxylovú skupinu.
7. Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu podľa nároku 1 až 5 všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV), 1 ! 1 2
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n a m 0 až 10, p a q 1 až 10, jeden z X a Z skupinu karboxylovú, dihydroxyfosforyloxylovú, karboxy[(Ci-C5)alkoxy]skupinu, karboxy[(Ci-C5)alkyltio]skupinu, skupinu [karboxy(Ci-C5)alkyl]aminokarbonylovú, [dikarboxy(Ci-C5)alkyl]aminokarbonylovú, {[karboxy[arnino(C|-C5)alkyl]}aminokarbonylovú a druhý acyloxyskupinu zo súboru zahŕňajúceho 6-aminohexanoyloxyskupinu, skupinu 6-oxohexanoylovú, 6-hydroxyhexanoyloxyskupinu, 6,7-dihydroxyheptanoyloxyskupinu a 3-karboxypropanoyloxyskupinu.
8. Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu podľa nároku 1 až 7, ktorým je
- α-N- {(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl} amid N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej kyseliny a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6,7-dihydroxyheptanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-oxohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-0-(6,7-dihydroxyheptanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-O-(6-oxohexanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-O-(6-hydroxyhexanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- (3RS,9R)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylaminojdekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-aminohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- (3R,9R)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylaminojdekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-aminohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- (3RS,9R)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylaminojdekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-aminohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-hydroxyhexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- 2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(dihydroxyfosforyloxy)butanoát {2-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-5-(6-oxohexyl)amino}pentylu a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- (2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylamino]nonán-l,9-diol 1-O-karboxymetyléter 9-0-(6-oxohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- (2S,8R)-l-(karboxymetyl)tio-2-[(R)-3-tetradekanoyloxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]nonán-9-ol 9-O-(7-aminoheptanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- (2S,8R)-2-[(R)-3-tetradekanoyloxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]nonán-9-ol 1-0-(2,2-dikarboxyetyl)éter 9-0-(6-oxohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-
1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-brómacetamidohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- (3RS,9R)-3-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-3-oxo-4-aza-9-[(R)-3-dekanoyloxytetradekanoylamino]dekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát lO-O-(ó-oxohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N- {(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl} -amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-sukcinylamidohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-glycinyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-sukcinyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-N-(3-aminopropylamid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N- {(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl} amid β-Ν-[( 1 S)-1 -karboxy-5 -aminopentyljamid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}-amid /3-N-[(lS)-l-karboxy-5-aminopentyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxy-tetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- o-N-{(4R)-5-(5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid /3-N-[(lS)-l,2-dikarboxyetyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}-amid /3-N-(lS)-l,2-dikarboxyetyljamid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxy-tetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}-amid kyseliny N-acetyl-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}-amid kyseliny N-(2-dekanoyloxyoktanoyl)-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou.
9. Derivát N-acylovaného pseudodipeptidu podľa nároku 1 až 7, ktorým je
- a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej kyseliny a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6,7-dihydroxyheptanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-oxohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N- {(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl} amid 5-O-(6,7-dihydroxyheptanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid 5-O-(6-oxohexanoát) kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- (3RS,9R), (3R,9R) a (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekán-l,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-aminohexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-1,10-diol 1-dihydrogenfosfát 10-(6-hydroxyhexanoát) a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- 2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(dihydroxyfosforyloxy)butanoát {2-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-5-(6-oxohexyl)amino}pentylu a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}-amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-sukcinyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl}-amid /3-N-[(lS)-l-karboxy-5-aminopentyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxy-tetradekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou,
- α-N- {(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]pentyl} -amid /3-N-[( 1 S)-1,2-dikarboxyetyl]amid kyseliny N-[(R)-3-dodekanoyloxytetra-dekanoyl]-D-asparágovej a jeho adičné soli s minerálnou alebo s organickou zásadou.
10. Spôsob prípravy derivátu N-acylovaného pseudodipeptidu, ktorý má kyslú skupinu v neutrálnej alebo v nabitej forme na jednom konci pseudodipeptidu a ktorý má na druhom konci pomocnú funkcionalizovanú vetvu, všeobecného vzorca (I), kde jednotlivé symboly majú význam uvedený v nároku 1, podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa blokuje aminoskupina v polohe (q+1) a skupinu YH v polohe omega omega-funkcionalizovanej aminokyseliny reakčnými činiteľmi ortogonálneho blokovania, voľná karboxylová skupina sa redukuje za získania príslušného alkoholu, uvoľní sa aminoskupina v polohe (q+1) a acyluje sa funkčným derivátom karboxylovej kyseliny vzorca R2OH, kde R2 má uvedený význam, a uvoľní sa koncová alkoholová skupina alebo aminoskupina za získania funkcionalizovaného aminoalkoholu všeobecného vzorca (V)
Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (V),
I
NHR2 kde znamená
Y skupinu hydroxylovú alebo výhodne aminoskupinu NH2,
R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, p a q 1 až 10, ktorý sa kondenzuje za prítomnosti peptidického kondenzačného činidla v inertnom rozpúšťadle s derivátom omega-funkcionalizovanej aminokyseliny všeobecného vzorca (VI)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI),
NHR1 kde znamená
R1 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, ma n 0 až 10,
X kyslú definovanú skupinu prípadne v esterifikovanej forme za vytvorenia pseudodipeptidu všeobecného vzorca (VII)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (VII),
I I
NHR1 NHR2 kde X, Y, R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam, a koncová voľná alkoholová skupina sa prípadne substituuje, alkyluje alebo acyluje substitučným, alkylačným alebo acylačným reakčným činidlom všeobecného vzorca (VIII)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII), kde znamená
A odstupujúcu skupinu, skupinu hydroxylovú, SH alebo NH2, r výhodne 1, ale tiež 0, s výhodne 2 až 6, ale tiež 1 až 10,
W výhodne skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, skupinu sulfhydrylovú, alkyltioskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, zmiešaného anhydridu, amidu alebo hydrazidu, azidoskupinu, tiokyanoskupinu alebo ich prekurzory, prípadne za prítomnosti kopulačného činidla a produkt sa katalytický hydrogenuje alebo sa inak odstraňuje chrániaca skupina, za získania derivátu všeobecného vzorca (I)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (I),
II
NHR1NHR kde X, Y, Z, R1, R2, n, m, p a q majú uvedený význam.
