CZ191797A3

CZ191797A3 - Použití nukleové kyseliny pro výrobu farmaceutického prostředku a prostředek s jejím obsahem

Info

Publication number: CZ191797A3
Application number: CZ971917A
Authority: CZ
Inventors: David Stephen Charnock-Jones; Stephen Kevin Smith; Andrew Mark Sharkey; Robert Brian Heap
Original assignee: Cambridge University Technical Services Limited
Priority date: 1994-12-24
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 1998-06-17
Also published as: MX9704765A; CA2208446A1; DE69530001D1; CN1174508A; NO972935D0; ATE234637T1; SK284119B6; ES2323909T3; EE03955B1; CZ293770B6; NO320436B1; PT799058E; HUT77338A; NO972935L; US20030186907A1; BG63332B1; JP2006124402A; AU4270796A; DE69530001T2; US6472374B1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití nukleové kyseliny . pro výrobu farmaceutického prostředku a prostředku s jejím obsahem.

Dosavadní stav techniky

Fyziologie endometria.

Pro zachycení embrya v.děloze savce musí být splněny dva: základní požadavky: za prvé, endometrium se musí připravit tak, aby bylo vnímavé na přítomnost blastocysty, která se pak může implantovat. Implantovaná blastocysta se vyživuje prostřednictvím tvořící se placenty; a za druhé, je nutnézklidnění myometriální aktivity, což umožní blastocystě) zachytit se v dutině dělohy, aniž by došlo k jejímu vypuzení. Oba tyto požadavky řídí hormony, které se vylučují během těhotenství, z nichž zvláště důležité jsou estrogeny a progesteron. Tyto steroidní hormony působí na endometrium a myometrium prostřednictvím receptorů, které se nacházejí v jádru cílových buněk. Po aktivaci, komplex steroidního hormónu navázaného na jaderný receptor reaguje se specifickými oblastmi DNK za účelem stimulace, potlačení nebo aktivace genů, které kóduií Droteiny a polypeptidy, jako jsou enzymy nebo růstové faktory.

Implantace se spouští kaskádou biochemických a biofyzikálních změn. V ranných stádiích zachycení blastocysty na stěnu dělohy se uplatňuje adheze molekul (například CAM 105) . Blastocysta a endometrium přejímají různé triky za účelem vylepšení bezprostředního styku mezí zárodečnou a • ·· « * ·· mateřskou tkání. U kopytnatců trofoblasty, které tvoří zevní vrstvu blastocystů, migrují do epitelu dělohy, se kterým následně fúzují. Migrace.buněk u žen pokročila, protože to nejsou pouze izolované nebo určité typy buněk, které migrují, ale velké plochy trofoblastů, jenž pronikají mezi epiteliální buňky dělohy. S ohledem na to, některé trofoblasty fúzují dohromady za vzniku syncycia. Tento proces probíhá velmi rychle a embryo se zachytí v děloze, aniž dojde .k zjevné degeneraci děložního epitelu. U některých biologických druhů se proces implantace zpožďuje, buď se čeká na podnět prostředí, aby se mládě narodilo v nejvhodnější dobu roku, nebo tento proces ovlivňují fyziologické faktory, jako je laktace, kdy matka před dalším těhotenstvím přestane kojit..

Příprava dělohy pro proces implantace se řídí vylučováním hormonů z vaječníku. Transport oplodněného vajíčka vejcovodem musí být přesně načasován, aby dorazilo do dělohy v přesný okamžik svého vývoje a v době, kdy děloha je připravena ho přijmout. Po většinu doby je děloha pro embryo nepřátelská, ve skutečnosti více nepřátelská než jiné části těla. Epiteliální' výstelka dělohy po většinu času odolává zachycení a invazi trofoblastů a pouze za velmi přesné hladiny hormonů se tato rezistence uvolní.

Nespářené myši a krysy nemají celý estrálhí cyklus, protože netvoří normální sekreční žluté tělísko, které produkuje zvýšené množství progesteronu. Jestliže se tato zvířata páří v estrusu, to znamená v čase, kdy vaječníkový folikul, ze kterého se uvolňuj.e vajíčko, vylučuje vysokou b 1 aH i nn ů o h ζίλ/ύλ» Λ ττ τ», - 4— X £ λ 1 ·Χ 1 -. - 1 — ——_Λ .IX

X* J_u*%-*^.** V* χ,υ Xi. v iiLiOUq aúA..LqilU J_ kJ J- J. Λ. Ll X CL úC VyLVUil žluté tělísko a vylučuje se zvýšující se koncentrace progesteronu, dojde k implantaci a začíná fáze těhotenství (délka 21 dnů). Jestliže dojde k neplodnému páření, projeví se podobné rysy, ale žluté tělísko přetrvává pouze 11 dnů a fáze pseudotěhotenství se zkrátí.

• ··· * · · • * * ·

4·« «' ··· ···*

Endometriálni buněčné a biochemické změny se nejvíce studovaly u myší a krys. Každým rokem přibývá informací o těchto problémech. Endometrium všech biologických druhů se skládá ze tří hlavních tkání: luminální epitel, glandulární epitel a trámčina. K proliferaci buněk těchto tří tkání dochází v různém čase. Luminální buňky proliřerují právě před obdobím estrusu a tento proces ovlivňuje-zvyšujícíse hladina estrogenů, které- produkují folikula ve vaječní cích. První den. těhotenství (u hlodavců den kopulace) zvířata zastavily množení, ale třetí den přichází druhá, menší, vlna aktivity. Čtvrtý den jsou aktivní glandulární buňky, ale pak jich ubývat Buňky “sťř'dmá'ťU se do^-čťVřt eho dne nemnož'í~ al^_ě paťy den pod vlivem progesteronu dosahují vysokého stupně proliferace. V případě žen se o těchto změnách, které jsou předzvěstí procesu implantace, ví málo. Je však známo, že k vrcholu proliferace epiteliálních buněk dochází během folikulární fáze cyklu a u buněk stromatu během lutéální nebo sekreční fáze, stejně jako je tomu u myší a krys.

Důvod, proč dochází k endometriálni buněčné proliferaci, není zcela znám. Věří se, že příprava děložní sliznice na implantaci zvýšením počtu buněk má nutriční a sekreční funkci (glandulární epitel) a že se podílí na velmi časné fázi tvorby placenty (decidualizace) . Nezbytnou podmínkou úspěšné e·’ implantace je, že mitóza buněk musí vést k diferenciaci buněk, a proto mitóza hraje rozhodující úlohu v počátku těhotenství. Důkaz, který podporuje . tuto úlohu je endometriálni produkce růstových faktorů (mitogenů), cytokinů a jaderných onkogenů. Řada těchto látek se produkuje ve zvýšených koncentracích jako odezva na hormony produkované vaječníky, které působí prostřednictvím svých receptorů.

Velká . pozornost se věnuje epidermálnímu růstovému faktoru (EGF), epidermálnímu růstovému faktoru, který váže heparin (HBEGF), amfiregulinu a růstovým faktorům, které váží * v • · · ·· ♦ · • * · » · ·♦ • · |l* · v insulin (IGF-I a IGF-II). Experimenty na myších prokázaly důležitou úlohu lokálního (parakrinální) působení nejméně jednoho z těchto růstových faktorů, amfiregulinu. Inhibice specifického genu pro implantaci a genu řízeného progesteronem pro amfiregulin se dosáhlo pomocí antiprogestinu, RU486. Tato inhibice brání implantaci (Das et al., Molecular Endocrinology 9, 691-705, 1995).

Z genové studie se zjistilo,' že cytokiny, inhibiční faktor leukémie (LIF) a colonie stimulující faktor (CSF), které produkuje děloha myší během implantace, jsou nepostradatelné. Což ukazuje, že při odstranění těchto fá-kto'rů^— nedochází—k-normá-lnl-mu—průběhu—i-mpi-a-n-taee—a—t-vo-rby placenty (Stewart et al. Nátuře 359, 76-79, 1992; Pollard et al., Developmental Biology 148,'273-283, 1991).

V případě jaderných onkogenů se v děloze po aplikaci estrogenu zvýší hladina c-jun a c-fos (což jsou časné indikátory transkripce genu). Tyto onkogeny se inhibují progesteronem.

Mezi různými biologickými druhy existují- důležité rozdíly v rozsahu invaze trofoblastu v době implantace. U žen je časný trofoblast vysoce invazivní, zatímco u prasat, které vykazují neinvazivní formu implantace, endometriální epitel není během tří .měsíční lhůty těhotenství nikdy porušen.

