SK284119B6

SK284119B6 - Použitie nukleovej kyseliny, kompozícia a spôsob jej výroby

Info

Publication number: SK284119B6
Application number: SK801-97A
Authority: SK
Inventors: David Stephen Charnock-Jones; Stephen Kevin Smith; Andrew Mark Sharkey; Robert Brian Heap
Original assignee: Cambridge University Technical Services Limited
Priority date: 1994-12-24
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 2004-09-08
Also published as: MX9704765A; CA2208446A1; DE69530001D1; CN1174508A; NO972935D0; ATE234637T1; ES2323909T3; EE03955B1; CZ293770B6; NO320436B1; PT799058E; HUT77338A; NO972935L; US20030186907A1; BG63332B1; JP2006124402A; AU4270796A; CZ191797A3; DE69530001T2; US6472374B1

Abstract

Použitie nukleovej kyseliny na výrobu liečiva na transfekovanie aspoň niektorých buniek reprodukčného traktu cicavčích samičích jedincov zavedením nukleovej kyseliny do uvedených buniek.ŕ

Description

Oblasť vynálezu

Vynález sa týka použitia nukleovej kyseliny na výrobu liečiva na transfekovanie aspoň niektorých buniek reprodukčného traktu cicavčích samičích jedincov zavedením nukleovej kyseliny do uvedených buniek

Doterajší stav techniky

Fyziológia endometria

Na prichytenie embrya v maternici cicavca sú vyžadované dve hlavné okolnosti: po prvé, príprava endometria na prijatie blastocysty, ktorá môže byť potom implantovaná a môže byť vyživovaná z vytvorenej placenty; po druhé, modifikácia aktivity myometria, ktorá musí byť v stave pokoja a tým umožňuje blastocyste, aby sa uhniezdila v dutine maternice bez nebezpečia vypudenia. Obidve tieto podmienky sú regulované účinkom hormónov počas gravidity, pričom estrogény a progesterón sú z tohto hľadiska zvlášť významné. Tieto hormóny účinkujú na endometrium a myometrium prostredníctvom svojich receptorov, ktoré sú uložené v jadre cieľových buniek. Aktivovaný komplex steroid-rcccptor v jadre je v interakcii so špecifickými oblasťami DNA, aby stimuloval, reprimoval alebo dereprimoval gény, ktoré kódujú bilekoviny a polypeptidy, ako sú enzýmy alebo rastové faktory.

Iniciácia implantácie je vyvolaná kaskádou biochemických a biofyzikálnych zmien. Adhezívne molekuly (napríklad CAM 105) sa implikujú vo včasných štádiách prichytenia sa blastocysty na stenu maternice. Potom sa blastocysta a endometrium prispôsobia tak, aby sa zosilnil úzky vzťah medzi fetálnym tkanivom a tkanivom matky. U kopytníkov bunky trofoblastu, ktoré vytvárajú vonkajšiu vrstvu blastocysty, migrujú do epitelu maternice, pričom dôjde k postupnej fúzii. Migrácia buniek prebieha u žien na inej úrovni, pretože nie je iba izolovaná a nie jc uskutočňovaná iba špecifickými bunkami, ktoré migrujú, ale veľkými plochami trofoblastu, ktoré prenikajú medzi epiteliálne bunky maternice. Aby k tomuto došlo, dochádza k fúzii niektorých buniek trofoblastu, aby sa vytvorilo syncítium. Proces je veľmi rýchly a embryo sa prichytí v tkanive maternice bez toho, aby došlo k významnejšej degenerácii epitelu maternice. Pri niektorých druhoch je proces implantácie oneskorený, podriadený pokynom prírody, ktoré zabezpečia, že mláďatá sa narodia vo vhodnom ročnom období, alebo fyziologickým faktorom, ako je laktácia, takže matka ukončí pridájanie predchádzajúceho vrhu skôr než dôjde k ďalšej gravidite.

Príprava maternice na implantáciu je regulovaná sekréciou ovariálnych hormónov. Transport oplodneného vajíčka cez vajíčkovod musí byť presne načasovaný, takže sa dostane do maternice v správnom čase jej vývoja, v období, keď má maternica vhodné podmienky na jeho prijatie. Vo väčšine prípadov maternica odmieta embryo, v skutočnosti viac ako iné oblasti tela. Epiteliálna vrstva maternice je, za väčšiny podmienok, rezistentná na prijatie a inváziu trofoblastu a táto rezistencia poľavuje iba za veľmi presných hormonálnych štádií.

Pri myšiach a potkanoch nespárené zvieratá nemajú úplný estrálny cyklus, netvoria normálne sekrečné žlté teliesko, ktoré produkuje zvýšené množstvá progesterónu. Ak dôjde k spáreniu v estrálnom období, v období, keď sa ovariálnym folikulom vylučujú vysoké hladiny estrogénov pri uvoľnení vajíčka, na mieste prasknutia folikulu sa vytvorí žlté teliesko, vylučujú sa zvýšené koncentrácie progesterónu, dôjde k implantácii a gravidita progreduje (dĺžka 21 dní). Ak po spárení nedôjde k oplodneniu, priebeh je podobný, až na to, že žlté teliesko pretrváva iba asi 11 dní a pseudogravidita sa ukončí.

Celuláme a biochemické zmeny, ktoré sa odohrávajú v endometriu, sú najviac zatiaľ preštudované u myší a potkanov, hoci informácie o týchto aspektoch u žien sa za posledné roky prehlbujú. Endometrium pri všetkých druhoch pozostáva z troch hlavných tkanív - luminálny epitel, glandulámy epitel a stroma. Proliferácia buniek sa v troch spomenutých tkanivách vyskytuje v rôznom čase. Luminálne bunky proliferujú tesne pred estrom (proestrus) pod vplyvom zvyšujúcich sa hladín estrogénov produkovaných vo folikuloch vaječníka. Po 1 dni gravidity (deň kopulačnej zátky u hlodavcov) delenie prestáva, ale potom dochádza k druhému, síce menšiemu prepuknutiu aktivity na 3. deň. Žľazové bunky majú najväčšiu aktivitu na 4. deň a potom sa aktivita znižuje. Stromálne bunky do 4. dňa neproliferujú, ale potom, pod vplyvom progesterónu, dosahujú vysoké hladiny proliferácie okolo 5 dňa. U žien sa o týchto zmenách, ktoré ohlasujú proces implantácie, vie menej, ale zdá sa, že vrchol proliferácie je v epiteliálnych bunkách počas folikulámej fázy cyklu a v stromálnych bunkách počas luteálnej alebo sekrečnej fázy, podobne ako u myší a potkanov.

Príčina endometriálnej bunkovej proliferácie nie je celkom objasnená. Uvažuje sa o príprave endometria na implantáciu zvýšením počtu buniek, ktoré budú mať nutritivnu a sekrečnú funkciu (žľazový epitel) a ktoré sa zúčastnia na veľmi včasných fázach tvorby placenty (decidualizácia). Ako nevyhnutná podmienka úspešnej implantácie, môže bunková mitóza postupovať smerom k diferenciácii buniek, a preto zohráva kľúčovú úlohu v skorých štádiách vzniku gravidity. Skutočnosťou, ktorá podporuje túto úlohu, je endometriálna produkcia rastových faktorov (mitogénov), cytokínov a jadrových onkogénov. Mnoho z týchto látok sa produkuje vo zvýšených koncentráciách pri odpovedi voči ovariálnym hormónom pôsobiacim prostredníctvom ich receptorov.

Z hľadiska rastových faktorov sa v súčasnosti venuje veľa pozornosti epidermálnemu rastovému faktoru (EGF), epidermálnemu rastovému faktoru viažucemu heparín (HBEGF), amfiregulínu a rastovým faktorom viažucim inzulín (IGF-I a IGF-II). V súčasnosti sa v experimentoch na myšiach zaznamenala dôležitosť lokálneho (parakrinného) účinku aspoň pri jednom z týchto rastových faktorov, pri amfireguline. Pomocou antiprogestínu, RU486 sa dosiahla inhibícia implantačno-špecifického a progesterónom regulovaného génu pre amfiregulín a toto malo za následok zabránenie implantácie (Das et al., Molecular Endocrinology, 9, 691-705, 1995).

Z hľadiska cytokínov sa vylučovacími sledovaniami zistilo, že leukemický inhibičný faktor (LIF) a kolónie stimulujúci faktor (CSF), ktoré sú produkované aj maternicou myší v čase implantácie, sú nevyhnutné, demonštrujúc, že ich odstránenie je nekompatibilné s implantáciou a normálnou placentáciou (Stewart et al., Náture, 359, 76-79, 1992; Pollard et al. Developmental Biology, 148, 273 - 283, 1991).

