CZ289472B6 - Chimérická protilátka, nukleová kyselina, která ji kóduje, způsob její produkce a farmaceutická kompozice, která ji obsahuje - Google Patents

Abstract

Popisuje se chim rick protil tka obsahuj c konstantn oblast a vazebn m sto pro antigen, kter se specificky v e k lidsk mu antigenu, ze dvou r zn²ch protil tek, ve kter konstantn oblast je konstantn oblast lidsk ho imunoglobulinu a st v zaj c antigen, kter se specificky v e k lidsk mu antigenu, je variabiln oblast imunoglobulinu opice Star ho sv ta. D le se popisuje nukleov kyselina, kter tuto protil tku k duje, zp sob produkce t to protil tky a farmaceutick kompozice, kter ji obsahuje.\

Description

Chimérická protilátka, nukleová kyselina, která ji kóduje, způsob její produkce a farmaceutická kompozice, která ji obsahuje

Oblast techniky

Přihláška se týká chimérických (rekombinantních) protilátek využitelných v humánní medicíně, nukleových kyselin, které je kódují, způsobů produkce takovýchto protilátek a farmaceutických kompozic, které je obsahují.

Dosavadní stav techniky

Myší monoklonální protilátky se využívají v diagnostice lidských onemocnění, jakož i pro řešení problémů základního biologického výzkumu. Tyto látky se taktéž používají při klinických testech a k léčbě jak akutních tak i chronických onemocnění, včetně leukémií, lymfonů, tuhých nádorů (např. tračníku, prsu, jater), AIDS a autoimunních onemocnění. Byly vytvořeny chimérické protilátky typu myš/člověk, na kterých byla ukázána vazebná charakteristika rodičovských myších protilátek a efektorová aktivita daná lidskou konstantní oblastí protilátky. Viz mimo jiné, Cabilly a kol., US pt. č. 4 816 567, Shoemaker a kol, US pat. č. 4 978 745, Beavers a kol., US pat. č. 4 975 369 a Boss a kol., US pat. č. 4 816 397 viz příloha. Tyto chimérické protilátky byly vesměs vytvořeny pomocí genomické genové knihovny DNA získané z existujících myších hybridomů. Nishimura a kol., 47 Cancer Research 999, 1987. V této knihovně je pak vyhledán gen, kódující variabilní oblast jak těžkého tak lehkého řetězce. Poté je nutno najít vhodný způsob, kterým jsou jednotlivé fragmenty protilátek sestaveny dohromady. Klonované geny pro variabilní oblasti jsou pak přeneseny do vhodného expresního vektoru. V tomto vektoru jsou již nakloňovány kazety obsahující geny pro vhodnou konstantní část lehkého nebo těžkého řetězce.

Tyto chimérické geny jsou pak exprimovány v libovolné buněčné linii, obyčejně v linii myšího myelomu.

Tyto chimérické protilátky byly již použity v humánní terapii. Protilátky, které se proti těmto protilátkám v člověku-recepientovi vytvoří, jsou velmi často překážkou další léčby.

Ehrlich a kol., 34 Clinical Chemistry 1681, 1988, Ehrlich a kol., 7 Hybridomas 385, 1988, Ehrlich a kol., 1 Human Antibody Hybridomas 23, 1990, (nelze považovati za předchůdce této patentové přihlášky), se v těchto pracech zmiňuje o tom, že je možno očekávat, že lidské monoklonální protilátky budou k léčbě člověka in vivo vhodnější, nežli monoklonální protilátky z myších myelomů. Také postupoval tezi, že protilátky primátů (např. šimpanzí monoklonální protilátky), budou v lidském organismu tolerovány, protože jsou strukturně podobné lidským protilátkám. Protože lidské protilátky nejsou imunogenní pro makaka Rhesuse (tzn. neindukují protilátkovou imunitní odpověď), předpokládal, že zrovna tak protilátky primátů nebudou imunogenní pro člověka. Ukázal také, že testování takovýchto protilátek na člověku není bezpodmínečně nutné, pakliže protilátka z primáta je identická s lidskou protilátkou, nebo se od ní neliší více, než se lidské protilátky liší navzájem mezi sebou. Předpokládal tedy, že šimpanzí protilátky mohou být užitečné v humánní terapii.

Podstata vynálezu

Vynález se týká chimérických (rekombinantních) protilátek obsahujících konstantní oblast a vazebné místo pro antigen, které se specificky váže k lidskému antigenů, ze dvou různých protilátek, ve kterých konstantní oblastí je konstantní oblast lidského imunoglobulinu a částí vázající antigen (antigen-rozpoznávající částí), která se specificky váže k lidskému antigenů, je variabilní oblast imunoglobulinu opice Starého světa. Mezi opice Starého světa, dále zmiňované rovněž jenom jako „opice“ patří mimo jiné pavián a maka, zejména pavián, maka Rhesus a

-1 CZ 289472 B6 makak jávský (cynomolgus). Dále se vynález týká nukleových kyselin, které tyto protilátky kódují a jejichž expresí tak vznikají uvedené lidské/opičí chimérické protilátky.

Vynález se rovněž týká způsobu produkce daných chimérických protilátek, při kterém se (i) u opice Starého světa vyvolá tvorba protilátek opice Starého světa vůči zmíněnému antigenů, (ii) nukleová kyselina opice Starého světa, kódující vazebné místo pro antigen variabilní oblasti uvedené protilátky opice Starého světa se izoluje, (iii) připraví se lidská nukleová kyselina kódující lidskou konstantní oblast lidské protilátky, (iv) výše zmíněná nukleová kyselina opice Starého světa a výše zmíněná lidská nukleová kyselina se ligují pro vytvoření rekombinantní nukleové kyseliny, a (v) výše zmíněná rekombinantní nukleová kyselina se exprimuje pro produkci uvedené rekombinantní protilátky.

Tyto chimérické protilátky lze použít jako imunoterapeutické látky pro léčbu lidských onemocnění. Vynález se tak rovněž týká farmaceutických kompozic, které obsahují terapeuticky nebo profylakticky účinné množství těchto protilátek ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

Vynález je založen na zjištění, že člověku evolučně vzdálené opice (mimo jiné pavián a makak (včetně makaků Rhesuse a jávského)), ne však už šimpanz, jsou nejenom dostatečně evolučně vzdálené od lidí, aby produkovaly protilátky proti lidským antigenům a to i značně konzervovaným (např. CD4 a CD54), ale jsou i natolik podobné lidem, aby měly protilátky podobné lidským. Proto nedochází u recipientů k imunitní odpovědi namířené proti podaným protilátkám, když jsou takové rekombinantní protilátky odvozené z opičích člověku podávány.

Na rozdíl od některých dřívějších protilátek užívaných pro humánní terapii protilátky podle vynálezu nemají některé nedostatky. Mimo jiné tyto: 1. imunogenicitu a indukci lidské protiprotilátkové odpovědi (human anti-antibody response-HAA) při opakovaném podávání « nezbytném pro léčbu chronických onemocnění. 2. relativně krátký poločas rozpadu ve srovnání s lidskými protilátkami. 3. nepřítomnost zesilovací funkce pro lidské buňky a komplement. Nepřítomnost těchto nedostatků myších a jiných protilátek je významnou výhodou pro lidskou terapii protilátkami vyrobenými podle současného vynálezu. Např. v případě chronických lidských onemocnění včetně autoimunních onemocnění nebo jakýchkoliv jiných onemocnění, která vyžadují delší podávání protilátek, je jedna z nejtěžších překážek pro opakovanou léčbu protilátkami pacientova imunitní odpověď na léčebnou protilátko. HAA odpověď je často nepředvídatelná a liší se od pacienta k pacientu. Tato odpověď je nejčastěji, i když ne vždy, namířena proti konstantní oblasti molekuly protilátky. A jakmile se jednou vyskytne, často zcela vyloučí nebo velmi sníží efektivitu další terapie touto protilátkou a nebo jinou protilátkou téhož izotypu.

Potenciálně by se problém HAA mohl obejít použitím lidských monoklonálních protilátek, tento přístup však podléhá etickým, klinickým a imunologickým omezením při imunizaci lidského subjektu různými antigeny (mimo jiné lidskými antigeny, tzn. antigenními a imunogenními oblastmi různých proteinů, polypeptidy a jejich ekvivalenty přítomnými v člověku) proto, aby se proti nim vytvořily protilátky. Přístup přihlašovatelů k obejití tohoto problému zahrnuje vytvoření protilátek vhodné specifity a požadované zesilovací funkce a jejich použití pro produkci rekombinantních protilátek. Tyto rekombinantní protilátky obecně obsahují vhodnou část variabilní oblasti opičí protilátky získané z imunizované opice a konstantní oblast protilátky z člověka. Tím je zachována specifíta a vysoká afinita monoklonálních protilátek a zároveň může být snadno vybrána lidská konstantní oblast vykazující požadovanou efektorovou funkci.

Vynález je dále založen na metodě amplifikování genů opičích imunoglobulinů pomocí polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction-PCR). Pro PCR byla použita RNA získaná z opičích lymfocytů za použití syntetických oligonukleotidových primerů specifických pro genovou rodinu těžkých a lehkých řetězců variabilní oblasti. Amplifíkované geny nebo části genů kódující vhodnou část komplementaritu určující oblasti (complementerity determining

-2CZ 289472 B6 region-CDR) byly vloženy do expresního vektoru (viz Winter, britská patentová přihláška č. GB 2188638A), který obsahoval lidské geny pro konstantní oblast a produkoval rekombinantní protilátky typu člověk-opice požadovaného izotypu. Tyto protilátky představují imunoterapeutické agens vhodné k lokalizaci nebo zabíjení vhodných cílových buněk (např. tumorových buněk) po podání in vivo.

Při realizaci vynálezu je potřeba klonovat antigen-rozpoznávající části variabilní oblasti genu opičí protilátky. Metoda tohoto klonování, používaná podle vynálezu, zahrnuje získání nukleové kyseliny, např. RNA z opice, vytvoření cDNA podle RNA pomocí reverzní transkriptázy, přípravu primerů komplementárního k sekvenci cDNA, která kóduje 5 vedoucí sekvenci genu protilátky, spojení této cDNA s primerem k vytvoření hybridního komplexu a amplifikaci této cDNA a produkci většího množství nukleové kyseliny kódující variabilní oblast opičí protilátky.

Antigen-rozpoznávající částí je míněna jedna nebo více částí variabilní oblasti opičí protilátky, která je zodpovědná za vazbu a/nebo rozpoznávání cílového antigenu (nebo epitopu nebo idiotypu), t.j. obsahující CDR oblast (viz níže) nebo celou variabilní oblast nebo jakoukoliv kombinaci těchto dvou oblastí včetně jakýchkoliv změn v kódujících jednotkách. Tyto změny mohou být provedeny, aby přizpůsobily tuto oblast člověku beze změny specifických vazebných schopností protilátky. Jestliže je použita jenom část celé variabilní oblasti, pak zbývající části, například tzv. úsek základní struktury, jsou připraveny z jiné protilátky, konkrétně lidské (viz níže a viz výše citované práce).

Výrazy „variabilní oblast“, „vedoucí sekvence“, „konstantní oblast“ a „úsek základní struktury“ jsou užívány v jejich obvyklém významu. Příklady jsou uvedeny dále a v pracích uvedených výše. Nejčastěji je vedoucí sekvence lidská, šimpanzí nebo opičí o délce přibližně 60 bází, příklady jsou uvedeny na obrázku 1. Přihlašovatelé objevili, že vedoucí sekvence pro opičí, šimpanzí nebo lidskou variabilní oblast jsou natolik podobné, že primery konstruované pro jednu jsou schopné amplifikovat i ostatní druhy. Při práci podle vynálezu je RNA amplifikována v takovém množství, že to postačuje k přenosu nukleové kyseliny do vektoru pro další klonování.

Vynález se rovněž týká způsobu produkce takových protilátek proti lidským antigenům, které nejsou pro člověka imunogenní. Tato metoda zahrnuje tvorbu opičích protilátek v opici proti lidským antigenům a izolaci opičí nukleové kyseliny, která kóduje antigen rozpoznávající část variabilní oblasti opičí protilátky. Po spojení s lidskou nukleovou kyselinou kódující lidskou konstantní oblast protilátky spolu vytvářejí rekombinantní nukleovou kyselinu. Tato rekombinantní nukleová kyselina pak produkuje požadovanou protilátku. Při tvorbě nové protilátky musí být nově produkovaná protilátka méně imunogenní než opičí konstantní oblast, tak aby nedocházelo k žádné významné imunitní odpovědi po podání rekombinantní protilátky člověku (o takových oblastech protilátek se zde zmiňujeme jako o homologních oblastech). Tak je vytvořena rekombinantní protilátka, která je funkčně shodná s lidskou, t.j. aminokyselinové složení její konstantní oblasti je homologní s lidskou konstantní oblastí. To znamená, že tato protilátka je stejná jako lidská protilátka, tam kde je to nutné pro redukování možnosti nežádoucí imunitní odpovědi a zároveň obsahuje antigen-vazebné místo z opičí protilátky.

Výrazem „neimunogenní“ je míněno, že protilátka proti sobě neobrací imunitní odpověď takové velikosti, která by redukovala efektivitu pokračujícího podávání protilátky po dobu potřebnou pro dosažení terapeutických výsledků u většiny populace (při srovnání s myšími nebo lidsko-myšími chimérickými protilátkami). Nejčastěji není pozorována žádná protilátková imunitní odpověď.

Podle výhodného provedení vynález zahrnuje převedení opičích buněk, které jsou odpovědné za produkci opičích protilátek, do stavu „nesmrtelnosti“ (imortalizaci). Této je dosaženo např. fúzí s hybridomy, virovou transformací s herpes papiovirem, klonováním jednotlivých B-buněk (tzv. přechodná nesmrtelnost) a vytvořením knihovny rekombinantních imunoglobulinů. Často tato metoda zahrnuje izolaci opičích B-buněk a to buď z periferní krve, sleziny, kostní dřeně nebo lymfatických uzlin; výběr klonu, který produkuje hledanou protilátku; uvolnění genů kódujících

-3CZ 289472 B6 tuto protilátku z nesmrtelné buněčné linie a přenesení těchto genů do produkční buněčné linie (buněčná linie, která zajišťuje dostatečnou produkci protilátek, tak aby byla využitelná pro humánní terapii). Vynález tedy popisuje rekombinantní protilátky tvořené lidskou konstantní oblastí a antigen-rozpoznávající částí opičí variabilní oblasti.

Vynález dále popisuje monoklonální protilátky nebo FAB, (FAB)2 části, dimery lehkého nebo těžkého řetězce, nebo jejich minimální rekombinantní fragmenty, tak jako SCA (jednořetězcová protilátka, single chain antibody) nebo jejich imunologicky aktivní fragmenty (CDR oblast), které jsou namířeny proti lidskému antigenů, a které jsou produkovány nesmrtelnými opičími Bbuňkami. Tyto fragmenty jsou využitelné jako imunosupresivní látky. Popř. může být k vynalezeným protilátkám připojena efektorová nebo nosná molekula. K protilátce podle vynálezu může být například připojen makrocyklus pro chelataci atomu těžkého kovu nebo toxin (např. ricin), který je kní připojen pomocí kovalentního můstku. Například může být FC fragment nebo doména CH3 nahrazena molekulou toxinu nebo enzymu a část imunoglobulinu může být navázána na polypeptidovou molekulu nosiče nebo efektoru. Standardními procedurami mohou být rovněž konstruovány bispecifícké protilátky.

