HU221204B1 - Use of nucleic acid for production of pharmaceuticals with tranfecting effect of nucleic acid on female mammals reproductive tract - Google Patents

Use of nucleic acid for production of pharmaceuticals with tranfecting effect of nucleic acid on female mammals reproductive tract Download PDF

Info

Publication number
HU221204B1
HU221204B1 HU9702205A HU9702205A HU221204B1 HU 221204 B1 HU221204 B1 HU 221204B1 HU 9702205 A HU9702205 A HU 9702205A HU 9702205 A HU9702205 A HU 9702205A HU 221204 B1 HU221204 B1 HU 221204B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
nucleic acid
growth factor
use according
cells
directing
Prior art date
Application number
HU9702205A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT77338A (hu
Inventor
David Stephen Charnock-Jones
Robert Brian Heap
Andrew Mark Sharkey
Stephen Kevin Smith
Original Assignee
Univ Cambridge Tech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9426380.3A external-priority patent/GB9426380D0/en
Application filed by Univ Cambridge Tech filed Critical Univ Cambridge Tech
Publication of HUT77338A publication Critical patent/HUT77338A/hu
Publication of HU221204B1 publication Critical patent/HU221204B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/204—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

A találmány eljárás emlős egyed reproduktív traktusa legalább néhánysejtjének egy vagy több tulajdonságának megváltoztatására, oly módon,hogy a nevezett sejtekbe nukleinsavat juttatnak. A találmány tárgyátképezik továbbá nukleinsavat tartalmazó készítmények, melyek a fentieljárásban alkalmazhatók. ŕ