Z hľadiska jadrových onkogénov, hladiny c-jun a c-fos (ktoré sú skorými indikátormi transkripcie génu), sa zvyšujú v maternici po podávaní estrogénu a sú inhibované progesterónom.

V rozsahu invázie trofoplastu v čase implantácie existujú medzi rôznymi druhmi významné rozdiely. U žien je skorý trofoblast vysoko invazívny, zatiaľ čo u prasiat, u ktorých je forma implantácie neinvazivna, počas troch mesiacov gestácie nedochádza k porušeniu epitelu maternice.

SK 288119 Β6

Zlyhanie implantácie je pri obidvoch týchto druhoch vysoké, dosahujúce asi 60, prípadne 30 %. Dôvody tohto zlyhania sú zložité a nedostatočne objasnené. U žien možno asi polovicu strát pripísať genetickým abnormalitám, ale u prasiat, rovnako ako u iných kopytníkov, kde je strata tiež veľká, predstavujú genetické defekty iba malé percento vzhľadom na celkový počet. Po zlyhaní implantácie u žien zníženie sekrécie progesterónu spôsobuje krvácanie, ako na konci normálneho menštruačného cyklu; toto sa u väčšiny iných živočíšnych druhov nevyskytuje. Poruchy menštruácie, ako aj implantácie sú známe. Okrem toho, menštruačné krvácanie, či už ako dôsledok sekvenčnej hormonálnej terapie, alebo v súvislosti s kontinuálnou substitučnou hormonálnou terapiou, alebo po podávaní čisto progesterónových kontraceptiv, sú významnou príčinou u chorých i zdravých žien. Objasnenie takéhoto krvácania je cieľom mnohých štúdií zameraných na biochemické mechanizmy (napríklad prostaglandíny, enzýmy, polypeptidy a proteíny, vazoaktívne látky, ako je doštičky aktivujúci faktor PAF a vaskulámy endoteliálny rastový faktor (VEGF) a bunkové mechanizmy (napríklad migrácia buniek udomácnených v maternici, ktoré produkujú imunosupresívne látky).

Súčasné poznatky reprodukčných procesov sú široko zamerané na reguláciu produkcie steroidných hormónov a na účinky týchto hormónov na ich cieľové tkanivá. Napriek všetkému sa zdá, že parakrinné a autokrinné faktory sú kľúčovými mediátormi reprodukčnej funkcie, hoci v interakcii so steroidmi (Benton, 1991, Current Opinion in Celí Biology, 3, 171-175; Rozengurt 1992, Current Opinion in Celí Biology, 4, 161-165; Tartakovski et al., 1991, Developmental Biology, 146, 345-352 Robertson et al., 1992 Current Opinion in Biology, 4, 585-590 Smith, 1994, Human reproduction, 9, 936-946, a Tabibzadeh, 1994, Human reproduction, 9, 947-967). Najviac objasnený príklad týchto poznatkov sa pozoruje u ovarektomizovanej myši. Na tomto modeli sa maternica prejaví významným rastom ako odpoveďou na jednotlivú dávku estradiolu. Tento účinok môže byt blokovaný anti-TGF protilátkou (TGF je „transformujúci rastový faktor“), čo naznačuje, že mitogénne účinky estrogénu v tomto tkanive sú sprostredkované TGFa (Nelson et al., 1992, Endocrinology, 131, 1657 až 1664).

Následne je medikamentózna liečba v gynekológii založená na steroidno/antisteroidnej regulácii maternice (Yen a Jaffe, 1991, Reproductive Endocrinology, ed. Jaffe a Benton, Pub. WB Saunders, Philadelphia; Baird, 1993, British Medical Bulletin, 49, 78-87). Napriek nevyvrátiteľnému úspechu tohto prístupu sa žiadny podstatný pokrok v technológii kontraceptiv nedosiahol počas 20 rokov, neidentifikovali sa spôsoby zlepšujúce implantáciu, nedosiahol sa žiadny pokrok pri podpore rastu placenty a jej vývinu a nenašiel sa žiadny nový spôsob liečenia benígnych gynekologických ochorení (menštruačná dysfunkcia a fibroidy).

Existuje množstvo publikovaných prác v súvislosti s použitím „génového prenosu“ u cicavcov, aby došlo k zmene genotypu aspoň niektorých buniek v určitom tkanive alebo tkanivách. Je známa najmä snaha „génovej terapie“ u ľudí zavedením sekvencii nukleových kyselín do recipientov, s cieľom prekonať genetickú deficienciu recipienta expresiou polypeptidov kódovaných zavedenými sekvenciami nukleových kyselín. Skúšania génovej terapie boli napríklad uskutočnené v prípadoch, kde DNA sekvencie (inkorporované pomocou vektorov vírusov) boli zavedené do dýchacích ciest pacientov s cystickou fibrózou, aby sa zmenil fenotyp prinajmenšom pri niektorých epiteliálnych bunkách výstelky dýchacích ciest pacientov. Dosiaľ neboli publiko vané žiadne snahy zaviesť DNA do endometria cicavcov, napriek tomu, že dostupné techniky existujú.

Podstata vynálezu

Jeden predmet vynálezu sa týka použitia nukleovej kyseliny na výrobu liečiva na transfekovanie aspoň niektorých buniek reprodukčného traktu ľudských samičích jedincov zavedením nukleovej kyseliny do uvedených buniek.

Ďalší predmet vynálezu sa týka použitia nukleovej kyseliny na výrobu liečiva na transfekovanie aspoň niektorých buniek reprodukčného traktu cicavčích samičích jedincov zavedením nukleovej kyseliny do uvedených buniek, kde liečivo sa jedincovi podáva v čase po ovulácii až do okamihu, vrátane, v rovnakom menštruačnom cykle, v ktorom je najvyššia hladina progesterónu v krvi.

V predkladanom vynáleze nemožno v žiadnom prípade uvažovať o rozširovaní existujúcich techník génovej terapie, ktoré sú už známe ako aspoň čiastočne úspešné pri aplikácii do pľúc pacientov s cystickou fibrózou. Vrodené genetické poruchy nemožno považovať za zodpovedné v súvislosti so známymi ochoreniami endometria, takže nie sú podnetom pre odborníkov v oblasti aplikácie techník génovej terapie do endometria. Ďalej, epitel endometria je rôznorodý (kuboidný, odvodený od epitelu célomu) v porovnaní s epitelom pľúc (ktorý je vrstevnatý), a preto nemožno predpokladať, že sa budú správať analogicky. Navyše, aspoň pri primátoch v endometriu jestvuje cyklické uvoľňovanie epitelu endometria, čo by mohlo zapríčiniť stratu akýchkoľvek treansfektovaných buniek. Konečne, vynálezcovia zistili, že neexistoval žiadny prenos zavedenej DNA do orgánov matky, ani do placenty embrya, kde by sa mohli vyskytnúť alebo spôsobiť praktické ťažkosti.

Typicky sa nukleová kyselina zavádza do samice cicavca (výhodne ženy), najmä do jej endometriálnych buniek. Je snaha zaviesť nukleovú kyselinu do žľazového epitelu endometria. Nukleová kyselina môže kódovať polypetid, ktorý už jc prirodzene zosyntetizovaný bunkami, do ktorých bola nukleová kyselina zavedená, takže hladina expresie takéhoto polypeptidu je zvýšená prostredníctvom účinku dávky génu. Alternatívne možno tento spôsob použiť na indukovanie buniek exprimovať polypeptid, ktorý v týchto bunkách predtým syntetizovaný nebol. Polypeptidom by mohol byť napríklad „umelý“ rekombinantný polypeptid, ktorý v prírode neexistuje, ako napríklad chimémy polypeptid obsahujúci úplne alebo čiastočne funkčné domény z dvoch alebo viacerých rozdielnych proteínov.

Nukleovou kyselinou je výhodne DNA, ale možno sa snažiť aj o zavedenie RNA (sense alebo non-sense vlákien). Antisense molekula by mohla byť použitá na inhibíciu alebo interferenciu s expresiou polypeptidu v bunkách, do ktorých je nukleová kyselina zavedená. Sekvenciou zavedenej nukleovej kyseliny môže byť antisense RNA, alebo DNA sekvencia určujúca intracelulámu syntézu antisense RNA. Iným spôsobom dosiahnutia takejto inhibície je zavedenie takej sekvencie do buniek, ktorá určuje syntézu ribozýmu, ktorý potom špecificky štiepi mRNA potrebnú na syntézu polypeptidu, ktorého expresia má byť inhibovaná.