Vynález rovněž popisuje farmaceutické kompozice, ve kterých jsou protilátky podle vynálezu použity pro terapeutické a profylaktické účely. Takovéto protilátky mohou být rovněž použity jako imunotoxiny, tzn. molekuly, které jsou charakterizovány dvěma komponenty a jsou použitelné pro zabíjení vybraných buněk in vitro nebo in vivo. Jednou složkou většinou bývá cytotoxická látka, která má obvykle fatální následky pro buňku pakliže jí je absorbována, druhá složka (tzv. dopravní prostředek delivery vehicle) zajišťuje způsob dopravní toxické látky k cílové buňce, např. buňce karcinomu. Tyto dvě složky jsou většinou chemicky vázány jednou z mnoha dobře známých chemických nebo genetických procedur. Např. je-li cytotoxickou látkou protein a druhou složkou intaktní imunoglobulin, ke spojení může být použito bifúnkčních spojníků, např. karboimidu, glutaraldehydu a jim podobných. Produkce různých imunotoxinů je dobře známá z dosavadního stavu techniky.

Vynález dále popisuje nukleovou kyselinu kódující lidsko—opičí rekombinantní protilátku.. Tato nukleová kyselina kóduje lidskou konstantní oblast a antigen-rozeznávající část opičí variabilní oblasti. Tato nukleová kyselina je vyčištěna, tzn. oddělena od biologických komponent, se kterými se přirozeně vyskytuje neboje výhodněji připravena jako homogenní roztok.

Vynález rovněž popisuje CDR-očkované protilátky, které jsou vytvořeny z nejméně jedné CDR oblasti. Tyto oblasti jsou tvořeny (za použití standardního Kabatova systému pro číslování aminokyselin) těmito aminokyselinovými zbytky: 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) a 95102(CDR3) na těžkém řetězci a aminokyselinovými zbytky 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) a 89-97 (CDR3) na lehkém řetězci variabilní oblasti opic Starého světa a kostrou variabilní oblasti některého jiného druhu. CDR očkovaná protilátka je schopná vázat tytéž antigeny jako původní opičí protilátka. Konstantní oblast je odvozena od lidské protilátky. Metodologie je obecně popsána v práci Jones a kol. 321 Nátuře 522,1986. Takovéto CDR rouby mohou být použity, jeli potřeba zajistit, aby protilátka byla podobnější lidské, a tak byla snížena možnost nepříznivé reakce u příjemce.

Způsob podle vynálezu výhodně zahrnuje imortalizaci a výběr takových buněk a makaka, které jsou zodpovědné za produkci protilátek a uvolnění imunoglobulinových genů z buňky; klonování a sekvenování protilátkových genů, které jsou zodpovědné za produkci protilátek, výběr sekvence úseku základní struktury lidské variabilní oblasti (nejlépe s nejbližší homologií s kostrou variabilní oblasti makaka); a náhradu CDR sekvencí makaka lidskými CDR sekvencemi. Pro zachování afinity protilátky k určenému antigenů mohou být provedené drobné modifikace v úseku základní struktury lidské variabilní oblasti.

„Drobnými modifikacemi“ je míněno, že méně než šest aminokyselinových zbytků v kostře podjednotky může být nahrazeno jinými aminokyselinami. Takovéto substituce nebo modifikace

-4CZ 289472 B6 jsou prováděny jedině u těch aminokyselin, které zprostředkovávají interakce, které drží kostru protilátky ve vhodné formě, tak aby byl rozpoznáván požadovaný antigen. U takovýchto modifikací se většinou odrazí rozdíly mezi aminokyselinami přítomnými v protilátkách lidských a opičích. Např. sekvence aminokyselin v lidské protilátce těsně před CDR3 oblastí těžkého řetězce, na pozicích 92-94 je obecně cystein, alanin, arginin (arginin bývá někdy nahrazen serinem nebo threoninem), přičemž u některých opičích protilátek je tato sekvence cystein, alanin, serin, v tomto případě, který je zde uveden jako příklad, tedy může být preferováno použití šeřinu na pozici 94, viz obr. 9D.

Protilátky podle vynálezu lze použít k léčbě člověka, který vykazuje určitý antigen, např. antigen nějak spojený s nemocí. Při takovém léčení se podává terapeuticky účinné množství rekombinantní protilátky podle vynálezu, specifické pro tento určitý antigen.

Podle výhodného provedení je výše zmíněným antigenem tumorový antigen, antigen provázející imunitní chorobu, antigen provázející autoimunní onemocnění, receptor exprimovaný na hostitelské buňce nebo některý antigen vybraný z lidských antigenů ze skupiny zahrnující CD58, VLA4, (alfa4betal integrin), CD2, LFA3, ELÁM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, lidský Tbuněčný receptor, CD3, CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNFalfa, TNFbeta, Tn antigen, IL-1, IL-8, C58, adhezivní molekuly např. VCAM, CD54, CD28, CD11A, CDllc, CD18 a CDllb, produkt onkogenu neu, MDR-1, (P-glykoprotein), TGFalfa a jeho receptor, a PGDF; přičemž rekombinantní protilátka je schopná buď odstranit (zabít nebo eliminovat) nežádoucí buňky (např. antiCD4) spoluprací s komplementem nebo killer buňkami, nebo je aktivní jako cytotoxické agens, neboje příčinou vazby FC receptoru na fagocyt. Popř. protilátka blokuje nebo stimuluje funkce receptorů nebo neutralizuje aktivní rozpustné produkty jako např. interleukiny, TNF, C5A.

Vynález se rovněž týká farmaceutických kompozic obsahujících výše uvedené protilátky nebo jejich fragmenty. Kompozice nebo produkty podle vynálezu mohou být konvenčně připraveny ve formě roztoků pro parenterální, nasální nebo orální podávání. Odpovídající přípravky obsahující protilátky mohou být smíchány s vhodnými přípravky obsahujícími jiné účinné látky, výsledkem čehož je zvětšená klinická použitelnost takto získaných přípravků.

Další znaky a výhody vynálezu budou patrné z následujícího popisu jeho výhodných provedení a příkladů.

Popis výhodných provedení vynálezu:

Stručný popis obrázků na výkresech

Na obr. 1 je tabulka ukazující 20 kodónů devíti různých Ig vedoucích sekvencí lidského těžkého řetězce a 10 opičích Ig vedoucích sekvencí těžkého řetězce. Sekvence primerů jsou označeny podtržením.

Na obr. 2 je diagram ukazující strukturu různých Ig řetězců, dále pak ukazuje relativní pozici vedoucí variabilní a konstantní oblasti spolu s restrikčními místy a primery použitými pro amplifíkaci. Na obr. 2a je těžký řetězec Ig, na obr. 2b je kappa a na 2c lambda řetězec imunoglobulinu.

Obr. 3 Na diagramu je vektor označený pGENEX-H(neo), který obsahuje kazetu těžkého řetězce, a který byl použit pro expresi lidských a chimérických protilátek. Na obrázku jsou vyznačena cílová místa pro restrikční enzymy.Symboly:P-promotor, V-vedoucí sekvence. ZzesilovaČ transkripce.

-5CZ 289472 B6

Obr. 4 Na obrázku je vektor označený pGENEX-L(Gpt), 9,5kb obsahující kazetu lehkého řetězce Ig, který byl vytvořen pro expresi lidských nebo chimérických protilátek. Na obrázku jsou vyznačena cílová místa pro restrikční enzymy. Symboly: P-promotor, V-vedoucí sekvence, Zzesilovač transkripce.

Obr. 5. Na diagramu je znázorněn vektor TCAE 5.2 vytvořený pro expresi imunoglobulinu z cDNA pro kappa lehký řetězec. V tomto vektoru byly geny pro imunoglobulin spojeny do tandemu s geny pro neomycin fosfotransferázu, která sloužila jako selektivní markér, na obrázku jsou vyznačena cílová místa pro restrikční enzymy. Symboly:LKC-lidský konstantní kappa řetězec, LGC-lidský konstantní gama I řetězec, L-vedoucí sekvence, CMV-promotor cytomegaloviru,BETA-hlavní promotor myšího beta globulinu, BGH-polyadenylační signál genu hovězího růstového hormonu, SV raný polyadenylační signál viru SV—40, SV ORI-počátek transkripce viru SV 40.

Obr. 6. Na diagramu je znázorněn vektor TCAE 6 vytvořený pro expresi imunoglobulinu z cDNA pro lambda lehký řetězec. V tomto vektoru byly geny pro imunoglobulin spojeny do tandemu s geny pro neomycin fosfotransferázu, která sloužila jako selektivní markér. Na obrázku jsou vyznačena cílová místa pro restrikční enzymy. Symboly: LGC-lidský konstantní gama I řetězec, LLC-lidský konstantní lambda řetězec, L-vedoucí sekvence, CMV-promotor cytomegaloviru, Beta -hlavní promotor myšího beta globulinu, BGH-polyadenylační signál genu hovězího růstového hormonu, SV raný polyadenylační signál viru SV-40, SV ORI-počátek transkriopce viru SV 40.

Obr. 7a, 7b a 8 ukazují několik sekvencí primerů k vedoucím sekvencím imunoglobulinů. Tyto primery byly použity v tomto vynálezu.

I) 5'primery ve směru transkripce.

Na obr. 7a jsou to:

A. Primery pro ranou vedoucí sekvenci těžkého řetězce lidské nebo opičí protilátky, s integrovaným místem pro restrikční enzym Sal I.

B. Primery pro pozdní vedoucí sekvenci těžkého řetězce lidské nebo opičí protilátky, s integrovaným místem pro restrikční enzym Mlu I.

Na obr. 7a': C. Primery pro úsek základní struktury 1 lidské nebo opičí protilátky, s integrovaným místem pro restrikční enzym Xho I.

II) 3'primery proti směru transkripce.

A. Protisměrné primery pro konstantní oblast těžkého řetězce lidské nebo opičí protilátky, s integrovaným místem pro restrikční enzym Nhe I.

Na obr. 7b jsou primery použité pro amplifíkaci lehkých variabilních řetězců opičích nebo lidských imunoglobulinů

I) 5'primery ve směru transkripce.

A. Primery pro ranou vedoucí sekvenci lehkého kappa řetězce lidské nebo opičí protilátky, s integrovaným místem pro restrikční enzym Bgl II.

B. Primery pro ranou vedoucí sekvenci lehkého lambda řetězce lidské nebo opičí protilátky, s integrovaným místem pro restrikční enzym Bgl II.

-6CZ 289472 B6

Na obr. 7b':

II) 3 'primery proti směru transkripce. A. Protisměrné primery pro lehký konstantní řetězec kappa lidské nebo opičí protilátky, s integrovanými místy pro restrikční enzymy Κρη I a BsiW I.

B. Protisměrné primery pro lehký konstantní řetězec lambda lidské nebo opičí protilátky, s integrovanými místy pro restrikční enzymy Κρη I, Hind III a Avr II.

Primery na obr. 8 budou později zmíněny jako SEQ.ID číslo 1-12 infra; pod jednotlivými body jsou uvedeny:

A. Variabilní oblast těžkého řetězce.

B. Konstantní oblast těžkého řetězce, vlákno proti směru transkripce.

C. Variabilní oblast lehkého řetězce.

D. Konstantní oblasti lehkého řetězce, vlákna proti směru transkripce.

Obr. 9a-9h. Na těchto obrázcích je srovnání sekvencí konvenční lidské oblasti s klonovanými opičími oblastmi VH 1 - VH 5, popř. VK1, VK2, Vlambda 3;

Jednotlivé obrázky znázorňují: 9a. konvenční lidská VH1 sekvence proti klonovaným opičím.(Akonvenční lidská VH1 sekvence, B-sekvence opičího klonu 1-2, C-sekvence opičího klonu VH 1-14).

9b. konvenční lidská VH2 sekvence proti klonovaným opičím.(A-konvenční lidská VH2 sekvence, B-sekvence opičího klonu 2-3, C-sekvence opičího klonu 2-13, D-sekvence opičího klonu 2-10).

9c. konvenční lidská VH3 sekvence proti klonovaným opičím.(A-konvenční lidská VH3 sekvence, B-sekvence opičího klonu 3-34, C-sekvence opičího klonu 3-36, D-sekvence opičího klonu 3-40, E-sekvence opičího klonu 3-9).

9d. konvenční lidská VH4 sekvence proti klonovaným opičím.(A-konvenční lidská VH4 sekvence, B-sekvence opičího klonu 4-13, C-sekvence opičího klonu 4-14, D-sekvence opičího klonu 4—16, E-sekvence SC-chimérického opičího klonu 3-9, F-opičí anti-CD4 chimérický klon).

9e. konvenční lidská VH5 sekvence proti klonovaným opičím.(A-konvenční lidská VH5 sekvence, B-sekvence opičího klonu 5-11).

9f. konvenční lidská VK1 sekvence proti klonovaným opičím.(A-konvenční lidská VK1 sekvence, B-sekvence opičího klonu Kl-7, C-sekvence opičího klonu Kl-3, D-sekvence opičího klonu K1-14).

9g. konvenční lidská VKII sekvence proti klonovaným opičím.(A-konvenční lidská VKII sekvence, B-sekvence opičího klonu K2-8, C-sekvence SC chimérického opičího klonu).

9h. konvenční lidská lambda VIII sekvence proti klonovaným opičím.(A-konvenční lidská lambda VIII sekvence, B-sekvence opičího klonu anti-CD4).

Na obr. 10 je srovnání konvenční lidské sekvence VH3 se čtyřmi různými opičími a osmi lidskými VH3sekvencemi. Symboly označují:A-KONV.LIDSKA VH3, B-RF TS2, C-RFSJ1, D-RF SJ2, E-BE, F-CHERRI, G-18/2, H-K6H6,1-1B11, J-opice č. 40, K-opice č. 9, L-opice č. 34, M-opice č. 36, N-lidská VH2.

Na obr. 11 je graf znázorňující přímou vazbu chimérické anti-CD4 protilátky podle vynálezu na SUP TI CD4 pozitivní buňky. Osa x - koncentrace protilátek (ng/ml), osa y - síla radioaktivního signálu (CPM1-125), A-myší antiCD4 protilátky, B-lidské imunoglobuliny, C-chimérické anti-CD4,.

Na obr. 12 je grafické znázornění inhibice vazby myších monoklonálních protilátek 1F3-CD4 na CD4 pozitivní buňky způsobené protilátkami z obr. 10. Osa x-koncentrace protilátky (ng/ml), osa y-procento inhibice, A-opičí anti-CD4, B-myší anti-CD4, D-chimérická anti-CD4 protilátka.

Na obr. 13 je část nukleotidových sekvencí opičího anti-CD4 těžkého řetězce od báze 1 do 420. Translace probíhá od metioninu vedoucí sekvence (ATG bp 4) až k bp 420. Zbytky aminokyselin jsou číslovány od aminok. Zbytku 1 v úseku základní struktury do posledního VH zbytku +120.