11. Spôsob prípravy podľa nároku 10 derivátu N-acylovaného pseudodipeptidu všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)„-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z(IV),
II
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n a m 0 až 10, p a q 1 až 10,
Y atóm kyslíka alebo skupinu NH,
X a Z kyslú skupinu v neutrálnej forme alebo nabitej forme, alebo pomocné funkcionalizované vetvy, vyznačujúci sa tým, že sa blokujú aminoskupiny v polohe (q+1) a v polohe omega diaminokyseliny všeobecného vzorca
H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q.1COOH, kde p a q majú uvedený význam, reakčnými činidlami zavádzajúcimi chrániace skupiny odstrániteľné acidolýzou a hydrogenolýzou, voľná karboxylová skupina sa redukuje za vytvorenia zodpovedajúceho alkoholu, uvoľňuje sa aminoskupina v polohe (q+1) a acyluje sa funkčným derivátom karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca R2OH, kde R2 má uvedený význam, uvoľňuje sa koncová aminoskupina hydrogenolýzou za získania aminoalkoholu všeobecného vzorca (IX)
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (IX),
I
NHR2 kde znamená
R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, p a q 1 až 10, ktorý sa kondenzuje za prítomnosti peptidického kondenzačného činidla v inertnom rozpúšťadle s derivátom aminokyseliny omega hydroxylovanej všeobecného vzorca (VI)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI),
I
NHR1 kde znamená
R1 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, m 1 až 10, n 0 až 10,
X dialkyloxyfosforyloxyskupinu alebo diaryloxyfosforyloxyskupinu všeobecného vzorca (R0)2P-0
I o
na vytvorenie pseudodipeptidu všeobecného vzorca (X) (RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (X),
I I I
O NHR1 NHR2 kde R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou, a koncová voľná alkoholová skupina sa prípadne substituuje, alkyluje alebo acyluje substitučným, alkylačným alebo acylačným reakčným činidlom všeobecného vzorca (VIII)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII), kde znamená
A odstupujúcu skupinu, skupinu hydroxylovú, SH alebo NH2, r výhodne 1, ale tiež 0, s výhodne 2 až 6, ale tiež 1 až 10,
W výhodne skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, skupinu sulfhydrylovú, alkyltioskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, zmiešaného anhydridu, amidu alebo hydrazidu, azidoskupinu, tiokyanoskupinu alebo ich prekurzory, prípadne v prítomnosti kopulačného činidla a produkt sa katalytický hydrogenuje alebo sa inak odstraňuje chrániaca skupina za získania derivátu všeobecného vzorca (XI) (HO)2P-O-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r-(CH2)s-W (XI),
I I I
O NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p, q, r a s majú uvedený význam.
12. Spôsob prípravy podľa nároku 10 derivátu pseudodipeptidu všeobecného vzorca (XII)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-O-(CH2)q-CH-(CH2)p-Z (XII),
I I
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n 0 až 10, m, p, ql až 10,
X a Z kyslú skupinu alebo pomocnú funkcionalizovanú vetvu, vyznačujúci sa tým, že sa blokuje funkčná aminoskupina v polohe (q+1) a omega diaminokyseliny všeobecného vzorca
H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q.1COOH, kde p a q majú uvedený význam, zavedením chrániacej skupiny odstrániteľnej acidolýzou a hydrogenolýzou, voľná karboxylová skupina sa redukuje za získania zodpovedajúceho alkoholu, uvoľní sa aminoskupina v polohe (q+1) a acyluje sa funkčným derivátom karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca R2OH, kde R2 má uvedený význam, chrániaca skupina z koncovej aminoskupiny sa odstráni hydrogenolýzou a alkyluje sa koncová aminoskupina reaktívnym esterom omega-funkcionalizovaného alkylu ako triflátu za získania aminoalkoholu všeobecného vzorca (XIII)
W-(CH2)sNH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XIII),
I
NHR2 kde W má uvedený význam a kde znamená
R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, p a q 1 až 10, s 2 až 7, ale tiež 1 až 10, ktorý sa kondenzuje za prítomnosti peptidického kondenzačného činidla v inertnom rozpúšťadle s derivátom aminokyseliny omega hydroxylovanej všeobecného vzorca (VI)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI),
I
NHR1 kde znamená
R1 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, m 1 až 10, n 0 až 10,
X dialkyloxyfosforyloxyskupinu alebo diaryloxyfosforyloxyskupinu všeobecného vzorca (R0)2P-0
I o
na vytvorenie pseudodipeptidu všeobecného vzorca (XIV) (RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-O-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(CH2)s-W (XIV),
I I I
O NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p a q a s majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou, produkt sa katalytický hydrogenuje alebo sa odstraňuje chrániaca skupina za získania derivátu všeobecného vzorca (XV) (HO)2P-O-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-O-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(CH2)s-W (XV),
I I I
O NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p, q, r a s majú uvedený význam, pričom výhodne znamená
W skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, zmiešaného anhydridu, amidu alebo hydrazidu, azidoskupinu, tiokyanoskupinu alebo ich prekurzory.
