SK285960B6 - Rekombinantné protilátky na liečenie ľudí - Google Patents

Abstract

Opisuje sa chimérna protilátka, ktorá sa viaže špecificky k ľudskému antigénu, je neimunogénna u človeka a nie je taká istá ako ľudská alebo šimpanzia protilátka a ktorá obsahuje polypeptidy s ľahkýma ťažkým reťazcom, z ktorých každý obsahuje: variabilnú oblasť, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu variabilnej oblasti protilátky opice Starého svetavybranej z makakov rézus, makakov jávskych a paviánov, konštantnú oblasť, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu konštantnej oblasti ľudskej alebo šimpanzej protilátky. Tiež je opísaný farmaceutický prostriedok s jej obsahom, spôsob jej výroby a použitie.

Description

Tento vynález sa týka chimérnej protilátky, ktorá sa viaže špecificky k ľudskému antigénu, farmaceutického prostriedku s jej obsahom, spôsobu jej výroby a použitia. Ďalej sa opisuje rekombinantná nukleová kyselina, ktorá obsahuje nukleotidové sekvencie kódujúce polypeptidy s ľahkým a ťažkým reťazcom chimérnej protilátky podľa vynálezu a fragment tejto chimérnej protilátky. Chimérna protilátka podľa vynálezu sa používa na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu ochorenia alebo poruchy vybranej zo skupiny pozostávajúcej z rakoviny, infekčného ochorenia, odmietnutia transplantovaného orgánu alebo tkaniva, a autoimúnneho alebo zápalového ochorenia alebo poruchy.

Doterajší stav techniky

Myšie monoklonálne protilátky sa používajú v diagnostike ľudských chorôb a v riešení základných problémov biologického výskumu. Tieto činidlá sa tiež používajú v klinických skúškach ako terapeutiká na akútne a chronické ľudské ochorenia vrátane leukémii, lymfómov, tuhých nádorov (napr. nádoru hrubého čreva, prsníka, pečene), AIDS a autoimúnnych ochorení.

Pripravili sa myšie/ľudské chiméme protilátky a ukázalo sa, že vykazujú väzobné charakteristiky rodičovskej myšej protilátky a efektorové funkcie spojené s ľudskou konštantnou oblasťou. Pozri napr. Cabilly a kol., U.S. Patent 4 816 567; Shoemaker a kol., U.S. Patent 4 978 745; Beavers a kol., U.S. Patent 4 975 369; a Boss a kol., U.S. Patent 4 816 397, ktoré sú tu všetky zahrnuté ako odkaz. Vo všeobecnosti sa tieto chimérne protilátky konštruujú prípravou genómovej génovej knižnice z DNA extrahovanej z už existujúcich myších hybridómov. Nishimura a kol., 47 Cancer Research 999, 1987. V knižnici sa potom vyhľadávajú gény variabilných oblastí ťažkých a ľahkých reťazcov vykazujúce správny typ preskupenia fragmentu protilátky. Klonované gény s variabilnými oblasťami sa potom ligujú do expresného vektora obsahujúceho klonované kazety vhodného génu ľudskej konštantnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca. Chimérne gény sa potom exprimujú do vybranej bunkovej línie, zvyčajne myšej myelómovej línie.

Takéto chimérne protilátky sa použili v humánnej terapii. Protilátky proti týmto chimérnym protilátkam sa však v mnohých prípadoch vytvárali v ľudskom príjemcovi. Takéto protilátky proti chimérnej protilátke znemožňujú pokračovanie terapie chimérnymi protilátkami.

Erlich a kol., 34 Clinical Chemistry 1681, 1988, Erlich a kol., 7 Hybridoma 385, 1988, Erlich a kol., 6 Hybridoma 151, 1987, Erlich a kol., 1 Human Antibody Hybridomas 23, 1990 (neprípustné ako doterajší stav techniky k tejto prihláške) uvádza, že ľudské monoklonálne protilátky sú očakávaným zlepšením v porovnaní s myšími monoklonálnymi protilátkami v humánnej terapii in vivo. Tiež sa uvádza, že protilátky primátov, iné ako ľudské napr. šimpanzie monoklonálne protilátky budú tolerované v ľuďoch, pretože sú štruktúrne podobné ľudským protilátkam. Pretože ľudské protilátky sú neimunogénne v opiciach makak rézus (t. j. nevyvolávajú protilátkovú odpoveď), predpokladá sa, že protilátky primátov budú neimunogénne u ľudí. Naznačujú, že testovanie protilátok u ľudí nebude potrebné, ak protilátka primáta má štruktúru konštantnej oblasti rovnakú, ako má ľudský imunoglobulín alebo aspoň, ak štruktúra nie je odlišná viac, ako sú protilátky odlišné medzi sebou navzájom. Teda navrhuje sa, že šimpanzie protilátky by mali byť užitočné v ľudskej terapii.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka chimérnej protilátky, ktorá sa viaže špecificky k ľudskému antigénu, je neimunogénna u človeka, a nie je taká istá ako ľudská alebo šimpanzia protilátka, a ktorá obsahuje polypeptidy s ľahkým a ťažkým reťazcom, z ktorých každý obsahuje variabilnú oblasť, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu variabilnej oblasti protilátky opice Starého sveta vybranej z makakov rézus, makakov jávskych a paviánov, a konštantnú oblasť, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu konštantnej oblasti ľudskej alebo šimpanzej protilátky.

Chimérna protilátka podľa vynálezu obsahuje polypeptidy s ľahkým a ťažkým reťazcom, z ktorých každý obsahuje konštantnú oblasť majúcu aminokyselinovú sekvenciu konštantnej oblasti ľudskej protilátky. Ďalej chimérna protilátka podľa vynálezu obsahuje polypeptidy s ľahkým a ťažkým reťazcom, z ktorých každý obsahuje variabilnú oblasť majúcu aminokyselinovú sekvenciu variabilnej oblasti protilátky makaka jávskeho.

Chimérna protilátka podľa vynálezu sa špecificky viaže k CD4 a obsahuje ľahký reťazec obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu variabilnej oblasti zobrazenej na obrázku 13 a ľudskú konštantnú oblasť lambda ľahkého reťazca, a ťažký reťazec obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu variabilnej oblasti zobrazenú na obr. 14 a ľudskú konštantnú oblasť gama-1.

Chimérna protilátka podľa predloženého vynálezu obsahuje: polypeptid s ľahkým reťazcom, ktorý obsahuje konštantnú oblasť majúcu aminokyselinovú sekvenciu konštantnej oblasti kapa alebo lambda ľahkého reťazca ľudskej protilátky, a polypeptid s ťažkým reťazcom, ktorý obsahuje konštantnú oblasť majúcu aminokyselinovú sekvenciu konštantnej oblasti gama-1 ťažkého reťazca ľudskej protilátky, kde táto protilátka je produkovaná expresiou z expresného vektora TCAE 5.2 zobrazeného na obr. 5 alebo TCAE 6 zobrazeného na obr. 6.

Chimérna protilátka podľa vynálezu sa špecificky viaže k ľudskému antigénu zahrnutému v autoimúnnom ochorení alebo poruche alebo ľudskému tumorovému antigénu.

Chimérna protilátka sa špecificky viaže k ľudskému antigénu vybratému zCD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CDI 9, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFa, TNF^, Tn antigénu, IL-1, IL-8, receptora ľudských T-buniek, CD3, CD28, CD8, CDI la, CDllb, CDllc, CD18, CD5a, CD45, produktu neu onkogénu, MDR-1, TGF-α, TGFa receptora, PDGF a CD71.

Vynález sa tiež týka farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje terapeuticky účinné alebo profylaktický účinné množstvo chimérnej protilátky podľa predloženého vynálezu vo farmaceutický prijateľnom nosiči.

Vynález tiež opisuje rekombinantnú nukleovú kyselinu, ktorá obsahuje nukleotidové sekvencie kódujúce polypeptidy s ľahkým a ťažkým reťazcom chimérnej protilátky podľa predloženého vynálezu.

Tiež je opísaný spôsob výroby chimérnej protilátky, ktorá sa špecificky viaže k ľudskému antigénu aje neimunogénna u ľudí, ktorý zahrnuje expresiu uvedenej rekombinantnej nukleovej kyseliny.

Navyše, vynález opisuje použitia takýchto chimérnych protilátok (kde tento výraz zahrnuje protilátky produkované fúziou DNA z dvoch rôznych génov pre protilátky, dokonca aj z toho istého druhu, napr. dvoch rôznych génov pre opičie protilátky, napríklad makak rézus a jávsky, za vzniku opičej/opičej rekombinantnej protilátky) ako imunoterapeutických činidiel na liečenie ľudských ochorení. Vynález je založený na objave, že vývojovo vzdialené opice [napr.

pavián alebo makak (vrátane makakov rézus a makakov jávskych)], na rozdiel od šimpanza, sú nielen dostatočne rozdielne od ľudí na to, aby sa v nich dali vytvoriť protilátky proti ľudským antigénom, dokonca k relatívne konzervovaným ľudským antigénom, napr. CD4 a CD54, ale sú aj dostatočne podobné ľudom na to, aby mali protilátky podobné ľudským protilátkam tak, že nenastane žiadna imunitná odpoveď proti protilátkam u hostiteľa, keď sa takéto opičie protilátky, alebo z nich odvodené rekombinantné protilátky, zavedú do človeka.

Na rozdiel od protilátok skoršie používaných na humánnu terapiu, protilátky podľa predkladaného vynálezu nemajú niektoré nedostatky, napr. 1. imunogenitu a vyvolávanie ľudskej protilátkovej odpovede (human anti-antibody, HAA) pri opakovanom podávaní potrebnom na liečbu chronických ochorení, 2. relatívne krátky polčas života v porovnaní s ľudskými protilátkami a 3. chýbajúce efektorové funkcie k ľudským bunkám alebo komplementu. Neprítomnosť týchto nedostatkov predstavuje podstatný pokrok na humánnu terapiu protilátkami vytvorenými podľa tohto vynálezu. Napríklad v prípade chronických ľudských ochorení vrátane autoimúnnych, alebo akýchkoľvek ochorení, kde je potrebné dlhšie podávanie protilátky, jednou z hlavných prekážok opakovanej protilátkovej terapie je hostiteľská odpoveď na terapeutickú protilátku. HAA odpovede sú často nepredvídateľné od pacienta k pacientovi. Takéto odpovede sú hlavne, aj keď nie výlučne, smerované proti konštantnej oblasti molekuly protilátky a akonáhle nastanú, často bránia ďalšej terapii danou protilátkou alebo inou protilátkou rovnakého izotypu, alebo zoslabujú účinnosť terapie.

Problémy HAA by sa potenciálne dali obísť použitím ľudských monoklonálnych protilátok. Tento prístup trpí ale etickými, klinickými a imunologickými obmedzeniami imunizácie ľudských jedincov mnohými antigénmi vybranými na tvorbu protilátok (napr. ľudskými antigénmi, kde tento výraz zahrnuje antigénne alebo imunogénne úseky ľubovoľných proteínov, polypeptidov alebo ich ekvivalentov, nachádzajúcich sa u ľudí). Prihlasovateľov prístup ako obísť tento problém, zahrnuje tvorbu protilátok potrebnej špecificity a žiadanej efektorovej funkcie a ich použitie na produkciu rekombinantných protilátok. Tieto rekombinantné protilátky vo všeobecnosti obsahujú príslušný úsek variabilnej oblasti protilátky odvodenej od imunizovanej opice a konštantnú oblasť protilátky z človeka alebo šimpanza. Takto sa zachovajú špecificity a vysoké afinity monoklonálnych protilátok a môžu sa ľahko vybrať vhodné ľudské alebo šimpanzie konštantné oblasti vykazujúce žiadané efektorové funkcie.

Predkladaný vynález je ďalej založený na spôsobe amplifikácie opičích imunoglobulínových génov, napr. pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (polymerase chain reaction, PCR), z RNA extrahovanej z opičích lymfocytov s použitím syntetických oligonukleotidových primárov špecifických pre rodinu génov variabilných oblastí ťažkých a ľahkých reťazcov. Amplifikované gény alebo príslušné oblasti, napríklad oblasti, ktoré kódujú oblasti určujúce komplementárnu (complementarity determining regions, CDR); pozri Winter, britská patentová prihláška č. GB2188638A, zahrnutá odkazom) sú klonované do expresného vektora obsahujúceho ľudské alebo šimpanzie gény s konštantnými oblasťami na produkciu opičej/ľudskej rekombinantnej protilátky alebo vektora obsahujúceho opičí gén konštantnej oblasti na produkciu úplne opičej rekombinantnej protilátky žiadaného izotypu. Tieto protilátky predstavujú imunoterapeuteké činidlá schopné lokalizovať a/alebo zabíjať prí slušné cieľové bunky (napr. nádorové bunky) po in vivo podaní.

Vynález ďalej opisuje spôsob klonovania úseku rozoznávajúceho antigén variabilnej oblasti opičieho génu pre protilátku. Tento spôsob zahrnuje získanie nukleovej kyseliny, napr. RNA, z opice, tvorbu cDNA k RNA (s použitím reverznej transkriptázy), získanie priméru komplementárneho k sekvencií kódujúcej 5‘ vedúcu sekvenciu génu pre protilátku, spojenie tejto cDNA a priméru na vytvorenie hybridného komplexu a amplifikáciu cDNA za tvorby nukleovej kyseliny kódujúcej variabilnú oblasť opičieho génu pre protilátku.

Pod „úsekom rozoznávajúcim antigén“ sa myslí jeden alebo viac úsekov variabilnej oblasti opičej protilátky, ktoré sú zodpovedné za väzbu cieľového génu a/alebo za rozoznáme cieľového antigénu (alebo epitopu alebo idiotypu) protilátkou. Toto napríklad zahrnuje CDR oblasti (pozri neskôr) alebo celé variabilné oblasti, alebo akúkoľvek kombináciu týchto dvoch oblastí vrátane akýchkoľvek zmien v kódujúcich oblastiach, ktoré môžu byť vyvolané na to, aby sa oblasti stali skôr „ľudskými“ ako „opičími“ bez zmeny špecifických väzobných vlastností protilátky. Ak sa použije len časť celej variabilnej oblasti, potom zostávajúce časti, napr, takzvaná „základná štruktúra“ sú poskytnuté inou protilátkou, výhodne ľudskou alebo šimpanzou protilátkou (pozri nižšie) spôsobmi, na ktoré sa odkazuje skôr a ktoré sú tu zahrnuté odkazmi.

Výrazy „variabilná oblasť“, „vedúca sekvencia“, „konštantná oblasť“ a „základná štruktúra“ sú tu používané spôsobom bežne uznávaným v odbore a ktorého príklady sú poskytnuté neskôr a v spôsoboch citovaných v stave techniky, ktoré sú tu zahrnuté ako odkaz.

Výhodne vedúcou sekvenciou je ľudská, šimpanzia alebo opičia vedúca sekvencia s približne 60 bázami, príklady ktorých sú poskytnuté na obr. 1.

Prihlasovateľ objavil, že opičie, šimpanzie a ľudské vedúce sekvencie variabilných oblastí sú dostatočne podobné tak, že priméry skonštruované na jeden z nich sú vhodné na amplifikáciu druhého. V spôsobe je RNA dostatočne amplifikovaná na dostatočnú produkciu nukleovej kyseliny na nahradenie tej nukleovej kyseliny, ktorá je vnútri vektora na budúce klonovanie.