Na obr. 14 je část nukleotidových sekvencí opičího V lambda řetězce od báze 1 do 387. Translace probíhá od metioninu vedoucí sekvence (ATG pb 4) až k bp 387. Zbytky aminokyselin jsou číslovány od aminok. zbytku 1 v úseku základní struktury do posledního V lambda zbytku +109.

Na obr. 15 je graf ukazující kompletitivní testy protilátek proti antigenu CD54 z imunizované opice, proti monoklonálním protilátkám 84HIO. Vazba probíhala na CHO buňky transfikované ICAM antigenem. Osa X-ředění séra (x 1/100), osa y-procento inhibice. Opice pro229 dostala 3 injekce SB buněk. Křivka A popisuje kompetitivní aktivitu z první krve, křivky B, C a D označují kompetitivní aktivitu pro různá data odběru krve.

Na obr. 16 je histogram srovnávající různé expresivní plazmy (TCAE 5.2 a TCAE 12) podle dosažené produktivity protilátek. Osa x-produkce protilátky (ng/ml), osa y-frakce kolonií v procentech. Kolonií TCAE 5.2 bylo 258, zatímco kolonií TCAE 12 bylo 98.

Opičí protilátky

Mezi opice Starého světa patří již zmínění pavián a makak (včetně Rhesuse a m.jávského). Tento vynález popisuje způsob přípravy protilátek pomocí genů různých opic. Uvedené příklady opic nejsou omezující podmínkou vynálezu a metody podle vynálezu, mohou být jednoduše aplikovány i na jiné opice Starého světa.

Na obr. 2 jsou v diagramu znázorněny obecné struktury genů kódujících imunoglobuliny těžkého, lehkého kappa a lehkého lambda řetězce. Každý z těchto řetězců začíná startovacím kodonem ATG po kterém následuje vedoucí sekvence o přibližně 60-ti bázích. Dále následuje sekvence kódující variabilní oblast imunoglobulinu, a pak i sekvence kódující konstantní oblast tohoto imunoglobulinu. Příklady různých vedoucích sekvencí (nebo signálních peptidů) těžkých řetězců jsou ukázány na obr. 1. Tyto sekvence lidské, popř. i opičí mohou být snadno určený běžnými technikami známými z dosavadního stavu techniky. Popř. technikami popsanými níže.

Ve spodní části obr. 1 jsou znázorněny různé lidské vedoucí sekvence. Přihlašovatelé dokázali, že primery komplementární k těmto sekvencím dovolují amplifikaci i imunoglobulinových genů z opic. Podobně primery homologní k opičím vedoucím sekvencím (viz horní část obr. 1) mohou být použity k amplifikaci jak opičích, tak i lidských imunoglobulinových genů. Při použití těchto primérů a standardních amplifikačních procedur mohou být snadno izolovány geny kódující různé opičí imunoglobuliny a potom určeny sekvence kódující jejich variabilní oblasti. Příklady takovýchto procedur jsou uvedeny níže. Výsledky níže uvedené analýzy jsou uvedeny na obr. 9a-9h a na obr. 10. Přihlašovatelé překvapivě zjistili, že vzhledem k tomu, že opice je schopna produkovat protilátky proti relativně konzervovaným lidským antigenům, je sekvence úseku základní struktury opičí variabilní oblasti nerozlišitelná od sekvence lidské. Tzn. proměnlivost sekvencí pro imunoglobuliny pozorovaná u opic podobná proměnlivost pozorované

-8CZ 289472 B6 u lidí, a proto je nemožné určit, která protilátka byla odvozena z člověčí nebo opičí protilátky bez analýzy samotného zdroje.

Např. na obr. 10 je sekvence aminokyselin pro VH3 oblast člověka srovnána se sekvencí opice. Lidské protilátky mezi sebou vykazují homologii mezi 83-98 procenty, zatímco opičí byly homologní z 90-95 procent s lidskou VH3 oblastí. Pro srovnání lidská VH2 oblast byla homologní s VH3 oblastí pouze ze 60-ti procent (Na tomto obrázku zrovna tak, jako na dalších je přítomnost téže aminokyseliny na témž místě vyznačena vodorovnou čárkou, zatímco přítomnost jiné aminokyseliny je vyznačena standardním jednopísmenovým kódem. Pozice, ve kterých nemůžeme najít žádnou shodnou (konsenzuální) aminokyselinu, jsou označeny X.) Podobně homologie mezi řetězci VH1, VH2, VH3, VH4 a VH5 a řetězci VK1, VK2 a Vlambda3 je ukázána na obr. 9a-h. Znovu se ukazuje, že existuje významná homologie mezi oblastmi opičích imunoglobulinů a týmiž oblastmi lidskými (včetně sekvencí J oblastí). Tato vysoká homologie je podobná té, kterou mají lidské protilátky mezi sebou samými.

Metodologie, kterou byly určeny tyto sekvence je popsána níže na příkladech. Tyto přihlášky nejsou jedinými možnými způsoby využití vynálezu a stejných výsledků, monoklonálních a chimérických protilátek může být dosaženo podobnými procedurami dobře známými v současném stavu techniky. Viz US patenty 4 816 567; 4 978 745; 4 975 369; 4 816 397, supra. Např. pro klonování genů kódujícího opičí variabilní oblast je tento gen jednoduše spojen s genem kódujícím opičí nebo lidskou konstantní oblast a tyto spojené geny jsou přeneseny do produkční buněčné linie. Ta pak produkuje požadovanou protilátku. Níže jsou uvedeny příklady takových procedur. V následujících příkladech první krok zahrnuje izolaci veškeré RNA z buněk opičí krve nebo sleziny. B-buňky z imunizovaných opic mohou být získány buď z periferní krve nebo lymfatických uzlin a použity buď přímo a nebo lépe nejdříve namnoženy v dostatečném množství. K namnožení může být použito buď transformace herpes papiovirem, fúze s heterologní buňkou myelomu a následnou selekcí nebo klonováním jednotlivých B-buněk ve vysokém zředění v přítomnosti lidských T lymfocytů.

Reverzní transkriptázou je poté veškerá RNA konvertována na jednovláknovou ss cDNA za použití nespecifických primerů (oligo dT nebo náhodných hexamerů) nebo specifických (k imunoglobulin CH1 nebo CK nebo Clambda konstantní oblasti) oligonukleotidových primerů. Jednovláknová cDNA produkovaná touto reakcí je amplifikována pomocí polymerázové řetězcové reakce (PCR). Při této reakci se k amplifikaci genů pro těžký nebo lehký variabilní řetězec používá ss cDNA spolu s deoxynukleotidovými trifosfáty, DNA polymerázou (termostabilní polymerázou) a specifickými primery. Použité primery jsou jednovláknové syntetické oligonukleotidy o velikosti od 20 do 40 bází, které obsahují některé degenerované báze, které se vážou na 5'imunoglobulinovou vedoucí sekvenci. Pro amplifikaci genové rodiny variabilních oblastí opičího těžkého řetězce bylo vytvořeno 6 různých primerů, které se vážou na 5'vedoucí sekvenci (viz. obrázek 7.1.). Tyto primery obsahují místo pro restrikční enzym. (Sáli). Při tvorbě těchto primerů bylo využito podobnosti genových rodin pro lidské a opičí těžké variabilní řetězce. S každým ze šesti 5'primerů pro 5'vedoucí sekvenci byl použit 3'primer specifický pro oblast konstantní oblasti vhodného izotypu (IgG IgM, IgA nebo IgE). Tyto primery rovněž obsahovaly místo pro restrikční enzym (Nhe 1). Podobně tak pro opičí kappa a lambda lehké řetězce, další páry primerů byly pak použity pro amplifikaci vhodného lehkého řetězce variabilní oblasti (obr. 7.2.).

Pro inkorporování jiných, unikátních restrikčních míst mohou být použity jiné sety primerů. To pak umožňuje usměrněné klonování amplifíkované DNA ve vhodném expresním vektoru obsahujícím totéž restrikční místo. Na obr. 7.1. je popsán set primerů, vázající se na 3'vedoucí sekvence těžkého řetězce protilátky, který obsahuje místo pro Blul, a set primerů vázající se na prvních 23 bází úseku základní struktury variabilní oblasti a obsahující místo pro Xho 1. Geny pro opičí těžké a lehké variabilní řetězce imunoglobulinů mohou být klonovány do člunkového (shuttle) vektoru hned po PCR amplifikaci, což umožní další molekulární manipulace (jsou-li potřebné), nebo klonovány přímo do expresního vektoru, který obsahuje geny lidského těžkého

-9CZ 289472 B6 nebo lehkého konstantního řetězce. Molekulární konfigurace imunoglobulinových genů v expresním vektoru může být genomická. To znamená, že je přítomen promotor a zesilovač transkripce (enhancer) a další regulační oblasti, zrovna tak jako místa sestřihu donor/akceptorových sekvencí na intron/exonových přechodech. Popř. mohou být geny pro chimérický imunoglobulin vloženy do cDNA užívající heterologní virové promotorové a transkripci zesilující (enhancer) sekvence.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - sekvenování opičích protilátek

Obrázky 7. a 8. ukazují primery s, anebo bez restrikčního místa, použité pro PCR amplifikaci genů pro imunoglobuliny z lidské anebo opičí cDNA. Detaily použitých procedur jsou popsány níže. RNA byla izolována z buněk opičí sleziny, periferní krve a lymfatických uzlin za použití standardní guanidin izothioklyjanátové metody. Celá RNA frakce izolovaná touto metodou byla potom použita jako matrice pro následnou amplifikaci. Alikvotní množství RNA bylo inkubováno v přítomnosti 200 jednotek reverzní transkriptázy z viru Moloneovy myší leukémie a nespecifických příměrů (oligodT nebo náhodných hexamerů) nebo specifických (IgG CH1 oblasti nebo kappa řetězce konstantní oblasti CK) oligonukleotidových příměrů (500 lOOpmol). Tím byla generována nekódující jednovláknová cDNA ve směru transkripce, která byla poté amplifikována použitím polymerázové řetězcové reakce (PCR). Alikvotní množství jednovláknové cDNA bylo inkubováno spolu s deoxynukleotidovými trifosfáty (20uM), termostabilní DNA polymerázou (2-5 jednotek) a syntetickými oligonukleotidovými primery (50pmol). Tak byly amplifikovány geny pro těžké nebo lehké variabilní řetězce. Primery byly odvozeny pro lidské sekvence.

Obrázek 8 ukazuje páry primerů, které byly použity pro amplifikaci několika reprezentativních sekvencí pro těžké a lehké variabilní řetězce imunoglobulinů makaka jávského z několika genových rodin. Tyto amplifikované sekvence byly klonovány do EcoRV plazmidového vektoru p-Bluescript (PBS, vyrábí Stratagene, CA) a pak byly použity pro sekvenování DNA. K sekvenování bylo použito DNA plazmidu obsahujícího klonovaný inzert jako dvouvláknovou DNA matrici a standardní sekvenční metody terminace řetězců.

Reprezentativní sekvence pro opičí imunoglobuliny (Makak jávský) jsou ukázány na obrázcích 9A a 9H. Zároveň jsou na obrázcích 9A - 9H konvenční aminokyselinové sekvence pro geny lidských variabilních oblastí z každé hlavní genové rodiny. Je zde také vyznačena procentuální homologie každé opičí sekvence s lidskou konvenční sekvencí, vyjma konstantních CDR oblastí. Úroveň homologie pro lidskou a opičí sekvencí pro danou rodinu genů je stejně vysoká jako mezi dvěma lidskými sekvencemi téže genové rodiny. Je tudíž nemožné rozlišit lidskou variabilní oblast od oblasti pocházející z opice Starého světa pouhým srovnáním jejich sekvencí.

Izolace RNA:

Opičí B-lymfocyty specifické proti určitému antigenu byly získány několika způsoby: fúzí buněk z lymfatických uzlin imunizované opice a buněk lidské/myší heteromyelomatické buněčné linie K5H6/B5 a následným vyhledáním hybridomatické linie, virovou transformací B-buněk a nebo technikami klonování jednotlivých B-buněk in vitro. V posledně jmenovaném případě byl růst jednotlivých opičích B-buněk v kultuře in vitro podporován společnou kultivací s lidskými Tbuňkami, které byly stimulovány protilátkami. Do každé z 96 jamek, které jsou na jedné desce pro pěstování tkáňových kultur, byla umístěna jedna B-buňka spolu s přibližně 150 000 lidskými T-buňkami. Tyto byly stimulovány protilátkou proti antigenu CD3 a ošetřeny mytomycinem. Po 2 týdenní inkubaci se jedna B buňka rozmnožila na nejméně 200 diferencovaných plazmatických buněk. Supematant kultur z těchto jamek byl testován na přítomnost imunoglobulinu technikou ELISA, přičemž byly testovací desky nejprve pokryty kozími-anti-opičími protilátkami.

-10CZ 289472 B6

Buňky pocházející jak z antigen-specifických virově transformovaných buněk, tak i z hybridomů byly napěstovány v dostatečném množství pro extrakci RNA. Ty z jamek na deskách pro klonování jednotlivých B buněk, jejichž obsah byl pozitivní při testech na přítomnost imunoglobulinu, byly odděleny od ostatních, dvakrát promyty studeným fosfátovým pufrem o pH 7,5 a centrifugovány (1 000 x g 10 min). Promyté buňky byly suspendovány ve 100 μΐ lyzačního roztoku (4M guanidinium-izothiokyanát, 25mM citrát sodný pH 7,0 0,5 % sarkosín sodný, 0,1 M

2- merkaptoethanol). Pak bylo přidáno 10 μΐ 2M octanu sodného o pH 4,0 a celá směs byla míchána. Protein se vysrážel po přidání 1 000 μΐ vodou nasyceného fenolu, míchání a přilití 20 μΐ směsi chloroform/izoamylalkohol (49:1). Vzorky byly míchány na mixéru a inkubovány v ledu po dobu 15 min. Poté byly centrifugovány (10 000 x g, 20 min). Vodná fáze byla přenesena do nových kyvet, smíchána se stejným objemem izopropanolu a inkubována po 1 hod při -20 °C. Pak následovala další centrifugace (lOOOOxg, 15 min). Sraženina byla promyta 70% ethanolem, znovu centrifugována a pelety vysušeny lyofilizací (Speedivac, Savant). Vysušená RNA byla pak opět rozpuštěna ve 100 μΐ lyzačního pufru. Pak bylo přidáno stejné množství izopropanolu (inkubace: při -20 °C, 1 hod). Sraženina byla zahuštěna centrifugací (10 000 x g, 15 min) a promyta 70% ethanolem. Pelety byly vysušeny lyofilizací (Speedivac, Savant) a skladovány při -20 °C v 70 % ethanolu do doby použití.