*··

Výskyt poruch implantace je u obou biologických druhů vysoký, dosahuje okolo 60 respektive 30%. Důvody pro toto vysoké procento poruch jsou komplexní a nejsou zcela vysvětleny. U žen, přibližně jedna polovina ztrát je způsobena genetickými abnormalitami, ale v případě prasat, stejně je tomu i u jiných kopytníků, kde ztráty jsou také vysoké, genetické defekty tvoří pouze několik procent.

Sekrece progesteronu u žen po poruše implantace způsobuje krvácení jako na konci normálního menstruačního cyklu; tento jev se neobjevuje u většiny jiných zvířat.

··

Poruchy menstruace stejně jako implantace jsou běžné. Navíc menstruační krvácení, které je důsledkem následující hormonální terapie ; nebo se spojuje s nepřetržitou kombinovanou hormon nahrazující léčbou nebo s dlouhodobě působící antikoncepcí obsahující pouze progestin, je podstatná příčina nemocí u žen. Cíly zjistit příčiny tohoto krváceni se podřídila řada současných studií, které se zaobírají biochemickými (např. prostaglandiny, enzymy, polypeptidy a proteiny, vazoaktivní sloučeniny, jako jsou faktor aktivující krevní destičky PAF a vaskulární endoteliální růstový faktor VEGF) a buněčnými mechanizmy ^-Chapf'íkTa-d—ďo—ndělOhy—mřgrujrcí—buňky;——které—produkuj-íimunosupresivní. sloučeniny).

Současná snaha porozumět reproduktivním procesům se většinou zaměřuje na řízení produkce steroidních hormonů, a působení těchto hormonů na cílové tkáně. Avšak parakrinální a autokrinální faktory se stále více jeví bytí klíčovými prostředníky reprodukce, ačkoli dochází k jejich interakci-se steroidy (Benton, 1991 Current Opinion in Cell Biology 3, 171-175; Rozengurt, 1992 Current Opinion in Cell Biology 4, 161-165; Tartakovsky et al., 1991 Developmeňtal Biology 146, 345-352; Robertson et al., 1992 Current Opinion ín Immunology

4, 585-590; Smith, 1994 Human Reproduction 9, 936-946; a , *·· Tabibzadeh, 1994 Human Reproduction 9, 947-967). -Nejjasnější příklad tohoto jevu je možné spatřit u myší, kterým se odstranily vaječníky. V tomto modelu jedna dávka estradiolu způsobuje růst dělohy. Tento účinek se může blokovat antiTGFa protilátkami (TGF je transformační růstový faktor)/ což naznačuje, že mitogenní účinky estrogenu v této tkáni jsou zprostředkovány faktorem TGFa (Nelson et al., 1992

Endocrinology 131, 1657—1664) .

Následně většina zásahů medicíny je z velké části založena na steroidní/antisteroidní regulaci dělohy (Yen &

«

9

Jaffe, 1991 v Reproductive endocrinology, Eds. Yen, Jaffe & Benton, Puto. WB Saunders, Philadelphie; Baird, 1993 British Medical Bulletin 49, 73-87). Navzdory nepochybnému úspěchu tohoto přístupu, v posledních 20-ti letech nedošlo k žádným koncepčním vylepšením způsobu antikoncepce, nenašly se 2působy jak zlepšit implantaci, jak podpořit růst placenty a nedošlo k vývoji nových přístupů pro léčení benigních gynekologických onemocnění (poruchy menstruace a fibroidy).

Řada publikací se týká použití metody přenosu genů u savců za účelem změnit genotyp alespoň některých buněk v _Urči-té-t-káni—nebo-tkáních—Zejména-u—1-i-dí—se-ap-l-i-kuj-e—genová— terapie. Cílem této léčby je u recipienta překonat genetické nedostatky pomocí exprese polypeptidů kódovaných zavedenými sekvencemi nukleové kyseliny. Metodu genové terapie lze například použít tímto způsobem, sekvence DNK (začleněné do virových vektorů) se zavedly do dýchacích cest pacientů z cystickou fibrózou tak, že dojde ke změně fenotypu alespoň některých epiteliálních buněk, které tvoří výstelku dýchacího traktu pacientů. Navzdory možnostem vhodných metod existují nepublikované pokusy o zavedení DNK do endometria savců.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří použití nukleové kyseliny pro výrobu farmaceutického prostředku pro změnu jednoho nebo více charakteristických znaků alespoň některých buněk rozmnožovacího ústrojí jedince savce.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž prostředek pro změnu jednoho nebo více charakteristických znaků alespoň některých buněk rozmnožovacího ústrojí jedince savce.

«» *· · ··· • *«, <

• · \ ·♦

Ψ F· • · « · • ♦ «· ·* * « « • · · ·· ♦·

Tento vynález nemůže být v žádném případě pokládán za rozšíření metod genové terapie, o nichž se ví, že jsou alespoň částečně úspěšné, když se aplikují do plic pacientů z cystickou fibrózou. Vzhledem k tomu, že se neuvažuje, že by nedědičné genetické poruchy byly odpovědné za libovolnou ze známých onemocnění endometria, pro odborníky neexistují žádné stimuly pro aplikaci metod genové terapie v případě endometria. Dále epitel endometria je odlišný (kuboidální .epitel.,—ep i.t e l_odvo z ený—z—ep i.t e lu—coe 1 omu)—od—ep i-t e lu—p líc (který je vyhladověn) a proto se nedá předpovědět, zda se bude chovat analogickým způsobem. U primátů dochází k cyklickému odpadávání endometriálního epitelu, při kterém dochází ke ztrátám libovolných transfektováných buněk. Vynálezce zjistil, že při aplikaci metod genové terapie nedochází k přenosu vnesené DNK do orgánů matky ani do placenty embrya. Kdyby k tomuto přenosu došlo, mohlo by to způsobit praktické obtíže.

Ve většině případů je nukleová kyselina vnesena do samice savce (raději Ženy) a zejména do jejích endometriálních buněk. Vhodná nukleová kyselina se vnese do glandulárního epitelu endometria. Nukleová kyselina může kódovat polypeptid, který se už v buňkách, do kterých se « β V Φ « · « · * · .

.»» ·· ♦·· ···· · nukleová kyselina vnáší, přirozeně syntetizuje. Pak dojde ke zvýšení exprese polypeptidu prostřednictvím účinku dávky genu. V jiném případě se metoda může použít pro vyvolání exprese polypeptidu v buňkách, kde se před tím zmíněný polypeptid nesyntetizoval. Polypeptid může být například umělý rekombinantní polypeptid, který se v přírodě nevyskytuje, jako je chimérický polypeptid obsahující zcela nebo částečně funkční doménu ze dvou nebo více různých proteinů.

Z nukleových kyselin se pro tyto účely upřednostňuje DNK, ale lze použít i RNK (buď negativní nebo pozitivní řetězec) . Antisense molekula může v BUnJřačK; So KtěřySh s'e vnesla, inhibovat nebo jinak interferovat s expresí polypeptidu. Vnesenou sekvencí nukleové kyseliny může být antisense RNK nebo DNK sekvence, která vnitrobuněčně řídí syntézu antisense RNK. Další způsob, jak dosáhnout takové inhibice, je zavést do buněk sekvenci, která řídí syntézu ribozómu, jenž pak bude specificky štěpit mRNK potřebnou pro syntézu polypeptidu, jehož exprese se má inhibovat.

Vynálezce zjistil, že doba aplikace nukleové kyseliny (vzhledem k fázi rozmnožovacího cyklu) vysoce ovlivňuje účinnost přijetí nukleové kyseliny. Vynálezce dále zjistil, že pro dosažení optimálního stupně přijetí aplikované nukleové kyseliny je nezbytné, aby se aplikace provedla v období po ovulaci, do dne a včetně dne, kdy je v krvi nejvyšší hladina progesteronu. K čemuž v normálním případě dochází přibližně ve stejnou dobu, jako je okamžik implantace zárodku, je-li přítomen v děloze.

Dále například vynálezce zjistil, že maximálního příjmu aplikované DNK, v případě myšího endometria, lze dosáhnout druhý až třetí den cyklu (den jedna je den, kdy se poprvé určí vaginální zátka). U lidí k ovulaci obyčejně dochází čtrnáctý den cyklu a implantace se objevuje uprostřed * ·♦ • ♦ ««» ·· luteální fáze (ačkoli u lidí se těžko určuje přesná doba ovulace).