Description

A találmány tárgya egyebek közt eljárás emlős méhnyálkahártya-szövet egy vagy több jellemzőjének módosítására.
A találmány háttere
Az endometrium (méhnyálkahártya) élettartama
Két fő tényező szükséges ahhoz, hogy az embrió beágyazódjon az emlős méhébe: először a méhnyálkahártya megfelelő fejlődése ahhoz, hogy a blasztociszta befogadására alkalmassá váljék, ami beágyazódik, és nutritív ellátást igényel a placenta képződéséig; és másodszor a méhizomzat aktivitásának módosulása, amelynek inaktívvá kell válnia, hogy a blasztociszta a méh üregében maradjon a kilökődés veszélye nélkül. Mindkét tényezőt terhességi hormonhatások szabályozzák, melyek közül az ösztrogén és a progeszteron különösen fontos. Ezek a szteroidhormonok az endometriumra és myometriumra a célsejtek magjában helyet foglaló receptorokon keresztül fejtik ki hatásukat. Aktivált állapotban a szteroid magreceptorkomplex interakcióba lép a DNS specifikus régióival, így fehérjéket és polipeptideket - mint enzimeket és növekedési faktorokat - kódoló géneket stimulál, gátol vagy felszabadít.
A beágyazódás kezdetét biokémiai és biofizikai változások sorozata idézi elő. Adhéziós molekulák (például: CAM 105) játszanak közre a blasztociszta méhfalhoz való tapadásának korai szakaszában. Ezután a blasztociszta és az endometrium különféle stratégiák folytán továbbfejleszti a közvetlen kapcsolatot a fötális és anyai szövetek között. Patásoknál a blasztociszta külső rétegét képező trofoblasztsejtek bevándorolnak a méh epitheliumába (hámszövetébe), amellyel azután fuzionálnak. A sejtmigráció nőkben egy lépéssel továbbhalad, mert nemcsak izolált vagy specifikus sejttípusok vándorolnak be, hanem a trofoblaszt nagy területei hatolnak be a méh epitheliumsejtjei közé. Ennek eléréséhez néhány trofoblasztsejt egyesül egymással, így szincíciumot képeznek. A folyamat igen gyors, és az embrió a méhepithelium különösebb degenerációja nélkül ágyazódik be a méh szöveteibe. Egyes fajoknál a beágyazódás folyamata eltolódik, vagy azért, hogy bevárja azokat a környezeti feltételeket, amelyek biztosítják, hogy a kölykök az év megfelelő szakában szülessenek, vagy élettani tényezők révén, mint a laktáció, hogy az anya befejezhesse az előző alom elválasztását, mielőtt a következő vemhesség bekövetkezne.
A méh előkészítését a beágyazódásra a petefészekhormonok termelése szabályozza. A megtermékenyített petesejt keresztüljutása a petevezetéken pontos időzítést igényel, hogy a méhbe a fejlődés megfelelő stádiumában kerüljön, és a méh megfelelő állapotban legyen a befogadásához. A legtöbb esetben a méh ellenálló az embrió befogadásával szemben, valójában ellenállóbb, mint egyes más testtájékok. A méhepithelium bélése a legtöbb esetben rezisztens a trofoblaszt megtapadására és inváziójára, és csak nagyon precíz hormonális állapot fennállása esetén csökken ez az ellenállás.
A párosítatlan egereknek és patkányoknak nincs teljes ösztruszciklusuk, minthogy nem képeznek normálisan szekretáló sárgatestet, ami növekvő mennyiségű progeszteront termelne. Ha ösztrusz esetén párosodnak abban az időben, amikor a petefészek, amelyből a pete kilökődött, nagy mennyiségű ösztrogént termel, a felszakadt follikulus helyén sárgatest képződik, majd növekvő mennyiségben progeszteront termel, a beágyazódás megtörténik, és a vemhesség fennmarad (21 nap időtartamú). Ha a párosodás infertilis maradt, hasonló folyamatok játszódnak le, kivéve, hogy a sárgatest csak 11 napig marad fenn, és az álterhesség megszakad.
Az endometriumban végbemenő celluláris és biokémiai változásokat a legalaposabban egérben és patkányban tanulmányozták, bár az ilyen jellegű ismeretek nők esetében az utóbbi években jelentősen növekedtek. A méhnyálkahártyát minden fajnál három fő réteg luminális epithelium, glauduláris epithelium és stroma - alkotja. Különböző időpontokban sejtproliferáció következik be a három szövetféleségben. A luminális sejtek közvetlenül az ösztrusz előtt (proösztrusz) proliferálnak a petefészek follikulus által termelt növekvő ösztrogénszintjeinek hatására. A terhesség első napján (rágcsálóknál a kopuláció napja) ez abbamaradt, de ezután egy, bár kisebb, második aktivitási csúcs jön létre a 3. napon. A glanduláris (mirigy) sejtek a 4. napon a legaktívabbak, majd aktivitásuk lecseng. A stroma sejtjei nem szaporodnak a 4. napig, de utána progeszteron hatásra az 5. napon nagy proliferációs szintet érnek el. Nők esetén kevesebbet tudunk ezekről a változásokról, amelyek megelőzik a beágyazódás folyamatát, de úgy tűnik, megnövekedett proliferáció mutatkozik az epitheliális sejtekben a ciklus follikuláris fázisában és a stromasejtekben a luteális vagy szekretoros fázisban, hasonlóan, mint egérben és patkányban.
Az endometriális sejtproliferáció célja nem teljesen tisztázott. Feltételezések szerint az endometrium előkészítését szolgálja a beágyazódásra úgy, hogy a növekvő sejtszám nutritív és szektoros funkciókat (glanduláris epithelium) láma el, és a placentaképződés nagyon korai fázisában venne részt (decidualizáció). A sikeres beágyazódás előfeltételeként a sejtmitózis sejtdifferenciálódássá fejlődhet, és így döntő szerepet játszik a terhesség fennmaradásának korai tényezőiben. Ezt a szerepet támasztja alá, hogy az endometrium növekedési faktorokat (nitogéneket), citokineket és nukleáris onkogéneket termel. Ezen vegyületek közül sok megnövekedett koncentrációban termelődik a receptoraikon keresztül ható petefészekhormonokra való válaszképpen (Husband és munkatársai: Repró. Fertil. Dev. 6, 381- 388, 1994; Simon és munkatársai: Endocrinology, 134, 521-528, 1994).
A növekedési faktorok közül jelenleg nagy figyelmet szentelnek az epidermális növekedési faktornak (EGF), a heparinkötő epidermális növekedési faktornak (HBEGF), az amfiregulinnak és az inzulinkötő növekedési faktoroknak (IGF-I és IGF—II). Ezen növekedési faktorok legalább egyike az amfiregulin helyi (parakrin) hatásának fontosságát bizonyítják a jelenlegi kísérletek egérben. Az amfiregulin beágyazódásspecifikus és progeszteron által szabályozott génjének gátlását RU 486 jelű antiprogesztinnel érték el, és ez a beágyazódás megakadályozását eredményezte. (Das és munkatársai: Molecular Endocrinology 9, 691-705, 1995).
HU 221 204 Β1
A citokinek közül a leukémia-inhibitorfaktor (LIF) és a kolóniastimuláló faktor (CSF), amelyek ugyancsak termelődnek az egerek méhében a beágyazódás ideje alatt, géneket megsemmisítő vizsgálatok során nélkülözhetetlennek bizonyultak, alátámasztva azt, hogy hiányuk összeegyeztethetetlen a beágyazódással és a normális placentációval (Stewart és munkatársai Natúré 359, 76-79,1992; Pollard és munkatársai Developmental Biology 148, 273-283, 1991).
A nukleáris onkogének közül a c-jun és c-fos (korai indikátorai a géntranszkripciónak) szintje megnő a méhben ösztrogén beadása után, és a progeszteron gátolja azt.
Lényeges különbségek vannak a különböző fajoknál a trofoblasztinvázió kiterjedésében a beágyazódás idején. Nőknél a korai trofoblaszt erősen invazív, míg sertésben, amelyekre a beágyazódás noninvazív formája jellemző, az endometriális epithelium soha nincs áttörve a vemhesség három hónapja alatt. Mindkét fajnál magas a sikertelen beágyazódások aránya, eléri - sorrendben - a 60, illetve 30%-ot. A sikertelenség magas arányának okai komplexek és nem teljesen tisztázottak. Nőknél a veszteségnek körülbelül a fele genetikai abnormalitásoknak tudható be, sertéseknél azonban, amint más patásoknál is, ahol a veszteség ugyancsak nagy arányú, a genetikai defektusok az összesnek csak néhány százalékát teszik ki.
Sikertelen beágyazódást követően nőknél a progeszteronszekréció esése vérzést idéz elő, mint a normálmenstruációs ciklus végén; ez a legtöbb állatnál nem jelentkezik. A menstruációs zavarok csakúgy, mint a beágyazódás zavarai általánosak.
A menstruációs vérzésen túl vagy a sorozatos hormonális kezelés következményeképpen, vagy folyamatos kombinált helyreállító terápiával vagy csak progeszterontartalmú hosszú hatású kontraceptívum-szedéssel kapcsolatban lép fel szignifikánsan gyengélkedés nőkben. Ezen vérzések alapját képező okok számos jelenlegi biokémiai [például: prosztaglandinok, enzimek, polipeptidek és fehérjék, vazoaktív vegyületek, mint trombocitaaktiváló faktor (PAF) és vasculáris endotheliális növekedési faktor (VEGF)] és sejtmechanizmus (például immunoszuppresszív vegyületeket termelő méhbe vándorló sejtek) vizsgálat középpontjában állnak.
A jelenlegi ismereteink a reproduktív folyamatokról nagyrészt a szteroidhormon-termelésre és ezen hormonok célszövetekre való hatásaira koncentrálódnak. Egyre inkább úgy tűnik azonban, hogy a parakrin- és autokrinfaktorok kulcsszereplői a reproduktív funkciónak, bár szteroidokkal interakcióba lépnek (Benton, 1991 Current Opinion in Cell Biology 3, 171-175; Rozengurt, 1992 Current Opinion in Cell Biology 4, 161-165; Tartakovsky és munkatársai, 1991 Developmental Biology 146, 345-352; Robertson és munkatársai, 1992 Current opinion in Immunology 4, 585-590; Smith, 1994 Humán Reproduction 9, 936-946; és Tabibzadeh, 1994 Humán Reproduction 9, 947-967). Erre legnyilvánvalóbb példa az ovariectomizált egér esete. Ebben a modellben a méh jelentős növekedést ér el válaszképpen ösztradiol egyszeri dózisára. Ezt a hatást anti-TGFa-antitesttel (a TGF „transzformáló növekedési faktor”) blokkolhatjuk, amiből arra következtethetünk, hogy az ösztrogén mitogén hatását ebben a szövetben a TGFa mediálja (Nelson és munkatársai, 1992 Endocrinology 131, 1657-1664).
Következésképpen a nőgyógyászati orvosi beavatkozások nagyrészt a méh szteroid/antiszteroid szabályozásán alapulnak (Yen & Jaffe, 1991, „Reproductive Endocrinology”, kiadó: Yen, Jaffe & Benton, Pub. WB Saunders, Philadelphia; Baird, 1993 British Medical Bulletin 49, 73-87). E megközelítés kétségtelen sikere ellenére 20 év óta nem történt haladás a kontraceptív-technológiában, nem fedtek fel eszközöket a beágyazódás elősegítésére, nem fejlődött a placentanövekedés és -fejlődés támogatása, és nincs új megközelítése a jóindulatú nőgyógyászati megbetegedések (menstruációs diszfunkció és fibroidok) kezelésének.
Számos publikáció látott napvilágot a „génátvitel” alkalmazásával kapcsolatban emlősökben egyes szövetben vagy szövetekben legalább néhány sejt genotípusának megváltoztatására. Különösen az emberi „génterápiás” kísérletek ismertek, amennyiben a recipiensbe nukleinsavszekvenciákat juttatnak a recipiens genetikai defektusának elfedésére úgy, hogy a bejuttatott nukleinsavszekvenciában kódolt polipeptidek és expresszálódnak. Olyan génterápiás kísérletek folynak például, amelyekben DNS-szekvenciákat (vírusvektorokba ültetve) juttatnak cisztikus fibrózisban szenvedő páciensek légutaiba abból a célból, hogy a páciens légzőtraktusát bélelő epitheliális sejtek közül legalább néhány fenotípusát megváltoztassák. A WO 94/05782. számú nemzetközi közzétételi irat emlőmirigy transzformálását tálja fel transzgenikus fehérjetermékek expresszáltatására. Mindeddig nem jelentek meg olyan kísérleti beszámolók, amelyekben DNS-t juttattak volna emlős-méhnyálkahártyába az ilyen elérhető technikák létezése ellenére.
A jelen találmányt az alábbiakban ismertetjük közelebbről.