13. Spôsob prípravy podľa nároku 10 derivátu karboxypseudodipeptidu všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV),
I I
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n 0 až 10, m, p a q 1 až 10,
X a Z kyslú skupinu alebo pomocnú funkcionalizovanú vetvu, vyznačujúci sa tým, že sa blokujú aminoskupiny v polohe (q+1) a v polohe omega diaminokyseliny všeobecného vzorca
H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q.1COOH, kde p a q majú uvedený význam, zavedením chrániacej skupiny odstrániteľnej acidolýzou a hydrogenolýzou, karboxylová voľná skupina sa redukuje za získania zodpovedajúceho alkoholu, odstraňuje sa skupina chrániaca aminoskupinu v polohe (q+1) a acyluje sa funkčným derivátom karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca R2OH, kde R2 má uvedený význam, a uvoľňuje sa koncová aminoskupina hydrogenolýzou za získania aminoalkoholu všeobecného (IX)
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)p-OH (IX),
I
NHR2 kde znamená
R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, p a q 1 až 10, ktorý sa kondenzuje za prítomnosti peptidického kondenzačného činidla inertnom rozpúšťadle s omegakarboxyaminokyselinou všeobecného vzorca (VI)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI),
NHR1 kde znamená
R1 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými definovanými substituentmi, m 1 až 10, n 0 až 10,
X je skupina RO-CO, za vytvorenia pseudodipeptidu všeobecného vzorca (XVI)
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI),
I , i 2
NHR1 NHR2 kde R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou, napríklad skupinu benzylovú, a koncová voľná alkoholová skupina sa prípadne substituuje, alkyluje alebo acyluje substitučným, alkylačným alebo acylačným reakčným činidlom všeobecného vzorca (VIII)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII), kde znamená
A odstupujúcu skupinu, skupinu hydroxylovú, SH alebo NH2, r výhodne 1, ale tiež 0, s výhodne 2 až 6, ale tiež 1 až 10,
W výhodne skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, skupinu sulfhydrylovú, alkyltioskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, zmiešaného anhydridu, amidu alebo hydrazidu, azidoskupinu, tiokyanoskupinu alebo ich prekurzory, pripadne za prítomnosti kopulačného činidla a produkt sa katalytický hydrogenuje alebo sa inak odstraňuje chrániaca skupina za získania derivátu všeobecného vzorca (XVII)
HO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r-(CH2)s-W (XVII), l , I 2
NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p, q, r a s majú uvedený význam.
14. Spôsob prípravy podľa nároku 10 derivátu pseudodipeptidu všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV),
I I
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n 0 až 10, m, p a q 1 až 10,
X a Z kyslú skupinu alebo pomocnú funkcionalizovanú vetvu, vyznačujúci sa tým, že sa blokuje voľná hydroxylová skupina pseudodipeptidu všeobecného vzorca (XVI)
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI), 1 > 1 2
NHR1 NHR2 kde R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou, ako napríklad skupinu benzylovú, labilnou chrániacou skupinou odstrániteľnou acidolýzou, uvoľňuje sa karboxylová skupina vo forme esteru, karboxylová skupina prípadne v aktivovanej forme sa redukuje za získania zodpovedajúceho primárneho alkoholu, ktorý sa prevádza na fosforečný ester spracovaním fosforylačným činidlom, skupina chrániaca hydroxylovú skupinu sa odstráni spracovaním kyselinou, a produkt sa podrobuje substitúcii, acylácii alebo alkylácii s použitím reakčného činidla všeobecného vzorca (VIII)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII), kde znamená
A odstupujúcu skupinu, skupinu hydroxylovú, SH alebo NH2, r výhodne 1, ale tiež 0, s výhodne 2 až 6, ale tiež 1 až 10,
W výhodne skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, skupinu sulfhydrylovú, alkyltioskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru, zmiešaného anhydridu alebo iného derivátu, prípadne za prítomnosti kopulačného činidla a produkt sa katalytický hydrogenuje alebo sa inak odstraňuje chrániaca skupina za získania derivátu všeobecného vzorca (XI) (HO)2P-O-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r-(CH2)s-W (XI),
I I I
O NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p, q, r, s majú uvedený význam.