Nukleová kyselina se může aplikovat v holé formě nebo může být vázaná na nebo spojená s jinými látkami (například liposomy). Běžný způsob, kterým se nukleová kyselina zavádí do buněk příjemce, který je savec, je jednoduchá transfekce (s nebo bez liposomů), jenž je podle vynálezce překvapivě účinná. Přičemž sekvence nemusí být začleněna do virového vektoru. Virové vektory jsou použitelné, zvláště ty, které mohou být cíleny do určitých buněčných typů (například jak se uvádí v WO 93/20221).

Nukleová kyselina šě může vňešt do buňky j~a)ío čas't konstrukce (například plazmidu, kozmidu a podobně) . Tato konstrukce obsahuje promotor, který je u savců funkční a způsobuje transkripci alespoň části zavedené nukleové kyseliny. Promotor může být konstituční, přednost se dává indukovatelnému promotoru, který umožňuje lepší kontrolu exprese vnesené sekvence.

U jedné určité metody podle vynálezu zavedeni molekuly nukleové kyseliny, do endometriálních buněk samic savců v

umožňuje snížení nebo zvýšení plodnosti. Vynález popisuje způsob antikoncepce u domácích zvířat (například koček a psů), Čímž se předchází narození nechtěných mláďat. Další provedení vynálezu poskytuje způsob zvýšení plodnosti chovných zvířat, jako jsou prasata, dobytek, ovce a podobně.

Nukleová kyselina se do rozmnožovacího ústrojí zavádí vaginální cestou. Tento způsob nevyžaduje invazivní chirurgický zásah. Avšak, jestliže je to nutné, nukleová kyselina se může zavést chirurgicky přímo do rozmnožovacího ústrojí (například do dělohy). Vynález umožňuje změnit jeden nebo více charakteristických rysů zavedením velkého počtu sekvencí různých nukleových kyselin.

sekvence zavedená do (přednostně při vysoké

V jednom provedení vynálezu rozmnožovacího ústrojí řídí expresy hladině) účinné Časti cytokinů nebo růstového faktoru¹ (účinná část je ta část molekuly, která zajišťuje biologickou aktivitu spojenou s celkem, například navázání specifického ligandů atd.). Příklady takových polypeptidů, které se mohou vznikat expresí zavedené sekvence, jsou například: interleukiny, inhibiční faktor leukémie (LIF), vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), epidermální růstový faktor. (EGF), epidermální růstový faktor vázající heparin (HBEGF), růstové faktory I a II vázající inzulín (IGF-I a IGF-II), amfiregulin, kolonie stimulující faktor (CSF) a faktor nekrózy nádoru (TNF).

V jiném provedení vynálezu Zavedená sekvence může řídit expresi účinné části antagonisty cytokinů nebo růstového faktoru, jako jsou antagonista receptorů IL-1. Je výhodné, aby antagonista byl rozpustný receptor, který je rozeznáván cytokinem nebo růstovým faktorem. Vhodné příklady zahrnují rozpustné receptory, které jsou rozeznávány transformačním růstovým faktorem ..(TGF) a, fibroblastovým růstovým faktorem (FGF), růstovým faktorem získaným z krevních destiček (PDGF), interleukinem-6 (IL-β) a VEGF.

V jiném provedení vynálezu zavedená sekvence*·může řídit expresi účinné oblasti, polypeptidů, který má imunologický účinek. Polypeptid může mít imunogenní aktivitu, čímž slouží ke stimulaci lokální imunní odezvy. Vynález se pak dá využít pro nový způsob imunizace. Je výhodné, aby imunogenní peptid kiwi ant - non 7 m,iVA7ní bn ns Mnonn íbi tuh 1 aro Ί rhv rirnt· ΐ 1 áhi&lr — J — —.w— .. — J.— -„-,-, - - — — J -------v rozmnožovacím ústrojí pomocí běžného mukózního imunního systému může vést k tvorbě odpovídajících protilátek v distálních mukózních místech, jako jsou gastrointestinální trakt, respirační trakt, slzné žlázy a podobně. Výhodnější však je, když antigen je jeden z patogenů, které napadají

a/nebo kolonizují rozmnožovací ústrojí. Takovým typickým patogenem je ten, který způsobuje pohlavně přenosné choroby. Příklady zahrnují viry, jako jsou HIV a papilomaviry (například HPV různých typů), chlamydíe a bakterie (například W. gonorrhoea}. Polypeptid, který má imunologický účinek, je imunoglobin nebo jeho účinná část (jako Fab, Fv, nebo scFv fragment nebo jeden řetězec protilátek). Imunoglobin nebo jeho účinná část může směřovat proti patogenu (proti těm, které jsou shora zmiňovány) nebo může směřovat proti některému jinému antigenu, jako je například steroidní nebo jiný hormon. Imunoglobiny nebo jejich fragmenty se mohou exprimovat místně a tak poskytuj”! ochranu protři oňěmocn'ěn'í· nebo regulují plodnost.

V dalších provedení vynálezu zavedená sekvence může řídit expresy polypeptidů nebo jeho účinné části, který může ovlivňovat menstruaci.

V jiném provedení .vynálezu zavedená nukleová¹ kyselina řídí expresy účinné části molekul receptoru na povrchu buněk rozmnožovacího ústrojí. Receptor může být receptorem pro cytokin, steroidní. hormon nebo růstový faktor (jako je EGF receptor, receptor TGFa nebo receptor VEGF). Řada známých receptorů se popisuje jako sirotčí receptory (orphan receptors) , kde ligand, který se váže na receptor «-není znám. Takový sirotčí receptor má význam pro farmaceutický průmysl, protože může být novým cílem pro nové léčebné a profylaktické Sloučeniny.

Vynález dále popisuje způsob charakterizující biologické vlastnosti polypeptidů, který obsahuje zavedenou sekvenci kódující polypeptid. Tento způsob charakterizuje polypeptid v buňkách rozmnožovacího ústrojí savců a určuje účinky exprimovaného polypeptidů. V tomto případě se upřednostňuje, aby savcem bylo laboratorní zvíře, jako je myš nebo krysa. Je vhodné, aby charakterizovaný polypeptid byl sirotčí receptor ·· ····

« » «

« · * » a je typické, že součástí charkterizace bude identifikace jeho ligandu. Obecně lze říct, že tento způsob zahrnuje analýzu histologických laboratorního zvířete, libovolné z sekcí, které se a jejich zpracování standardních metod různých histochemické barvení, hybridizace in sítu, barvení atd.).

nabízí další způsob, regulace, endometriální získaly z za použití (například imunologické

Vynález steroidními hormony, rozmnožovací kapacity nebo plodnosti} my nez funkce (a tím i a to- pomocí přenosu genu in vivo. Pro tyto účely' se vytvořily genové konstrukce, které specificky modulují působení cytokinů. Čehož se může dosáhnout různými způsoby. Například u buněk, které produkují vylučovaný cytokin, se může zabránit syntéze faktoru blokací transkripci a translace použitím promotoru, jenž řídí antisense konstrukce nebo ribozómy. V jiném případě se působení vylučovaného· faktoru může blokovat antagonisty receptorů. Přirozeně se vyskytující rozpustné receptory mohou odklidit a neutralizovat bioaktivní ligand, čímž působí jako konkurenční antagonista receptorů. Existují také přirození antagonisty receptorů například ILIRa (antagonista receptorů interleukinu-1). Interperitonální aplikace tohoto proteinu blokuje u myší implantaci blastocysty (Simon et_a„ al., 1994 citace uvedena na jiném místě).

Existují důkazy, které potvrzují, že rozpustné růstové faktory vylučované epitelem vejcovodu a dělohy mohou řídit vývoj embrya savce před implantací přímým působením přes receptory exprimované na embryu (Pampfer et al., 1990· In Vitro Cellular and Developmental Biology 26, 944-948). Na druhou stranu vyvíjející se embryo produkuje růstové faktory, které mohou působit autokrinalním způsobem nebo mohou působit na endometrium a tak ovlivnit schopnost přijmout embryo. Například u myší se LIF exprese (z mateřské tkáně) v *♦· · » * • ·· *·· ··«· glandulárním epitelu ve čtvrtý den, právě v čase před implantací, silně zvyšuje. . LIF je schopen působit na blastocysty před implantací, které exprimují LIF receptor (LIF-R). Tato exprese LIF u matky je potřebná pro implantaci,

LIF se embryo nebude dostanou do fáze

1992, citace na jiném potom u myší zničených produkcí implantovat, ačkoli myši se pseudotěhotenství (Stewart et al., místě).