A találmány tárgya - először - eljárás emlős egyed reproduktív traktusa legalább néhány sejtjének egy vagy több jellemző tulajdonságának megváltoztatására azáltal, hogy ezekbe a sejtekbe nukleinsavat juttatunk.
A találmány tárgya - másodszor - nukleinsavtartalmú készítmény előállítása emlős egyed reproduktív traktusa legalább néhány sejtjének egy vagy több jellemző tulajdonságának megváltoztatására való használatra.
A találmány tárgya - harmadszor - nukleinsavtartalmú készítmény használata emlős egyed reproduktív traktusa legalább néhány sejtjének egy vagy több jellemző tulajdonságának megváltoztatására.
A találmány tárgya - negyedszer - egy nukleinsavtartalmú készítmény felhasználása olyan anyag előállítására, amely egy emlős egyed reproduktív traktusa legalább néhány sejtjének egy vagy több jellemző tulajdonságát változtatja meg.
A találmány tárgya - ötödször - eljárás készítmény előállítására, amely egy nukleinsav és egy gyógyászatilag alkalmazható vivőanyag keverékét tartalmazza emlős egyed reproduktív traktusa legalább néhány sejtjé3
HU 221 204 Β1 nek egy vagy több jellemző tulajdonságának megváltoztatására.
A jelen találmány semmi esetre sem tekinthető azon génterápiás technikák egyenes kiterjesztésének, amelyek legalább részben sikeresnek tudottak cisztikus fibrózisban szenvedő betegek tüdejébe juttatás esetén. Öröklött genetikai rendellenességet nem tartanak felelősnek egyetlen ismert endometrium megbetegedéséért sem, így nem készteti az e téren képzetteket a génterápiás technikák méhnyálkahártya esetén történő alkalmazására. Az endometrium epitheliumtípusa különbözik továbbá (köbhám, a coeloma epitheliumából származik) a tüdőepithelium típusától (ami többrétegű), ezért nem lehet megjósolni, hogy ugyanúgy viselkedne. Továbbá, legalábbis a főemlősöknél az endometrium epitheliuma ciklikusan lelökődik, ami az összes beoltott sejt elvesztéséhez vezetne. Végül a feltalálók azt találták, hogy a bemutatott DNS nem került át az anyai szervekbe, sem az embrió placentájába, amelyek közül bármelyik megtörténhetett volna, és gyakorlati problémákat okozhatott volna.
Szokásos módon egy emlős nősténybe (előnyösen nőbe) nukleinsavat juttatnak, pontosabban annak endometriumsejtjeibe. A nukleinsavat előnyösen az endometrium glanduláris epitheliumába (mirigyhámjába) juttatjuk. A nukleinsav kódolhat olyan polipeptidet, amelyet a sejtek, amikbe a nukleinsavat ültettük, már természetesen is szintetizáltak, így ezen polipeptid megjelenési szintje növekszik a géndózis hatására. Másrészt az eljárás használható arra is, hogy a sejteket olyan polipeptid termelésére serkentse, amelyet azok a sejtek korábban nem állítottak elő. A polipeptid lehet például egy „mesterséges” rekombináns polipeptid, amelyik nem létezik a természetben, mint például egy kimer polipeptid, amelyik - teljesen vagy részben - két vagy több különböző protein működő részét tartalmazza.
A nukleinsav előnyösen DNS, de megpróbálható RNS is (szensz- vagy nonszenszláncok). Az antiszenszmolekula felhasználható arra, hogy azon sejten belül, amelybe a nukleinsavat beültettük, gátolja egy polipeptid expresszióját - vagy más módon interferáljon a polipeptid expressziójával. A bejuttatott nukleinsavszekvencia lehet antiszensz RNS- vagy olyan DNS-szekvencia, amely antiszensz RNS termelését irányítja intracellulárisan. Más mód ilyen gátlás elérésére, ha a sejtekbe olyan szekvenciát juttatunk, ami egy ribozim előállítását irányítja, ami azután (le)hasítja azt az mRNS-t, ami szükséges a polipeptid szintéziséhez, melynek termelését elgondolásunk szerint gátolni kívánjuk.
A találmány feltalálói úgy találták, hogy a nukleinsav alkalmazásának időpontja (a reprodukciós ciklus stádiumától függően) nagymértékben befolyásolja a nukleinsav felvételének hatékonyságát. A feltalálók tapasztalata szerint általában az alkalmazott nukleinsav optimális mértékű felvételének eléréséhez az szükséges, hogy a beadás az ovulációt követő periódusban történjék addig a napig (beleértve ezt a napot is) amikor a progeszteronszint csúcsot ér el a vérben. A progeszteronszint normálisan körülbelül ugyanabban az időpontban tetőzik amikor az embrió - amennyiben a méhben jelen van - beágyazódásra alkalmas.
így például a feltalálók tapasztalata szerint az alkalmazott DNS-felvétel maximuma egérendometriumba a ciklus 2-3. napján történik (az első napnak azt vesszük, amelyiken a hüvelyi nyákcsap először észlelhető). Emberben az ovuláció tipikusan a ciklus 14. napján történik, a beágyazódás pedig számítások szerint általában a közép-luteálisfázisban (bár a pontos időpont nehezen meghatározható emberben).
A nukleinsav alkalmazható tiszta formában, vagy egyéb anyagokhoz (például liposzómához) kötve vagy kapcsolva. Szokásosan a nukleinsavat a befogadó emlős sejtjeibe egyszerű transzfekcióval (liposzómával vagy anélkül) juttatjuk be, amit a jelen feltalálók meglepően hatékonynak találtak - a bejuttatandó szekvencia virális vektorban való alkalmazásának szükségessége nélkül. Mindazonáltal a virális vektorok kívánatosak lehetnek, különösen azok, amelyek egyes sejttípusokat céloznak meg (például a WO 93/20221-ben leírtak).
A nukleinsavat szokásos módon egy szerkezet (például plazmid, kozmid vagy hasonló) részeként juttatjuk be, amely szerkezet előnyösen tartalmaz egy promotert, ami beültethető az emlősbe, és a bejuttatott nukleinsav legalább egy részének transzkripcióját idézi elő. A promoter lehet konstitutív vagy előnyösebben indukálható, ami a beültetett szekvencia expressziójának nagyobb kontrollját teszi lehetővé.
A találmány egyik megvalósítási formája szerint nukleinsavmolekula beültetése egy nőstény emlős egyed endometriumsejtjeibe lehetővé teszi az illető fertilitásának szabályozását pozitív és negatív irányba. A találmány különösen alkalmas új eljárásként való felhasználásra háziállatok (például macska, kutya) fogamzásgátlására a nemkívánatos kölykök születésének megelőzésére. A találmány más megjelenési formájában eljárást nyújt haszonállatok, mint sertés, szarvasmarha, birka és hasonlók termékenységének fokozására.
Előnyösen a nukleinsavat a hüvelyen keresztül juttatjuk a reproduktív traktusba, így elkerüljük az invazív sebészeti technikákat. Amennyiben szükséges azonban, a nukleinsav sebészi beavatkozás útján is beültethető a reproduktív traktusba (azaz a méhbe). A találmány lehetőséget nyújt arra, hogy egy vagy több jellemző tulajdonságot megváltoztassunk igen nagy számú különböző nukleinsavszekvencia egyikének vagy közülük többnek a beültetésével.
Egyik megjelenési formában az ivarszerv sejtjeibe juttatott nukleinsavszakasz egy citokin vagy növekedési faktor hatékony részének (előnyösen magas szintű) termelését irányítja (a hatékony rész a molekula azon része, amely az egészre jellemző biológiai aktivitást őrzi például egy specifikus ligandumhoz kötődve stb.). Ilyen, a beültetett szekvenciák által termeltethető polipeptidek közé tartoznak, de nem kizárólagosan, az alábbiak: interleukinek, leukémia-inhibitorfaktor (LIF), vasculáris endotheliális növekedési faktor (IEGF), epidermális növekedési faktor (EGF), heparinkötő epidermális növekedési faktor (HBEGF), inzulinkötő növekedési faktor I és II (IGF-I és IGF—II), amifregulin, kolóniastimuláló faktor (CSF) és tumor necrosis faktor (TNF).
HU 221 204 Β1
Másik megvalósítási formában a bejuttatott szekvencia egy citokin- vagy növekedésifaktor-antagonista, mint például IL- 1-receptor-antagonista hatékony részének termelését irányíthatja.
Előnyösen az antagonista egy szolubilis citokinvagy növekedésifaktor-receptor lehet. Megfelelő példák közé tartoznak a következő szolubilis receptorok: transzformáló növekedési faktor (TGF)a, fibroblaszt növekedési faktor (FGF), trombocitából származó növekedési faktor (PDGF), interleukin-6 (IL—6) és VEGF.
További megvalósítási formában a bejuttatott szekvencia immunológiai hatású polipeptid hatásos részének termelését irányíthatja. Nevezetesen a polipeptid immunogén aktivitással rendelkezhet, ezáltal helyi immunválasz stimulációját szolgálja. így a találmány felhasználható új immunizációs eljárás biztosítására való felhasználásra. Előnyösen az immunogén polipeptid egy nyálkahártya-kórokozóból származó antigén. Az általános nyálkahártya-immunrendszer működése folytán a reproduktív traktusban az antitesttermelés stimulációja a disztális nyálkahártya-területeken a megfelelő antitest termelését eredményezheti, mint például a gyomor-bél rendszerben, légzőtraktusban, könnymirigyekben és hasonló helyeken. Bár az antigén egy olyan kórokozóból származik, amely a reproduktív traktust támadja meg és/vagy betegiti meg, legelőnyösebb egy olyan kórokozó, amelyik szexuális úton terjedő megbetegedést okoz.
A példák közé tartoznak olyan vírusok, mint HIV-, papillomavírusok (például HPV különböző típusai), chlamidia és baktériumok (például N. gonorrhoea). Másrészt az immunológiai hatású polipeptid lehet egy immunglobulin vagy annak hatásos része (mint például Fab-, Fv- vagy ScFv-fragmentum, vagy egy egyláncú antitest). Az immunglobulin vagy annak hatásos része irányulhat a kórokozó (mint például a fent említettek) ellen, vagy valamilyen más antigén ellen, mint például szteroid vagy egyéb hormon. így immunglobulinokat vagy azok részeit termeltethetjük helyileg, hogy védelmet nyújtsunk betegségek ellen vagy szabályozzuk a fertilitást.
További megvalósítási formában a bejuttatott szekvencia menstruációt befolyásoló hatású polipeptid vagy hatásos része termelését irányíthatja.
További megvalósítási formában a bejuttatott nukleinsav a reproduktív traktus sejtjeinek felszínén egy receptormolekula hatásos részének termelését irányíthatja. A receptor lehet citokin-, szteroidhormon- vagy növekedésifaktor-receptor (mint például EGF-receptor, TFG-a-receptor vagy FEGF-receptor). Számos receptor ismeretes „árva” receptorként, amelyeknél a receptorhoz kötődő ligandum ismeretlen. Ezek az „árva” receptorok a gyógyszergyártás jelentős figyelmére tarthatnak számot, minthogy új terápiás és profilaktikus vegyületek célját szolgálhatják.
Ennek megfelelően más szempontból a találmány tárgya eljárás egy polipeptid biológiai tulajdonságainak meghatározására úgy, hogy a karakterizálandó polipeptidet kódoló szekvenciát egy emlős reproduktív traktusába ültetjük, és a termelt polipeptid hatásait értékeljük. Előnyösen az emlős egy laboratóriumi állat, mint egér vagy patkány. A karakterizálandó polipeptid alkalmasan egy „árva” receptor, és a karakterizálása legalább részben a ligandum meghatározását is tartalmazza. Általában az eljáráshoz tartozik a laboratóriumi emlősből vett szövetminták vizsgálata, ami a különböző standard technikák bármelyikével végezhető (például hisztokémiai festés, in situ hibridizáció, immunológiai festés stb.).
A jelen találmány így új alternatívát szolgáltat az endometriumfunkció szteroidszabályozására (és így a reproduktív kapacitás vagy fertilitás szabályozására) direkt géntranszferrel in vivő. Ennek elérésére genetikai szerkezetek szolgálnának a citokinhatás specifikus szabályozására. Ez különböző módokon érhető el. Például a szekretált citokint termelő sejtek faktorszintetizálása megelőzhető a transzkripció és transzláció blokkolásával antiszenszszerkezetek vagy riboszómákat szállító promoter felhasználásával. Másrészt a szekretált faktor hatása receptorantagonistákkal blokkolható. A természetesen előforduló szolubilis receptorok elfedhetik és neutralizálhatják a bioaktív ligandumokat, így kompetitív receptorantagonistákként viselkednek. Másfelől léteznek természetes receptorantagonisták, például ILlRa (interleukin-1 receptorantagonista). Ezen protein intraperitoneális alkalmazása blokkolja a blasztociszta beágyazódását egérben (Simon és munkatársai, 1992, korábban már citálva).