15. Spôsob prípravy podľa nároku 10 derivátu pseudodipeptidu všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV),
I I
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n 0 až 10, m, p a q 1 až 10,
X a Z kyslú skupinu alebo pomocnú funkcionalizovanú vetvu, vyznačujúci sa tým, že sa odstraňuje chrániaca skupina z karboxylovej skupiny vo forme esteru v pseudodipeptide všeobecného vzorca (XVI)
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI),
I I
NHR1 NHR2 kde R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou napríklad skupinu benzylovú, takto vytvorená kyselina sa podrobuje peptidickej kopulácii s diaminoalkánom alebo s čiastočne chránenou aminokyselinou, ako je napríklad 3-benzyloxykarbonylamino-l-aminopropán, L-aspartát dibenzylu alebo benzylester e-N-benzyloxykarbonyl-L-lyzínu za prítomnosti peptidického kopulačného činidla a kopulačný produkt sa prípadne podrobí substitučnej reakcii, acylácii alebo alkylácii reakčným činidlom všeobecného vzorca (VIII)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII), kde znamená
A odstupujúcu skupinu, skupinu hydroxylovú, SH alebo NH2, r výhodne 1, ale tiež 0, s výhodne 2 až 6, ale tiež 1 až 10,
W výhodne skupinu zo súboru zahŕňajúceho skupinu formylovú, acetylovú, kyanoskupinu, atóm halogénu, aminoskupinu, skupinu brómacetamidovú alebo jódacetamidovú, acylamidoskupinu, diacylimidoskupinu, skupinu sulfhydrylovú, alkyltioskupinu, skupinu hydroxylovú, 1,2-dihydroxyetylovú, acyloxyskupinu, skupinu vinylovú, etinylovú, karboxylovú voľnú alebo vo forme esteru alebo iného derivátu, prípadne za prítomnosti aktivačného činidla a z produktu sa odstraňujú chrániace skupiny napríklad hydrogenolýzou za získania produktu všeobecného vzorca (XVIII)
R3-NH-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r-(CH2)s-W (XVIII),
I I
NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p, q, r a s majú uvedený význam a R3 znamená aminoalkylovú, karboxyalkylovú, dikarboxyalkylovú alebo aminokarboxyalkylovú skupinu.
16. Enantioméry a diastereoméry zlúčenín všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1, všeobecného vzorca (IV) podľa nároku 7, všeobecného vzorca (XI) podľa nároku 11, všeobecného vzorca (XII) podľa nároku 12, všeobecného vzorca (XVI) podľa nároku 13 alebo všeobecného vzorca (XVIII) podľa nároku 15.
17. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa chráni aminoskupina na reťazci omitínu alebo lyzínu N-benzyloxykarbonyláciou po počiatočnej reakcii kyslej skupiny so soľou medi v alkalickom prostredí, reakciou karboxylátu medi s benzylchlórmravčanom a uvoľnením karboxylovej skupiny chelatáciou medi v kyslom prostredí a následne α-Ν-terc-butoxykarbonyláciou za získania a-N-tercbutoxykarbonylovaného a omega-N-benzyloxykarbonylového derivátu.
18. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa voľná karboxylová skupina redukuje s použitím borán-sírového komplexu dimetylu alebo sa necháva reagovať karboxylový derivát s alkylchlórmravčanom za získania zmesového anhydridu, ktorý sa redukuje bórhydridom alkalického kovu alebo kovu alkalickej zeminy za získania hydroxylovaného derivátu s primárnou alkoholovou skupinou.
19. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa benzyloxykarbonylová skupina odstraňuje hydrogenolýzou v hydroxylovom rozpúšťadle obsahujúcom trietylamín.
20. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa amín, zbavený chrániacej skupiny, kopuluje s α-acylamino-omegafosforylovanou karboxylovou kyselinou za prítomnosti kopulačného peptidického činidla, spravidla 2-izobutyl-l-izobutoxykarbonyl-l,2-dihydrochinoleínu za získania chráneného fosforylovaného pseudodipeptidu.
21. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa alkoholová skupina pseudodipeptidu acyluje reakciou s omega-funkcionalizovaňou kyselinou za prítomnosti esterifikačného činidla, zvlášť N-etyl-N,N'-(dimetylaminopropyl)-karbodiimidu, za získania alkenylesteru.
22. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa alkenylová skupina alkenylesteru dihydroxyluje na susednej diolovej skupine, pričom sa po odstránení chrániacej skupiny pseudodipeptid oxiduje j odistou kyselinou za získania zlúčeniny, ktorá má aldehydovú skupinu.
23. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa alkoholová skupina pseudodipeptidu acyluje omega-alkánovou kyselinou.
24. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa všetky chrániace skupiny odstraňujú hydrogenolýzou za prítomnosti katalyzátora za získania pseudodipeptidu s aminoalkanoylovou pomocnou skupinou.
25. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že kyslou reakčnou kopulačnou zložkou je derivát asparágovej kyseliny alebo glutámovej kyseliny získaný acyláciou aminoskupiny 0-benzylesteru aminokyseliny derivátom mastnej kyseliny za prítomnosti acylačného činidla za získania /3-benzylesteru N-acyl asparágovej alebo glutámovej kyseliny.
26. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že na N-acylderivát asparágovej alebo glutámovej kyseliny kopuluje s aminoalkohol-a-acylderivátom omitínu alebo lyzínu a získaný pseudodipeptid sa podrobuje hydrogenolýze za prítomnosti katalyzátora za získania pseudodipeptidu s karboxylovou skupinou.
27. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa hydroxylová skupina pseudodipeptidu acyluje s použitím omega-funkcionalizovanej kyseliny alkenylovou skupinou a alkenylová skupina sa podrobuje dihydroxylácii, odstráneniu chrániacej skupiny a oxidácii kyselinou jodistou za získania zlúčeniny všeobecného vzorca (XVII).
28. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa hydroxylová skupina pseudodipeptidu acyluje s použitím omega aminoalkánovej kyseliny za získania zlúčeniny všeobecného vzorca (XVII).
29. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa aminoalkohol získaný redukciou omitínu alebo lyzínu alkyluje omega-alkenyltriflátom, kopuluje sa s a-acylaminovanou omega-fosforylovanou karboxylovou kyselinou za prítomnosti acylačného činidla, ako N-etyl-N,N'-(dimetylaminopropyl)karbodiimid, alkenylová skupina sa dihydroxyluje za prítomnosti oxidu osmičelého, chrániaca skupina sa odstráni a susedná diolová skupina sa oxiduje jodistanom sodným za získania zlúčeniny s aldehydovou skupinou.
30. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa O-alkyluje na dusíku chránený serín, skupina chrániaca aminoskupinu sa odstráni acidolýzou, znovu sa acyluje aminoskupina 3-hydroxylovaným derivátom mastnej kyseliny za prítomnosti acylačného činidla za získania N-acylovaného O-alkylovaného derivátu serínu, ktorý sa kopuluje s aminoalkoholom za prítomnosti peptidického kopulačného činidla, acyluje sa voľná hydroxylová skupina omega-funkcionalizovanou alkánovou kyselinou za získania zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde znamená X karboxyalkyloxyskupinu.
31. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že východiskovou aminokyselinou je cysteín alebo homocysteín, ktorý sa alkyluje p-metoxybenzylbróm-acetátom, acyluje sa na dusíku 3-hydroxylovanou mastnou kyselinou, kopuluje sa S-alkylovaný a N-acylovaný derivát takto získaný s 5-amino-2-[3-hydroxytetradekanoyl-amino]pentán-l-olom za prítomnosti peptidického kopulačného činidla a získaný kondenzačný produkt sa acyluje na primárnej voľnej alkoholovej skupine omega-funkcionalizovanou alkánovou kyselinou a produkt sa prípadne zbavuje chrániacej skupiny za získania zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde X znamená karboxyalkyltioskupinu.
32.Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa p-metoxybenzyloxykarbonylderivát serínu O-alkyluje s použitím dibenzylmetylén-malonátu v alkalickom prostredí, aminoskupina sa zbavuje chrániacej skupiny spracovaním kyselinou a voľná aminoskupina sa acyluje 3-hydroxylovanou kyselinou za prítomnosti acylačného činidla, takto získaný N-acylovaný O-alkylovaný derivát sa kopuluje s aminoalkoholom za prítomnosti kopulačného peptidického činidla za získania pseudodipeptidu, ktorý sa acyluje na voľnej hydroxylovej skupine s použitím omega-funkcionalizovanej alkánovej kyseliny skupinou aldehydovou alebo amínovou, alkenylový derivát sa dihydroxyluje, chrániaca skupina sa odstraňuje hydrogenolýzou a oxidáciou jodistou kyselinou za získania zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde X znamená dikarboxyalkoxyskupinu.
33. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa vychádza z benzylesteru O-fosforylovaného homoserínu, ktorý sa N-acyluje 3-benzyloxytetradekánovou kyselinou, benzylester sa selektívne hydrogenolyzuje, kyselina sa kopuluje s derivátom α-Ν-dodekanoyloxytetradekanoomitinolu za prítomnosti kopulačného peptidického činidla za získania pseudodipeptidu, ktorého voľná hydroxylová skupma sa acyluje s použitím omega-fimkcionalizovanej kyseliny alkenylovou skupinou alebo aminoskupinou za prítomnosti karbodiimidu a prípadný alkenylderivát sa podrobuje dihydroxylácii, odstráneniu chrániacej skupiny hydrogenolýzou za prítomnosti katalyzátora a oxidácii kyselinou jodistou za získania zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde R1 znamená hydroxyalkanoylovú skupinu a R2 acyloxyalkanoylovú skupinu.
34. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa pseudodipeptid ako medziprodukt kyseliny asparágovej alebo glutámovej chráni na voľnej hydroxylovej skupine zavedením skupiny odstrániteľnej acidolýzou, karboxylová skupina obsiahnutá vo forme esteru sa zbavuje chrániacej skupiny odstrániteľnej iným spôsobom a zvlášť hydrogenolýzou a uskutočňuje sa redukcia výhodne po aktivácii vo forme zmesového anhydridu redukčným činidlom ako bórhydridom alkalického kovu, takto vytvorená hydroxylová skupina sa fosforyluje, skupina chrániaca hydroxylovú skupinu sa odstraňuje hydrolýzou v kyslom prostredí, takto regenerovaná hydroxylová skupina sa acyluje omega-funkcionalizovanou karboxylovou kyselinou a podrobuje sa dihydroxylácii a následne odstráneniu chrániacej skupiny hydrogenolýzou za prítomnosti katalyzátora a oxiduje sa jodistou kyselinou za získania zlúčeniny všeobecného vzorca (XI), ktorá má aldehydovú skupinu.
35. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa pseudodipeptid ako medziprodukt kyseliny asparágovej alebo glutámovej zbavuje chrániacej skupiny na karboxylovej skupine, obsiahnutej vo forme esteru, karboxylová skupina sa kopuluje s aminoalkánom alebo s aminokyselinou čiastočne chránenou za prítomnosti kopulačného činidla, kopulačný produkt sa buď zbavuje chrániacej skupiny najmä hydrogenolýzou alebo sa podrobuje acylačnej reakcii s použitím omega-funkcionalizovanej alkánovej kyseliny a v prípade alkenylderivátu sa podrobuje dihydroxylácii, následne sa odstraňuje chrániaca skupina, najmä hydrogenolýzou a oxidáciou kyselinou jodistou za získania zlúčeniny všeobecného vzorca (XVIII).
36. Pseudodipeptid všeobecného vzorca (IV)
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV),
I I
NHR1 NHR2 kde znamená
R1 a R2 acylovú skupinu odvodenú od karboxylovej kyseliny s 2 až 24 atómami uhlíka, nasýtenej alebo nenasýtenej, lineárnej alebo rozvetvenej, nesubstituovanej alebo substituovanej jedným alebo niekoľkými substituentmi, volenými zo súboru zahŕňajúceho skupinu hydroxylovú, alkylovú, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, n a m 0 až 10, p a q 1 až 10,
Y atóm kyslíka alebo skupinu NH,
X a Z kyslú skupinu v neutrálnej forme alebo nabitej forme, alebo pomocné funkcionalizované vetvy, pseudodipeptid všeobecného vzorca (XVI)
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI), i 1 I 2
NHR1 NHR2 kde R1, R2, m, n, p a q majú uvedený význam a R znamená chrániacu skupinu odstrániteľnú hydrogenolýzou, pseudodipeptid všeobecného vzorca (XVII)
HO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r-(CH2)s-W (XVII),
I I
NHR1 NHR2 kde W, R1, R2, m, n, p, q, r a s majú uvedený význam, v enantiomémej čistej forme alebo vo forme zmesi stereoizomérov.
37. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako účinnú látku aspoň jednu zlúčeninu podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I) vo forme racemickej alebo opticky aktívnej, vo forme čistých diastereomérov alebo vo forme zmesi, vo forme neutrálnej alebo spolu s nábojom alebo v zmesi s inertným excipientom alebo nosičom netoxickým a farmaceutický prijateľným.
38. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako účinnú látku aspoň jednu soľ zlúčeniny všeobecného vzorca (I) s terapeuticky prijateľnou anorganickou alebo organickou zásadou.
39. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako účinnú látku aspoň jednu zlúčeninu všeobecného vzorca (I) vo forme čistého diastereoméru alebo vo forme zmesi spolu alebo v zmesi s farmaceutický prijateľným excipientom alebo nosičom.
40. Zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I) naštepená na antigén na použitie na úpravu imunitnej odozvy.
41. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje konjugát podľa nároku 40.
42. Zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I) naštepená na farmakofór na použitie na zlepšovanie terapeutickej účinnosti a/alebo jej cielenia.
43. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kompozíciu podľa nároku 42.
SK920-2002A 1999-12-22 2000-12-21 Acylpseudodipeptid s pomocnou funkčnou vetvou, spôsoby jeho prípravy a farmaceutické prostriedky, ktoré ho obsahujú SK287514B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB1999/002038 WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 1999-12-22 Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
PCT/FR2000/003650 WO2001046126A1 (fr) 1999-12-22 2000-12-21 Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK9202002A3 SK9202002A3 (en) 2003-04-01
SK287514B6 true SK287514B6 (sk) 2010-12-07

Family

ID=11004948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK920-2002A SK287514B6 (sk) 1999-12-22 2000-12-21 Acylpseudodipeptid s pomocnou funkčnou vetvou, spôsoby jeho prípravy a farmaceutické prostriedky, ktoré ho obsahujú

Country Status (16)

Country Link
US (3) US7799762B2 (sk)
EP (1) EP1242365A1 (sk)
JP (1) JP4902924B2 (sk)
CN (2) CN1434795B (sk)
AR (1) AR035024A1 (sk)
AU (3) AU1581400A (sk)
BR (1) BR0016696A (sk)
CA (1) CA2395197C (sk)
CZ (1) CZ20022194A3 (sk)
HU (1) HUP0204531A3 (sk)
LV (1) LV12886B (sk)
PL (1) PL208584B1 (sk)
RU (1) RU2275378C2 (sk)
SK (1) SK287514B6 (sk)
TW (1) TWI237022B (sk)
WO (2) WO2001046127A1 (sk)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6835721B2 (en) 1999-02-01 2004-12-28 Eisai Co., Ltd. Immunomodulatory compounds and methods of use thereof
US7915238B2 (en) 1999-02-01 2011-03-29 Eisai R & D Management Co., Ltd. Immunomodulatory compounds and methods of use thereof
US20040006242A1 (en) 1999-02-01 2004-01-08 Hawkins Lynn D. Immunomodulatory compounds and method of use thereof
AU1581400A (en) * 1999-12-22 2001-07-03 Om Pharma Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer
AU2005249212B2 (en) 2004-05-28 2010-05-20 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant
AU2005266106B2 (en) * 2004-07-23 2010-12-09 Om Pharma Combination anticancer therapy and pharmaceutical compositions therefore
WO2006095270A1 (en) * 2005-03-10 2006-09-14 Om Pharma Combination anticancer therapy or om-174 and pharmaceutical compositions therefor
US20060210590A1 (en) 2005-02-03 2006-09-21 Alk-Abello A/S Minor allergen control to increase safety of immunotherapy
GB0503337D0 (en) 2005-02-17 2005-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions
JP5869744B2 (ja) 2005-03-23 2016-02-24 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｃｄ４ｔ細胞および／または改善された記憶ｂ細胞応答を誘導するためのインフルエンザウイルスおよび水中油型エマルジョンアジュバントの使用