Zistilo sa, že čas podávania nukleovej kyseliny (vo vzťahu k štádiu reprodukčného cyklu) veľmi ovplyvňuje účinnosť absorpcie nukleovej kyseliny. Ďalej sa zistilo, že vo všeobecnosti, aby sa získal optimálny stupeň absorpcie podanej nukleovej kyseliny, je nevyhnutné, aby k podaniu došlo v období po ovulácii až do dňa, vrátane dňa, keď je hladina progesterónu v krvi najvyššia. Za normálnych o

SK 288119 B6 kolností je hladina progesterónu najvyššia v období podobnom s tým obdobím, keď v prípade prítomnosti embrya v maternici môže dôjsť k implantácii.

Ďalej bolo napríklad zistené, že maximálna absorpcia podanej DNA u myšieho endometria sa vyskytuje na 2. až

3. deň cyklu (za 1. deň sa považuje deň, keď sa po prvý raz detegovala vaginálna zátka). U ľudí sa ovulácia bežne vyskytuje na 14. deň cyklu a k implantácii obvykle dochádza v strede luteálnej fázy (hoci presné časové vyjadrenie u ľudí je iba nedostatočne určené).

Nukleová kyselina sa môže podávať v nahej forme, alebo môže byť naviazaná alebo asociovaná s inými látkami, napríklad lipozómami. Bez problémov je nukleová kyselina zavedená do buniek cicavčieho recipienta jednoduchou transfckciou (s alebo bez lipozómov), pri ktorej sa zistilo, že je prekvapujúco účinná bez toho, aby bolo potrebné zavedenie prostredníctvom vírusového vektora. Napriek tomu, vírusové vektory môžu byť žiaduce, najmä tie, ktoré môžu byť namierené do určitých typov buniek (napríklad, ako je to publikované vo WO 93/20221).

Nukleová kyselina bude jednoducho zavedená ako časť konštruktu, napríklad plazmidu, kozmidu a podobne, pričom konštrukt výhodne obsahuje promotór, použiteľný u cicavca, aby sa spôsobila transkripcia pri najmenšom v časti zavedenej nukleovej kyseliny. Promotór môže byť konštitutívny, alebo výhodnejšie indukovateľný, takže umožňuje väčšiu kontrolu expresie zavedenej sekvencie.

V jednom zvláštnom postupe uskutočnenom podľa tohto vynálezu, zavedenie molekuly nukleovej kyseliny do endometriálnych buniek samičieho cicavčieho jedinca umožňuje zvýšenie a zníženie fertility jedinca. Vynález možno použiť zvlášť pri poskytnutí spôsobu kontracepcie u domácich zvierat (napríklad u mačiek a psov), na zabránenie neželaných vrhov. Za iných podmienok vynález poskytuje spôsob zvýšenia fertility u úžitkových zvierat, u prasiat, teliat, ovci, a podobne.

Výhodne jc nukleová kyselina zavedená do reprodukčného traktu cez vagínu, čím sa predíde potrebe invazívnych chirurgických techník. Ale v prípade, že je to nutné, je možnosť priameho zavedenia nukleovej kyseliny do repodukčného traktu pomocou chirurgických techník napríklad do maternice. Vynález poskytuje možnosť zmeniť jednu alebo viac charakteristík zavedením jednej, viacerých alebo veľkého množstva sekvencii rôznych nukleových kyselín.

Z jedného hľadiska sekvencia zavedená do buniek reprodukčného traktu riadi expresiu, výhodne vo vysokých hladinách, účinného množstva cytokínu alebo rastového faktora, pričom účinné množstvo predstavuje časť molekuly, ktorá si ponecháva biologickú účinnosť ako celok, napríklad väzbu na špecifický ligand, a podobne. Príkladmi takýchto polypeptidov, ktoré by mohli byť exprimované zavedením sekvencie sú, ale bez ohraničenia, nasledovné polypeptidy: interleukíny, leukémiu inhibujúci faktor (LIF), vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF), epidermálny rastový faktor (EGF), heparín viažuci epidermálny rastový faktor, amfiregulín, kolónie stimulujúci faktor (CSF) a faktor tumoróznej nekrózy (TNF).

Z ďalšieho pohľadu môže zavedená sekvencia riadiť expresiu účinnej časti antagonistu cytokínu alebo rastového faktora, ako je IL-1 receptorový antagonista. Výhodne môže byť antagonistom solubilný receptor pre cytokín alebo rastový faktor. Vhodné príklady zahrnujú solubilné receptory pre: transformujúci rastový faktor (TGF)a, fibroblastový rastový faktor (FGF), rastový faktor odvodený od doštičiek (PDGF), interleukín-6 (IL-6) a VEGF.

Z ďalšieho aspektu môže zavedená sekvencia riadiť expresiu účinnej dávky polypeptidu, ktorý má imunologický účinok. Polypeptid môže hlavne mať imunogénny účinok, čím slúži na stimuláciu miestnej imunitnej odpovede, preto vynález možno použiť ako nový spôsob imunizácie. Výhodne bude imunogénny polypeptid antigénom z mukózneho patogénu. Pôsobením bežného mukózneho imunitného systému stimulácia tvorby protilátok v reprodukčnom systéme môže vyústiť do tvorby zodpovedajúcich protilátok v distálnych mukóznych oblastiach, ako je gastrointestinálny trakt, respiračný trakt, slzné žľazy, a podobne. Výhodne však bude antigén jedným z patogénov, ktoré sú invazívne a/alebo kolonizujú reprodukčný trakt, typicky patogénom, ktorý spôsobuje ochorenia prenášané pohlavným stykom. Príklady zahrnujú také vírusy, ako sú HIV, papilloma vírusy, t.j. HPV rôznych typov, chlamýdic a baktérie, napríklad N. gonorrhoea. Alternatívne môže byť polypeptid, ktorý má imunologický účinok, imunoglobulínom, alebo jeho účinnou časťou (ako napríklad Fab, Fv, alebo scFv fragment alebo protilátka s jednoduchým reťazcom). Imunoglobulin alebo jeho účinná časť môže byť namierená proti niektorým ďalším patogénom (ako je už spomenuté skôr), alebo môže byť namierená proti niektorému ďalšiemu antigénu, ako sú steroidné alebo iné hormóny. Preto imunoglobulíny alebo ich fragmenty by mohli byť exprimované lokálne, aby poskytovali ochranu pred ochorením, alebo aby regulovali fertilitu.

Z ďalšieho aspektu môže zavedená sekvencia riadiť expresiu polypeptidu alebo jeho účinnej časti, ktorá má vplyv na menštruáciu.

Okrem toho môže zavedená nukleová kyselina riadiť expresiu účinnej časti receptorovej molekuly na povrchu buniek reprodukčného traktu. Receptorom by mohol byť receptor pre cytokín, steroidný hormón alebo rastový faktor (ako EGF receptor, TGFa receptor, alebo VEGF receptor). Mnoho receptorov je známych, ktoré sú opísané ako „sirotské“ receptory, v ktorých nie je známy ligand, ktorý sa naväzuje na receptor. Takéto sirotské receptory sú zvláštnym predmetom záujmu farmaceutického priemyslu, keďže môžu poskytovať ciele pre nové terapeutické alebo profylaktické zlúčeniny.

Na základe toho v ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob, ktorý charakterizuje biologické vlastnosti polypeptidu, vrátane zavedenia sekvencie kódujúcej polypeptid, ktorý má byť charakterizovaný v bunkách reprodukčného traktu cicavca a stanovenie účinkov exprimovaného polypeptidu. Výhodne je cicavcom laboratórne zviera, ako myš a potkan. Výhodne bude polypeptidom, ktorý má byť charakterizovaný sirotský receptor a typicky najmenej časť jeho charakterizácie bude zahrňovať identifikáciu jeho ligandu. Vo všeobecnosti bude spôsob zahrňovať analýzu histologických rezov z laboratórneho zvieraťa a ich spracovanie jednou zo štandardných techník, napríklad histochemické farbenie, hybridizácia in situ, imunologické farbenie, atď.

Predkladaný vynález teda poskytuje novú alternatívnu reguláciu steroidov endometriálnej funkcie, a teda reprodukčnej schopnosti alebo fertility, priamym prenosom génu in vivo. Toto možno dosiahnuť množstvom spôsobov. Napr. bunky, ktoré produkujú vylučovaný cytokín by mohli byť chránené pred syntetizovaním faktora blokovaním transkripcie a translácie s použitím promótora s antisense konštruktami alebo ribozýmami. Alternatívne možno účinok sekrečného faktora blokovať receptorovými antagonistmi. Prirodzene sa vyskytujúce rozpustné receptory môžu vychytávať a neutralizovať bioaktívny ligand, čím pôsobia ako kompetitívne receptorové antagonisty. Alternatívne existujú prirodzené receptorové antagonisty, napríklad ILIRa- antagonista receptoru interleukínu-1. Intraperitone

SK 288119 Β6 álne podávanie tohto proteínu zabraňuje implantácii blastocysty u myši (Šimon et al., 1994 citované inde).