Nyilvánvaló tény, hogy a petevezeték és a méhepitheliuma által termelt szolubilis növekedési faktorok képesek az emlősembrió beágyazódás előtti fejlődésének befolyásolására úgy, hogy közvetlenül az embrión megjelenő receptorokon keresztül hatnak (Pampfer és munkatársai, 1990 In Vitro Cellular and Developmental Biology 26, 944-948). Másrészt a fejlődő embrió termel növekedési faktorokat, amelyek autokrin módon hatnak, vagy az endometrium receptivitása befolyásolása útján. Például egérben a LIF-termelődés (az anyai szövetekből) drámaian felfokozódik a glanduláris epitheliumban a 4. napon, közvetlenül a beágyazódást megelőzően. A LIF hat a beágyazódás előtt álló blasztocisztára, amely LIF-receptort (L1F-R) termel. A LIF ezen anyai termelése életfontosságú a beágyazódás tekintetében, minthogy a LIF-receptortól megfosztott egerekben az embrió nem ágyazódik be, míg ha álterhes nősténybe átültetjük, akkor igen (Stewart és munkatársai, 1992 más helyen citálva).
A feltalálók kiterjesztették munkájukat emberre is és RT-PCR segítségével kimutatták, hogy az emberi embrió termel LIF-R-t kódoló mRNS-t, de önmaga nem termel LIF-et. A LIF hatását az alacsony affinitású LIF-R-receptorhoz kötődve fejti ki. A magas affinitású kötődés megnő, ha a LIF/LIF-R komplex reagál a gp 130 jelátvivő járulékos proteinnel. A humán embrió tartalmazza ezt a proteint kódoló mRNS-t is (Sharkey és munkatársai Biology of Reproduction 53, 955-962, 1995). A feltalálók kimutattak továbbá szteroidok által szabályozott LIF-szekréciót humán glanduláris epitheliumban, amely a luteális fázisban tetőzik (a beágyazó5
HU 221 204 Β1 dás várható időpontja körül - Chamock és munkatársai, 1994, korábban már citálva). Továbbá LIF adagolása humán implantáció előtt álló embriókba in vitro - a beszámolók szerint - elősegítette a fejlődést. Mindezen tények alátámasztják azt az elképzelést, hogy a LIF fontos szerepet játszhat a humán beágyazódásban, mint ahogy egérben is. Világos, hogy a citokinek lényeges kommunikációt mediálhatnak a méhüregben lévő embrió és az endometrium között (mindkét irányba). A jelen találmány lehetővé teszi géntranszfer használatát ezen kommunikáció megszakítására vagy megerősítésére, így új eljárásokhoz vezet a fogamzásgátlás vagy ellenkezőleg, az asszisztált reprodukció területén.
A reproduktív fúnkció parakrin és autokrin szabályozásának legújabb vizsgálatai leíró elemzésre korlátozódnak a helyi citokin/receptor szintek változtatását szolgáló hatékony eljárások hiányában. A jelen találmányban ismertetett tények arra utalnak, hogy a méhnyálkahártya in vitro transzfekciója keresztülvihető. Ez lehetővé teszi a méhnyálkahártya kísérletes manipulációját és új terápiás stratégiákat nyújt. Az alábbiakban körvonalazásra kerülő munka ismerteti egy reportergén használatát az in vivő méhbe történő géntranszfer gyakorlati alkalmazhatóságának bemutatására. A gyakorlatban olyan gén (vagy egyéb DNS-szerkezet) használata célszerű, amely képes a méh funkciójának megváltoztatására. Ilyen példák közé tartoznak a receptorantagonisták (például IL-lRa, oldékony VEGF-receptorok stb.) természetes vagy módosított citokinek és növekedési faktorok, proteázinhibitorok vagy szteroidreceptorok és különféle ribozim- és antiszenszszerkezetek. Ez a munka bemutatja, hogy gének átültethetők az endometriumba in vivő, és ez felhasználhatóvá válik számos különböző méhnyálkahártya- (vagy placenta-) állapotban, például mind állatban, mind emberben a beágyazódás elősegítésére, a beágyazódás megakadályozására (fogamzásgátlás) endometriosis és menorrhagia, hiperplázia és adenocarcinoma esetén.
Az általunk kifejlesztett protokollok használatával az alább ismertetésre kerülő eredményekhez jutottunk. Ezek bemutatják, hogy génszerkezetek transzferálhatok az endometriumba mind in vivő (egérben) mind in vitro, és ezek a szerkezetek transzkripció (és transzláció) szempontjából aktívak.
A találmányt ismertetjük továbbá illusztrációként szolgáló példákkal, és hivatkozunk az azokat kísérő ábrákra, amelyekben:
Az 1A és 1B ábra olyan egérendometrium szövettani metszetének fotomikrográfiás képét mutatja, amelyeknél transzfekció történt A) plazmidszerkezettel, amely egy β-galaktozidáz reportergén termelését irányítja, vagy B) egy hasonló plazmiddal, amelyből hiányzik a reportergén. A transzfektált sejteket egyértelműen azonosíthatjuk a citoplazmában levő intenzív sötét (kék) festődés alapján, amely a B metszetnél nem észlelhető.
A 2. ábra olyan humán endometriumsejtek fotomikrográfiás képe, amelyek az 1A ábra szerinti plazmiddal transzformáltak - a reportergén megjelenésének megfelelő sötét (kék) festődés főként a visszamaradt glanduláris szerkezettel áll összefüggésben, míg a környező sejtek festődése gyengébb.
A 3. ábra egy oszlopgrafikon, ami a CAT-vizsgálat (beütés per cső) eredményeit mutatja klór-amfenikolacetil-transzferázt (pcDNA3CAT) kódoló génnel sikeresen transzfektált endometriumsejtek esetén összehasonlítva egy kontrollplazmiddal (pcDNA3) transzfektált sejtekkel; és a 4. ábra oszlopgrafikonja egy luciferázvizsgálat relatív fényességi egységekben mért eredményeit mutatja luciferázét (pcDNA3LUC) kódoló génnel sikeresen transzfektált endometriumsejtek esetén, összehasonlítva kontrollplazmiddal (pcDNA3) transzfektált sejtekkel.
Példák
1. példa
Egér
Érett, még egyszer sem szült BALB/cJ egereket tartottunk egy ellenőrizhető kisállatketrecben egér- és patkánytápon (Labsure; Christopher Hill Group, Poole, Dorset, UK) az alábbi viszonyok között: 14 óra fény: 10 óra sötétség, fénymegvonás 22.00 órakor, 22 °C. Éjszakára vasectomizált hímekkel egy szintre helyeztük őket, és másnap reggel hüvelyi nyákcsap jelenlétét vizsgáltuk. A párosodás feltételezett időpontja 02:00 volt (0. időpont) és az 1. napnak azt a napot számítottuk, amikor a nyákcsap először észlelhető volt. A kísérlet előtt a párosodott nőstényeket elkülönítve tartottuk.
Laparotomiát végeztünk aszeptikus körülmények között Metafane anaesthesiában (metoxi-fluorán, CVet Ltd., Bury St. Edmunds). A méhszarvakat vagy középső ventrális vagy bilaterális metszésből tártuk fel. Injekciókat adtunk vagy a kürt végébe a tubo-uterinális találkozásnál vagy a méhszarv alapjánál az uterocervivális találkozásnál. Ismételt vizsgálatok azt mutatták, hogy az utóbbi technika biztosította a legjobb eljárást a beadásra, de bizonyos célokra az előbbi előnyösebb, ha a reproduktív traktus megzavarásának minimalizálása szükséges.
Liposzóma/DNS (pcDNA szerkezeti β-galaktozidáz reportergén), csak DNS vagy kontrolloldat- (25-100 μΐ) injekciókat adtunk egy lapos Stratatip hegyének beszúrásával a szarv alapjához. Előzőleg az oldatokat a tű hegyéhez húztuk Travesty felrakóeszköz segítségével, amit felhasználtunk az oldat szarvba való lassú befecskendezésének szabályozására is.
Az injekció beadása után a metszést megszakított matracöltésekkel zártuk, és az egereket visszaengedtük a ketreceikbe, ételt és italt szabadon fogyaszthattak.
Plazmidszerkezetek
A jelen találmányban (a példák során) ismertetett plazmidok alapja a kereskedelemben elérhető pcDNA3 vektor (Katalógusszám: V790-20, Invitrogen, San Diego, California, USA). A pcDNA3 plazmidot reportergén nélkül negatív kontrollként használtuk. A pcDNA3^gal, pcDNA3-CAT és pcDNA3-Luc kísérleti plazmidok sorrendben β-galaktozidáz, klór6
HU 221 204 Β1 amfenikol-acetil-transzferáz és luciferáz reportergéneket tartalmaznak. Ezek a plazmidok a következő genetikus elemeket tartalmazzák: ampicillin-rezisztenciagén, ColEl replikációs origó, CMV-promoter, [reportergén], poliA marha-növekedésifaktor addíciós helye, fi replikációs origó, SV40 replikációs origó, neomicinrezisztenciagén, és egy SV40 poliA addíciós helye, melyek olyan operábilis kapcsolatban vannak, hogy a reportergén termelhető legyen az eukarióta sejtben a plazmid bejuttatása következtében. A plazmid DNS-t lúgos lízissel megtisztítottuk E. colitól, majd Qiagen ioncserélő oszlopon tovább tisztítottuk (a gyártók instrukciói szerint).
Liposzóma-előállitás
Az alkalmazott liposzóma egy DOPSA (2,3 dioleiloxi-N-[2-(spermin-karboxamido)-etil]-N-N-dimetil-lpropán-aminium-trifluor-acetát) és DOPE (dioleoilfoszfatidil-etanol-amin) 3:1 tömegarányú keveréket tartalmazó lipidkészítmény (Lipofect-AMINE; Gibco BRL Paisley, Scotland). Számos DNS: lipid arányt és különböző injekciótérfogatokat használtunk, amint azt az 1. táblázat mutatja. A DNS-t és liposzómákat minden esetben közvetlenül a kísérlet előtt kevertük össze. 10 pl DNS-oldatot adagoltunk 10μ1 lipidoldathoz, óvatosan összekevertük, és 15 percre szobahőmérsékleten hagytuk. 80 μΐ PBS-t adtunk hozzá, hogy a DNS és lipid végső koncentrációja az 1. táblázat szerinti legyen. Majd ezt injektáltuk az álterhes egerek méhébe (lásd a fenti részt az egerekre és a sebészi eljárásra vonatkozólag).
A $-galaktozidás hisztokémiai lokalizációja
Az állatokat szén-dioxid belélegeztetéssel elöltük, és a méhszarvakat zsírtól és mesenteriumtól mentesen eltávolítottuk. Mindegyik szarvat 3 metszetre osztottunk, a felső és alsó metszetet folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk, és -70 °C-on tároltuk a β-galaktozidáztartalom kvantitatív meghatározása előtt. Minden méhszarv középső szeletét PBS-ben oldott 1,25% glutáraldehidben fixáltuk 15 percig, PBS-ben kétszer átmostuk, és X-gal festőoldatba helyeztük (1 mg/ml Xgal, 5 mM K3Fe(CN)6, 5 nM K4Fe(CN)6, 2 mM MgCl2, 0,02% NP40, és 0,01% nátrium-deoxikolát) 24 órára szobahőmérsékleten. A szeleteket PBS/3% DMSO-ban (2x5 perc), 70% etanolban (3x5 perc) átmostuk, és 100% etanolba tettük. A szöveteket glikol-metakrilátgyantába beágyaztuk, és 7 pm-es metszeteket vágtunk belőle, és mikroszkópos vizsgálat előtt neutrálvörössel megfestettük.
Eredmények
Az alábbi 1. táblázat bemutatja a különböző alkalmazott körülményeket, és a méhmetszetek kapott festődési intenzitását a DNS/liposzóma komplexek beadása után. A táblázatban szereplő eredmények demonstrálják a plazmid DNS beadási idejének kritikus voltát, mivel a 2. napon adagolva a legjobbak az expressziós szintek, a 3. napon beadva elfogadható szintet kapunk, de a
4. napon beadva a reportergén már nagyon kis mértékben expresszálódik, vélhetőleg azért, mert az endometriumsejtek nem veszik föl az anyagot ebben az időpontban nem teljesen világos okoknál fogva.
1. táblázat
A beadás napja (boncolás napja) DNS (pg/ml) Lipid (pg/ml) Injektált mennyiség (pl) Hiszto- kémiai fertőzés intenzitása
2(5) 2 20 50 + +
3(5) 2 20 50 + +
4(6) 2 20 50 -
2(6) 2 20 50 + ++
2(5) 8 20 20 + +
4(6) 8 20 50 -
4(6) 30 20 50 +
4(6) 2 60 50
A festődés intenzitása: + + + erős, ++ közepes, + gyenge
- nem festődött.
Kontrollok
Egy injekcióban nem részesült egér az álterhesség
6. napján vett méhmetszete nem mutatott β-galaktozidázaktivitáson alapuló festődést.