Vynálezce nyní zahrnul do tohoto výzkum i lidi a pomocí RT-PCR ukázal, že lidská embrya exprimuj! mRNK kódující LIFR, ale samy LIF neexprimují. LIF působí prostřednictvím vazby ~ňa receptor LIF-R š ňižkou afinitou. K vazbě š vysokouafinitou dochází, když komplex LIF/LIF-R reaguje se signálním transdukujícím přídavným proteinem- gpl30. Lidská embrya také obsahují mRNK kódující tento protein (Sharkey et al., 1995 Biology of Reproduction 53, 955-962). Vynálezci také dokázali, že vylučování LIF v lidském glandulárním epitelu se reguluje steroidy. K maximální sekreci dochází v luteální fázi (přibližně v době očekávané implantace (Charnock-Jones et al., 1994 citace na jiném místě)). Uvádí se, že aplikace LIF na lidská embrya in vitro ve fázi před implantací podporuje jeho další vývoj. Tento důkaz podporuje teorii, že LIF hraje důležitou úlohu při implantaci u lidí, „stejně jako to je u myší. Je zřejmé, že cytokiny mohou zprostředkovat důležité spojení mezi embryem, které se nachází v lumenu dělohy, a endometriem (v obouch směrech). Tento vynález umožňuje použití způsobu přenosu genu za účelem přerušení nebo zesílení tohoto spojení, což vede k novým způsobům antikoncepce nebo naopak podporuje implantaci.

Nej aktuálnější studie parakrinální a autokrinální regulace funkce rozmnožování se omezují na popisnou analýzu v důsledku nedostatku účinných' metod pro modulaci místní hladiny cytokin/receptor. Důkaz uvedený v této přihlášce

Μ ·»♦· ukazuje, že lze provést transfekci děložního epitelu ín vitro. To umožňuje expedimentovat s endometriem a nabízí to nové léčebné přístupy. Dále uvedená práce popisuje použití reportního genu za účelem demonstrace použitelnosti způsobu in vivo přenosu genu do dělohy. V praxi se použije gen (nebo další konstrukce DNK), který je schopen změnit funkci dělohy. Jako příklady lze uvést antagonisty receptorů (například ILlRa, receptory rozaznatelné VEGF atd.), přirozené' nebo modifikované cytokiny a růstové faktory, inhibitory proteázy nebo steroidní receptory a ' varianty rybozómu a antisense konstrukce. Tato práce ukazuje, že geny se mohou přenášet do endometria in vivo a to se dá využít v různých stavech endometria (a placenty), například ke zlepšení implantace u zvířat a lidí,' k přerušení implantace' (jako· antikoncepce), u endometriózy a menoragie, hyperplázii a u adenokarcinomu.

Když.jsme použily námi vyvinuté protokoly, získaly jsme výsledky, které jsou dále popsány. · Výsledky naznačují,, že konstrukce genů se mohou do endometria přenášet způsobem in vivo a in vitro, přičemž dochází k transkripci (i translaci) těchto produktů.

Přehled obrázků na výkrese

6‘·

Obrázek č.: IA a 1B ukazuje fotomikrograf histologických sekcí myšího endometria transfektovaného (A) konstrukcí plazmidu řídící expresi β-galaktozidázového reportního genu nebo (B) podobným plazmidem bez reportního genu. Transfektované buňky se mohou zcela jasně určit podle intenzity zabarvení cytoplazmy (modrá barva). Buňky v části B se neobarví.

Na obrázku č.:2 je fotomikrograf lidských endometriálních buněk in vitro, které jsou transformovány stejným plazmidem jako na obrázku IA. Tmavé (modré) zabarvení ··· · • * *

• · «·· Η * ·· · • ··· · způsobené expresí reportního genu se spojuje se zbývající glandulární strukturou, zatímco okolní buňky se obarvily slaběji;

Na obrázku č.: 3 je znázorněn graf ukazující výsledky CAT testu (počet ve zkumavce) endometriálních buněk, které se úspěšně transfektovaly genem kódujícím chloramfenikolovou transferázu (pcDNA3CAT) ve· srovnání s buňkami transfektovanými kontrolním plazmidem (pcDNA);

Obrázek č.: 4 zobrazuje graf s výsledky luciferázového testu (relativní jednotky světla) endometriálních buněk, které se úspěšně transfektovaly genem kódující luciferázu (pcDNA3LUC) ve srovnání s buňkami transfektovanými kontrolním plazmidem (pcDNA) .

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Myši

Myši BALB/cJ, které ještě neměly mláďata, se přechovávaly za podmínek: 14 hodin světla, 10 hodin tma,· světlo se zhasínalo ve 20.00 hodin; při teplotě 22^cC;krmily se myší a krysí stravou (Labsure; Christopher Hill Group, Poole, Dorset, UK) . Myši strávily jednu noc dohromady se a'· samci stejného druhu, kteří prodělali vázektomii. Příští ráno se určovalo, zda samice mají vaginální zátku. Předpokládá se, že k páření došlo ve dvě hodiny v noci. Čas 0 a den 1 se počítá jako den, kdy se poprvé objevila vaginální zátka. Spařené myší samice se před dalšími experimenty separovaly.

Laparotomie probíhala za aseptických podmínek pod anestezí metafanem (metoxyfluoran, C.Vet Ltd., Bury St, Edmunds). Roh dělohy se odkryl naříznutím na střední straně břicha nebo na jeho obou stranách. Injektáž se provedla buď na špičce rohu dělohy, kde vstupuje do dělohy vejcovod, nebo na spodině rohu dělohy, kde se na dělohu napojuje děložní « · · · · čípek. Opakované studie ukazují, že metoda uvedená jako druhá je nej lepší způsob aplikace, ale z nějakých důvodů ta předchozí metoda je preferovaná v případech, kdy je nezbytné minimalizovat porušení rozmnožovacího ústrojí.

i

Injektáž komplexu liposom/DNK (konstrukce pcDNA, + /-βgalaktozidázový reportní gen), samotné DNK nebo kontrolních roztoků (25 až 100 μΐ) proběhla, tak, že špička ploché mikropipety Stratatip se zavedla do spodiny rohu dělohy. Roztoky byly před tím zavedeny do špičky aplikátorem Travesty, který se také užíval k řízení pomalé aplikace roztoků do rohu dělohy. _; __

Po injekci se řez uzavřel za použiti přerušovaných šitových stehů a myši se nechaly zotavit v klecích. Dostaly potravu a vodu podle libosti.

Plazmidové konstrukce.

Plazmidy popsané v této přihlášce (způsobem příkladu) jsou založeny na běžně dostupném vektoru pcDNA3 (Katalog, č.: V790-20, Invitrogen, San Diego,· California, USA). Plazmid pcDNA3, který nenese reportní gen, se použil jako negativní kontrola. Experimentální plazmidy. pcDNA3^gal, pcDNA3-CAT a pcDNA3-Luc obsahují β-galaKtozidázový, chloramfenikolacetyltransferázový a luciferázový reportní gen. Tyto plazmidy obsahují následující genové elementy; gen nesoucí rezistenci na ampicilin, počátek replikace ColEl, CMV promotor, (reportní gen), polyA adiční místo hovězího růstového hormonu, počátek replikace fl, počátek replikace viru SV40, gen nesoucí rezistenci na neomycin a polyA adiční místo viru SV40·. Tyto elementy jsou v .takovém vztahu, že reportní gen se může po zavedení plazmidu exprimovat v eukaryontních buňkách. Plazmidová DNK se může získat z E.coli ««· · alkalickou lyží a dále se může čistit na ionexové koloně Qiagen (podle postupu doporučeným výrobcem).

Příprava liposomů

Zde používané liposomy jsou směsí 3:1 (hmotnost/hmotnost) lipidové formulace DOPSA (2,3-dioleyloxyN-[2 (sperminkarboxamido) etyll-N-N-dimetyl-l-propanaminium trifluoroacetát) a DOPE :(dioleoylfosfatidylatanolamin). (LipofectAMINE; Gibco BRL Paisley, Scotland), V tabulce č. 1 se uvádí použité poměry počtu DNK ku lipidům a různé objemy TnřýělíčiT DŇK a íiposomy se smíchaly bezprostředně před použitím v experimentu. 10μ1 roztoku DNK se přidalo k 10μ1 roztoku lipidů/ směs se jemně zamíchala a nechala, se stát při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Dále se přidalo 80μ1 PBS, konečná koncentrace:DNK a lipidů je uvedena v tabulce 1. Tato směs se pak injekcí zavedla do dělohy pseudotěhotných myší. (nahlédni do předchozí sekce, kde jsou uvedeny podrobnosti, o myších a chirurgickém zákroku).

>

Histochemická lokalizace β-galaktozidázy

Zvířata se usmrtila vdechováním oxidu uhličitého a oddělily se rohy dělohy, očistily se od tuku a okruží. Každý roh se rozdělil na 3 části. Horní a spodní část se zamrazily v kapalném dusíku a před kvantifikací obsahu β-galaktozidázy se uložily do ~7Q°C. Střední část každého rohu dělohy se fixovala i, 25 % glutaraldehydem v roztoku PBS po dobu 15 minut, dvakrát se promyla pufrem PBS a ponořila se do roztoku určeného pro X-gal barvení (1 mg/ml X-gal, 5 mM K₄Fe(CN)₆, 2mM MgCl₂, 0,02 % NP40 a 0,01 % deoxycholát sodný) na dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Sekce se pak promyly v roztoku PBS s 3% DMSO (po dobu dvakrát 5 minut) , 70 % etanolem (po • * * ♦ ·· • · » · · 9 9 9 · · · · • * * Í dobu třikrát 5 minut) a umístily se do 100 % etanolu. Tkáně se zapustily do glykolmetakrylátové pryskyřice a nařezaly se 7 pm silné části a před mikroskopickým pozorováním se obarvily neutrální červení.

Výsledky

Tabulka č. 1 ukazuje různé podmínky, při kterých probíhaly experimenty, a výslednou intenzitu barvení částí dělohy po aplikaci komplexů DNK/liposomy. Výsledky uvedené v tabulce ukazují důležitost· načasování aplikace plazmidové DNKt—'Je'sťri^_ž'e^_~apli^_ka'ce—probrěltta—druhý—deng—do-s-áh-řo—senejsilnější exprese, . při aplikaci třetí den je exprese dostačující. Pokud se komplexy DNK/liposomy aplikovaly čtvrtý den, dosáhlo ' se velmi slabé exprese reportního ' genu, pravděpodobně proto, že endometriální buňky nepřijaly v tento okamžik konstrukci z ne zcela jasných důvodů. . *

Tabulka č.: 1

Den aplikace (den pitvy)	. DNK (gg/ml)	Lipid (gg/ml)	Objem injekce , (gl)	Intenzita histochem. barvení
2(5)	2	20	50	++
3(5)	2 .	20	50	++
4(6)	2	20	50	-
2(6)	2	20	50	+++
2(5)	8	20	20	++
4(6)	8	20	50	-
4(6)	30	20	50	+
4 (6)	2	60	50

Intenzita barvení: +++ silná; ++ mírná; + slabá; - žádná.

• · * ·· «

Kontroly

Šest dnů pseudotěhotná myš, které se neaplikovala injekce, nevykazuje zabarvení dělohy, jenž charakterizuje βgalaktozidázovou aktivitu.

Pseudotěhotné myši (aplikace se provedla druhý den; pitva den šestý), kterým se injekcí zavedlo 50μ1 pcDNA3 bez β-galaktozidázy (2gg/ml) a lipid (20gg/ml) nevykazuje zabarvení', dělohy, jenž charakterizuje β-galaktozidázovou aktivitu.

_P.o.z.o.r.ováni_hi.sto-log-i-G-k-ýeh—seke-i—p©—ba-r-ven-í— pomocí—X---gaŤ ukazuje, že glandulární epitel se silně zbarvil a luminální epitel se také zbarvil, ale jeho intenzita je slabší. Optimální intenzita barvení . se ' pozorovala- u zvířat transfektovaných -2gg/ml DNK',a 20gg/ml lipidu při aplikaci v objemu 50μ1 druhý den- pseudotěhotenství. Sekce z těchto zvířat jsou na obrázku č. la a na obrázku č. lb jsou sekce z kontrolního zvířete, do kterého se (za· stejných podmínek) zavedl plazmid, jenž nenese gen pro β-gal. >

Příklad 2: Transfekce primárních kultur lidského endometria ' «Vynálezce také ukázal, že u lidských endometriálních epiteliálních buněk lze dosáhnout vysoké účinnosti transfekce in vitro.

Použili se už dříve popsané lipidy a plazmid (pcDNA3, +/- β-galaktozidázový reportní gen). Endometriáiní buňky se připravily způsobem podle Smith a Kelly (Smith et al., 1987Prostaglandins 34, 553-561), Po přípravě kultury se transfekce provedla podle následujícího protokolu. DNK ^g) a liposomy (8μς) se naředily médiem bez séra (Opti-MEMl BRL)

na .konečný objem ΙΟΟμΙ, směs se promýchala a inkubovala při teplotě místnosti pod dobu 15 minut. Pak se přidalo dalších 800μ1 média Opti-MEM. K buňkám se pak přidala směs DNK a liposomů (o objemu 0,5 ml) a vše se inkubovalo při teplotě 37°C po dobu 3 hodiny v inkubátoru v atmosféře CO₂- Po inkubaci se přidalo 0,5 ml kultivačního média, kteréobsahuje 20 % fetální telecí sérum. Buňky se fixovaly (0,1 % glutaraldehydem), promyly se a 24 hodin po transfekci se obarvily pomocí X-gal. .

Tyto experimenty ukazují, že se geny mohou přenášet do .endome-tr-ia—í-n—vu-v©-.—Ta-feo—s-k-u-tečnos-fe—se—může—využ’řt—u—řady stavů endometria (a stavů placenty), například ke zvýšení implantace jak u lidí tak u zvířat, k porušení implantace (jako antikoncepce), u endometriózy a.menoragie, hyperplázii a u adenokarcinomu. . ' ,

Další získaná, data se vztahují k in vitro transfekci izolovaných buněk lidského děložního epitelu. Tyto komplementy in vivo experimentu fungují u myší a naznačují, že podobné buňky se mohou transfektovat stejnými liposomy a .?

DNK, jako se používají při transfekci in vivo.

Přiklad 3: Transfekce lidského endometriálního epitelu in vitro ”

Z endometria se izolovaly primární epiteliální buňky a kultivovaly se podle metody, kterou popisuje Zhang et al.. (J.Cell Science, 1995; 108:323-331). Buňky se nanesly na standardní šesti komůrkové plotny určené pro kultivaci' tkáňových kultur a kultivovaly se do dalšího dne, až jejich hustota dosáhla 50% konfluence. Buňky se. inkubovaly- 5 dnů, pak se přenesly na plotny se 24 komůrkami, hustota buněk byla 60 000 buněk na jednu komůrku. Příští den se buňky • · · « transfektovaly komplexy DNK/liposomy (DNK/LC). Transfekce probíhá následovně:

Postup transfekce

Přístroje:

LipofektAMINE (Gibco katalog č. 18324-012), Opti-MEM I (Gibco katalog č. 51985-018) .

Kultivační plotny se 24-ti komůrkami.

Médium pro kultivaci buněk popisuje Zhang eťal. (shora citováno).

Toto rnéčTíuSi obsahuje DMEM/HEPES, 10 % FCS, 30gg/ml růstového' suplementu endoteliálních buněk (Sigma, katalog č. E-2759), 90gg/ml heparinu (Sigma katalog č. H-3149), 5ug/rtil gentamycinu (Sigma katalog č. G-1272), lgg/ml fungizonu (Gibco katalog č. 15290-018). Dále se použily kationty Mg²⁺ a Ca²⁺ bez PBS a zkumavky Eppendorf o objemu 2ml.

Použily se dvě různé plazmidové konstrukce, které obsahují různé reportní geny. Plazmid pcDNA3CAT se získal od firmy Invitrogen Corp. a obsahuje reportní gen kódující enzym chloramfenikolacetyltransferázu. Druhý plazmid pcDNA31uc obsahuje stejný vektor, ale . gen pro CAT se nahradil genem kódujícím enzym luciferázu ze světlušek. Izolace DNK vektorů ve velkém objemu se provedla za použití systému Qiagen midiprep. Jako negativní kontrola se použil plazmid pcDNA3, který neobsahuje žádný reportní gen.

Příprava komplexů DNK/liposomy

1) roztok A

Ve zkumavkách Eppendorf se do 100gl Opti-MEM I naředí lgg DNK. Používá se DNK v transfekčním médiu o konečné koncentraci lgg/ml.

a· ···

2) roztok B

Ve zkumavkách Eppendorf se do ΙΟΟμΙ Opti-MEM I naředí 4μ1 lipofectAMINE tak, aby konečná koncentrace v transfekčním médiu byla 8gg/ml.

3) Roztoky A a B se smíchají v nové zkumavce a jemně se promíchají;

4) Směs se inkubuje při teplotě místnosti po dobu 15 minut.

Promývání buněk

1) Monovrstva buněk se před transfekcí třikrát promyje čerstvě připraveným PBS bez séra.

2) Dále se monovrstva buněk dvakrát promyje médiem OptiMEM I.

Transfekce

1) Do každé zkumavky obsahující směs DNK a lipidů se.· přidá 800μ1 (celkem 1' ml) média Opti-MEM. Konečnákoncentrace DNK je lgg/ml a koncentrace' lipofectAMINE je 8gg/ml. .

2) Z monovrstvy se odstraní médium Opti-MEM. *·

3) Směs DNK/LC se jemně promýchá a ředěný komplexní roztok se přelije na promyté buňky, 0,5ml/24 komůrek.

4) Monovrstva buněk se inkubuje po dobu 3 hodin při teplotě 37°C v inkubátoru s atmosférou C0₂.

Další kultivace buněk

1) Po třech hodinách se odstraní transfekční směs a do každé komůrky se přidají 2 ml média, které popisuje Zhang, a pokračuje se v kultivaci.

··· ·

I * ·««

Kvantitativní test až 48 hodin po transfekci- se buňky extrahovaly a testovala se reportní aktivita CAT a luciferázy:

1) Buňky se třikrát promyly v PBS

2) Buňky se uvolnily z podloží 300μ1 lyzačního pufru (Promega katalog č. E-3871) a přenesly.se do zkumavky Eppendorf.

3) Extrakty se rychle zamrazily při teplotě -70°C a skladují se až do dalšího testování.

4) Extrakty se rozmrazily a centrifugovaly se při _1.3_0.0.0.g_po_dobu—L5-m-i-nu-t>———-^-5) Cyklus mrazení/rozmrazení/centrifugace se- opakuje ještě jednou.

6} Při testu prokazujícím aktivitu reportního genu luciferázy;. se. používá testovací souprava od firmy Tropix (katalog č: BC100L). V každé zkumavce je 40μ1 extraktu.

7) Aktivita reportního genu kódující CAT se testuje použitím soupravy Quan-t-CAT'- od firmy Amersham (katalog č. TRK 1012).

Výsledky . ₌

Primární endometriální buňky se transfektovaly na plotnách s 24 komůrkami, jak se popisuje shora. Transfekce proběhla vždy ve třech komůrkách s pcDNA3 (užívá se jako kontrola), pcDNACAT a pcDNA3LUC. Buňky se po 43 hodinách shromáždily a prokazovala se jejich luciferázová a CAT aktivita.

Enzym CAT katalyzuje přenos acetyl skupin z acetylkoenzymu A na chloramfenikol. Při použití tritiovaného acetylcoA se přenese radioznačení na chloramfenikol. Aktivita CAT ve vzorku je přímo úměrná množství produkovaného » · « · • »· »» tritiovaného chlorantfenikolu. Výsledky se udávají v jednotkách cpm na zkumavku. Standardní křivka se vynese za použití lyžujícího pufru, který obsahuje známé množství čištěného CAT.

Výsledky se uvádějí na obrázku č.3, kde je graf, do kterého se vynesly průměrné hodnoty. 7- standardní odchylka průměru třech stanovení typického experimentu. Výsledky v numerické formě jsou uvdeny níže. CAT aktivita buněk transfektovaných plazmidem pcDNA3CAT je přibližně 6 krát vyšší než kontrolní vzorky, což ukazuje na úspěšnou transfekci endometriálních buněk.

pcDNA3

710

616

662 průměr 662 ⁺ /- 271 pcDNA3CAT .. 4480 4134 3234 ' průměr 3951 ⁺ /. 372

Při testu dokazujícím produkci luciferázy se buněčný extrakt obsahujícíluciferázu smíchá se substrátem luciferázy luciferinem, což vede k emisi světla. Intenzita světelného signálu je úměrná enzymu luciferázy, která je přítomna v extraktu, a může .se měřit luminometrem. Výsledky-'Se uvádí v relativních jednotkách světla.

Výsledky se uvádějí na obrázku č.4, kde se znázorňuje graf ilustrující průměrné hodnoty 7- standardní odchylku průměru pro tři stanovení typického experimentu. Numerická forma výsledků se uvádí níže. Signál· buněk,, které nesou plazmid pcDNA3LUC, je víc jak 30 krát silnější než je signál kontrolních vzorků, což opět ukazuje na úspěšnou transfekci endometriálních buněk.

Příklady možné aplikace přenosu endometriálního genu.

Do endometria se může vnést nejméně sedm genových konstrukcí různého typu, čímž se dosáhne řady různých účinků. Každý z těchto typů se popisuje dále.

1) Nadměrná exprese cytokinů a růstových faktorů.

Toto jsou koncepčně nej jednoduší typy konstrukcí. Vytvořily se za účelem nadměrné exprese buď cytokinu nebo růstového faktoru v epiteliálních buňkách dělohy. Příklady cDNK vhodných pro takovou nadměrnou expresi zahrnují ty, které kódují LIF, VEGF, EGF, CSF, TNF, amfiregulin. a řadu _inte.rleukinů_a_ko.l.oni.e_s,t,imulu.j.í.cí_fak.to.r_y_._Ukázalo_s.e.,_ž.e, tyto DNK se přirozeně exprimují v endometriu a jsou důležité při regulaci funkce endometria. (Stewart et al., 1992, Nátuře, 359, 76-79; Charnock-Jones et al., 1994, Journal of Reproduction and Fertility, 101, 421-426; Charnock-Jones et al., 1993, Biology of Reproduction, .48, 1120-1128; Das et al., 1995, Molecular Endocrinology, 9, 691; Tabibzadeh (1994, Human Reproduction Updata,' 9, 947-967) publikoval rozsáhlý přehledný článek v tomto oboru). Každé z těchto činidel ovlivňuje různé 'aspekty reprodukční funkce zahrnující implantaci, vývoj krevních cév a biologii leukocytů. Proto možné indikace pro aplikaci takových konstrukcí jsou ty, kde je nutné zvýšit plodnost, zvláště u chovných druhů zvířat nebo předejít koncepci u lidí nebo domácích zvířat a také léčit různé poruchy menstruace u lidí.

Příklad experimentu, který je vhodný pro zvýšení plodnosti chovných zvířat.

Ukázalo se, že LIF podstatně ovlivňuje proces implantace (Stewart et al., 1992 citace je shora uvedena). Tento faktor se produkuje v endometriu v době implantace. Je proto možné, že u biologických druhů, kde poměr ztrát embryí je vysoký, ««· · « * zvyšující se hladiny LIF exprimováného v endometriu v době implantace může snížit uvedený poměr ztrát. Proto transfekce genové konstrukce vytvořené za účelem řízení exprese LIF v endometriu, v době implantace, může zvýšit plodnost uvedených biologických druhů. Konstrukce vnesené do endometria musí obsahovat příslušné regulační sekvence, které zaručují, že protein LIF se bude produkovat v příslušný okamžik. Je pravděpodobné, že toho se může dosáhnout, když se použije promotor z genu kódující LIF v biologickém druhu, jenž je předmětem zájmu.

Vnesení genu do endometria může také přispět k léčbě žen s poruchami menstruace. Příkladem takové léčby je změna ve vývoji krevních cév v endometriu transfekci genu, který kóduje angiogenní růstové faktory například VEGF. Místní zvýšení produkce VEGF může způsobit zvýšení růstu kapilár a z toho důvodu může' podpořit, zesílení' endometria. Stejně i zvýšená hladina VEGF může způsobit zacelení kapilár po menstruaci a tak se může změnit patern krvácení u pacientek, kterým se aplikuje tento typ konstrukce.

z

Nadměrná exprese receptorů.