Syntéza jednovláknové cDNA:

Veškerá RNA získaná z buněk, které vznikly v jedné jamce byla rozpuštěna ve 32 μΐ redestilované vody, do které bylo přidáno 1 μΐ (50-100 pmol) primerů (buď náhodných hexamerů, oligo dt nebo 3 imunogobulin - specifických primerů) a 10 μΐ 5X revertázového pufru (0,25 tris HC1 pH 8,3, 0,325M KC1, 15 mM MgCh, 50 mM dithiothreitolu). Směs byla zahřáta na 50 °C na 5 min, po kterých byla 2 min umístěna do ledu. Pak byla směs opět rozehřátá a byl přidán 1 μΐ RNA-sinu (Promega), 5 μΐ deoxynukleotidových trifosfátů (5mM), a 1 μΐ (200 jednotek) reverzní transkriptázy z viru Moleneyovy myší leukémie (BRL). Směs byla inkubována po dobu 1,5 hod při 37 °C. Po ukončení reverzní transkripce byla směs jednovláknové cDNA a RNA extrahována směsí fenolu a chloroformu a pročištěna na 1 ml koloně G-25 SEPHADEX. Materiál, který prošel touto kolonou byl použit jako ss cDNA matrice pro amplifikaci pomocí PCR.

Amplifikace ss cDNA

3- 10 μΐ jednovláknové cDNA bylo smícháno s 10 μΐ 10X pufru pro PCR (500 mmol K.C1, 100 mmol tris HC1 pH 8,3; 15 mmol MG Cl 2), 1,6 μΐ roztoku deoxynkleotidových trifosfátů (1,25 mmol), 50 pmol specifického 5'primeru proimunoglobulin, 50 pmol specifického 3'primerů pro imunoglobulin, a 2-5 oblastmi termostabilní DNA polymerázy (Syntetic Genetics). Reakční objem byl doplněn 10 μΐ vodou a převrstven 100 μΐ minerálního oleje. Reakční směs byla inkubována za následujících teplot po určenou dobu: 94 °C - 1 min.

°C - 2 min.

°C - 2 min.

Tento cyklus byl opakován 30-35x. Amplifíkovaný produkt byl testován elektroforézou na agarózovém gelu (1,2% agarózový gel) a jeho molámí hmotnost určena za použití standardů molekulových vah. Amplifikované geny pro variabilní oblast putovaly přibližně stejné jako markéry o délce 350-500 bp. Takto amplifikované geny byly použity pro klonování ve vhodném plazmidovém vektoru.

-11CZ 289472 B6

Příklad 2: Klonování genů opičích protilátek.

Protože sekvence genů pro opičí variabilní oblast jsou na úrovni cDNA nerozeznatelné od lidských genů téže genové rodiny, imunitní odpověď na lidsko/opičí chimérické protilátky je stejná jako odpověď proti lidským protilátkám (je-li vůbec nějaká).

Technologie PCR může být použito k zavedení specifických míst pro restrikční enzymy (mimo jiné Sáli, BglII, ApnI a Nhel), do sekvencí variabilních oblastí opic Starého světa. Při této reakci je použito vhodných primerů viz obr. 6. Pomocí takovýchto primerů byla do již dříve existujících klonovaných genů zavedena požadovaná restrikční místa. Tyto geny pak byly amplifikovány ze svých specifických vektorů. Po případě bylo těchto vektorů použito přímo k amplifikaci buněčné RNA.

Byly zkonstruovány expresivní vektory dvou typů. První (viz obr. 3a 4) umožňují klonování cDNA pro variabilní oblasti opičích imunoglobulinů, které jsou pomocí unikátního restrikčního místa vloženy do kazetového vektoru. V tomto vektoru jsou jednotlivé imunoglobulinové geny uspořádány v genomické konfiguraci. Tento typ vektoru obsahuje promotor imunoglobulinu, 2 exony vytvářející vedoucí sekvenci imunoglobulinu, 2 restrikční místa Spěl a Mhel, donorové sekvence pro sestřih ve směru transkripce, zesilovač transkripce imunoglobulinu, gen konstantní lidské oblasti (těžký nebo lehký řetězec) a signály pro polyadenylaci ve směru transkripce. Navíc obsahují bakteriální replikační začátek, gen pro betalaktamázu, užitečnou kvůli bakteriální selekci a gen pro neomycin fosfotransferázu pro selekci G418, nebo gen pro xantin-guanin fosforibozyl transferázu (Gpt) pro selekci kyselinou mykofenolovou v savčích buňkách. Expresní vektory pro těžký a lehký řetězec používají gen pro neomycin fosfotransferázu (Neo) a xantinguanin fosforibozyl transferázu (Gpt), které byly použity jako selektivní markéry.

Druhý typ expresivních systémů (viz obr. 5 a 6) užívá genů pro imunoglobuliny v cDNA konfiguraci. To znamená, že mezi 5'vedoucí sekvencí a 3'sekvencí konstantní oblasti se nenacházejí žádné introny nebo místa sestřihu. Tento typ vektorů používá heterologní virové promotory a zesilovače transkripce (enhancery) které řídí geny pro těžký a lehký řetězec imunoglobulinů (v tandemovém uspořádání) polyadenylační sekvence a selektivní markary pro savčí buňky (Neo). Translace genů Neo může být zeslabena změnou kodómu, který leží vedle startovního místa proti směru transkripce, z ACC na TCT. Navíc obsahují gen pro dihydrofolát reduktázu, která usnadní amplifikaci genu v přítomnosti methotrexátu. Geny pro variabilní oblast opičích imunoglobulinů, které měly být klonovány do expresních vektorů v konfiguraci cDNA byly amplifikovány buď zjiž existujících sekvencí klonovaných ve člunkovém vektoru (PBS), nebo přímo z RNA. Při klonování z RNA bylo použito primerů obsahujících buď restrikční místa Sáli nebo Mlul a Nhel pro těžký řetězec, nebo BglII a Kpnl nebo PsiWI pro kappa nebo lambda lehké řetězce. Potenciální použití dalších unikátních restrikčních míst není vyloučeno.

Chimérické geny pro těžké a lehké řetězce byly vloženy elektroporační technikou jeden po druhém (pro genomické konstrukce), nebo v jednom vektoru (konstrukce konfigurované jako cDNA), do produkční buněčné linie. Elektroporéza byla použita pro vložení lineárních DNA konstrukcí buď do vaječných buněk čínských křečků (CHO chinese hamster ovary) nebo buněk myšího myelomu. Pak následovalo klonování jednotlivých transfikovaných buněk na 96 jamkových deskách pro pěstování tkáňových kultur. Elektroporace a elektroporačním zařízení BTX-100 (BTX, San Diego) v jednomililitrových plastikových kyvetách probíhala za takových podmínek, aby bylo dosaženo optimálního počtu transfikovaných buněk za daného množství DNA vektorů. V konstrukcích, které obsahovaly virové regulační prvky, bylo použito CHO buněk, které byly adaptovány pro růst v suspenzi v sérum-prostém médiu (CHO-s SFM II minus hypoxantin a thymidin, Gibco).

-12CZ 289472 B6

Klonování genu variabilní oblasti Ig

Produkty PCR byly extrahovány směsí fenolu a chloroformu a pak pročištěny na 1 ml koloně SEPHADEX G-25. V případě, že pro klonování do plazmidu bylo zapotřebí DNA fragmentů se zarovnanými konci, bylo složení směsi pro PCR následující. 1 μΐ jednomolámího MgCl₂, po 0,5 μΐ l,25mM roztoků deoxynukleotid trifosfátů a 1 μΐ DNA polymerázy podle Klenowa (5 jednotek) bylo doplněno na celkový objem 100 μΐ pro PCR reakci. Tato směs byla inkubována při 37 °C po dobu 15 min, aby se zaplnily všechny 5'přečnívající konce. Před klonováním do vektoru se zarovnanými konci (blunt end cloning) byly 5'konce fosforylovány. K reakční směsi bylo přidáno 5 μΐ 10 mmol ATP, 1 μΐ T4 fágové polynukleotid kinázy (10 jednotek), a celá směs pak byla inkubována při 37 °C po dobu 30 min. Amplifikované fragmenty s integrovanými restrikčními místy byly nejdříve nastříhány vhodným restrikčním enzymem a pak přímo zapojeny do plazmidu bez další fosforylace. V obou případech byly fragmenty určené ke klonování extrahovány směsí fenolu a chlorofomu před přenesením do vhodného vektoru.

Při vlastní ligační reakci bylo 10% fosforylovaných nebo restrikčními enzymy nastříhaných fragmentů smíšeno s přibližně 2 ng vhodného vektoru (celkový objem 8 μΐ), který byl předtím rozštěpen restrikčním enzymem (enzymy). Pro klonování se zarovnanými konci byl použit plazmid p-Bluescript, naštěpený enzymem EcoRV. Pro klonování s lepivými konci byl použit vektor TCAE 5.2 nebo 6.0, popřípadě pGenexH nebo pGenexL, který byl nastříhán vhodnými restrikčními enzymy. 1 μΐ 10X ligačního pufru (500 milimol tris HC1 pH 7,6,100 milimol MgCl₂, 10 milimol ATP, 10 milimol dithiothreitolu), a 1 μΐ T4 fágové DNA ligázy (1 jednotka) bylo přidáno k reakční směsi. Reakce se nechala probíhat při 14 °C přes noc. Tento materiál byl použit k transformaci buněk E. coli HB 101 za použití standardní kalciumchloridové metody. Selekce transformovaných bakterií proběhla při růstu na agarových deskách obsahujících LB médium a ampicilin. Potom byly vybrány jednotlivé kolonie a pěstovány přes noc na LB médium obsahujícím ampicilin. Plazmidová DNA byla extrahována za použití standardní metody alkalické lýzy buněk. Po restrikční analýze, která určila který z klonů obsahuje imunoglobulinové inzerty, byla DNA připravena k sekvenování.

Sekvenování klonovaných genu

Klonované geny pro variabilní oblast imunoglobulinu byly sekvenovány pomocí standardní metody terminace řetězců. Jako matrice pro sekvenování byl použit dvouvláknový DNA plazmid obsahující klonovaný inzert. Před sekvenováním byla dvouvláknová DNA chemicky denaturována. Při sekvenování byla použita T7 fágová DNA polymeráza „SEQUENASE“ (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), radioizotopově značené alfa-deoxy ATP, a primery následujících sekvencí: (5'CAGAGCTGGGTACGTCCTCA 3') a (5'GCCCCCAGAGGTGCTCTTGG 3') pro IgG variabilní oblast těžkého řetězce ve směrech 5'» 3' (respektive 3» 5”). Dále pak primery (5'CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3') a (5'GGCTTGAAGCTCCTCAGAGC 3') pro variabilní oblast lehkého řetězce imunoglobulinu lambda ve směru 5'>3' , respektive 3'>5'. Reakční produkty byly poté rozděleny elektroforézou na 6 % polyakrylamidovém gelu.

Výsledky sekvenování několika genů těžkého a lehkého variabilního řetězce imunoglobulinů opic Starého světa jsou zahrnuty na obrázcích 9a-9h. Klonování a sekvenování genů pro imunoglobuliny makakajávského ještě nebylo popsáno v literatuře. Tím méně se dá určit stupeň homologie mezi geny lidské a makakovy oblasti. Homologie mezi šimpanzím V-lambda a genem a jeho lidským genomickým protějškem byla popsána. Z výsledků plyne, že vykazuje pouhá 2 % rozdílnosti ve stavbě úseků základní struktury.

-13CZ 289472 B6

Transfekce a selekce

Geny pro těžký a lehký řetězec variabilní oblasti byly po sekvenování nakloňovány do vhodných expresních vektorů. Toto mohly být vektory zkonstruované s imunoglobulinovými regulačními prvky v genomické konfiguraci (viz obrázky 3-4) nebo s virovými regulačními prvky, ve kterých byla použita konfigurace cDNA (obrázky 5-6). Vhodná restrikční místa (Spěl a Nhel) mohou být vytvořena na primech pro PCR a to buď na primeru pro iniciační krok, nebo na zpětném primeru. Tyto primery slouží při amplifikaci imunoglobulinových genů ze kyvadlového vektoru, do kterého byly předtím klonovány. Po případě mohou být geny pro variabilní oblast klonovány do expresních vektorů přímo po PCR amplifikaci zRNA, to znamená, že mezikrok sčlunkovým vektorem není nezbytný.

Elektroporace

Elektroporace byla použita k současné, nebo v jednotlivých, po sobě následujících krocích, transfekci genomických struktur těžké a lehké podoblasti do buněk Sp2/O. Při konsekventní transfekci následovala hned po elektroporaci konstrukce chimérického lehkého řetězce, selekce v kyselině mykofenolové. Kultury supematantů jednotlivých klonů byly pěstovány na deskách o 96 jamkách. Tvorba lehkého řetězce byla testována antisérem proti lidskému lehkému konstantnímu řetězci. Pomocí techniky ELISA byl vybrán klon s nejsilnější expresí lehkého řetězce. Následná elektroporace transfektantů, obsahujících lehký řetězec s vektorem obsahujícím chimérickou lidsko-opičí konstrukci těžkého řetězce imunoglobulinu, umožňuje vybrat transfektant exprimující chimérickou protilátku požadované specificky a izotypu.

Konstrukce lehkého řetězce ve vektoru p-Genex-L (obrázky 3-4) byla elektroporaci přenesena do myší myelomatické buněčné linie Sp2/0 podle následujícího návodu. Buňky Sp2/0 o koncentraci 1x70⁷/1 ml v transfekčním pufru (272 mM sacharózy, 7 mM fosfátu sodného, pH 7,4, 1 mM MgCl₂) byly smíchány s 50 pg vektoru pGenex-L, ve kterém byl nakloňován gen pro lehký řetězec, a který byl předtím zlinearizován působením restrikčního enzymu PvuII. Buněčná suspenze byla umístěna do lml plastikové spektrofotometrické kyvety, ve které byly dvě 3,5 mm vzdálené, ploché elektrody. Pomocí transfekčního aparátu BTX-100 (BTX, inc.) byl buňkám dán impulz o trvání přibližně 500 mikrosekund (takový aby usmrtil přibližně 50 % buněk). Tato hodnota se ukázala vhodná pro transfekci při pokusech s buňkami v nepřítomnosti DNA. Při pokusech bylo rostoucí napětí nanášeného proti množství buněk, které přežily dalších 24 hodin. Napětí, které odpovídalo 50 % úmrtnosti bylo použito pro následné elektroporační experimenty. Při použití přístroje BTX-100 se ukázalo, že optimální hodnotou jsou pulzy trvající 200500 mikrosekund. Po pulzu se buňky nechaly vzpamatovat na ledu 15 minut a poté byly přeneseny do 96 jamkových desek pro tkáňové kultury. Pro pěstování bylo použito Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM-Dulbecco s modified Engle s medium), které obsahovalo 5 % hovězí fetální sérum a 10 % médium uzpůsobené pro Sp2/0 buňky. Buňky byly pěstovány při takové koncentraci, při které byl pozorován růst kolonií po selekci vhodnou drogou, přibližně v jedné až třech jamkách na jedné desce.

Tento parametr byl získán pro každý elektroporační experiment pěstováním různých koncentrací elektroporvaných buněk (1000-10 000 buněk na jednu jamku) a následným výběrem buněk, které obsahovaly plazmid. Jamky, ve kterých docházelo na desce k růstu buněk, byly spočítány po přibližně dvou až třech týdnech selekce. Pro další experimenty bylo použito takové koncentrace, která dala vzniknout jedné pozitivní jamce ze tří, které byly pozitivní při testech na přítomnost prvního plazmidu.