CN101355928B (zh) 2005-04-26 2013-05-22 卫材R&D管理株式会社 用于癌症免疫疗法的组合物和方法
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CA2808919C (en) 2005-12-22 2016-04-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine
AU2007222135B2 (en) * 2006-03-09 2012-02-02 Om Pharma Immunomodulatory compounds and treatment of diseases related to an overproduction of inflammatory cytokines
EP2476434A1 (en) 2006-03-30 2012-07-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
PL2422810T3 (pl) 2006-07-17 2015-03-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Szczepionka przeciw grypie
BRPI0715581A2 (pt) 2006-07-18 2013-04-24 Glaxosmithkline Biolog Sa proteÍna de fusço hÍbrida imunogÊnica, composiÇço, uso de uma proteÍna ou uma partÍcula, mÉtodo para tratar um paciente suscetÍvel À infecÇço por plasmàdio, sequÊncia de nucleotÍdeo, hospedeiro, e, processo para a produÇço de proteÍna
WO2008012538A2 (en) 2006-07-25 2008-01-31 The Secretary Of State For Defence Live vaccine strains of francisella
DK2137210T3 (en) 2007-03-02 2017-01-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hitherto unknown method and compositions
TW200908994A (en) 2007-04-20 2009-03-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP2687228B1 (en) 2007-06-26 2017-07-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
ES2626634T3 (es) 2007-12-19 2017-07-25 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Formas solubles de la glucoproteína F del virus de Hendra y Nipah y usos de la misma
AU2008340949A1 (en) 2007-12-24 2009-07-02 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Recombinant RSV antigens
KR20110009157A (ko) 2008-04-16 2011-01-27 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
WO2010079081A1 (en) 2009-01-07 2010-07-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Methods for recovering a virus or a viral antigen produced by cell culture
GB0901423D0 (en) 2009-01-29 2009-03-11 Secr Defence Treatment
GB0901411D0 (en) 2009-01-29 2009-03-11 Secr Defence Treatment
JP5843615B2 (ja) 2009-02-06 2016-01-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 密度勾配超遠心分離によるウイルスまたはウイルス抗原の精製
AR075437A1 (es) 2009-02-17 2011-03-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica que comprende al menos un antigeno del virus del dengue inactivado y un adyuvante sin aluminio, metodo para producir dicha vacuna y su uso para preparar un medicamento
GB0906234D0 (en) 2009-04-14 2009-05-20 Secr Defence Vaccine
MX2012000036A (es) 2009-06-24 2012-02-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna.
US9492531B2 (en) 2009-06-24 2016-11-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant RSV vaccines
DK3178490T3 (da) 2009-07-15 2022-06-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa RSV F-proteinsammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af disse
GB0913680D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
CA2774555A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunodiffusion assay for influenza virus
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
CN102858961A (zh) 2010-05-03 2013-01-02 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 新方法
GB201009273D0 (en) 2010-06-03 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
US20130216613A1 (en) 2010-10-15 2013-08-22 Guy Jean Marie Fernand Pierre Baudoux Cytomegalovirus gb antigen
US20140072622A1 (en) 2011-05-17 2014-03-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine against streptococcus pneumoniae
US20130144540A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-06 Palo Alto Research Center Incorporated Constrained de novo sequencing of peptides
JP2015514696A (ja) 2012-03-18 2015-05-21 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ヒト・パピローマウイルスに対するワクチン接種方法
US20140037680A1 (en) 2012-08-06 2014-02-06 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Novel method
CA2879939A1 (en) 2012-08-06 2014-02-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method
BE1022174B1 (fr) 2013-03-15 2016-02-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccin
EP3632458A1 (en) 2013-07-26 2020-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of bacterial infections
KR20160040290A (ko) 2013-08-05 2016-04-12 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 조합 면역원성 조성물
ES2778928T3 (es) 2013-08-30 2020-08-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Producción a gran escala de virus en cultivos celulares
CN104436157A (zh) 2013-09-23 2015-03-25 恩金生物有限公司 流感疫苗和治疗
WO2015130584A2 (en) 2014-02-25 2015-09-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
WO2015165480A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same
JP6664338B2 (ja) 2014-06-13 2020-03-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組合せ物
CA2977493C (en) 2015-03-03 2023-05-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Display platform from bacterial spore coat proteins
WO2016180852A1 (en) 2015-05-12 2016-11-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for preparing antigen-specific t cells from an umbilical cord blood sample
WO2016207408A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Institute For Research In Biomedicine Novel vaccines in prevention and treatment of malaria
GB201614799D0 (en) 2016-09-01 2016-10-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions
MX2019006349A (es) 2016-12-16 2019-08-22 Inst Res Biomedicine Proteinas recombinantes rsv f de prefusion nuevas y usos de las mismas.