Počítá se s tím, že zvyšující se počet a typ receptorů e·.» exprimovaných epitelem děiohy přináší podstatné biologické důsledky. Mezi typy receptorů, jejichž nadměrná exprese je vhodná, patří například růstový faktor, receptory cítokinů například EGF, TGFa, VEGF a různé kolonie stimulující faktory a interleukiny. V epiteliálních buňkách se také mohou s výhodou exprimovat receptory steroidních hormonů. Očekává se, že taková transfekce se může použít v případech, je-li nutné zvýšit plodnost, předejít koncepci, léčit poruchy menstruace a také objasnit funkci sirotčích receptorů (sirotčí receptory jsou receptory, jejichž ligand zůstává běžně neurčený). Sirotčí receptor je předmětem zájmu farmaceutického průmyslu, protože charakterizace takového ligandu může vést k vytvoření nových léků.

Zjišťuje se, že vývoj endometria je komplexní proces zprostředkovaný interakcí řady cytokinů a jejich receptorů a že stimulační účinky steroidů produkovaných vaječníky jsou často zprostředkovány těmito cytokiny. Zejména se ukázalo (Nelson et al., 1992, Endocrinology, 131, 1657-1644), že

TGFa potencinálně zprostředkovává působení estrogenu v děloze myši. Proto se očekává, že transfekce konstrukcí, které řídí syntézu tohoto faktoru, může podpořit endometriální růst a z toho důvodu může zvýšit plodnost v situacích, kde endometrium není adekvátně vyvinuté. Podobně se předpokládá, že tento faktor může podpořit obnovu epiteliálního povrchu po menstruaci a proto se může využít při léčbě menoragie.

Existuje několik zástupců rodiny receptorů steroidních hormonů, jejichž ligand není běžně znám. Transfekce takové cDNK do endometria může s výhodou objasnit biologickou funkci těchto receptorů a'proto se mohou využít při hledání nových farmaceutických činidel, které působí na tyto receptory (Evans 1988, Science 240, 889-895).

3) Transfekce konstrukcí vytvořených za účelem blokovat nebo předcházet působení cytokinových růstových faktorů a jiných hormonů.

Transfekce přirozených antagonistů cytokinů a růstových faktorů otevírá možnosti modulovat funkce endometria. Příkladem takového antagonisty je receptorový antagonista interleukinu 1 (Hannum et al., 1990, Nátuře 343, 336).

Ukázalo se, že aplikace tohoto proteinu blokuje těhotenství u myší (Simon et al., 1994 Endocrinology 134, 521-528). Jiné *♦· · ··» · * » »·Μ přirozené antagonisty cytokinů a růstových faktorů zahrnují přirozené rozpustné receptory. Rozpustné receptory se popisují u řady systémů růstový faktor/cytokin. Například TNE (Engelmann et al., 1990, J.Biol. Chem. 265, 14497-14504), FGF (Givol et la., 1992, FASEB Journal, 6, 3362-3369), PDGF (Tiesman & Hart, 1993, J.Biol.Chem. 268, 9621-9628) a IL-6 {Novick et al, 1989, J.Exp.Med. 170, 1409-1414). Je běžné, že doména receptorů vázající extracelulární ligand se z buňky uvolňuje jako volně rozpustný faktor. Tohoto jevu se dosahuje buď proteolýzou nebo alternativním sestřihem za vzniku zkomolené molekuly proteinu, který nemá transmembránovou a

-i-n-t-raee-l-u-l-á-rn-í—doménu-__Auto-ři—Kendal.l_a_T.homas_(.1.9.9.3.,_P.r.o.c...

(například anti-VEGF vyskytují přirozeně, předpokládá tolerovány.

Nati. Acad. Sci. USA, 90, 10705-10709) popisují rozpustnou variantu VEGF receptorů fit. Tento protein je schopný blokovat působení VEGF in vitro. Izolovaly se tři další cDNK, které kódují, další, rozpustné varianty (v PCT/GB95/01213) . Použití těchto přirozených činidel má několik výhod ve srovnáni s jinými antagonisty protilátky) . Jelikož se v těle se, že nevyvolají imunní odezvu a budou dobře Protože se odvodily od receptorů vázaného na membránu, vazebné charakteristiky budou velice podobné a tak se budou velmi účinně ucházet o ligand. Je možné, že existují

U:· další přirozené rozpustné receptory nebo že se mohou vytvořit in vitro. Je také pravděpodobné, že exprimovaná doména ze zástupců rodiny receptorů steroidních hormonů, která váže ligand, může působit jako dominantní negativní receptor a jestliže exprese v buňce je dostatečně vysoká, bude se ucházet o ligand. V jiném případě neaktivující, ale DNK vázající receptor se může použít za účelem zablokování transkripce genu. Tato aplikace se dá použít za účelem antagonizace působení na přirozené steroidy zahrnující ty, které jsou ještě neurčenými ligandy sirotčích receptorů (Pemrick et al., 1994, Leukemia 8, 1797-1806). Signalizační nedostačující receptory z rodiny zahrnující receptor se sedmi transmembránovými doménami se také může vytvořit a transfektovat.

Ukázalo se, že rozpustný antagonista receptoru interleukinu 1 (Eisenberg et al., 1990, Nátuře 343, 341) antagonizuje působení IL-1 in vivo (Simon et al., 1994, Endocrinology 134, 521-528). Tudíž se očekává, že transfekce endometria konstrukcí cDNK, která se vytvořila za účelem řídit syntézu antagonisty, bude blokovat těhotenství u myší.

Další faktory, které pravděpodobně antagonizují působení .růstového—f.a.k.tor.u_nebo_ c.yto.kinu,—zahrnuj- í_ro.zp.ustné—variantypřirozených receptorů, například rozpustnou variantu VEGF receptoru pro fit popisují autoři Kendall a Thomas (1993,, citace uvedena shora) a také Boocock et al (1995 J.Nati.Cancer Ins.. 87, 506-516). Očekává se, že místní produkce:. takových. faktorů 'antagonizuje působení VEGF a může vést k terapeutickému. použití v . situacích, kde dochází k hyperproliferaci endoteliálnich buněk, například u řady různých poruch menstruace, a kde je nutné redukovat hustotu* kapilár v endometriu. Tyto poruchy ^Jzahrnují maligní onemocnění.

i * 4) Použití antisense léčby za účelem předejít místní produkci specifického hormonu (nebo enzymu).

Dalším přístupem k blokování působení cytokinů, růstových faktorů a hormonů bude použití antisense nebo ribozomélní technologie, která blokuje buď produkci ligandů nebo produkci receptorů v příslušných buňkách (James, 1991 Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 2 191-214; Albert and Morris, 1994 Trends in Phármacological Sciences 15, 250-254),

Antisense technologie se opírá o navázání tzv. antisense oligonukleotidů nebo polynukleotidů na buněčnou mRNK. Tato • · · * ··· ·· ··· ···· vazba brání translaci uvedené mRNK a proto se snižuje množství příslušného proteinu, který je buňkou produkován. V případě tohoto přístupu se úspěšně používaly syntetické oligonukleotidy nebo polyribonukleotidy. Očekává se, že liposomy zprostředkovaná transfekce oligonukleotidů nebo liposomy zprostředkovaná transfekce konstrukcí DNK, které řídí syntézu delších antisense polyribonukleotidů, bude specificky a selektivně snižovat redukci proteinu pomocí transfektovaných buněk. Ribozomy také předcházejí produkci proteinu selektivním štěpením RNK, která kóduje specifický protein, jenž je předmětem zájmu. Tyto rybozómy se mohou také ťrán-s^fektovat-ve-formě-po-l-yr-i-bonu-k-l-eo-fe-idů-neb©-j-a-kokonstrukce DNK, které řídí syntézu takových polynukleotidů (nahlédni do James 1991, a Albert and Morris 1994, obě citace jsou shora uvedeny). Příklad takového použití antisense ribozómu za účelem.prevenceoplodnění je následující. Už se zjistilo, že LIF podstatně ovlivňuje proces implantace těhotenství u savců (Stewart et al., 1992, citace shora uvedena). Proto se očekává, že transfekce oligonukleotidy nebo konstrukcemi DNK, které řídí syntézu antisense polyribonukleotidů nebo ribozómů působících proti mRNK LIF, bude bránit syntéze tohoto faktoru. Nedostatek uvedeného faktoru pak povede k poruše implantace a tak se zablokuje koncepce.

Podobný přístup se použije za účelem blokování produkce angiogenních růstových faktorů, například VEGF, které budou bránit proiíferaci endoteliálních buněk, jenž je nutná pro růst nádoru. Tento druh léčby je proto významný v případě, že se léčí maligní onemocnění.

