BG63332B1 - Метод за промяна на една или повече характеристики на клетки на репродуктивния тракт на бозайник - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до метод, по който се променят характеристиките на тъканта на ендометриума при бозайници, като нуклеинова киселина (ДНК) се въвежда в жлезистия епител на ендометриума като плазмид или друга конструкция. Въведената нуклеинова киселина включва промотор, оперативно свързан с последователност, предназначена да се транскрибира веукариотна клетка.

Description

Изобретението се отнася до метод за промяна на една или повече характеристики на тъканта на ендометриума при бозайници.

Предшестващо състояние на техниката

Физиология на еднометриума

Необходими са две главни събития, за да се установи ембрионът в матката на бозайници: първо, предварителна подготовка на ендометриума така, че той да стане възприемчив за присъствието на бластоцист, който след това може да се имплантира и да се изхранва чрез образуването на плацентата, и второ, модификация в активността на миометриума, който трябва да стане неподвижен и по този начин да позволи на бластоциста да се установи в утробата без опасност от изхвърляне. Тези две събития се контролират от действието на хормоните на бременността, от които особено важни са естрогените и прогестеронът. Тези стероидни хормони действат върху ендометриума и миометриума чрез своите рецептори, които са разположени в ядрото на прицелните клетки. След като веднъж се активира, комплексът стероид-ядрен рецептор взаимодейства със специфични области в DNA, за да стимулира, репресира или дерепресира гени, които кодират белтъци и полипептиди, като ензими или растежни фактори.

Инициирането на имплантацията се предизвиква от каскада биохимични и биофизични изменения. В ранните стадии от прикрепването на бластоциста към стената на матката участват адхезивни молекули (напр., САМ 105). След това бластоцистьт и ендометриумът използват различни “хитрости”, за да се подобри контактът между феталната и майчината тъкан. В разред копитни животни трофобластните клетки, които образуват най-външния слой на бластоциста, мигрират в епитела на матката, с който впоследствие се сливат. При жените миграцията на клетките протича една стъпка по-нататък, тъй като мигрират не само изолирани и специ фични типове клетки, а големи области от трофобласта, които преминават между епителните клетки на матката. За да направят това, някои от трофобластните клетки се сливат, за да образуват синцитиум. Процесът е много бърз и ембрионът се закрепва в маточните тъкани без по-нататъшна видима деградация на маточния епител. В някои видове процесът на имплантация е забавен или за да се изчакат признаци във външната среда, които осигуряват раждането на малките в благоприятно време на годината, или от физиологични фактори, като лактация, така че майката да е приключила с износването на предишната бременност преди пълното установяване на следващата.

Подготовката на матката за имплантация се регулира от секрецията на яйчни хормони. Транспортът на оплоденото яйце през маточната тръба (овидукт) трябва да се извърши в точно определено време, така че то да пристигне в матката на необходимия етап от своето развитие и когато матката е напълно готова да го приеме. В повечето случаи матката е невъзприемчива за ембриона, на практика по-невъзприемчива отколкото някои други области в тялото. Епителната обвивка на матката в повечето случаи е устойчива към прикрепването и инвазията на трофобластите, като тази устойчивост намалява само при много прецизни хормонални състояния.

При мишки и плъхове неоплодените животни нямат пълен цикъл на еструс, тъй като те не образуват нормално секреторно жълто тяло (corpus luteum), което произвежда нарастващи количества прогестерон. Ако оплождането се извърши в състояние на еструс, времето, когато от яйчния фоликул, от който се отделя яйцето, се секретират големи количества естрогени, на мястото на разкъсания фоликул се образува жълто тяло, след това се секретират нарастващи количества прогестерон, извършва се имплантация и бременността напредва (продължителност, 21 дена). При стерилно оплождане протичат подобни събития с тази разлика, че жълтото тяло се запазва само 11 дена и псевдобременността се прекъсва.

Клетъчните и биохимични изменения, които настъпват в ендометриума, са изследвани по-обстойно при мишки и плъхове, макар че през последните години информацията за тези аспекти при жените нарасна значително. При всички видове ендометриумът е изграден от три основни тъкани - призматичен епител, жлезист епител и строма. В трите тъкани пролиферацията на клетките настъпва по различно време. Призматичните клетки пролиферират непосредствено преди еструса (проеструс) под въздействието на нарастващите количества естрогени, произведени от фоликулите в яйчника. След първия ден от бременността (денят на съвъкупляването при гризачи) те прекратяват делението си, но след това на третия ден се активират повторно, макар и по-слабо. Жлезистите клетки показват най-силна активност на четвъртия ден, която след това намалява. Клетките на стромата не пролиферират до четвъртия ден, но след това под влиянието на прогестерона те достигат високи темпове на пролиферация след петия ден. Малко се знае за тези изменения, които предшестват процеса на имплантация при жените, но изглежда, че както при мишки и плъхове пролиферацията на епителните клетки достига своя максимум по време на фоликулната фаза от цикъла, а на клетките от стромата по време на фазата на лутеума (фаза на жълтото тяло) или на секрецията.

Предназначението на клетъчната пролиферация в ендометриума не е напълно изяснено. Смята се, че тя подготвя ендометриума за имплантация чрез увеличаване броя на клетките, които ще изпълняват изхранващи или секреторни функции (жлезист епител) и които участват в много ранните стадии от образуването на плацентата (децидуализация). Като предварително изискване за успешна имплантация клетъчната митоза може да напредне по посока на клетъчна диференциация и по този начин да играе ключова роля в ранните събития от забременяването. Доказателство в подкрепа на тази роля е образуването на растежни фактори (митогени), цитокини и ядрени онкогени в ендометриума. Много от тези съединения се произвеждат в покачващи се концентрации в отговор на яйчните хормони, които действат чрез своите рецептори.

От растежните фактори понастоящем се отделя по-голямо внимание на епидермалния растежен фактор (EGF); епидермалния растежен фактор, свързващ хепарин (HBEGF); амфирегулин и на растежните фактори, свързващи инсулин (IGF1 и IGF2). Доказателство за значението на локалното (паракринно) действие на поне един от тези растежни фактори, амфирегулина, беше получено при неотдавнашни експерименти с мишки. Инхибиране на гена за амфирегулин, който е специфичен за имплантацията и се регулира от прогестерон, беше постигнато чрез антипрогестин, RU486, което води до възпрепятстване на имплантацията (Das etai. Molecular Endocrinology 9, 691-705, 1995).

Чрез изследвания от типа “нокаутиране на гени” беше намерено, че от цитокините незаменими са факторът, инхибиращ левкемия (LIF) и колониястимулиращият фактор (CSF), които също се образуват в матката на мишка по време на имплантацията. Беше показано, че тяхното отстраняване е несъвместимо с имплантацията и с нормалното образуване на плацентата (плацентация). (Stewart et al. Nature 359, 76-79, 1992; Pollard et al. Developmental Biology 148, 273-283, 1991).

От ядрените онкогени количеството на c-jun и c-fos (които са ранни индикатори на генната транскрипция) се повишава след прилагането на естрогени и се инхибира от прогестерон.

Между различните видове съществуват важни различия в степента на трофобластна инвазия по време на имплантацията. При жените ранният трофобласт е силно инвазивен, докато при прасета, които имат неинвазивна форма на имплантация, епителът на ендометриума не се нарушава нито веднъж през тримесечния период на бременността. В тези два вида неуспехът на имплантацията е висок и достига съответно около 60 и 30 %. Причините за тази висока степен на неуспешна имплантация са сложни и недокрай разбрани. При жените около половината от тези случаи се дължат на генетични отклонения, но при прасетата, както и при други копитни, при които загубата също е голяма, генетичните дефекти са отговорни само за малък процент от общия.

След неуспешна имплантация при жените спадът на прогестероновата секреция причинява кървене, както в края на нормалния менструален цикъл, което не се случва при повечето други животни. Нарушенията в менструацията, както и в имплантацията, са широко разпространени. Освен това, показателен случай за “болно здраве” при жените е менструалното кървене или като резултат от последо вателна хормонална терапия, или по повод продължителна комбинирана терапия с хормонални заместители или прилагането на продължително действащи противозачатъчни, съдържащи само прогестин. Причините, лежащи в основата на това кървене, фокусират в себе си много от съвременните изследвания върху биохимичните (напр., простагландини, ензими, полипептиди и белтъци, вазоактивни съединения, като факторът, активиращ тромбоцитите (PAF) и васкуларно-ендотелния растежен фактор (VEGF) и клетъчни механизми, например мигриращи клетки, придвижващи се към матката, които произвеждат имуносупресивни съединения.

Съвременното разбиране на репродуктивните процеси акцентира главно върху контрола на образуването на хормони и действието на тези хормони върху техните прицелни тъкани. Все повече се вижда обаче, че паракринните и автокринни фактори са ключови посредници (медиатори) на репродуктивната функция, макар и да взаимодействат със стероидите (Benton, 1991 Current Opinion in Cell Biology 3, 171-175; Rozengurt, 1992 Current Opinion in Cell Biology 4, 161-165; Tartakovsky et al., 1991 Developmental Biology 146, 345-352 Robertson et al., 1992 Current Opinion in Immunology 4, 585-590; Smith, 1994 Human Reproduction 9,936946; и Tabibzadeh, 1994 Human Reproduction 9, 947-967). Най-ясният пример за това се наблюдава при мишки с отстранени яйчници. В този модел матката нараства неимоверно в отговор на единична доза естрадиол. Този ефект Мйже да се блокира от анти-TGFa антитяло (TGF е “трансформиращ растежен фактор”), което навежда на мисълта, че митогенните ефекти на естрогена в тази тъкан се опосредстват от TGFa (Nelson et al., 1992 Endocrinology 131, 1657-1664).

Ето защо лекарствената интервенция в гинекологията се основава главно на стреоид/ антистероидната регулация на матката (Yen & Jaffe, 1991 in “Reproductive Endocrinology”, Eds, Yen, Jaffe & Benton, Pub. WB Saunders, Philadelphia; Baird, 1993 British Medical Bulletin 49, 73-87). Независимо от несъмнения успех на този подход, през последните 20 години няма концептуален напредък в противозачатъчната технология, не са идентифицирани способи за подобряване на имплантацията, няма напре дък и в подобряването на плацентния растеж и развитието, не са намерени и нови подходи за лечение на доброкачествените гинекологични заболявания (менструална дисфункция и фиброиди).

Направени са редица публикации във връзка с използването на “преноса на гени” при бозайници за промяна в генотипа на поне някои клетки в определена тъкан или тъкани. Известно е, че се правят опити за “генна терапия” При хората чрез въвеждане в реципиентите на последователности от нуклеинови киселини, за да се избегне генетичната недостатъчност в реципиента чрез експресията на полипептиди, които се кодират от въведените последователности на нуклеинови киселини. Провеждани са генно-терапевтични изпитвания, например, при които в дихателните пътища на пациенти, страдащи от муковисцидоза (cystic fibrosis), са въвеждани последователности от DNA, включени във вирусни вектори, така че да се промени фенотипът на поне някои от епителните клетки, покриващи дихателния път на пациентите. Досега няма публикувани опити за въвеждане на DNA в ендометриума на бозайници, независимо от наличието на подходящи техники за това.

Техническа същност на изобретението

В един аспект методът съгласно изобретението се отнася до промяна на една или повече характеристики на поне някои от клетките на репродуктивния тракт на бозайник чрез въвеждане на нуклеинова киселина в посочените клетки.

Във втори аспект изобретението се отнася до препарат, включващ нуклеинова киселина, като препаратът е предназначен да се използва за промяна на една или повече характеристики на поне някои от клетките на репродуктивния тракт на бозайник.

В трети аспект изобретението предоставя за използване препарат, включващ нуклеинова киселина за промяна на една или повече характеристики на поне някои от клетките на репродуктивния тракт на бозайник.

В четвърти аспект изобретението предоставя за използване препарат, включващ нуклеинова киселина за приготвянето на субстанция за промяна на една или повече ха рактеристики на поне някои клетки от репродуктивния тракт на бозайник.

В пети аспект изобретението предоставя метод за приготвянето на препарат, който да се използва за промяна на една или повече характеристики на поне някои от клетките на репродуктивния тракт на бозайник, който метод включва смесване на нуклеинова киселина с физиологично приемлива субстанция-носител.

Настоящото изобретение не може да се разглежда като разширение на техниките за генна терапия, за които вече е известно, че са сполучливи поне от части, когато се прилагат към бели дробове на пациенти, болни от муковисцидоза. Смята се, че за нито едно от известните заболявания на ендометриума не са отговорни наследствени генетични нарушения, така че специалистите не са имали стимул да прилагат техниките на генната терапия спрямо ендометриума. Освен това, епителът на ендометриума е от различен тип (кубичен, произхождащ от целомния епител) в сравнение с белодробния епител, който е многослоен и затова за него не би могло да се предскаже аналогичен начин на поведение. Нещо повече, поне при примати е налице циклично олющване на епитела на ендометриума, което би причинило загубата на всяка трансфектирана клетка.

Съгласно изобретението е установено, че няма пренос на въведената DNA нито в органите на майката, нито в плацентата на ембриона - две събития, които биха могли да настъпят и да създадат практически затруднения.

Нуклеиновата киселина обикновено се въвежда в бозайник от женски пол (за предпочитане жена), по-специално в клетките на неговия ендометриум. Желателно е нуклеиновата киселина да се въведе в жлезистия епител на ендометриума. Нуклеиновата киселина може да кодира полипептид, който вече естествено се синтезира от клетките, в които се въвежда нуклеиновата киселина, така че количеството на този полипептид да се увеличи чрез ефекта на генното дозиране. Като алтернатива методът може да се използва за индуциране експресията на полипептид в клетките, който преди това не се е синтезирал в тези клетки. Полипептидът би могъл, например, да бъде “изкуствен” рекомбинантен полипептид, който не съществува в природата, като химерен полипептид, включващ изцяло или час тично функционални домени от два или повече различни белтъка.

Предпочита се нуклеиновата киселина да бъде DNA, но би могло да се опита и въвеждането на RNA (на значещи (сенс) или на незначещи (антисенс) вериги). Би могла да се използва антисенсмолекула, за да се инхибира или по някакъв друг начин да се попречи на експресията на полипептид в клетките, в които е въведена нуклеиновата киселина. Въведената последователност от нуклеинова киселина може да бъде антисенс RNA или може да бъде последователност от DNA, която направлява синтезата на антисенс RNA в клетката. Друг път за постигането на подобно инхибиране е въвеждането на последователност в клетките, която направлява синтезата на рибозом, който след това ще разкъса специфично mRNA, която е необходима за синтезата на полипептида, чиято експресия се цели да бъде инхибирана.

Установено е съгласно изобретението, че времето на въвеждане на нуклеиновата киселина (по отношение на стадия от репродуктивния цикъл) съществено повлиява ефективността на поемане на нуклеиновата киселина. Установено е, че за да се получи оптимална степен на поемане на въведената нуклеинова киселина, е необходимо въвеждането да бъде направено в периода след овулацията до и включително и в деня, в който е налице максимум в нивото на прогестерона в кръвта. Нивото на прогестерона нормално достига максимум почти в същото време, в което намиращият, се в матката ембрион се имплантира.

Съгласно изобретението е установено, че максимално поглъщане на въведената DNA от мишия ендометриум се извършва на 2-3 ден от цикъла (като за първи ден се взема денят, в който за първи път е установен полов контакт) . При човека овулацията обикновено настъпва на 14 ден от цикъла, като се смята, че по правило имплантацията се извършва в средна фаза на лутеума (макар че при човека точното време не е строго дефинирано).

Нуклеиновата киселина може да бъде въведена самостоятелно или може да бъде свързана или асоциирана с други субстанции (напр., липозоми). За удобство нуклеиновата киселина се въвежда в клетките на реципиента бозайник чрез обикновена трансфекция (със или без липозоми), която съгласно изобретението е установено, че е изненадващо ефективна, без да е необходимо последователността да бъде включена във вирусен вектор. Независимо от това вирусните вектори могат да бъдат желани, по-специално тези от тях, които могат да се насочват към определени клетъчни типове, както е показано в патент на WO 93/20221.

Целесъобразно е нуклеиновата киселина да се въведе като част от конструкция (например плазмид, космид или други подобни), която конструкция да включва предимно промотор, който оперира в бозайници, така че да предизвиква транскрипция на поне част от въведената нуклеинова киселина. Промоторът може да бъде кноститутивен или повече се предпочита индуцируем, така че да позволи поголям контрол върху експресията на въведената последователност.

В един отделен метод, изпълнен съгласно изобретенето, въвеждането на нуклеинова киселина в клетките от ендометриума на бозайник от женски пол позволява регулиране на плодовитостта по посока на нейното повишаване или намаляване. По-специално съгласно изобретението може да се използва за обезпечаване на противозачатъчен метод при домашните животни като котки и кучета, за да се предотвратят нежелани раждания.

В други приложения изобретението предоставя метод за подобряване на плодовитостта на различни видове селскостопански животни, като прасета, рогат добитък, овце и други подобни.

Предпочита се нуклеиновата киселина да се въведе в репродуктивния тракт през влагалището, като по този начин се избягва необходимостта от интервенция с хирургически техники. Ако е необходимо, нуклеиновата киселина би могла да се въведе с помощта на хирургически техники непосредствено в репродуктивния тракт (например матката). Изобретението разкрива възможността за промяна на една или повече характеристики чрез въвеждането на една или повече от много голям брой различни последователности на нуклеинови киселини.

В едно приложение въведената в клетките на репродуктивния тракт последователност направлява експресията (за предпочитане в големи количества) на ефективен участък от цитокин или растежен фактор (ефективен учас тък е тази част от молекулата, която съхранява биологичната активност, частично асоциирана с цялата молекула, например свързване със специфичен лиганд и т.н.). Примери за (

такива полипептиди, които биха могли да се експресират от въведената последователност, включват, но не се ограничават до следните: интерлевкини; фактор, инхибиращ левкемията (LIF), васкуларно-ендотелен растежен фактор (VEGF); епидермален растежен фактор (EGF); епидермален растежен фактор, свързващ хепарин (HBEGF), растежни фактори I и И, свързващи инсулин (IGF-I и IGF-II), амфирегулин, колониястимулиращ фактор (CSF) и тумор некрозисен фактор (TNF).

В друго приложение въведената последователност може да направлява експресията на ефективен участък от антагонист на цитокин или растежен фактор, като антагониста на рецептора за IL-1. Антагонистът може да бъде разтворим рецептор за цитокин или растежен фактор, което е по-благоприятно. Съответните примери включват рецептори за следните (фактори): трансформиращ растежен фактор (TGF)a; фибробластен растежен фактор (FGF); растежен фактор, произхождащ от тромбоцитите (PDGF); интерлевкин-6 (IL6) и VEGF.

В друго приложение въведената последователност може да направлява експресията на ефективен участък от полипептид, който има имунологичен ефект. По-специално полипептидът може да има имуногенна активност, като по този начин служи за стимулиране на локален имунен отговор. Така изобретението може да се използва за обезпечаване на нов метод за имунизация. Имуногенният полипептид е целесъобразно да бъде антиген от мукозен патоген. Като се има предвид общата имунна система на мукозата, стимулирането на антитялообразуването в репродуктивния тракт може да доведе до образуването на съответните антитела в дисталните места на мукозата, като стомашно-чревния тракт, дихателните пътища, сълзотворните (лакримални) жлези и други. За предпочитане е обаче антигенът да бъде от патогените, които инвазират и/или колонизират репродуктивния тракт, обикновено патоген, който причинява заболяване, предаващо се по полов път. Примерите включват вируси, такива като HIV, папилома вируси (напр., HPV от различни типове), хла мидии и бактерии (напр., N. gonorrhoea). Като алтернатива полипептидът, имащ имунологичен ефект, може да бъде имуноглобулин или ефективен участък от него (такъв като Fab-, scFv-фрагмент или едноверижно антитяло). Имуноглобулинът или ефективният участък от него може да бъде насочен срещу патоген (такъв като споменатите по-горе) или може да бъде насочен срещу някой друг антиген, като стероид или друг хормон. По този начин имуноглобулините или техните фрагменти биха могли да се експресират локално, за да осигурят предпазване от заболяване или за да регулират плодовитостта.

В друго приложение въведената последователност може да направлява експресията на полипептид или на ефективен участък от него, който има ефект върху менструацията.

В друго приложение въведената нуклеинова киселина може да направлява експресията върху повърхността на клетките от репродуктивния тракт на ефективен участък от рецепторна молекула. Рецепторът би могъл да бъде рецептор за цитокин, за стероиден хормон или растежен фактор (такъв като рецептора за EGF, рецептора за TGFa или рецептора за VEGF). Известни са редица рецептори, които се описват като “орфанови” рецептори, за които не е известен лигандът, който се свързва с рецептора. Такива орфанови рецептори са от особен интерес за фармацевтичната промишленост, тъй като те могат да представляват мишени за нови терапевтични или профилактични съединения.

Съгласно изобретението в друг аспект се предоставя метод за охарактеризиране на биологичните свойства на полипептид. Методът включва въвеждане на последователността, кодираща полипептида, който трябва да се охарактеризира, в клетките на репродуктивния тракт на бозайник и определяне на ефекта от експресията на полипептида. Предпочита се бозайникът да бъде лабораторно животно, като мишка или плъх. Целесъобразно е полипептидът, който ще се охарактеризира, да представлява орфанов рецептор и обикновено поне част от неговото охарактеризиране ще включва идентифициране на лиганда му. Методът най-общо включва анализа на хистологични срези, взети от лабораторното животно, и тяхното обработване по всяка една от раз личните стандартни техники (напр., хистохимично оцветяване, хибридизация in situ, имунологично оцветяване и т.н.).

Съгласно изобретението е създадена нова алтернатива за стероидно регулиране функцията на ендометриума (а по този начин и на репродуктивния капацитет и плодовитост) чрез непосредствен пренос на гени in vivo. За да се постигне това се проектират генетични конструкции за специфично модулиране на цитокиновото действие, като това може да се постигне по различни начини. Например, като се използват антисенс конструкции или рибозоми, направлявани от промотор, би могло чрез блокиране на транскрипцията и транслацията да се попречи на клетките, които произвеждат секретиращия се цитокин, да синтезират фактора. Действието на секретиращия се фактор може алтернативно да се блокира чрез рецепторни антагонисти. Срещащите се в природата разтворими рецептори могат да улавят и неутрализират биоактивен лиганд, действайки по този начин като конкурентни рецепторни антагонисти. Като алтернатива съществуват и природни рецепторни антагонисти, например ILIRa (рецепторен антагонист на интерлевкин-

1). Интраперитонеалното приложение на този белтък блокира имплантацията на бластоциста в мишка (Simon et al., 1994, цитиран на друго място).

Налице е съществено доказателство, което показва, че разтворимите растежни фактори, които се секретират от епитела на маточната тръба и матката, могат да контролират предимплантационното развитие на зародиша при бозайници като действат директно чрез рецепторите, които се експресират върху ембриона (Pampfer et al., 1990 In Vitro Cellular and Developmental Biology 26, 944-948). От своя страна развиващите се ембриони произвеждат растежни фактори, които могат да действат по автокринен механизъм или върху ендометриума, повлиявайки неговата възприемчивост. Например, в мишки експресията на LIF (от майчините тъкани) се засилва драстично в жлезистия епител на четвъртия ден, непосредствено преди имплантацията. LIF е в състояние да действа върху предимплантационния бластоцист, който експресира рецептора за LIF (LIFR). Тази експресия на LIF от страна на майката е жизнено необходима за имплантацията, тъй като в “нокаутирани” по LIF мишки ембрионите не се имплантират, макар че това става, ако те се пренесат в псевдобременни женски (Stewart et al., 1992, цитирана другаде).

Съгласно изобретението е разширена работата по посока към човека и е установено чрез R.T-PCR (полимеразна верижна реакция с първоначална матрица RNA), че човешките ембриони експресират mRNA, кодираща LIF-R, но не експресират LIF. LIF действа, като се свързва със слабоафинитетния рецептор LIF-R. Свързване със силен афинитет протича, когато комплексът LIF/LIF-R взаимодейства с допълнителен белтък gpl30, който предава сигнали. Човешките ембриони също съдържат mRNA, кодираща този белтък (Sharkey et al., 1995 Biology of Reproduction 53, 955-962). Установено е съгласно изобретението, че секрецията на LIF в човешкия жлезист епител се регулира от стероиди, които са най-много във фазата на лутеума (фазата на жълтото тяло, около очакваното време за имплантация - Chamock-Jones et al., 1994, цитирана другаде). Освен това има съобщение, че въвеждането на LIF в човешки предимплантационни ембриони in vitro подобрява развитието. Всички тези доказателства подкрепят идеята, че LIF може би е важен за имплантацията при човека, както това е при мишките. Ясно е, че цитокините могат да опосредстват важни взаимоотношения между ембриона в маточния лумен и ендометриума (и в двете посоки). Настоящото изобретение позволява използването на генен пренос за разрушаване или засилване на тези взаимоотношения, водейки до нови методи против зачеване или обратно, за подобряване на имплантацията.

Повечето съвременни изследвания на паракринната или автокринна регулация на репродуктивната функция са ограничени до описателен анализ, поради липсата на ефективни методи за модулиране на локалните равнища цитокин/рецептор. Доказателството съгласно изобретението показва, че е възможно да се осъществи трансфекция на маточния епител in vitro. Това позволява експериментално манипулиране на ендометриума и предлага нови терапевтични стратегии. Работата, представена по-нататък, описва използването на индикаторен ген за демонстрация на практическата възможност за пренос на гени в матката in vivo. На практика би могъл да се използва ген (или друга конструкция от DNA), който е в състояние да промени функция на матката. Такива примери включват рецепторни антагонисти (напр., IL-IRa, разтворими рецептори за VEGF и т.н.), природни или модифицирани цитокини и растежни фактори, протеазни инхибитори или стероидни рецептори и разнообразие от рибозомни и антисенс конструкции. Могат да се пренасят гени в ендометриума in vivo, което ще намери приложение при различни състояния на ендометриума (или на плацентата), например за подобряване на имплантацията при животните и човека, за прекъсване на имплантацията (т.н. контрацепция), при ендометриоза и менорагия, хиперплазия и аденокарцином.

Съгласно изобретението, като се използват разработените протоколи се получават описаните по-долу резултати. Те показват, че гениите конструкции могат да се пренасят в ендометриума както in vivo (в мишки), така и in vitro и че тези конструкции са транскрипционно (и транслационно) активни.

Описание на приложените фигури

Изобретението се пояснява с илюстративни примери и с приложените фигури, от които:

фигури 1А и 1В показват фотографски микроснимки на хистологични срези от миши ендометриум, трансфектиран с (А) плазмидна конструкция, направляваща експресията на индикаторния ген β-галактозидаза или с (В) подобен плазмид, несъдържащ индикаторния ген. Трансфектираните клетки могат ясно да се идентифицират по интензивното тъмно (синьо) оцветяване на цитоплазмата, което отсъства в срез В.

Фигура 2 представлява фотографска микроснимка на клетки от човешки ендометриум in vitro, които са трансфектирани със същия плазмид, както във фигура 1А - тъмното (синьо) оцветяване вследствие експресията на индикаторния ген е свързано главно със запазената жлезиста структура, докато заобикалящите я клетки се оцветяват по-слабо.

Фигура 3 представлява диаграма, която показва резултатите от определянето на CAT (в импулси на епруветка) в клетки от ендометриума, трансфектирани успешно с ген, кодиращ хлорамфениколацетилтрансфераза (pcDNA3CAT) в сравнение с клетки, трансфек тирани с контролния плазмид (pcDNA3); и фигура 4 представлява диаграма, която показва резултатите от определянето на луцифераза (в относителни светлинни единици) в клетки от ендометриума, трансфектирани успешно с ген, кодиращ луцифераза (pcDNA3LUC) в сравнение с клетки, трансфектирани с контролния плазмид (pcDNA3).

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1. Мишки

Нераждали полово зрели мишки BALB/ с се отглеждат в малка къщичка за животни (Small Animal House) с контрол на светлината (14 h светло: 10 h тъмно; светлината се изключва в 20,00 h) и при температурата (22°С), като се хранят с храна за мишки и плъхове (Labsure; Christopher Hill Group, Poole, Dorset, UK). Те се поставят c вазектомизирани мъжки от същата порода през нощта и на следващата сутрин се изследват за наличието на полов (вагинален) контакт. Приема се, че съешаването е станало в 02,00 h (време 0) като за първи ден се смята денят, в който за първи път е установен контакт. Преди експеримента съешавалите се женски се отглеждат отделно.

Провежда се лапаротомия, като се използват асептични процедури под метафанова упойка (метоксифлуоран, С-Vet Ltd., Bury St. Edmunds). Маточните рогове се отварят чрез средновентрални или билатерални разрези. Инжекциите се правят или на върха на рога в тубо-маточната свръзка, или в основата на рога в маточно-цервикалната свръзка. Повторни изследвания показват, че последната техника дава най-добрия метод на приложение, но за някои цели първата техника е за предпочитане, когато е необходимо да се сведе до минимум разкъсването на репродуктивния тракт.

Инжектиранията на липозома/DNA (конструкция pcDNA3 +/- индикаторен ген за β-галактозидаза), “гола” DNA или контролни разтвори (25-100 μΐ) се извършват чрез вкарване върха на плосък наконечник (Stratatip) в основата на рога. Разтворите предварително се изтеглят в наконечника с помощта на апликатор (Travesty), който се използва също и за да се контролира бавното инжектиране на разтворите в рога.

След инжекцията разрезът се затваря, като се използва прекъснат матрачен шев и мишките се оставят да се възстановят в клетките им, снабдени с храна и вода ad libitum.

Плазмидни конструкции

Плазмидите, описани съгласно изобретението (чрез примерите), са на основата на търговски достъпния вектор pcDNA3 (Catalogue No. V790-20, от Invitrogen, San Diego, California, USA). Плазмидът pcDNA3, несъдържащ никакъв индикаторен ген, се използва като отрицателна контрола. Експерименталните плазмиди pcDNA3-3gal, pcDNA3-CAT и pcDNA3-Luc съдържат съответно индикаторните гени за β-галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза и луцифераза. Тези плазмиди съдържат следните генетични елементи: ген за ампицилинова резистентност, начало за репликация ColEl, промотор на CMV (цитомегаловирус), (индикаторен ген), място за прибавяне на полиА от гена на говеждия растежен хормон, начало за репликация (на едноверижния фаг) fl, начало за репликация (на вируса) SV40, ген за неомицинова устойчивост и място за добавяне на полиА от SV40, в оперативна връзка, така че индикаторният ген да би могъл да се експресира в еукариотните клетки след въвеждане на плазмида. Плазмидната DNA се пречиства от Е. coli чрез алкален лизис, като за допълнително пречистване се използва йонообменна колона Qiagen (съгласно инструкциите на производителя) .

Получаване на липозоми

Използваните липозоми са 3:1 (тегло/ тегло) липидни препарати на DOPSA (2,3-диолеилокси-N- [2(сперминкарбоксиамидо)-етил] N-N-диметил-1 -пропанамониев трифлуорацетат) и DOPE (диолеилфосфатидилетаноламин) (LipofectAMINE; Gibco BRL Paisley, Scotland). Използват се редица отношения ΏΝΑ^ηπηλ и различни инжекционни обеми, както е показано в таблица 1. DNA/липозомите се смесват непосредствено преди всеки експеримент. Към 10 μΐ липиден разтвор се прибавя 10 μΐ разтвор на DNA, смесват се внимателно и се оставят 15 min на стайна температура. След това се прибавят 80 μΐ PBS, за да се получи крайната концентрация на DNA и липид, както е показано в таблица 1. Тази смес после се инжектира в матката на псевдобременни мишки. (Виж по-горния раздел описание на мишките и хирургическата намеса).

Хистохимична локализация на β-галактозидазата

Животните се убиват чрез инхалация с въглероден диоксид и маточните рогове се изрязват без мастна и мезентериална тъкан. Все- 5 ки рог се разделя на 3 среза, като горният и долният срез се замразяват рязко в течен азот и се съхраняват на -70°С до количественото измерване на β-галактозидазното съдържание. Средният срез от всеки маточен рог се фиксира в 1,25% глутаралдехид в PBS за 15 min, изплаква се два пъти с PBS и се поставя в оцветяващ разтвор, съдържащ X-gal (1 mg/ml X-gal, 5 mM KjFe(CN)₅, 5 mM K₄Fe(CN)₆, 2 mM MgCl₂, 0,02% NP40, и 0,01% натриев дезоксихолат) за 24 h на стайна температура. След това срезите се изплакват с PBS/3% DMSO (2x5 min), 70% етанол (3x5 min) и се поставят в 100% етанол. Тъканите се включват в гликолметакрилатна смола, изрязват се 7 μ срези и преди микроскопското изследване се прави насрещно оцветяване с неутрално червено.

Резултати

В таблица 1 (по-долу) са показани различните условия, които са използвани, и получаващата се интензивност на оцветяване на маточните срези след въвеждане на комплексите DNA/липозоми. Показаните в таблицата резултати демонстрират критичността на времето на въвеждане на плазмидната DNA, като въвеждането на 2 ден дава най-добрите равнища на експресия, въвеждането на 3 ден дава приемливи равнища, но въвеждането на 4 ден води до много слаба експресия на индикаторния ген, вероятно, поради това, че в тази времева точка клетките на ендометриума не биха приели конструкцията според не напълно ясни причини.

Таблица 1. ί

Ден на въвеждане (ден на аутопсия)	DNA ( g/ml)	Липид ( g/ml)	Инжекционен обем ( 1)	Интензивност на хистохимичното оцветяване
2(5)	2	20	50	++
3(5)	2	20	50	++
4(6)	2	20	50	-
2(6)	2	20	50	+++
2(5)	8	20	20	++
4(6)	8	20	50	-
4(6)	30	20	50	+
4(6)	2	60	50	-

Интензивност на оцветяване: +++ силно, ++ умерено, + слабо, - липсва

Контроли

Неинжектирана псевдобременна в 6 ден мишка не показва оцветяване на матката за βгалактозидазна активност.

Псевдобременна мишка (ден на въвеждане 2, ден на аутопсия 6) инжектирана с 50 μΐ pcDNA3 минус β-галактозидаза (2 p.g/ml) и липид (20 pg/ml) не показва оцветяване на матката за β-галактозидазна активност.

Изследването на хистологичните срези след оцветяване с x-gal показва, че жлезистият епител е силно оцветен, призматичният епител съшо се оцветява, но по-слабо. Оптимално оцветяване се наблюдава в животни, трансфектирани с 2 pg/ml DNA и 20 pg/ml липид в обем 50 pl, въведени на втория ден от псевдобременността. На фигура 1А е показан срез от едно такова животно, а фигура 1В - срез от контролно животно, което получава (при идентични условия) плазмид, който не съдържа гена за β-gal.

Пример 2. Трансфекция на първични култури от човешки ендометриум

Изобретателите са показали също, че епителни клетки от човешки ендометриум могат да се трансфектират in vitro с висока ефективност.

Използват се същите плазмиди (pcDNA3, +/- индикаторен ген за β-галактозидаза) и липиди, както вече описаните. Клетките от ендометриума се приготвят по метода на Smith и Kelly (Smith et al., 1987 Prostaglandins 34, 553561). След като културата порасне, се използва следният протокол за трансфекция. DNA (2 pg) и липозомите (8 pg) се разреждат поотделно със 100 pl среда, несъдържаща серум (Opti-MEM 1 BRL), смесват се и се инкубират на стайна температура 15 min. След това се добавят още 800 pl Opti-MEM 1. Клетките (в 24-ямкови плаки) се промиват с PBS, последвано от промиване с Opti-MEM 1. След това към клетките се прибавя сместа DNA/липозоми и те се инкубират на 37°С 3 h в СО₂-инкубатор, след което се прибавят 0,5 ml културална среда, съдържаща 20% фетален телешки серум. Клетките се фиксират (0,1% глутаралдехид) , промиват се и се оцветяват с X-gal 24 h след трансфекцията.

Тази работа показва, че в ендометриума могат да се пренасят гени in vivo и това ще намери приложение при различни състояния на ендометриума (и на плацентата), например за подобряване на имплантацията както при животните, така и при човека, за прекъсване на имплантацията (т.н. контрацепция), при ендометриоза и менорагия, хиперплазия и аденокарцином.

Получени са допълнителни данни във връзка с in vitro трансфекцията на пречистени епителни клетки от човешка матка. Това допълва работата in vivo с мишки и показва, че подобни клетки след прекарано минимално време в култура могат да се трансфектират ефективно със същите липозоми и DNA, използвани in vivo.

Пример 3. Трансфекция на епител от човешки ендометриум in vitro

Първични епителни клетки от човешки ендометриум се изолират и култивират съглас но метода на Zhang et al., (J. Cell Science, 1995; 108: 323-331). Клетките се посяват в стандартни 6-ямкови плаки, така че на другия ден да достигнат плътност от 50% конфлуентност. Клетките се култивират 5 дни, след това се препосяват в 24-ямкови плаки при плътност 60 000 клетки на ямка. На следващия ден клетките се трансфектират с комплексите DNA/ липозоми (DNA/LC). Последните се приготвят, както следва:

Процедура на трансфекция

Апарат

LipofectAMINE (от фирмата Gibco с каталожен № 18324-012), Opti-MEM 1 (от фирмата Gibco с каталожен № 51985-018).

24-ямкова плака за клетъчни култури

Средата, в която се култивират клетките, е описаната от Zhang et al., (цитиран погоре). Тя се състои от DMEM/HEPES, 10% FCS (фетален телешки серум), 30 pg/ml добавка за растеж на ендотелни клетки (от фирмата Sigma с каталожен № Е-2759), 90 pg/ml хепарин (от фирмата Sigma с каталожен № Н3149), 5 pg/ml гентамицин (от фирмата Sigma с каталожен № G-1272) и 1 pg/ml фунгизон (от фирмата Gibco с каталожен № 15290-018). Използват се също PBS, несъдържащ Mg-H- и Са++, както и епруветка от 2 ml на фирмата Eppendorf.

Използват се две различни плазмидни конструкции, съдържащи различни индикаторни гени. pcDNA3CAT е получен от корпорацията Invitrogen и съдържа индикаторен ген, кодиращ ензима хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT). Вторият плазмид pcDNA31uc включва същия вектор, но генът за CAT е заменен с гена, кодиращ ензима луцифераза на светулка. Препарати на DNA от векторите в големи количества се получават чрез използване на системата Qiagen midiprep. Като отрицателна контрола се използва pcDNA3, несъдържащ индикаторен ген.

Получаване на комплексите DNA/липозоми

1) Разтвор А

Разтваря се 1 pg DNA в 100 pl OptiMEM 1 в епруветка на фирмата Eppendorf. DNA се използва при крайна концентрация в средата за трансфекция от 1 pg/ml.

2) Разтвор В

Разтваря се 4 pl LipofectAMINE в 100 pl

Opti-MEM 1 в епруветка на фирмата Eppendorf. LipofectAMINE се използва при крайна концентрация в средата за трансфекция от 8 pg/ ml.

3) Двата разтвора А и В се обединяват в нова епруветка и се разбъркват внимателно.

4) Инкубира се на стайна температура 15 min.

Промиване на клетките

1) Преди трансфекция монослоят от клетки се промива около три пъти с прясно приготвен PBS, несъдържащ серум.

2) Монослоят от клетки се промива още веднъж два пъти с Opti-MEM 1.

Трансфекция

1) Към всяка епруветка, съдържаща сместа DNA-липид, се прибавят 800 μΐ (общо 1,0 ml) от Opti-MEM. Крайната концентрация на DNA е 1 pg/ml, а концентрацията на lipofectAMINE е 8 pg/ml.

2) От клетъчния монослой се отстранява Opti-MEM 1.

3) Сместа DNA/LC се разбърква внимателно и разреденият разтвор на комплекса се надслоява върху промитите клетки, 0,5 ml/24ямкова плака.

4) Клетъчният монослой се инкубира 3 h на 37°С в СО₂-инкубатор.

По-нататъшно култивиране

1) Трансфекционната смес се отстранява 3 h по-късно, към всяка ямка се прибавят по 2 ml от средата на Zhang и култивирането продължава.

Количествено определяне

От 24 до 48 h след трансфекцията клетките се екстрахират и се тестват за наличието съответно на хлорамфениколацетилтрансферазна (CAT) или луциферазна индикаторна активност.

1. Клетките се промиват три пъти с PBS.

2. Клетките се екстрахират с 300 pl лизиращ буфер (на фирмата Promega с каталожен № Е-3871), като преди това се остъргват изцяло от плаката и се прехвърлят в епруветка на фирмата Eppendorf.

3. Екстрактът се замразява бързо на -70°С и се съхранява до извършване на определянето.

4. Преди определянето екстрактите се размразяват и се центрофугират на 13000 g 5 min.

5. Цикълът замразяване/размразяване/ въртене се повтаря още веднъж.

6. Активността на индикаторния ген за луцифераза се определя, като се използва набор реактиви (kit) за определяне на луцифераза от фирмата Tropix (каталожен № BC100L). От всеки екстракт се използват по 40 pl на епруветка.

7. Активността на индикаторния ген за CAT се определя, като се използва наборът реактиви Qant-t-CAT от фирмата Amersham (каталожен № TRK 1012).

Резултати

Първични епителни клетки от ендометриума се трансфектират в 24-ямкови плаки, както е описано по-горе. Трансфекциите се извършват в три повторения на ямки с pcDNA3 (като контрола), pcDNACAT и pcDNA3LUC. Клетките се събират след 48 h и се определят за луциферазна или САТ-активност.

Ензимът CAT катализира преноса на ацетилни групи от ацетил-Коензим А върху хлорамфеникол. Използването на ацетил соА, белязан с тритий (³Н>, води до пренос на радиоактивния белег върху хлорамфеникола. Активността на CAT в дадена проба е непосредствено пропорционална на количеството радиоактивен хлорамфеникол, който се получава. Поради това, резултатите се изразяват в импулси (срт) на епруветка. Стандартна крива може да се получи, като се използва лизис буфер, който съд ържа известни количества пречистен CAT.

Резултатите са представени на фигура 3, която представлява диаграма, показваща средна стойност стандартно отклонение (mean sem) за три определяния в един типичен експеримент. Резултатите са представени по-долу в числен вид, като CAT-активността в клетките, обработени с pcDNA3CAT, е около 6 пъти по-висока, отколкото в контролните проби, което демонстрира успешна трансформация на клетките от ендометриума.

pcDNA3 pcDNA3CAT

7104480

6164134

6623234 средно 662 ± 271 3951 ± 372

В теста за луцифераза клетъчният екстракт, съдържащ луцифераза, се смесва с нейния субстрат луциферин, което води до излъчването на светлина. Интензивността на светлинния сигнал е пропорционална на луциферазния ензим, присъстващ в екстракта, и може да се измери с луминометър. Първоначалните резултати са дадени в относителни светлинни единици.

Резултатите са представени на фигура 4, която представлява диаграма, илюстрираща средна стойност ± стандартно отклонение (mean ± sem) за три определяния в един типичен експеримент. Резултатите са представени по-долу в числен вид. Сигналът от клетки, обработени с pcDNA3LUC, е над 30 пъти посилен, отколкото фоновия сигнал в контролните проби, което отново демонстрира успешна трансфекция на клетките от ендометриума.

Примери за възможни приложения на преноса на гени в ендометриума

Най-малко седем различни типа генни конструкции биха могли да се трансфектират в ендометриума за постигането на множество различни ефекти. Всеки от тези различни типове ще бъде описан по реда си.

1) Свръхекспресия на цитокини и растежни фактори

Това са концептуално най-простите типове конструкции, доколкото те ще са така проектирани, че да свръхекспресират цитокин или растежен фактор в епителните клетки на матката. Примерите на подходящи cDNA за подобна свръхекспресия включват тези, кодиращи LIF, VEGF, EGF, CSF, TNF, амфирегулин, както и множество интерлевкини и колония стимулиращи фактори. Показано е, че те се експресират естествено в ендометриума и се смята, че са важни за регулиране функцията на ендометриума. (Stewart et al., 1992, Nature, 359, 76-79); Chamock-Jones et al., 1994, Journal of Reproduction and Fertility, 101, 421-426; Charnock-Jones et al., 1993, Biology of Reproduction, 48, 1120-1128; Das et al., 1995, Molecular Endocrinology, 9, 691-; Tabibzadeh (1994, Human Reproduction Update, 9, 947-967) е публикувал обширен обзор в тази област). Всеки от тези агенти засяга различни аспекти на репродуктивната функция, включително имплантация, развитие на кръвоносните съдове и биология на левкоцитите. Поради това, възможни индикации за приложение на такива конструкции са случаите, когато се желае подобряване на плодовитостта, особено при добитъка, или за предпазване от забременяване при хората и техните домашни животни, както и за лечение на различни менструални нарушения при хората.

Пример на експеримент, за подобряване плодовитостта при добитъка

Съгласно изобретението LIF е от съществено значение за процеса на имплантация (Stewart et al., 1992, цитиран по-горе). Този фактор се произвежда от ендометриума по време на имплантацията. Поради това е възможно във видове, в които скоростите на загуба на ембриони са високи, чрез повишаване равнищата на експресия на LIF от ендометриума по време на имплантация да могат да се редуцират тези скорости на загуба. Ето защо трансфекцията на генна конструкция, предназначена да направлява синтезата на LIF в ендометриума по времето на имплантация, би могла да подобри степента на плодовитост при такива видове. Трансфектираните в ендометриума конструкции би трябвало да съдържат подходящи регулаторни последователности, които осигуряват продукцията на белтъка LIF по необходимото време. Вероятно това би могло да се постигне, като се използва промоторът от гена за LIF на посочените видове.

Могат да се разглеждат също така и подходи, предназначени за облекчаване на менструалната дисфункция при жените чрез използване на пренос на гени в ендометриума. Пример за това е промяната в развитието на кръвоносните съдове в ендометриума чрез трансфекция на ген, кодиращ ангиогенни растежни фактори, например VEGF. Би могло да се очаква, че локалното покачване на производството на VEGF ще засили капилярния растеж и ще предизвика уплътняване на ендометриума. По същия начин повишените равнища на VEGF могат да улеснят възстановяването на капилярите след менструация и по този начин да променят профила на кървене при пациенти, третирани с този тип конструкция.

2) Свръхекспресия на рецептори

Би могло да се допусне, че увеличаването на броя и типа рецептори, които се експресират от маточния епител, ще има значителни биологични последици. Типовете рецептори, чиято свръхекспресия може да се желае, включват, но не са ограничени до, рецептори за растежни фактори и цитокини, например, за EGF, TGFa, VEGF, както и за разнообра зие от колония стимулиращи фактори и интерлевкини. Рецепторите на стероидните хормони също са подходящи за експресия в епителните клетки. Би могло да се очаква, че такава трансфекция, ще е от полза в случаите, когато се желае подобряване на плодовитостта, предпазване от забременяване, лечение на менструално нарушение, а също и изясняване функцията на орфановите рецептори (орфановите рецептори са рецептори, чиито лиганди понастоящем не са известни). Орфановите рецептори са обект на голям интерес от страна на фармацевтичната промишленост, тъй като охарактеризирането на техните лиганди би могло да доведе до създаването на нови лекарства.

Развитието на ендометриума представлява сложен процес, който се опосредства от взаимодействието на много цитокини с техните рецептори и стимулиращите ефекти на яйчните стероиди често се осъществяват чрез тези цитокини. По-специално е показано (Nelson et al., 1992, Endocrinology, 131, 1657-1644), че TGFa е потенциален посредник на естрогенното действие в матка на мишки. Поради това, би могло да се очаква, че трансфекцията на конструкция, направляваща синтезата на този фактор, ще предизвика нарастване на ендометриума и по този начин би могла да повиши плодовитостта в ситуации, когато ендометриумът не се е развил адекватно. По подобен начин би могло да се предположи, че този фактор ще съдейства за възстановяване на епителната повърхност след менструация и, поради това, ще е полезен за лечение на менорагия.

Съществуват няколко члена на суперфамилията рецептори за стероидни хормони, за които лигандът понастоящем не е известен. Трансфекцията на такива cDNA в ендометриума би могла да бъде от голяма полза за изясняване биологичната функция на тези рецептори и, поради това, може да намери приложение в търсенето на нови фармацевтични агенти, които действат върху тези рецептори, (Evans 1988, Science 240, 889-895).

3) Трансфекция на конструкции, предназначени да блокират или възпрепятстват действието на цитокинови растежни фактори и други хормони.

Трансфекцията с природни антагонисти на цитокините и на растежните фактори разкрива възможността за моделиране функцията на ендометриума. Пример за такъв антагонист би могъл да бъде антагонистът на рецептора за интерлевкин 1 (Hannum et al., 1990 Nature 343, 336). Установено е, че въвеждането на този белтък блокира бременността в мишки (Simon et al., 1994 Endocrinology 134, 521528). Другите природни антагонисти на цитокини и растежни фактори включват природните разтворими рецептори. Разтворими рецептори са описани за множество системи от типа растежен фактор/цитокин. Например TNF (Engelmann et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 14497-14505), FGF (Givol et al., 1992, FASEB Journal, 6, 3362-3369), PDGF (Tiesman & Hart, 1993, J. Biol. Chem. 268, 9621-9628) и IL-6 (Novick et al., 1989, J. Exp. Med. 170, 1409-1414). Тяхна обща особеност е, че извънклетъчният рецепторен домен, свързващ лиганда, се освобождава от клетката като свободно разтворим фактор. Това се постига или чрез протеолиза или чрез алтернативен сплайсинг, което води до образуването на скъсена белтъчна молекула, в която отсъстват трансмембранният и вътреклетъчният домен. Kendall и Thomas (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10705-10709) описаха разтворим вариант на рецептора за VEGF, fit. Този белтък е в състояние да блокира действието на VEGF in vitro. Съгласно изобретението са изолирани други три cDNA, кодиращи допълнителни разтворими варианти (виж PCT/GB95/01213). Използването на тези природни агенти има някои предимства пред другите антагонисти (например анти-VEGF антитела). Тъй като те се срещат естествено в тялото, би могло да се предположи, че те не биха предизвиквали имунен отговор и биха се толерирали добре. Също така, доколкото те произлизат от рецептор, свързан с мембраната, свързващите (им) характеристики ще са много сходни и, поради това, те ще конкурират много ефективно за (свързване с) лиганда. Възможно е в природата да съществуват и други разтворими рецептори или те биха могли да се конструират in vitro. Вероятно е също така, че ако се експресира лиганд-свързващият домен на член от фамилията рецептори за стероидни хормони, той ще действа като доминантен негативен рецептор, доколкото би се конкурирал за лиганда, ако се експресира в клетката в достатъчно големи количества. Като алтернатива би могъл да се използва неактивиращ, но свързващ DNA “рецептор” за блокиране на генната тран скрйпция. Това приложение би било полезно за антагонизиране (неутрализиране) на действието върху природни стероиди, включително и върху такива, каквито са засега неидентифицираните лиганди за орфанови рецептори (Permick et al., 1994 Leukemia 8, 1797-1806). Биха могли да се конструират и трансфектират също така и рецептори от семейството рецептори със седем трансмембранни домена, дефицитни в предаването на сигнал.

Установено е, че разтворимият антагонист на рецептора за интерлевкин-1 (Eisenberg et al., 1990 Nature 343, 341) антагонизира действието на IL-1 in vivo (Simon et al., 1994 Endocrinology 134, 521-528). Поради това, би се очаквало, че трансфекцията на ендометриума с конструкцията на cDNA, предназначена да направлява синтезата на антагониста, ще блокира бременността в мишки.

Другите фактори, за които се предполага, че ще антагонизират действието на растежни фактори или цитокини, включват разтворими варианти на природните рецептори. Например разтворимият вариант на VEGE-peцептора за fit е описан от Kendall & Thomas (1993, цитирани по-горе), а също и от Воососк et al., (1955 J. Natl. Cancer Ins. 87, 506-516). Очаква се, че локалното образуване на такива фактори ще антагонизира действието на VEGF и може да доведе до полезно терапевтично приложение в случаите, когато се наблюдава хиперпролиферация на ендотелните клетки, например при множество менструални смущения, при които е желателно да се намили плътността на капилярите в ендометриума. Тук би могло да се включат и малигнени заболявания.

4) Използване на методи антисенс за възпрепятстване локалното производство на срецифичен белтък (ензим)

Алтернативен подход за блокиране действието на цитокини, растежни фактори и хормони се прилага при използването на антисенс или рибозомната техногия. Чрез нея в съответните клетки се блокира или образуването на лиганди или образуването на рецептори (James, 1991 Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 2 191-214; Albert & Morris, 1994 Trends in Pharmacological Sciences 15, 250-254).

Технологията антисенс се основава на свързването на т.нар. антисенс-олигонуклеотиди или полинуклеотиди с клетъчната mRNA. Това свързване възпрепятства транслацията на та зи mRNA и така намалява количеството от съответния белтък, който се произвежда в клетката. За този подход успешно се използвани синтетични олигонуклеотиди или полирибонуклеотиди. Очаквало се, че трансфекцията на олигонуклеотиди чрез липозоми или трансфекцията чрез липозоми на конструкции от DNA, които направляват синтеза на по-дълги антисенс-полирибонуклеотиди, ще редуцира избирателно и специфично производството на белтък в трансфектираната клетка. Рибозомите също възпрепятстват белтъчното производство чрез избирателно разкъсване на RNA, която кодира посочения специфичен белтък. И двата вида (антисенс или рибозом) могат да се трансфектират като полирибонуклеотиди или като конструкции от DNA, които направляват синтеза на такива полинуклеотиди (виж обзорите на James 1991 и на Albert & Morris 1994, цитирани по-горе). Един пример на такова приложение на антисенс-рибозим за блокиране на плодовитостта би бил следният. Вече е показано, че LIF е от съществено значение за процеса на имплантация при бременността у бозайници (Stewart et al., 1992, цитиран по-рано). Поради това се очаква, че трансфекцията на олигонуклеотиди или на конструкции от DNA, направляващи синтеза на антисенс-полирибонуклеотиди например на рибозоми, насочени срещу mRNA на LIF, ще преустанови синтеза на този фактор. Отсъствието на този фактор след това би довело до невъзможност за имплантация и поради това - до блокиране на зачеването.