Existujú významné zistenia, ktoré nasvedčujú tomu, že solubilné rastové faktory vylučované vajíčkovodom a epitelom maternice môžu regulovať preimplantačný vývoj v embryu cicavca, priamym účinkom prostredníctvom receptorov exprimovaných v embryu (Pampfer et al., 1990, In vitro Cellular and Developmental Biology, 26, 944-948). Naopak, vyvíjajúce sa embryá produkujú rastové faktory, ktoré môžu pôsobiť autokrinným spôsobom, alebo na endometrium tak, že ovplyvňujú jeho receptivitu. Napr. u myší je LIF expresia (z materských tkanív) výrazne nadregulovaná v glandulámom epiteli na 4. deň, tesne pred implantáciou. LIF má schopnosť účinkovať na preimplantačné blastocysty, ktoré exprimujú LIF receptor (LIF-R). Táto materská expresia LIF je vitálna na implantáciu, keďže u myší bez LIF nedôjde k implantácii embryí, hoci k tomu dochádza transferom na pseudogravidné jedince. (Stewart et al., 1992 citované inde).

Vynálezcovia rozširujú teraz toto sledovanie na ľudí a pomocou RT-PCR ukázali, že ľudské embryá exprimujú mRNA kódujúcu LIF-R, ale samy LIF neexprimujú. LIF účinkuje naviazaním sa na nízkoafinitný receptor LIF-R. Vysokoafinitná väzba sa zvyšuje, keď LIF/LIF-R komplex interaguje so signálnym transdukčným doplnkovým proteínom gpl30. Ľudské embryá tiež obsahujú mRNA kódujúcu tento proteín (Sharkey et al., 1995, Biology of Reproduction, 53, 955-962). Vynálezcovia tiež dokázali, že LIF sekrécia v ľudskom glandulámom epiteli je regulovaná steroidmi, s maximom v luteálnej fáze (okolo očakávaného času implantácie-Chamock-Jones et al., 1994, citované inde). Okrem toho sa ukázalo, že podávanie LIF ľudským preimplantačným embryám in vitro zlepšuje vývin. Všetky tieto poznatky podporujú názor, že LIF by mohol byť pri implantácii u ľudí rovnako dôležitý ako u myší. Je jasné, žc cytokíny môžu sprostredkovať dôležitú komunikáciu medzi embryom v maternici a endometriu v oboch smeroch. Predkladaný vynález dovoľuje použiť génový prenos na prerušenie alebo zvýšenie tejto komunikácie, čo vedie k novým spôsobom kontracepcie, alebo naopak k zlepšenej implantácii. Najnovšie štúdie parakrinnej a autokrinnej regulácie reprodukčnej funkcie sú limitované na opisnú analýzu s nedostatkom účinných metód modulujúcich lokálne hladiny cytokín/receptor. Poznatok prezentovaný v tejto žiadosti naznačuje, že transfekcia epitelu maternice in vitro je uskutočniteľná. Toto umožňuje experimentálnu manipuláciu s endometriom a poskytuje nové terapeutické stratégie. Práca predložená opisuje použitie reporterového génu na demonštráciu uskutočnenia uterinámeho génového prenosu in vivo. V praxi by bolo možné použiť gén alebo iný DNA konštrukt, ktorý je schopný meniť funkciu maternice. Takéto príklady zahŕňajú receptorových antagonistov, napríklad IL-IRa, rozpustné VEGF receptory, atď., prirodzené alebo modifikované cytokíny a rastové faktory, inhibítory proteázy alebo steroidných receptorov a rôzne ribozýmové a antisense konštrukty. Táto práca ukazuje, že gény môžu byť transfekované do endometria in vivo a toto nájde uplatnenie pri mnohých endometriálnych a placentálnych stavoch napríklad pri zlepšení implantácie u zvierat a ľudí, zabránení implantácie, t. j. kontracepcia, pri endometrióze a menorágii, hyperplázii a pri adenokarcinóme.

S použitím vytvorených postupov sú získané výsledky uvedené neskôr. Demonštrujú, že génové konštrukty možno prenášať do endometria tak in vivo, u myší, ako aj in vitro a tieto konštrukty sú transkripčne a translačne aktívne.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Vynález bude ďalej opísaný pomocou príkladov na ilustráciu a s odkazom na sprievodné obrázky, kde:

obr. 1A a IB predstavujú fotomikrografie histologických rezov myšieho endometria transfekovaného plazmidovým konštruktom (A), ktorý riadi expresiu reporterového génu β-galaktozidázy, alebo (B) podobného plazmidu bez reporterového génu. Transfekované bunky možno jasne definovať intenzívnym tmavým (modrým) sfarbením cytoplazmy, ktoré v reze B chýba;

obr. 2 je fotomikrografia ľudských endometriálnych buniek in vitro, ktoré sú transformované tým istým plazmidom ako na obr. 1A - tmavé (modré) sfarbenie spôsobené expresiou reporterového génu súvisí hlavne s pretrvávajúcou glandulámou štruktúrou, kým okolité bunky sa sfarbujú slabšie;

obr. 3 je stĺpcový graf znázorňujúci výsledky CAT testu (v počtoch na skúmavku) pre endometriálne bunky úspešne transfekované génom kódujúcim chloramfenikol acetyltransferázu (pcDNA3CAT) v porovnaní s bunkami transfekovanými kontrolným plazmidom (pcDNA3); a obr. 4 je stĺpcový graf ukazujúci výsledky luciferázového testu (v relatívnych jednotkách svetla) pre endometriálne bunky úspešne transfekované génom kódujúcim luciferázu (pcDNA3LUC) v porovnaní s bunkami transfekovanými kontrolným plazmidom (pcDNA3).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Myši

Nulipary dospelé BALB/cJ myši boli umiestnené do svetlého 14 hod. svetla: 10 hod. tma; vypínanie svetla o 20.00 hod. malého zverinca s kontrolovanou teplotou 22 °C a dostávali stravu pre myši a potkany (Labsure; Chnstopher Hill Group, Poole, Dorset, UK). Boli umiestnené spolu s vazektomizovanými samcami rovnakého druhu a nasledujúce ráno boli hodnotené na prítomnosť vaginálnej zátky. Predpokladanou dobou párenia bol čas o 02.00 hod., čas 0 a za 1. deň sa považoval deň, keď bola zátka po prvý raz zistená. Spárené samice boli pred hodnotením umiestnené jednotlivo.

Laparotómia sa uskutočnila za aseptických podmienok pri anestézii Metafanom (metoxyfluoran, C-Vet Ltd., Bury St. Edmunds). Rohy maternice boli exponované alebo stredne ventrálnej alebo bilaterálnej incízii. Injekcie sa podali alebo do hrany rohu v tubo-uterinnom spoji alebo do spodnej časti rohu v uterocervikálnom spoji. Opakované štúdie ukázali, že posledne spomenutá technika predstavovala najlepší spôsob podávania, v niektorých prípadoch však bola výhodnejšia 1. technika, v prípade, že bolo potrebné minimalizovať poškodenie reprodukčného traktu.

Injekcie lipozóm/DNA (pcDNA3 konštrukt, reporterový gén +/- β-galaktozidázy) holej DNA a kontrolných roztokov (25-100 μΐ) boli uskutočnené inzerciou plochého hrotu Stratatipu do spodnej časti rohu. Roztoky boli predtým natiahnuté do hrotu pomocou Travesty aplikátora, ktorý sa tiež použil na kontrolu pomalého injikovania do rohu. Po injektovaní bola incízia skončená s použitím prerušovaných matracových stehov a myši sa nechali zotaviť v klietkach a dostávali stravu a vodu ad libitum.

Konštrukty plazmidov

Plazmidy tu opísané pomocou príkladov sú založené na báze komerčne dostupného vektora pcDNA3 (Katalógové

SK 288119 B6

Tabuľka 1 číslo V790-20, od firmy Invitrogen, San Diego, Kalifornia, USA). Plazmid pcDNA3 bez reporterového génu bol použitý ako negatívna kontrola. Experimentálne plazmidy pcDNA3-Dgal, pcDNA3-CAT a pcDNA3-Luc obsahovali β-galaktozidázu, chloramfenikol acetyltransferázu a reporterové gény luciferázy. Tieto plazmidy obsahovali nasledovné genetické elementy: gén rezistencie na ampicilín, ColEl originál replikácie, CMV promoter, [reportér gén], poly A adičné miesto pre bovinný rastový hormón, fl pôvod replikácie, SV40 pôvod replikácie, adičné miesto génu rezistencie na neomycín a adičné miesto SV40 poly A, v takom operabilnom vzťahu, že reportér gén by mohol byť exprimovateľný v eukaryotických bunkách za zavedenia plazmidu. Plazmidová DNA bola purifikovaná z E. coli alkalickou lýzou a bola ďalej purifikovaná s použitím Qiagénovej ionexovej kolóny (podľa inštrukcií výrobcu).