5) Místní produkce imunoglobinů a jejich fragmentů

Za účelem vytvořit jeden řetězec protilátek, který má skoro shodné vazebné charakteristiky jako celé monoklonální φ φφφ • * φφφ ·» • Φ Φ V V φ φ φ · * • φ φ · · φ · • « · φ φ φ φ φ φφ φ φφ · protilátky, od nichž byl odvozen, je možné použít moderní rekombinantní technologii. Takový jeden řetězec protilátek se může úspěšně exprimovat v bakteriích (He et al, 1995 Immunology 84, 662-668) . V principu je možné vytvořit konstrukci, která bude řídit expresi jednoho řetězce protilátek, a exprimovat ji v epiteliálních buňkách. Jestliže toto proběhne v endometriu in vivo, počítá se s tím, že jeden řetězec protilátek zaměřený proti steroidnímu hormonu se bude vázat na steroídní hormon a bude bránit jeho působení v epiteliálních buňkách. Příklad takových protilátek je jeden řetězec protilátek, který se odvodil z antiprogesteronových monoklonálních protilátek DB3 (He et al., 1995, citace uvedená shora). Jestliže se tyto protilátky vylučují do dutiny dělohy, budou vázat progesteron a mohou také působit v jiné části dělohy. Protilátky vystupující proti růstovým faktorům, a. cytokinům, o. nichž se ví, že jsou aktivní v endometriu, mohou podobně blokovat funkci uvedených faktorů, jestliže dochází k jejich lokální produkci.

Další aplikace lokálně produkovaných protilátek spočívá v prevenci nebo léčbě pohlavně přenosných chorob, V těchto situacích protilátky určené proti agens, které je předmětem zájmu (například papilomavirus, HIV, chlamydie) se budou vylučovat do dutiny dělohy a prostřednictvím uvedeného agens budou fungovat jako prevence proti infekci. Protilátky proti spermiím nebo oocytům hrají důležitou úlohu v antikoncepce.

6) Aktivní imunizace k dosažení mukózní imunity.

Další způsob jak dosáhnout místní imunity je vytvoření konstrukce, která bude řídit vylučování antigenu do dutiny dělohy. To vysvětluje místní imunní odezvu a tak je také možné dosáhnout mukózní imunitu, která je specifická pro dané místo. Po mnoho let se ví (Howe, 1967 Journal of Reproduction and Fertility 13, 563-566), že v dutině dělohy se nacházejí • ·· · • » · · • ···· leukocyty. Je možné, že antigen produkovaný transfektovanými endometriálními buňkami je přijímán zmíněnými leukocyty, což vysvětluje mukózní imunní odezvu. Zavedením antigenů do střevní dutiny se vyvolá uvedená imunita a některé příklady naznačují, že je velice účinná (například vakcinace proti poliomyelitidě.

Antigen blokující místa vazby.

Navázání patogenů na mukózní prvrchy je často nezbytné pro počátek infekce. Zablokování navázání patogenů na tyto místa může pak představovat způsob ochrany lidí a zvířat proti nemocem, zejména u pohlavně přenosných chorob. Tento způsob se dá aplikovat nejen u bakteriálních patogenů (jako jsou patogenní kmeny E.coli a N.gonorrhoea), ale také u virových, patogenů·;. Řada vir.ů, když infikují buňku, se váží na receptor na povrchu;buňky.. Očekává se, že rozpustné receptory produkované místně budou soupeřit s molekulami na povrchu buňky a tak budou sloužit jako prevence virové infekce. Saturace receptorů na povrchu-buňky pomocí virových imitátorů (které působí jako virový ligand) může také^Jblokovat infekci, stejně jako místní produkce specifických imunoglobinů nebo jejich účinných vazebných částí.

Claims

• Λ Λ

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití nukleové kyseliny pro výrobu farmaceutického prostředku pro změnu jednoho nebo více charakteristických znaků alespoň některých buněk rozmnožovacího ústrojí jedince savce.
2. Použití podle nároku 1, při němž jedinec savce je člověk.

-X—P-ou-ž-i-t-í—pod-l-e—nároku—1—nebo—2~,—při—němž n'U'kTebva kyselina se vnese do endometriálních buněk.
4. Použití podle libovolného z nároků 1, 2 nebo 3, při němž se nukleová' kyselina aplikuje do glandulárního epitelu. endometria..
5. Použití podle libovolného z předcházejících nároků, při němž užitá nukleová kyselina je DNK.
6. Použití podle libovolného z předcházejících nároků, při němž k aplikaci nukleové kyseliny dojde v období po ovulaci, až do okamžiku a včetně, kdy je v krvi nejvysší hladina progesteronu.
7. Použití podle libovolného z předcházejících nároků, při němž se nukleová kyselina užije použitím lipozomu, viru nebo jiné částice nosiče.

S. Použití podle libovolného z předcházejících nároků, při němž se nukleová kyselina užije jako plazmid nebo jiná konstrukce.

• ··· • · « • · 1 • * ♦ · l * * · ·· • * ♦ « * · · 4 ¹ 9 9 9 9
9. Použití podle libovolného z předcházejících nároků, při němž použitá nukleová kyselina obsahuje promotor, operabilně spojený se sekvencí tak, aby došlo v eukaryontní buňce k její transkripci.
10. Použití podle nároku 9, při němž se užije indukovatelný promotor.
11. Použití podle libovolného z předcházejících nároků, při němž sekvence nukleové kyseliny obsahuje část, která je operabilně spojená s promotorem v antisense orientaci, takže inhibuje expresi polypeptidu v buňkách, do kterých . j.e_t.a.t.o_ se.k.ve.n c.e_z.a .v.e.d e. n a-----—
12. Použití podle libovolného z předcházejících nároků, při němž změna charakteristického rysu, k níž došlo zavedením sekvence nukleové kyseliny, vede ke změně plodnosti jednotlivce ..
13. Použití podle libovolného z předcházejících nároků, při němž nukleová kyselina řídí expresi alespoň účinné části cytokinu nebo růstového faktoru.

vázající heparin (HBEGF), inzulín (IGF-I a IGF-II),
14. Použití podle libovolného z předcházejících nároků, při němž nukleová kyselina řídí expresi alespoň účinné části ječné z následujících látek: Interleukin, inhibiční faktor leukémie (LIP), vaskulární endoteliálni růstový faktor (VEGF), epičermální růstový faktor (EGF), epidermální růstový faktor růstový faktor I a II vázající amfiregulin, kolonie stimulující faktor uckxOí,y nádoru (TNF), 'nepatocytový růstový faktor (HGF) a fibroblastový růstový faktor (FGF).
15. Použití podle libovolného z nároků 1 až 12, při němž nukleová kyselina řídí expresi alespoň účinné části antagonisty cytokinu nebo antagonisty růstového faktoru.

nukleová kyselina

1 nebo rozpustného transformačního růstového faktoru ** · • ··· • · · ··· ··
16. Použití podle nároku 15, při němž řídí expresi antagonisty receptorů leukinu receptorů jedné z následujících látek : růstového faktoru (TGF)dU, fibroblastového (FGF), růstového faktoru získaného z krevních destiček (PDGF), interleukinu-6, vaskulárního endoteliálního' růstového faktoru (VEGF) nebo _ hepacytového růstového faktoru (receptor Met).
17. Použití podle libovolného z nároků 1 až 12, při němž nukleová kyselina řídí expresi alespoň účinné části receptorů růstového faktoru, cytokinů nebo steroidního hormonu v—buňce^-:--^::18. Použití podle nároku 17, při němž sekvence nukleové kyseliny řídí expresi alespoň účinné části receptorů jedné z následujících látek: EGF, transformačního růstového faktoru (TGF)φ nebo VEGF.
19. Použití podle libovolného z nároků 1 až 12, při němž nukleová kyselina řídí expresi alespoň účinné části polypeptidu, který má místní imunologický účinek.
20. Použití podle nároku 19, při němž nukleová kyselina ndi expresi alespoň účinné části antigenu z patogenů.
21. Použití podle nároku 19 nebo 20, při němž nukleová kyselina řídí expresi alespoň imunogenní části polypeptidu z jednoho z následujících agens: HIV, papilomaviry, chlamydie nebo N. gonorrhoea.
22. Použití podle nároku 19, při němž nukleová kyselina řídí expresi imunoglobinu nebo jeho účinné části.

» • · · ·· »· * *
23. Prostředek pro změnu jednoho nebo více charakteristických znaků alespoň některých buněk rozmnožovacího ústrojí jedince savce, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu, schopnou vyvolat požadovanou změnu.