Egy álterhes egér (beadás a 2. napon, boncolás a 6. napon) 50 μΐ β-galaktozidázmentes pcDNA3-t (2 pg/ml) és lipidet (20 pg/ml) tartalmazó injekciót kapott; a méhe nem mutatott β-galaktozidázaktivitáson alapuló festődést.
Az X-gal festést követő hisztológiai metszetvizsgálatok azt mutatták, hogy a glanduláris epithelium erősen festődött, és a luminális epithelium ugyancsak festődött, de kevésbé erősen. Optimális festődés azon állatoknál volt észlelhető, amelyeket az álterhességük 2. napján 50 μΐ 2 pg/ml koncentrációjú DNS és 20 pg/ml koncentrációjú lipid keverékével transzfektáltunk. Az 1A ábra egy ilyen állatból vett metszetet mutat, míg az 1B ábra egy kontrollállatból származó metszetet mutat, amelyik (azonos körülmények között) β-val - génmentes plazmidot kapott.
2. példa
Primer humán endometriumkultúrák transzfekciója
Bemutatjuk továbbá, hogy a humán endometrium epithelsejtjei in vitro nagy hatékonysággal transzfektálhatók.
A már ismertetettekkel azonos plazmidot (pcDNA3^-galaktozidáz-reportergén) és lipidet használtunk. Az endometriumsejteket Smith és Kelly szerint (Smith és munkatársai, 1987 Prostaglandius 34, 553-561) preparáltuk. A kultúra létrejötte után a következő transzfekciós protokollt alkalmaztuk. DNS-t (2 pg) és liposzómát (8 pg) 1000 pl szérummentes közegben (Opti-MEM 1 BRL) hígítottunk, kevertünk és szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltunk. Ezután további 800 pl Opti-MEM-l-et adtunk hozzá. A sejteket (24 lyukú tányérban) PBS-sel átmostuk, majd OptiMEM-1-gyei is átmostuk. A DNS/liposzóma keveréket (0,5 ml) hozzáadtuk sejtekhez, és 37 °C-on 3 órán át CO2-inkubátorban inkubáltuk, majd 0,5 ml 20% fötális borjúszérumot tartalmazó kultúra közeget adtunk hoz7
HU 221 204 Β1 zá. A sejteket fixáltuk, (0,1% glutáraldehid), átmostuk és X-gal-lal festettük 24 órával a transzfekció után.
Ez a munka bemutatja, hogy a gének átvihetők az endometriumra in vivő és ez az endometrium (és placenta) számos különböző állapotában felhasználható lesz, például a beágyazódás elősegítésére mind állatban, mind emberben, a beágyazódás megakadályozására (azaz fogamzásgátlásra), endometriozisban és menorrhagiában, hyperplasia és adenocarcinoma esetén.
További adatokat nyertünk a tisztított humán méhnyálkahártya sejtek in vitro transzfekciójával kapcsolatban. Ez kiegészíti az in vivő egérkísérletet, és bemutatja, hogy hasonló sejtek kultúrában töltött minimális idő után hatékonyan transzfektálhatók ugyanazon liposzómákkal és DNS-ekkel, amelyeket in vivő használtunk.
3. példa
Humán méhnyálkahártya in vitro transzfekciója
Humán primer endometriumból származó epithelsejteket izoláltunk és kultúrában szaporítottuk Zhang és munkatársai (J. Cell Science, 1995; 108:323-331) eljárása szerint. A sejteket standard 6 lyukú szövetkultúralemezekre helyeztük, hogy 50%-os összefolyási sűrűséget érjünk el a következő napon. A sejtek 5 napot töltöttek a kultúrában, majd átkerültek 24 lyukú lemezekre 600 000 sejt/lyuk sűrűségben. A következő napon a sejteket DNS/liposzóma komplexekkel (DNA/LC) transzferáltuk. Ez az alábbiak szerint történt:
Transzfekciós eljárás
Eszközök
LipofectAMINE (Gibco Katalógusszám: 18324012),
Opti MÉM 1 (Gibco Katalógusszám: 51985-018) lyukú kultúraedény
Sejtkultúraközeg Zhang és munkatársai szerint (fentiekben citálva)
Ez a következőkből áll: DMEM/HEPES, 10% FCS, 30 pg/ml endotheliumsejt-növekedési kiegészítő anyag (Sigma Katalógusszám: E-27599), 90 pg/ml heparin (Sigma Katalógusszám: H-3149), 5 pg/ml gentamycin (Sigma Katalógusszám: G-1272) és 1 pg/ml fugizon (Gibco Katalógusszám: 15290-018). Használtunk továbbá Mg++-, Ca++-mentes PBS-t és egy 2 mles Eppendorf-csövet.
Két különböző plazmidszerkezetet használtunk, amelyek különböző reportergéneket tartalmaztak. A pcDNA3CAT-t az Invitrogen Corporationtól szereztük be, ez klór-amfenikol-acetil-transzferáz-enzimet kódoló reportergént tartalmaz. A másik pcDNA3Iuc plazmid ugyanazt a vektort tartalmazza, de a CAT-gén helyett a szentjánosbogár-luciferázenzimet kódoló gént. A vektorok DNS-készítményeinek széles skáláját állítottuk elő Qiagen midipreprendszer segítségével. Negatív kontrollként reportergént nem tartalmazó pcDNA3-t alkalmaztunk.
DNS/Liposzöma komplexek előállítása
1. A oldat
Hígítsunk 1 pg DNS-t 100 μΐ OptiMEM-I-ben egy Eppendorf-csőben. 1 pg/ml végső koncentrációjú DNS-t a transzfekciós közegben.
2. B oldat
Hígítsunk 4 μΐ LipofectAMINE-t 100μ1 OptiMEMI-ben egy Eppendorf-csőben. 8 pg/ml végső koncentrációjú LipofectAMINE-t használjunk a transzfekciós közegben.
3. Egyesítsük az A és B oldatokat egy új csőben, és óvatosan keverjük össze tartalmukat.
4. Inkubáljuk szobahőmérsékleten 15 percig.
A sejtek átmosása
1. A transzfekció előtt mossuk át nagyjából a sejtegyréteget háromszor szérummentes FRISS PGS-sel.
2. Újra mossuk át kétszer a sejt-egyréteget kétszer OptiMEM I-gyel.
Transzfekció
1. Adjunk 800 μΐ (összmennyiség 1,0 ml) OptiMEM-et mindegyik DNS-lipid keveréket tartalmazó csőhöz. A DNS végső koncentrációja 1 pg/ml és a LipofectAMINE koncentrációja 8 pg/ml.
2. Távolítsuk el az OptiMEM-I-et a sejt-egyrétegről.
3. Keverjük óvatosan a DNS/LC keveréket, és helyezzük a hígított komplexoldatot az átmosott sejtekre, 0,5 ml/24 lyuk.
4. Inkubáljuk a sejt-egyréteget 3 órán át 37 °C-on egy C02-inkubátorban,
További sejtkultúra
1. 3 óra múlva távolítsuk el a transzfekciós keveréket, és adjunk 2 ml Zhang-közeget mindegyik lyukba, és folytassuk a tenyésztést.
Kvantitatív vizsgálat
A transzfekció után 24-48 óra múlva a sejteket extraháltuk, és megfelelő módon CAT- vagy luciferázreporter-aktivitást vizsgáltunk az alábbiak szerint.
1. A sejteket háromszor PBS-ben mostuk át.
2. A sejteket 300 μΐ Lysis pufferrel (Promega Katalógusszám: E-3871) extraháltuk, majd a sejteket óvatosan Eppendorf-csőbe kapartuk be.
3. Az extraktumot -70 °C-on gyorsfagyasztottuk, és a vizsgálatig tároltuk.
4. A vizsgálathoz az extraktumot engedtük felolvadni és 13 000 g-vel centrifugáltuk 5 percig.
5. A fagyasztás/felengedés/centrifugálás folyamatot még egyszer megismételtük.
6. A luciferázreportergén-aktivitást Luciferase assay kit (Tropix) felhasználásával (Katalógusszám: BC100 L) vizsgáltuk. 40 μΐ-t használtunk mindegyik extraktumhoz tubusonként.
7. A CAT-reportergén-aktivitást Quan-t-CAT kit (Amersham) (Katalógusszám: TRK 1012) segítségével mértük.
Eredmények
A primer endometrium epithelsejteket 24 lyukú lemezen transzfektáltuk a fent ismertetett módon. A transzfekciót tripla lyukakban pcDNA3-mal kontroll, pcDNACAT-tal és pcDNA3LUC-cal végeztük. 48 óra múlva a sejteket összegyűjtöttük és vizsgáltuk a luciferáz- vagy CAT-aktivitást.
A CAT-enzim katalizálja az acetilcsoport átvitelét az acetil-koenzim A-ról a klór-amfenikolra. Tríciumos acetil-koenzim használata a radioaktív jelzés átvitelét
HU 221 204 Bl eredményezi a klór-amfenikolra. Egy mintában a CATaktivitás egyenesen arányos a képződött tríciumos klóramfenikol mennyiségével. Az eredményeket ezért leütés/perc/cső értékben fejeztük ki. Standard görbét készíthetünk tisztított CAT ismert mennyiségeit tartalmazó lízispuffer felhasználásával.
Az eredményeket a 3. ábra mutatja, ami egy oszlopgrafikon, melyen az átlag ±sem-értékek láthatók, amelyeket az egyes kísérletek háromszori mérésével kaptunk. Az eredmények numerikus formáját alább mutatjuk be, ahol a CAT-aktivitás a pcDNA3CAT-tal kezelt sejtekben 6-szor magasabb, mint a kontrollmintákban, ami az endometriumsejtek sikeres transzfekcióját igazolja.
pcDNA3 pcDNA3CAT
710 4480
616 4134
662 3234 átlag 662+271 3951+372
A luciferáz vizsgálata esetén a luciferáztartalmú sejtextraktumot kevertük össze a szubsztrátjával, a luciferinnel, ami fénykibocsátást eredményez. A fényjel intenzitása arányos a kivonatban levő luciferázenzimmel, és luminométerrel mérhető. A kezdeti eredményeket relatív fényegységekben adtuk meg.
Az eredményeket a 4. ábra mutatja, ami egy oszlopgrafikon, amin az egyes kísérletek háromszori elvégzésével kapott átlag±sem-értékeket ábrázoljuk. Az eredmények numerikus megjelenítése szerint a pcDNA3LUCcal kezelt sejtekből származó jel 30-szor magasabb volt, mint a kontrollminták háttéijele, ami ugyancsak az endometriumsejt sikeres transzfekcióját igazolja.
Példák az endometriális géntranszfer lehetséges módjaira
Legalább két különböző típusú génszerkezet transzfektálható az endometriumba különböző hatások variációinak elérésére. Ezen különböző típusok mindegyikét sorban ismertetjük.
1. Citokinek és növekedési faktorok többlettermelése
Ezek elvileg a legegyszerűbb formái azon szerkezeteknek, amelyek az elgondolások szerint a citokin vagy növekedési faktor többlettermelését okozhatják a méhepithelium-sejtekben. Ilyen túltermeltetésre alkalmas cDNS-ekre példák azok, amelyek LIF, VEGF, EGF, CSF, TNF amfiregulin és különböző interleukinek és kolóniastimuláló faktorok valamelyikét kódolják. Ezekről kimutatott, hogy természetes módon termelődnek az endometriumban, és feltételezések szerint fontos szerepet töltenek be az endometrium működésének szabályozásában [Stewart és munkatársai, 1992, Natúré, 359, 76-79; Camock-Jones és munkatársai, 1994, Journal of Reproduction and Fertility, 101, 421-426; Chamock-Jones és munkatársai, 1993, Biology of Reproduction, 48, 1120-1128; Das és munkatársai, 91995, Molecular Endocrinology, 9, 691-; Tabibzadeh 1994, Humán Reproduction Update, 9, 947-967]. Ezen szerek mindegyike a reproduktív funkció különböző szakaszaiban hat, beleértve a beágyazódást, véredények kifejlődését, és a leukociták biológiáját. így ezen szerkezetek alkalmazásának lehetséges indikációi lennének a termékenység javítása, különösen lábasjószágoknál vagy fogamzásgátlás emberben és háziállatokban, valamint különböző menstruációs zavarok kezelése emberben.
Kísérleti példa lábasjószág fertilitásának fokozására
Kimutatott, hogy LIF szükséges a beágyazódás folyamatához (Stewart és munkatársai, 1992, fentiekben citálva). Ezt a faktort az endometrium termeli a beágyazódás időszakában. így lehetséges, hogy olyan fajoknál, amelyeknél az embrionális veszteség aránya magas, az endometrium LIF-termelésszintjének emelésével a beágyazódás idején ez a veszteségarány csökkenthető. Ezért olyan génszerkezet transzfekciója, amely az endometrium LIF-szintézisének szabályozására irányul a beágyazódás idején, javíthatja a termékenységi mutatókat ilyen fajoknál. Az endometriumba bejuttatott génszerkezeteknek olyan szabályozószekvenciákat kellene tartalmazniuk, amelyek biztosítják, hogy a LIF-protein a megfelelő időben termelődjék. Valószínű, hogy ez elérhető a szóban forgó fajból származó LIF-gén promoterjének felhasználásával.
Nők menstruációs zavarainak enyhítését célzó kezelések is elképzelhetők endometrium-géntranszfer felhasználásával. Erre szolgáló példa lenne a véredények fejlődésének megváltoztatása az endometriumban angiogén növekedési faktorokat például VEGF-t kódoló gén transzfekciójával. A VEGF-termelés helyi növekedésétől várható, hogy a kapillárisok növekedése fokozódik, és ezáltal elősegíti az endometrium vastagodását. Továbbá a megnövekedett VEGF-szintek elősegíthetik a kapillárisok újraképződését menstruáció után, és így megváltoztatják az ilyen típusú szerkezettel kezelt páciensek vérzési rendjét.
2. Receptorok többlettermelése