Přímo po elektroporaci byly buňky umístěny v médiu, které neobsahovalo selekční drogu. Čerstvé médium bylo přidáno dva dny po elektroporaci. Obsahovalo buď G418 nebo kyselinu mykofenolovou pro buňky, které vykazovaly neomycin-fosfortransferázovou respektive guanozil fosfo-transferázovou aktivitu. První týden byly buňky přikrmovány po dvou dnech a poté dvakrát za týden. Koncentrace použité drogy byla určena experimentem, při kterém byly buňky

-14CZ 289472 B6 inkubovány v přítomnosti vzrůstajících koncentrací drogy, a pak byly spočítány buňky, které přežily. Pro selekci byla použita dvakrát větší koncentrace drogy, než která dala 100 % úmrtnost. Pro buňky Sp2/0 bylo použito přibližně 1 pg kyseliny mykofenolové /ml a přibližně 800 pg/ml G418.

Elektroporéza buněk se prováděla několika způsoby.

Buď se genomické vektrory pro těžký a lehký řetězec (pGenex-H a pGenex-L) elektroporovaly současně a nebo se lehký řetězec elektroporoval zvlášť. Ve druhém případě se pomocí techniky ELISA vybíraly klony, které vykazovaly vysokou úroveň exprese chimérického lehkého řetězce imunoglobulinu. Tyto klony byly pak napěstovány a elektroporovány s vektorem, který obsahoval těžký řetězec. V případě, že se použilo cDNA tandemových genových konstrukcí, byl nejdříve zlinearizován expresní vektor (TCAE 5.2 nebo TCAE 6) naštěpením restriktázou Notl. Jednoduchá elektroporace byla dostatečná k dosažení integrace genů jak pro těžký tak lehký řetězec. Po dvou až třech týdnech byly supematanty zjamek, ve kterých pokračoval růst i v přítomnosti selekční drogy, testovány na sekreci chimérického lehkého řetězce nebo celého imunoglobulinu pomocí techniky ELISA. Geny imunoglobulinů v konfiguraci cDNA byly elektroporovány buď do buněk Sp2/0 tak jak bylo popsáno výše, nebo do vaječných buněk čínského křečka (CHO), které byly adaptovány pro růst v suspenzi v médiu bez séra. Při elektroporaci CHO buněk byl použit aparát BTX-600 a podmínky, při kteiých bylo dosaženo maximálního počtu G-418 rezistentních kolonií. Tyto podmínky byly následující: 210 voltů, 400 pF a 130 ohmů. Po elektroporaci byly buňky spočítány, promyty a resuspendovány v transfekčním pufru a umístěny na 15 minut do ledu. Koncentrace buněk byla upravena na lxlO⁷ živých /ml a 400 μΐ buněčné suspenze bylo umístěno do 0,4 mililitrových sterilních kyvet (BTX inc.). 25 pg DNA vektoru TCAE5.2 nebo TCAE6, který byl linearizován působením restriktázy Not I, a ve kterém byly nakloňovány geny pro variabilní oblast imuniglobulinu z makaka, bylo rozpuštěno v pufru TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) tak, aby výsledná koncentrace byla 1 pg/ml. Tato suspenze byla přidána k buněčné suspenzi. Elektroporace byla provedena vybitím přístroje pomocí tlačítka pro automatické ovládání náboje a pulzu. Kyveta byla dána na 15 minut do ledu, buňky suspendovány ve 120 mililitrech média bez séra a pak rozkapány na šest 96-ti jamkových desek (200 pl na jednu jamku, která tak obsahovala přibližně 6,667 elektroporovaných, nebo 3,333 buněk). Pro tuto buněčnou linii byly zavedeny nové elektroporační parametry a selekce látkou g418 probíhala při koncentraci 400 pg/ml.

Vyhledávání buněk produkujících protilátky

V sektretu transfektantů byla přítomnost lidských opičích nebo chimérických protilátek testována použitím techniky ELISA dle následujícího: desky o 96 jamkách s plochým dnem (Dynatech) byly pokryty kozími-lidskými IgG nebo kappa (200 nanogramů na jamku) v potahovacím pufru (uhličitan sodný 0,8 mg/ml, hydrogenuhličitan sodný 1,55 pg/ml, pH 9,6) a inkubovány nejméně na 16 hodin při 4 °C. Pak byl potahovací pufr odstraněn a jamky blokovány 120 pl blokovacího pufru (1 % hovězí sérový albumin (BSA) ve fosfátovém pufru, který obsahoval 0,2 % azidu sodného) blokování probíhalo 1 hodinu při teplotě 37 °C. K jamkám obsahujícím blokovací pufr bylo přidáno tolik supematantu buněčné kultury, aby výsledný objem činil 125 pl. Pak byly desky inkubovány 2 hodiny při teplotě 37 °C. Pak byly desky 5x promyty v PBS pufru. Poté bylo přidáno 100 pl kozí-anti-lidské IgG (nebo kappa) konjugovaného s křenovou peroxidázou a naředěné 1:1000-1:5000 v ředicím pufru (1 % BSA, 0,05 % Tween-20, 0,02 % azidu sodného v PBS). Desky byly inkubovány 1 hodinu při 37 °C a pak opět 5x promyty v PBS pufru. Chimérické protilátky byly detekovány 100 pl roztoku peroxidu vodíku a substrátu (3,3, 5,5 tetrametylbenzidin, 1:1 objemově) na jednu jamku. Barevná reakce byla ukončena po 2-5 minutách přidáním 100 pl dvoumolámí kyseliny sírové na jamku.

Odborníci mohou snadno provádět metodiky srovnatelné svýše popsanými. Případy takovéto technologie včetně imortalizace vybraných B-buněk hybridomatickou fúzí, tak jak bylo popsáno

-15CZ 289472 B6 výše. Tato fúze byla provedena s buněčnou linií K5H6/B5, popsanou Carrollem a kol., 164 J. Experimental Medicine 1566.1986, nebo se srovnatelnou buněčnou linií např. SPAZ4(Sandoz, viz Ehrlich a kol., 34 Clin. Chem. 1681, 1988). Podobné buněčné linie mohou být snadno konstruovány standardními technikami, za použití běžně publikovaných metodik. Popřípadě mohou být imunoglobulinové geny klonovány z: A) buněk imortalizovaných virovou transformací herpes papiovirem, viz Markova a kol., 30Vopr. Virusol 549, 1985, nebo se srovnatelným virem, B) klonováním jednotlivých B-buněk a přípravou přechodně nesmrtelných klonů, viz Amoroso a lidské 145 J.Immunology 3155, 1990, nebo C) užitím bakteriofágové knihovny rekombinantních protilátek, viz Huse a kol., 246 Science 1275, 1989 a McCafferty a kol., 348 Nátuře 552, 1990. Vyhledávání klonů obsahujících žádanou protilátku může být provedeno výše popsanými technikami nebo srovnatelnými technikami za současného stavu techniky dobře známými, a poté je gen požadovaného imunoglobulinu uvolněn z imortalizované buněčné linie. Navíc protilátky, které produkují izolované opičí B-buňky mohou být použity pro lidskou terapii bez další manipulace a tvorby chimérických protilátek.

Odborníkům jsou dobře známy standardní techniky jak získat lidskou konstantní oblast imunoglobulinu a pak ji spojit s opičí variabilní oblastí. Vlastní příklady užitečných chimérických protilátek proti specifickým buněčným povrchovým receptorům, které mohou být použity v lidské imunoterapii jsou tyto: CD4, ICAM, CD19, CD20, CD8, CD1 la, CD1 lb, CD28, CD18, CD45, CD71,aTRC.

Příklad 3: Klonování a exprese lidsko-opičích chimérických protilátek specifických proti CD4.

Následující text je typickým příkladem způsobů a protilátek, které jsou podstatou tohoto vynálezu.

Tvorba opičích nesmrtelných linií B-buněk

Dospělý jedinec makaka jávského (White Sands New Mexico Primáte Center) byl imunizován intramuskulámě, na několika místech (injekcemi 150-300 pg rozpustných CD4 receptorů (sCD4) nebo buněčnými membránami (lxlO⁸buněk) zCD4 pozitivních buněčných linií supTl rozpuštěných ve standardním adjuvans. Imunizace se opakovala každé 2-3 týdny celkem 6x. Amplituda imunitní reakce byla zvednuta injekcí 100 pg sCD4 do oblasti třísel. O týden později byla z téhož stehna chirurgicky odstraněna lymfatická uzlina a z ní pak vysáta lmfa. Lymfocyty byly izolovány tak, že byla lymfatická uzlina nejdříve nakrájena a pak vypláchnuta sterilním DMEM médiem. Buněčná suspenze byla filtrována přes nylonovou gázu a pak centrifugována při 1000 x g po dobu 10 minut.

Přibližně 1 x 10⁸ lymfocytů bylo suspendováno v Tris -NH4CI pufru (16ml pH 7,5) a zahřáto na 5 minut na 37 °C tak, aby došlo k lýze erytrocytů. Lymfocyty byly odstraněny centrifugací a znovu suspendovány v L-leucin-metylesteru (LME) a inkubovány po dobu 45 minut při 37 °C. Pak byly buňky zfiltrovány znovu přes nylonové sítko a centrifugovány. Pak byl přidán 1 mililitr fetálního telecího séra, buňky suspendovány a 2 krát promyty v RPMI bez séra. Pak byly buňky spočítány a smíchány v jedné 50 mililitrové kónické centrifugační kyvetě, spolu se stejným počtem heteromyelomových buněk K6H6/B5, které byly rovněž 2krát promyty v sérum-prostém médiu. Pak byly buňky jemně suspendovány v 1 mililitru 50 % PEG (polyethylen glykol), který byl přidáván pomalu, za jemného míchání po dobu jedné minuty. Během dalších pěti minut bylo k buňkám, za jemného míchání, přidáno 20 ml sérum-prostého média, tak aby se naředil PEG. Po dvojnásobném promytí médiem bez séra byly buňky suspendovány a naředěny na koncentraci 5xl0⁵na 0,1 militru v médiu RPMI, které obsahovalo 20% fetálního telecího séra a gentamycinu. Pak byly umístěny do 96 jamkových desek pro pěstování mikrotkáňových kultur a to 0,1 ml suspenze na jamku. Pak byl přidán do každé jamky stejný objem (0,1 mililitru) média HAT a hybridu bylo umožněn na 14-17 dní růst před další selekcí.

-16CZ 289472 B6

Vyhledávání zfázovaných buněčných hybridů, které produkují anti CD4 protilátky AntiCD4 specifita byla testována následujícím způsobem: ELISA desky byly potaženy rekombinantní sCD4 o koncentraci 100 ng na jamku a blokovány 1 % hovězím sérovým albuminem vPBS. Z každé jamky na desce tkáňových kultur bylo odebráno 50 μΐ hybridního supematantu a ten byl po dobu 60 minut inkubován v deskách potažených sCD4. Vazba byla detekována další inkubací s kozími-anti-lidskými nebo kozími-anti-opičími imunoglobuliny značenými ^I25I po dobu 60 minut. Po čtyřnásobném promytí destilovanou vodou bylo záření jamek změřeno na gamapočítači. Pozitivní jamky byly znovu otestovány a hybridní buňky z těchto buněk byly třikrát klonovány. Poprvé pět buněk na jamku, a pak dvakrát jedna buňka na jamku. V této fázi byly buňky anti-CD4 pozitivní dále vybírány podle své schopnosti vázat se na buněčný povrch s receptory CD4. Tento výběr byl prováděn kompetitivní inhibici vazby s anti-CD4 myší monoklonální protilátkou (nazývaná 1F3) proti CD4 pozitivní buněčné linii supTl. Tyto testy byly prováděny společnou inkubací různých opičí-anti CD4 a 10 ng ¹²⁵I značené 1F3 spolu s 3x 10⁵subTl buňkami v jedné jamce z 96 na jedné desce. Po jedné hodině inkubace při pokojové teplotě (asi 20-25 °C) byly buňky vakuově přesáty na filtr ze skelných vláken. Po extenzivním promytí PBS pufrem byly filtry změřeny na gamapočítači, z čehož byla určena inhibice vazby protilátek 1F3 na subTl buňky, způsobená supematanty opičích hybridů.

Byly vybírány takové klony, které produkovaly protilátky vykazující silnou inhibici myších 1F3 protilátek. Izotyp klonu, který jsme vybrali jsme určili pomocí lidských izotopových zkoumadel. Zjistili jsme, že jde o IgG2, obsahující lehký řetězec lambda. Tato buněčná linie byla pak napěstována v dostatečném počtu pro klonování svých imunoglobulinových genů.

Klonování genu pro těžký a lehký řetězec variabilní oblasti z opičích imortalizovaných b-buněk

Z 1 x 10⁷ opičích imortalizovaných B-buněk byla izolována veškerá RNA pomocí guanidinizothiokyanátové metody, popsané výše. 1/10 z celkové RNA byla použita k vytvoření jednovláknové cDNA, za pomoci oligo-dT primerů a reverzní transkriptázy (rovněž popsáno výše). 1/10 z celkové ss cDNA byla amplifikována v PCR reakcích. Ke každé ze šesti PCR reakcí bylo potřeba jednoho ze šesti oligonukleotidových primerů, specifických pro 5'Vh genovou rodinu. Tyto primery obsahovaly místo pro restriktázu Sáli, zatímco zároveň použité oligonukleotidové primery pro IgG 3 'konstantní oblast obsahovaly místo pro restriktázu Nhe I viz. obr. 7.1. Podobně 5 dalších PCR reakcí používalo jeden z pěti oligonukleotidových primerů pro 5' lambda vedoucí sekvenci obsahující místo pro Bgl II spolu s 3'primerem pro konstantní oblast, obsahujícím místo pro Avr II.

Reakční podmínky byly stejné, jak je uvedeno výše. Každá PCR reakce byla provedena ve třech paralelních stanoveních. Produkty každé amplifikační reakce lehkého a těžkého řetězce byly rozděleny elektroforézou na 1,2 % agarózovém gelu. Primer těžkého řetězce VH4 (SEK. ID. C.: 13: 5'ACTAAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT3') a lambda primer (SEK. ID. Č.: 14: 5'ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3 ) poskytly výrazné proužky při elektroforéze na agarózovém gelu. Produkty těchto reakcí byly použity pro klonování do vektoru TCAE 6, kteiý obsahuje sekvence konstantních oblastí, jak lidského IgGl, tak lidského lehkého řetězce typu lambda.

Klonování dvou genů kódujících variabilní oblasti do expresního vektoru TCAE 6 bylo provedeno následovně. Nejprve byly produkt PCR reakce těžkého řetězce a vektor TCAE 6 rozpuštěny společně s restrikčními enzymy Sal I a Nhe I. Vzniklé štěpy byly extrahovány směsí fenol/chloroform a přečištěny na sloupci SEPHADEXu G-25. Produkt PCR reakce byl ligován spolu se štěpem vektoru přes noc za přítomnosti T4 ligázy. Ligováno bylo přibližně 500 ng DNA v objemu 10 μΐ, přičemž molámí poměr inzert/vektor byl 10:1. Ligovaný materiál byl použit pro transformaci XL-1 Blue kompetentních buněk (Stratagene) a transformované buňky byly vysety na LB agarové plotny obsahující 50 pg/ml ampicilinu. Kolonie bakterií rezistentních a ampicilinu byly posbírány a pěstovány jako minikultury v 5 ml média. Z každé z těchto minikultur byla plazmidová DNA extrahována standardní alkalickou lyží, rozštěpena pomocí restrikčních

-17CZ 289472 B6 enzymů Sal I a Nhe I a štěpy byly rozděleny elektroforézou na 1,2 % agarózovém gelu. Plazmidy s inzerty o velikosti přibližně 450 bp byly použity jako templáty pro následné klonování variabilních oblasti lehkého řetězce. Produkty PCR reakce lehkého řetězce jakož i plazmid obsahující inzert těžkého řetězce byly rozštěpeny za pomoci restrikčních enzymů Bgl II a Avr II a spojeny pomocí ligázy. Plazmidové minikultury byly roztříděny štěpením restrikčními enzymy Bgl II a Avr II. Štěpy poskytující inzerty o velikosti přibližně 400-450 bp byly použity pro další práci. Plazmidy, obsahující jak Sal Ι/Nhe I, tak Bgl II/Avr II inzerty, byly vypěstovány ve větším množství za účelem sekvencování DNA. Expresní vektory TCAE 5.2 a TCAE 6 tandemové chimérické protilátky byly odvozeny z vektoru CLDN, který sám o sobě je odvozen od vektoru RLDNIOb (253 Science 77-79, 1991). Vektor RLDNIOb je odvozen od expresního vektoru TND (7 DNA 651-661,1988).

Vektor RLDNIOb se liší od vektoru TND následujícími způsoby. Transkripční kazeta (promotor, cDNA, polyadenylační signál) kódující reduktázu kyseliny dihydrolistové (DHFR) byla umístěny mezi kazetu pro aktivátor tkáňového plazminogenu (t-PA expresivní kazeta) a kazetu pro neomycinfosfotransferázu (NEO) tak, že všechny tři kazety jsou umístěny tandemově ve stejné transkripční orientaci. Dále ve vektoru CLDN byl promotor genu kódujícího DHNR nahrazen hlavním myším betaglobinovým promotorem (3 Mol. Cell Biol. 1246-54, 1983) a t-PA cDNA byla nahrazena spojovníkem (polylinker). Všechny tři eukaryotické transkripční kazety (t-PA, DHFR, NEO) mohou být separovány z bakteriální plazmidové DNA (pUC9 derivát) rozštěpením restrikční endonukleázou Notl.

CLDN se liší od RLDNIOb, protože Rousův LTR před spojovníkem byl nahrazen zesilovačem transkripce promotoru raného genu lidského cytomegaloviru (41 Cell, 521, 1985). Expresní vektory TCAE 5.2 a TCAE 6 se liší od CLDN tím, že:

1. Obsahují 4 transkripční kazety (na místo tří) v tandemovém pořadí:

a) Konstantní oblast lehkého řetězce lidského imunoglobulinu odvozenou přes amplifikaci cDNA pomocí PCR reakce. Ve vektoru TCAE 5.2 se jedná o konstantní oblast lehkého řetězce typu kappa lidského imunoglobulinu (aminokyseliny č. 108-214-číslování podle Kabáta, alotyp Km3), a ve vektoru TCAE 6 se jedná o konstantní oblast lehkého řetězce typu lambda lidského imunoglobulinu (aminokyseliny č. 108-215-číslování podle Kabáta, genotyp Oz minus, Mcg minus, alotyp Ke minus).

b) Konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu; v obou konstruktech se jednalo o konstantní oblast těžkého řetězce typu gama 1 lidského imunoglobulinu (aminokyseliny č. 114 — 478 - číslování podle Kabáta, alotyp Gmla, Gmlz), který byl odvozen přes amplifikaci cDNA pomocí PCR reakce.

c) DHFR; obsahující svůj vlastní eukarytický promotor a polyadenylační signál.

d) NEO; rovněž obsahující svůj vlastní eukarytický promotor a polyadenylační signál.

3. Kazety kódující lehký řetězec lidského imunoglobulinu obsahující uměle připravenou signální sekvenci pro sekreci imunoglobulinových řetězců.

4. Kazety kódující lehký a těžký řetězec lidského imunoglobulinu obsahující specifický DNA spojovník, který umožňuje inzerci variabilních oblastí lehkého a těžkého imunoglobulinového řetězce a nemění aminokyseliny normálně nalézané v imunoglobulinových řetězcích. Začlenění výše uvedených změn vedlo k vytvoření vektorů TCAE 5.2 a TCAE 6. Klonování genů kódujících variabilní oblasti lehkého a těžkého imunoglobulinového řetězce získaných z antiCD4 heterohybridomatické buněčné linie E9.1, do vektoru TCAE 6 vedlo ke konstruktu, který je uložen v ATCC. Konstrukt, který byl uložen, obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce imuniglobulinu makaka jávského (cynomolgus) a variabilní oblast lehkého řetězce imuno

-18CZ 289472 B6 globulinu makakhjávského získané klonováním zanti-CD4 hybridomatické buněčné linie E9.1. Jejich sekvence jsou zobrazeny na obr. 13 a 14. Konstantní oblast těžkého řetězce je lidského původu a jedná se o izotyp Gmla a Gmlz. Konstantní oblast lehkého řetězce typu lambda je rovněž lidského původu a jedná se genotyp Oz minus, mcg minus a alotyp Ke minus. Geny kódující imunoglobulin jsou klonovány do savčího expresního vektoru TCAE 6 zobrazeného na obrázku 6. Když byl vektor TCAE 6 elektroporován do savčí buněčné linie CHO, tato produkovala opičí/lidskou antiCD4 chimérickou protilátku. DNA konstrukt popsaný na tomto místě byl použit pro transformaci bakteriálního kmene XL-1 Blue, vyselektovaného pomocí ampicilinu a uchovávaného ve formě bakteriální buněčné suspenze ve sterilním LB médiu obsahujícím 15 % glycerol.

Další užitečný expresní systém je ten, v němž gen kódující selektivní signální sekvenci je modifikován tak, aby bylo umožněno zvýšení výtěžku rekombinantního systému kódujícího požadovanou sekvenci. Například zeslabení iniciace transkripce dominantní vybrané signální sekvence má sice za následek menší počet kolonií rezistentních kdané látce ve srovnání s nepoškozeným vektorem, ale každá kolonie produkuje podstatně vetší množství požadovaného produktu, než je tomu u nepoškozeného vektoru. Například iniciace translace je prvním krokem v proteosyntéze. Místo iniciace translace genu kódujícího neomycinfosfotransferázu (G418 rezistentní gen) bylo změněno z konvenční Kozákovy sekvence ccAccATGG) na zřídka se vyskytující (vzácnou) Kozákovou sekvenci (sekvence ccTccATGC). Zeslabení iniciace translace u G418 rezistentního genu mělo za následek:

1. Významné (5-ti násobné) snížení počtu G418 rezistentních kolonií získaných ze stejného množství plazmidové DNA transfikované do jedné buňky a

2. výrazné zvýšení množství produktu genu exprimovaného v každém klonu. V klonech obsahujících konvenční Kozákovu sekvenci, 73% kolonií produkovalo méně než 25 ng/ml a jenom 3 % produkovaly více než 100 ng/ml. V klonech, v nichž byla konvenční Kozákova sekvence nahrazena zřídka se vyskytující Kozákovou sekvenci 8 % celkového množství kolonií produkovalo méně než 25 ng/ml ve srovnání s 63 % kolonií, které produkovaly více než 100 ng/ml. Přesně, viz obr. 16 (kde TCAE 5.2 obsahuje konvenční Kozákovu sekvenci a TCAE 12 obsahuje zřídka se vyskytující Kozákovu sekvenci). 258 bakteriálních kolonií bylo odvozeno 2 po sobě jdoucími elektroporacemi 25 pg DNA, která obsahovala gen pro neomycinfosfotransferázu s konvenčním (nezměněným) místem počátku translace. 201 z těchto kolonií (78 %) nevyprodukovalo žádný detekovatelný produkt (to znamená, méně než 25 ng/ml chimérického imunoglobulinu) a jenom 8 kolonií (3%) vyprodukovalo více než 100 ng/ml produktu. 98 kolonií bylo odvozeno 6 po sobě jsoucími elektroporacemi 25 pg DNA, která obsahuje gen pro neomycinfosfotransferázu s pozměněným místem iniciace translace. 63 % těchto kolonií produkovalo více než 100 ng/ml produktu a jenom 8 % těchto kolonií produkovalo méně než 25 ng/ml.

Sekvenování DNA

Plazmidová DNA byla získána ze 100 ml kultur. Tato byla dále prurifikována směsí 2,5 molámího chloridu sodného (1 díl) a 20 % polyethylenglykolu (6 dílů) při 0 °C po dobu 15 minut. Po centrifugaci při 10 000 g po dobu 20 minut byla peleta promyta 70% ethanolem, znova centrifigována a vysušena v Speedivac (Savant). Peleta byla resuspendována v deionizované vodě na výslednou koncentraci 150 až 250 pg/ml. Sekvencováno bylo 5 pg dvouvláknové DNA za použití techniky podle Sangera. Byly použity primeiy homologní k sekvencím uvnitř expresního vektoru. Tyto sekvence jsou umístěny po nebo proti směru transkripce inzertu lehkého nebo těžkého řetězce. Inzerty byly sekvencovány jak ve směru 5'»3' tak ve směru 3'-» 5'. Dva klony anti-CD4 lehkého řetězce a dva klony anti-CD4 těžkého řetězce z nichž každý byl vytvořen pomocí samostatného PCR reakce, byly paralelně sekvencovány za účelem zjištění, zdali v průběhu PCR reakce nedošlo k záměně pořadí nukleotidů. U obou zkoumaných těžkých řetězců i u obou klonů lehkých řetězců bylo nalezeno

-19CZ 289472 B6 identické pořadí nukleotidů v celé jejich délce. Tím bylo potvrzeno, že během amplifikačního procesu nedošlo k žádným chybám. Sekvence anti-CD4 těžkého a lehkého řetězce jsou ukázány na obrázcích 13 a 14 a na Seznamu sekvencí č.: 15 a 16.

Exprese opičího/lidského chimérického anti-CD4

Expresní vektory TCAE 5.2 a TCAE 6 mohou být použity nejenom pro své stabilní začlenění do buněčných linií Sp2/0 a CHO, ale také, jelikož obsahují SV40 origin, mohou být přechodně exprimovány v buněčné linii COS. Exprese COS buněk byla provedena následovně: COS buňky byly vysety jeden den před transformací tak, aby bylo jejich dělení z 50 % - 70 % následující den synchronní. Kultivační médium bylo odstraněno a buňky byly dvakrát promyty transfekčním pufrem (TB-140 mM NaCl, 25 mM Tris, 5 mM KC1, 0,5 mM Na₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂). 30 pg plazmidu TCAE 6 (přečištěného centrifugací v gradientu CsCI) obsahujícího anti-CD4 opičí/lidské chimérické lehké a těžké řetězce bylo smícháno se 3 ml DEAE dextranu na jednu misku (1 mg/ml v TB).

DNA byla inkubována s buňkami po dobu 1 hodiny při 37 °C. Po ukončení inkubace byl roztok DNA odstraněn a nahrazen 3 mí 20 % glycerolu na dobu 1,5 až 2,5 minut a poté byly buňky dvakrát promyty TB. Buňky byly inkubovány v 5 ml čerstvého média obsahujícího 100 μΜ chloroquinu (7-chloro-4(-4-diethylamino-l-methylbutylamino)chinolin) po dobu 3-5 hodin při 37 °C. Poté byly dvakrát promyty médiem a inkubovány ve standardním DMEM po dobu 72 hodin. V supematantu z transfikovaných COS buněk byla při různých zředěních zjišťována přítomnost protilátky pomocí ELISA. Kozí protilátka proti lidskému lehkému řetězci typu lambda byla naadsorbována na povrch 96 reakčních jamek a jako detekující protilátka byl použit peroxidázou značený kozí anti-lidský IgG. Reakce byla provedena za standardních ELISA podmínek. Bylo zjištěno, že COS buňky produkují opičí/lidskou chimérickou protilátku v množství 10-40 ng/ml. Větší objem supematantu byl desetkrát zahuštěn a použit při testech RIA s přímou vazbou na desku. Při těchto testech protilátky interagovaly s CD4 pozitivními supTl buňkami. Dále opičí anti-CD4 a opičí/lidské anti-CD4 byly použity k inhibici vazby vysoce afinitní myší anti-CD4 (1F3) protilátky (obr. 12). Bylo zjištěno, že opičí/lidská rekombinantní protilátka (ATCC No. 69030) se váže nejenom k CD4 pozitivním buňkám, ale je rovněž schopna inhibovat vazbu 1F3 k buňkám obsahujícím CD4 v koncentracích přibližně rovných koncentracím 1F3 nebo koncentracím opičí protilátky.

Dále uvádíme příklad postupu a využití protilátek.

Příklad 4: Tvorba opičích protilátek proti lidským antigenům získaným z lymfocytů.

Dospělý makak jávský (White Sands New Mexico Primáte Center) byl imunizován intramuskulámě na několik místech lidskými lymfocyty obsahujícími CD54 v celkovém množství 5.10⁸ buněk. Buňky použité pro imunizaci byly střídavě SB buňky (lidská B lymfoidní linie) a aktivované lidské lymfocyty získané z periferního krevního oběhu. Aktivace byla provedena směsí mitogenu (pokeweed) (2,5 mg/ml), prohobol-monoacetátu (40 nM) a fytohemaglutininu (4 mg na jamku). Imunizace byla opakována každé 2 až 3 týdny po dobu 8 měsíců. Titr protilátek byl v séru imunizovaných zvířat zjišťován několikrát metodou inhibice vazby myší protilátky (84H10), která se váže na ICAM-1. Saturační množství 84H10 bylo navázáno na buňky získané zvaječníku čínského křečka (CHO), které byly již předtím transfíkovány expresním vektorem obsahujícím lidskou C54 cDNA, a které byly vybrány pero svou vysokou míru exprese receptoru CD54 umístěného na povrchu buněk, spolu s opičím sérem v klesající koncentraci. Inhibice vazby 84H10 je ukázána na obr. 15.

Další myší monoklonální protilátky specificky rozpoznávající antigeny lidských lymfocytů byly testovány zmíněnou inhibiční metodou za použití opičího séra získaného imunizačními postupy uvedenými výše.

-20CZ 289472 B6

Průmyslové využití

Protilátky produkované způsobem uvedeným výše nebo ekvivalentními technikami mohou být čištěny kombinací afmitní a molekulové vylučovací chromatografie za účelem zjištění jejich biologických charakteristik. Tato stanovení zahrnují určení specificity a vazebné afinity, jakož i efektorové funkce, která má souvislost s daným izotypem, např. ADCC, nebo komplementární vazby. Takové protilátky mohou být použity buď jako pasivní nebo jako aktivní terapeutická agens velkému počtu lidských nemocí včetně lymfomů B-buněk, infekčních nemocí včetně AIDS, autoimunitních a zánětlivých nemocí a u transplantací. Protilátky mohou být použity buď ve své nativní formě, nebo jako součást komplexů protilátka/chelát, protilátka/lék nebo protilátka/toxin. Dále neporušené protilátky nebo jejich fragmenty (Fab₂, Fab, Fv) mohou být použity jako diagnostické reagencie nebo jako potenciální vakcíny nebo imunogeny v aktivní imunoterapii pro vyvolání tvorby antiidiotypických odpovědí.