Подобен подход е възможно да се използва за блокиране производството на ангиогенни растежни фактори, например на VEGF, който би преустановил пролиферацията на ендотелните клетки, която е необходима за растежа на туморите. Поради това, този тип терапия би могъл да носи особени предимства в случаите, когато се лекува малигнено заболяване.

5) Локално производство на имуноглобулини и на техни фрагменати

Като се използва модерната рекомбинантна DNA технология, е възможно да се получат едноверижни антитела, които имат почти същите характеристики на свързване, както цялото моноклонално антитяло, от което те са получени. Такива едноверижни антитела са експресирани успешно в бактерии (He et al., 1995

Immunology 84, 662-668). Възможно е да се създаде конструкция, която да направлява експресията на едноверижно антитяло и тя да се експресира в епителни клетки. Ако това се извърши в ендометриума in vivo, би могло да се предположи, че едноверижните антитела, насочени срещу даден стероиден хормон, биха се свързали със стероида и биха преустановили неговото действие в епителните клетки. Пример на подобно антитяло би могло да бъде едноверижното антитяло, получено от антипрогестероновото антитяло DB3 (He et al., 1995, цитиран по-горе). Ако това антитяло се секретира в лумена на матката, то също би се свързало с прогестерона и би могло да действува навсякъде в матката. Антителата, произвеждани локално по този начин и насочени срещу растежни фактори и цитокини, за които се знае, че са активни в ендометриума, биха могли да блокират тяхната функция.

В друго приложение локално произведените антитела участват в профилактиката или лечението на болести, предавани по полов път. Очаква се, че антителата, насочени срещу агента - например папилома вирус, HIV, хламидия, ще се секретират в лумена на матката и ще възпрепятстват инфекцията с него. Антителата, насочени срещу спермени или ооцитни антигени, биха могли да се разглеждат като играещи роля в контрацепцията.

6) Активна имунизация за постигане на имунитет в мукозата

Съгласно изобретението е създаден и метод, който би могъл да се използва за постигане на локален имунитет чрез проектирането на конструкции, които биха направлявали секрецията на антиген в лумена. Това би предизвикало локален имунен отговор и по този начин би се постигнал имунитет в специфично място на мукозата. Известно е (Home, 1967 Journal of Reproduction and Fertility 13, 563-566), че луменът на матката съдържа много левкоцити. Възможно е антигенът, който се произвежда от трансфектираните клетки на ендометриума, да се поеме от левкоцитите и след това да се представи за предизвикване на имунен отговор в мукозата. Доставянето на антигени в чревния канал води до подобен имунитет и е показано, че в някои случаи е много ефективно (например ваксиниране против полиомиелит).

7) Блокиране на местата за прикрепване на патогени

Прикрепването на патогените към мукозните повърхности често е съществено предварително условие за установяване на инфекцията. Поради това, блокирането на залавянето на патогените за тези места може да представлява метод за предпазване на човека или животните от заболяване, особено от заболявания, които се предават по полов път. Това се отнася не само за бактериални патогени (такива като определени патогенни щамове на E.coli и N. gonorrhoea), но също и за вирусни патогени. Много от вирусите при инфекция се прикрепват чрез “рецептор” върху клетъчната повърхност. Може да се очаква, че локалното производство на разтворим рецептор ще се конкурира с молекулите от повърхността на клетката и по този начин ще попречи на вирусната инфекция. По същия начин насищането на рецепторите от клетъчната повърхност с вирусни миметици (които действуват подобно на вирусния “лиганд”) също би могло да блокира инфекцията, както при локалното производство на специфични имуноглобулини или на ефективно свързващи се части от тях.

Claims (25)

1. Патентни претенции

   1. Метод за промяна на една или повече характеристики на клетки на репродуктивния тракт на бозайник, по-специално при хора, характеризиращ се с това, че в клетките се въвежда нуклеинова киселина.
2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина се въвежда в клетки на ендометриума.
3. 3. Метод съгласно всяка от претенциите 1 или 2, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина се въвежда в жлезистия епител на ендометриума.
4. 4. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина е DNA.
5. 5. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина се въвежда в периода след овулацията, до и включително в точката, в която е налице максимум в равнището на прогестерона в кръвта.
6. 6. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина се въвежда в липозо ма, вирус или друга носеща частица.
7. 7. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина се въвежда като плазмид или друга конструкция.
8. 8. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина включва промотор, оперативно свързан с последователност, предназначена да се транскрибира в еукариотна клетка.
9. 9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че промоторът е индуцируем.
10. 10. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина включва участък, оперативно свързан в посока антисенс с промотора, така че да се инхибира експресията на полипептид в клетките, в които се въвежда последователността.
11. 11. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че чрез въвеждането на последователността от нуклеинова киселина характеристиката се променя, вследствие на което се променя и плодовитостта на индивида.
12. 12. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина направлява експресията най-малко на ефективен участък от цитокин или растежен фактор.
13. 13. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина направлява експресията най-малкото на ефективен участък на един от следните (фактори): интерлевкин; фактор, инхибиращ левкемията (LIF); васкуларно-ендотелен растежен фактор (VEGF); епидермален растежен фактор (EGF); епидермален растежен фактор, свързващ хепарин (HBEGF); инсулинсвързващи растежни фактори I и II (IGF-I) и IGF-II); амфирегулин; колониястимулиращ фактор (CSF); тумор некрозисен фактор (TNF); хепатоцитен растежен фактор (HGF); и фибробластен растежен фактор (FGF).
14. 14. Метод съгласно всяка от претенциите от 1 до 11, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина направлява експресията най-малко на ефективен участък от антагонист на цитокин или от антагонист на растежен фактор.
15. 15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина направлява експресията на антагонист на рецептора за интерлевкин-1 или на разтворим рецептор за един от следните (фактори): трансформиращ растежен фактор (TGF)a; фибробластен растежен фактор (FGF); растежен фактор, произхождащ от тромбоцитите (PDGF); интерлевкин-6; васкуларно-ендотелен растежен фактор (VEGF); или хепатоцитен растежен фактор (“Met” рецептор).
16. 16. Метод съгласно всяка една от претенциите от 1 до 11, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина направлява експресията във и/или клетката наймалкото на ефективен участък от рецептор за растежен фактор, цитокин или стероиден хормон.
17. 17. Метод съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че въведената последователност от нуклеинова киселина направлява експресията най-малкото на ефективен участък от рецептор за един от следните (фактори); EGF, трансформиращ растежен фактор (TGF)a или VEGF.
18. 18. Метод съгласно всяка една от претенциите от 1 до 11, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина направлява експресията най-малкото на ефективен участък от полипептид, имащ локален имунологичен ефект.
19. 19. Метод съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина направлява експресията наймалкото на ефективен участък от антиген на патоген.
20. 20. Метод съгласно претенция 18 или 19, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина направлява експресията най-малкото на имуногенния участък от полипептид на един от следните (организми): HIV, папилома вирус, Chlamydia или N. gonorrhoea.
21. 21. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че въведената нуклеинова киселина направлява експресията на имуноглобулин или на ефективен негов участък.
22. 22. Състав, включващ нуклеинова киселина, предназначен за използване по метода съгласно всяка от предходните претенции.
23. 23. Използване на препарат, включващ нуклеинова киселина, съгласно всяка от претенциите от 1 до 22.
24. 24. Използване на състав, включващ нуклеинова киселина, за приготвянето на субстанция за промяна на една или повече характе- 5 ристики поне на някои от клетките на репродуктивния тракт при бозайник.
25. 25. Метод за получаването на състав, предназначен за използване по метода съгласно всяка от претенциите от 1 до 22, който метод се характеризира с това, че включва смесването на нуклеинова киселина с физиологично приемлива субстанция носител.