A méhepithelium által termelt receptorok számának és típusainak növelése az elvárások szerint szignifikáns biológiai következményekkel járna. A receptortípusok, amelyek többlettermelése kívánatos lehet - de nem kizárólag - a növekedési faktor és citokinreceptorok például EGF, TGFa, FEBF és különböző kolóniastimuláló faktorok és interleukinek. Szteroidhormon-receptorok ugyancsak expresszálhatók az epitheliumsejtekben. Ilyen transzfekciók várhatóan hasznosak abban az esetben, ha termékenység fokozása, fogamzásgátlás, menstruációs zavarok kezelése és „árva” receptorok funkciójának megvilágítása a cél („árva” receptorok azok a receptorok, amelyek ligandumja jelenleg nem azonosított). Az „árva” receptorok a gyógyszeripar nagy érdeklődésre számot tartó területét reprezentálják, minthogy a ligandum meghatározása új gyógyszer-generációhoz vezethet.
Egyre inkább felismerhetővé válik, hogy az endometrium fejlődése olyan komplex folyamat, amelyet sok citokin és receptoraik kölcsönhatása befolyásol, és hogy az ovariális szteroidok stimuláló hatásai gyakran ezen citokineken keresztül érvényesülnek. Kimutatták (Nelson és munkatársai, 1992, Endocrinology, 131,
HU 221 204 Β1
1657-1644), hogy a TGFa az ösztrogén hatás potenciális mediátora egérméhben. Ezért ezen faktor szintézisét vezérlő szerkezetek transzfekciójától várható, hogy elősegíti az endometrium növekedését és így növeli a fertilitást olyan esetekben, amelyekben a méhnyálkahártya fejlődése nem volt megfelelő. Hasonló módon ettől a faktortól várható, hogy elősegíti a méhnyálkahártyafelszín helyreállítását menstruáció után, így hasznos lehet menorrhagia kezelésében.
A szteroidhormon-receptorok nagy családjának számos tagjánál a ligandum jelenleg ismeretlen. Ilyen cDNS-ek transzfekciója az endometriumba igen hatékony lehet ezen receptorok biológiai funkciójának felderítésében, így alkalmazást nyerhet olyan új gyógyászati szerek kutatásában, amelyek ezen receptorok révén hatnak. (Evans, 1988, Science 240, 889-895).
3. Citokin növekedési faktorok és más hormonok hatásának blokkolására vagy megelőzésére szolgáló szerkezetek transzfekciója
Citokinek és növekedési faktorok természetes antagonistáinak transzfekciója lehetőséget nyújt az endometrium működésének befolyásolására. Egy példa az ilyen antagonisták közül az interleukin-1 receptorantagonista (Hannum és munkatársai, 1990, Natúré 343, 336). Ezen protein alkalmazása a kimutatások szerint megakadályozta a terhességet egérben (Simon és munkatársai, 1994, Endocrinology, 134, 521-528). A citokinek és növekedési faktorok további természetes antagonistái a szolubilis receptorok. Szolubilis receptorokat írtak le különböző növekedési faktor/citokin rendszerekben. Például: TNF (Englemann és munkatársai, 1990, J. Bioi. Chem. 265, 14497-14504), FGF (Givol és munkatársai, 91992, FASEB Journal, 6, 3362-3369), PDGF (Tiesman & Hart, 1993, J. Bioi. Chem. 268, 9621-9628) és IL-6 (Novick és munkatársai, 3989, J. Exp. Med. 170, 1409-1414). Általános jellemző, hogy a receptor extracelluláris ligandumkötő helye a sejtből szabadon szolubilizálódó faktorként szabadul fel. Ez vagy proteolízissel érhető el, vagy alternatív kapcsolással, ami egy csonka proteinmolekulát hoz létre, ami a membránok közti és intracelluláris területeken hiányzik. Kendall és Thomas (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10705-10709) a VEGF-receptor fit egy szolubilis variánsát ismerteti. Ez a protein képes volt a VEGF hatásának blokkolására in vitro. Mi három további olyan cDNS-t izoláltunk, amelyek további szolubilis variánsokat kódolnak (lásd PCT/GB95/01213). Ezen természetes szerek használata számos előnnyel jár a többi antagonistákhoz képest (például anti-VEGF-antitestek). Minthogy a természetben előfordulnak a testben, várható, hogy nem provokálnak immunválaszt és jól tolerálhatóak. Ugyancsak, minthogy a membránhoz kötött receptorból származnak, kötődési tulajdonságaik nagyon hasonlóak lesznek, és így hatékonyan versenyeznek a ligandumért. Lehetséges, hogy más szolubilis receptorok is léteznek a természetben vagy in vitro létrehozhatók. Ugyancsak valószínű, hogy ha a szteroidhormon-receptorcsalád egy tagjának ligandumkötő területe expresszálódott, ez domináns negatív receptorként hathat, amennyiben versenyezni fog a ligandumért, ha a sejtben elég nagy mértékben termelődött. Másrészt egy nem aktiválódó, de DNS-kötő receptor felhasználható lenne géntranszkripció blokkolására. Ez az alkalmazás hasznos lenne természetes szteroidok hatásának antagonizálására, beleértve azokat, amelyek az „árva” receptorok még azonosítatlan ligandumjai (Pemrick és munkatársai, 1994 Leukémia 8, 1797-1806). A hét membránok közti receptorcsalád hiányos receptorait megjelölve ezek előállíthatok és transzfektálhatók lehetnek.
A szolubilis interleukin-1 receptorantagonista (Eisenberg és munkatársai, 1990 Natúré 343, 341) a kimutatások szerint antagonizálja az IL-1 hatásait in vivő (Simon és munkatársai 1994 Endocrinology 134, 521-528). így az endometrium transzfekciója antagonista szintézist irányító cDNS-szerkezettel várhatóan megakadályozza a vemhességet egérben.
Más, a növekedési faktort vagy citokinhatást antagonizáló megfelelő faktorok közé tartoznak a természetes receptorok szolubilis variánsai, például a VEGF-receptor fit szolubilis variánsai, amelyet Kendall és Thomas (19983, fentiekben citálva) és Boocock és munkatársai (1995. J. Natl. Cancer Ins. 87, 506-516) ismertetnek. Ezen faktorok helyi termeléséről az várható, hogy antagonizálják a VEGF hatásait és hasznos terápiás alkalmazást nyújthatnak olyan esetekben, amelyekre az endothelsejtek hiperproliferációja jellemző, például különböző menstruációs zavarokban, ahol az endometrium kapillárissűrűségének csökkentése kívánatos. Idetartoznak malignusmegbetegedések is.
4. Antiszenszeljárások használata egy specifikus protein (vagy enzim) helyi termelésének megelőzésére
A citokinek, növekedési faktorok és hormonok hatásának blokkolására egy alternatív megközelítést nyújtana az antiszensz- vagy ribozimtechnológia vagy ligandumtermelés, vagy a receptorok termelésének blokkolására a megfelelő sejtekben (James, 1991, Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 2, 191-214; Albert & Morris, 1994, Trends in Pharmacological Sciences 15, 250-254).
Az antiszensztechnológia egy úgynevezett antiszensz oligonukleotid vagy polinukleotid kötésén alapszik egy celluláris mRNS-hez. Ez a kötés megakadályozza ezen mRNS transzlációját, így csökkenti a sejt által termelt megfelelő proteinmennyiséget. Mind a szintetikus oligonukleotidokat, mind a poliribonukleotidokat sikeresen alkalmazták erre a célra. Liposzóma közvetítette oligonukleotid-transzfekció vagy olyan liposzóma közvetítette DNS-szerkezet-transzfekció, amely hosszabb antiszensz poliribonukleotidok szintézist irányítja, várhatóan specifikusan és szelektíven csökkenti a transzfektált sejtek proteintermelését. A ribozimek ugyancsak megelőzik a proteintermelést a szóban forgó specifikus proteint kódoló RNS szelektív hasítása révén. Ezek ugyancsak transzfektálhatók mint poliribonukleotidok vagy mint DNS-szerkezetek, amelyek ilyen polinukleotidok szintézisét irányítják (lásd James 1991 és Albert & Morris 1994, mindkettő a fentiekben citálva). Például antiszensz ribozim fogamzásgátlóként való felhasználása a következőképpen történhet. Ismert,
HU 221 204 Β1 hogy a LIF szükséges a beágyazódás folyamatához emlősterhességben (Stewart és munkatársai, 1992, korábban citálva). Ezért akár olyan oligonukleotidok akár DNS-szerkezetek transzfekciójától, amelyek LIF mRNS elleni antiszensz poliribonukleotidok vagy riboszómák szintézisét irányítják, várható ezen faktor előállításának gátlása. Ezen faktor hiánya beágyazódási rendellenességhez fog vezetni, így a fogamzás gátlódik.
Hasonló eljárás alkalmazható az angiogén (érképző) növekedési faktorok, például a VEGF termelésének gátlásához, ami megakadályozza a tumor növekedéséhez szükséges endothelsejt-proliferációt. így ez a kezelési mód különösen előnyös malignusbetegség terápiájában.
5. Immunglobulinok és fragmentumok helyi termelése
A modem rekombináns DNS-technológia felhasználható olyan egyláncú antitestek előállítására, amelyek kötődési tulajdonságai csaknem azonosak azon teljes monoklonális antitestével, amelyből származnak. Ilyen egyláncú antitesteket sikeresen termeltettek baktériumokkal (He és munkatársai, 91995 Immunology 84, 662-668). Elvileg lehetséges olyan szerkezet előállítása, amelyik egy egyláncú antitest termelését irányítja és megjeleníti azt epithelsejtekben. Ha ez az endometriumban történne in vivő, várhatóan a szteroidhormon elleni egyláncú antitestek a szteroidhoz kötődnének és megakadályoznák az epithelsejtekre kifejtett hatásukat. Ilyen antitestre példa a DB3 antiprogeszteron monoklonális antitestből származó egyláncú antitest (He és munkatársai, 1995, fentiekben citálva). Ha ilyen antitest a méhüregbe szekretálódna, az megkötné a progeszteront is, és máshol is kifejthetné hatását a méhben. Az endometriumban hatékonynak ismert növekedési faktorok és citokinek ellen irányuló antitestek hasonló módon megakadályozhatnák hatásukat, ha helyileg így termelődnének.
A helyileg termelődő egyláncú antitestek további alkalmazási lehetősége lenne a szexuális úton terjedő betegségek megelőzése és kezelése. Ebben az esetben a szóban forgó kórokozó elleni antitestek (például papillomavírus, HÍV, chlamydia) a méhüregbe szekretálódva kivédenék a szóban forgó kórokozóval történő fertőződést. Spermium vagy oocita elleni antitestek várhatóan szerepet játszhatnak fogamzásgátlóként.
6. Nyálkahártyái immunitást előidéző aktív immunizálás
Helyi immunitás kifejlesztésére felhasználható további eljárás lenne olyan szerkezetek tervezése, amelyek egy antigén szekrécióját az üregbe irányítanák. Ez helyi immunválaszt idézne elő, így helyi specifikus nyálkahártyái immunitást érnénk el. Evek óta ismert (Howe, 1967 Journal of Reproduction and Fertility 13, 563-566), hogy a méhüregben számos leukocita van. Lehetséges, hogy a transzfektált endometriumsejtek által termelt antigént felveszik ezen leukociták, majd kialakul a nyálkahártyái immunválasz. Az antigének bélüregbe történő felszabadulása ilyen immunitást eredményez, és néhány esetben igen hatékonynak mutatkozik (például poliomyelitis elleni vakcináció).
7. Patogének kapcsolódási helyének blokkolása
Kórokozók nyálkahártyafelszínhez történő kapcsolódása gyakran elengedhetetlenül feltétele a fertőzés létrejöttének. így a patogének ezen helyekhez történő kapcsolódásának blokkolása módot ad ember vagy állat fertőződésének kivédésre, különösen a szexuális úton terjedő betegségek esetén. Ez nemcsak bakteriális kórokozókra vonatkozik (mint az E. coli és N. gonorrhoea egyes patogén törzsei), hanem virális kórokozókra is. Sok vírus a sejt fertőzése során egy sejtfelszíni receptorhoz kötődik. Szolubilis receptorok helyi termelése várhatóan versengést hoz létre a sejtfelszíni molekulákkal, így kivédi a vírusinfekciót. Egyenértékű, ha a sejtfelszíni receptorokat vírusmimetikummal (úgy hat, mint a vírus „ligandumja”) telítjük, azaz így is meggátolható a fertőzés kialakulása, valamint specifikus immunglobulinok vagy azok hatékony kötőrészeinek helyi termelésével.