Lipozómový prípravok

Použitým lipozómom bol 3:1 (v/v) lipidový prípravok DOPSA (2,3-diolyloxy-N-[2(sperminkarboxymido)etyl]-N-N-dimetyl-l-propanamínium trifluoracetát) a DOPE (diolylfosfatidyl etanolamín) (LipofectAMINE; Gibco BRL Paisley, Škótsko). Množstvo DNA: boli použité rôzne pomery lipidov a rôzne injekčné objemy, ako je uvedené v tab. 1. DNA/lipozómy boli zmiešané tesne pred každým experimentom. 10 μί DNA roztoku sa pridalo k 10 μΐ roztoku lipidu, jemne sa zmiešali a nechali sa stáť 15 min. pri izbovej teplote. Potom sa pridalo 80 μΐ PBS, aby vznikla finálna koncentrácia DNA a lipid, ako je uvedené v tab.l. Tento roztok bol potom injektovaný do maternice pseudogravidných myší. Pozri odsek podrobne sa týkajúci myší a chirurgie.

Histochemická lokalizácia β-galaktozidázy

Zvieratá boli usmrtené inhaláciou kysličníka uhličitého a vybrali sa rohy maternice bez tuku a mezentéria. Každý roh bol rozdelený na 3 rezy, vrchný a spodný rez boli zmarazené v tekutom dusíku a uchovávali sa pri -70 °C pred kvantifikáciou β-galaktozidázy. Stredný rez každého rohu maternice bol fixovaný v 1,25 % glutaraldehyde v PBS 15 min., 2x bol premytý PBS a bol umiestnený do X-gal farbiaceho roztoku (1 mg/ml X-gal, 5 mM K₃Fe(CN)₆, 2 mM MgCl₂, 0,02 % NP40 a 0,01% deoxycholátu sodného) na 24 hod. pri izbovej teplote. Rezy boli potom premyté v PBS/3% DMSO (2x5 min.), 70 % etanolom (3x5 min.) a uložili sa do 100 % etanolu. Tkanivá boli zapustené do glykolmetakrylátovej živice a narezali sa rezy 7 pm a zafarbili sa neutrálnou červeňou pred mikroskopickým hodnotením.

Výsledky

Tabuľka 1 uvádza rôzne použité postupy a výslednú intenzitu sfarbenia rezov maternice po podávaní komplexov DNA/lipozóm. Výsledky vyjadrené v tab. 1 demonštrujú dôležitosť načasovania podania plazmidovej DNA, pričom najlepšie hladiny expresie sa dosiahli na 2. deň , pri podaní na 3. deň boli hladiny významné, ale podávanie na 4. deň sa prejavilo veľmi malou expresiou reporterového génu, pravdepodobne preto, že endometriálne bunky v tomto bode neviazali konštrukt z dôvodov, ktoré nie sú celkom objasnené.

Deň podávania (deň autopsie)	DNA (Mg/ml)	Lipid (Mg/ml)	Inj. objem (μί)	Intenzita histochem. farb.
2(5)	2	20	50	++
3(5)	2	20	50	++
4(6)	2	20	50	-
2(6)	2	20	50	+++
2(5)	8	20	20	++
4(6)	8	20	50	-
4(6)	30	20	50	+
4(6)	2	60	50	-

intenzita sfarbenia +++ silná, ++ mierna, + slabá, - žiadna

Kontroly:

Neinjektovaná 6-dňová pseudogravidná myš nemala žiadne sfarbenie maternice pre β-galaktozidázu.

U pseudogravidnej myši (deň podania 2.; autopsia deň 6.) injektovanej 50 μΐ pcDNA3 bez β-galaktozidázy (2 pg/ml) a lipidom (20 pg/ml) sa neobjavilo žiadne sfarbenie maternice na aktivitu β-galaktozidázy.

Hodnotenie histologických rezov po farbení X-gal ukázalo, že glandulámy epitel bol silne sfarbený, tiež aj luminálny epitel, ale v menšej miere. Optimálne sfarbenie sa zistilo u zvierat transfekovaných 2 pg/ml DNA a 20 pg/ml lipidu v 50 μΙ podaných v 2. deň pseudogravidity. Obr. la znázorňuje rez od takéhoto zvieraťa a obr. lb znázorňuje rez od kontrolného zvieraťa, ktoré dostalo, za rovnakých podmienok, plazmid bez β-gal génu.

Príklad 2

Transfekcia primárnych kultúr ľudského endometria

Vynálezcovia tiež demonštrovali, že ľudské endometriálne epiteliálne bunky možno transfekovať in vitro s vysokou účinnosťou.

Ten istý plazmid, pcDNA3, +/- reporterový gén β-galaktozidázy a lipidy boli použité, ako už bolo opísané. Endometriálne bunky boli pripravené spôsobom podľa Smitha a Kellyho (Smith et al., 1987, Prostaglandins, 34, 553-561). Po kultivácii bol použitý nasledovný transfekčný postup. DNA (2 pg) a lipozóm (8 pg) boli každé zriedené v 100 μί média bez prítomnosti séra (Opti-MEMl BRL), boli zmiešané a inkubované pri izbovej teplote 15 min. Potom sa pridalo ďalších 800 μί Opti-MEMl. Bunky (v 24 jamkových platniach) boli premyté PBS s následným premytím Opti-MEMl. K bunkám sa pridala DNA/Lipozómová zmes (0,5 ml) a boli inkubované pri 37 °C 3 hod. v CO₂ inkubátore, potom sa pridalo 0,5 ml kultivačného média s obsahom 20 % fetálneho teľacieho séra. Bunky boli fixované (0,1 % glutaraldehyd), boli premyté a farbené X-gal 24 hod. po transfekcii.

Táto práca ukazuje, že je možné prenášať gény do endometria in vivo, čo nájde uplatnenie pri mnohých endometriálnych alebo placentálnych stavoch, napríklad zlepšenie implantácie u zvierat i ľudí, Zabránenie implantácii (t. j. kontracepcia), endometrióza a menorágia, hyperplázia a adenokarcinóm. Vzhľadom na transfckciu in vitro purifikovaných buniek maternice boli získané ďalšie údaje. Toto dopĺňa in vivo práca na myšiach a ukazuje, že podobné bunky, po minimálnej dobe kultivácie, možno účinne transfekovať tým istým lipozómom a DNA v podmienkach in vivo.

SK 288119 B6

Príklad 3

Transfekcia ľudského endometriálneho epitelu in vitro

Ľudské primáme epiteliálne bunky z endometria boli izolované a kultivované podía metodiky Zhang et al.(J. Celí Science, 1995; 108: 323-331). Bunky boli nanesené na platne pre tkanivové kultúry so 6 jamkami, aby sa dosiahla hustota zhluku 50 % v nasledujúcom dni. Bunky boli kultivované 5 dní, potom sa premiestnili na platne s 24 jamkami, pri hustote 60 000 buniek/jamka. Nasledujúci deň boli bunky transfekované DNA/lipozómovými komplexmi (DNA/LC). Tieto boli pripravené nasledovne:

Postup transfekcie:

Zariadenie

LipofectAMINE (Gibco Catalogue No. 18324-012), OptiMEMI (Gibco Catalogue No. 51985-018) jamkový kultivačný disk

Médium pre bunkové kultúry, ako bolo opísané Zhangom et al. (citované skôr). Pozostáva z DMEM/HEPES, 10% FCS, Suplementu endoteliálneho bunkového rastu (Sigma Catalogue No. E-2759), v 30μg/ml heparínu (Sigma Catalogue No. H-3149), v 90 pg/ml, gentamycínu (Sigma Catalogue No. G-1272), v 5 pg/ml a fungizonu (Gibco Catalogue No. 15290-018) pri 1 pg/ml. Tiež sa použili Mg++, Ca++ bez PBS a 2 ml Eppendorfova skúmavka.

Použili sa dva rozdielne plazmidové konštrukty s obsahom rôznych reportérových génov. pcDNA3CAT bol získaný od Invitrogen Corporation a obsahuje reportér gén kódujúci enzým chloramfenikolacetyltransferázu. Druhý plazmid pcDNA3Iuc obsahoval ten istý vektor, ale CAT gén bol nahradený génom kódujúcim luciferázový enzým svätojánskych mušiek. Veľká škála DNA prípravkov vektorov bola vyrobená s použitím Qiagen midiprep systému. Ako negatívna kontrola bola použitá pcDNA3 neobsahujúca žiadny reperterový gén.