V ďalšom aspekte vynález opisuje spôsob výroby protilátky proti ľudskému antigénu, ktorá nie je imunogénna u človeka. Spôsob zahrnuje vznik opičej protilátky v opici proti ľudskému antigénu a izoláciu opičej nukleovej kyseliny kódujúcej úsek rozoznávajúci antigén variabilnej oblasti opičej protilátky. Poskytne sa ľudská nukleová kyselina kódujúca ľudskú konštantnú oblasť a liguje sa k opičej nukleovej kyseline za tvorby rekombinantnej nukleovej kyseliny. Táto nukleová kyselina sa potom exprimuje za tvorby požadovanej protilátky. Alternatívne sa môže použiť šimpanzia alebo ľudská nukleová kyselina kódujúca konštantnú oblasť na tvorbu rekombinantnej protilátky. V aminokyselinovej sekvencií ľudských a šimpanzích konštantných oblastí sa nachádza niekoľko rozdielov alebo žiadne rozdiely (t. j. sú homológne) a tieto rozdiely medzi človekom a opicou sa môžu jednoduchým spôsobom upraviť štandardnými technikami, ak sa na tvorbu rekombinantnej protilátky použije nukleová kyselina kódujúca opičiu konštantnú oblasť. V predloženom riešení je dôležité, že protilátka, ktorá sa má vyrobiť, je menej imunogénna ako opičia konštantná oblasť tak, že sa nevyvoláva žiadna významná imunitná odpoveď, keď je zavedená do človeka. (Takéto oblasti protilátok sa nazývajú homológnymi oblasťami). Týmto spôsobom sa rekombinantná protilátka upravuje tak, aby bola rovnako funkčná ako ľudská protilátka vo svojej aminokyselinovej sekvencií, t. j. má konštantnú oblasť homológnu s ľudskou alebo šimpanzou konštantnou oblasťou protilátky. Súhrnom táto protilátka je tak ľudská protilátka, ako je potrebné na zníženie možnosti neželanej imunologickej odpovede na protilátku a obsahuje oblasť viažucu antigén opičej protilátky.

Pod pojmom „neimunogéna“ sa mysli, že protilátka nevyvoláva protilátkovú odpoveď postačujúcu na zníženie účinnosti nepretržitého podávania protilátky u väčšiny ľudí počas obdobia postačujúceho na dosiahnutie dostatočného terapeutického účinku, napr. v porovnaní s myšou alebo myšou/ľudskou chimémou protilátkou. Výhodne sa nepozoruje žiadna protilátková odpoveď.

Vo výhodných uskutočneniach spôsob zahrnuje imortalizáciu opičej bunky zodpovednej za produkciu opičej protilátky, napríklad hybridómovou fúziou, vírusovou transformáciou s Herpes papio, klonovanim jednotlivých B-buniek (nazývaným tiež „prechodná imortalizácia“) a vytvorením knižnice rekombinantných imunoglobulínov. V iných výhodných uskutočneniach spôsob zahrnuje selekciu B-bunky z opice, či už z leukocytov periferálnej krvi, sleziny, kostnej drene alebo lymfatickej uzliny; selekciu klonu, ktorý produkuje vhodnú protilátku; získanie imunoglobulinového génu kódujúceho túto protilátku z imortalizovanej bunkovej línie; a reexpresiu génov v produkčnej línii (t. j. v bunkovej línii, ktorá spôsobuje produkciu protilátky dostatočnú na to, aby bola užitočná na humánnu terapiu)·.

Ďalej vynález opisuje rekombinantnú protilátku tvorenú buď ľudskou alebo šimpanzou konštantnou oblasťou a úsekom rozoznávajúcim antigén opičej variabilnej oblasti alebo konštantnou oblasťou prvej opice a úsekom rozoznávajúcim antigén variabilnej oblasti druhej, odlišnej opice.

Ďalej vynález opisuje monoklonálnu protilátku, alebo Fab, (Fab)₂ diméru ľahkého reťazca alebo ťažkého reťazca, alebo akýkoľvek minimálny rekombinantný fragment z nich, ako sú Fv alebo jednoreťazcová protilátka (single chain antibody, SCA) alebo iné ich imunologický aktívne fragmenty (napr. CDR oblasť) k ľudskému antigénu, ktoré sú vytvárané imortalizovanou opičou B-bunkou. Takéto fragmenty sú užitočné ako imunosupresívne činidlá. Alternatívne protilátka podľa vynálezu môže mať pripojenú efektorovú alebo reportérovú molekulu. Napríklad protilátka podľa vynálezu môže mať makrocyklus na chelátovanie atómu ťažkého kovu, alebo toxínu, ako je ricín, pripojený kovalentnou mostíkovou štruktúrou. Navyše Fc fragment alebo CH3 doména v úplnej molekule protilátky môžu byť nahradené molekulou enzýmu alebo toxínu a časť imunoglobulínového reťazca môže mať väzbu s polypeptidovou efektorovou alebo reportérovou molekulou. Bišpecifické protilátky sa tiež môžu konštruovať pomocou štandardných postupov.

Ďalším aspektom vynálezu sú farmaceutické prostriedky, v ktorých sa protilátky podľa vynálezu poskytujú na terapeutické alebo profylaktické použitia. Takéto protilátky sa tiež môžu použiť ako imunotoxíny, t. j. molekuly, ktoré sú charakterizované dvomi zložkami a sú osobitne užitočné na zabíjanie vybraných buniek in vitro a in vivo. Jedna zložka je cytotoxické činidlo, ktoré je zvyčajne fatálne pre bunku, ak je k nej pripojené alebo absorbované. Druhá zložka, známa ako „dodávacie vehikulum“, poskytuje prostriedok na prenos toxického činidla ku konkrétnemu typu buniek, ako sú nádorové bunky. Tieto dve zložky sa vzájomne bežne chemicky viažu akýmikoľvek dobre známymi chemickými alebo genetickými postupmi. Napríklad cytotoxické činidlo je protein a druhá zložka je intaktný imunoglobulin, spojenie sa môže dosiahnuť heterobifunkčnými sieťovacími činidlami napr. karbodiimidom, glutraldehydom a podobne. Vytváranie rôznych imunotoxinov je v odbore dobre známe.

V ďalšom podobnom aspekte vynález opisuje nukleovú kyselinu kódujúcu ľudskú/opičiu rekombinantnú protilátku. Vo výhodných uskutočneniach nukleová kyselina kóduje ľudskú alebo opičiu konštantnú oblasť a úsek rozoznávajúci antigén opičej variabilnej oblasti a táto nukleová kyselina je purifikovaná, t. j. oddelená od biologických zložiek, s ktorými sa prirodzene vyskytuje alebo, ešte výhodnejšie, poskytuje sa ako homogénny roztok.

V ešte ďalšom aspekte vynález obsahuje CDR-očkovanú protilátku tvorenú najmenej jednou z oblastí určujúcich komplementaritu (CDR), to je aminokyselinových zvyškov (s použitím štandartného značkovacieho Kabatovho systému) 31-35 (CDR 1),50- 65 (CDR 2) a 95 - 102 (CDR 3)špccifikovancho ťažkého reťazca a aminokyselinových zvyškov 24 - 34 (CDR 1), 50 - 56 (CDR 2), a 89 - 97 (CDR 3) špecifikovaného ľahkého reťazca variabilnej oblasti opice Starého sveta a základnú štruktúru imunoglobulínovej variabilnej oblasti z iného druhu. CDR-očkovaná protilátka je schopná viazať ten istý antigén ako pôvodná opičia protilátka. Konštantná oblasť protilátky je odvodená z ľudského alebo šimpanzieho imunoglobulínu. Metodológia na uskutočnenie tohto aspektu je vo všeobecnosti opísaná Jonesom a kol., 32i Náture 522, 1986. Takéto CDR štepy sa môžu meniť podľa potreby, aby sa zaistilo, že sa budú javiť podobnejšie ľudským a aby sa zmenšila pravdepodobnosť vyprovokovania škodlivej reakcie proti protilátke.

Vo výhodných uskutočneniach spôsob zahrnuje imortalizáciu alebo selekciu bunky z makaka, ktorá je zodpovedná za produkciu protilátky makaka a získanie imunoglobulinových génov z tejto bunky; klonovanie a sekvencovanie proti látkových génov zodpovedajúcich za produkciu protilátky; výber ľudskej sekvencie základnej štruktúry variabilnej oblasti (prednostne s najtesnejšou homológiou k základnej štruktúre variabilnej oblasti makaka); a náhradu ľudských CDR sekvencií CDR sekvenciami makaka a môžu sa zhrnúť menšie modifikácie v ľudskej oblasti základnej štruktúry na udržanie afinity protilátky k jej antigénu.

Výrazom „menšie modifikácie“ sa rozumie, že menej ako celkovo šesť aminokyselín v základnej štruktúre sa môže substituovať inými aminokyselinami. Zvyčajne sa takéto substitúcie alebo modifikácie vykonajú, len keď tieto aminokyseliny sú zapojené do konformačných interakcií, ktoré udržujú základnú štruktúru vo vhodnom tvare tak, že žiadaný antigén je rozoznávaný protilátkou. Také modifikácie budú vo všeobecnosti odrážať odlišné aminokyseliny prítomné v opičej protilátke v porovnaní s ľudskou protilátkou. Napríklad aminokyselinová sekvencia ľudskej protilátky tesne pred ťažkým reťazcom CDR 3, 92 - 94, je vo všeobecnosti cysteín-alanín-arginín (o arginíne sa vie, že je v menšej časti protilátok nahradený serínom alebo treoninom); v niektorých protilátkach opice je sekvencia cysteínalanín-serín; takto v tomto príklade môže byť daná prednosť použitiu serínu ako aminokyseliny 94 (pozri obr. 9D).

V ďalšom aspekte vynález opisuje použitie protilátky podľa vynálezu ako liečiva na liečenie človeka, ktorý má konkrétny antigén, napr. spojený s ochorením. Opisuje sa podávanie terapeuticky účinného množstva rekombinantnej protilátky špecifickej na konkrétny antigén, kde rekombinantná protilátka je taká, čo má buď ľudskú alebo šimpanziu konštantou oblasť a úsek rozpoznávajúci antigén opičej variabilnej oblasti alebo má konštantnú oblasť prvej opice a úsek rozoznávajúci antigén variabilnej oblasti druhej, rozdielnej opice.

Vo výhodných uskutočneniach uvedeného aspektu je antigén nádorový antigén, antigén zapojený do poruchy imunity, antigén zapojený do autoimúnnej odozvy, receptor exprimovaný na hostiteľských bunkách alebo antigén vybraný z ľudských antigénov CD58, VLA4 (alΓπ4β1 integrín), CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD2O, receptor ľudských T-buniek, CD3, CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNFa, TNFp, Tn antigén, IL-I, IL-8, C5a, molekúl adhézie, napr. VCAN, CD54, CD28, CDI la, CDIIc, CDI 8 A CDllb, produktu neu onkogénu, MDR-1 (P-glykoproteínu), TGFa a jeho receptoru, a PDGF; a rekombinantná protilátka je aktívna buď v depletácii (zabíjaní alebo eliminácii) nechcených buniek (napr. anti-CD4) pôsobením s komplementom, alebo je aktívna ako cytotoxické činidlo, alebo spôsobuje Fc-receptorovú väzbu s fagocytom. Alternatívne protilátka blokuje alebo stimuluje receptorové funkcie, alebo neutralizuje aktívne rozpustné produkty, ako sú jeden alebo viac intcrlcukínov, TNFaC5a.

V ďalšom aspekte vynález obsahuje farmaceutické prostriedky uvedených protilátok alebo ich fragmentov. Prostriedky alebo výrobky podľa vynálezu sa pohodlne poskytujú vo forme roztokov vhodných na parenterálne, nasálne alebo orálne podávanie. Vhodné prípravky protilátky sa môžu zmiešať s vhodnými prípravkami iných činidiel, pričom poskytujú lepšie klinické využitie.

Iné obsahové vlastnosti a prednosti vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho opisu výhodných uskutočnení.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 je diagramové znázornenie dvadsiatich kodónov v deviatich rôznych vedúcich sekvenciách Ig ťažkých reťazcov a desiatich opičích sekvenciách Ig ťažkých reťazcov.

Obr. 2 je diagramové znázornenie štruktúr rôznych Ig reťazcov ukazujúce relatívne polohy vedúcich, variabilných a konštantných oblastí vzhľadom na polohy reštrikčných miest a primérov používaných na amplifikáciu.

Obr. 3 je diagramové znázornenie vektora s kazetou ťažkého reťazca na expresiu ľudských alebo chimémych protilátok.

Obr. 4 je diagramové znázornenie vektora s kazetou ľahkého reťazca na expresiu ľudských alebo chimémych protilátok.

Obr. 5 a 6 sú diagramové znázornenia vektorov navrhnutých na expresiu imunoglobulínov z cDNA kapa, resp. lambda ľahkého reťazca. V týchto vektoroch sú imunoglobulínové gény usporiadané v tandemovej konfigurácii s použitím neomycín fosfotransferázy ako selekčného markeru.

Obr. 7-1,7-2 a 8 ukazujú sekvencie nukleových kyselín rôznych primérov vedúcej sekvencie podľa vynálezu (tieto priméry v obr. 8 zodpovedajú priméru zo zoznamu uvedenému ako SEKV. ID Č. 1 - 12).

Obr. 9A až 9H sú porovnania sekvencii ľudských a opičích VH1, VH2, VH3, VH4 a VH5 oblasti, resp. sekvencií VKI, VK11, a VlambdalII.

Obr. 10 je porovnanie ľudských a opičích VH3 sekvencií, sjedným porovnaním k ľudskej VH2 sekvencii.

Obr. 11 jc grafické znázornenie väzby protilátky podľa vynálezu k ľudskému CD4 antigénu.

Obr. 12 je grafické znázornenie inhibicie väzby 1F3 protilátkou ukázanou v obr. 10.

Obr. 13 a 14 sú úseky nukleotidových sekvencii antiCD4 VH a VL oblastí.

Obr. 15 je graf ukazujúci anti-CD54 aktivitu.

Obr. 16 je histogram porovnávajúci vlastnosti plazmidovej expresie.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Opičie protilátky

Opice Starého sveta zahrnujú paviány a makaky (vrátane makakov rézus amakakov jávskych). Tento vynález poskytuje podrobnosti použitia nárokovaného vynálezu s rôznymi opičími génmi. Tieto príklady nie sú obmedzujúce a môžu sa ľahko aplikovať na iné opice Starého sveta.

Na obr, 2, kde je diagramovou formou ukázaná všeobecná štruktúra génov kódujúcich imunoglobulínové ťažké, kapa ľahké a lambda ľahké reťazce. Každý z týchto reťazcov je tvorený ATG štartovacím kodónom nasledovaným vedúcou sekvenciou s približne 60 bázami, oblasťou kódujúcou variabilnú oblasť imunoglobulínu a konštantnou oblasťou tohto imunoglobulínu. Príklady rôznych vedúcich sekvencii alebo signálnych peptidov ťažkých reťazcov sú ukázané na obr. 1. Tieto sekvencie a ich ekvivalenty v opiciach sa dajú stanoviť Štandardnými technikami dobre známymi odborníkom v odbore, ako je opísané.

Sekvencie ukázané v dolnej časti obr. 1 sú ľudské vedúce sekvencie. Prihlasovatelia zistili, že konštrukcia primérov komplementárnych k týmto vedúcim oblastiam umožňuje amplifikáciu Ig génov z opíc. Podobne priméry homológne k opičím vedúcim sekvenciám (pozri napr. hornú časť obr. 1) sa dajú použiť na amplifikáciu opičích imunoglobulínových génov a tiež na amplifikáciu ľudských imunoglobulínových génov.

Pri použití takýchto primérov v štandardných amplifikačných postupoch sa môžu gény kódujúce rôzne opičie imunoglobulínové gény, izolovať a stanoviť sekvencie kódujúce variabilné oblasti protilátok. Príklady takýchto postupov sa uvádzajú neskôr. Výsledky analýz uvedené neskôr sú prezentované v obr. 9A až 9H a v obr. 10. Prihlasovateľ s prekvapením zistil, že napriek schopnosti tvorby protilátok k pomerne konzervovaným ľudským antigénom v opiciach, sekvencie základnej štruktúry variabilných oblastí takto vytváraných protilátok sú neodlisiteľné od ľudských protilátok. To znamená, že rozsah variability v imunoglobulínových sekvenciách pozorovaný u opič bol podobný rozsahu pozorovanému u ľudí a nebolo možné určiť, ktorá protilátka pochádzala z človeka alebo z opice bez analýzy samotného zdroja.

Takto napríklad, s odkazom na obr. 10, aminokyselinová sekvencia VH3 oblasti človeka bola porovnaná s opičou. Ľudské protilátky vykazovali rozsah homológie medzi sebou od 83 do 98 %, zatiaľ čo opičie boli od 90 do 95 % homológne s ľudskou VH3 oblasťou. Naproti tomu ľudská VH2 oblasť bola homológna s ľudskou VH3 oblasťou do 60 %. [V tomto obrázku, podobne ako v iných obrázkoch, je prítomnosť rovnakej aminokyseliny v ktorejkoľvek pozícii označená pomlčkou, zatiaľ čo prítomnosť odlišnej aminokyseliny je označená štandardným jednopísmenovým kódom. Pozície, ktorým sa nedá prisúdiť žiadna zhodná aminokyselina sú označené ako X]. Podobne homológie pre VH1, VH2, VH3, VH4 a VH5 a pre VKI, VKII a VlambdaIII sú ukázané na obr. 9A - 9H. Opäť sa pozorovala významná homológia medzi opičími a ľudskými imunoglobulínovými oblasťami v každej variabilnej oblasti vrátanie sekvencie imunoglobulinovej J oblasti. Takáto vysoká homológia je podobná homológii pozorovanej medzi ľudskými protilátkami.

Metodológia, ktorou sa stanovovali sekvencie sa uvádza v príkladoch. Odborníci v odbore budú vedieť, že tieto príklady nie sú obmedzujúce pre tento vynález a že rovnocenné výsledky a monoklonálne a chiméme protilátky sa dajú získať podobnými postupmi dobre známymi tým. Čo majú bežné znalosti v odbore. Pozri napr. U.S. patenty 4 816 567; 4 978 745; 4 975 369; 4 816 397, vyššie. Napríklad po klonovaní génu kódujúceho opičiu variabilnú oblasť, takýto gén sa dá ľahko ligovať ku génu kódujúcemu opičiu alebo ľudskú konštantnú oblasť a fúzované gény exprimovať v produkčnej bunkovej línii na produkciu prihlasovateľovej protilátky. Nižšie sú poskytnuté príklady takýchto postupov.

V nasledujúcich príkladoch prvý krok postupu zahrnuje izoláciu celkovej RNA z opičích buniek periferálnej krvi alebo sleziny. B bunky z imunizovaných opič sa môžu získať z periferálnej krvi alebo lymfatických uzlín a použiť priamo alebo môžu byť výhodne expandované. Expanzia môže zahrnúť transformáciu vírusom Herpes papio, fúziou k heterológnym myelómovým bunkám s následnou selekciou alebo klonovanie jednotlivých B-buniek za limitujúceho zried’ovania v prítomnosti stimulovaných ľudských T-buniek.

Celková RNA sa potom prevedie na jednovláknovú (ss) cDNA reverznou transkriptázou s použitím nešpecifických (oligo-dT alebo náhodných hexamérov) alebo špecifických (imunoglobulínových CH1 alebo CK alebo Clambda konštantných oblastí) oligonukleotidových primérov. Jednovláknová cDNA vytvorená touto reakciou sa amplifikuje s použitím polymerázovej reťazovej reakcie, v ktorej sa ss cDNA, spolu s deoxynukleotidovými trifosfátmi, DNA polymerázou (napr. termostabilnou polymerázou) a špecifickými primármi sa použije na amplifikáciu variabilných oblastí ťažkých alebo ľahkých reťazcov imunoglobulínových génov. Použité priméry sú jednovláknové syntetické oligonukleotidy medzi 20 až 40 bázami, ktoré obsahujú niektoré degenerované bázy a ktoré sa viažu na imunoglobulínové 5‘ vedúce sekvencie. Šesť rôznych primérov k 5' vedúcim sekvenciám (pozri obr. 7 - I zahrnujúci reštrikčné enzýmové miesto napr. Sali) sa navrhlo na amplifikáciu rodiny opičích variabilných oblastí ťažkého reťazca na základe ich podobnosti s rodinou ľudských variabilných oblastí ťažkého reťazca. S každým zo šiestich primérov k 5' vedúcim sekvenciám sa použil 3’ primér špecifický pre doménu konštantnej oblasti relevantného izotypu (napr. IgG, IgM, IgA lebo IgE) tiež zahrnujúci reštrikčné enzýmové miesto (napr. NheI). Podobne pre opičie kapa a lambda ľahké reťazce sa používajú iné páry primérov na amplifikáciu príslušných variabilných oblasti ľahkých reťazcov (obr. 7 - 2).

Iné súbory primérov sa môžu použiť, aby sa zaviedli rôzne unikátne reštrikčné miesta na umožnenie orientovaného klonovania PCR-amplifikovanej DNA do vhodných expresných vektorov obsahujúcich to isté miesto. Súbor primérov viažucich sa k 3' koncu vedúcej sekvencie ťažkého reťazca protilátky so zavedeným Mlul miestom alebo súbor primérov viažucich sa k prvým 23 bázam sekvencie základnej štruktúry so zavedeným Xhol miestom sa môžu tiež použiť, ako je opísané na obr. 7-1. Variabilné oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov opičích imunoglobulínových génov môžu byť klonované do kyvadlového vektoru priamo po PCR amplifikácii na umožnenie ďalšej molekulovej manipulácie, ak je potrebná, alebo klonované priamo do expresného vektora, ktorý obsahuje konštantné oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov ľudských génov. Molekulová konfigurácia imunoglobulínových génov v expresnom vektore môže byť genómová konfigurácia, v ktorej sú prítomné promótor/zosilňovač a ďalšie regulačné oblasti, ako aj zostrihové donorové/akceptorové sekvencie na spojenie intrón/'exón. Alternatívne sa môžu chimérne imunoglobulíno vé gény zaviesť do cDNA konfigurácie s použitím heterológnych vírusových promótorových/zosilňovacích sekvencií.

Príklad 1: Sekvencia opičích protilátok

Obr. 7 a 8 ukazujú priméry s reštrikčnými miestami alebo bez reštrikčných miest používaných na PCR amplifikáciu imunoglobulínových génov z opičej a/alebo ľudskej cDNA. Podrobnosti používaných postupov sú uvedené neskôr. RNA sa izolovala z opičích slezinových buniek, buniek periferálnej krvi alebo buniek lymfatických uzlín pomocou štandardnej guanidínium izotiokyanátovej metódy. Celková frakcia RNA izolovaná podľa tejto metódy sa potom použila ako vzor na nasledujúcu amplifikačnú reakciu. Podiel RNA sal inkuboval v prítomnosti 200 jednotiek reverznej transkriptázy z Moloneyho vírusu myšej leukémie a nešpecifických (oligo-dT alebo náhodných hexamérov) alebo špecifických (na imunoglobulínové IgG CH 1 oblasti alebo kapa reťazcové konštantné oblasti CK) oligonukleotidových primérov (50 - 100 pikomólov) na vytvorenie nekódujúceho sense vlákna jednovláknovej cDNA. Jednovláknová cDNA vytvorená touto reakciou sa potom amplifikovala s použitím polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR). Podiel jednovláknovej cDNA sa inkuboval spolu s deoxynukleotid trifosfátmi (20 μΜ), termostabilnou DNA polymerázou (2 - 5 jednotiek) a od ľudských sekvencií odvodenými syntetickými oligonukleotidovými primérmi (50 pikomólov) na amplifikáciu variabilných oblastí buď ťažkých alebo ľahkých reťazcov imunoglobulínových génov.

S použitím párov primérov ukázaných na obr. 8 sa amplifikovalo niekoľko reprezentantov imunoglobulínových sekvencií variabilných oblasti ťažkého a ľahkého reťazca z radu génových rodín makaka jávskeho. Tieto amplifikované sekvencie sa klonovali do EcoRV miesta plazmidového vektora p-Bluescript (pBS, dostupného od Stratagene, CA) a použilo sa na sekvenovanie. Sekvenovanie DNA sa vykonalo s použitím plazmidu obsahujúceho klonovaný inzert ako dvojlvláknového DNA templátu a štandardnej sekvenačnej metódy terminácie reťazca.

Reprezentatívne sekvencie imunoglobulínov makaka jávskeho sú ukázané na obr. 9A - 9H. Na obr. 9A - 9H sú ukázané aj konsenzus sekvencie aminokyselín pre ľudské gény variabilných oblastí predstavujúce každú z väčších génových rodín variabilných oblastí. Vyznačené je percento homológie každej opičej sekvencie s ľudskou konsenzus sekvenciou, s vylúčením domén konštantných oblastí a CDR oblastí. Úroveň homológie medzi ľudskými a opičími sekvenciami pre danú rodinu je taká vysoká ako medzi ľudskými sekvenciami v rámci tejto rodiny. Preto nie je možné rozlíšenie medzi variabilnými oblasťami imunoglobulínových sekvencií pochádzajúcich z opíc Starého sveta a pochádzajúcich z človeka len na základe samotného porovnania sekvencií.

Izolácia RNA

Opičie antigén-špecifické B bunky sa získali niekoľkými spôsobmi: fúziou buniek lymfatických uzlín imunizovaných opíc s partnerskými bunkami myších/ľudských heteromyelómov línie K5H6/B5 a následným výberom hybridómových línií, pomocou virusovo transformovaných B buniek alebo technikou in vitro klonovania jednotlivých B buniek. V poslednom prípade bol rast jednotlivej opičej B bunky podporovaný in vitro ko-kultiváciou s ľudskými T bunkami, ktoré boli stimulované protilátkou. Jednotlivé B bunky s umiestnili do jednotlivých jamiek 96-jamkovcj platničky na tkanivové kultúry, každá spolu so 150 000 anti-CD3-stimulovanými ľudskými bunkami, spracovanými s mytomycínom C. Po dvojtýždňovom inkubačnom období jednotlivé B bunky expandovali na najmenej 200 diferencovaných plazmatických buniek. V kultivačnom supematante sa z týchto jamiek zisťovala prítomnosť imunoglobulínov technikou ELISA s použitím zachycovacej protilátky, kozieho proti-opičieho imunoglobulínu.

Bunky buď z antigén-špecifických vírusovo transformovaných buniek alebo hybridómov sa nechali rásť do počtu postačujúceho na extrakciu RNA. Jamky z techniky in vitro klonovania jednotlivých B buniek, ktoré boli pozitívne na imunoglobulíny, sa preniesli, dvakrát premyli studeným fosforečnanom pufrovaným soľným roztokom s pH

7.5 a odstreďovali (1000 x g 10 mm). Premyté bunky sa suspendovali v 100 μΐ lyzačného roztoku (4 M guanidinium izotiokyanát, 25 mN citrát sodný pH 7,0, 0,5 % sarkozín sodný, 0,1 M 2-merkaptoetanol). Pridalo sa 10 μΐ 2 M octanu sodného, pH 4,0 a roztok sa premiešal. Proteín sa odstránil pridaním 100 μΐ fenolu nasýteného vodou, miešaním a pridaním 20 μί zmesi chloroform/izoamylalkohol (49 : 1). Po intenzívnom miešaní a inkubácii na ľade počas 15 min. sa vzorky 20 min. odstreďovali 10 000 x g. Vodná fáza sa preniesla do novej skúmavky, zmiešala s rovnakým objemom izopropanolu a inkubovala 1 hod. pri -20 °C. Zrazenina sa získala odstreďovaním 10 000 x g počas 15 minút, premyla sa 70 % etanolom, opätovne odstreďovala, peleta sa vysušila v prístroji Speedivac (Savant). Vysušená RNA sa znovu rozpustila v 100 μί lyzačného pufra. Pridal sa rovnaký objem izopropanolu a inkubovalo sa 1 hod. pri -20 °C. Zrazenina sa získala odstreďovaním 10 000 x g 15 minút a premyla 70 % etanolom. Peleta sa vysušila v prístroji Speedivac (Savant) a uchovávala do použitia pri -20 °C v 70 % etanole.

Syntézajednovláknovej cDNA

Celková RNA extrahovaná z buniek pochádzajúca zjednej jamky sa rozpustila v 32 μί dvakrát destilovanej vody, ku ktorým sa pridalo 1 μί (50 - 100 pikomólov) priméru (buď náhodných hexamérov, oligo dT alebo 3' imunoglobulin-špecifíckého priméru) a 10 μί 5X pufra pre reverznú transkriptázu (0,25 M tris-HCl pH 8,3, 0,375 M KCI, 15 mM MgCl₂, 50 mM ditiotreitolu). Zmes sa zahriala na 65 °C počas 5 minút a potom sa uložila do ľadu na 2 minúty. Po zahriatí sa pridal 1 μί RNAsin (promega), 5 μί deoxynukleotidových trifosforečnanov a 1 gl (200 jednotiek) reverznej transkriptázy z Moloneyho vírusu myšej leukémie (BRL) a zmes sa inkubovala počas 1,5 hodiny pri 37 °C. Po dokončení reverzno-transkriptázovej reakcie sa zmes jedno vlákno vej cDNA/RNA extrahovala zmesou fenol/chloroformom a nechala sa prejsť cez rotačnú kolónu ml G-25 SEPHADEX. Materiál, ktorý prešiel cez kolónu, sa použil ako templát ss cDNA na PCR amplifikáciu.

Amplifikácia ss cDNA až 10 μΐ ss cDNA sa zmiešalo s 10 μί 1OX PCR pufru (500 mN KCl,100mN tris-HCl, pH 8,3,15 mN MgCl₂),

1.6 μί 1,25 mN deoxynukleotidových trifosforečnanov, 50 pikomólov špecifického imunuglobulínového 5'priméru, 50 pikomólov špecifického imunoglobulinového 3' priméru a až 5 jednotkami termostabilnej DNA polymerázy (Synthetic Genetics). Reakčný objem sa upravil na 100 μΐ s vodou a prevrstvil 100 μΐ minerálneho oleja. Reakčná zmes sa inkubovala pri nasledujúcich teplotách počas špecifikovaných časov:

°C 1 minútu °C 2 minúty 72 °C 2 minúty

Tento cyklus sa opakoval 30- až 35-krát. Amplifikované produkty sa skúmali pomocou elektroforézy v agarózovom géli s použitím 1,2 % agarózového gélu a štandardov molekulovej hmotnosti. Gény amplifikovanej imunoglobulínovej variabilnej oblasti sa nachádzali približne medzi 350 až 500 bp markermi. PCR amplifikované produkty sa potom použili na klonovanie do vhodných plazmidových vektrorov.

Príklad 2: Klonovanie opičích protilátkových génov

Pretože sekvencie variabilných oblastí opičích génov, na cDNA úrovni, sú nerozlíšiteľné od ľudských členov rovnocennej génovej rodiny, imunitné odpovede na opičie/ľudské chiméme protilátky, ak nejaké sú, sa nebudú pravdepodobne líšiť od odpovedí, ktoré sa vyvinú proti molekulám ľudských protilátok.

PCR technológia sa môže využiť na zavedenie špecifických reštrikčných enzýmových miest vrátane (ale bez obmedzenia) Sali, BglI, KpnI a NheI do sekvencii variabilných oblastí opíc Starého sveta počas PCR amplifikačnej reakcie s použitím primárov odvodených od tých, ktoré sú uvedené na obr. 6. Už existujúce klonované gény sa amplifikovali z ich špecifických vektorov s použitím týchto primárov na zavedenie špecifického reštrikčného miesta, ktoré sa následne použilo na klonovanie do expresného vektora. Alternatívne sa tieto primery použili na amplifikáciu priamo z bunkovej RNA.

Expresné vektory, ktoré sa skonštruovali, boli dvoch typov. Prvý (pozri obr. 3 a 4) umožňuje, aby sa klonovaná cDNA variabilných oblastí imunoglobulínových génov zaviedla do kazetového vektora, s použitím unikátnych reštrikčných miest, v ktorom sú prvky imunoglobulinového génu usporiadané v genómovej konfigurácii. Tento typ vektora obsahuje imunoglobulínový promótor, dva exóny, ktoré vytvárajú imunoglobulínovú vedúcu sekvenciu, dve klonovacie miesta Spel a NheI, downstream spojovacie donorové sekvencie, oblasť imunoglobulínovej zosilňovacej sekvencie, konštantnú oblasť ľudského génu (ťažký alebo ľahký reťazec) a downstream polyadenylačné signály. Navyše zahrnujú bakteriálny začiatok replikácie, (3-laktamázový gén na bakteriálnu selekciu a neomycín fosfotransferázový gén na G418 selekciu alebo xantín-guanín fosforibozyltransferázový (gpt) gén na selekciu s mykofenolovou kyselinou v cicavčích bunkách. Expresné vektory pre ťažké a ľahké reťazce používajú neomycín fosfotransferázový gén (Neo) a xantín-guanín fosforibozyl-transferázový (Gpt) gén ako markery, ktoré sa môžu vybrať.

Druhý typ expresného systému (pozri obr. 5 a 6) používa imunoglobulínové gény v cDNA konfigurácii. Teda, medzi 5' vedúcou sekvenciou a3' sekvenciou konštantnej oblasti nie sú prítomné žiadne intróny alebo spojovacie miesta. Vektor tohto typu využíva heterológne vírusové promótorové/zosilňovacie sekvencie, riadiace imunoglobulínové gény ťažkých a ľahkých reťazcov usporiadané v tandemovom spôsobe, polyadenylačné sekvecie a selekčný marker pre cicavčie bunky (Neo). Neo gén môže byť modifikovaný na oslabenie svojej translácie, napr. zmenou upstream kodónov a susediaceho štartovacieho miesta génu z ACC na TCT. Navyše je prítomný gén dihydrofolát reduktázy (dhfr) na následnú amplifikáciu génov metotrexátom. Opičie imunoglobulínové gény variabilných oblastí na klonovanie do expresných vektorov s cDNA konfiguráciou sa amplifikovali buď z existujúcich klonovaných génov v shuttle vektore (PBS), alebo priamo z RNA s primérmi obsahujúcimi buď reštrikčné miesta Sali alebo Mlul a NheI, pre ťažký reťazec alebo BglII a KpnI alebo BsiWI pre kapa alebo lambda ľahké reťazce. Iné potenciálne jedinečné reštrikčné miesta však nie sú vylúčené.

Chimérne imunoglobulinové gény ťažkého a ľahkého reťazca sú zavedené osobitne alebo postupne (pre konštrukty s genómovou konfiguráciou), alebo do toho istého vektora (pre konštrukty s cDNA konfiguráciou), pomocou elektroporácie do produkčnej bunkovej línie. Elektroporácia sa použila na zavedenie linearizovaných DNA konštruktov do buniek buď vaječníkov čínskeho škrečka (Chinese hamster ovary, CHO) alebo myších myclómových buniek s nasledujúcim klonovaním jednotlivých buniek transfektantov do 96-jamkovej platničky na tkanivové kultúry. Podmienky elektroporácie používajúce elektroporačné zariadenie BTX-100 (BTX, San Diego) a 1 ml jednorazové plastové kyvety dávali optimálny počet transfektantov na dané množstvo vektorovej DNA. CHO bunky adaptované na rast v suspenzii v bezsérovom prostredí (CHO-S SFM II mínus hypoxantín a tymidín, Gibco) sa použili v konštruktoch obsahujúcich vírusové regulačné prvky.

Subklonovanie génov Ig variabilných oblasti

Produkty PCR reakcie sa extrahovali zmesou fenol/chloroform a prešli cez rotačnú kolónu s 1 m! G-25 SEPHADEX. Ak mal byť DNA fragment zaklonovaný do plazmidu tupými koncami, pridalo sa 1 /tl 1 M MgCI₂, 0,5 ml 1,25 mM deoxynukleotidových trifosforečnanov a 1 μΐ Klenow DNA polymerázy (5 jednotiek) k celkovej PCR reakčnej zmesi a inkubovalo sa 15 minút pri 37 °C na zaplnenie všetkých 5' prečnievajúcich koncov. Pred klonovaním tupých koncov do plazmidu sa 5' konce fosforylovali nasledujúcim spôsobom:

μΐ 10 mM ATP, 1 μΐ T4 polynukleotidovej kinázy (10 jednotiek) sa pridalo do celkovej reakčnej zmesi a inkubovalo 30 minút pri 37 °C. Amplifikované fragmenty, ktoré obsahovali vnútorné reštrikčné miesta, sa najskôr štiepili vhodným reštrikčným enzýmom a použili priamo na ligáciu bez fosforylácie. V obidvoch prípadoch sa fragment, čo sa mal klonovať, extrahovať zmesou fenol/chloroformom pred ligáciou do príslušného vektora.

Na ligačnú reakciu sa zmiešalo 10 % fosforylovaného fragmentu alebo reštrikčným enzýmom štiepeného PCR amplifikovaného fragmentu s približne 2 ng príslušného vektora (celkový objem 8 μΐ) predtým štiepeného reštrikčným enzýmom (enzýmami). Na klonovanie s tupými koncami sa použil pBluescript štiepený EcoRV. Na klonovanie s lepivými koncami sa použili vhodné vektory TCAE 5.2 alebo 6.0 alebo pGenex-H alebo pGenexL štiepené príslušnými reštrikčnými enzýmami. Pridal sa 1 pl 10X ligačného pufra (500 mM tris-HCl pH 7,6, 100 mM MgCl₂, 10 mM ATP, 10 mM ditiotreitol), 1 μί T4 DNA ligázy (1 jednotka) a reakcia sa nechala prebiehať pri 14 °C cez noc. Ligovaný materiál sa použil na transformáciu kompetentných buniek E. coli HB101 s použitím štandardnej metódy transformácie s chloridom vápenatým. Transformované baktérie sa selektovali rastom na LB agarových platniach, s obsahom ampicilinu. Vybrali sa individuálne kolónie a nechali sa rásť cez noc v LB médiu obsahujúcom ampicilín a potom sa extrahovala plazmidová DNA s použitím štandardnej metódy s alkalickou lýzou. Po reštrikčnej analýze na stanovenie klonov, ktoré obsahovali imunoglobulinové inzerty, sa pripravila DNA na sekvenovanie.

Sekvenovanie klonovaných génov

Klonované variabilné oblasti imunoglobulínových génov sa sekvenovali s použitím štandardnej metódy terminácie reťazcov. Dvojvláknová plazmidová DNA obsahujúca klonovaný inzert sa použila ako sekvenačný templát. Pred sekvenovanim sa dvojvláknová DNA chemicky denaturovala. DNA sa sekvenovala s použitím T7 DNA polymerázy SEQUENASE (Unitcd States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), rádioaktívne značenej deoxyATP a nasledujúce sekvenačné priméry: (5' CAGAGCTGGGTACGTCCTCA 3') a (5' GCCCCCAGAGGTGCTCTTGG 3') pre variabilnú oblasť imunoglobulínu s ťažkým reťazcom v orientáciách 5' k3' resp. 3' k5'; (5' CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3') a (5' GGCTTGAAGCTCCTCAGAGG 3') pre variabilnú oblasť imunoglobulinového lambda ľahkého reťazca v orientáciách 5' k 3' resp. 3' k 5'. Reakčné produkty sa separované na 6 %-ných polyakrylamidových géloch a čítali.

Výsledky sekvenovania radu imunoglobulínových génov opíc Starého sveta pre variabilné oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov sú zhrnuté v obr. 9A - 9H. Klonovanie a sekvenovanie imunoglobulínových génov opice rodu makaka jávskeho nebolo predtým v literatúre opísané. Preto sa ani nedá definovať stupeň homológie medzi V oblasťou génov človeka a makaka jávskeho. Homológia medzi jednotlivým šimpanzím variabilným lambda génom ajeho ľudským genomickým náprotivkom bola opísaná a ukázala len 2 % rozdielov v oblastiach základnej štruktúry.

Transfekcia a selekcia

Klonované gény variabilných oblastí ťažkých a ľahkých reťazcov sa po sekvenovaní subklonovali do príslušných expresných vektorov. Týmito vektormi môžu byť vektory konštruované s imunoglobulínovými regulačnými prvkami v genómovej konfigurácii (ako sú ukázané na obr. 3 a 4) alebo s vírusovými regulačnými prvkami v cDNA konfigurácii (ako sú ukázané na obr. 5 a 6). Príslušné reštrikčné miesta (Spel a Nhel) môžu byť navrhnuté v PCR amplifikačných primároch počas začiatočného amplifikačného kroku, alebo sa naopak dajú použiť amplifikačné priméry obsahujúce reštrikčné miesta na amplifikáciu imunoglobulínových génov z prehadzovacich vektorov, do ktorých boli naklonované. Alternatívne môžu byť imunoglobulinové gény variabilných oblastí priamo klonované do expresných vektorov po PCR amplifikácii z RNA tak, že subklonovanie nie je potrebné.

Elektroporácia

Elektroporácia sa používala buď na ko-transfekciu genomických štruktúr s ťažkými a ľahkými reťazcami, alebo na postupnú transfekciu gcnomických štruktúr s ťažkými a ľahkými reťazcami do buniek Sp2/0. Pri postupných transfekciách elektroporácia chimérneho konštruktu s ľahkými reťazcom sa následne vykonala selekcia v mykofenolovej kyseline. Triedenie kultivačných supernantantov z klonov pestovaných v 96-jamkových platničkách na produkciu ľahkého reťazca s antisérom proti ľudskej konštantnej oblasti s ľahkým reťazcom pomocou techniky ELISA umožnilo výber klonov s najvyššou expresiou ľahkého reťazca. Nasledujúca elektroporácia transfektantov s ľahkým reťazcom s vektorom obsahujúcim opičí/ľudský chimérny imunoglobulínový konštrukt s ťažkým reťazcom umožňovala výber transfektómov exprimujúcich chimérnu protilátku požadovanej špecificity a izotypu.

Konštrukt s ľahkým reťazcom pGENEX-L (obr. 3 a 4) sa transfekoval do myšej myelómovej bunkovej línie Sp2/0 elektroporáciou nasledujúcim spôsobom. Bunky SP2/0 v koncentrácii 1 χ 10⁷/ml v transfekčnom pufri (272 mM sacharóza, 7 mM fosforečnan sodný pH 7,4, I mM MgCl₂) sa zmiešali s 50 μg pGENEX-L obsahujúcim príslušný klonovaný gén s ľahkým reťazcom, ktorý bol predtým linearizovaný štiepením reštrikčným enzýmom Pvull. Bunky sa vlo žili do 1 ml jednorazovej plastovej spektrofotometrickej kyvety a do kyvety sa zaviedli ploché elektródy vzdialené od seba 3,5 mm. S použitím transfekčného prístroja BTX-100 (BTX, Inc.) bunky dostali impulz prúdu počas 500 mikrosekúnd taký, žc došlo k usmrteniu približne 50 % buniek. Táto hodnota sa stanovila pred transfekciou pulzovaním buniek, bez prítomnosti DNA, zvyšovaním napätia a meraním počtu buniek prežívajúcich 24 hodín. Zostrojil sa graf napätie/životnosť buniek a napätie zodpovedajúce 50 % mortalite buniek sa používalo vo všetkých nasledujúcich elektroporačných pokusoch. Pri použití pristroja BTX-100 sa zistilo, že optimálnu hodnotu má impulz s amplitúdou 200 počas 500 mikrosekúnd. Bunky sa po pulzovaní nechali zregenerovať na ľade 15 minút predtým, ako sa preniesli do 96-jamkovej platničky na tkanivové kultúry v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) obsahujúcom 5 % fetálne teľacie sérum a 10 % Sp2/0 upravené médium. Bunky sa naniesli v koncentrácii, pri ktorej sa bunkový rast pozoroval v približne jednej z troch jamiek po selekcii príslušnou zlúčeninou. Tento parameter sa stanovil pre každý elektroporačný pokus nanášaním rôzneho počtu elektroporovaných buniek na jamku (1000 - 10 000) a selekciou buniek, ktoré mali zavedený plazmid. Počet jamiek, ktoré vykazovali bunkový rast, sa na každej platničke počítaný po 2 až 3 týždňoch selekcie. Takto sa vhodný počet buniek, ktoré dávali jednu pozitívnu jamku z troch pri danej koncentrácii konkrétneho plazmidu, stanovil na použitie v budúcich pokusoch.

Priamo po elektroporácii sa bunky vložili do média bez selektujúcej zlúčeniny. Čerstvé médium obsahujúce buď G418 alebo kyselinu mykofenolovú sa pridalo k bunkám vykazujúcim neomycín fosfotransferázovú alebo guanazyl fosfotransferázovú aktivitu dva dni po elektroporácii. Bunkám sa vymieňalo médium každé dva dni počas prvého týždňa a potom dva razy za týždeň. Koncentrácia zlúčeniny použitej na selekciu sa stanovila inkubáciou buniek v prítomnosti jej zvyšovanej koncentrácie a sledovaním životnosti buniek. Použitá koncentrácia bola dva razy vyššia ako tá, ktorá dávala 100 % usmrtenie buniek. Pre Sp2/0 bol približne potrebný 1 μΐ kyseliny mykofenolovej /ml a pre G418 800 pg/ml.

Bunky sa elektroporovali niekoľkými spôsobmi: buď sa ko-elektroporovali genómové vektory ťažkých a ľahkých reťazcov (pGeneX-H a pGeneX-L), alebo sa elektroporovali samotné ľahké reťazce. V druhom prípade sa vyberali klony s vysokou hladinou expresie chimémeho imunoglobulinového ľahkého reťazca s použitím techniky ELISA. Tieto klony sa potom necahli rásť a elektroporovali sa vektorom obsahujúcim ťažký reťazec. Ak sa použili cDNA tandemové génové konštrukty, expresný vektor (TCAE5.2 alebo TCAE6) sa najskôr linearizoval štiepením s reštrikčným enzýmom Notl. Jediná elektroporácia postačovala na dosiahnutie integrácie obidvoch génov s ťažkým, ako aj s ľahkým reťazcom. Po 2 až 3 týždňoch sa supernatanty z jamiek, v ktorých pokračoval rast s príslušnou selektujúcou zlúčeninou, skúšali na sekréciu chimémych imunoglobulinových ľahkých reťazcov alebo celých imunogbobulinov s použitím techniky ELISA. Imunoglobulínové gény v cDNA konfigurácii sa elektroporovali buď do Sp2/0 buniek, alebo do buniek vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) adaptovaných na rast v suspenzii v bezsérovom médiu. CHO bunky sa elektroporovali s použitím elektroporačného prístroja BTX 600 nastaveného na podmienky na dosiahnutie maximálneho počtu kolónií odolných proti G418. Tieto podmienky boli 210 voltov, 400 pF a 13 ohmov. Po elektroporácii sa bunky spočítali, premyli transfekčným pufrom, resuspendovali v tom istom pufre a dali na ľad počas minút. Bunky sa nastavili na 1 * 10⁷ živých buniek/ml a 400 μΐ bunkovej suspenzie bolo daných do 0,4 ml sterilnej jednorazovej kyvety (BTX Inc.). 25 pg Not 1 linearizovaného DNA TCAE 5.2 alebo TCAE 6 vektora, obsahujúceho klonované gény variabilnej oblasti imunoglobulinov makaka, sa resuspendovalo v TE pufre (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) na 1 μΐ/ml a pridaných k bunkovej suspenzii. Elektroporácia sa vykonala vybitím pristroja s použitím tlačidla na automatické nabitie a impulz. Kyveta sa dala na ľad na 15 minút a bunky sa zriedili do 120 ml bezsérového média a dali do šiestich 96-jamkových doštičiek (200 μΐ na jamku, obsahujúcu približne 6667 buniek lebo 3333 živých buniek na jamku). Nezávislé elektroporačné parametre sa stanovili pre túto bunkovú líniu a selekcia G418 prebiehala pri 400 pg/ml.

Výber na produkciu protilátok

Prítomnosť ľudských, opičích alebo chimémych protilátok vylučovaných transfektantmi sa zisťovala technikou ELISA nasledujúcim spôsobom: 96-jamkové platničky s plochým dnom (Dynatech) sa pokryté kozím anti-ľudským IgG alebo kapa pri 200 ng/jamku v pokrývačom pufri (uhličitan sodný 0,8 mg/ml, kyslý uhličitan sodný 1,55 mg/ml, pH 9,6) a inkubovali najmenej 16 hodín pri 4 °C. Pokrývači pufer sa odstránil a jamky sa blokovali 120 pl blokovacieho pufra (1 % hovädzí sérumalbumín vo fosforečnane pufrovanom soľným roztokom obsahujúcim 0,2 % azid sodný) a inkubovali 1 hod. pri 37 °C. Supematant bunkovej kultúry v množstve až 125 pl sa pridal do jamiek obsahujúcich blokovací pufer a platnička sa inkubovala 2 hod. pri 37 °C. Platničky sa potom päťkrát premyli PBS. Pridalo sa 100 pl kozieho anti-ľudského IgG (alebo kapa) značeného peroxidázou chrenu sedliackeho, riedeného 1 : 1 000 až 1 : 5000 v zrieďovacom pufri (1 % hovädzí sérumalbumín, 0,05 % Tween-20, 0,02 % azid sodný v PBS). Platničky sa inkubovali 1 hod. pri 37 °C a potom päťkrát premyli PBS. Chiméma protilátka sa detegovala so 100 pl peroxidu vodíku a substrátom 3,3', 5,5'-tetrametylbenzidínu (1 : 1 v/v) na jamku. Farebná reakcia sa zastavila po 2 až 5 min. so 100 pl 2 M kyselinou sírovou na jamku.

Odborníci v odbore môžu ľahko vykonať metodológie rovnocenné tým, ktoré sú opísané. Príklady takejto technológie zahrnujú imortalizáciu vybraných B-buniek hybridómovou fúziou, ako je opísané, s bunkovou líniou K5H6/B5 opísanou Carrollom a kol. 164 J. Experimental Medicíne 1566, 1986, alebo ekvivalentnou bunkovou líniou, ako je napríklad SPAZ4 (dostupnou od Sandoz, pozri Ehrlich a kol., 34 Clin. Chem 1681, 1988). Podobné bunkové línie sa dajú ľahko skonštruovať štandardnými technikami verejne dostupnej metodológie. Alternatívne môžu byt imunoglobulinové gény klonované z:

(a) buniek imortalizovaných vírusovou transformáciou Herpes papio, ako opisuje Markova a kol., 30 Vopr. Virusol 549, 1985, alebo ekvivalentným vírusom, (b) klonovaním jednotlivých B-buniek na poskytnutie prechodnej imortalizácie, ako opisuje Antaroso a Lipské 145 J. Immunology 3155, 1990, alebo (c) s použitím bakteriofágových knižníc rekombinantných imunoglobulinov, ako opisuje Huse a kol,, 246 Science 1275, 1989 a McCefferty a kol., 348 Náture 552, 1990. Výber na klony obsahujúce príslušnú protilátku sa môže vykonať technikami opísanými skôr, alebo rovnocennými technikami dobre známymi odborníkom v odbore, a žiadaný imunoglobulínový gén sa môže získať z imortalizovanej bunkovej línie. Navyše sa môže protilátka produkovaná izolovanými opičími B bunkami používať na humánnu terapiu, bez manipulácie na vytvorenie chimémej protilátky.

Ľudská konštantná oblasť sa môže získať štandardnými technikami so všetkými žiadanými izotypmi dobre známymi odborníkom v odbore a variabilné oblasti opičích protilátok sa môžu lígovať s takouto ľudskou konštantnou oblasťou. Osobitne užitočné chiméme protilátky proti špecifickým ľudským povrchovým bunkovým receptorom, ktoré sa môžu použiť pri humánnej imunoterapii, zahrnujú CD4, ICAMs, CD 19, CD20, CD8, CD1 la, CD1 lb, CD28, CD 18, CD45, CD71 aTCR.

Príklad 3: Klonovanie a expresia opičej/ľudskej chimérnej protilátky so špecificitou pre CD4

Nasledujúci príklad je konkrétny príklad postupov a protilátok podľa tohto vynálezu.

Vytváranie opičích imortalizovaných B-bunkových línií

Dospelý makak jávsky (White Sands New Mexico Primáte Center) sa imunizoval intramuskuláme, na viac miestach, so 150 až 300 pg rozpustného CD4 (sCD4) alebo bunkovými mebránami (1 x 10⁸ buniek) z CD4-pozitívnej bunkovej línie supTl s použitím štandardného adjuvans. Imunizácia bola opakovaná každé 2 až 3 týždne, celkovo šesťkrát. Opica dostala posilňovaciu dávku injekciou 100 pg sCD4 do trieslovej oblasti jedného stehna a po jednom týždni sa chirurgicky odobrala lymfatická uzlina z toho istého stehna. Lymfocyty sa odstránili z lymfatickej uzliny rozrezaním tkaniva a opláchnutím sterilným DMEM médiom. Bunková suspenzia sa prefiltrovala cez nylonovú gázu a odstred’ovala pri 1000 x g počas 10 minút.

Približne 1 χ I0⁸ lymfocytov sa suspendovalo v Tris-pufri chloridu amónneho (16 mM, pH 7,5) a zohriatych na 37 °C, aby sa lyžovali erytrocyty. Lymfocyty sa zhromaždili odstreďovaním a resuspendovali v L-leucín metylesteri (LME) a inkubovali pri 37 “C 45 minút. LME-opracované bunky sa filtrovali cez nylonovú sieťku a odstreďovali. Pridal sa 1 ml fetálneho teľacieho séra, bunky sa suspendovali a premývali dvakrát bezsérovým RPMI. Bunky sa spočítali a zmiešali v jedinej 50 ml kónickej odstredivkovej skúmavke spolu s rovnakým počtom K6H6/B5 heteromyelómových buniek, vopred premytých dvakrát bezsérovým médiom. Bunky sa jemne suspendovali v 1 ml 50 % PEG (polyetylénglykol) pridaného pomaly s jemným miešaním počas 1 minúty. Bunky sa potom resuspendovali pridaním 20 ml bezsérového média počas 5 minút s jemným miešaním, na zriedenie PEG. Po dvojnásobnom premytí bezsérovým médiom sa bunky resuspendovali na koncentráciu 5 x x JO⁵ buniek/0,1 ml v RPMJ médiu obsahujúcom 20 % fetálne teľacie sérum a gentamycín a umiestnili do 96-jamkových platničiek na tkanivové kultúry v množstve 0,1 ml na jamku. Do každej jamky sa pridal rovnaký objem (0,1 ml) HAT média a bunky sa ponechali rásť pred vykonaním výberu 14 až 17 dní.

Výber fúzovaných bunkových hybridov na produkciu antiCD4

Test na určenie anti-CD4 špecificity sa vykonal nasledujúcim spôsobom: ELISA platničky sa pokryli rekombinantným sCD4 pri koncentrácii 100 ng na jamku a blokovali 1 % hovädzím sérumalbumínom v PBS.

jd podiel hybridomóvého supematantu sa odobral z každej jamky a nechal inkubovať s platňou pokrytou sCD4 60 minút. Väzba sa detegovala pomocou inkubácie s kozím proti-ľudským alebo kozím proti-opičím IgG značeným ^l25I počas 60 minút. Po štvornásobnom premytí destilovanou vodou sa jamky merali v gama počítači. Pozitívne jamky sa duplicitne znovu testovali a hybridómové bunky z týchto jamiek sa subklonavali trikrát, jedenkrát pri 5 bunkách na jamku, potom dvakrát pri 1 bunke na jamku. V tomto štádiu sa pozitívne anti-sCD4 testovali na schopnosť viazať sa k bunkovému povrchovému CD4. Toto sa vykonalo inhibíciou väzby myšieho anti-CD4 monoklonálu, označeného 1F3, k CD4 pozitívnej bunkovej línii supTl. V stručnosti, sa to vykonalo ko-inkubáciou rôzneho množstva opičej anti-CD4 a 10 ng 1F3 značeného ^ir'I s 3 x 10⁵ supTl buniek na jamku na 96-jamkovej platničke. Po inkubácii počas 1 hodiny pri izbovej sa bunky odstránili pomocou vákuovej filtrácie na filtroch zo sklených vlákien. Po extenzívnom premývaní s PBS sa flltráty hodnotili na gama počítači na určenie inhibície väzby 1F3 k bunkám supTl prostredníctvom opičích hybridómových supematantov.

Vybral sa kandidátny kloň, ktorý produkoval protilátku, ktorá vykazovala silnú inhibíciu proti 1F3. Vybraný kloň sa izotypoval s použitím ľudských izotypovacích reagentov a určil sa ako IgG2 majúci lambda ľahký reťazec. Táto bunková línia sa nechala rozrásť na väčšie počty na klonovanie jej imunoglobulínových génov.

Klonovanie génov variabilných oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov z opičích imortalizovaných B-bunick

Celková RNA sa izolovala z 1 x 10⁷ opičích imortalizovaných B-buniek s použitím guanidínium izotiokyanátovej metódy opísanej skôr. Jedna desatina celkovej RNA sa použila na vytvorenie jednovláknovej cDNA s použitím oligo-dT oligonukleotidového priméru a reverznej transkriptázy, tiež ako je opísané. Jedna desatina z množstva ss cDNA sa použila na nastavenie PCR reakcií. Zo šiestich PCR reakcií každá zahrnovalajeden zo šiestich oligonukleotidových primárov špecifických pre 5' V_H rodinu, obsahujúci Sal I reštrikčné miesto spolu s oligonukleotidom pre IgG 3' konštantnú oblasť, obsahujúcim Nhe I miesto, ako sú obidve ukázané v obrázku 7-1. Podobne sa nechalo prebehnúť päť PCR reakcií s použitím jedného z piatich oligonukleotidových primárov pre 5' lambda vedúcu sekvenciu, obsahujúcich Bgl II miesto a primér pre IgG 3' lambda konštantnú oblasť obsahujúci Avr II miesto. Podmienky reakcie boli, ako je opísané. Každá PCR reakcie prebehla trikrát. Reakčné produkty každej amplifikácie ťažkého a ľahkého reťazca sa analyzovali na 1,2 % agarózových géloch. Primér VH4 ťažkého reťazca (SEKV. ID. Č.: 13: 5' ACTAAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3') a lambda primér (SEKV. ID. Č.: 14: 5' ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3') poskytovali silné pruhy pri agarózovej gélovej elektroforéze. Produkty týchto reakcií sa použili na klonovanie do vektora TCAE 6, ktorý obsahuje sekvencie ľudskej IgGI a ľudskej lambda konštantnej oblasti.

Klonovanie týchto dvoch génov variabilných oblastí do expresného vektora TCAE 6 sa vykonalo postupne. Najskôr sa PCR produkt s ťažkým reťazcom a vektor TCAE 6 štiepili reštrikčnými enzýmami Sal I a Nhe I, produkty sa extrahovali zmesou fenol/chloroform a prešli cez rotačnú kolónu G-25 SEPHADEX. PCR produkt sa ligoval do rozštiepeného vektora cez noc pri 14 “C v prítomnosti T4 DNA ligázy. Približne celkovo 500 ng DNA sa ligovalo v objeme 10 jil pri molárnom pomere inzert/vektor 10 : 1. Ligovaný materiál sa použil na transformáciu XL-1 Blue doplnkových buniek (Stratagene) a tieto transformované bunky sa naniesli na LB agarové platne obsahujúce 50 jxg/ml ampicilín. Zozbierali sa kolónie baktérií odolných proti ampicilínu a nechali sa rásť ako 5 ml minikultúry. Z každej tejto kultúry sa DNA extrahovala štandardným postupom alkalickej lýzy, štiepila sa reštrikčnými enzýmami Sal I a Nhe I a produkty sa delili na 1,2 % agarózovom géli. Plazmidy s inzertami približne 450 bp sa použili ako templáty na následné klonovanie variabilných oblastí s ľahkým reťazcom. Produkty PCR reakcie s ľahkým reťazcom, ako aj plazmid obsahujúci inzert s ťažkým reťazcom sa štiepili reštrikčnými enzýmami Bgl Π a Avr II a spoločne sa ligovali. Plazmidové minikultúry sa podrobili výberu štiepením Bgl II a Avr II. Štepy poskytujúce inzert s približne 400 - 450 bp sa počítali ako pozitívne. Plazmidy obsahujúce obidva inzerty Sal I/Nhe I a Bgl 11/ Avr II sa nechali rozrásť na väčšie množstvá na sekvenovanie DNA.

Tandemové expresné vektory TCAE 5.2 a TCAE 6 chimémej protilátky sa odvodili od vektora CLDN, ktorý sám je derivátom vektora RLDNIOb (253 Science 77 - 79, 1991). RLDNIOb je pritom derivát expresného vektora TN D (7 DNA 651-661, 1988).

RLDNIOb sa odlíšil od vektora TND nasledujúcimi spôsobmi. Transkripčná kazeta dihydrofolát reduktázy (DHFR) (promótor, cDNA a polyadenylačná oblasť) sa umiestnila do priestoru medzi kazetu aktivátoru tkanivového plazminogénu (expresná kazeta t-PA) a kazetu neomycín fosfotransferázy (NEO) tak, žc všetky tri kazety sú v tandeme a v rovnakej transkripčnej orientácii. Navyše sa promótor génu DHFR v CLDN nahradil myším beta globínovým hlavným promótorom (3 Mol. Celí Biol 1246-54, 1983) a t-PA cDNA sa nahradila polylinkerom. Všetky tri eukaryotické transkripčné kazety (expresné, DHFR, NEO) sa môžu oddeliť od bakteriálnej plazmidovej DNA (derivátu pUC9) štiepením reštrikčnou endonukleázou Nôti.

CLDN sa odlišuje od RLDNIOb, pretože Rous LTR pred polylinkerom sa nahradil zosilňovačom ľudského cytomegalovírusového promótoru najbližšieho skorého génu (41 Celí 521,1985).

Expresné vektory TCAE 5.2 a TCAE 6 sa líšia od CLDN v tom, že:

1. Obsahujú štyri transkripčné kazety (miesto troch), v tandemovom poradí:

(a) konštantná oblasť ľudského imunoglobulínu s ľahkým reťazcom odvodená cez amplifikáciu cDNA polymerázovou reťazovou reakciou. V TCAE 5.2 je to kapa konštantná oblasť ľudského imunoglobulínu s ľahkým reťazcom (aminokyseliny 108 - 214 v Kabátovom číslovaní, alotyp Km3) a v TCAE 6 lambda konštantná oblasť ľudského imunoglobulínu s ľahkým reťazcom (aminokyseliny 108 - 215 v Kabátovom číslovaní, genotyp Oz mínus, Mcg mínus, Ke mínus alotyp), (b) konštantná oblasť ľudského imunoglobulínu s ťažkým reťazcom; v obidvoch konštruktoch bol ľudský imunoglobulín s ťažkým reťazcom gama 1 konštantná oblasť (aminokyseliny 114 - 478 v Kabátovom číslovaní, alotyp Gmla, Gmlz), ktorá bola odvodená amplifikáciou cDNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie, (c) DHFR; obsahujúci vlastný eukaryotický promótor a polyadenylačnú oblasť, (d) NEO; tiež obsahujúci vlastný eukaryotický promótor a polyadenylačnú oblasť.

3. Kazety ľudského imunoglobulínu s ťažkým a ľahkým reťazcom obsahujú syntetické signálne sekvencie pre sekréciu imunoglobulinových reťazcov.

4. Kazety ľudského imunoglobulínu s ťažkým a ľahkým reťazcom obsahujú špecifické DNA linkery, ktoré umožňujú inzerciu variabilných oblastí ľahkého a ťažkého reťazca, ktoré zachovávajú translačný čítací rámec a nemenia aminokyseliny normálne sa nachádzajúce v imunoglobulínových reťazcoch. Zavedenie opísaných zmien viedlo ku konštrukcii vektorov TCAE5.2 a TCAE6, Klonovanie génov variabilných oblasti s ťažkým a ľahkým reťazcom imunoglobulínu z anti-CD4 heterohybridómovej bunkovej línie E9.1 do TCAE6 viedlo ku konštruktu, ktorý je uložený v A TCC. Konštrukt, ktorý bol uložený, obsahuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu makaka jávskeho a variabilnú oblasť ľahkého reťazca imunoglobulínu makaka jávskeho, ktorých sekvencie sú v obrázkoch 13, resp. 14, klonované z anti-CD4 hybridómovej bunkovej línie E9.1. Konštantná oblasť ťažkého reťazca je ľudského pôvodu, gama 1 izotypu a Gmla, Gmlz alotypu. Konštantná oblasť lambda ľahkého reťazca je tiež ľudského pôvodu, Oz mínus, mcg mínus genotypu a Ke mínus alotypu. Imunoglobulínové gény sú klonované do expresného vektora TCAE6, ukázaného v obrázku 6, ktorý, keď bol elektroporovaný do cicavčej bunkovej línie CHO, produkoval opičiu/ľudskú chimému anti-CD4 protilátku. Tu opísaný DNA konštrukt sa použil na transformáciou bakteriálneho kmeňa XL-1 Blue, selektoval antibiotikom ampicilínom a uložil ako suspenzia bakteriálnych buniek v sterilnom LB médiu obsahujúcom 15 % glycerol.

Iný užitočný expresný systém je taký, v ktorom je gén kódujúci selekčný marker pozmenený na zvyšovanie výťažku rekombinantných systémov kódujúcich žiadanú sekvenciu. Napríklad narušenie iniciácie translácie dominantného selekčného markeru vedie k zníženiu počtu kolónií odolných proti liečivám, v porovnaní s nepozmeneným vektorom, ale každá individuálna kolónia exprimuje význačne vyššie hladiny pripojeného génového produktu ako v nenarušenom vektore. Napríklad iniciácia translácie je prvým krokom v syntéze proteínov. Miesto iniciácie translácie neomycín fosfotransferázového génu (odolného génu G418) sa zmenilo z Kozákovho konsenzu (sekvencia ccAccATGG) na slabšie Kozákovo miesto (sekvencia ccTccATGC). Narušenie iniciácie translácie odolného génu G418 malo za následok:

1. významné (päťnásobné) zníženie počtu G418 rezistentných kolónií získaných z rovnakého množstva plazmidovej DNA transfekovanej na bunku a 2. významné zvýšenie množstva exprimovaného pripojeného génového produktu v každom klone. V klonoch obsahujúcich Kozákov konsenzus 73 % testovaných kolónií produkovalo menej ako 25 ng/ml, s len 3 % produkujúcich viac ako 100 ng/ml. Pre klony s pozmeneným slabším Kozákovým miestom 8 % testovaných kolónií produkovalo menej ako 25 ng/ml v porovnaní so 63 % kolónií produkujúcich viac ako 100 ng/ml. Konkrétne, s odkazom na obr. 16 (kde TCAE 5.2 má Kozákov konsenzus a TCAE 12 má slabšie Kozákovo miesto), 258 kolónií sa odvodilo z dvoch elektroporácií 25 gg DNA, ktorá obsahuje neomycín fosfotransferázový gén s konsenzus (nezmeneným) miestom štartu translácie. 201 z týchto kolónií (78 %) neexprimovalo žiadny detegovateľný génový produkt (t. j. < 25 ng/ml chimérneho imunoglobulínu) a len 8 kolónií (3 %) exprimovalo viac ako 100 ng/ml. 98 kolónií sa odvodilo od šiestich elektroporácií 25 gg DNA, ktorá obsahuje neomycín fosfotransferázový gén s pozmeneným miestom štartu translácie. 63 % z týchto kolónií exprimovalo viac ako 100 ng/ml a len 8 % z týchto kolónií exprimovalo menej ako 25 ng/ml.

Sekvenovanie DNA

Plazmidová DNA sa pripravila zo 100 ml kultúr. Ďalej sa čistila zrážaním (1 objem) zmesou 2,5 M chloridu sodného a 20 % polyetylénglykolu (6 objemov) na ľade počas 15 minút. Po odstreďovaní 10 000 x g 15 minút sa peleta premyla 70 % etanolom, opätovne odstredila a vysušila v prístroji Speedivac (Savant). Peleta sa opätovne suspendovala v deionizovanej vode na koncentráciu 150 - 250 gg/ml. Sekvenovanie sa vykonalo na 5 gg dvojvláknovej DNA s použitím Sangerovej metódy. Použili sa sekvenačné priméry, ktoré boli homológne so sekvenciami expresného vektora použitých upstream a downstream inzertov ľahkého alebo ťažkého reťazca. Inzerty sa sekvenovali v obidvoch smeroch 5'k3'a3'k5'. Dva klony anti-CD4 ľahkého reťazca a dva klony anti-CD4 ťažkého reťazca generované oddelene z PCR reakcie, sa sekvenovali paralelne, aby sa stanovilo, či sa počas PCR reakcie zaviedli nejaké zmeny nukleotidov. Pre obidva vybrané klony ťažkého reťazca a pre obidva vybrané klony ľahkého reťazca sa zistila identita po celej dĺžke, potvrdzujúca, že sa počas amplifikačného procesu nezavádzali žiadne chyby. Sekvencia anti-CD4 ťažkých a ľahkých reťazcov jc ukázaná na obrázkoch 13 a 14 a zozname sekvencii č.: 15 a 16.

Expresia o opičej/ľudskej chimérnej anti-CD4

Expresné vektory TCAE 5.2 a TCAE 6 sa môžu používať nielen na stabilne integrovanú expresiu do bunkových línií Sp2/0 a CHO ale, pretože obsahuje SV40 začiatok, môže tiež byť exprimovaný prechodne v bunkovej línii COS. Expresia v COS bunkách sa vykonala nasledujúcim postupom: COS bunky sa naočkovali jeden deň pred transfekciou tak, aby boli na 50 - 70 % konfluentné nasledujúci deň. Kultivačné médium sa odstránilo a bunky sa premyli dvakrát transfekčným pufrom (Transfection Buffer, TB - 140 mM NaCI, 25 mM Tris, 5 mM KC1, 0,5 mM Na₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂). 30 pg plazmidu TCAE 6 purifikovaného chloridom céznym obsahujúceho anti-CD4 opičie/ľudské chiméme ťažké a ľahké imunoglobulínové reťazce sa zmiešalo s 3 ml DEAE dextránu na jednu misku (1 mg/ml v TB). DNA sa nechala inkubovať s bunkami 1 hodinu pri 37 °C. Roztok DNA sa odstránil a nahradil 3 ml 20 % glycerolu počas 1,5 - 2,5 minút, po ktorých sa bunky dvakrát premyli s TB. Bunky sa inkubovali v 5 ml čerstvého média obsahujúceho 100 mM chlorochĺnu počas 3 až 5 hodín pri 37 °C, po ktorom sa dvakrát premyli médiom a inkubovali s normálnym DMEM počas 72 hodín. Supematant (100 pl) z transfckovaných COS buniek sa v rôznych riedeniach analyzoval na prítomnosť protilátky technikou založenou na ELISA. Kozie protiľudské lambda sa použili na pokrytie 96-jamkových testovacích platničiek a peroxidázou značené kozie protiľudské IgG ako detekčná protilátka, pri štandardných ELISA podmienkach. Zistilo sa, že COS bunky produkujú 10 až 40 ng/ml opičej/ľudskej chimérnej protilátky. Väčšie objemy supernatantu sa desaťkrát skoncentrovali a použili v priamej väzbe RIA k CD4 pozitívnym supTl bunkám. Rodičovská celá opičia protilátka a irelevantný ľudský imunoglobulín sa použili ako pozitívne, resp. negatívne kontroly (obr. 11). Navyše, opičie anti-CD4 a opičie/ľudské chiméme antiCD4 sa použili na inhibíciu väzby vysokoafinitnej myšej anti-CD4 (IF3) protilátky (obr. 12). Je možné vidieť, že opičia/ľudská rekombinantná protilátka (ATCC No. 69030) sa nielen viaže k CD4 pozitívnym bunkám, ale je aj schopná inhibovať väzbu 1F3 k CD4 pozitívnym bunkám v približne rovnakých koncentráciách ako plne opičia protilátka alebo samotná 1F3.

V nasledujúcom texte sa opisuje príklad postupov a protilátok podľa vynálezu.

Príklad 4: Generovanie opičích protilátok proti ľudským leukocytovým antigénom

Dospelý makak jávsky (White Sand New Mexico Primáte Center) sa imunizovanal intramuskuláme, na viacerých miestach s 5 x 10⁸ CD54 úplne pozitívnych ľudských lymfocytov. Alternatívne sa použili SB bunky (ľudská B lymfoidná línia) a aktivované periferálne ľudské lymfocyty, aktivované preinkubáciou so zmesou mitogénu líčidla amerického (2,5 mg/ml), forbol monoacetátu (40 nM) a fytohemaglutininu (4 mg/jamka) so zahrnutím štandardného ad juvans. Imunizácia sa opakovala každé 2 až 3 týždne počas obdobia ôsmich mesiacov. Séra z imunizovaných zvierat sa testovali v rôznych časoch inhibiciou väzby myšacej protilátky, 84H10, o ktorej je známe, že sa viaže k ICAM-1. Saturačné množstvo 84H10 bolo naviazané k bunkám vaječníkov čínskeho škrečka (CHO), predtým transfekovaných expresným vektorom obsahujúcim ľudskú CD54 c-DNA a vyberaných na vysokú expresiu bunkového povrchového CD54, spolu so zvyšujúcim sa riedením opičieho séra. Inhibícia väzby 84H10 je ukázaná na obr. 15.

Iné myšie monoklonálne protilátky, ktoré rozoznávajú iné ľudské lymfocytové antigény, sa testovali inhibiciou s použitím opičích sér získaných tými istými imunizačnými metódami.

Použitie

Protilátky vytvorené opísaným spôsobom alebo rovnocennými technikami, sa môžu purifikovať afinitnou chromatografiou alebo chromatografiou podľa molekulovej veľkosti na charakterizáciu vo funkčných biologických analýzach. Tieto analýzy zahrnujú stanovenia špecificity a väzbovej afinity, ako aj efektorových funkcií spojených s exprimovaným izotypom, napr. ADCC alebo fixáciou komplementu. Takéto protilátky môžu byť použité ako pasívne alebo aktívne terapeutické činidlá proti množstvu ľudských ochorení vrátane B bunkových lymfómov, infekčných ochorení vrátane AIDS, autoimúnnych a zápalových ochorení a transplantácii. Protilátky sa môžu použiť buď vo svojej prirodzenej forme, alebo ako časť komplexov protilátka/chelát, protilátka/liečivo alebo protilátka/toxín. Navyše sa môžu celé protilátky alebo fragmenty protilátok (Fab Fab, Fv) použiť ako zobrazovacie činidlá alebo ako potenciálne vakcíny alebo imunogény v aktívnej imunoterapii na generovanie anti-idiotypových odpovedí.

Množstvo protilátky užitočné na preukázanie terapeutického účinku sa môže stanoviť štandardnými technikami dobre známymi odborníkom v odbore. Protilátky sa vo všeobecnosti budú získavať štandardnými technikami vo farmaceutický prijateľnom pufri, a môžu sa podávať akoukoľvek požadovanou cestou. Z dôvodov účinnosti tu nárokovaných protilátok a ich tolerovania ľuďmi je možné tieto protilátky podávať opakovane, aby sa bojovalo s rôznymi chorobami alebo chorobnými stavmi u človeka.

Anti-CD4 rekombinantné protilátky (alebo ich fragmenty) podľa vynálezu sú tiež vhodné na vyvolanie imunosupresie, t. j. vyvolanie supresie ľudského alebo zvieracieho imunitného systému. Tento vynález sa preto týka spôsobu profylaktického alebo terapeutického vyvolania imunosupresie u človeka alebo u iného živočícha, u ktorého je to potrebné, podávaním účinného, netoxického množstva takejto protilátky podľa vynálezu takémuto človeku alebo inému živočíchovi.

Schopnosť látok podľa tohto vynálezu vyvolávať imunosupresiu sa môže ukázať v štandardných testoch používaných na tento účel, napríklad zmiešaným lymfocytovým reakčným testom alebo testom merajúcim inhibíciu proliferácie T-buniek meranú spotrebou tymidínu.

Skutočnosť, že protilátky podľa vynálezu majú použitie vo vyvolaní imunosupresie znamená, že môžu byť užitočné pri liečení alebo prevencii odolnosti proti transplantovaným orgánom alebo tkanivám alebo proti ich odmietnutí (napr. obličiek, srdca, pľúc, kostnej drene, kože, rohovky atď.); liečení alebo prevencii autoimúnnych, zápalových, proliferatívnych a hyperproliferativnych ochorení, a kožných prejavov imunologický medikovaných chorôb (ako napr. reumatoídna artritída, lupus erythematosus, systémový lupus erythematosus, Hashimotova tyreoiditída, skleróza multi plex, ťažká myastémia, diabetes typu 1, uveitída, nefrotický syndróm, atopické dermatitídy, kontaktné dermatitídy a iné ekzémové dermatitídy, seboroické dermatitídy, plochý červený lišaj, Pemplugus, bulózny pemfigus, pľuzgienkovitá epidermolýza, urtikária, angioedémy, vaskulitídy, erytémy, kožná eozínofílie, ohraničená alopécia atď.); liečenie reverzibilných obštrukčných ochorení dýchacích ciest, črevných zápalov a alergií (napr. celiakálne ochorenie, proktitída, gastroenterická eozínoíília, mastocytóza, Crohnova choroba a ulcerózna kolitida) a potravinových alergií (napr. migréna, nádcha a ekzémy).

Odborník v odbore bude schopný, rutinným experimentovaním stanoviť, čo je účinné, netoxické množstvo protilátky na účel vyvolania imunosupresie. Vo všeobecnosti však účinné dávkovanie bude v rozmedzí od asi 0,05 až do 100 miligramov na kilogram telesnej hmotnosti na deň.

Protilátky (alebo ich fragmenty) podľa vynálezu by mali byť užitočné aj na liečbu nádorov u cicavcov. Konkrétnejšie mali by byť užitočné na zmenšenie veľkosti nádoru, inhibíciu rastu nádoru alebo predĺženie času prežitia živočícha s nádorom. Takto tento vynález opisuje liečbu nádorov u človeka alebo iného živočícha podávaním účinného, netoxického množstva protilátky. Odborník v odbore bude schopný, rutinným experimentovaním, stanoviť, čo je účinné, netoxické množstvo protilátky na účel liečenia karcinogénnych nádorov. Vo všeobecnosti sa však účinné dávkovanie očakáva v rozmedzí od asi 0,05 do 100 miligramov na kilogram telesnej hmotnosti na deň.

Protilátky podľa vynálezu sa môžu podávať človeku alebo inému živočíchovi v súlade s uvedenými spôsobmi liečby v množstve postačujúcom vykázať taký účinok terapeutického alebo profylaktického stupňa. Takéto protilátky podľa vynálezu sa môžu podávať takémuto človeku alebo inému živočíchovi v konvenčnej dávkovacej forme, spojením protilátky podľa vynálezu s konvenčným farmaceutický prijateľným nosičom podľa známych techník. Odborník v odbore rozpozná, že forma a charakter farmaceutický prijateľného nosiča alebo riedidla je diktovaná množstvom aktívnej látky, s ktorou sa má skombinovať, cestou podávania a inými dobre známymi variabilnými veličinami.

Cesta podávania protilátky (alebo jej fragmentu) podľa vynálezu môže byť orálna, parenterálna, inhalačná alebo miestna. Výraz parenterálny, ako sa tu používa, znamená vnútrožilové, vnútrosvalové, podkožné, rektálne, vaginálne a intraperitoneálne podávanie. Vo všeobecnosti sa preferujú podkožné a vnútrosvalové formy parentrálneho podávania.

Denný režim parentrálnych alebo orálnych dávok na použitie látok podľa vynálezu na profylaktické alebo terapeutické vyvolanie imunosupresie, alebo na terapeutické pôsobenie na karcinogénne nádory bude vo všeobecnosti v rozmedzí asi 0,05 až 100, ale výhodne asi 0,5 až 10 miligramov na kilogram telesnej hmotnosti na deň.

Protilátka podľa vynálezu sa môže podávať inhalačné. Pod inhalačným podávaním sa rozumie intranazálne alebo orálne inhalačné podávanie. Vhodné dávkovacie formy pre takéto podávanie, ako sú aerosólové prípravky alebo inhalátory s odmeranou dávkou, sa dajú pripravovať konvenčnými technikami. Výhodné dávkové množstvo látky podľa vynálezu na používanie bude vo všeobecnosti od asi 10 do 100 miligramov.

Protilátka podľa vynálezu sa môže podávať aj topicky. Topickým podávaním sa myslí nesystémové podávanie a zahrnuje aplikáciu protilátky (alebo jej fragmentu) podľa tohto vynálezu, externe na pokožku, do nosnej dutiny, alebo nakvapkaním takejto protilátky do ucha, oka a nosu, a kde nedôjde k významnému vstupu do krvného riečišťa. Systémovým podávaním sa myslí orálne, vnútrožilové, in traperitoneálne a vnútrosvalové podávanie. Množstvo protilátky potrebné na terapeutické alebo profylaktické účinky sa bude samozrejme meniť s vybranou protilátkou a povahou a závažnosťou stavu, ktorý sa má liečiť a bude nakoniec na voľnom rozhodnutí lekára. Vhodná topická dávka protilátky podľa vynálezu bude všeobecne vnútri rozmedzia asi 1 až 100 miligramov na kilogram telesnej hmotnosti denne.

Prípravky

Aj keď je možné protilátku alebo jej fragment podávať samotne, výhodné je podávať ju ako farmakologický prípravok. Aktívna zložka môže predstavovať na topické podávanie od 0,001 % do 10 % (hmotnosť/hmotnosť), napr, od 1 % do 2 % prípravku podľa hmotnosti, aj keď môže predstavovať taký vysoký obsah ako 10 % (hmotnosť/hmotnosť), ale výhodne nie viac ako 5 % (hmotnosť/hmotnosť) a ešte výhodnejšie od 0,1 % do 1 % (hmotnosť/hmotnosť).

Topické prípravky podľa vynálezu obsahujú aktívnu zložku spolu s jedným alebo viacerými pre ňu prijateľnými nosičmi a prípadne akýmikoľvek inými terapeutickými zložkami. Nosič musí byť „prijateľný“ v takom zmysle, aby bol kompatibilný s inými zložkami prípravku a nepoškodzoval zdravie príjemcu.

Prostriedky vhodné na topickc podávanie obsahujú tekuté alebo polotekuté prípravky vhodné na prienik kožou na miesto, kde je liečba potrebná, napr. emulzie, krémy, masti alebo pasty, a kvapky vhodné na podávanie do oka, ucha alebo nosu.

Kvapky podľa tohto vynálezu môžu obsahovať vodné alebo olejové roztoky alebo suspenzie a môžu sa pripravovať rozpustením aktívnej zložky vo vhodnom vodnom roztoku baktericídneho a/alebo fungicídneho činidla a/alebo akéhokoľvek iného vhodného konzervačného činidla a výhodne zahrnujú povrchovo aktívne činidlo. Výsledný roztok potom môže byť vyčirený filtráciou, prenesený do vhodnej nádobky, ktorá je sa potom uzavrie a sterilizuje v autokláve alebo ponechaním pri 95 °C - 100 °C počas pol hodiny. Alternatívne sa môže roztok sterilizovať filtráciou a preniesť do nádobky aseptickou technikou. Príkladmi baktericídneho alebo fungicídneho činidla vhodného na zahrnutie do kvapiek sú fenylmerkurinitrát alebo acetát (0,002 %), benzalkóniumchlorid (0,01 %) a chlórhexidínacetát (0,01 %). Vhodné rozpúšťadlá pre prípravky olejovitých roztokov zahrnujú glycerol, zriedený alkohol a propylénglykol.

Emulzie podľa tohto vynálezu zahrnujú také zložky, ktoré sú vhodné na aplikáciu na kožu alebo do očí. Očná emulzia môže obsahovať sterilný vodný roztok, prípadne obsahujúci baktericid a môže sa pripraviť spôsobmi podobnými ako na prípravu kvapiek. Emulzie alebo tekuté masti na aplikáciu na kožu môžu tiež obsahovať činidlo pôsobiace rýchle schnutie a chladenie kože, ako alkohol alebo acetón, alebo zvlhčovač ako glycerol, alebo olej ako pižmový a arašidový olej.

Krémy, masti a pasty podľa tohto vynálezu sú tekuté alebo polotekuté prípravky aktívnej zložky na vonkajšie použitie. Môžu sa pripravovať miešaním aktívnej zložky v jemne delenej alebo práškované forme, samotnej alebo v roztoku alebo suspenzii vo vodnej alebo nevodnej kvapaline, pomocou vhodnej inštrumentácie, na mastnom alebo nemastnom základe. Základ môže obsahovať uhľovodíky, ako tuhé, mäkké alebo tekuté parafíny, glycerol, včelí vosk, kovové mydlá, rastlinný kaučuk, oleje prírodného pôvodu, ako mandľový, kukuričný, arašidový, pižmový alebo olivový olej, tuk z vlny alebo jeho deriváty, alebo mastné kyse liny, ako steárovú alebo olejovú kyselinu, spolu s alkoholom, ako je propylénglykol alebo makrogoly. Prípravok môže zahrnovať akékoľvek povrchovo aktívne činidlo, ako aniónové, katiónové alebo neiónové povrchovo aktívne, ako sorbitanové estery a ich polyoxyetylénové deriváty. Suspendujúce činidlá, ako prírodné gumy, celulózové deriváty alebo anorganické materiály, ako oxid kremičitý, a iné zložky, ako lanolín, môžu byť tiež zahrnuté.

Odborník v odbore bude vedieť, že optimálne množstvo a umiestnenie jednotlivých dávkovaní protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu budú určené povahou a rozsahom stavu, ktorý sa má liečiť, formou, cestou a miestom podávania, a konkrétnym živočíchom, ktorý sa má liečiť a že takéto optimum sa môže určiť bežnými technikami. Odborník v odbore tiež uvíta, ak optimálny priebeh liečby, t. j. počet dávok protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu podaný denne počas určitého počtu dni sa môže zistiť odborníkmi v odbore s použitím konvenčného priebehu testov určenia liečby.

Ďalej sa predpokladá, že odborník v odbore môže s použitím predchádzajúceho opisu, použiť predkladaný vynález v najplnšom rozsahu. Nasledujúci text sa preto môže použiť ako iba ilustrativne príklady a žiadnym spôsobom nie ako akékoľvek obmedzenie rozsahu predkladaného vynálezu.

Prostriedok vo forme kapsuly

Farmaceutický prostriedok podľa tohto vynálezu vo forme kapsúl sa pripravuje plnením štandardnej dvojdielnej kapsuly z tvrdej želatíny 50 mg protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu, v práškovej forme, 100 mg laktózy, 32 mg mastenca a 8 mg stearanu horečnatého.

Injekčný parenterálny prostriedok

Farmaceutický prostriedok podľa tohto vynálezu vo forme vhodnej na injekčné podávanie sa pripravuje miešaním 1,5 % hmotn. protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu v 10 % objem, propylénglykolu a vode. Roztok je sterilizovaný filtráciou.

Masťový prostriedok

Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu 1,0 g.

Biely mäkký parafín 100,0 g.

Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu sa dispergujú v malom objeme vehikula za vytvorenia hladkého homogénneho produktu. Deformovateľné kovové tuby sa potom naplnia touto disperziou.

Miestne krémový prostriedok

Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu 1,0 g.

PolawaX GP 200 20,0 g.

Biely včelí vosk 2,5 g.

Metylhydroxybenzoát 0,1 g.

Destilovaná voda do 100,0 g.

Polawax, včelí vosk a lanolin sa spolu zahrievajú na 60 °C. Pridá sa roztok metylhydroxybenzoátu a homogenizácia sa dosiahne miešaním pri vysokých otáčkach. Teplota sa potom nechá klesnúť na 50 °C. Potom sa pridá protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu arozdisperguje sa a prostriedok sa nechá vychladnúť pri pomalom miešaní.

Topický emulzný prostriedok

Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu 1,0 g.

Sorbitan monolaurát 0,6 g.

Polysorbát 20 0,6 g.

Cetostearylalkohol 1,2 g.

Glycerín 6,0 g.

Metylhydroxybenzoát 0,2 g.

Čistená voda B.P. do 100,0 ml. (B.P. = British Pharmacopeia)

Metylhydroxybenzoát a glycerín sa rozpustia v 70 ml vody pri 75 °C. Sorbitan monolaurát, Polysorbát 20 a cetostearylalkohal sa roztavia spolu pri 75 °C a pridajú do vodného roztoku. Výsledná emulzia sa homogenizuje, nechá sa ochladnúť s nepretržitým miešaním a protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu sa pridajú ako suspenzia k zvyšku vody. Celá suspenzia sa mieša pokiaľ nie je homogenizovaná.

Prostriedok očných kvapiek

Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu 0,5 g.

Metylhydroxybenzoát 0,01 g. Propylhydroxybenzoát 0,04 g.

Čistená voda B.P. do 100,0 ml.

Metyl a propylhydroxybenzoáty sa rozpustili v 70 ml čistenej vody pri 75 °C a výsledný roztok sa nechá vychladnúť. Potom sa pridá protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu, roztok sa sterilizuje filtráciou cez membránový filter (0,022 pm rozmer pórov) a balí aseptický do vhodných sterilných nádobiek.

Prostriedok na inhalačné podávanie

Na aerosólovú nádobku s obsahom 15-20 ml: zmieša sa 10 mg protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu s 0,2 - 0,5 % lubrikačným činidlom, ako je polysorbát 85 alebo olejová kyselina, a táto zmes sa disperguje s pohonnou látkou, ako je freón, výhodne v kombinácii s (1,2-dichlórtetrafluóroetánom) a difluórehlórmetánom a vloží sa do vhodnej aerosólovej nádobky vhodnej na intranazálne alebo ústne inhalačné podávanie.

Prostriedok na inhalačné podávanie

Na aerosólovú nádobku s obsahom 15-20 ml: rozpustí sa 10 mg protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu v etanole (6 - 8 ml), pridá sa 0,1 - 0, 2 % lubrikačné činidlo, ako je polysorbát 85 alebo olejová kyselina, a táto zmes sa disperguje v pohonnej látke, ako je freón, výhodne v kombinácii s (l,2-dichlórtetrafluóroetánom) a difluórehlórmetánom a vloží sa do vhodnej aerosólovej nádobky vhodnej na intranazálne alebo ústne inhalačné podávanie.

Protilátky a farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sú najmä vhodné na parenterálne podávanie, t. j. podkožné, vnútrosvalové alebo vnútrožilové. Prostriedky na parenterálne podávanie budú bežne obsahovať roztok protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu alebo ich zmes v prijateľnom nosiči, výhodne vo vodnom nosiči. Môže sa použiť rad vodných nosičov, napr. voda, pufrovaná voda, 0,4 % soľný roztok, 0,3 % glycín a podobne. Tieto roztoky sú sterilné a v podstate bez časticového materiálu. Tieto roztoky sa môžu sterilizovať konvenčnými, dobre známymi sterilizačnými technikami. Prostriedky môžu obsahovať farmaceutický prijateľné pomocné látky napríklad potrebné na priblíženie sa k fyziologickým pomerom, ako sú činidlá na nastavenie pH a pufrovancie činidlá atď. Koncentrácia protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu v takýchto farmaceutických prípravkoch sa môže meniť v širokom rozmedzí, napr. od menej ako 0,5 %, obvykle alebo najmenej 1 %, do takej vysokej, ako je 15 % alebo 20 % hmotn., a vyberie sa primárne na základe objemu tekutiny, viskozít atď., podľa konkrétneho spôsobu vybraného podávania.

Takto sa farmaceutický prostriedok podľa vynálezu na vnútrosvalovú injekciu môž.e pripraviť tak, aby obsahoval 1 ml sterilnej pufrovanej vody a 50 mg protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu. Podobne sa môže pripraviť farmaceutický prostriedok podľa vynálezu na vnútrožilovú injekciu tak, aby obsahoval 250 ml sterilného Ringerovho roztoku a 150 mg protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu. Praktické spôsoby na prípravu parenterálne podávateľných prostriedkov sú dobre známe alebo budú jasné odborníkom v odbore, a sú opísané podrobnejšie napríklad v Remington's Pharmaceutical Science 15. vydanie, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, zahrnutom tu ako odkaz.

Protilátky (alebo ich fragmenty) podľa vynálezu sa môžu lyofilizovať na skladovanie a rekonštituovať vo vhodnom nosiči pred použitím. Táto technika sa ukázala ako účinná s konvenčnými imunoglobulínmi a môže sa použiť lyofilizačné a rekonštitučné techniky v známe odbore.

V závislosti od požadovaných výsledkov, farmaceutický prostriedok podľa vynálezu sa môže podávať na profylaktické alebo terapeutické použitie. V terapeutických aplikáciách sa prostriedok podáva pacientovi, ktorý už má ochorenie, v množstve postačujúcom na vyliečenie alebo prinajmenšom na čiastočné potlačenie ochorenia a jeho komplikácií. Pri profylaktickej aplikácii prostriedky obsahujúce protilátky podľa vynálezu alebo ich zmesi sa podávajú pacientovi, ktorý ešte neochorel na posilnenie pacientovej odolnosti.

Jednotlivé alebo viacnásobné podávanie farmaceutických prostriedkov sa môže uskutočniť s takými dávkami a takým spôsobom, ako zvolí ošetrujúci lekár. V každom prípade farmaceutický prostriedok podľa vynálezu má poskytnúť množstvo upravenej protilátky alebo jej fragmentov podľa vynálezu dostatočné na účinné liečenie pacienta.

Tiež je potrebné pripomenúť, že protilátky podľa tohto vynálezu, sa môžu použiť tiež na návrh a syntézu buď peptidových alebo nepeptidových zlúčenín (mimetík), ktoré by boli vhodné v rovnakej terapii ako protilátky. Pozri Saragovi a kol., Science 253, 792 - 795 (1991).

Uloženie

Kmeň GCAEG E. coli XI-I Blue, Anti CD-4 je uložený s ATCC a má pridelené číslo 69030. Toto uloženie sa vykonalo 9. júla 1992.

Prihlasovateľ a jeho spoločníci potvrdzujú svoju zodpovednosť za náhradu týchto kultúr, ak vyhynú pred uplynutím platnosti udeleného patentu, 5 rokov po poslednej žiadosti o kultúru, alebo 30 rokov, podľa toho, ktorá lehota potrvá dlhšie, a zodpovednosť upozorniť depozitár na udelenie tohto patentu, pričom v tomto čase sa depozit stane neodvolateľné prístupný verejnosti. Do tohto času sa stane dostupným pre Commisioner of Pattents podľa podmienok 37 C.F.R článkov 1 - 14 a 35 U.S.C. článku 112.

(1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATELIA: ROLAND A. NEWMAN

NABIL ΜΑΝΝΑ RONALD W. RAAB (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Chiméma protilátka, ktorá sa viaže špecificky k ľudskému antigénu, farmaceutický prostriedok s jej obsahom, spôsob jej výroby a použitie (iii) POČET SEKVENCIÍ: 16 (iv) KOREŠPONDENČNÁ ADRESA:

(A) ADRESÁT: Lyon & Lyon (B) ULICA: 611 West Sixth Street (C) MESTO: Los Angeles (D) ŠTÁT: California (E) ZEM: USA (F) POŠTOVNÉ SMEROVACIE ČÍSLO: 02111-2658 (v) POČÍTAČOVÁ ČÍTACIA FORMA:

(A) TYP MÉDIA: DISKETA 3,5“, 1,44 Mb (B) POČÍTAČ: IBM kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: IBM P.C. DOS (Verzia 5.0) (D) POČÍTAČOVÝ PROGRAM (SOFTWARE): WordPerfect (Verzia 5.0) (vi) ÚDAJE O PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:

(B) DÁTUM PODANIA:

(C) KLASIFIKÁCIA:

(vii) ÚDAJE O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:

Celkový počet prihlášok vrátane prihlášky uvedenej nižšie: 2 (A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: 07/856 281 (B) DÁTUM PODANIA: 23. MARCA 1992 (A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: 07/735 064 (B) DÁTUN PODANIA: 25. JÚLA 1991 (viii) INFORMÁCIA O ZÁSTUPCOVI:

(A) MENO: Warburg, Richard J.

(B) ČÍSLO REGISTRÁCIE: 32,327 (C) ODKAZ/ČÍSLO SPISU: 198/158 (ix) INFORMÁCIA O SPOJENÍ:

(A) TELEFÓN:(213) 489 -1600 (B) FAX: (213)955-0440 (C) TELEX: 67-3510 (2) INFORMÁCIA O SEKV. ID Č. 1:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 1:

CCATGGACTG GACCTGG 17 (3) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 2:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 2:

ATGGACATAC TTTGTTCCAC 20 (4) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 3:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (c) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 3:

CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20 (5) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 4:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 4:

ATGAAACACC TGTGGTTCTT 20 (6) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 5:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 5:

ATGGGGTCAA CCGCCATCCT 20 (7) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 6:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 6:

ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT 20 (8) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 7:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 16 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 7:

TTGGGGCGGA TGCACT 16 (9) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 8:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 8:

GATGGGCCC TTGGTGGA 17 (10) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 9:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 9:

GATGACCCAG TCTCCAGCCTC 21

K (11) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 10:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 10

CTCACTTGCT GCACAGGTCC 21

Y VR M (12) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 11:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 11:

AAGACAGATGGTGCAGCCA 19 (13) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 12:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 12:

GGAACAGAGT GACCGAGGGG 20 (14) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 13:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 31 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 13:

ACTAAGTCGA CATGAAACAC CTGTGGTTCT T 31 (15) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 14:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 14:

ATCACAGATC TCTCACCATG ACCTGCTCCC

CTCTCCTCC 39 (16) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 15:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 423 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 15:

GAC ATG ΛΛΛ CAC CTG TGG TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCC CCC AGA48

TGG GTC TTG TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG GCG GGC CCA GGA CTG GTG96

AAG CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC144

ATC AGC GGT GAC TAT TAT TGG TTC TGG ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG192

GGA CTG GAG TGG ATC GGC TAC ATCTAT GCC AGT GGT GGG GGC ACC AAT240

TAC AAT CCC TCC CTC AAC AAT CGA GTC TCC ATT TCA ATA GAC ACG TCC288

AAG AAC CTC TTC TCC CTG AAA CTG AGG TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG336

GCC GTC T.4T TAC TGT GCG AGT .AAT ATA TTG AAA TAT CTT CAC TGG TTA384

TTA TAC TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA423 (17) INFORMÁCIA O SEKV. ID. Č. 16:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 3S7 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 16:

ACC ATG GCC TGG GCT CTG CTG CTC CTC GGC CTC CTT GCT CAC TTT ACA48

GAC TCT GCG GCC TCC TAT GAG TTG AGT CAG CCT CGC TCA GTG TCC GTG96

TCC CCA GGA CAG ACG GCC GGG TTC ACC TGT GGG GGA GAC .AAC GTT GGA144

AGG AAA AGT GTA CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA CCG CAG GCC CCT GTG192

CTG GTC ATC TAT GCT GAC AGC GAA CGG CCC TCA GGG ATC CCT GCG CGA240

TTC TCT GGC TCC AAC TCA GGG AAC ACC GCC ACC CTG ACC ATC AGC GGG288

GTC GAG GCC GGG GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAG GTG TGG GAC AGT336

ACTGCTGATCAT TGG GTC TTC GGC GGA GGG ACC CGG CTG ACC GTC CTA384

GGT387

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Chimérna protilátka, ktorá sa viaže špecificky k ľudskému antigénu, je neimunogénna u človeka, a nie je taká istá ako ľudská alebo šimpanzia protilátka, a ktorá obsahuje polypeptidy s ľahkým a ťažkým reťazcom, z ktorých každý obsahuje variabilnú oblasť, ktorá ma aminokyselinová sekvenciu variabilnej oblasti protilátky opice Starého sveta vybranej z makakov rézus, makakov jávskych a paviánov, a konštantnú oblasť, ktorá má aminokyselinová sekvenciu konštantnej oblasti ľudskej alebo šimpanzej protilátky.
2. 2. Chiméma protilátka podľa nároku 1, ktorá obsahuje polypeptidy s ľahkým a ťažkým reťazcom, z ktorých každý obsahuje konštantnú oblasť majúcu aminokysclinovú sekvenciu konštantnej oblasti ľudskej protilátky.
3. 3. Chiméma protilátka podľa nároku 2, ktorá obsahuje polypeptidy s ľahkým a ťažkým reťazcom, z ktorých každý obsahuje variabilnú oblasť majúcu aminokyselinová sekvenciu variabilnej oblasti protilátky makakajávskeho.
4. 4. Chiméma protilátka podľa nároku 3, ktorá sa špecificky viaže k CD4 a obsahuje ľahký reťazec obsahujúci aminokyselinová sekvenciu variabilnej oblasti zobrazenej na obrázku 13 a ľudskú konštantnú oblasť lambda ľahkého reťazca, a ťažký reťazec obsahujúci aminokyselinová sekvenciu variabilnej oblasti zobrazenú na obr. 14 a ľudskú konštantnú oblasť gama-1.
5. 5. Chiméma protilátka podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorá obsahuje:

   polypeptid s ľahkým reťazcom, ktorý obsahuje konštantnú oblasť majúcu aminokyselinová sekvenciu konštantnej oblasti kapa alebo lambda ľahkého reťazca ľudskej protilátky, a polypeptid s ťažkým reťazcom, ktorý obsahuje konštantnú oblasť majúcu aminokyselinová sekvenciu konštantnej oblasti gama-1 ťažkého reťazca ľudskej protilátky, kde táto protilátka je produkovaná expresiou z expresného vektora TCAE 5.2 zobrazeného na obr. 5 alebo TCAE 6 zobrazeného na obr. 6.
6. 6. Chiméma protilátka podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorá sa špecificky viaže k ľudskému antigénu zahrnutému v autoimúnnom ochorení alebo poruche alebo ľudskému tumorovému antigénu.
7. 7. Chimérna protilátka podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorá sa špecificky viaže k ľudskému antigénu vybratému zCD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFa, TNFp, Tn antigénu, 1L-1, 1L-8, receptora ľudských T-buniek, CD3, CD28, CD8, CDlla, CD 11 b, CD 11 c, CD 18, CD5a, CD45, produktu neu onkogénu, MDR-1, TGF-α, TGFa receptora, PDGF a CD71.
8. 8. Chiméma protilátka podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorá je terapeuticky účinná pri podávaní v dávke od 0,05 mg/kg do 100 mg/kg telesnej hmotnosti.
9. 9. Chiméma protilátka podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na použitie ako terapeutické činidlo.
10. 10. Chiméma protilátka podľa nároku 9, ktorá sa špecificky viaže k ľudskému antigénu zahrnutému v rakovine, infekčnom ochorení alebo autoimúnnom alebo zápalovom ochorení alebo poruche, a odmietnutí transplantovaného orgánu alebo tkaniva, na použitie na liečenie alebo prevenciu tohto ochorenia alebo poruchy.
11. 11. Chiméma protilátka podľa nároku 9, na použitie na liečenie ochorenia alebo poruchy vyvolaním imunosupresie.
12. 12. Chiméma protilátka podľa nároku 11, kde ochorenie alebo porucha sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z reumatoidnej artritídy, lupus erythematosus, systémového lupus erythematosus, Hashimotovej tyreoiditídy, sklerózy multiplex, ťažkej myastémie, diabetes typu 1, uveitídy, nefrotického syndrómu, psoriázy, atopickej dermatitídy, kontaktnej dermatitídy, seboroickej dermatitídy, ekzematickej dermatitídy, plochého červeného lišaja, pemfigus, bulózneho pemfigus, pľuzgierikovitej epidermolýzy, urtikárie, an gioedémov, vaskulitídy, erytému, kutánnej eozinofílie, ohraničenej alopécie, reverzibilných obštruktívnych ochorení dýchacích ciest, migrény, ekzému, rhinitídy, iných alergických ochorení alebo porúch spojených s intestinálnym zápalom, vrátane celiakálneho ochorenia, proktitídy, eozinofílie gastroenteritis, mastocytózy, Cronovej choroby a ulceratívnej kolitídy.
13. 13. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje terapeuticky účinné alebo profylaktický účinné množstvo chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 vo farmaceutický prijateľnom nosiči.
14. 14. Rekombinantnú nukleová kyselina, ktorá obsahuje nukleotidové sekvencie kódujúce polypeptidy s ľahkým a ťažkým reťazcom chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12.
15. 15. Rekombinantná nukleová kyselina podľa nároku

    14, ktorá je expresným vektorom zobrazeným na obr. 5 alebo 6.
16. 16. Spôsob výroby chimémej protilátky, ktorá sa špecificky viaže k ľudskému antigénu aje neimunogénna u ľudí, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje expresiu rekombinantnej nukleovej kyseliny podľa nároku 14 alebo

    15.
17. 17. Fragment chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, ktorý sa špecificky viaže k ľudskému antigénu, je neimunogénny u človeka a obsahuje variabilné oblasti polypeptidov s ľahkým a ťažkým reťazcom protilátky opice Starého sveta vybranej z makakov rézus, makakov jávskych a paviánov, a fragment konštantnej oblasti majúcej aminokyselinová sekvenciu konštantnej oblasti ľudskej alebo šimpanzej protilátky, pričom tento fragment vykazuje protilátkovú efektorovú funkciu u ľudí.
18. 18. Fragment Fab, alebo (Fab)₂ chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, ktorý sa špecificky viaže k ľudskému antigénu, je neimunogénny u človeka, a obsahuje variabilné oblasti polypeptidov s ľahkým a ťažkým reťazcom protilátky opice Starého sveta vybranej z makakov rézus, makakov jávskych a paviánov, a kde polypeptidy s ľahkým a ťažkým reťazcom konštantnej oblasti majú aminokyselinové sekvencie častí konštantnej oblasti Fab alebo (Fab)₂ fragmentu ľudskej alebo šimpanzej protilátky.
19. 19. Fragment protilátky podľa nároku 17 alebo 18, ktorý obsahuje variabilné oblasti polypeptidov s ľahkým a ťažkým reťazcom protilátky opice makakajávskeho.
20. 20. Fragment protilátky podľa nároku 19, ktorý obsahuje aminokyselinové sekvencie s ľahkým a ťažkým reťazcom variabilnej oblasti zobrazené na obrázkoch 13 a 14.
21. 21. Rekombinantná nukleová kyselina, ktorá obsahuje nekleotidové sekvencie kódujúce polypeptidy obsahujúce variabilnú oblasť fragmentu chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 20.
22. 22. Spôsob výroby fragmentu chimcrncj protilátky, ktorý sa špecificky viaže k ľudskému antigénu aje neimunogénny u človeka, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje expresiu rekombinantnej nukleovej kyseliny podľa nároku 21.
23. 23. Použitie chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu ochorenia alebo poruchy vybranej zo skupiny pozostávajúcej z rakoviny, infekčného ochorenia, odmietnutia transplantovaného orgánu alebo tkaniva, a autoimúnneho alebo zápalového ochorenia alebo poruchy.
24. 24. Použitie chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu autoimúnneho ochorenia alebo poruchy.
25. 25. Použitie chimérnej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov I až 12 na výrobu liečiva na liečenie rakoviny.
26. 26. Použitie chimérnej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na výrobu liečiva na liečenie ochorenia alebo poruchy vybranej zo skupiny pozostávajúcej z reumatoidnej artritídy, psoriázy, transplantácie, atopickej dermatitídy, kontaktnej dermatitídy alebo seboroickej dermatitídy.
27. 27. Použitie chimérnej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na výrobu liečiva na liečenie ochorenia alebo poruchy vybranej zo skupiny pozostávajúcej z reumatoidnej artritídy, lupus erythematosus, Hashimotovej tyreoiditídy, sklerózy multiplex, ťažkej myastémie, diabetes typu 1, uveitidy, nefrotického syndrómu, psoriázy, atopickej dermatitídy, kontaktnej dermatitídy, seboroickej dermatitídy, ekzematickej dermatitídy, plochého červeného lišaja, pemfigus, bulózneho pemfigus, pľuzgierikovitej epidermolýzy, urtikárie, angioedémov, vaskulitídy, erytému, kutánnej eozinofíliázy, ohraničenej alopécie, reverzibilného obštruktívneho ochorenia dýchacích ciest, migrény, ekzému, rhinitidy, iných alergických ochorení alebo porúch spojených s intestinálnym zápalom vrátane celiakálneho ochorenia, proktitídy, eozinofilie gastroenteritis, mastocytózy, Cronovej choroby a ulceratívnej kolitídy.