US20200093909A1 (en) 2017-04-19 2020-03-26 Institute For Research In Biomedicine Plasmodium sporozoite npdp peptides as vaccine and target novel malaria vaccines and antibodies binding to
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
EP4004018A1 (en) 2019-07-24 2022-06-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Modified human cytomegalovirus proteins
MX2023006320A (es) 2020-12-02 2023-06-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Cadena donante complementada fimh.
WO2022161598A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 Eth Zurich Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof
WO2022162012A2 (en) 2021-01-26 2022-08-04 Eth Zurich Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof
WO2023114727A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bacteriophage lambda-vaccine system
WO2023144665A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified human cytomegalovirus proteins

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2460290A1 (fr) * 1979-06-29 1981-01-23 Rhone Poulenc Ind Nouveaux tetra- ou pentapeptides, leur preparation et les medicaments qui les contiennent
DE4119856A1 (de) 1991-06-17 1992-12-24 Hoechst Ag N-acyl-s-(2-hydroxyalkyl)-cysteine, deren herstellung sowie deren verwendung als zwischenprodukte zur herstellung von synthetischen immunadjuvantien und synthetischen impfstoffen
DE4123366A1 (de) 1991-07-15 1993-01-21 Sandoz Ag Acylpentanoylamidoglycinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE4123365A1 (de) 1991-07-15 1993-01-21 Sandoz Ag Acylaminopentansaeurederivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
JPH06206893A (ja) * 1992-09-07 1994-07-26 Suntory Ltd 新規なジサッカライド誘導体
EP0668289A4 (en) * 1993-09-07 1998-10-21 Suntory Ltd NEW DISACCHARIDE DERIVATIVE.
DK1108738T3 (da) * 1993-09-10 2003-07-28 Petrovax Inc Immunstimulerende vaccinebærer
DK0729473T3 (da) * 1993-11-17 2000-10-30 Deutsche Om Arzneimittel Gmbh Glucosamin-disaccharider, fremgangsmåde til deres fremstilling farmaceutisk sammensætning deraf og deres anvendelse
GB9727123D0 (en) * 1997-12-22 1998-02-25 Int Centre Genetic Eng & Bio Synthesis of diamines
AU761396B2 (en) * 1998-06-30 2003-06-05 Om Pharma Novel acyl pseudodipeptides, preparation method and pharmaceutical compositions containing same
AU1581400A (en) * 1999-12-22 2001-07-03 Om Pharma Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer

Also Published As

Publication number Publication date
AU2857201A (en) 2001-07-03
JP4902924B2 (ja) 2012-03-21
US20030203852A1 (en) 2003-10-30
SK9202002A3 (en) 2003-04-01
AU2006202085C1 (en) 2012-07-05
CN1434795A (zh) 2003-08-06
US7799762B2 (en) 2010-09-21
AU2006202085A1 (en) 2006-06-15
WO2001046127A1 (fr) 2001-06-28
CN1434795B (zh) 2012-11-14
US8173133B2 (en) 2012-05-08
EP1242365A1 (fr) 2002-09-25
CN101164543A (zh) 2008-04-23
HUP0204531A3 (en) 2004-12-28
RU2002119418A (ru) 2004-01-10
PL208584B1 (pl) 2011-05-31
CA2395197A1 (fr) 2001-06-28
AU1581400A (en) 2001-07-03
AR035024A1 (es) 2004-04-14
US20050192232A1 (en) 2005-09-01
HUP0204531A2 (hu) 2003-06-28
CZ20022194A3 (cs) 2002-11-13
JP2003518086A (ja) 2003-06-03
CN101164543B (zh) 2012-03-21
RU2275378C2 (ru) 2006-04-27
LV12886B (en) 2003-03-20
BR0016696A (pt) 2004-06-22
CA2395197C (fr) 2013-03-26
AU2006202085B2 (en) 2012-01-19
US20100215685A1 (en) 2010-08-26
TWI237022B (en) 2005-08-01
WO2001046126A1 (fr) 2001-06-28
PL356405A1 (en) 2004-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK287514B6 (sk) Acylpseudodipeptid s pomocnou funkčnou vetvou, spôsoby jeho prípravy a farmaceutické prostriedky, ktoré ho obsahujú
ES2284275T3 (es) Nuevos pseudodipeptidos acilados, su procedimientos de preparacion y las composiciones farmaceuticas que los incluyen.
JP2003518086A5 (sk)
AU768574B2 (en) Immunological adjuvant compound
EP1420825A2 (en) Immunomodulatory compounds and methods of use thereof
US7560584B2 (en) Immunomodulatory compounds and methods of use thereof
US20130022628A1 (en) Acyl pseudopeptides which carry a functionalized auxiliary arm
KR100898844B1 (ko) 작용기화된 보조 아암을 가진 아실 슈도디펩티드
AU2008202882A1 (en) Immunological adjuvant compound

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20131221