Príprava DNA/lipozómových komplexov

1. Roztok A

Zriediť lpg DNA v 100 pl Opti-Mem I v Eppendorfovej trubici.

Použiť DNA vo finálnej koncentrácii 1 pg/ml v transfekčnom médiu.

2. Roztok B

Zriediť 4 pl LipofectAMINE v 100 pl Opti-MEM v Eppendorfovej trubici. Použiť LipofectAMINE vo finálnej koncentrácii 8 pg/pl v transfekčnom médiu.

3. Zmiešať oba roztoky A a B do novej trubice a jemne premiešať.

4. Inkubovaťpri izbovej teplote 15 min.

Premývanie buniek

1. Pred transfekciou dôkladne premyť monovrstvu buniek 3x v FRESH PBS bez séra.

2. Znovu 2 x premyť monovrstvu buniek Opti-MEM I.

Transfekcia

1. Pridať 800 pl (celkovo 1,0 ml) Opti-MEM do každej trubice obsahujúcej zmes DNA/lipid. Finálna DNA koncentrácia 1 pg/ml a koncentrácia LipofectAMINE 8 pg/ml.

2. Odstrániť Opti-MEM z monovrstvy buniek.

3. Jemne zmiešať zmes DNA/LC a preliať zriedený komplexný roztok na premyté bunky, 0,5 ml/24 jamiek.

4. Inkubovať monovrstvu buniek 3 hod. pri 37 °C v CO₂inkubátore.

Ďalšia bunková kultúra

1. o 3 hod. odstrániť transfekčnú zmes a pridať 2 ml Zhangovho média do každej jamky a pokračovať v kultivácii.

Kvantitatívny test až 48 hod. po transfekcii boli bunky extrahované a hodnotené na CAT alebo aktivitu luciferázy, podľa vhodnosti.

1. 3x premyť bunky PBS.

2. Extrahovať bunky 300 pl Lysis pufra (Promega Catalogue No. E-3871), zotrieť bunky do Eppendorfovej trubice.

3. Rýchlo zmraziť extrakt pri -70 °C a uchovávať až po uskutočnenie testu.

4. Aby sa mohlo hodnotiť, roztopiť extrakty a centrifugovaťpri 13,000 g 5 min.

5. Ešte raz zopakovať cyklus zmrazovania a roztápania.

6. Hodnotiť aktivitu luciferázového reporterového génu s použitím súpravy pre luciferázový test od f. Tropix (Catalogue No. BC100L). Použiť 40 pl každého extraktu pre 1 trubicu.

7. Aktivita CATreporterového génu bola hodnotená s použitím Quan-t-CAT súpravy od f. Amersham (Catalogue No. TRK 1012).

Výsledky

Primáme endometriálne bunky boli transfekované v 24 jamkových platniach, ako je uvedené. Transfekcie sa uskutočnili na trojitých jamkách s pcDNA3 (ako kontrola), pcDNACAT a pcDNA3LUC. Po 48 hod. boli bunky zozbierané a testované na luciferázovú alebo CAT aktivitu.

CAT enzým katalyzuje transfer acetylových skupín z acetylkoenzýmu A na Chloramfenikol. Použitie triciovaného acetylcoA vyústi do transferu rádioznačenia na chloramfenikol. CAT aktivita vo vzorke je priamo úmerná množstvu vytvoreného tríciom značeného chloramfenikolu. Výsledky sú preto vyjadrené v cpm na trubicu. Štandardná krivka môže byť vytvorená s použitím lýzového pufra obsahujúceho známe množstvá purifikovanej CAT.

Výsledky sú znázornené na obr. 3, ktorý je stĺpcovým grafom vyjadrujúcim priemer ± sem pre trojnásobné stanovenia v bežnom pokuse. Výsledky v číselnej podobe boli, ako je znázornené neskôr, s CAT aktivitou v bunkách opracovaných pcDNA3CAT asi 6x vyššie v porovnaní s kontrolnými vzorkami, čo demonštruje úspešnú transfckciu endometriálnych buniek.

pcDNA3	pcDNA3CAT
710	4480
616	4134
662	3234
priemer 662+271	3951±372

V luciferázovom teste je bunkový extrakt obsahujúci luciferázu zmiešaný so svojím substrátom luciferínom, čo má za výsledok emisiu svetla. Intenzita svetelného signálu je v proporcionalite s prítomnosťou luciferázového enzýmu v extrakte a môže byť meraná luminometrom. Začiatočné výsledky sú uvedené v relatívnych jednotkách svetla.

Výsledky sú znázornené na obr. 4, ktorý je stĺpcovým grafom znázorňujúcim priemer ± sem pre trojnásobné stanovenia v bežnom pokuse. Výsledky v číselnej podobe boli, ako je uvedené. Signál z buniek opracovaných pcDNA3LUC bol 30x vyšší ako základný signál kontrolných vzoriek, čo opäť demonštruje úspešnú transfekciu endometriálnych buniek.

SK 288119 Β6

Príklady možných použití endometriálneho génového prenosu.

Možno transfekovať najmenej 7 rôznych typov génových konštruktov do endometria, aby sa dosiahla paleta rozličných účinkov. Každý z týchto odlišných typov bude opísaný postupne.

1. Nadexpresia cytokínov a rastových faktorov

Tieto predstavujú najjednoduchšie typy konštruktov z toho hľadiska, že sa použijú pri pre-expresii cytokínu alebo rastových faktorov v epiteliálnych bunkách maternice. Príklady vhodných cDNA na takúto pre-expresiu zahrnujú tie, ktoré kódujú LIF, VRGF, EGF, CSF, TNF. Amfiregulín a množstvo interleukínov a faktorov stimulujúcich kolónie. Ukázalo sa, že tieto sú exprimované prirodzene v endometriu a považujú sa za dôležité pri regulácii endometriálnej funkcie (Stewart et al., 1992, Náture, 359, 76-79; Charnock-Jones et al., 1994, Joumal of Reproduction and Fertility, 101, 421-426; Chamock-Jones et al., 1993, Biology of Reproduction, 48,1120-1128; Das et al., 1995, Molecular Endocrinology, 9, 691; Tabibzadeh (1994, Human Reproduction Update, 9, 947-967) publikoval široký prehľad v tejto oblasti). Každý z týchto faktorov ovplyvňuje rôzne aspekty reprodukčnej funkcie vrátane implantácie, vývinu krvných vlásočníc a biológie leukocytov. Preto možnými indikáciami na podávanie takýchto konštruktov by mohli byť stavy, keď je potrebné zlepšiť fertilitu, najmä u úžitkových zvierat, alebo je potrebné zabrániť koncepcii u ľudí, u domácich zvierat a tiež v prípade potreby liečby množstva menštruačných porúch u ľudí.

Príklad pokusu navrhnutého na zlepšenie fertility úžitkových zvierat

Ukázalo sa, že LIF je základom pri procese implantácie (Stewart et al., 1992 citované skôr). Tento faktor je produkovaný endometriom v čase implantácie. Je preto možné, že pri druhoch, kde sú podiely strát embryí vysoké, by zvyšujúce sa hladiny LIF expresie z endometria v čase implantácie mohli tieto straty redukovať. Preto transfekcia génového konštruktu navrhnutého na riadenie syntézy LIF z endometria v čase implantácie by mohla zlepšovať fertilitu pri takýchto druhoch. Konštrukty transfekované do endometria by potrebovali obsahovať primerané regulačné sekvencie, aby sa zabezpečilo, že LiF proteín bol produkovaný v primeranom čase. Je pravdepodobné, že toto by sa dalo dosiahnuť použitím promótora z LIF génu zo zodpovedajúceho druhu.

Liečby smerované na odstránenie menštruačnej dysfunkcie u ľudí by mohli tiež byť počítať s použitím endometriálneho génového transferu. Príkladom toho by mohla byť zmena vývinu krvných vlásočníc v endometriu transfekciou génu kódujúceho angiogénne rastové faktory, napríklad VEGF. Miestne zvýšenie VEGF produkcie by sa dalo očakávať pri zvýšení kapilárneho rastu, a preto by sa mohlo podporiť hrubnutie endometria. Rovnako môžu zvýšené hladiny VEGF uľahčovať reparabilitu kapilár po menštruácii a teda meniť mieru krvácania u pacientok pomocou tohto typu konštruktu.

2. Nadexpresia receptorov

Dalo by sa očakávať, že zvýšenie počtu a typov receptorov exprimovaných epitelom maternice by mohlo mať významné biologické dôsledky. Typy receptorov, ktoré by prichádzali do úvahy z hľadiska nadexpresie zahrnujú, ale nie sú ohraničené na receptory rastových faktorov a cytokínov, napríklad EGF, TGFd, VEGF a množstvo faktorov stimulujúcich kolónie a interleukíny. Receptory steroidných hormónov sú tiež vhodné na expresiu do epiteliálnych buniek. Dalo by sa očakávať, že takáto transfekcia je vhodná na zlepšenie fertility, zabránenie počatia, liečbu menštruačných porúch a tiež na objasnenie funkcie „sirotských“ receptorov (sirotské receptory sú také receptory, kde t. č. ligand nie je identifikovaný). Sirotské receptory predstavujú oblasť veľkého záujmu farmaceutického priemyslu, keďže charakterizovanie ligandu môže viesť k vývinu nových liečiv.

Uznáva sa, že vývin endometria predstavuje komplexný proces sprosredkovaný interakciou mnohých cytokínov a ich receptorov a tiež, že stimulačné účinky ovariálnych steroidov sú často sprostredkované prostredníctvom týchto cytokínov. Najmä sa ukázalo (Nelson et al., 1992, Endocrinology, 131, 1657-1644), že TGFa je potenciálnym mediátorom účinku estrogénu v maternici myši. Preto by sa dalo očakávať, že transfekcia konštruktov riadiaca syntézu tohto faktora by mohla podporiť endometriálny rast, a preto by mohla zvýšiť fertilitu v prípadoch, keď endometrium nie je primerane vyvinuté. Podobne by sa dalo očakávať, že tento faktor by mohol podporiť obnovu epitel iálneho povrchu po menštruácii, a preto by mohol byť vhodný pri liečbe menorágie.

Existuje niekoľko zástupcov veľkej skupiny steroidných hormonálnych receptorov, pre ktoré je ligand v súčasnosti neznámy. Transfekcia takýchto cDNA do endometria by mohla mať veľký prínos z hľadiska objasnenia biologickej funkcie týchto receptorov, a preto by našla uplatnenie vo vyhľadávaní nových farmaceutík, ktoré účinkujú na týchto receptoroch. (Evans, 1988, Science, 240, 889-895).

3. Transfekcia konštruktov navrhnutých na zabránenie alebo prevenciu účinku cytokínových rastových faktorov a iných hormónov

Transfekcia prirodzených antagonistov cytokínových a rastových faktorov otvára možnosť modulácie endometriálnej funkcie. Príkladom takýchto antagonistov by mohol byť antagonista receptora interleukinu 1 (Hannum et al., 1990, Náture, 343,336). Ukázalo sa, že podávanie tohto proteínu zabraňuje gravidite u myší (Šimon et al., 1994, Endocrinology, 134, 521-528). Medzi iných prirodzených antagonistov cytokínov a rastových faktorov patria prirodzené solubilné receptory. Solubilné receptory boli opísané v množstve systémov rastový faktor/cytokín. Napr. TNF (Engelmann ct al., 1990, J Biol. Chem., 265, 14497 - 14504), FGF (Givol et al., 1992, FASEB Joumal, 6, 3362-3369),PDGF (Tiesman & Hart, 1993, J. Biol. Chem., 268, 9621-9628) a IL-6 (Novick et al., 1989, J. Exp. Med., 170, 1409 - 1414). Spoločným znakom je, že väzobná doména extracelulámcho ligandu receptora sa uvoľňuje z bunky ako voľne solubilný faktor. Toto možno dosiahnuť alebo proteolýzou alebo alternatívnym štiepením, ktoré vytvára skrátenú molekulu bielkoviny, ktorá nemá transmembránové a intraceluláme domény. Kendall a Thomas (1993, Proc. Natl. Acad.Sci, USA, 90,10705-10709) opísali solubilný variant fit VEGF receptora. Tento proteín bol schopný zabraňovať účinku VEGF in vitro. Izolovali sa ďalšie cDNA kódujúce ďalšie solubilné varianty (pozri PCT/GB95/01213). Použitie týchto prirodzených činidiel má oproti iným antagonistom niekoľko výhod (napríklad anti-VEGF protilátky). Keďže sa prirodzene vyskytujú v tele, dalo by sa očakávať, že nebudú vyvolávať imunitnú odpoveď a mali by byť dobre znášateľné. Tiež, keďže sú odvodené od membránového väzobného receptora, budú väzobné chrakteristiky veľmi podobné a teda budú veľmi účinne kompetitivne smerom k ligandu. Je možné, že existujú iné solubilné receptory, alebo by mohli byť vyrobené génovým inžinier

SK 288119 Β6 stvom in vilro. Je tiež pravdepodobné, že keby bola doména viažuca ligand zo skupiny steroidných hormonálnych receptorov exprimovaná, mohla by pôsobiť ako dominantne negatívny receptor tým, že by kompetitívna vzhľadom na ligand, ak by bola exprimovaná v bunkách v dostatočne vysokých hladinách. Alternatívne, nie aktivačný, ale DNA väzobný „receptor“ by sa mohol použiť na zabránenie transkripcii génu. Toto použitie by bolo vhodné na antagonizáciu účinku prirodzených steroidov vrátane tých, ktoré sú dosiaľ neidentifikovanými ligandmi pre sirotské receptory (Pemrick et al., 1994, Leukémia, 8, 1797-1806). Signálne deficientné receptory z receptorovej nadčeľade sedem transmembránovej domény by sa tiež mohli vyrobiť génovým inžinierstvom a mohli by byť trasfektované.

Rozpustný antagonista receptora interleukínu-1 (Eisenberg et al., 1990, Náture, 343,341) sa prejavil antagonizáciou účinkov IL-1 in vivo (Šimon et al., 1994, Endocrinology, 134, 521-528). Preto by sa od transfekcie cndometria navrhnutým cDNA konštruktom na riadenie syntézy antagonistu dalo očakávať, že dôjde k zabráneniu gravidity u myší.

Iné faktory, ktorc podobne antagonizujú účinok rastového faktora alebo cytokínu, zahrnujú solubilné varianty prirodzených receptorov, napríklad solubilný variant VEGF receptoru pre fit bol opísaný Kendallom a Thomasom (1993, citované vyššie) a tiež Boocockom et al. (1995, J. Natl. Cancer Ins., 87, 506-516). Očakávalo by sa, že miestna tvorba takýchto faktorov by mohla antagonizovať účinky VEGF a mohla by mať vhodné terapeutické použitie v situáciách, kde sa vyskytuje hyperproliferácia endoteliálnych buniek, napríklad pri mnohých menštruačných poruchách, kde je potrebné znižovať hustotu kapilár endometria. Toto by zahrňovalo malígne ochorenie.

4. Použite antisense spôsobov pri prevencii miestnej produkcie špecifického proteínu (alebo enzýmu)

V alternatívnom prístupe blokovania účinku cytokínov, rastových faktorov a hormónov by mohlo byť použitie antisense alebo ribozýmovej technológie na blokovanie produkcie ligandov alebo produkcie receptorov zodpovedajúcich bunkách (James, 1991, Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 2, 191 - 214; Albert a Morris, 1994, Trends in Pharmacological Sciences, 15, 250 - 254).

Antisense technológia spočíva na väzbe tzv. antisense oligonukleotidu alebo polynukleotidu na bunkovú mRNA. Táto väzba zabraňuje translácii tejto mRNA, a preto znižuje množstvo zodpovedajúceho proteínu produkovaného bunkou. Syntetické oligonukleotidy alebo aj polyribonukleotidy boli v tomto prístupe použité s úspešnosťou. Očakávalo by sa, že lipozómami sprostredkovaná transfekcia oligonukleotidov alebo lipozómami sprostredkovaná transfekcia DNA konštruktov, ktoré riadia syntézu dlhších antisense polyribonukleotidov, špecificky a selektívne znižuje redukciu proteínov u transfekovaných buniek. Ribozýmy tiež zabraňujú produkcii proteínov pomocou selektívneho štiepenia RNA, ktorá kóduje konkrétny špecifický proteín. Tieto tiež môžu byť transfekované ako polyribonukleotidy alebo ako DNA konštrukty, ktoré riadia syntézu takýchto polynukleotidov (kvôli prehľadu pozri James 1991 a Albert & Morris, 1994, obe práce sú citované skôr). Príklad takéhoto použitia antisense ribozýmu na zabránenie fertility by mohol byť nasledovný. Už bolo spomenuté, že LIF zohráva zásadnú úlohu v procese implantácie pri gravidite u cicavcov (Stewart et al., 1992, citované skôr). Preto by sa dalo očakávať, že transfekcia oligonukleotidov aj DNA konštruktov riadiacich syntézu antisense polyribonukleotidov alebo ribozýmov namierených proti LIF mRNA by mohla zabrániť syntéze tohto faktora. Nedostatok faktora by potom mal viesť k zlyhaniu implantácie, a teda by bolo zabránené koncepcii.

Podobný prístup by mohol byť použitý pri zabránení produkcie angiogénnych rastových faktorov, napríklad VEGF, čo by mohlo zabrániť proliferácii endoteliálnych buniek, ktorú vyžaduje tumorózny rast. Preto tento typ terapie by mohol byť zvlášť výhodný v prípade potreby liečby malígneho ochorenia.

5. Lokálna produkcia imunoglobulínov a ich fragmetov

Je možné použiť modernú technológiu rekombinantnej DNA na tvorbu protilátok s jednoduchým reťazcom, ktoré majú takmer identické väzobné charakteristiky ako čistá monoklonová protilátka, od ktorej sú odvodené. Takéto protilátky s jednoduchým reťazcom boli úspešne exprimované v baktériách (He et al., 1995, Immunology, 84, 662 až 668). V princípe je génovým inžinierstvom možné vytvoriť konštrukt, ktorý bude riadiť expresiu protilátky s jednoduchým reťazcom a exprimovať ju do epiteliálnych buniek Ak by sa toto uskutočnilo v endometriu in vivo, dalo by sa očakávať, že protilátky s jednoduchým reťazcom namierene proti steroidnému hormónu by sa naviazali na steroid a zabránili by jeho účinku v epiteliálnych bunkách. Príkladom takejto protilátky by bola protilátka s jednoduchým reťazcom odvodená od antiprogesterónovej monoklonovej protilátky DB3 (He et al., citované skôr). Keby tieto protilátky boli vylučované do lumenu maternice, mohli by tiež viazať progesterón a mohli by mať účinok aj v iných miestach maternice. Protilátky namierené proti rastovým faktorom a cytokínom, ktoré sú známe svojou aktivitou v endometriu by mohli podobne zabraňovať ich funkcii, ak by týmto spôsobom boli prukované lokálne.

Ďalším použitím lokálne produkovaných protilátok s jednoduchým reťazcom by mohlo byť ich uplatnenie pri prevencii alebo liečbe sexuálne prenášaných ochorení. V takejto situácii protilátky namierené proti pôvodcovi, ktorý prichádza do úvahy (napríklad papilloma vírus, HIV, chlamýdie) by boli vylučované do lumenu maternice a zabraňovali by tak infekcii spôsobenej konkrétnym pôvodcom. Protilátky namierené proti spermiovým alebo oocytámym antigénom by mohli zohrávať úlohu v kontracepcii.

6. Aktívna imunizácia na dosiahnutie mukóznej imunity

Ďalším spôsobom, ktorý by sa mohol použiť na dosiahnutie miestnej imunity by mohlo byť navrhnutie konštruktov, ktoré by riadili sekréciu antigénu do lumenu. Takto by sa vylúčila miestna imunitná odpoveď, a teda dosiahla by sa špecifická mukózna imunita. Mnoho rokov je známe (HOwe, 1967, Joumal of Reproduction and Fertility, 13, 563-566), že lumen maternice obsahuje množstvo leukocytov. Je možné, aby antigén produkovaný transfekovanými endometriálnymi bunkami vychytávaný týmito leukocytmi následne vyvolal mukóznu imunitnú odpoveď. Uvoľňovanie antigénov do lumenu čreva sa prejavilo takouto imunitou a v niektorých prípadoch sa ukázalo ako vysoko účinné napríklad očkovanie proti polyomyelitíde.

7. Blokovanie miest prilipnutia patogénov

Prilipnutie patogénov na mukózne povrchy je často základnou predispozíciou vzniku infekcie. Blokovanie prilipnutia patogénov na tieto miesta preto môže predstavovať spôsob ochrany ľudí alebo zvierat pred ochorením, najmä pred ochoreniami prenášanými pohlavným stykom. Toto sa týka nielen bakteriálnych patogénov (ako sú určité patogénne kmene E. coli a N. gonorrhoeá), ale aj vírusov. Mnoho vírusov, keď infikujú stenu, prilipnú na povrchový

SK 288119 Β6 „receptor“. Lokálnu produkciu solubilných receptorov možno posudzovať z hľadiska súťaženia s molekulami povrchových buniek, a preto prevencie vírusovej infekcie. Rovnako nasýtenie povrchových receptorov látkami pripomínajúcimi vírusy, ktoré účinkujú ako vírusový „ligand“, by mohlo zabrániť infekcii, keďže by mohlo dôjsť k produkcii špecifických imunoglobulinov alebo ich účinných častí.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

L Použitie nukleovej kyseliny na výrobu liečiva na transfekovanie aspoň niektorých buniek reprodukčného traktu ľudských samičích jedincov zavedením nukleovej kyseliny do uvedených buniek.
2. Použitie podľa nároku 1, kde liečivo sa jedincovi podáva v čase po ovulácii až do okamihu, vrátane, v rovnakom menštruačnom cykle, v ktorom je najvyššia hladina progesterónu v krvi.
3. Použitie nukleovej kyseliny na výrobu liečiva na transfekovanie aspoň niektorých buniek reprodukčného traktu cicavčích samičích jedincov zavedením nukleovej kyseliny do uvedených buniek, kde liečivo sa jedincovi podáva v čase po ovulácii až do okamihu, vrátane, v rovnakom menštruačnom cykle, v ktorom je najvyššia hladina progesterónu v krvi.
4. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1,2 alebo 3, kde nukleová kyselina sa zavádza do endometriálnych buniek.
5. Použite podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde nukleová kyselina sa zavádza do žľazového epitelu endometria.
6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde zavádzanou nukleovou kyselinou je DNA.
7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde nukleová kyselina sa zavádza do lipozómu, vírusu alebo inej nosičovej častice.
8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde nukleová kyselina sa zavádza ako plazmid alebo iný konštrukt.
9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde zavádzaná nukleová kyselina obsahuje promótor operatívne spojený so sekvenciou, ktorá sa má transkribovať v eukaryotickej bunke.
10. Použitie podľa nároku 9, kde promótor je inducibilný.
11. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde zavádzaná nukleokyselinová sekvencia zahŕňa časť, operatívne spojenú v antisense orientácii s promótorom, na inhibíciu expresie polypeptidu v bunkách, do ktorých sa sekvencia zavádza.
12. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde zavedenie nukleokyselinovej sekvencie spôsobuje zmenu fertility jedinca.
13. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde zavedená nukleová kyselina riadi expresiu aspoň účinnej časti cytokínu alebo rastového faktora.
14. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde zavedená nukleová kyselina riadi expresiu aspoň účinnej časti jedného z nasledujúcich: interleukín, leukémiu inhibujúci faktor - LIF, vaskulámy endoteliálny rastový faktor - VEGF, epidermálny rastový faktor - EGF, heparín viažuci epidermálny rastový faktor - HBEGF, inzulín viažuce rastové faktory I a II - IGF-1 a IGF-II, amfiregulín, kolónie stimulujúci faktor - CSF, faktor tumoróznej nekrózy - TNF, hepatocytámy rastový faktor - HGF a fíbroblastový rastový faktor - FGF.
15. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde zavedená nukleová kyselina riadi expresiu aspoň účinnej časti antagonistu cytokínu alebo antagonistu rastového faktora.
16. Použitie podľa nároku 15, kde zavedená nukleová kyselina riadi expresiu interleukín-1 receptorového antagonistu alebo rozpustného receptora pre jedného z nasledujúcich: transformujúci rastový faktor - TGFa, fíbroblastový rastový faktor - FGF, rastový faktor odvodený z krvných doštičiek - PDGF, interleukín-6, vaskulámy endoteliálny rastový faktor - VEGF alebo hepatocytový rastový faktor „Met“ receptor.
17. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde zavedená nukleová kyselina riadi expresiu aspoň účinnej časti receptora pre rastový faktor, cytokin alebo steroidný hormón v a/alebo na bunke.
18. Použitie podľa nároku 17, kde zavedená nukleokyselinová sekvencia riadi expresiu aspoň účinnej časti receptora pre jedného z nasledujúcich: EGF, transformujúci rastový faktor - TGFa alebo VEGF.
19. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde zavedená nukleová kyselina riadi expresiu aspoň účinnej časti polypeptidu majúceho lokálny imunologický účinok.
20. Použitie podľa nároku 19, kde zavedená nukleová kyselina riadi expresiu aspoň účinnej časti antigénu z patogénu.
21. Použitie podľa nároku 19 alebo 20, kde zavedená nukleová kyselina riadi expresiu aspoň imunogénnej časti polypeptidu z jedného z nasledujúcich: HIV, papiloma vírusy, Chlamydia alebo N. gonorrhoea.
22. Použitie podľa nároku 19, kde zavedená nukleová kyselina riadi expresiu imunoglobulínu alebo jeho účinnej časti.