Claims (22)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Nukleinsav alkalmazása nőnemű emberi személy reproduktív traktusa legalább néhány sejtjének a nukleinsavval történő transzfektálására alkalmas gyógyszer előállítására.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, az ovulációt követő időszakban addig az ideig történő bejuttatásra alkalmas gyógyszer előállítására, amíg a progeszteron szintje a vérben ugyanazon menstruációs ciklusban csúcsot ér el, ahol az időszak az időpontot is magában foglalja.
  3. 3. Nukleinsav alkalmazása nőnemű emlős reproduktív traktusa legalább néhány sejtjének a nukleinsavval történő transzfektálására, az ovulációt követő időszakban addig az időpontig történő bejuttatásra alkalmas gyógyszer előállítására, amíg a progeszteron szintje a vérben ugyanazon menstruációs ciklusban csúcsot ér el, ahol az időszak az időpontot is magában foglalja.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az alkalmazott nukleinsav endometriumsejtekbe történő bejuttatásra alkalmas.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az alkalmazott nukleinsav endometrium glanduláris epitéliumába történő bejuttatásra alkalmas.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az alkalmazott nukleinsav DNS.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az alkalmazott nukleinsav Eposzoméban, vírusban vagy más vivőrészecskében történő bejuttatásra alkalmas.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az alkalmazott nukleinsav plazmidként vagy más szerkezetként történő bejuttatásra alkalmas.
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az alkalmazott nukleinsav eukarióta sejtben átírandó szekvenciához működőképesen kapcsolt promotert tartalmaz.
    HU 221 204 Β1
  10. 10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az alkalmazott promoter indukálható.
  11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az alkalmazott nukleinsavszekvencia promoterhez működőképesen kapcsolt antiszensz irányítottságú részt tartalmaz a polipeptidtermelés meggátlása céljából azon sejtekben, amelyekbe történő bejuttatásra a szekvencia alkalmas.
  12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsavszekvencia a kezelt egyén termékenységének megváltoztatására alkalmas.
  13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsav citokin vagy növekedési faktor legalább egy hatékony része expressziójának irányítására alkalmas.
  14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsav az alábbiak bármelyike legalább egy hatékony része expressziójának irányítására alkalmas: interleukin; leukémia-inhibitorfaktor (LIF); vasculáris endotheliális növekedési faktor (VEGF); epiderurális növekedési faktor (EGF); heparinkötő epidermális növekedési faktor (HBEGF); inzulinkötő növekedési faktor I és II (IGF-I és IGF—II); amphiregulin; kolóniastimuláló faktor (CSF); tumor necrosis faktor (TNF); hepatocita növekedési faktor (HGF); és fibroblaszt növekedési faktor (FGF).
  15. 15. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsav citokinantagonista vagy növekedésifaktor-antagonista legalább egy hatékony része expressziójának irányítására alkalmas.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsav interleukin-1 receptorantagonista vagy az alábbiak közül egy szolubilis receptora expressziójának irányítására alkalmas: transzformáló növekedési hormon (TGF)a; fibroblaszt növekedési faktort (FGF); trombocitából származó növekedési faktor (PDGF); interleukin-6; vasculáris endotheliális növekedési faktor (VEGF); vagy hepatocita növekedési faktor („Met receptor).
  17. 17. Az 1 -12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsav növekedési faktor, citokin vagy szteroidhormon-receptor legalább egy hatékony részének a sejtben és/vagy a sejtfelszínen történő expressziójának irányítására alkalmas.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsav az alábbiak receptorának legalább egy hatékony része irányítására alkalmas: EGF, transzformáló növekedési faktor (TGF)a vagy VEGF.
  19. 19. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsav helyi immunológiai hatással rendelkező polipeptid legalább egy hatékony része expressziójának irányítására alkalmas.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsav kórokozó antigénje legalább egy hatékony része expressziójának irányítására alkalmas.
  21. 21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsav az alábbi polipeptidek legalább egy immunogén része expressziójának irányítására alkalmas: HÍV, papillomavírusok, Chlamydia vagy N. gonorrhoea.
  22. 22. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a bejuttatott nukleinsav immunglobulin vagy egy hatékony része expressziójának irányítására alkalmas.
HU9702205A 1994-12-24 1995-12-21 Use of nucleic acid for production of pharmaceuticals with tranfecting effect of nucleic acid on female mammals reproductive tract HU221204B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9426380.3A GB9426380D0 (en) 1994-12-24 1994-12-24 Regulation of endometrial function by in vivo gene transfer
GBGB9520879.9A GB9520879D0 (en) 1994-12-24 1995-10-12 Improvements in or relating to endometrial function
PCT/GB1995/003008 WO1996020013A1 (en) 1994-12-24 1995-12-21 Improvements in or relating to endometrial function