Množství protilátky, které je terapeuticky účinné, může být zjištěno pomocí standardních technik, které jsou odborníkům velmi dobře známy, Protilátky budou obecně připravovány standardními technikami ve farmaceuticky přijatelném pufru a mohou být podávány jakýmkoli způsobem. Vzhledem k účinnosti výše zmíněných protilátek a vzhledem k toleranci lidského organismu vůči těmto protilátkám, je možné podávat tyto protilátky opakovaně za účelem léčby různých nemocí nebo patologických stavů člověka.

Anti-CD4 rekombinantní protilátky (nebo jejich fragmenty) podle tohoto vynálezu jsou rovněž použitelné pro indukci imunosuprese, tzn. indukci suprese lidského nebo zvířecího imunitního systému. Tento vynález má proto vztah k postupům proíylakticky nebo terapeuticky indukované imunosuprese v organismu člověka nebo ve zvířecím organismu, u kteiých je tato imunosuprese žádoucí. Imunosuprese se dosáhne podáním účinného, netoxického množství takové protilátky z tohoto vynálezu člověku nebo zvířeti.

Schopnost sloučenin podle tohoto vynálezu indukovat imunosupresi může být prokázána standardními testy používanými za tímto účelem, např. testem smíšené reakce lymfocitů nebo testem měřícím inhibici proliferace T-buněk sledováním příjmu thymidinu.

Skutečnost, že protilátky podle tohoto vynálezu jsou použitelné pro indukci imunosuprese znamená, že tyto protilátky jsou použitelné k léčbě nebo k prevenci rezistence k odmítnutí transplantovaných orgánů nebo tkání (např. ledvin, srdce, plic, kostní dřeně, kůže, rohovky atd.); k léčbě nebo k prevenci autoimunitních, zánětlivých, proliferativních a hyperproliferativních nemocí a k léčbě nebo prevenci kožních projevů imunologicky léčených nemocí (např. revmatická artritida, lupus eiythematodes, Hashimotova tyreoiditida, roztroušená skleróza, myasthenia gravis, diabetes typu 1, uveitida, nefrotický syndrom, lupénka, atopická dermatitida, kontaktní dermatitida, lišej plochý, Pemplugus, bulózní pemfigus, Epidermolysis bullosa, kopřivka, angioedemas vasculitides, erytem, kožní eozynofilie, Alopecia areata atd.); léčbě vratných obstruktivních nemocí cest dýchacích, střevních zánětů a alergií (např. celiakie, proktidida, eosinophylia gastroenteritis, mastocytosys, Crohnova nemoc, vředovitá kolitida) a alergií majících souvislost s příjmem potravy (např. migréna, rinititida a ekzém).

Použitím běžných experimentů by odborník byl schopen určit, jaké je účinné a zároveň netoxické množství protilátky potřebné k indukci imunosuprese. Nicméně všeobecně účinné množství se bude pohybovat v rozmezí od 0,05 do 100 mg protilátky na kilogram živé váhy za den.

Protilátky (nebo jejich fragmenty) podle tohoto vynálezu by rovněž měly být použitelné k léčbě nádorů v organismu savců. Přesněji, měly by být použitelné pro zmenšení velikosti nádoru, zabránění dalšímu růstu nádoru a/nebo prodloužení života zvířat postižených rakovinou. Tudíž tento vynález má rovněž vztah k metodám léčení nádorů v lidském organismu nebo v organismu zvířat, a to podáním účinného netoxického množství protilátky takovému člověku nebo zvířeti. Použitím běžných experimentů by odborník byl schopen určit, jaké je účinné a zároveň netoxické

-21CZ 289472 B6 množství protilátky potřebné k léčbě rakovinových nádorů. Nicméně všeobecně účinné množství se bude pohybovat v rozmezí od 0,05 do 100 mg protilátky na kilogram živé váhy za den.

Protilátky podle tohoto vynálezu mohou být podávány člověku nebo zvířatům v souladu s výše zmíněnými postupy léčby a to v množstvích dostatečných pro terapeuticky nebo profylakticky účinnou léčbu. Protilátky z tohoto vynálezu mohou být podávány člověku nebo zvířatům v konvenčních formách připravených kombinací protilátky z tohoto vynálezu s konvenčními farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo rozpouštědly podle známých technik. Odborník zajisté pochopí, že druh a charakter farmaceuticky přijatelného nosiče závisí na množství aktivní látky, se kterou je kombinován, způsobu aplikace a dalších proměnných veličinách.

Aplikace protilátky (nebo jejích fragmentů) podle tohoto vynálezu může být orální, parenterální, inhalací nebo místně. Termín parenterální je zde použit ve smyslu intravenózní, intramuskulámí, podkožní, rektální, vaginální nebo intraperitoneální aplikace. Podkožním a intramuslulámím způsobům parenterální aplikace je obvykle dávána přednost.

Denní dávky přípravku využívajícího sloučeniny podle tohoto vynálezu aplikované parenterálně nebo orálně za účelem profylaktické nebo terapeutické indukce imunosuprese nebo za účelem terapeutické léčby karcinogenních nádorů, budou celkově v množstvích od 0,05 do 100, ale raději v množstvích od 0,05 do 10 mg na kilogram živé váhy za den. Protilátka podle tohoto vynálezu může být rovněž aplikována inhalací. „Inhalací“ je myšleno intranazální nebo orální vdechování. Vhodné aplikační formy pro výše zmíněnou aplikaci, jako jsou např. areosol nebo inhalátor s automatickým dávkováním, mohou být připraveny konvenčními postupy. Navrhované množství sloučeniny podle tohoto vynálezu se pohybuje v rozmezí od 10 do 100 mg.

Protilátka podle vynálezu může být rovněž aplikována místně. Místní aplikace je míněna nesystémová aplikace a zahrnuje aplikaci směsi protilátek (nebo jejich fragmentů) podle tohoto vynálezu externě na epidermis, do ústní dutiny a kapání dané protilátky do uší, očí a nosu a do míst, kde nemůže nijak podstatně proniknout do krevního oběhu. Systemickou aplikací je míněna orální, intravenózní, intramuskulámí a intraperitoneální aplikace. Množství protilátky požadované k dosažení terapeutického nebo profylaktického účinku se bude samozřejmě lišit v závislosti na druhu protilátky, na podmínkách, za kterých je léčba prováděna a na druhu živočicha, u něhož je léčba prováděna, a závisí plně na úsudku lékaře. Vhodná dávka protilátky z tohoto vynálezu aplikovaná místně bude celkově ležet v rozmezí od 1 do 100 mg na kilogram živé váhy za den.

Formy aplikace:

I když je možné aplikovat protilátku nebo její fragmenty samostatně, je výhodnější je podávat v různých farmaceutických formulacích. Aktivní složky mohou tvořit - pro místní aplikaci 0,001 % až 10 % hmotn., např. 1 % až 2 % z celkové hmotnosti aplikační formy. Ačkoli mohou tvořit až 10 % hmotn., je upřednostňováno množství do 5 % hmotn. a ještě výhodněji činí od 0,1 % hmotn. z celkové hmotnosti aplikační formy.

Aplikační formy určené k místní aplikaci obsahují aktivní složky spolu sjedním nebo více přijatelným (-mi) nosičem (nosiči) a dále mohou obsahovat ještě terapeutické složky. Nosič (nosiče) musí být „přijatelné“ ve smyslu kompatibility s ostatními složkami aplikační formy a nesmí mít negativní vliv na příjemce.

Aplikační formy vhodné k místní aplikaci zahrnují kapalné nebo polokapalné preparáty schopné proniknout přes pokožku do místa požadovaného účinku. Těmto požadavkům vyhovují linimenta, roztoky, krémy, masti a mazání a kapky vhodné k aplikaci do očí, uší a nosu.

Kapky podle tohoto vynálezu mohou obsahovat sterilní vodný nebo olejový roztok nebo suspenzi a mohou být připraveny rozpuštěním aktivní složky ve vhodném vodném roztoku baktericidní

-22CZ 289472 B6 a/nebo fungicidní agens a/nebo nějakého dalšího vhodného konzervačního prostředku, a je-li to možné, měly by rovněž obsahovat povrchově aktivní agens. Výsledný roztok může být potom přečištěn filtrací a přemístěn do vhodné nádoby, která je dále zapečetěna a sterilizována vautoklávu nebo při teplotě 90- 100 °C po dobu půl hodiny. Alternativním postupem čištění roztoku je sterilizace filtrací a aseptický přenos tohoto roztoku do nádoby. Příklady vhodných baktericidních a fungicidních agens, které mohou být přidány do kapek, jsou nitrát nebo acetát fenylmerkuria (0,002%), benzalkonium chlorid (0,01%) a acetát chlorhexidinu (0,01%). Rozpouštědly vhodnými k přípravě olej ovitého roztoku jsou glyceroí, zředěný alkohol a propylenglykol.

Roztoky podle tohoto vynálezu jsou ty, které jsou vhodné pro aplikaci na kůži nebo do očí. Roztoky aplikované do očí mohou obsahovat sterilní vodný roztok, který nutně nemusí obsahovat nějakou baktericidní látku a mohou být připraveny postupy podobnými postupům pro přípravu kapek. Roztoky a liminenta určené k aplikaci na kůži mohou také obsahovat agens, který uiychluje usychání a ochlazuje kůži, jako např. alkohol nebo aceton a/nebo zvlhčovač jako např. glyceroí nebo olej (např. ricinový olej nebo arašídový olej).

Krémy, masti nebo mazání podle současného vynálezu jsou polotuhé aplikační formy aktivních složek určené pro vnější aplikaci. Tyto mohou být připraveny smícháním aktivní složky ve formě jemné drti nebo v práškové formě (buď samostatně nebo ve vodném či nevodném roztoku či suspenzi) s mastnou nebo nemastnou bází za pomoci vhodného zařízení. Báze mohou obsahovat uhlovodíky, jako např. tuhý, mazlavý nebo kapalný alkan, glyceroí, včelí vosk, mýdlo obsahující kovové ionty; rostlinné lepidlo; přírodní olej jako např. mandlový, kukuřicový, arašídový, ricinový nebo olivový olej; lanolin nebo jeho deriváty, nebo mastné kyseliny jako např. kyselina stearová či olejová spolu s alkoholem jako je např. propylenglykol nebo makrogol. Do aplikačních forem mohou být včleněny vhodné povrchové agens, jakými jsou např. aniontové, kationtové nebo neiontové povrchové aktivátory jako např. estery sorbitolu nebo polyoxyethylen. Suspenzační činidla jako např. přírodní gumy, deriváty celulózy nebo anorganické materiály jako např. SiO₂ a další složky jako lanolin mohou být rovněž vpraveny do těchto aplikačních forem.

Odborník pochopí, že optimální množství a místo aplikace jednotlivých dávek protilátky nebo jejích fragmentů podle tohoto vynálezu bude určeno podstatou a rozsahem podmínek, za kterých je léčení prováděno, aplikační formou, způsobem a místem podání, a druhem léčeného zvířete, a že jejich optima mohou být stanovena konvenčními technikami. Odborník zajisté také ocení, že optimální průběh léčby, tzn. počet dávek protilátky nebo jejích fragmentů podle vynálezu podávaných denně definovaný počet dní, může být zjištěn, jestliže se bude používat konvenční postupy při diagnostických testech.

Bez dalšího propracování je vidět, že odborník, který bude využívat předcházející popis, je schopen využít současný vynález v celém jeho rozsahu. Následující odstavce by proto měly být chápány jako toliko ilustrativní příklady a nějako omezení rozsahu využití současného vynálezu ve všech směrech.

Přípravek v kapslích:

Farmaceutický přípravek podle tohoto vynálezu ve formě kapslí je připraven naplněním standardní dvoudílné želatinové kapsle 50 mg protilátky nebo jejích fragmentů podle vynálezu v práškové formě, 100 mg laktózy, 32 mg křídy a 8 mg stearátu hořečnatého.

Přípravek pro injekční použití

Předmětem tohoto vynálezu je farmaceutický přípravek vhodný pro injekční podávání, je připraven smíšením 1,5 % (hmotnostně) vynalezené protilátky (nebo její části) s 10%ním vodným roztokem (objemově) propylenglykolu. Roztok je sterilizován filtrací.

-23i

Mast

Protilátka podle vynálezu nebo její část 1 g

Bílý měkký parafín do 100 g

Vynalezená protilátka je rozetřena s malým množstvím parafínu tak, aby vznikl jemný homogenní produkt. Disperzí jsou pak plněny kovové stlačitelné tuby.

Krém pro místní aplikaci

Protilátka podle vynálezu, nebo její část 1 g

Polawax GP200,20 g

Bezvodný lanolín 2 g

Bílý vosk 2,5 g

Methylhydroxybenzoát 0,1 g

Destilovaná voda do 100 g

Polawax, včelí vosk a lanolín jsou spolu zahřívány na 60 °C.

Pak se přidá ktéto homogenní disperzi 0,1 g methylhydroxybenzoátu a mixováním za vysoké rychlosti je dosaženo homogenizace směsi. Pak se nechá teplota klesnout na 50 °C. Potom se přidá protilátka podle vynálezu nebo její část a za pomalého míchání se směs nechá vychladnout.

Roztok pro místní aplikaci

Protilátky podle vynálezu nebo jejich části 1 g

Sorbitan-monolaurát 0,6 g

Polysorbát 20, 0,6 g

Cetostearol 1,2 g

Glycerin 6 g

Methylhydroxybenzoát 0,2 g

Přečištěná voda B.P. do 100,00 ml. (zkratka B.P. znamená British Pharmacopeia).

Methylhydroxybenzoát a glycerin jsou rozpuštěny v 70 ml vody při 75 °C. Sorbitan-monolaurát, polysorbát 20 a cetostearylalkohol se spolu roztaví při 75 ° C a převedou do vodného roztoku. Výsledná emulze je homogenizována a nechá se za stálého míchání vychladnout. Protilátka podle vynálezu, nebo její část, je pak přidána jako suspenze ve zbývající vodě. Celá suspenze je pak míchána dokud není homogenní.

. Oční kapky

Protilátky podle vynálezu, nebo jejich část 0,5 g

Methylhydroxybenzoát 0,01 g Propylhydroxybenzoát 0,04 g Přečištěná voda B.P.. do 100,00 ml

Methylhydroxybenzoát a propylhydroxybenzoát jsou rozpuštěny v 70 ml přečištěné vody B.P. o teplotě 75 °C a výsledný roztok se nechá vychladnout. Pak se přidá vynalezená protilátka nebo její část a roztok je sterilizován filtrací přes membránový filtr (velikost pórů 0,022 pm). Poté je přípravek asepticky zabalen do vhodných sterilních obalů.

Přípravek pro inhalační podávání

Najedno aerosolové balení v obsahu 15-20 ml je zapotřebí: směs 10 mg protilátky podle vynálezu, nebo její části s 0,2-0,5 % zvlhčovači (lubrikační) látkou (např. polysorbát 85 nebo kyselina olejová).

-24CZ 289472 B6

Tato směs se disperguje v pohonném plynu (např. freon nejlépe kombinace 1,2-dichlortetrafluorethanu nebo difluorchlormethanu). Disperze je poté uzavřena ve vhodném aerosolovém obalu, který je adaptován pro nosní nebo ústní inhalaci.

Přípravek pro inhalační podávání

Pro aerosolové balení o kapacitě 15-20 ml je zapotřebí:

rozpustit 10 mg vynalezené protilátky nebo její části v ethanolu (6-8 ml). Přidá se 0,1-0,2 % zvlhčovacího činidla (např. polysorbát 85 nebo kyselina olejová). Tato směs se disperguje v pohonném plynu (např. freon nejlépe kombinace 1,2-dichlortetrafluorethanu a difluorchlormethanu). Disperze je poté uzavřena ve vhodném aerosolovém obalu, který je adaptován pro nosní nebo ústní podávání.

Vynalezené protilátky a farmaceutické prostředky jsou užitečné hlavně při parenterálním podávání tzn. podkožním, intramuskulámím nebo intraverózním podávání. Přípravky pro parenterální podávání nejčastěji obsahují roztok vynalezené protilátky nebo její části, nebo jejich směs rozpuštěnou ve vhodném nosiči, nejlépe pak ve vodném. Může být použito mnoho různých vodných nosných látek: voda, pufrovaná voda, 0,4 % roztok soli, 0,3 % roztok glycinu, a podobně. Tyto roztoky jsou sterilní a vesměs prosté znečišťujících nerozpustných látek. Tyto roztoky mohou být sterilizovány konvenčními dobře známými sterilizačními technikami. Přípravky mohou obsahovat farmaceuticky vhodné pomocné substance, je-li třeba se přiblížit fyziologickým podmínkám, jako například pH vytvářející a udržující látky atd. Koncentrace vynalezených protilátek nebo jejich částí v takovýchto farmaceutických prostředcích se může široce měnit. To znamená od méně než 0,5 %, přes obyčejně (nebo nejméně) 1 %, až do 15 % nebo 20 % (hmotnostně). Tyto přípravky mohou být dle výběru v kapalném, viskózním, nebo jiném stavu vzhledem k vybranému způsobu podávání.

Farmaceutický přípravek podle vynálezu, vhodný pro intramuskulámí injekci, může být připraven z 1 ml sterilní, pufrované vody a 50 mg vynalezené protilátky nebo její části. Podobně farmaceutický přípravek podle vynálezu, vhodný pro intraverózní infuze, může být připraven z 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 150 mg vynalezené protilátky, nebo její části. Vhodné metody pro přípravu parenterálně podavatelných přípravků jsou odborníkům dobře známy, nebo jsou zřejmé. Více detailů je popsáno v literatuře, např.: Remington s Pharmaceutical Science, 15té vyd., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, zde přiloženo v referencích.

Vynalezené protilátky (nebo jejich části) mohou být skladovány v lyofílizovaném stavu a před použitím převedeny do vhodného nosiče. Tato technika je efektivní i při práci s konvenčními imunoglobuliny, a tak mohou být použity, z dosavadního stavu techniky známé, způsoby jejich lyofílizace a zpětného převedení do přirozeného stavu. Podle zamýšlených výsledků mohou být vynalezené farmaceutické přípravky podávány preventivně, nebo až při vlastní léčbě. Při terapeutické aplikaci jsou přípravky podávání pacientovi, který již strádá chorobou, v množství dostačujícím k léčbě nebo alespoň k zamezení dalšího rozšiřování nemoci, a ji doprovázejících komplikací. Při preventivních aplikacích jsou přípravky obsahující tyto protilátky nebo jejich směs podávány pacientovi, který ještě není nemocný. Podávaná protilátka pak slouží k zesílení jeho obranyschopnosti.

Jednorázové a několikanásobné podávání těchto farmaceutických přípravků může být prováděno dávkami a podle způsobu, který určí ošetřující lékař. V každém případě vynalezené farmaceutické prostředky by měly obsahovat vynalezené farmaceutické prostředky by měly obsahovat takové množství vynalezených protilátek nebo jejich částí, které jsou dostatečné k efektivní léčbě pacienta.

-25CZ 289472 B6

Měli bychom se taktéž zmínit o tom, že vynalezené protilátky mohou být použity také k tvorbě a syntéze jak peptidových tak nepeptidových sloučenin (peptidům podobných), které mohou být užitečné při stejné léčbě jako původní protilátka. Viz Saragovi a kol., Science, 253,792, 795(1991).

POPIS SEKVENCÍ (1) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE : ID. Č.: 1

CCATGGACCTG GACCTGG 17 (2) INFORMACE A SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 2 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 2

ATGGACATAC TTTGTTCCAC 20 (3) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 3 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 3

CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20 (4) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 4 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 4

ATGAAACACC TGTGGTTCTT 20 (5) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 5 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 5

-26CZ 289472 B6

ATGGGGTCAA CCGCCATCCT 20 (6) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 6 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 6

ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT 20 (7) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 7 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 7

TTGGGGCGGA TGCACT 16 (8) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 8 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 (B) : NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 8

GATGGGCCC TTGGTGGA 17 (9) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 9 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 9

GATGACCCAG TCTCCAGCCTC 21

K (10) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 10 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 10

-27CZ 289472 B6

CTCACTTGCT GCACAGGGTCC 21

Y VR M (11) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 11 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 11

AAGACAGATG GTGCAGCCA 19 (12) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 12 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ(D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 12

GGAACAGAGT GACCGAGGGG 20 (13) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 13 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 13

ACTAAGTCGA CATGAAACAC CTGTGGTTCT T 31 (14) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 14 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 14

ATCACAGATC TCTCACCATG ACCTGCTCCC CTCTCCTCC 39 (15) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 15 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 423 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 15

-28CZ 289472 B6

GAC

ATG

AAA

CAC

CTG

TGG

TTC

TTC

CTC

CTC

CTG

GTG

GCA

GCC

CCC

AGA

48

TGG

GTC

TTG

TCC

CAG

GTG

CAG

CTG

CAG

GAG

GCG

GGC

CCA

GGA

CTG

GTG

96

AAG

CCT

TCG

GAG

ACC

CTG

TCC

CTC

ACC

TGC

AGT

GTC

TCT

GGT

GGC

TCC

144

ATC

AGC

GGT

GAC

TAT

TAT

TGG

TTC

TGG

ATC

CGC

CAG

TCC

CCA

GGG

AAG

192

GGA

CTG

GAG

TGG

ATC

GGC

TAC

ATC

TAT

GGC

AGT

GGT

GGG

GGC

ACC

AAT

240

TAC

AAT

CCC

TCC

CTC

AAC

AAT

CGA

GTC

TCC

ATT

TCA

ATA

GAC

ACG

TCC

288

AAG

AAC

CTC

TTC

TCC

CTG

AAA

CTG

AGG

TCT

GTG

ACC

GCC

GCG

GAC

ACG

336

GCC

GTC

TAT

TAC

TGT

GCG

AGT

AAT

ATA

TTG

AAA

TAT

CTT

CAC

TGG

TTA

384

TTA

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

GTC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

423

(16) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 16 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 387 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (xi) POPIS SEKVENCE: ID. Č.: 16

ACC	ATG	GCC	TGG	GCT	CTG	CTG	CTC	CTC	GGC	CTC
GAC	TCT	GCG	GCC	TCC	TAT	GAG	TTG	AGT	CAG	CCT
TCC	CCA	GGA	CAG	ACG	GCC	GGG	TTC	ACC	TGT	GGG
AGG	AAA	AGT	GTA	CAG	TGG	TAC	CAG	CAG	AAG	CCA
CTG	GTC	ATC	TAT	GCT	GAC	AGC	GAA	CGG	CCC	TCA
TTC	TCT	GGC	TCC	AAC	TCA	GGG	AAC	ACC	GCC	ACC
GTC	GAG	GCC	GGG	GAT	GAG	GCT	GAC	TAT	TAC	TGT
ACT	GCT	GAT	CAT	TGG	GTC	TTC	GGC	GGA	GGG	ACC

GGT

CTT	GCT	CAC	TTT	ACA	48
CGC	TCA	GTG	TCC	GTG	96
GGA	GAC	AAC	GTT	GGA	144
CCG	CAG	GCC	CCT	GTG	192
GGG	ATC	CCT	GCG	CGA	240
CTG	ACC	ATC	AGC	GGG	288
CAG	GTG	TGG	GAC	AGT	336
CGG	CTG	ACC	GTC	CTA	384

387

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Chimérická protilátka obsahující konstantní oblast a vazebné místo pro antigen, které se specificky váže k lidskému antigenu, ze dvou různých protilátek, ve které konstantní oblastí je konstantní oblast lidského imunoglobulinu a částí vázající antigen, která se specificky váže k lidskému antigenu, je variabilní oblast imunoglobulinu opice Starého světa.
2. 2. Protilátka podle nároku 1, kde uvedenou opicí Starého světa je makak Rhesus.
3. 3. Protilátka podle nároku 1, kde uvedenou opicí Starého světa je makak jávský.

   -29CZ 289472 B6
4. 4. Protilátka podle nároku 1, kde uvedenou opicí Starého světa je pavián.
5. 5. Protilátka podle nároku 1, 2, 3 nebo 4, která specificky váže lidské antigeny vybrané ze souboru zahrnujícího CD58, VCAM,VLA4, CD2, LFA3, ELÁM, LAM, CD25,CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbeta, antigen Tn, IL-1, IL-8, lidský receptor T-buněk, CD3, CD28, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD5a, CDllc, CD45, produkt onkogenu neu, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF a CD71.
6. 6. Protilátka podle nároku 1, která specificky váže lidské antigeny vybrané ze souboru zahrnujícího CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELÁM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbeta, antigen Tn, IL-1, IL-8, lidský receptor Tbuněk, CD3, CD28, CD8, CD1 la, CD1 lb, CD1 lc, CD18, CD5a, CD45, produkt onkogenu neu, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF a CD71.
7. 7. Protilátka podle nároku 2, která specificky váže lidské antigeny vybrané ze souboru zahrnujícího CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELÁM, LAM, CD23, CD25, CD4, CD19, CD20, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbeta, antigen Tn, IL-1, IL-8, lidský receptor Tbuněk, CD3, CD28, CD8, CD1 la, CD1 lb, CD1 lc, CD18, CD5a, CD45, produkt onkogenu neu, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF a CD71.
8. 8. Protilátka podle nároku 3, která specificky váže lidské antigeny vybrané ze souboru zahrnujícího CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELÁM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbeta, antigen Tn, IL-1, IL-8, lidský receptor Tbuněk, CD3, CD28, CD8, CD1 la, CD1 lb, CD18, CD5a, CD1 lc, CD45, produkt onkogenu neu, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF a CD71.
9. 9. Protilátka podle nároku 4, která specificky váže lidské antigeny vybrané ze souboru zahrnujícího CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELÁM, LAM, CD23, CD25, CD4, CD19, CD20, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbeta, antigen Tn, IL-1, IL-8, lidský receptor Tbuněk, CD3, CD28, CD8, CD1 la, CD1 lb, CD1 lc, CD18, CD5a, CD45, produkt onkogenu neu, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF a CD71.
10. 10. Protilátka podle nároku 1 nebo 2, ve které uvedené vazebné místo pro antigen obsahuje CDR úseky variabilní oblasti opice Starého světa.
11. 11. Protilátka podle nároku 1, ve které uvedené vazebné místo pro antigen obsahuje celou variabilní oblast opice Starého světa.
12. 12. Nukleová kyselina kódující chimérickou protilátku podle nároku 1.
13. 13. Nukleová kyselina podle nároku 12, kde uvedená protilátka obsahuje úsek základní struktury lidské protilátky.
14. 14. Nukleová kyselina podle nároku 12, kde vazebné místo pro antigen uvedené protilátky obsahuje CDR úseky variabilní oblasti opice Starého světa.
15. 15. Způsob produkce chimérické protilátky kdanému antigenu, vyznačující se tím, že se (i) u opice Starého světa vyvolá tvorba protilátek opice Starého světa vůči výše zmíněnému antigenu, (ii) nukleová kyselina opice Starého světa, kódující vazebné místo pro antigen variabilní oblasti uvedené protilátky opice Starého světa se izoluje, (iii) připraví se lidská nukleová kyselina kódující lidskou konstantní oblast lidské protilátky,

    -30CZ 289472 B6 (iv) výše zmíněná nukleová kyselina opice Starého světa a výše zmíněná lidská nukleová kyselina se ligují pro vytvoření rekombinantní nukleová kyseliny, a (v) výše zmíněná rekombinantní nukleová kyselina se exprimuje pro produkci výše zmíněné rekombinantní protilátky.
16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedené vazebné místo pro antigen obsahuje CDR úseky variabilní oblasti opice Starého světa.
17. 17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedené vazebné místo pro antigen obsahuje celou variabilní oblast opice Starého světa.
18. 18. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že stupeň (i) zahrnuje imortalizaci buňky schopné produkce výše zmíněné protilátky opice Starého světa.
19. 19. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že stupeň (ii) zahrnuje výběr nukleové kyseliny opice Starého světa kódující variabilní oblast výše zmíněné protilátky opice Starého světa.
20. 20. Způsob podle nároku 18, vyznačující se t í m, že imortalizace se provede fůzí s hybridomem.
21. 21. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že imortalizace se provede virovou transformací.
22. 22. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že imortalizace se provede pomocí klonování jediné B-buňky.
23. 23. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že imortalizace se provede vytvořením genové knihovny.
24. 24. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že se vybere lidská konstantní oblast odpovídající požadovanému izotypu.
25. 25. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že stupeň (i) zahrnuje selekci Bbuňky z výše zmíněné opice Starého světa.
26. 26. Způsob podle nároku 25, vy zn ač u j í cí se tí m , že B-buňka se získá z lymfocytů periferního krevního oběhu, lymfatických uzlin, kostní dřeně nebo sleziny.
27. 27. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že stupeň (i) dále zahrnuje vyhledávání buněk výše zmíněné opice Starého světa produkujících výše zmíněné protilátky.
28. 28. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že exprese se provede v produkční buněčné linii.
29. 29. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, zmíněná izolace zahrnuje izolaci celé variabilní oblasti.
30. 30. Způsob podle libovolného z nároků 15až29, vyznačující se tím, že antigen je vybrán ze souboru zahrnujícího CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELÁM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbeta, antigen Tn, IL-1, IL-8, lidský receptor T-buněk, CD3, CD28, CD8, CD18, CDlla, CDllb, CDllc, CD5a, CD45, produkt onkogenu neu, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF a CD71.

    -31CZ 289472 B6
31. 31. Farmaceutická kompozice, v y z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje terapeuticky nebo profylakticky účinné množství protilátky podle nároku 1 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
32. 32. Farmaceutická kompozice podle nároku 31, vyznačující se tím, že uvedená

    5 protilátka váže specificky CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELÁM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbeta, antigen Tn, IL-1, IL-8, lidský receptor T-buněk, CD3, CD28, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD5a, CDllc, CD45, produkt onkogenu neu, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF a CD71.