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT77338A HUT77338A (hu) 1998-03-30
HU221204B1 true HU221204B1 (en) 2002-08-28

Family

ID=26306279

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9702205A HU221204B1 (en) 1994-12-24 1995-12-21 Use of nucleic acid for production of pharmaceuticals with tranfecting effect of nucleic acid on female mammals reproductive tract

Country Status (23)

Country Link
US (2) US6472374B1 (hu)
EP (1) EP0799058B1 (hu)
JP (2) JPH10511548A (hu)
KR (1) KR20050052548A (hu)
CN (1) CN1241646C (hu)
AT (1) ATE234637T1 (hu)
AU (1) AU712278B2 (hu)
BG (1) BG63332B1 (hu)
BR (1) BR9510408A (hu)
CA (1) CA2208446A1 (hu)
CZ (1) CZ293770B6 (hu)
DE (1) DE69530001T2 (hu)
DK (1) DK0799058T3 (hu)
EE (1) EE03955B1 (hu)
ES (1) ES2323909T3 (hu)
HU (1) HU221204B1 (hu)
MX (1) MX9704765A (hu)
NO (1) NO320436B1 (hu)
NZ (1) NZ297537A (hu)
PL (1) PL192784B1 (hu)
PT (1) PT799058E (hu)
SK (1) SK284119B6 (hu)
WO (1) WO1996020013A1 (hu)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6777639B2 (en) 2002-06-12 2004-08-17 Nanotechnologies, Inc. Radial pulsed arc discharge gun for synthesizing nanopowders
US7704965B2 (en) 2002-06-26 2010-04-27 The Penn State Research Foundation Methods and materials for treating human papillomavirus infections
US7012214B2 (en) * 2003-09-24 2006-03-14 Nanotechnologies, Inc. Nanopowder synthesis using pulsed arc discharge and applied magnetic field
WO2005047483A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Medical Research Council Renta: an hiv immunogen and uses thereof
CA2654324A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 International Aids Vaccine Initiative Hiv-1 clade a consensus sequences, antigens, and transgenes
WO2007146106A2 (en) * 2006-06-05 2007-12-21 Cryo- Cell International, Inc. Procurement, isolation and cryopreservation of maternal placental cells
US20080050814A1 (en) * 2006-06-05 2008-02-28 Cryo-Cell International, Inc. Procurement, isolation and cryopreservation of fetal placental cells
EP2550362B1 (en) 2010-03-25 2017-01-04 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
WO2012149038A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Advanced Bioscience Laboratories, Inc. Truncated hiv envelope proteins (env), methods and compositions related thereto
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
WO2013093629A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Modular vaccines, methods and compositions related thereto
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
US9347065B2 (en) 2012-03-29 2016-05-24 International Aids Vaccine Initiative Methods to improve vector expression and genetic stability
EP2679596B1 (en) 2012-06-27 2017-04-12 International Aids Vaccine Initiative HIV-1 env glycoprotein variant
WO2014040025A2 (en) 2012-09-10 2014-03-13 International Aids Vaccine Initiative Immunogens of hiv-1 broadly neutralizing antibodies, methods of generation and uses thereof
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
US10093720B2 (en) 2014-06-11 2018-10-09 International Aids Vaccine Initiative Broadly neutralizing antibody and uses thereof
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
US9925258B2 (en) 2015-10-02 2018-03-27 International Aids Vaccine Initiative Replication-competent VSV-HIV Env vaccines
KR101802090B1 (ko) 2016-09-26 2017-11-27 서울대학교산학협력단 탈락막 자궁내막 세포를 포함하는 자궁내막 손상의 치료용 조성물
BR112022009421A2 (pt) 2019-11-14 2022-10-25 Aelix Therapeutics S L Regimes de dosagem para vacinas
TW202146427A (zh) 2020-02-21 2021-12-16 美商國際愛滋病疫苗開發股份有限公司 用於預防冠狀病毒疾病的疫苗組合物
CN112458161A (zh) * 2020-11-12 2021-03-09 深圳市锦欣医疗科技创新中心有限公司 一组子宫内膜容受性生物标志物、试剂盒及判断子宫内膜容受性的方法
KR20220083029A (ko) * 2020-12-11 2022-06-20 주식회사 커스토젠 자궁내막 비후용 약학적 조성물

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5858784A (en) * 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
WO1994005782A1 (en) * 1992-09-10 1994-03-17 Trustees Of Tufts College In vivo production of transgenic organ by introducing the transgene via lumen
GB9410534D0 (en) 1994-05-26 1994-07-13 Lynxvale Ltd Improvements in or relating to growth factor inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
MX9704765A (es) 1998-02-28
CA2208446A1 (en) 1996-07-04
DE69530001D1 (de) 2003-04-24
CN1174508A (zh) 1998-02-25
NO972935D0 (no) 1997-06-23
ATE234637T1 (de) 2003-04-15
SK284119B6 (sk) 2004-09-08
ES2323909T3 (es) 2009-07-27
EE03955B1 (et) 2003-02-17
CZ293770B6 (cs) 2004-07-14
NO320436B1 (no) 2005-12-05
PT799058E (pt) 2003-11-28
HUT77338A (hu) 1998-03-30
NO972935L (no) 1997-08-22
US20030186907A1 (en) 2003-10-02
BG63332B1 (bg) 2001-10-31
JP2006124402A (ja) 2006-05-18
AU4270796A (en) 1996-07-19
CZ191797A3 (cs) 1998-06-17
DE69530001T2 (de) 2004-06-03
US6472374B1 (en) 2002-10-29
EP0799058A1 (en) 1997-10-08
NZ297537A (en) 2000-04-28
BG101714A (en) 1998-03-31
JPH10511548A (ja) 1998-11-10
PL324088A1 (en) 1998-05-11
BR9510408A (pt) 1998-11-10
CN1241646C (zh) 2006-02-15
WO1996020013A1 (en) 1996-07-04
PL192784B1 (pl) 2006-12-29
DK0799058T3 (da) 2003-11-24
KR20050052548A (ko) 2005-06-02
SK80197A3 (en) 1998-04-08
EP0799058B1 (en) 2003-03-19
AU712278B2 (en) 1999-11-04
EE9700133A (et) 1997-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU221204B1 (en) Use of nucleic acid for production of pharmaceuticals with tranfecting effect of nucleic acid on female mammals reproductive tract
Croy et al. Can murine uterine natural killer cells give insights into the pathogenesis of preeclampsia?
MXPA97004765A (en) Improvements in or that are related to the endometr function
Chowdhury et al. The expression of angiogenic growth factors and their receptors in ovarian follicles throughout the estrous cycle in the ewe
Boos et al. Immunohistochemical assessment of progesterone, oestrogen and glucocorticoid receptors in bovine placentomes during pregnancy, induced parturition, and after birth with or without retention of fetal membranes
JP2012184273A (ja) レラキシンのアゴニストまたはアンタゴニストの投与によるアポトーシスを調節する方法
US9534034B2 (en) Methods of modulating apoptosis by administration of relaxin agonists or antagonists
Wang et al. The UCMSC-bFGF/scaffold system accelerates the healing of the uterine full-thickness injury
US20120046228A1 (en) Methods for Modulating Ovulation
KR100582915B1 (ko) 자궁내막기능또는자궁내막기능과관련된기능의개선방법
US20020177574A1 (en) Endometrial gene therapy
AU2002211855A1 (en) Methods of modulating apoptosis by administration of relaxin agonists or antagonists
Van Nguyen Roles of colony stimulating factor-1 in mammary gland development and transforming growth factor-β3 in mammary gland involution
Grieco et al. Session 61–Female Fertility/Basic

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees