SK282495B6

SK282495B6 - Acylovaný inzulínový derivát a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje

Info

Publication number: SK282495B6
Application number: SK324-96A
Authority: SK
Inventors: Svend Havelund; John Broberg Halstrom; Ib Jonassen; Asser Sloth Andersen; Jan Markussen
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 2002-02-05
Also published as: FI961220A0; IL110977A; NO2004006I2; DE69428134D1; BG61611B1; EP1132404A2; WO1995007931A1; EP1132404A3; JP2000060556A; DE69428134T2; IL110977A0; LU91101I2; FR04C0020I1; JP2002308899A; NL300160I2; CA2171424C; KR100310122B1; DE122004000035I2; EP0792290A1; NO2017041I1

Abstract

Je opísaný acylovaný inzulínový derivát, v ktorom Xaa v polohe A21 a B3 sú nezávisle aminokyselinové zvyšky kódované genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys; Xaa v polohe B1 je Phe alebo je vypustený; Xaa v polohe B30 je a) nekódovaná, lipofilná aminokyselina, ktorá má 10 až 24 uhlíkových atómov, pričom acylová skupina s až 5 uhlíkovými atómami je viazaná k epsilon-aminoskupine LysB29 alebo (b) aminokyselinový zvyšok je vypustený, alebo je to akýkoľvek aminokyselinový zvyšok, ktorý je kódovaný genetickým kódom okrem Lys, Agr a Cys, pričom epsilon-aminoskupina LysB29 má lipofilný substituent; a akýkoľvek jeho Zn2+ komplex, za predpokladu, že keď v polohe B30 je Thr alebo Ala a v polohe A21 a B3 sú Asn a v polohe B1 je Phe, potom je inzulínový derivát Zn2+ komplex a farmaceutický prostriedok na liečenie cukrovky s jeho obsahom.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka acylovaného inzulínového derivátu, ktorý je rozpustný a má predĺžený čas pôsobenia, ako aj farmaceutického prostriedku, ktorý tento derivát obsahuje ako účinnú zložku. Acylované inzulínové deriváty sa používajú na liečbu cukrovky.

Doterajší stav techniky

Mnoho pacientov je liečených opakovanými dennými injekciami inzulínu v režime skladajúcom sa z jednej alebo dvoch denných injekcií protrahovaného inzulínu na pokrytie základnej potreby, doplňovaných injekciami rýchle účinkujúceho inzulínu na pokrytie potreby vo vzťahu k jedlu.

Prostriedky protrahovaného inzulínu sú v danej oblasti dobre známe. Jeden z hlavných typov prostriedkov protrahovaného inzulínu tvorí injikovateľná vodná suspenzia inzulínových kryštálov alebo amorfného inzulínu. V týchto prostriedkoch je obvykle použitý protamín inzulín, Zn inzulín alebo protamín Zn inzulín.

S použitím suspenzie je spojených niekoľko nedostatkov. Preto aby sa zaistilo presné dávkovanie, musia byť pred odobratím suspenzie z fľaštičky alebo vytlačením zo zásobníka častice inzulínu homogénne suspendované jemným trepaním. Taktiež pri skladovaní suspenzie inzulínu musí byť teplota udržovaná v užšom rozsahu ako pre roztok inzulínu, aby nedošlo ku koagulácii.

Zatiaľ čo sa predtým verilo, že protamíny sú neimunogénne, sa teraz zistilo, že protamíny môžu byť pre ľudí imunogénne a že ich použitie na lekárske účely môže spôsobiť tvorbu protilátok (Samuel a kol., Studies on the immunogenecity of protamines in humans and experimental animals by means of a micro-complement fíxation test, Clin. Exp. Immunol. 33, str. 252 - 260 (1978)).

Taktiež bolo objavené, že protamín-inzulínový komplex je sám osebe imunogénny (Kurtz a kol., Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-inzulins. Diabetologica 25, str. 322 - 324 (1983)). Preto musia niektorí pacienti, ktorí užívajú protrahované inzulínové prostriedky obsahujúce protamíny, užívanie prerušiť.

Iný typ protrahovaných inzulínových prostriedkov sú roztoky, ktoré majú hodnotu pH pod fyziologickým pH, pri ktorom sa inzulín zráža, keď je roztok injikovaný a pH sa zvýši. Nevýhodou týchto roztokov je, že distribúcia častíc zrazeniny podľa veľkosti, ktorá vzniká pri injikovaní roztoku v tkanive, a časové rozvrhnutie podávania lieku je závislé od prúdenia krvi v mieste injekcie a ďalších faktorov, z ktorých niektoré sú nepredvídateľné. Ďalším nedostatkom je to, že tuhé častice inzulínu môžu fungovať ako lokálne dráždidlo a spôsobiť zápal tkaniva v mieste vpichu.

WO 91/12817 (Novo Nordisk, A/S) opisuje protrahovaný rozpustný inzulínový prostriedok obsahujúci komplexy kobaltu (III). Protrakcia týchto komplexov je len stredná a biodostupnosť obmedzená.

Ľudský inzulín má 3 primáme aminoskupiny: N-koncovú skupinu A-reťazca a B-reťazca a ε-aminoskupinu Lys⁸²⁹. Niektoré deriváty inzulínu, ktoré sú substituované na jednej alebo viacerých týchto skupinách sú v danej problematike známe. US Patent č. 3 528 960 (Eli Lilly) sa týka N-karboxyaroylinzulínov, v ktorých jedna, dve alebo tri primáme aminoskupiny inzulínovej molekuly majú karboxyaroylovou skupinu. Boli objavené nešpecifický N^tB29-substituované inzulíny.

Podľa GB Patentu č. 1 492 997 (Nat. Res. Dev. Corp.), bolo objavené, že inzulín s karbamylovou substitúciou na N⁴³²⁹ má zlepšenú krivku hypoglykemického efektu.

JP predložený patentový návrh č. 1-254699 (Kodama Co., Ltd.) opisuje inzulín, kde je mastná kyselina naviazaná na aminoskupinu Phe⁸¹ alebo na ε-amino skupinu Lys®²⁹, alebo na obidve tieto skupiny. Cieľom uvedenej derivatizácie je získanie farmakologicky prijateľného, stabilného inzulínového preparátu.

Inzulíny, ktoré v polohe B30 majú aminokyselinu, ktorá má najmenej päť atómov uhlíka a pre ktorú nemusí byť kódovanie tripletom nukleotidov, sú opísané v podanom patentovom návrhu č. 57-067548 (Shionogi). Inzulínové analógy sú patentovo nárokované ako použiteľné na liečbu diabetes mellitus, najmä pre pacientov, ktorí sú rezistentní proti inzulínu, kvôli vzniku protilátok na hovädzí alebo prasací inzulín.

„Inzulínovými derivátmi“, ako sa používa v predkladanom dokumente, sú mienené zlúčeniny, ktoré majú molekulovú štruktúru podobnú ako ľudský inzulín, vrátane disulfidových môstikov medzi Cys^A7 a Cys⁸⁷ a medzi Cys^A2° a Cys⁸¹⁹ a vnútorný disulfidový môstik medzi Cys^A6 a Cys^Ä11, a ktoré majú inzulínovú aktivitu.

tak stále pretrváva potreba protrahovaných injikovateľných inzulínových prostriedkov, ktoré sú roztokmi a obsahujú inzulíny, ktoré zostanú v roztoku po injikácii a majú minimálne zápalové a imunogénne vlastnosti.

Jedným predmetom predkladaného vynálezu je predložiť deriváty ľudského inzulínu s protrahovanou krivkou pôsobenia, ktoré sú rozpustné pri fyziologických hodnotách pH.

Ďalším predmetom predkladaného vynálezu je predložiť farmaceutický prostriedok obsahujúci deriváty ľudského inzulínu podľa predkladaného vynálezu.

Ďalším predmetom predkladaného vynálezu je predložiť spôsob prípravy derivátov ľudského inzulínu podľa predkladaného vynálezu.

Podstata vynálezu

Neočakávane sa zistilo, že niektoré deriváty ľudského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys⁸²⁹ má lipofilný substituent, majú protrahovanú krivku pôsobenia a sú rozpustné pri fyziologických hodnotách pH.

V súlade s tým, zo širšieho hľadiska, sa predkladaný vynález týka inzulínového derivátu, ktorý má nasledujúcu sekvenciu:

A-reťazec S -S

I ⁷

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 | 8 9 10 1112

S

I

B-reťazecS

Xaa-Val-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val1 23456789 10 1112

SK 282495 Β6

A-reíaiec (pokračovanie)

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (sekvencia id. č.:l)

14 15 16 17 18 1921

S

B-rečazec (pokračovanie) X

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324

B-reťazec (pokračovanie)

Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Xaa (sekvencia id. č.:2)

26 27 28 2930 kde Xaa v polohe A21 a B3 je nezávisle vybrané zo skupiny, ktorá sa skladá z aminokyselinových zvyškov, ktoré môžu byť kódované genetickým kódom, okrem Lys, Arg a Cys; Xaa v polohe BI je Phe alebo je vypustené; Xaa v polohe B30 je (a) nekódovaná, lipofilná aminokyselina, ktorá má 10 až 24 uhlíkových atómov, v tom prípade acylová skupina karboxylovej kyseliny s až piatimi atómami uhlíka je naviazaná na ε-aminoskupinu Lys⁸²⁹, (b) akýkoľvek aminokyselinový zvyšok, ktorý môže byť kódovaný genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys, v tom prípade ε-aminoskupina Lys⁸²’ má lipofilný substituent alebo (c) je vypustené, v tom prípade ε-aminoskupina Lys⁸²⁹ má lipofilný substituent; a akékoľvek jeho Zn²⁺ komplexy, za predpokladu, že pokiaľ Xaa v polohe B30 je Thr alebo Ala, Xaa v polohe A21 a B3 sú obidva Asn, a Xaa v polohe BI je Phe, potom je inzulínový derivát Zn²⁺ komplex.

V preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde B30 aminokyselinový zvyšok je vypustený alebo je to akýkoľvek aminokyselinový zvyšok, ktoiý môže byť kódovaný genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys; A21 a B3 aminokyselinové zvyšky sú nezávisle vybrané zo skupiny, skladajúcej sa z aminokyselinových zvyškov, ktoré môžu byť kódované genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys; Phe⁸¹ môže byť vypustený; ε-aminoskupina Lys⁸²⁹ má lipofilný substituenL ktorý má najmenej 6 uhlíkových atómov; 2 až 4 Zn²⁺ ióny môžu byť naviazané na každý inzulínový hexamér, s podmienkou, že pokiaľ B30 je Thr alebo Ala a A21 a B3 sú obidva Asn, a Phe⁸¹ nie je vypustený, potom sú 2 až 4 Zn²⁺ ióny naviazané na každý hexamér inzulínového derivátu.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde B30 aminokyselinový zvyšok je vypustený alebo je to akýkoľvek aminokyselinový zvyšok, ktorý môže byť kódovaný genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys; A21 a B3 aminokyselinové zvyšky sú nezávisle vybrané zo skupiny, skladajúcej sa z akéhokoľvek aminokyselinového zvyšku, ktorý môže byť kódovaný genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys; s podmienkou, že keď B30 aminokyselinový zvyšok je Ala alebo Thr, potom najmenej jeden zvyšok A21 a B3 je iný ako Asn; Phe⁸' môže byť vypustený; ε-aminoskupina Lys⁸²⁹ má lipofilný substituent, ktorý obsahuje najmenej 6 uhlíkových atómov.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselinový zvyšok B30 je vypustený alebo je to akýkoľvek aminokyselinový zvyšok, ktorý môže byť kódovaný genetickým kódom, okrem Lys, Arg a Cys; A21 a B3 aminokyselinové zvyšky sú aminokyselinové zvyšky sú nezávisle vybrané zo skupiny, skladajúcej sa z akéhokoľvek aminokyselinového zvyšku, ktorý môže byť kódovaný genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys; Phe⁸¹ môže byť vypustený; ε-aminoskupina

Lys⁸²⁹ má lipofilný substituent, ktorý obsahuje najmenej 6 uhlíkových atómov; a 2 až 4 Zn²⁺ ióny sú naviazané na každý hexamér inzulínového derivátu.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselinový zvyšok B30 je vypustený.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselinový zvyšok B30 je Asp.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselinový zvyšok B30 je Glu.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselinový zvyšok B30 je Thr.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je lipofilná aminokyselina, ktorá má najmenej 10 uhlíkových atómov.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je lipofilná α-aminokyselina, ktoTá má 10 až 24 uhlíkových atómov.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je alifatická nasýtená α-aminokyselina s rovným reťazcom, ktorá má 10 až 24 uhlíkových atómov.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je D- alebo L-N^e-dodekanoyllysín.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je a-aminodekánová kyselina.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je a-aminoundekánová kyselina.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je a-aminododekánová kyselina.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je a-aminotridekánová kyselina.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je a-aminotetradekánová kyselina.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je a-aminopentadekánová kyselina.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je a-aminohexadekánová kyselina.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde aminokyselina B30 je α-aminokyselina.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde A21 aminokyselinový zvyšok je Ala.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde A21 aminokyselinový zvyšok je Gin.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde A21 aminokyselinový zvyšok je Gly.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde A21 aminokyselinový zvyšok je Ser.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde B3 aminokysclinový zvyšok je Asp.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde B3 aminokyselinový zvyšok je Gin.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde B3 aminokyselinový zvyšok je Thr.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys®²⁹ má lipofilný substituent, ktorým je acylová skupina zodpovedajúca karboxylovej kyseline, ktorá má najmenej 6 atómov uhlíka.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys®²⁹ má lipofilný substituent, ktorým je prípadne rozvetvená acylová skupina, ktorá odpovedá karboxylovej kyseline, ktorá má uhlíkový reťazec s dĺžkou 8 až 24 atómov.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys®²⁹ má lipofilný substituent, ktorým je acylová skupina zodpovedajúca mastnej kyseline, ktorá má najmenej 6 uhlíkových atómov.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys®²⁹ má lipofilný substituent, ktorým je acylová skupina zodpovedajúca lineárnej, nasýtenej karboxylovej kyseline, ktorá má 6 až 24 uhlíkových atómov.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys®²⁹ má lipofilný substituent, ktorým je acylová skupina zodpovedajúca lineárnej, nasýtenej karboxylovej kyseline, ktorá má 8 až 12 uhlíkových atómov.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys®²⁹ má lipofilný substituent, ktorým je acylová skupina zodpovedajúca lineárnej, nasýtenej karboxylovej kyseline, ktorá má 10 až 16 uhlíkových atómov.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys®²⁹ má lipofilný substituent, ktorým je oligooxyetylénová skupina obsahujúca až 10, výhodnejšie až 5, oxyetylénových jednotiek.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys®²⁹ má lipofilný substituent, ktorým je oligooxypropylénová skupina obsahujúca až 10, výhodnejšie až 5, oxypropylénových jednotiek.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde sú na každý inzulínový hexamér naviazané 2 Zn²⁺ ióny.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde sú na každý inzulínový hexamér naviazané 3 Zn²⁺ ióny.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu, kde sú na každý inzulínový hexamér naviazané 4 Zn²⁺ ióny.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka derivátov ľudského inzulínu podľa vynálezu na prípravu liečiv na liečbu diabetu.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka farmaceutických prostriedkov na liečbu diabetu pacientov, ktorí takúto liečbu potrebujú, zahŕňajúce terapeuticky účinné množstvo derivátov ľudského inzulínu podľa vynálezu spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka farmaceutických prostriedkov na liečbu diabetu pacientov, ktorí takúto liečbu potrebujú, zahŕňajúce terapeuticky účinné množstvo derivátov ľudského inzulínu podľa vynálezu v zmesi s inzulínom alebo s analógmi inzulínu, ktoré majú rýchly začiatok pôsobenia, spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich deriváty ľudského inzulínu podľa vynálezu, ktoré sú rozpustné pri fyziologických hodnotách pH.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich deriváty ľudského inzulínu podľa vynálezu, ktoré sú rozpustné pri hodnotách pH 6,5 až 8,5.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka protrahovaných farmaceutických prostriedkov obsahujúcich deriváty ľudského inzulínu podľa predkladaného vynálezu.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka farmaceutických prostriedkov, ktoré sú roztoky obsahujúce 120 nmol/ml až 1200 nmol/ml, výhodnejšie 600 nmol/ml derivátov ľudského inzulínu podľa predkladaného vynálezu.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka spôsobu liečby diabetu pacientov, ktorí takúto liečbu potrebujú, zahŕňajúci podávanie účinného množstva derivátov ľudského inzulínu podľa vynálezu spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.

V inom preferovanom prevedení sa vynález týka farmaceutických prostriedkov na liečbu diabetu pacientov, ktorí takúto liečbu potrebujú, zahŕňajúcu podávanie účinného množstva derivátov ľudského inzulínu podľa vynálezu v zmesi s inzulínom alebo s analógmi inzulínu, ktoré majú rýchly začiatok pôsobenia, spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.

Príklady preferovaných derivátov ľudského inzulínu podľa predkladaného vynálezu, v ktorých nie sú naviazané ióny Zn²⁺, sú nasledujúce:

N“²⁹-tridekanoyl des(B30) ľudský inzulín, N^tB29-tetradekanoyl des(B30) ľudský inzulín, N^’-dekanoyl des(B30) ľudský inzulín, N^£®²⁹-dodekanoyl des(B30) ľudský inzulín, N^E®²⁹-tridekanoyl Gly*²¹ des(B30) ľudský inzulín, N‘^B29-tetradekanoyl Gly*²¹ des(B30) ľudský inzulín, N^eB29-dekanoyl Gly*²¹ des(B30) ľudský inzulín, N^£B29-dodekanoyl Gly*²¹ des(B30) ľudský inzulín, N^£®²⁹-tridekanoyl Gly*²¹ Gin®³ des(B30) ľudský inzulín, N^EB29-tctradckanoyl Gly*²¹ Gin®³ des(B30) ľudský inzulín, N'^B29-dekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín, N^’-dodekanoyl Gly*²¹ Gin®³ des(B30) ľudský inzulín, N^EB29-tridckanoyl Ala*²¹ des(B30) ľudský inzulín, N'^B29-tetradekanoyl Ala*²¹ des(B30) ľudský inzulín, N^£®²⁹-dekanoyl Ala*²¹ des(B30) ľudský inzulín, N^EB29-dodekanoyl Ala*²¹ des(B30) ľudský inzulín, N^cB29-tridekanoyl Ala*²¹ Gin®³ des(B30) ľudský inzulín, N^£B29-tetradekanoyl Ala*²¹ Gin®³ des(B30) ľudský inzulín, N'^B29-dekanoyl Ala*²¹ Gin®³ des(B30) ľudský inzulín, N^E®²⁹-dodekanoyl Ala*²¹ Gin®³ des(B30) ľudský inzulín, N'^BM-tridekanoyl Gin⁰³ des(B30) ľudský inzulín, N^cB29-tetradekanoyl Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín, N^EB29-dekanoyl Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín, N^E®²⁹-dodekanoyl Gin®³ des(B30) ľudský inzulín, N^E®²⁹-tridekanoyl Gly*²¹ ľudský inzulín, N^’-tetradekanoyl Gly*²¹ ľudský inzulín, N^E®²⁹-dekanoyl Gly*²¹ ľudský inzulín, N^E®²⁹-dodekanoyl Gly*²¹ ľudský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Gly*²¹ Gin®³ ľudský inzulín, N'^BM-tetradekanoyl Gly*²¹ Gin®³ ľudský inzulín, N^EB29-dekanoyl Gly*²¹ Gin®³ ľudský inzulín, N^sB29-dodekanoyl Gly*²¹ Gin®³ ľudský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Ala*²¹ ľudský inzulín, N^E®²⁹-tetradekanoyl Ala*²¹ ľudský inzulín,

SK 282495 Β6

N^tB29-dckanoyl Ala*²¹ ľudský inzulín, N^’-dodekanoyl Ala*²¹ ľudský inzulín, N^eB29-tridekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín, N^cB29-tetradekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín, N^eB29-dekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín, N^cB29-dodckanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín, N^’-tridekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín, N^tB29-tetradekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín, N^tB29-dekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín, N‘^B29-dodekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N'^B29-tetradekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^’-dekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^tB29-dodekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^tB29-tridekanoyl Gly*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^EB29-tetradekanoyl Gly*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^’-dekanoyl Gly*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^cB29-dodekanoyl Gly*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^cB29-tridekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^’-tetradekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^EB29-dekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^sB29-dodekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^cB29-tridekanoyl Ala*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^sB29-tetradekanoyl Ala*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N'^BW-dekanoyl Ala*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^tB29-dodekanoyl Ala*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N'^B29-tetradekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N'⁸²⁹-dekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^£B29-dodekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^’-tridekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N'^B29-tetradekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín, N^’-dekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín a N^EB29-dodekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín.

Príklady preferovaných derivátov ľudského inzulínu podľa predkladaného vynálezu, v ktorých sú naviazané dva ióny Zn²⁺ na každý inzulínový hexamér, sú nasledujúce: (N^eB29-tridekanoyl des(B30) ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl des(B30) ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^’-dekanoyl des(B30) ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^’-dodekanoyl des(B30) ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^eB29-tridekanoyl Gly*²¹ des(B30) ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^-tetradekanoyl Gly*²¹ des(B30) ľudský inzulín^ 2Zn²⁺, (N^’-dekanoyl Gly*²¹ des (B30) ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^’-dodekanoyl Gly*²¹ des(B30) ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^-tridekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ des(B30)ľudský inzulín)^ 2Ζη^, (N^-tetradekanoyl Gly^’Gh^des^Ojľudský inzulín^ 2Ζη* (N^-dekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ des(B30) lúdský inzulín)^ 2Zn*, (N^-dodekanoyl Gly*²¹ Gin⁸⁵ des(B30) ľudský inzulink 2Zn²’. (N^-tndekanoyl Ala*²¹ des(B30) ľudský inzulín^ 2ΖΠ²*, (N^-tetradekanoyl Ala*²¹ des(B30) ľudský' inzulín^ 2ΖΠ²*·, (N^-dekanoyi Ala*²¹ des (B30) ľudský inzulín^ 2Zn*, (N^-dodekanoyl Ala*²¹ des(B30) ľudský inzulín^ 2Zn^:‘, (N^-tndekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ des(B30)ľudský inzulín^ 2Zn²\ (N^-tetnriekanoyl Ala^G^des^Ojľudský inzulín)^ 2Zn²*, (N^-dekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín^ 2Zn²’, (N^-dodekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín^ 2Zn^, (N^-tridekanoyl Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín^ ŽZh²⁴, (N^-tetradekanoyi Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulink ŽZn²*, (N^£B29-dekanoyl Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín)s, 2Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gin⁸³ des (B30) ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^cB29-tridek.anoyl ľudský inzulín)^, 2Zn²⁺, (N^t829-tetradekanoyl ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^cB29-dodekanoyl ľudský inzulín),;, 2Zn²⁺6 (N^EB29-tridekanoyl Gly*²¹ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^cB29-tetradekanoyl Gly*²¹ ľudský inzulín)^, 2Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gly*²¹ ľudský inzulín)^ 2Zn²⁺, (N^cB29-dodekanoyl Gly*²¹ ľudský inzulin)6,2Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)s, 2Zn²⁺, (N^:eB29-tetradekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^eB29-dekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulin)6,2Zn²⁺, (N^’-tridekanoyl Ala*²¹ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^’-tetradekanoyl Ala*²¹ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^’-dekanoyl Ala*²¹ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Ala*²¹ ľudský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^eB29-tridekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)^, 2Zn²⁺, (N^’-tetradekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^’-dekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^’-dodekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^’-tetradekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^’-dekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^eB29-dodekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^’-tridekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^eB29-tetradekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^’-dekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)^, 2Zn²⁺, (N^EB2’-dodekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^’-tridekanoyl Gly*²¹ Glu⁸³ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^cB29-tetradekanoyl Gly*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^eB29-dekanoyl Gly*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín),;, 2Zn²⁺, (N^cB29-dodekanoyl Gly*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^, 2Zn²⁺, (N^-tndekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 2ΖΠ²⁴, (N^-tetradekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 2Zn²\ (N^-dekanoyi Gly*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 22^, (N^-dodekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 2Zn²¹', (N^EB29-tridekanoyl Ala*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Ala*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^ED29-dekanoyl Ala*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)^, 2Zn²⁺, (N^£B29-dodekanoyl Ala*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzuím)s, 2Zn²⁺, (N'^’-tridekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^, 2Zn²⁺, (N^-tctradekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 2Zrt\ (N'^fl29-dekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulínjg, (N^-dodekanoyl Ala*²¹ Gin“ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín), 2Zn²⁺(N^e829-tridekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)s, 2Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^eB29-dckanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^eB29-dodekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,2Zn²⁺.

Príklady preferovaných derivátov ľudského inzulínu podľa predkladaného vynálezu, v ktorých sú naviazané tri ióny Zn²⁺ na každý inzulínový hexamér, sú nasledujúce: (N“²⁹-tridekanoyl des(B30) ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^rBM-tctradckanoyl des(B30) ľudský inzulín)^ 3Zn²⁺, (N^’-dekanoyl des (B30) ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^eB29-dodekanoyl des(B30) ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^eB29-tridekanoyl Gly*²¹ des(B30) ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^-tetradekanoyl Gly*²¹ des(B30) ľudský inzulín^ 3ΖΠ²*, (N^-dekanoyl Gly*²¹ des (B30) ľudský inzulín^, 3Zn²⁺, (N^-dodekanoyl Gly*²¹ des(B30) ľudský inzulín^ 3^, (N^-tridekanoyl Gly*²¹ Gin⁸³ des(B30)ľudský inzulín^Zn²*, (N^-tetradekanoyl Gly^A21Gln“des(B30)ľudský inzulín^ 3Ζη^ (N^-dekanoyl Gly*²¹ Gin“ des(B30) lúdský inzulín^ 3S1* (N^-dodekanoyl Gly*²¹ Gin“ des(B30) ľudský inzulín),, 3ΖΠ²⁴, (N^-tridekanoyl Ala*²¹ des(B30) ľudský inzulín^ 32η²*, (N^-tetradekanoyi Ala*²¹ des(B30) ľudský inzulín^ 3Zn* (N^EB29-dekanoyl Ala*²¹ des (B30) ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^’-dodekanoyl Ala*²¹ des(B30) ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^-tridekanoyl Ala*²¹ Gin“ des(B30)ľudský inzulín^ SZn²¹·, (N^-tetradekanoyl Ala^A21Gln“des(B30)ľudský inzulínje, 3Zn²¹, (N^-dekanoyi Ala*²¹ Gin“ des(B30) ľudský inzulín^ 3Zn²⁺, (N^-dodekanoyl Ala*²¹ Gin“ des(B30) ľudský inzulín)^ 32η², (N^-tridekanoyl Gin“ des(B30) ľudský inzulín)^, 32η²*, (bŕ^-tetiadekanoyl Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín)^ 3Zn^w,

SK 282495 Β6 (N^tB29-dekanoyl Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín)6, 3Zn* (N^-dodekanoyl Gin⁸³ des (B30) ľudský inzulín)6,3Zn*, (N^cB29-tridekanoyl ľudský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^’-tetradekanoyl ľudský inzulín)6,3Zn* (N^’-dekanoyl ľudský inzulín)₆,3Zn²⁺, (N'^B29-dodekanoyl ľudský inzulín)6, 3Zn*6, (N^’-tridekanoyl Gly“¹ ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Gly“¹ ľudský inzulín)6, 3Zn* (N^EE29-dekanoyl Gly“¹ ľudský inzulín)6,3Zn* (N^tE29-dodekanoyl Gly“¹ ľudský inzulín)6,3Zn^z+, (N^EB29-tridekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6, 3Zn^z+, (N^’-tetradekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6, 3Zn^z+, (N^fB29-dekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^eB29-tridekanoyl Ala“¹ ľudský inzulín)6,3Zn^z+, (N^EB29-tetradekanoyl Ala“¹ ľudský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^eB29-dckanoyl Ala“¹ ľudský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Ala“¹ ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N'^B29-tridekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^eB29-tetradekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^£B29-dekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^’-dodekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6, 3Zn* (N^eB29-tridekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín)6, 3Zn^z+, (N^cB29.tetradekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulin)6,3Zn*, (N^’-dekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín)s, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulin)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N'^B29-dodekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulm)6,3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Gly“¹ Glu⁸³“ ľudský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^s829-tetradekanoyl Gly“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N'^B29-dekanoyl Gly“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^cB29-dodekanoyl Gly“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,3Zn*, (N^-tridekanoyl Gly“¹ Gh⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 3Zn* (N^-tetradekanoyl Glý^'GIr^Glu⁸³⁰ ľudsícý inzulín^ 3Zn* (N^-dekanoyl Gly“¹ Gln^Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)^ 32n*, (N^-dodekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský^- inzulín^ 3äi* (N^EB29-tridekanoyl Ala“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^, 3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Ala“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,3Zn^z+, (N^tB29-dekanoyl Ala“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulln)6,3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Ala“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^-tridekanoyl Ala^'Gln^Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 3Zn*, (N^-tetradekanoyl Ala“¹ Gin“ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)^ 3Zn* (N^-dekanoyi Ala“¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)^ 3Zn* (N^-dodekanoyl Ala“¹ Gin“ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 3Zn* (N^EB29-tridekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6, 3Zn*, (N^’-tetradekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,3Zn*, (N^EB29-dekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6, 3Zn²⁺.

Príklady preferovaných derivátov ľudského inzulínu podľa predkladaného vynálezu, v ktorých sú naviazané štyri ióny Zn²⁺ na každý inzulínový hexamér, sú nasledujúce: (N -tridekanoyl des(B30) ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^eB29-tetradekanoyl des(B30) ľudský inzulín)6,4Zn*, (N^EB29-dekanoyl des(B30) ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^eB29-dodekanoyl desfB30) ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^cB29-tridekanoyl Gly“¹ des(B30) ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B2’-tetradekanoyi Gly“¹ des(B30) ľudský inzulín^ 4Zn* (N^EB29-dekanoyl Gly“¹ des(B30) ľudský inzulín)6,4Zn*, (N^-dodekanoyl Gly“¹ des(B30) ľudský inzulínje, 4Zn* (N^-tridekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ des(B30)ľudský inzulín^ 4Zn* (N^-tetradckanoyl Gly“¹Gln⁸³des(B30)l'udsÍfy inzulín);,, 4Zn*, (N^-dekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ des(B30) ľiídský inzulín^ 4Zn*, (N^-dodekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín^ 4Zn*, (N'^-tridekanoyl Ala“¹ des(B30) ľudský inzulín^ 4Zh, (N^-tetradekanoyl Ala“¹ des(B30) ľudský inzulín^ 4Zn* (N^-dekanoyi Ala“¹ des (B30) ľudský inzulín^ 4Zn*, (N^-dodekanoyl Ala“¹ des(B30) ľudský inzulín^ 4Zn*, (N’^’-tridekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ des(B30)ľudský inzulín^ 42h*, (N^-tetradekanoyi Ala^Ghŕ’de^BSOjlbdský inzulínj^, 4Zn* (N^-dekanoyi Ala“¹ Gh⁸³ des(B30) ľudský inzulín^ 42n* (N^-dodekanoyi Ala“¹ Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín^ 42n* (K^-tridekanoyl Gh⁸³ dcs(B3 0) ľudský inzulín^ 42h* (N^-tetiadekanoyl Gin⁸³ des(B30) ľudský inzuíín)6,4Zn*, (N^EB29-dekanoyl Gin⁸³ des(B30) ľudský inzulín^, 4Zn²⁺, (N^eB29-dodekanoyl Gin⁸³ des (B30) ľudský inzulín)6,4Zn^z+, (N^E029-tridekanoyl ľudský inzulín)6,42n*, (N^’-tetradekanoyl ľudský inzulín)₆,4Zn²⁺, (N^’-dekanoyl ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^cB29-dodekanoyl ľudský inzulín)6,42n*6, (N^eB29-tridekanoyl Gly“¹ ľudský inzulín)6,4Zn*, (N^eB29-tetradekanoyl Gly“¹ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gly“¹ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E829-dodekanoyl Gly“¹ ľudský inzulín)6,4Zn^z+, (N^EB29-tridekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,4Zn*, (N^EB29-tetradekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^’-dekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ ľudský mzulín)6,42n* (N^EB29-dodekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Ala“¹ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Ala“¹ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Ala“¹ ľudský inzulin)6,42n* (N^£B29-dodekanoyl Ala“¹ ľudský inzulín)6,42n* (N^EB29-tridekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N’^’-tetradekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín^, 4Zn^z+, (N^EB29-dekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,4Zn* (N^EB29-dodekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ ľudský inzulín)6,4Zn^z+, (N^EB29-tridekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín^, 4Zn , (N^’-tetradekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín^, 4Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gin⁸³ ľudský inzulín)6,4Zn*, (N^tB29-tridekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,4Zn*, (N^EB29-tetradekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^’-dekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^tEM-dodekanoyl Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,4Zn*, (N^EB29-tridekanoyl Gly“¹ Glu⁸™ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^eB29-tctradekanoyl Gly“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gly“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,4Zn* (N^EB29-dodekanoyl Gly*²¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^-tridckanoyi Gly“¹ Gh⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 4Zn* (N^-tetradekanoyl Gly“¹ Gh⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 4Zn* (N^-dekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 4Zh*, (N^-dodekanoyl Gly“¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)^ 4Zn* (N^-tridekanoyi Ala“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 4Zn* (N^-tetradekanoji Ala“¹ Glu⁸³⁰ ľudský^- inzulín^ 4Zh*, (N^-dekanoyl Ala“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^, 4Zn*, (N^-dodekanoyl Ala“¹ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 4Zn*, (N^-tridekanoyi Ala“¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^ 4Zn* (N^-tetradekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín^» 42h* (N^-dekanojd Ala“¹ ΟτΡ’αιΓ’Ί^ΐηζίΐΙίηΜΖι?³, (N^-dodekanoylAla^l Gin“ Glu^ ľudský inzulín)^, 4Zn*, (N'^B29-tridekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,4Zn* (N^E829-tetradekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)6,4Zn* (N^’-dodekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ ľudský inzulín)₆,4Zn*

Prehľad obrázkov na výkresoch

Predkladaný vynález je ďalej opísaný s odkazmi na priložené obrázky, kde obr. 1 ukazuje konštrukciu plazmidu pEA5.3.2; obr. 2 ukazuje konštrukciu plazmidu pEA108 a obr. 3 ukazuje konštrukciu plazmidu pEAl 13.

SK 282495 Β6

Podrobný opis vynálezu Terminológia

Trojpismenové kódy a jednopísmenové kódy pre aminokyselinové zvyšky sú tu použité tak, ako je uvedené v J. Biol. Chem. 243, str. 3558 (1968).

V sekvenciách DNA: A je adenín, C je cytozín, G je guanínaTjetymín.

Sú použité nasledujúce skratky:

DMSO pre dimetylsulfoxid, DMF pre dimetylformamid, Boe pre terc-butoxykarbonyl, RP-HPLC pre HPLC na reverznej fáze, X-OSu pre N-hydroxysukcinimidester, X pre acylovú skupinu a TFA pre trifluóroctovú kyselinu.

Príprava lipofílných derivátov inzulínu

Deriváty inzulínu podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené napr. nasledujúcim spôsobom:

1. Deriváty inzulínu, ktoré majú v polohe B30 aminokyselinový zvyšok, ktorý môže byť kódovaný genetickým kódom, napr. treonín (ľudský inzulín) alebo alanín (prasací inzulín)

1.1. Východisková látka je ľudský inzulín

Ľudský inzulín reaguje s Boc-činidlom (napr. di-terc-butyldikarbonát) za vzniku (Al,Bl)-diBoc ľudského inzulínu, t. j. ľudského inzulínu, kde N-konce obidvoch reťazcov sú chránené Boc-skupinou. Po nepovinnom čistení, napr. HPLC, je acylová skupina zavedená na ε-aminoskupinu Lys⁸²⁹ tak, že produkt necháme reagovať s N-hydroxysukcinimidesterom, ktorý má všeobecný vzorec (I)

X-OSu ([), kde X je acylová skupina, ktorá má byť zavedená. V poslednom kroku je použitá TFA k odstráneniu Boc-skupín a je izolovaný produkt, ΝΒ^εΒ29-Χ ľudský inzulín.

1.2. Východisková látka je jednoreťazcový inzulínový prekurzor.

Ako východisková látka môže byť použitý jednoreťazcový inzulínový prekurzor, predĺžený v polohe Bl predĺžením (Ext), ktoré je napojené na Bl cez arginínový zvyšok a kde môstik od B30 na Al je arginínový zvyšok, t. j. zlúčenina so všeobecným vzorcom (II):

Ext-Arg-B(i-30) -Arg-A(i-2i) (Π).

Acyláciou tohto východiskového materiálu N-hydroxysukcinimidesterom, ktorý má všeobecný vzorec (I), kde X je acylová skupina, je zavedená acylová skupina X na e-aminoskupinu Lys⁸²⁹ a na N-koncovú aminoskupinu prekurzora. Reakciou tohto acylovaného prekurzora, ktorý má všeobecný vzorec (III) (N^CBae-X>, Ext-Arg-B(l-30)-Arg-A(l-21) (ΙΠ) s trypsínom v zmesi s vodou a vhodného s vodou miesiteľného rozpúšťadla, napr. DMF, DMSO alebo nižšieho alkoholu, sa získa meziprodukt (N^-X), Arg⁸³¹ inzulín. Reakciou tohto meziproduktu s karboxypeptidázou B získame žiadaný produkt, (N^-X) inzulín.

2. Deriváty inzulínu bez aminokyselinového zvyšku v polohe B30, t j. des(B30) inzulíny.

2.1. Východisková látka je ľudský inzulín alebo prasací inzulín

Reakciou ľudského inzulínu i prasačieho inzulínu s karboxypeptidázou A v amónnom pufre získame v obidvoch prípadoch des(B30)inzulín. Po nepovinnom čistení reaguje des(B30)inzulín s Boc-činidlom (napr. di-terc-butyl dikarbonát) za vzniku (Al.Bl)-diBoc des(B30)inzulínu, t. j.

des(B30)inzulín, kde N-konce obidvoch reťazcov sú chránené Boc-skupinou. Po nepovinnom čistení, napr. HPLC, je acylová skupina zavedená na ε-aminoskupinu Lys⁸²⁹ tak, že produkt necháme reagovať s N-hydroxysukcinimidesterom, ktorý má všeobecný vzorec (I), kde X je acylová skupina, ktorá má byť zavedená. V poslednom kroku je použitá TFA k odstráneniu Boc-skupín a izoluje sa produkt, (Ν^εΒ29-Χ) des(B30)inzulín.

2.2. Východisková látka je jednoreťazcový inzulínový prekurzor

Ako východisková látka môže byť použitý jednoreťazcový inzulínový prekurzor, predĺžený v polohe Bl predĺžením (Ext), ktoré je napojené na Bl cez arginínový zvyšok a ktorý má môstik od B30 na Al. Výhodnejší je môstik peptid, ktorý má všeobecný vzorec (V):

(V), kde Y je kódovaná aminokyselina okrem lyzínu a arginínu, a n je nula alebo celé číslo 1 až 35. Keď a > 1, Y môžu byť iné aminokyseliny. Preferované príklady môstika medzi B30 na Al sú: AlaAlaArg, SerArg, SerAspAspAlaArg a Arg (Európsky patent č. 163529). Reakciou takéhoto prekurzora, ktorý má všeobecný vzorec (VI):

Ext-Arg-B(l-301 -Y„-Arg-A(l-2U (VI) s lyzylovou endopeptidázou, napr. proteázou Achromobackter lyticus, získame Ext-Arg-B(l-29)Thr-Y_n-Arg-A( 1-21) des(B30) inzulín. Acyláciou tohto medziproduktu N-hydroxysukcinimidesterom, ktorý má všeobecný vzorec (I), kde X je acylová skupina, je zavedená acylová skupina X na ε-aminoskupinu Lys⁸²⁹ a na N-koncovú aminoskupinu A-reťazca a B-reťazca za vzniku (N^’-X) X-Ext-Arg-B(l-29)X-Thr-Y_n-Arg-A(l-21) des(B30) inzulínu. Reakciou tohto medziproduktu s trypsínom v zmesi s vodou a vhodným organickým rozpúšťadlom, napr. DMF, DMSO alebo nižším alkoholom, získame požadovaný derivát, (N^’-X) des(B30) ľudský inzulín.

Charakteristika N⁶⁸²⁹ modifikovaných inzulínov

Niektoré experimentálne údaje o modifikovaných inzulínoch ukazuje tab. 1.

Lipofilicita derivátov inzulínu v porovnaní s ľudským inzulínom, k'_rel, bola meraná na HPLC kolóne LiChrosorb RP18 (5 pm, 250 x 4 mm) izokratickou elúciou pri 40 °C s použitím zmesí A) 0,1 M sodný fosfátový pufor, pH 7,3, obsahujúci 10 % acetonitrilu, a B) 50 % acetonitrilu vo vode ako eluenta. Elúcia bola pozorovaná UV absorpciou eluátu pri 214 nm. Mŕtvy čas, to, bol zistený nastrieknutím 0,1 mM dusičnanu sodného. Retenčný čas pre ľudský inzulín, th^, bol nastavený na prinajmenšom 2¾ zmenou pomeru medzi roztokmi A a B. k_re] (tdoivási toX(h*udský ' to)·

Stupeň prolongácie účinku na pokles glukózy krvi bol študovaný na králikoch. Každý derivát inzulínu bol testovaný subkutánnou injekciou 12 nmol pre každého zo šiestich králikov v jednodennom retardačnom teste. Vzorky pre analýzu glukózy boli odobraté pred injekciou a 1,2,4 a 6 hodín po injekcii. Zistené hodnoty glukózy boli vyjadrené ako percentá pôvodných hodnôt. Index protrakcie, ktorý bol vypočítaný z hodnôt glukózy krvi, je zmeraný Index protrakcie (prolongácia), pozri str. 211 v Markussen a kol., Proteín Engineering 1 (1987) 205-213. Ako meradlo vzorca slúžili ako hodnota 100 hovädzí ultrapomalý inzulín a ako hodnota 0 Actrapid inzulín (Novo Nordisk A/S, 2880 Bagsvaerd, Denmark).

Deriváty inzulínu uvedené v tab. 1 boli podávané v roztokoch obsahujúcich 3 Zn²⁺ na každý inzulínový hexamér, okrem tých, kde je výslovne uvedené, že sú bez Zn.

SK 282495 Β6

Pre veľmi protrahované analógy je králičí model nevhodný, pretože pokles glukózy krvi z pôvodnej hladiny je príliš malý na určenie indexu protrakcie. Prolongácia týchto analógov je lepšie charakterizovaná rýchlosťou zmiznutia pre prasatá. T_50% je čas, kedy 50 % A14 Tyr (^l25I) analóga zmizne z miesta injekcie, merané externým y-počítadlom (Ribel, U. a kol., The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in Man. In: M. serrano-Rios a P. J. Lefebre (editori): Diabetes 1985; Proceedings of the 12th Congress of the Intemational Diabetes Federation, Madrid, Španielsko, 1985 (Excerpta Medica, Amsterdam, (1986) 891 - 96).

V tab. 2 sú hodnoty T50 % skupiny veľmi protrahovaných inzulínových analógov. Analógy boli podané v roztokoch obsahujúcich 3 Zn²⁺ na každý inzulínový hexamér.

Tabuľka 1

Inzulínový derivát *	Relatívna Upofilita	Glukóza krvi, pôvodné hodnoty	%	Index protnlccie
lh	2h	3h	6h
N^^-beazoyí inzulín	1,14
N^c329«fcnylacetyi inzulín (bezZn)	1,28	55,4	58,9	88,8	90,1	10
N^^-cyklohexylacetyl iimtlm	1,90	53,1	49,6	66,9	81,1	28
N^<B29-cyldohexylpropionyl inzulín	3,29	55,5	47,6	61,5	73,0	39
N*⁰²⁹-cyldohexylvalcroyi inaiKfl	9,87	65	58,3	65,7	71,0	49
N*³²⁹-oktanoyi inzulín	3,97	57,1	54,8	69	78,9	33
inzulín	11.0	74,3	65,0	603	64,1	65
N*³²⁹-dekanoyl inzulín	12,3	733	59,4	64,9	68,0	60
N*⁰²⁹-undckanoyl, det(B30) inzulín		19,7	88,1	80.0	72.1	80
N'^’-laurayl, de(B30) inzulín	37,0	91,4	90,0	84,2	83,9	78
N^’-myristoyl inzulín	113	98,5	92.0	83,9	84,5	97
N¹⁰²⁹-chdoyl inzulín		7,64	58,2	53,2	69	20
N*⁸²⁹-7-deoxycholoyl inzulín (bez Zn)	24,4	76,5	65,2	77,4	87,4	35
N“⁰²⁹4itochoioyl inzulín (bez Zn)		51,6	98,3	92,3	100,5	115
N*⁰²⁹-4-benzoylfenylalanyl inzulín		2,51	53,9	58,7	74,4	14
N*⁰²⁹-3,5-dijodotyrozyl inzulín	1,07	53,9	48,3	60,8	82,1	27
N^^-L-tyroxyl inzulín	8,00

Tabuľka 2

Derivát ľudského inzulían	Relatívna bydrofobicita	Subkutánne vymknutie pre prasatá
600 μΜ, 3Zn²⁺/hexamer, fenol 9,3%, glycerol 1,6%, pH 7,5		^Ts»%> ^hodiy
N^eB29-dckanoyl, dcs(B30) inzulín	11,0	5,6
N^€B29-undekanoyl, des(B30) inzulín	19,7	6,9
N^’-louroyl, de(B30) inzulín	37	10,1
N^’-tridekanoyl, des(B3O) inzulín	65	12,9
N^’-myrótoyt do(B30) inzulín	113	13,8
N^’-p^mitoyl, dn(B30) inzulín	346	12,4
N*^S29-sukdmmidomyri5tová kyselina inzulín	10.5	13,6
N*^B29-myristoyi inzulín	113	11,9
ľudský NPH		10

Rozpustnosť

Rozpustnosť všetkých Ν'®²⁹ modifikovaných inzulínov uvedená v tab. 1, kedy každý obsahuje 3 ióny Zn²⁺ na každý inzulínový hexamér, presahuje 600 nmol/ml v neutrálnom (pH 7,5), vodnom, farmaceutickom prostriedku, ktorý ďalej obsahuje 0,3 % fenolu ako konzervačné látky a 1,6 % glycerolu na udržanie izotonicity. 600 nmol/ml je koncentrácia ľudského inzulínu v 100 IU/ml v prostriedkoch obvykle používaných v klinickej praxi.

Aminoskupina ε-Β29 sa môže zúčastniť amidovej väzby, sulfónamidovej väzby, karbamidu, tiokarbamidu alebo karbamátu. Lipofilným substituentom, ktorý nesie ε-B29 aminoskupina, môže byť aj alkylová skupina

Farmaceutické prostriedky obsahujúce deriváty ľudského inzulínu podľa predkladaného vynálezu môžu byť podávané parenterálne pacientom, ktorí potrebujú takúto liečbu. Parenterálne podávanie môže byť realizované ako subkutánne, intramuskuláme alebo intravenózne injekciou pomocou injekčnej striekačky. Alternatívou je parenterálne podávanie pomocou infúznej pumpy. Ďalšou možnosťou je prostriedok, ktorým môže byť prášok alebo kvapalina na podávanie derivátov ľudského inzulínu formou nazálneho spreja.

Injikovateľné prostriedky obsahujúce ľudský inzulín podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené bežnými technikami farmaceutického priemyslu, ktoré zahrnujú rozpúšťanie a miešanie zložiek za vzniku žiadaného výsledného produktu.

Podľa jedného postupu sú deriváty ľudského inzulínu rozpustené v takom objeme vody, ktorý je menší ako výsledný objem zmesi, ktorá má byť pripravená. Izotonické činidlo, konzervačná látka a pufor sú pridané podľa potreby a pH hodnota roztoku je upravená - pokiaľ je to nutné - použitím kyseliny, napr. kyseliny chlorovodíkovej, alebo zásady, napr. vodného roztoku hydroxidu sodného. Nakoniec sa riedením vodou dosiahne žiadaný objem a koncentrácia.

Príklady izotonických činidiel sú chlorid sodný, mannitol a glycerol.

Príklady konzervačných činidiel sú fenol, m-krezol, metylhydroxybenzoát a benzoylchlorid.

Príklady vhodných pufrov sú octan sodný a fosforečnan sodný.

Prostriedok na nosné podávanie derivátov inzulínu podľa predkladaného vynálezu môže byť pripravený napríklad tak, ako je opísané v Európskom patente č. 272097 (Novo Nordisk A/S).

Inzulínové prostriedky podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité na liečbu diabetu. Výška optimálnej dávky pre akéhokoľvek pacienta závisí od mnohých faktorov, vrátane účinnosti použitých špecifických derivátov ľudského inzulínu, veku, telesnej hmotnosti, fyzickej aktivity a stravy pacienta, od možných kombinácií ďalších liekov a od stavu diabetu. Odporúča sa, aby bola optimálna denná dávka pre každého pacienta určená individuálne, tieto postupy sú v danom odbore známe a sú podobné ako pre známe inzulínové prostriedky.

Pokiaľ je to vhodné, môžu byť deriváty ľudského inzulínu podľa predkladaného vynálezu použité v zmesi s ďalšími typmi inzulínu, napr. ľudského inzulínu alebo prasacieho inzulínu, alebo inzulínových analógov s rýchlejším nástupom účinnosti. Príklady týchto inzulínových analógov sú opísané napríklad v Európskych patentových aplikáciách, ktoré majú publikačné čísla EP 214826 (Novo Nordisk A/S), EP 375437 (Novo Nordisk (A/S) a EP 383472 (Eli Lilly & Co.).

Predkladaný vynález je ďalej dokumentovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré však nepredstavujú obmedzenie rámca vynálezu. Vlastnosti opísané v predchádzajúcom opise a v nasledujúcich príkladoch môžu, osobitne alebo v akejkoľvek ich kombinácii, byť východiskovým materiálom na realizáciu vynálezu v rôznych jeho formách.

SK 282495 Β6

Príklady uskutočnenia vynálezu

Plazmidy a DNA materiál

Všetky expresné plazmidy boli typu cPOT. Tieto plazmidy sú opísané v EP patentovej aplikácii č. 171142 a sú charakterizované obsahom Schizosaccharomyces pombe triozového fosfátizomerázového génu (POT) na účely plazmidovej selekcie a stabilizácie. Plazmid obsahujúci POT-gén sa dá získať z deponovanej E. coli línie (ATCC 39685). Plazmidy ďalej obsahujú S. cerevisiae triózový fostátizomerázový promótor a terminátor (PTPI a TTPI). Sú identické ako pMT742 (Egel-Mitani, M. a kol., Gene 73 (1988) 113-120) (pozri obr. 1) okrem oblasti definovanej ECoRI-Xbal reštrikčným miestom zahŕňajúcim kódovaciu oblasť pre signál/líder/produkt.

Syntetické DNA fragmenty boli syntetizované na automatickom DNA syntetizéri (Applied Biosystems model 380A) s použitím fosforamiditovej chémie a komerčne dostupných činidiel (Beaucage, S. L. a Caruthers, M. H., Tetraheron Letters 22 (1981) 1859 - 1869).

Všetky ostatné použité metódy a materiály sú v danej oblasti bežné (pozri napr. Sambrook, J., Fritsch, E. F. a Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).

Analytické metódy

Molekulárne hmotnosti pripravených inzulínov boli získané MS (hmotnostnou spektroskopiou) alebo PDMS (plazmatickou desorpčnou hmotnostnou spektroskopiou) s použitím zariadení Bio-Ion 20 (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Švédsko) a/alebo ESMS (elektrosprejovou hmotnostnou spektrometriou) s použitím API III Biomolekulárneho hmotnostného analyzátora (Perkin-Elmer Sciex Inštrumente, Thomhill, Kanada).

Príklad 1

Syntéza Ala*²¹ Asp⁸³ prekurzora ľudského inzulínu z kvasinkovej línie yEA002 s použitím LaC212spx3 signál/líder.

Boli syntetizované nasledujúce oligonukleotidy:

δ. 9 β 5 ’ - TCXjCrAAGAGATTCGTTOACCÄACACTTGTGCGGTTCTCA

CirGGTTGAAGCTrTGTACTTGGTTTjTGGTGAA AGAGGTrTCTTCTACACTCCAAAGTCTGACGACGCT-3' (Asp”) (id. C. sekvencie: 3)

e. 128 5’-CTGCaSGClGCGTCTAAGCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAA

AGAACAGATAGAA3TACAACATTGTTGAACGATACCCTTAGCGTC GTCAGACTTTGG-3¹ (AlaA^MX) (id. č. sekvencie: 4) č. 126 5¹-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTľG-3¹ (Asp^-3) (id. č. sekvencie: 51

í. 16 5'-CTGCTCTAQAGCCTGCGGCCTGCGTCT-3' (id. č. sekver.cie: 6)

Nasledujúca polymerázová reťazová reakcia (PCR) bola uskutočnená s použitím reagenčnej súpravy Gene Amp PCR (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA) podľa návodu výrobcu. Vo všetkých prípadoch bola zmes PCR prevrstvená 100 μΐ minerálneho oleja (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA).

2,5 μΐ oligonukleotidu č. 98 (2,5 pmol)

2.5 μΐ oligonukleotidu č. 128 (2,5 pmol) 10 μΐ 10X PCR pufra pldNTP zmesi 0,5 μΐ Taq enzýmu

58.5 μΐ vody

Jeden cyklus prebiehal: 94 °C počas 45 s, 49 °C počas 1 min., 72 °C počas 2 min.

Následne bolo pridané 5 μΐ oligonukleotidov č. 16 a č. 126 a bolo prevedené 15 cyklov: 94 °C počas 45 s, 45 °C počas 1 min., 72 °C počas 1,5 min. Zmes PCR bola nane sená na 2,5 % agarózový gél a bola urobená elektroforéza použitím štandardných techník (Sambrook a kol., Molekulárne klonovanie, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989). Výsledné DNA fragmenty boli vyrezané z agarózového gélu a izolované použitím Gene Clean Kit (Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) podľa návodu výrobcu. Čistený PCR DNA fragment bol rozpustený v 10 μΐ vody a reštrikčného endonukleázového pufra a štepený reštrikčnými endonukleázami Ncol a Xba I štandardnými technikami, clektroforézovaný na 2,5 % agarózovom géli a čistený použitím Gene Clean Kit, ako bolo opísané.

Plazmid pAK188 sa skladá z DNA sekvencie 412 bp zloženej z EcoRI/Ncol fragmenta kódujúcej syntetický kvasinkový signál/líder gén LaC212spx3 (opísané v príklade 3 WO 89/02463) a nasleduje syntetický Ncol/Xbal fragment kódujúci inzulínový prekurzor MI5, ktorý má SerAspAspAlaLys môstik spojujúci B29 a Al aminokyselinové zvyšky (pozri sekvencia id. č. 14,15 a 16), vložené do EcoRI/Xbal fragmentu vektora (fagemidu) pBLUESCRIPT IIsk(+/-) (Stratagene, USA). Plazmid pAK188 je znázornený na obr. 1.

Plazmid pAK188 bol taktiež štepený reštrikčnými endonukleázami Ncol a Xbal a bol izolovaný vektorový fragment 3139 bp. Dva DNA fragmenty boli na seba naviazané s použitím T4 DNA ligázy a štandardných podmienok (Sambrook a kol., Molekular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989). Väzbová zmes bola transformovaná do kompetentnej E. coli línie (R-, M+) a nasledovala selekcia na ampicilínovú rezistenciu. Plazmidy boli izolované z výsledných E. coli kolónií s použitím štandardných DNA minipreparačných techník (Sambrook a kol., Molekular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989), riadenými vhodnými reštrikčnými endonukleázami, napr. EcoRI, Xbal, Ncol a Hpal. DNA sekvenčnou analýzou (Seyuenase, U. S. Biochemical Corp.) sa zistil pre selektovaný plazmid obsah správnej sekvencie pre Ala*²¹, Asp⁸³ prekurzora ľudského inzulínu a bol nazvaný pEA5.3.

Plazmid pKFN1627 je E. coli - S. cerevisiae transportný vektor, identický ako plazmid pKFN1003 opísaný v EP patente č. 375718, až na krátku DNA sekvenciu, ktorá je v protismere k špecifickému Xbal miestu. V pKFN1003 je táto sekvencia 178 bp fragment kódujúci syntetický aprotinínový gén íúzovaný do konštrukcie kvasinkového pomocného faktora alfa 1 signál-líder sekvencie. V pKFN1627 zodpovedajúci 184 bp sekvencii kóduje inzulínový prekurzor MI5 (Glu⁸¹, Glu⁸²⁸), t. j. B(l-29, Glu⁸¹, Glu⁸²⁸)-SerAspAspAlaLys-A(l-21) fuzovaný do konštrukcie pomocného faktora alfa 1 sekvencie (pozri sekvencia id. č. 17, 18 a 19). Vektor pKFN1627je zobrazený na obr. 1).

pEA5.3 boyl štepený reštrikčnými endonukleázami EcoRI a Xbal a bol izolovaný fragment s 412 bp. Kvasinkový expresný vektor pKFN1627 bol štepený reštrikčnými endonukleázami Ncol a Xbal a pomocou Ncol a EcoRI, a z prvého štepenia bol izolovaný DNA fragment s 9273 bp a z druhého DNA fragment s 1644 bp. 412 bp EcoRI/Xbal fragment bol nato naviazaný na dva ďalšie fragmenty, čo je 9273 bp Ncol Ι/Xbal fragment a 1644 bp Ncol/EcoRI fragment použitím štandardných techník.

Väzbová zmes bola transformovaná do E. coli, ako je opísané. Plazmid z výslednej E. coli bol izolovaný použitím štandardných techník, riadených vhodnými reštrikčnými endonukleázami, ako je EcoRI, Xbal, Ncol, Hpal. Sekvenčnou DNA analýzou vybraného plazmidu (s použitím Sequenase kit ako je opísané výrobcom, U. S. Biochemical) bolo zistené, že obsahuje správnu sekvenciu pre Ala*²¹Asp⁸³ DNA prekurzora ľudského inzulínu a je vložený za DNA kódujúcou LaC212spx3 signál/líder DNA. Plazmid

SK 282495 Β6 bol nazvaný pEA5.3.2. aje na obr. 1. DNA sekvencia kódujúca LaC212spx3 signál/líder/Ala“¹ Asp^B3 ľudský inzulínový prekurzorový komplex a jeho aminokyselinová sekvencia sú sekvencie id. č. 20, 21 a 22. Plazmid pEA5.3.2 bol transformovaný do S. cerevisiae línie MT663 ako je opísané v Európskej patentovej aplikácii, ktorá má patentové číslo 214826 a výsledná línia bola nazvaná yEA002.

Príklad 2

Syntéza Ala*²¹ Thr⁸³ prekurzora ľudského inzulínu z kvasinkovej línie yEA005 s použitím LaC212spx3 signál/líder. Boli syntetizované nasledujúce oligonukleotidy:

S. 101 S'-TCGCTAAGAGA'rTCGTTACTCAACACTTGTGCGGTTCTCACTT

GSrrGAAGCTTTGTACTTOTTTGTCGTCAAAGAGGTTTCTTCTACA CTCCAAAGTCTGACGACGCT-3' (Thr”’) (id. ¢. sekvencie: 7)

C. 12 8 S' ♦ CTGCGGGCTGCGTCTAAGCACAGTASnTTCCÄATTGGTACAAA

GAACAGATAGAAGTACAACATTGTľCAACGATACCCTTAGCGTCG TCAGACTIT3G-3' (Ala**¹) (id. č. sekvencie: 4)

δ. 15 5'-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTA-3' (Thr·’) (id.Č. sekvencie: 8)

C. 16 5’-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' (id. č. sekvencie: 6)

DNA kódujúca Ala*²¹ Thr⁸³ prekurzor ľudského inzulínu bola skonštruovaná tým istým spôsobom, ako je opísané pre DNA kódujúcu Ala*²¹ Asp⁸³ prekurzor ľudského inzulínu v príklade 1. DNA sekvencia kódujúca LaC212spx3 signál/líder/Ala^'Thr⁸³ ľudský inzulínový prekurzorový komplex a jeho aminokyselinová sekvencia sú sekvencie id. č. 23, 24 a 25. Plazmid pEA8.1.1, pre ktorý sa zistilo, že obsahuje žiaducu sekvenciu, bol transformovaný do 5. cerevisiae línie MT663 ako je opísané v príklade 1 a výsledná línia bola nazvaná yEA005.

Príklad 3

Syntéza Gly*²¹ Asp⁸³ prekurzora ľudského inzulínu z kvasinkovej línie yEA007 s použitím LaC212spx3 signál/lider.

Boli syntetizované nasledujúce oligonukleotidy:

e. 98 5'-TOGCTAAGAGATTCGTTGACCAACACTTGTGCGGTTCTCACTTC

GTraAAGeTTTCTACITGGTTTGTGGTCAAAGAGGTTTCTTCT ACACTCCAAAGTCTGACGACGCT-3' (Asp“’) (id. d. sekvencie: 3)

d. 127 5'-CTGOGGGCTGCGTCTAACCACAGTAGTTTTCCAATTGOTACAA

AQAACAGATAGAAGTACZAACATTGTTCAACGATACCCT TAGCGTCGTCAGACTTTGG - 3' (Gly*’ ^x) (id. ¢. sekvencie:9)

č. 126 5^,’GTCGCCATGGCTAAGAGA'TTCGTTG-3 ’ (Asp“^a) (id. Č. sekvencie: 5)

Č. 16 5’-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCľr-3 ’ (id. S. sekvencie: 6)

DNA kódujúca Gly*²¹ Asp⁸³ prekurzor ľudského inzulínu bola skonštruovaná tým istým spôsobom, ako je opísané pre DNA kódujúcu Ala*²¹ Asp⁸³ prekurzor ľudského inzulínu v príklade 1. DNA sekvencia kódujúca LaC212spx3 signál/líder/Gly^'Asp⁸³ ľudský inzulínový prekurzorový komplex a jeho aminokyselinová sekvencia sú sekvencie id. č. 26,27 a 28. Plazmid pEAl.5.6, pre ktorý sa zistilo, že obsahuje žiaducu sekvenciu, bol transformovaný do S. cerevisiae línie MT663 ako je opísané v príklade 1 a výsledná línie bola nazvaná yEA007.

Príklad 4

Syntéza Gly*²¹ Thr⁸³ prekurzora ľudského inzulínu z kvasinkovej línie yEA006 s použitím LaC212spx3 signál/líder.

Boli syntetizované nasledujúce oligonukleotidy:

Č . 101 5 ¹ - ra^AAGAGATTCGITACTCAACAClTCTGCGGTn-TCACTT

GGTTGAAGCnTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACA CTCCAAAGTCTGACGACGCT-3' (Thr^B3) (id. C. sekvencie: 7)

Č . 12 7 5 ¹ · CTGCGGGCTOCGTCTAACCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAA

AGAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCT TAGCGTCGTCAGACTTTGG-3' (Gly*^ai) (id. č. sekvencie: 9)

Č. 15 5'-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTA-3' (Thr“’) (id.C. sekvencie: 8}

č. 16 5'-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3’ (id. δ. sekvencie: 6)

DNA kódujúca Gly*²¹ Thr⁸³ prekurzor ľudského inzulínu bola skonštruovaná tým istým spôsobom, ako je opísané pre DNA kódujúcu Ala*²¹ Asp⁸³ prekurzor ľudského inzulínu v príklade 1. DNA sekvencia kódujúca LaC212spx3 signál/líder/Gly^A21Thr^B3 ľudský inzulínový prekurzorový komplex a jeho aminokyselinová sekvencia sú sekvencie id. č. 29, 30 a 31. Plazmid pEA4.4.11, pre ktorý sa zistilo, že obsahuje žiaducu sekvenciu, bol transformovaný do S. cerevisiae línie MT663 ako je opísané v príklade 1 a výsledná línia bola nazvaná yEA006.

Príklad 5

Syntéza Arg^8-1 Arg⁸³¹ jednoreťazcového prekurzora ľudského inzulínu s N-koncovým predĺžením (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) z kvasinkovej línie yEA113 s použitím alfa faktor líder.

A)

Boli syntetizované nasledujúce oligonukleotidy:

S. 220 S'-ÄCGTACOTTCTAGAGCCIGCSCCCTCC-J' (id. Č. sekvencie: 10)

C. 263 5 ’ -CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGITTGTGGTCAAAGAGGTTTC

TTCTACACTCCAAAGACTAGAGGTATCGTTGAA-3' (id. S. sekvencie: 11)

í. 307 5 · -gctaacgtcgccatggctaagagagaagaagctgaagctgaagct

AGATTCGTTAACCAACAC-3' (id. δ. sekvencie: 12)

Nasledujúca Polymerázová reťazcová reakcia (PCR) bola uskutočnená s použitím reagenčnej súpravy Gene Amp PCR (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA) podľa návodu výrobcu. Vo všetkých prípadoch bola zmes PCR prevrstvená 100 μΐ minerálneho oleja (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Plazmid pAK220 (ktorý je identický ako pAK188) sa skladá z DNA sekvencie 412 bp kódujúcej syntetický kvasinkový signál/líder LaC212spx3 (opísané v príklade 3 WO 89/02463) a nasleduje inzulínový prekurzor MI5 (pozri id. č . sekvencie: 14, a 16), vložené do vektora (fagemidu) pBLUESCRIPT IIsk(+/-) (Stratagene, USA).

μΐ oligonukleotidu č. 220 (100 pmol) 5 μΐ oligonukleotidu č. 263 (100 pmol) 10 μΐ 10X PCR pufra μί dNTP zmesi 0,5 μΐ Taq enzýmu

0,5 μΐ pAK220 plazmidu (identického k pAK188) ako templátu (0,2 pg DNA) 63 μί vody

Bolo urobených celkom 16 cyklov, pričom každý cyklus prebiehal 1 minútu pri 40 °C a 2 minúty pri 72 °C. Zmes PCR bola nanesená na 2 % agarózový gél a bola uskutočnená elektroforéza použitím štandardných techník. Výsledné DNA fragmenty boli vyrezané z agarózového gélu a izolované použitím Gene Clean Kit (Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) podľa návodu výrobcu. Čistený PCR DNA fragment bol rozpustený v 10 pl vody a reštrikčného endonukleázového pufra a štepený reštrikčnými endonukleázami HindlII a Xbal štandardnými technikami. HindlII/Xbal DNA fragment bol čistený použitím Gene Clean Kit, ako bolo opísané.

Plazmid pAK406 sa skladá z DNA sekvencie 520 bp zloženej z EcoRI/HindlII fragmentu odvodeného z pMT636 (opísaného v WO 90/10075) kódujúcej kvasinkový alfa faktor líder a Časť inzulínového prekurzoru pripojeného k HindlII/Xbal fragmentu pAK188 kódujúcim zvyšok inzulínového prekurzora MI5 (pozri id. č. sekvencie: 32, 33 a 34) vloženom do vektora cPOT. Vektor pAK406 je znázornený na obr. 2.

Plazmid pAK406 sa skladá z DNA sekvencie 412 bp kódujúcej syntetický kvasinkový signál/líder LaC212spx3 (opísané v príklade 3 WO 89/02463) a nasleduje gén pro inzulínový prekurzor B(l-29)-GluLysArg-A(l- 21) (A21-Gly) (pozri id. č. sekvencie: 35, 36 a 37) vložené vektoru cPOT. Plazmid pAK233 je znázornený na obr. 2.

Plazmid pAK233 bol štepený reštrikčnými endonukleázami Ncol a Xbal a bol izolovaný vektorový fragment 9273 bp. Plazmid pAK406 bol taktiež štepený reštrikčnými endonukleázami Ncol a HindlII a bol izolovaný vektorový fragment 2012 bp. Tieto dva DNA fragmenty boli na seba naviazané spolu s HindlII/Xbal PCR fragment s použitím T4 DNA ligázy a štandardných podmienok. Väzbová zmes bola transformovaná do kompetentnej E. coli línie (R-, M+) a nasledovala selekcia na ampicilínovú rezistenciu. Plazmidy boli izolované z výsledných E. coli kolónií s použitím štandardných DNA minipreparačných techník, riadenými vhodnými reštrikčnými endonukleázami, napr. EcoRI, Xbal, Ncol a HindlII. DNA sekvenčnou analýzou sa zistil pre selektovaný plazmid obsah správnej sekvencie pre Arg⁸³¹ jednoreťazcového prekurzora DNA ľudského inzulínu a že je vložený za DNA kódujúcou S. cerevisiae alfa faktora DNA. Plazmid bol nazvaný pEA108 aje zobrazený na obr. 2. DNA sekvencia kódujúca alfa faktor líder/Arg⁸³¹jednoreťazcového prekurzorového komplexu ľudského inzulínu a jeho aminokyselinová sekvencia je sekvencia id. č.: 38, 39 a 40. Plazmid pEA108 bol transformovaný do S. cerevisiae kmeňa MT663 ako je opísané v príklade 1 a výsledná línie bola nazvaná yEA108.

B)

Nasledujúca polymerázová reťazcová reakcia (PCR) bola uskutočnená s použitím reagenčnej súpravy Gene Amp PCR (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA) podľa návodu výrobcu. Vo všetkých prípadoch bola zmes PCR prevrstvená 100 pl minerálneho oleja (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA).

pl oligonukleotidu č. 220 (100 pmol) 5 pl oligonukleotidu č. 263 (100 pmol) ΙΟρΙΙΟΧ PCR pufra pl dNTP zmesi

0,5 pl Taq enzýmu

0,2 pl pEA108 plazmidu ako templátu (0,1 pg DNA) 63 pl vody

Bolo urobených celkom 16 cyklov, pričom každý cyklus prebiehal 1 minútu pri 40 °C a 2 minúty pri 72 °C. Zmes PCR bola nanesená na 2 % agarózový gél a bola uskutočnená elektroforéza použitím štandardných techník. Výsledné DNA fragmenty boli vyrezané z agarózového gélu a izolované použitím Gene Clean Kit (Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) podľa návodu výrobcu. Čistený PCR DNA fragment bol rozpustený v 10 pl vody a reštrikčného endonukleázového pufra a štepený reštrikčnými endonukleázami Ncol a Xbal štandardnými technikami. Ncol/Xbal DNA fragment bol čistený použitím Gene Clean Kit, ako bolo opísané.

Plazmid pAK401 sa skladá z DNA sekvencie 523 bp zloženej z EcoRI/Ncol fragmentu odvodeného z pMT636 (opísaného v WO 90/10075) (konštruovaného vložením Ncol centra na 3'-koniec alfa lídra centrálne dirigovanou mutagenéziou) kódujúcou alfa faktor líder a Ncol/Xbal fragment z pAK188 kódujúci inzulínový prekurzor MI5 (pozri sekvencia id. č.: 41, 42 a 43) vloženého do vektora (fagemid) pBLUESCRIPT Iisk(+/-) (Stratagene, USA). Plasmid pAK401 je znázornený na obr, 3.

Plazmid pAK401 bol štepený reštrikčnými endonukleázami Ncol a Xbal a bol izolovaný vektorový fragment 3254 bp, ktorý bol spojený s Ncol/Xbal PCR fragmentom. Väzbová zmes bola transformovaná do kompetentnej E. coli línie a plazmidy boli izolované z výsledných E. coli kolónií s použitím štandardných DNA minipreparačných techník, riadenými vhodnými reštrikčnými endonukleázami, napr. EcoRI, Xbal, Ncol. Selektovaný plazmid, nazvaný p 113A (zobrazený na obr. 3), bol štepený EcoRI a Xbal a bol izolovaný fragment 535 bp.

Plazmid pAK233 bol štepený reštrikčnými endonukleázami Ncol a Xbal a EcoRI/Ncol a boli izolované fragmenty 9273 a 1644 bp. Tieto dva DNA fragmenty boli na seba naviazané spolu s EcoRI/Xbal fragmentom z pl 13A s použitím T4 DNA ligázy a štandardných podmienok. Väzbová zmes bola transformovaná do kompetentnej E. coli línie (R-, M+) a nasledovala selekcia na ampicilínovú rezistenciu. Plazmidy boli izolované z výsledných E. coli kolónií s použitím štandardných DNA minipreparačných techník, riadenými vhodnými reštrikčnými endonukleázami, t. j.. EcoRI, Xbal, Ncol a HindlII. DNA sekvenčnou analýzou sa zistil pre selektovaný plazmid obsah správnej sekvencie pre Arg⁸³¹ jednoreťazcového prekurzora DNA ľudského inzulínu s N-koncovým predĺžením GluGluAlaGluAlaGluAlaArg, a že je vložený za DNA kódujúcou S. cerevisiae alfa faktor DNA. Plazmid bol nazvaný pEA113 a je zobrazený na obr. 2. DNA sekvencia kódujúca alfe faktor líder/Arg⁸·’ Arg⁸³¹ jednoreťazcového prekurzorového komplexu ľudského inzulínu s N-koncovým predĺžením (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) a jeho aminokyselinová sekvencia je sekvencia id. č.: 44, 45 a 46. Plazmid pEA113 bol transformovaný do S. cerevisiae kmeňa MT663 ako je opísané v príklade 1 a výsledná línia bola nazvaná yEA113.

Príklad 6

Syntéza Arg⁸’¹ Arg⁸³¹ jednoreťazcového prekurzora ľudského inzulínu s N-koncovým predĺžením (GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) z kvasinkovej línie yEA136 s použitím alfa faktor líder.

Bol syntetizovaný nasledujúci oligonukleotid: č. 389 5¹-GCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCGAAG

CTGAAAGATTCGTTAACCAACAC-3 ' (id. č. sekvencie: 13)

Nasledujúca PCR bola urobená s použitím reagenčnej súpravy Gene Amp PCR μΐ oligonukleotidu č. 220 (100 pmol) 5 μΐ oligonukleotidu č. 389 (100 pmol) 10 μΐ 10X PCR pufra 16 μΐ dNTP zmesi 0,5 μΐ Taq enzýmu μΐ pEA113 plazmidu ako templátu (0,5 pg DNA) 63 μΐ vody

Bolo urobených celkom 12 cyklov, pričom každý cyklus prebiehal 1 minútu pri 95 °C, 1 minútu pri 37 °C a 2 minúty pri 72 °C.

DNA kódujúca alfa faktor líder/Arg®'¹ Arg®³¹ jednoreťazcového prekurzorového komplexu ľudského inzulínu s N-koncovým predĺžením (GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) bol konštruovaný tým istým spôsobom aký je opísaný pre DNA kódujúcu alfa faktor líder/Arg⁸'¹ Arg®³¹ jednoreťazcového prekurzorového komplexu ľudského inzulínu s N-koncovým predĺžením (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) v príklade 5. Plazmid bol nazvaný pEA136. DNA sekvencia kódujúca alfa faktor líder/Arg®'¹ Arg⁸³¹ jednoreťazcového prekurzorového komplexu ľudského inzulínu s N-koncovým predĺžením (GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) a jeho aminokyselinová sekvencia sú sekvencie id. č.: 47, 48 a 49. Plazmid pEA136 bol transformovaný do S. cerevisiae kmeňa MT663 ako je opísané v príklade 1 a výsledná línia bola nazvaná yEA136.

Príklad 7

Syntéza (Al.Bl)-diBoc ľudského inzulínu g ľudského inzulínu neobsahujúceho zinok sa rozpustilo v 41,3 ml DMSO. K roztoku sa pridalo 3,090 ml kyseliny octovej. Reakčná zmes bola nechaná pri laboratórnej teplote a reakcia začala pridaním 565 mg di-terc-butylpyrouhličitanu rozpusteného v 5,650 ml DMSO. Reakcia sa nechala prebiehať počas 51/2 hodiny a potom sa zastavila pridaním 250 μί etanolamínu. Produkt sa vyzrážal pridaním 1500 ml acetónu. Zrazenina sa oddelila centrifúgáciou a vysušila za zníženého tlaku. Získalo sa 6,85 g látky.

(Al,Bl)-diBoc inzulín sa čistil HPLC na reverznej fáze nasledujúcim spôsobom: surový produkt sa rozpustil v 100 ml 25 % obj. etanolu vo vode, pH sa pomocou HCI upravilo na pH 3,0 a všetko sa aplikovalo na kolónu (5 cm priemer, 30 cm dĺžka) naplnenú oktadecyldimetylsilyl substituovanými časticami silikagélu (stredný priemer častice 15 gm, veľkosť pórov 100 A) a ekvilibrovalo sa elúciou pufrom. Elúcia bola urobená pomocou zmesí etanolu a 1 mM vodnej HCI, 0,3 M K.C1 pri prietoku 2 1/h. Inzulín bol eluovaný zvýšením obsahu etanolu z 30 % na 45 %. Vhodné frakcie boli zriedené na 20 % etanol a vyzrážané pri pH 4,8. Zrazený materiál bol izolovaný centrifúgáciu a vysušený za zníženého tlaku. Takto sa získalo 1,701 g (Al,Bl)-diBoc ľudského inzulínu pri čistote 94,5 %.

Príklad 8

Syntéza (N^e8M-benzoyl ľudský inzulín/, 3Zn²⁺.

400 mg (Al,Bl)-diBoc ľudského inzulínu sa rozpustilo v 2 ml DMSO. K roztoku sa pridalo 748 μί zmesi N-metylmorfolínu a DMSO (1:9, v/v). Reakcia sa uskutočňovala pri 15 °C a začala sa pridaním 14,6 mg N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny benzoovej rozpusteného v 132 μί DMF. Reakcia bola zastavená po 2 hodinách pridaním 100 ml acetónu. Zrazenina sa oddelila centrifugáciou a vysušila za zníženého tlaku. Bolo získaných 343 mg látky.

Boe chrániaci skupiny sa odstránili pridaním 4 ml TFA. Látka sa ponechala rozpustená počas 30 minút a potom sa vyzrážala pridaním 50 ml acetónu. Zrazenina sa oddelila centrifugáciou a vysušila za zníženého tlaku.

Ν'⁸ -benzoyl ľudský inzulín sa čistil HPLC na reverznej fáze ako je opísané v príklade 7. Bolo získaných 230 mg látky. Rekryštalizáciou z 15 % vodného etanolu, ktorý obsahoval 6 mM Zn²⁺ a 50 mM citrátu pri pH 5,5 sa získali kryštály zlúčeniny uvedenej v titule, ktoré sa oddelili centrifugáciou a vysušili za zníženého tlaku. Výťažok bol 190 mg.

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 5911, teoretická: 5911.

Príklad 9

Syntéza (N^EB29-litocholoyl ľudský inzulín/, 3Zn²⁺.

400 mg (Al,Bl)-diBoc ľudského inzulínu sa rozpustilo v 2 ml DMSO. K roztoku sa pridalo 748 μί zmesi N-metylmorfolínu a DMSO (1:9, v/v). Reakcia sa uskutočňovala pri 15 °C a začala sa pridaním 14,6 mg N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny litocholovej rozpusteného v 300 μί DMF. Reakcia bola zastavená po 2 hodinách pridaním 100 ml acetónu. Zrazenina sa oddelila centrifugáciou a vysušila za zníženého tlaku. Bolo získaných 331 mg látky.

B29-litocholoyl ľudský inzulin sa čistil HPLC na reverznej fáze ako je opísané v príklade 7. Bolo získaných 67 mg látky s čistotou 94 %. Rekryštalizáciou z 15 % vodného etanolu, ktorý obsahoval 6 mM Zn²⁺ a 50 mM citrátu pri pH 5,5 sa získali kryštály zlúčeniny uvedenej v titule, ktoré sa oddelili centrifugáciou a vysušili za zníženého tlaku. Výťažok bol 49 mg.

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 6160, teoretická: 6166.

Príklad 10

Syntéza (N^EB29-dekanoyl ľudský inzulín/, 3Zn²⁺.

400 mg (ΑΙ,ΒΙ/diBoc ľudského inzulínu sa rozpustilo v 2 ml DMSO. K roztoku sa pridalo 748 μί zmesi N-metylmorfolínu a DMSO (1:9, v/v). Reakcia sa uskutočnila pri 15 °C a začala sa pridaním 14,6 mg N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dekánovej rozpusteného v 132 μί DMF. Reakcia bola zastavená po 60 minútach a produkt sa vyzrážal pridaním 100 ml acetónu. Zrazenina sa oddelila centrifugáciou a vysušila za zníženého tlaku. Bolo získaných 420 mg medziproduktu.

Boe chrániace skupiny sa odstránili pridaním 4 ml TFA. Látka sa nechala rozpustená počas 30 minút a potom sa produkt vyzrážal pridaním 50 ml acetónu. Zrazenina sa oddelila centrifugáciou a vysušila za zníženého tlaku. Výťažok surového produktu bol 420 mg.

Surový produkt sa čistil HPLC na reverznej fáze ako je opísané v príklade 7. Bolo získaných 254 mg látky uvedenej v titule. Čistota bola 96,1 %. Rekryštalizáciou z 15 % vodného etanolu, ktorý obsahoval 6 mM Zn²⁺ a 50 mM citrátu pri pH 5,5 sa získali kryštály zlúčeniny uvedenej v titule, ktoré sa oddelili centrifugáciou a vysušili za zníženého tlaku. Výťažok bol 217 mg.

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 5962, teoretická: 5962.

Príklad 11

Syntéza des(B30) ľudského inzulínu.

Syntéza des(B30) ľudského inzulínu bola uskutočnená postupom opísaným Markussenom (Methods in diabetes research, vol. I, Laboratory methods, časť B, 404-410. Editori: J. Lamer a S. Phol, John Wiley & Sons, 1984). 5 g ľudského inzulínu sa rozpustilo v 500 ml vody, zatiaľ čo sa pH roztoku udržovalo pridávaním 0,5 M kyseliny sírovej na 2,6. Následne sa inzulín vysolil pridaním 100 g síranu amónneho a zrazenina sa oddelila centrifugáciou. Sediment sa rozpustil v 800 ml 0,1 M hydrogenuhličitanu amónneho a hodnota pH roztoku sa upravila na 8,4 pomocou 1 M amoniaku.

mg hovädzej karboxypeptidázy A sa suspendovalo v 25 ml vody a tak dlho sa pridával 1 M amoniak pokiaľ sa pri pH 10 nezískal číry roztok. Roztok karboxypeptidázy sa pridal k roztoku inzulínu a reakcia sa nechala prebiehať po12

SK 282495 Β6 čas 24 hodín. Pridalo sa niekoľko kvapiek toluénu, ktorý počas reakcie pôsobil ako stabilizačný prostriedok.

Po 24 hodinách sa des(B30) ľudský inzulín vykryštalizoval pridaním 80 g chloridu sodného do roztoku za miešania. Hodnota pH sa potom upravila na 8,3 a kryštalizácia sa nechala prebiehať počas 20 hodín za mierneho miešania. Kryštály boli izolované 1,2 pm filtrom, boli premyté 250 ml ľadovo studeného 2-propanolu a nakoniec vysušili za zníženého tlaku.

Príklad 12

Syntéza (Al.Bl)-diBoc des(B30) ľudského inzulínu.

Zlúčenina uvedená v titule bola syntetizovaná spôsobom opísaným v príklade 7, s použitím des(B30) prasacieho inzulínu ako východiskovej látky. Surový produkt sa zrážal acetónom a bol vysušený za zníženého tlaku. (Al,Bl)-diBoc des(B30) ľudský inzulín bol čistený HPLC na reverznej fáze spôsobom opísaným v príklade 7.

Príklad 13

Syntéza N^cB29-dekanoyl des(B30) ľudského inzulínu.

400 mg (Al,Bl)-diBoc des(B30) ľudského inzulínu bolo použitých ako východisková látka pre syntézu N“®²⁹-dekanoyl des(B30) ľudského inzulínu podľa spôsobu opísanom v príklade 10. Surový produkt bol vyzrážaný acetónom a vysušený za zníženého tlaku a pomocou TFA odchránený. Výsledný produkt bol vyzrážaný acetónom a vysušený za zníženého tlaku. N^tB29-dekanoyl des(B30) ľudský inzulín sa potom čistil HPLC na reverznej fáze postupom opísaným v príklade 10.

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 5856, teoretická: 5861.

Príklad 14

Syntéza N^tB29-dodekanoyl des(B30) ľudského inzulínu.

a) Imobilizácia A. lyticus proteázy mg A. lyticus proteázy, rozpustenej v 5 ml vodného 0,2 M NaHCO3 pufra, pH 9,4, sa zmiešalo so 4 ml usadeného gélu MiniLeak Médium, ktorý bol premytý tým istým pufrotn (MiniLeak je divinylsulfón aktivovanej Sepharosy CL 6B, získanej od KemEnTec, Copenhagen). Gél sa jemným miešaním udržoval počas 24 hodín za laboratórnej teploty v suspenzii. Potom sa gél oddelil filtráciou, premyl vodou a suspendoval v 20 ml IM etanolamínového pufra, pH 9,4, a udržoval sa v suspenzii počas 24 hodín za laboratórnej teploty. Nakoniec sa gél premyl vodou a 0,1 M kyselinou octovou a uchovával sa pri 4 °C. Aktivita enzýmu v filtráte bola 13 % hodnoty pre pôvodný roztok, čo znamená, že výťažok imobilizácie bol 87 %.

b) Imobilizácia prasacieho trypsínu

Prasací trypsín bol imobilizovaný na MiniLeak Low tak, že sa dosiahol stupeň substitúcie 1 mg na ml gélu, za podmienok opísaných pre imobilizáciu A. lyticus.

c) Syntéza Glu (GluAla) jArg-B (1-29) , ThrArg-A (1-21) inzulínu pomocou imobilizovanej A. lyticus proteázy

K 200 mg Glu (GluAla) ₃Arg-B (1-29) -ThrArg-A (1-21) jednoreťazcového prekurzora ľudského inzulínu, rozpustenému v 20 ml 0,1 M NaHCO₃ pufra, pH 9,0, sa pridali 4 ml gélu, ktorý obsahoval imobilizovanú A. lyticus proteázu. Po 6 hodinách udržovania gélu v suspenzii v reakčnej zmesi za laboratórnej teploty bola hydrolýza kompletná, čím sa získal Glu(GluAla) ³Arg-B (1-29) , ThrArg-A (1-21) ľudský inzulín (reakcia bola sledovaná HPLC na reverznej fáze). Po hydrolýze sa gél odstránil filtráciou. K filtrátu sa pridalo 5 ml etanolu a 15 μΐ 1 M ZnCl₂ a pH sa pomocou HC1 upravilo na 5,0. Zrážanie produktu bolo kompletné po státí cez noc pri 4 °C za mierneho miešania. Produkt bol oddelený centrifugáciou. Po premytí 1 ml ľadovo chladného 20 % etanolu a vysušenia za zníženého tlaku bol výťažok 190 mg.

d) Syntéza N^aA1,N^aB1,N^EB29-tridodekanoyl Glu (GluAla)₃Arg-B(l-29), ThrArg-A(l-21) ľudského inzulínu pomocou N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekánovej.

190 mg (30 pmol) Glu(GluAla) jArg-B/l^), ThrArg*A(l-21) inzulínu sa rozpustilo v 1 ml DMSO a 1,05 ml 0,572 M roztoku Ν,Ν-diizopropyletylamínu v DMF. Roztok bol ochladený na 15 °C a bolo pridaných 36 mg (120 pmol) N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekánovej rozpusteného v 0,6 ml DMSO. Reakcia úplne prebehla počas 24 hodín. Bola izolovaná lipofilná zlúčenina uvedená v titule.

e) Syntéza N^’-dodekanoyl des(B30) inzulínu

Produkt z predchádzajúceho kroku d., v 2,65 ml DMSO/DMF/N,N-diizopropyletylamín, sa neriedil 10,6 ml 50 mM glycínového pufra, ktorý obsahoval 20 % etanolu a pH sa pomocou NaOH upravilo na hodnotu 10. Po státí počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote sa pridal 1 ml MiniLeak gélu, ktorý obsahoval 1 mg imobilizovaného trypsínu na ml gélu. Reakčná zmes sa mierne miešala počas 48 hodín za laboratórnej teploty. Aby sa izoloval žiadaný produkt, reakčná zmes sa aplikovala na HPLC kolónu s reverznou fázou (5 cm priemer, 30 cm dĺžka) naplnenou oktadecyldimetylsilyl substituovanými časticami silikagélu (stredný priemer častice 15 pm, veľkosť pórov 100 A). Elúcia bola uskutočnená pomocou 20 mM Tris/HCl pufrov, s pH upraveným na 7,7, ktoré obsahovali zvyšujúcu sa koncentráciu etanolu, 40 % až 44 % (v/v) pri prietoku 2000 ml/h. Hlavný vrchol eluovaný pri 43 až 44 % etanole obsahoval zlúčeninu uvedenú v titule. Frakcie obsahujúce hlavný vrchol boli spojené, pridala sa voda, aby sa koncentrácia etanolu znížila na 20 % (v/v) a pH bolo upravené na 5,5. Roztok sa ponechal stáť cez noc pri -20 °C, kedy sa vyzrážal produkt. Zrazenina bola izolovaná centrifugáciou pri -8 °C a vysušená za zníženého tlaku. Výťažok zlúčeniny uvedenej v titule bol 90 mg.

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 5892, teoretická: 5890.

Príklad 15

Syntéza N^cBM-(N-myristoyl-a-glutamyl) ľudského inzulínu

500 mg (Al,Bl)-diBoc ľudského inzulínu bolo rozpustených v 2,5 ml DMSO a bolo pridaných 428 μΐ etyldiizopropylamínu v 2,5 ml DMSO/DMF 1/1 (v/v). Teplota bola upravená na 15 °C a bolo pridaných 85 mg N-myristoyl-Glu(OBut) N-hydroxysukcinimid esteru rozpusteného v 2,5 ml DMSO/DMF 1/1 (v/v). Po 30 minútach sa reakčná zmes naliala do 60 ml vody, pH sa upravilo na 5 a zrazenina sa oddelila centrifugáciou. Zrazenina sa sušila za zníženého tlaku. Usušená reakčná zmes bola rozpustená v 25 ml TFA a roztok sa nechal 30 minút stáť za laboratórnej teploty. TFA sa odstránila odparením za zníženého tlaku. Želatínový odparok sa rozpustil v 60 ml vody a pH bolo pomocou koncentrovaného amoniaku upravené na 11,2. Zlúčenina uvedená v titule bola kryštalizovaná z tohto roztoku úpravou pH na 8,5 pomocou 6 N HC1. Produkt bol izolovaný centrifugáciou, jedenkrát premytý 10 ml vody a vysušený za zníženého tlaku. Výťažok bol 356 mg. Čistota podľa HPLC 94%.

Produkt z tohto príkladu je ľudský inzulín, v ktorom má ε-aminoskupina Lys⁶²⁹ substituent vzorec (VI):

CH_a(CH_a) _laCONHCH(CH_aCH_aCOOH) CO- (VI).

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 6146, teoretická: 6148.

Príklad 16

Syntéza N^EB29-undekanoyl des(B30) ľudského inzulínu.

Zlúčenina uvedená v titule bola syntetizovaná analogicky ako N^cBM-dodekanoyl des(B30) ľudský inzulín ako je opísané v príklade 14, použitím N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny undekánovej namiesto N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekánovej.

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 5876, teoretická: 5876.

Príklad 17

Syntéza N^E®²⁹-tridekanoyl des(B30) ľudského inzulínu

Zlúčenina uvedená v titule bola syntetizovaná analogicky ako N^cB29-dodekanoyl des(B30) ľudský inzulín ako je opísané v príklade 14, použitím N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny tridekánovej namiesto N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekánovej.

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 5899, teoretická: 5904.

Príklad 18

Syntéza N^EB29-myristoyl des(B30) ľudského inzulínu

Zlúčenina uvedená v titule bola syntetizovaná analogicky ako N^cB29-dodekanoyl des(B30) ľudský inzulín ako je opísané v príklade 14, použitím N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny myristovej namiesto N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekánovej.

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 5932, teoretická: 5918.

Príklad 19

Syntéza N^cB29-palmitoyl des(B30) ľudského inzulínu

Zlúčenina uvedená v titule bola syntetizovaná analogicky ako N'^B29-dodekanoyl des(B30) ľudský inzulín ako je opísané v príklade 14, použitím N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny palmitovej namiesto N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekánovej.

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 5944, teoretická: 5946.

Príklad 20

Syntéza N^EB29-suberoyl-D-tyroxín ľudského inzulínu

a) Príprava N-(sukcinimidylsuberoyl)-D-tyroxínu

Disukcinimidylsuberát (1,0 g, Pierce) bol rozpustený v DMF (50 ml) a za miešania pri 20 °C sa pridal D-tyroxín (2,0 g, Aldrich). Tyroxín sa pomaly rozpustil a po 20 hodinách sa rozpúšťadlo odparilo za zníženého tlaku. Olejovitý odparok bol kryštalizovaný z 2-propanolu na 0,6 g N-(sukcinimidylsuberoyl)-D-tyroxínu pri teplote topenia 128 -133 °C.

b) Reakcia (Al,Bl)-diBoc ľudského inzulínu s N-(sukcinimidylsuberoyl)-D-tyroxínom (Al, Bl) -diBoc ľudský inzulín (200 mg bol rozpustený v suchom DMF (10 ml) prídavkom trietylamínu (20 μΐ) za laboratórnej teploty. Potom bol pridaný N-(sukcinimidylsuberoyl)-D-tyroxín (80 mg). Reakcia bola pozorovaná HPLC na reverznej fáze a keď reakcia prebehla z 90 %, rozpúšťadlo sa odparilo za zníženého tlaku. K odparku sa pridala bezvodá kyselina octová (5 ml) a roztok sa ponechal stáť 1 h pri laboratórnej teplote. Po odparení kyseliny trifluóroctovej za zníženého tlaku sa odparok rozpustil v zmesi 1 M kyseliny octovej (5 ml) a acetonitrilu (1,5 ml), čistil na preparatívnej HPLC kolóne s reverznou fázou a odsolil na kolóne PD-10. Výťažok N^cB29-suberoyl-D-tyroxín ľudského inzulínu bol 50 mg.

Produkt z tohto príkladu je ľudský inzulín, v ktorom má ε-aminoskupina Lys®²⁹ substituent so vzorcom (VII):

Thyrox-CO(CH_a) _SCO- (VII), kde Thyrox je tyroxín viazaný ku skupine oktándiovej kyseliny amidovou väzbou cez svoju a-aminoskupinu.

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 6724, teoretická: 6723.

Príklad 21

Syntéza N^EB29-(2-sukcinylamid)myristová kyselina ľudského inzulínu

a) Príprava hydrochloridu metyl esteru kyseliny a-aminomyristovej

Do metanolu (5 ml, Merck) pri -10 °C sa po kvapkách za prudkého miešania pridal tionylchlorid (0,2 ml, Aldrich). Potom sa pridala kyselina a-aminomyristová (0,7 g, pripravená z α-bróm kyseliny reakciou s amoniakom). Reakčná zmes sa miešala za laboratórnej teploty cez noc a potom sa odparila do sucha. Surový produkt (0,7 g) bol použitý priamo v kroku b.

b) Príprava metyl esteru kyseliny N-sukcinoyl-a-aminomyristovej

Hydrochlorid metyl esteru kyseliny a-aminomyristovej (0,7 g) bol rozpustený v chloroforme (25 ml, Merck). Postupne bol pridaný trietylamín (0,35 ml, Fluka) a sukcinanhydrid (0,3 g) Fluka. Reakčná zmes sa miešala počas dvoch hodín za laboratórnej teploty, odparila do sucha a odparok bol rekryštalizovaný zo zmesi etylacetát/petroléter (1/1). Výťažok: 0,8 g.

c) Príprava metyl esteru kyseliny N-(sukcmimidylsukcinoyl)-a-aminomyristovej

Metyl ester kyseliny N-sukcinoyl-a-aminomyristovej (0,8 g) bol rozpustený v DMF (10 ml, Merck, vysušený nad molekulárnymi sitami 4A). Bol pridaný suchý pyridín (80 μΐ, Merck) a di(N-sukcinimidyl)karbonát (1,8 g, Fluka) a reakčná zmes sa miešala za laboratórnej teploty cez noc. Odparok sa čistil flash chromatografiou na silikagéli 60 (Merck) a rekryštalizoval zo zmesi 2-propanol/petroléter (1/1). Vývažok metyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminomyristovej: 0,13 g, teplota topenia 64 - 66 °C.

d) Reakcia (Al,Bl)-di Boe ľudského inzulínu s metyl esterom kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminomyristovej

Reakcia bola realizovaná podľa spôsobu opísanom v príklade 20, s tým rozdielom, že sa namiesto N-(sukcinimidylsuberoyl)-D-tyroxínu použil metyl ester kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminomyristovej. Po odparení kyseliny trifluóroctovej za zníženého tlaku sa k odparku pridal 0,1 M hydroxid sodný pri teplote 0 °C, aby sa zhydrolyzoval metylester. Keď sa podľa HPLC na reverznej fáze zistilo, že hydrolýza je úplná, pH sa upravilo na hodnotu 3 a roztok sa lyofilizoval. Po čistení na preparatívnej HPLC kolóne s reverznou fázou a odsolení na kolóne PDΊΟ bol výťažok N^íB29-(2-sukcinylamido)myrystovej kyseliny ľudského inzulínu 39 mg.

Produkt z tohto príkladu je ľudský inzulín, v ktorom má ε-aminoskupina Lys®²⁹ substituent so vzorcom (VIII):

CH_a(CH_a) _laCH(COOH)NHCOCH_aCH_aCO- (VIII)

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 6130, teoretická: 6133.

Príklad 22

Syntéza N^EB29-oktyioxykarbonyl ľudského inzulínu

Syntéza bola prevedená podľa spôsobu opísanom v príklade 20, s tým rozdielom, že sa namiesto N-(sukcinimidylsuberoyl)-D-tyroxínu použil n-oktyloxykarbonyl-N-hydroxysukcimmid (9 mg, pripravený z n-oktylchloroformátu (Aldrich) a N-hydroxysukcinimidu). Výťažok N^eB29-oktyloxykarbonyl ľudského inzulínu bol 86 mg.

Produkt z tohto príkladu je ľudský inzulín, v ktorom má ε-aminoskupina Lys“⁹ substituent so vzorcom (IX):

CH₃(CH₃),OCO- (IX)

Molekulová hmotnosť, nájdená MS: 5960, teoretická: 5964.

Príklad 23

Syntéza N^eB29-(2-sukcinylamid)palmitová kyselina ľudského inzulínu

a) Príprava metyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminopalmitovej.

Táto zlúčenina bola pripravená postupom opísaným v príklade 21 a) až c), s tým, že sa namiesto kyseliny a-aminomyristovej použila kyselina a-aminopalmitová.

b) Reakcia (Al,Bl)-di Boe ľudského inzulínu s metyl esterom kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminopalmitovej.

Reakcia bola realizovaná podľa spôsobu opísanom v príklade 21 d., s tým rozdielom, že sa namiesto metyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminomyristovej použil metyl ester kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminopalmitovej, čím sa získal N^£B29-(2-sukcinylamid) palmitová kyselina ľudský inzulín.

Produkt z tohto príkladu je ľudský inzulín, v ktorom má ε-aminoskupina Lys®²⁹ substituent so vzorcom (X):

CH₃ (CH_a) ₁₃CH (COOH) NHCOCH_aCH_aCO- (X)

Príklad 24

Syntéza N^EB29-(2-sukcinylamidoetyloxy)palmitová kyselina ľudského inzulínu

a) Príprava metyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-2-aminoetyloxypalmitovej.

Táto zlúčenina bola pripravená postupom opísaným v príklade 21 a) až c), s tým, že sa namiesto kyseliny a-aminomyristovej použila kyselina 2-aminoetyloxypalmitová (syntetizovaná podľa všeobecného postupu opísanom v R. TenBrink, J. Org. Chem. 52 (1987) 418 - 422.

b) Reakcia (Al,Bl)-di Boe ľudského inzulínu s metylesterom kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-2-aminoetyloxypalmitovej.

Reakcia bola realizovaná spôsobom opísaným v príklade 21 d), s tým rozdielom, že sa namiesto metyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminomyristovej použil metyl ester kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-2-aminoetyloxypalmitovej, čím sa získal N“²⁹-(2-sukcinylamidoetyloxy)palmitová kyselina ľudský inzulín.

Produkt z tohto príkladu je ľudský inzulín, v ktorom má ε-aminoskupina Lys®²⁹ substituent so vzorcom (XI):

CH₃(CHj) _x3CH(COOH)NHCH₂CHjOCOCHjCHjCO- (XI)

Príklad 25

Syntéza N^EB29-litocholoyl-a-glutamyl des(B30) ľudského inzulínu

Syntéza bola realizovaná podľa postupu opísanom v príklade 13, s tým, že sa namiesto N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dekánovej použil a-N-hydroxysukcinimid ester, γ-terc-butyl ester kyseliny N-litocholoyl-L-glutámovej.

Produkt z tohto príkladu je des(B30) ľudský inzulín, v ktorom má ε-aminoskupina Lys®²⁹ substituent so vzorcom (ΧΠ):

litocholoyl-NHCH(CHjCHjCOOH)CO- (XII).

Molekulová hmotnosť produktu, nájdená MS: 6194, teoretická: 6193.

Príklad 26

SyntézaN'®²⁹-3,3',5,5'-tetrajódtyroacetyl ľudského inzulínu

Syntéza bola realizovaná podľa postupu opísanom v príklade 10, s tým, že sa namiesto N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dekánovej použil N-hydroxysukcinimid ester kyseliny 3,3',5,5'-tetrajódtyrooctovej.

Molekulová hmotnosť produktu, nájdená MS: 6536, teoretická: 6538.

Príklad 27

Syntéza N^E®²⁹-L-tyroxyl ľudského inzulínu

Syntéza bola realizovaná podľa postupu opísanom v príklade 10, s tým, že sa miesto N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dekánovej použil N-hydroxysukcinimid ester Boc-L-tyroxínu.

Molekulová hmotnosť produktu, nájdená MS: 6572, teoretická: 6567.

Príklad 28

Farmaceutický prostriedok, ktoiý obsahuje v roztoku 600 nmol/ml N^eB29-dekanoyl des(B30) ľudský inzulín s 1/3 Zn²⁺.

N^EB29-dekanoyl des(B30) ľudský inzulín (1,2 pmol) bol rozpustený vo vode (0,8 ml) a pH bolo upravené na 7,5 pridaním 0,2 M hydroxidu sodného. Bol pridný 0,01 M octan zinočnatý (60 pl) a roztok, ktorý obsahoval 0,75 % fenolu a 4 % glycerolu (0,8 ml). pH roztoku bolo upravené na 7,5 pomocou 0,2 M hydroxidu sodného a objem roztoku bol upravený vodou na 2 ml.

Vytvorený roztok sa sterilizoval filtráciou a aseptický previedol do patróny alebo do nádobky.

Príklad 29

Farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje v roztoku 600 nmol/ml N^EB29-dekanoyl des(B30) ľudský inzulín s 1/2 Zn²⁺.

1,2 pmol zlúčeniny uvedenej v titule bolo rozpustené vo vode (0,8 ml) a pH bolo upravené na 7,5 pridaním 0,2 M hydroxidu sodného. Bol pridaný roztok, ktorý obsahoval 0,75 % fenolu a 1,75 % chloridu sodného (0,8 ml). pH roztoku bolo upravené na 7,5 pomocou 0,2 M hydroxidu sodného a objem roztoku bol upravený vodou na 2 ml.

Príklad 30

Farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje v roztoku 600 nmol/ml N^E® -litocholoyl ľudský inzulín s 1/3 Zn²⁺.

1,2 pmol zlúčeniny uvedenej v titule bolo suspendované vo vode (0,8 ml) a rozpustené upravením hodnoty pH roztoku na 8,5 pomocou 0,2 M hydroxidu sodného. K roztoku potom bolo pridané 0,8 ml zásobného roztoku, ktorý obsahoval 0,75 % krezolu a 4 % glycerolu vo vode. Nakoniec bolo pH roztoku upravené na 8,5 a objem roztoku bol upravený vodou na 2 ml.

Zoznam sekvencii

1. Všeobecné informácie:

i) Žiadateľ:

(A) Meno: Novo Nordisk A/S (B) Ulica: Novo Allé (C) Mesto: DK-2880 Bagsvaerd (E) Štát: Dánsko (F) Telefón: +45 44448888 (G) Fax:+45 44490555 (H) Telex: 37173 ii) Názov vynálezu: Acylovaný inzulín iii) Počet sekvencii: 49 iv) Adresa pre korešpondenciu:

(A) Adresát: Novo Nordisk A/S

Corporate Patents (B) Ulica: Novo Al 1 e (C) Mesto: DK-2880 Bagsvaerd (E) Štát: Dánsko

v) Forma určená pre počítač:

(A) Typ média: flopy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-D4S/MS-DOS (D) Softvér: Patent In č. 1.0, verzia 1,25 vi) Údaje súčasnej žiadosti:

(A) Číslo žiadosti:

(B) Dátum podania:

(C) Klasifikácia:

vii) Údaje predchádzajúcej žiadosti:

(A) Čísla žiadostí: DK1044/93 aUS 08/190, 829 (B) Dátumy podania: 9. 9.1993 a 2.2.1994 viii) Informácia o právnom zástupcovi:

(A) Meno: Jrrgensen, Dan a kol.

(C) Číslo referencie : 3985.204-W0, DJ ix) Telekomunikačná informácia:

(A) Telefón: +45 44448888 (B) Fax +45 44493256

2. Informácia o sekvencii id. č.: 1:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 21 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 1:

Gly íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser

10

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

20

2. Informácia o sekvencii id. č.: 2:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ moíekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 2:

Xaa Val Xaa Gin Hla Leu Cye Gly Sir Hla Leu Val

1510

Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe

1520

Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa

2530

2. Informácia o sekvencii id. č.: 3:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 110 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá

ÍOO (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 3:

TGGCTAAGAG ATTCGTTGAC CAACACTTGT GCGGTTCTCA CTTGGTTGAA 50

GCTTTGTACT TGGTTTGTGG TGÄÄÄGAGGT ttcttctaca ctccaaagtc lOQ

TGACGACGCT ÍLO

2. Informácia o sekvencii id. č.:4:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 100 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 4:

CTGCGGGCTO CGTCTAAGCA CAGTAGTTTT CCAATTGGTA CAAAGAACAG 50

ATAGAAGTAC AACATTGTTC AACGATACCC TTAGCGTCGT CAGACTTTGG

2. Informácia o sekvencii id. č.: 5:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 25 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 6:

GTCGCCATGG CTMOAGATT CGTTG

2. Informácia o sekvencii id. č.: 6

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 6:

CTGCTCTAGA GCCTGCGGGC TGCGTCT

2. Informácia o sekvencii id. č.: 7:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 110 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 7:

TGGCTAAGAG ATTCGTTACT CAACACTTGT GCGGTTCTCA CTTGGTTGAA

GCTTTGTACT TGGTTTGTGG TGAAAGAGGT TTCTTCTACA CTCCAAAGTC TGACGACGCT

2. Informácia o sekvencii id. č.: 8:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 25 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 8: GTCGCCATGG CTAAGAGATT CGTTA

2. Informácia o sekvencii id. č.: 9:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 100 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 9:

CTGCGGGCTG CGTCTAACCA CAGTAGTTTT CCAATTOGTA CAAAOAACAQ 50

ATAGAAGTAC AACATTCTTC AACGATACCC TTAGCGTCGT CAGACTTTCG 1OO

2. Informácia o sekvencii id. č.: 10:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová

SO

100

110

SK 282495 Β6 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 15:

(C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 10:

ACGTACGTTC TAGAGCCTSC GGCCTGC 27

2. Informácia o sekvencii id. č.: 11:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 78 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 11:

CACTTGGTTG AÄGCTTTOTA CTTGGTTTGT GGTGAAAGAG GTTTCTTCTA 50

CACTCCAAAG ACTAGAGGTA TCGTTQAA 76

2. Informácia o sekvencii id. č.: 12:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 63 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 12:

GCTAACGTCG CCAT3GCTAA GAGAGAAGAA GCTGÄAGCTG AAGCTAGATT 50

CGTTAACCAA CAC «3

2. Informácia o sekvencii id. č.: 13:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 65 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 13:

GCTAACGTCG CCATGGCTAA GAGAQAAGAA GCTGAAGCGÄ AGCTGAAAGA 50

TTCGTTAACC AACAC

2. Informácia o sekvencii id. č.: 14:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA ix) vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie: 80...391 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 14:

ATCGMÍTCC AncUSUT ASTTCAAACA ASAASAnAC AAACTATCAA TTICATACAC

AATATAAACC ACCAAAASA ATS AAC 6CT GTT TTC TTS GTT TTC TCC TTC ATC

Het lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu íle I $ 10

6GA

rrc

TBC

TG6

6CC

CM

CCA

GTC

ACT

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

eiy

Phe

Cys

Trp

AU

Gin

Pre

Val

Thr

«ly

Asp

Glu

Ser

Val

Glu

15

20

2$

ATT

cca

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

íle

Pro

61U

Glu

Ser

Leu

lle

AU

G1U

Asn

Thr

Leu

Ala

Asn

30

35

40

GTC

fiCC

ATG

GCT

AAG

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

Val

Ale

Met

AU

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

HU

Leu

Cys

Gly

Ser

HU

41

60

6$

TTS

GTT

GAA

GCT

TT6

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TAC

Leu

Val

61U

AU

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

60

65

70

75

ACT

CCA

AAG

TCT

6AC

GCT

AAG

GCT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

ACT

Thr

Pre

lys

Ser

A*P

ASp

AU

Lys

61/

IU

Val

Glu

Gin

cys

Thr

BO

BS

>0

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

AAC

TAGACGCAfiC

Str

II»

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

G1u

Asn

Tyr

cys

ASn

9S 100

CC6CAS6CTC TASA

2. Informácia o sekvencii id. ¢.: 15:

Mét

Lys

AU

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

Íle

Gly

Phe

cys

Trp

Ala

l

5

10

15

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

G1u

Ser

Val

Glu

lle

Pro

Glu

Ser

20

ZS

30

Leu

íle

Ala

Glu

Asn

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

AU

Met

Ala

Lys

35

40

45

Arg

Phe

Val

Asn

filn

H1s

Leu

cys

Gly

Ser

His

Leu

Vil

Glu

AU

Leu

50

55

50

Tyr Leu Val Cys äly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp

70 75 80

Asp Ala Lys Gly íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu

90 95

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100

2. Informácia o sekvencii id. č.: 16:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 16:

TAGCTTAAGG TMCTTCTTA TCAAGTTTCT TCTTCTAATS TTTCATACTT AAAGTATST6CO

TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AAUGSAACT ASCCTAAGAC120

CACCCGGfiTT 66TCAGTGAC CGCTACnAG TAGACAACTC TAACfiCCTTC TCASASACTA1SO

GTACCCACTT TTSTCCTCAA ACCGATTGCA SCOSTACCSA TTCTCTAACC AATTCCTTGT240

CAACAC6CCA A6ASTSAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA300

GATGTGAGGT TTCACACTCC TSCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT 6A4CATACAC380

AACAAACAT6 βΠΑΛΟΠΤΤ TSATGACATT GATCTCCSTC GGGCGTCCGA CATCT413

2. Informácia o sekvencii id. č.: 17:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 523 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie; 80...499 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 17:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC 60

AATATAAACC ATTAAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 112

Met Arg Phe Pro Ser íle Phe Thr Ala Val Leu

6 10 (0

1U

160 zoa

256

304

352

401

415

TTC GCA GCA

TCC

GCA

TTA

GCT

CCA

GTC

AAC

ACT

ACA

GAA

160

Phe AU AU

Ser

AU

Leu

Ala

AU

Pro

Val

Asn

Thr

Glu

15

20

25

GAT GAA ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

208

Asp Glu Thr

AU

Gin

lle

Pro

AU

61 u

AU

Val

IU

Gly

Tyr

Ser

Asp

30

35

40

TTA GAA GGG GAT

TTC

GAT

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

256

Leu Glu Gly Asp

i Phe

Asp

Val

AU

Val

Leu

Pro

Phe

5er

Asn

Ser

Thr

4S

50

SS

AAT

MC

GGG

m

TTG

TTT

ATA

MT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

304

Asn

Gly

Leu

Phe

íle

Asn

Thr

lle

AU

Ser

ne

AU

60

SS

70

75

AAA

GM

GGG

GTA

TCT

TTG

GAT

AAG

AGA

GM

GTT

AAC

CM

CAC

TTG

352

Lys

Clu

G1U

Gly

Val

Ser

Leu

Asp

Ln

Arg

GlU

Val

Asn

Gin

HU

Lw

80

85

90

TGC

GGT

TCT

CAC

TT6

GTT

GM

GCT

TTG

TAC

Π6

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

400

Cys

Gly

Ser

HU

Leu

Val

Glu

AU

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

«1/

Glu

Arg

95

100

105

GGT

TTC

TAC

ACT

GM

AAG

TCT

GAC

GCT

MG

GGT

ATC

GTT

GM

44B

Gly

Phe

Tyr

Thr

Glu

lys

Ser

Asp

ASP

AU

Lys

61/

íle

Val

Glu

no

115

120

CAA

TGT

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CM

TT6

GAA

AAC

TAC

TCT

496

Gin

Cys

Thr

Ser

lle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

61 u

Asn

Tyr

Cys

125

130

135

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 104 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín

AAC TAGAC6CAGC CCGCAGGCTC TAGA 523

Asft

140

2. Informácia o sekvencii id. č.: 18:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 140 aminokyselín

SK 282495 Β6

B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 18:

««t Arq PM Pro Ser II» Phe Thr AU v·! le» Phe AU AU 5»r Ser 1 S 1015

Ala Leu AU AU Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr AU Gin 20 2530 íle Pro AU Glu Ala Val íle Glj Tyr Ser Aso leu Glu Gh Asa Phe 35 4045

Asp Val AU Val Leu Pro Ph· Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu leu 50 SSSO

Phe Íle Asn Thr Thr Íle A1a Ser IU Ala Ala Lys 61u Glu Gly Val «5 70 75N

Sar leu Asp Lys Ars Glu Val Asn Gin HU Leu Cys 61y Ser His Leu GS 9095

Val Glu AU Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu ArJ Gly Phe Phe Tyr Thr 100 105no u Lys Ser Asp Asp AU Lys Gly íle Vil Glu Gin Cys tys 7hr Ser

US 120iu

Íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

130 135no

2. Informácia o sekvencii id. č.: 19:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 523 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 19:

TAGCTTAAGG ΤΑΛΟΠΟΤΤΑ TCAAGTTIGT TCncTlATU ΓΠίΑΤΜΙΤΤ AAAGTATGTGSO

TTATATTTGC TAATTTTCTT ACTCTAAA66 AAGTTAAAAA TGACGTCAAA ATAAKGTCG120

TAGGAGGCGT AATCGACGAG GTCAGTTGTG ATGTTGTCTT CTACTTTGCC GTCTTTAAGGItO

CCGACTTCGA CASTAGCCAA TGAGTCTAAA TCTTCCCCTA AAKTACAAC GACA4AACGG!4O

TAAAAGGTTG TCGTGTTTAT TGCCCAATAA CAAATATTTA TGATGATAAC 6GTCGTAAC6300

ACGATTTCTT CTTCCCCATA 6AAACCTATT CTCTCTTCAA ΤΤββΠίΤΜ ACACSCCAAG3Í0

AGTGAACCAA CHCGAAACA TGAACCAAAC ACCACTTTCT CCAAAGAAGA TGTGACTTTT420

CAGACTGCTG CGATTCCCAT AGCAACTTGT TACAACATGA AGATAGACAA 6AAACAT66T430

TAACCTTTTG ATGACATTGA TCTGCGTC66 GC6TCC6AGA TCT523

2.1nformácia o sekvencii id. č.: 20:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie: 80...391 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 20:

2. Informácia o sekvencii id. č.: 21:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 104 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 21:

Met

Lys

Ala

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

IU

G1y

Phe

Cys

Trp

AU

1

5

10

15

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Val

Glu

íle

Pro

Glu

Ser

20

25

30

Leu

Íle

IU

AU

Glu

Asn

Thr

Leu

AU

Asn

Val

AU

Het

AU

Lys

35

40

45

Arg

Ph«

Val

Asp

Gin

His

Leu

cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

AU

Leu

50

55

60

Tyr

Leu

Va1

Cys

Gly

61 u

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

55

70

75

80

Asp

Ala

Lys

Gly

IU

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

85

90

95

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

AU

100

2. Informácia o sekvencii id. č.: 22:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 22:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAäTG TTTGATAQTT 50

AAAGTATGTG TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGäACCAA 100

AÄCAGGAACT AGCCTAAGAC GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG 150

TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA GTAGCGACTT TTGTGGTGAÄ 200

ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AACTGGTTGT GAACACGCCA 250 AGAGTGAÄCC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA 3CO GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT 350 GAAGATAGÄC AAQAAACATQ GTTAACCTTT TGATGACACG AATCTGCGTC 40C GGGCGTCCGA GATCT 415

2. Informácia o sekvencii id. č.: 23:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie: 80...391 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 23:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA 50

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA tnCATACAC MTATMACG ACCAAAAGA ATG AAG 6CT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC Kat Lys AU Val Phe Leu Val Leu Ser Leu IU 1 5 10

6GA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT SOC GAT GAA TCA TCT GTT GAG Gly Phe Cys Trp AU Gin Pre Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu 15 MZS

ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT 6AA AAC ACC ACT TTG GCT A*í 11« Pro Glu Glu Ser Leu íle íle AU Glu Asn Thr Thr Leu AU Asn 30 35 40

112

160

208

GTC GCC ATG GCT AAG AGA TTC 6Π GAC CAA CAC TTG TGC GGT TCT CAC256

Vil AU Met AU Lys Ars Ph* Vil Asp Gin His Lw Cys Gly Ser His

5055

TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTC GH TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC304

Leu Val Glu AU Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Ara Gly Phe Phe Tyr

65 707$

ACT CCA AAG TCT GAC GAC GCT AAfi GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT352

Thr Pro Lys Ser Asp Asp AU Lys Gly IU Val Glu Gin Cys Cys Thr

8590

TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GM AAC TAC TGT GCT TAGAC6CAGC 401 Ser IU Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys AU

CCGCABCCTC TMA ¹⁰°41«

TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG 97

Met 1

Lys

Ala

Val Phe 5

Leu

GTT TTG

TCC

TTG

ATC

GGA

TTC

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

139

Val Leu

Ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

10

15

20

GGC GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

181

Gly Asp

Glu

Ser

Val

Glu

íle

Pro

Glu

G1U

Ser

Leu

tie

25

30

ATC GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

223

íle Ala

Glu

Asn

Thr

Leu

Ala

Aon

Val

Ala

Met

Ala

Lys

35

40

45

SK 282495 Β6

AGA

TTC

GTT

ACT

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

265

Arg

Phe

Val

Thr

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

HÍ8

Leu

Val

Glu

50

55

eo

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TAC

ACT

307

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg Gly

Phe

phe

Tyr

Thr

65

70

75

CCA AAG

TCT

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

349

Pro

Lys

Ser

ASP

Asp

Ala

Lys

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

eo

85

90

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

GCT

391

Thr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Ala

100

TAGACGCASC CCCCAGGCTC TAGA 415

2. Informácia o sekvencii id. č.: 24:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 104 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. Č.: 24:

Met

Lys

Ala

val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cys

Trp

1

5

10

15

Ala

Gin

Pro

val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

ser

Val

Glu

íle

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Ser

Leu

íle

Ala

Glu

Άβη

Thr

Leu

Ala

Asn

val

Ala

35

40

45

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Thr

Gin

HiS

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

50

55

60

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

65

70

75

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Ala

Lys

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

80

85

90

Thr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Ala

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCÄA 50

TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAÄGA ATG AÄG GCT GTT TTC TTC 97 Met Lys Ala Val Phe Leu

5

GTT

TTG

TCC

TTG

ATC

GGA

TTC

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

139

val

Leu

Ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

10

15

2C

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

ÄTT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTO

ATC

181

Gly

Asp

Glu

Ser

val

Glu

íle

Pro

Glu

Ser

Leu

íle

25

30

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

íle

Ala

Glu

Asn

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Lys

35

40

45

AGA

TTC

GTT

GAC

CAA

CAC

TTO

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

223

Arg

Phe

Val

Asp

Gin

HiS

Leu

Cys

Gly

Ser

HiS

Leu

Val

G1U

50

55

60

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TAC

ACT

265

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

65

70

75

CCA

AAG

TCT

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

307

Pro

Lys

Ser

ASP

Aep

Ala

Lys

Gly

íle

val

GlU

Gin

cys

Cys

80

8S

90

ACT TCT .

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TCT

* GGT

' 349

Thr 1

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

G1U

Asn

Tyr

Cys

i Gly

95

100

TAGACGCASC CCGCAGGCTC TAGA 415

2. Informácia o sekvencii id. č.: 27:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 104 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 27:

100

2. Informácia o sekvencii id. č.: 25 i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 25:

Met

Lys

Ala

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cys

Trp

1

5

10

15

Ala

Gin

Pro

val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Val

Glu

íle

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Ser

Leu

íle

Ala

Glu

Asn

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

35

40

45

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asp

Gin

Kle

Leu

Cya

Gly

Ser

Hla

Leu

50

55

60

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

65

70

75

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Ala

Lys

Gly

íle

val

Glu

Gin

Cys

SO

85

90

Thr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

95

100

TACCTTääCC	TAAGTTCTTA	TCAAGTTTGT	TCTTCTAATC	TTTGATAGTT	50
AAAGTATGTO	TTATATTTCC	TGGTTTTCTT	ACTTCCGACÄ	AAAGAACCAA	100
AACAOGAACT	ÄGCCTAAGAC	GACCCGGGTT	GGTCAGTCAC	CGCTACTTAG	150
TAGACAACTC	TÄAGGCCTTC	TCAGAGACTA	GTAGCGACTT	TTGTOGTGAA	200
ACCGATTGCA	GCGGTACCGA	TTCTCTAAGC	ÄATOAGTTGT	GAACACGCCA	250
AGAGTGAACC	AACTTCGAAA	CATGAACCAA	ACACCACTTT	CTCCAAAGAA	300
GATCTCAGGT	TTCAGACTGC	TGCGATTCCC	ATAGCAACTT	GTTACAACÄT	350
GAAGATAGAC	AAGAAACATG	GTTAACCTTT	TGÄTGACACG	AATCTGCGTC	400
GGGCGTCCGA	GATCT				415

2. Informácia o sekvencii id. č.: 28:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 28:

2. Informácia o sekvencii id. č.: 26:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie: 80...391 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 26:

TAGCTTAAGG	TAAGTTCTTA	TCAAGTTTGT	TCTTCTAATC	TTTGATAGTT	50
AÄAGTATGTG	TTATATTTGC	tggttttctt	ACTTCCGACÄ	AAAGAACCAA	100
aaCaGGaaCt	ÄGCCTAAGAC	GACCCGGGTT	GGTCAGTGAC	CGCTACTTAG	150
TASACAACTC	TÄAGGCCTTC	TCAGAGACTA	GTAGCGACTT	TTGTGGTGAA	200
ACCGATTGCA	GCGGTACCGA	TTCTCTAAGC	AACTGGTTGT	GAACACGCCA	250
AGAGTGAACC	AACTTCGAAA	CATGAACCAA	ACACCACTTT	CTCCAAAGAA	300
GATGTGAGGT	TTCAGACTGC	TGCGATTCCC	ATAGCAACTT	GTTACAACÄT	350
GAAGATAGAC	AAGAAACATG	GTTAACCTTT	TGATGACACC	AATCTGCGTC	400
GGGCGTCCGA	GATCT				415

2. Informácia o sekvencii id. č.: 29:

i) Charakteristiky sekvencia:

SK 282495 Β6 ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 31:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie: 80...391 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 29:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA 50

TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG 97 Met: Lys Ala Val Phe Leu

GTT

TTG

tcc

TTG

ATC

GGA

TTC

TGC

IGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

139

Val

Leu

Ser

Leu

íle

Gly Phe

Cya

Trp

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

10

15

20

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT GAG

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

161

Gly

Asp

Glu

Ser

Val

Glu

íle

Pro

Glu

Ser

Leu

íle

25

30

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

223

íle

Ala

Glu

Asn

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Lys

35

40

45

AGA

TTC

GTT

ACT

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GIT

GAA

265

Arg

Phe

Val

Thr

Gin

Hĺb

Leu

Cys

Gly

Ser

HÍ8

Leu

Val

Glu

50

55

60

GCT

TTG

TAC

TTG

GIT

TOT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TAC

ACT

307

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

65

70

75

CCA

AAG

TCT

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

349

Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly íle Val Glu Gin Cys Cys

8590 kCT TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT GGT 391

Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

95100

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA415

2. Informácia o sekvencií id. č.: 30:

i) Charakteristiky sekvencie:

xi) Opis

:sekven

cie:

sekvencia ii

d. č.

:30

Met

Lys

Ala

Yal

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cys

Trp

1

5

10

15

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Val

Glu

íle

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Ser

Leu

íle

Ala

Glu

Asn

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

35

40

45

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Thr

Gin

Hie

Leu

Cys

Gly

Ser

Mis

Leu

50

55

60

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

G1U

Arg

Gly

Phe

Tyr

65

70

75

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Ala

Lys

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

80

65

90

Thr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

95

100

2. Informácia o sekvencií id. č.: 31:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna

TAGCTTAAGG	TAAGTTCTTA	TCAAGTTTGT	TCTTCTAATG	TTTGATAGTT	50
AAAGTATGTG	TTATATTTGC	TGGTTTTCTF	ACTTCCGACA	AAAGAACCAA	100
AACAGGAACT	AGCCTAAGAC	GACCCGGGTT	GGTCAGTCAC	CGCTACTTAG	150
TAGACAACTC	TAAGGCCTTC	TCAGAGACTA	GTAGCGACTT	TTGTGGTGAA	200
ACCGATTGCA	GCGGTACCGA	TTCTCTAAGC	AATGAGTTGT	GAACACGCCA	250
AGAGTGAACC	AACTTCGAAA	CATGAACCAA	ACACCACTTT	CTCCAAAGAA	300
GATGTGAGGT	TTCAGACTGC	TGCGATTCCC	ATAGCAACTT	GTTACAACAT	350
GAAGATAGAC	AAGAAäCATG	GTTAACCTTT	TGATGACACC	AATCTGCGTC	400
GGGCGTCCGA	GATCT				415

2. Informácia o sekvencií id. č.: 32:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie: 80...499 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 32:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA 50

TTTCATACAC AATATAAACG ATTAAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT 97

Met Arg Phe Pro Ser íle

TTT

ACT

GCA

GTT

TTA

TTC

GCA

TCC

GCA

TTA

GCT

139

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ser

Ala

Leu

Ala

10

15

20

CCA

GTC

AAC

ACT

ACA

GAA

GAT

GAA

ACC

GCA

CAA

ATT

CCG

181

Pro

val

Asn

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

íle

Pro

25

30

GCT

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

223

Ala

Glu

Ala

Val

íle

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

35

40

45

GAT

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

AAT

AAC

GGG

265

A8p

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Gly

50

55

60

TTA TTG TTT ΑΤΑ AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT AAA 307

Leu Leu Phe íle Asn Thr Thr íle Ala Ser íle Ala Ala Lys

7075

GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC 349

Glu

Gly

Val

Ser

Leu

Asp

Lys

Arg

Phe

val

Asn

Gin

als

80

85

90

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

391

Leu

Cys Gly

Ser

Mís

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

val

Cys

95

100

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TAC

ACT

CCA

AAG

TCT

GAC

GCT

433

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Ala

105

110

115

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

ACT

TCT

ATC

TCT

TTG

475

Lys

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

íle

Cys

ser

Leu

120

125

130

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

AAC

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC 517

Tyr

Gin

Leu

Glu

Aen

Tyr

Cys

Asn

135

140

TAGA523

2. Informácia o sekvencií id. č.: 33:

i) Charakteristiky sekvencie:

SK 282495 Β6 (A) Dĺžka: 140 aminokyselín (B) Typ; aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 33:

Mec

Arg

Phe

Pro

Ser

íle

Phe

Thr

Ala

val

Leu

Phe

Ala

Ser

1

S

10

15

Ser

Ala

Leu

Ala

Pro

val

Asn

Thr

Glu

Aep

Glu

Thr

20

25

30

Ala

Gin

íle

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

íle

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

35

40

45

Gly

Asp

Phe

Asp

Val

Ala

val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

50

55

60

Aan

Gly

Leu

Phe

íle

Asn

Thr

íle

Ala

ser

íle

Ala

65

70

75

Lys

Glu

Gly

Val

Ser

Leu

Asp

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

HÍS

80

85

90

Leu

Cys

Gly

Ser

Hla

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

95

100

105

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Ala

Lys

Gly

110

115

120

íle

Val

Glu

Gin

cys

Cys

Thr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

12S

130

135

Glu Asn Tyr Cys Asn

140

2. Informácia o sekvencií id. č.: 34:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 523 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 34:

TAGCTTAAGG	TAAGTTCTTA	TCAAGTTTGT	TCTTCTAATG	TTTGATAGTT	50
ÄAAGTATGTG	TTATATTTGC	TAATTTTCTT	actctaaagg		100
TGACGTCAAA	ATAAGCGTCG	TAGGAGGCGT	AATCGACGAG	GTCAGTTGTG	150
ATGTTGTCTT	CTACTTTGCC	GTG'J ťl'AAGG	CCGACTTCGA	CAGTÄGCCAA	200
TGAGTCTAÄA	TCTTCCCCTA	AAGCTACAAC	GACAAAACGG	TAAAÄGGTTG	250
TCGTGITTAT	TGCCCAATAA	CAAATATTTA	TGATOATAAC	GGTCGTAACG	300
ACGATTTCTT	CTTCCCCATA	GAAACCTATT	CTCTAAGCAA	TTGGTTGTGA	350
ACACGCCAAG	AGTGAACCAA	CTTCGAAACA	TGAACCAAAC	ACCACTTTCT	400
CCAAAGAAGA	TGTGAGGTTT	CAGACTGCTG	CGATTCCCAT	AGCAACTTGT	450
TACAACATGA	AGATAGACAA	GAAACATGGT	TAACCTTTTÚ	ATGACATTGA	500
TCTGCGTCGG	GCGTCCGAGA	TCT			523

2. Informácia o sekvencií id. č.: 35:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 409 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie: 80...385 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 35:

ATCGMTTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA SO

TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG 97

Met Lys Ala Val Phe Leu

1

5

GIT

TTG

TCC

TTG

ATC

GGA

TTC

TGC

tGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

139

Val

Leu

ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

10

15

20

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

181

Gly

Aep

Glu

Ser

Val

Glu

íle

Pro

G1U

Glu

Ser

Leu

íle

2$

30

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

223

íle

Ala

G1U

Asn

Thr

Leu

Ala

Asn

val

Ala

Met

Ala

Lys

35

40

45

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

265

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

HÍ6

Leu

Val

Glu

50

55

60

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TAC

ACT

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

65

70

75

CCT

AAG

GAA

AAG

AGA

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

ACT

TCT

307

Pro

Lys

Glu

Lys

Arg

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

80

85

90

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

GGT

343

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

100

409

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA

2. Informácia o sekvencií id. č.: 36:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 102 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín

xi) Opis

í sekvencie:

sekvenc

ia id. č.:

36:

Met

Lys

Ala

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cys

Trp

1

5

10

15

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Val

Glu

íle

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Ser

Leu

íle

Ala

Glu

Asn

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

35

40

45

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

50

55

60

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

65

70

75

Thr

Pro

Lys

Glu

Lys

Arg

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

80

85

90

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

95

100

2. Informácia o sekvencií id. č.: 37:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 409 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 37:

TAGCTTAAGG	TAAGTTCTTA	TCAAGTTTGT	TCTTCTAATG	TTTGATAGTT	50
ÄAAGTATGTG	TTATATTTGC	TGGTTTTCTT	ACTTCCGACA	AAAGAACCAA	100
AACAGGAACT	AGCCTAAGAC	GACCCGGGTT	GGTCA6TGAC	CGCTACTTAG	150
TAGACAACTC	TAAGGCCTTC	TCAGAGACTA	GTAGCGACTT	TTGTGGTGAA	200
ACCGATTOCA	GCGGTACCGA	TTCTCTAAGC	AATTGGTTGT	GAACACGCCA	250
AGAGTGAACC	AACTTCGAAA	CATGAACCAA	ACACCACTTT	CTCCAAAGAA	300
GATGTGAGGA	TTCCTTTTCT	CTCCATAGCA	ACTTGTTACA	ACATGAAGAT	350
AGACAAGAAA	CATGGTTAAC	CTTTTGAT3A	CACCAATCTG	CGTCGGGCGT	400
CCGAGATCT					409

2. Informácia o sekvencií id. č.: 38:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 511 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS

SK 282495 Β6 (B) Umiestenie: 77...487 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 38:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATl'T SO

CATACACAAT ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT 97

Met Arg Phe Pro Ser íle Phe

ACT GCA GTT TTA TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA139

Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala AlaPro

1520

GTC AAC ACT ACA ACA GAA CAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT181 val Asn Thr Thr Thr Glu Αβρ Glu Thr Ala Gin IL· ProAla

3035

GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT TTA GAA GGG GAT TTC GAT223

Glu Ala Val íle Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly- Asp Phe Asp

4045

GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA AAT AAC GGG TTA265

Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Aen Ser Thr Asn Asn Gly Leu

5560

TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT AAA GAA307

Leu Phe íle Asn Thr Thr íle Ala Ser íle Ala Ala Lys Glu

7075

GAA GGG GTA TCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG349

Glu Gly Val Ser Met Ala Lys Arg Phe Yal Asn Gin HisLeu

8590

TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TCT GGT391

Cys Gly Ser His Leu val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly

100105

GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCA AAG ACT AGA GGT ATC GTT433

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pre Lys Thr Arg Gly íle val

110115

GAA CAA TGT TGT ACT TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA475

GLu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu

120 125130

AAC TAC TGC AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA 511

Asn Tyr Cys Asn

135

2. Informácia o sekvencii id. č.: 39:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 137 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 39:

Met Arg Phe Pro Ser íle Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser 15 1015

Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Aan Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr

2530

Ala Gin íle Pro Ala Glu Ala Val íle Gly Tyr Ser Asp Leu Glu

4045

Gly Asp Phe Asp Val Ala val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn

5560

Asn Gly Leu Leu Phe íle Asn Thr Thr íle Ala Ser íle Ala Ala

7075

Lys Glu Glu Gly Val Ser Met Ala Lys Arg Phe Val Asn Gin His

8590

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Yal Cya Gly

100105

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly íle Val Glu

110 115120

Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr

125 130135

Cys Asn

2. Informácia o sekvencii id. č.: 40:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 511 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.; 40:

CTTAÄGGTAA GTTCTTATCÄ AGTTTGTTCT TCrAATSTTT GATAGTTAAA SO

GTATGTGTTA TATTTGCTAA TTTTCTTACT ΟΓΑΛΑΟΟΑΜ TTAAAAATCA 100

CGTCAAAATA AGCGTCGTAG GAGCCCTAAT CGACGAGGTC AGTTGTGATG 150

TTGTCTTCTA CTľTGCCGTG TTTAAGGCCG ACTTCGACAG TAGCCAATGA 200 GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA AAGGTTCTCG 250 TGTTTATTGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAACGACG 300

ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGÁTTCTC TAAGCAATTG GTTGTGAACA 350 CGCCAAGCGT GAACCAACTT CGAAACATGA ACCAAACACC ACTTTCTCCA 400

AAGAAGATGT GACGTTTCTG ATCTCCATAC CAACTTGTTA CAACATGAAG 450

ATAGACAAGA AACATCGTTA ACCTTTTGAT GACGTTGATC TGCGTCGGGC 500 GTCCGAGATC T 511

2. Informácia o sekvencii id. č.: 41:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 523 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: iineáma ii) Typ molekuly: cDNA ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie: 80...499 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 41:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA 50

TTTCATACAC AATATAAACG ATTAAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT 97

Met Arg Phe Pro Ser íle

1S

TTT ACT GCA GTT TTA TTC GCA OCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT 139

Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala

1520

CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG181

Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin ílePro

2530

GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT TTA GAA GGG GAT TTC223

Ala Glu Ala Val íle Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly AspPhe

4045

GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA AAT AAC GGG265

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn AsnGly

5560

TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT AAA307

Leu Leu Phe íle Asn Thr Thr íle Ala Ser íle Ala AlaLys

7075

GAA GAA GGG GTA TGC ATG GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC349

Glu Glu Gly Val Ser Met. Ala Lys Arg Phe Val Asn GinHis

8590

TTG TGC GGT TCC CAC TTO GTT GAA GCT TTG TAC TTO GTT TGC391

Leu Cys Gly Ser His Leu VaL Glu Ala Leu Tyr Leu ValCys

95100

GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG TCT GAC GAT GCT433

Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp AspAla

105 110115

AAG GGT ATT GTC GAG CAA TGC TGT ACC TCC ATC TGC TCC TTG475

Lys Gly íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys SerLeu

120 125130

TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC TAGACGCAGC509

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

135140

CCGCAGGCTC TAGA523

SK 282495 Β6

2. Informácia o sekvencii id. č.: 42:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 140 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 42:

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

íle

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ser

1

5

10

1S

Ser

Ala

Leu

Ala

Pro

val

Asn

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

20

25

30

Ala

Gin

íle

Pro

Ala

Glu

Ala

val

íle

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

35

40

45

Gly

Asp

Phe

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

50

55

60

Asn

Gly

Leu

Phe

íle

Asn

Thr

íle

Ala

Ser

íle

Ala

65

70

75

Lys

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

80

95

90

Leu

Cys

Gly

Ser

HiS

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

95

100

105

Glu

Arg Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Ala

Lys Gly

110

115

120

íle

Val Glu

Gin

Cya

Cys

Thr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr Gin

Leu

125

130

135

Glu Asn Tyr Cys Asn

140

2. Informácia o sekvencii id. č.: 43:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 523 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 43:

TAGCTTAAGG TAAGTTCITA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATÄGTT 50

AMGTATGTG TTATATTTCC TAATTTTCTT ACTCTAAAGG AAfiTTAAAAA 100

TCACGTCAAA ATäAGCGTCG TAGGAGGCGT ÄATCGACGAG GTCAGTTGTG 150

ATGTTGTCTT CTACTTTGCC GTGTTTAAGG CCGACTTCGA CAGTAGCCAA 200

TGAGTCTAAA TCTTCCCCTA AAGCTACAAC GACAAAACGG TAAAAGGTTC 250

TCG’IGTTTAT TGCCCAATAA CAAATATTTA TGATGATAAC GGTCGTAACG 300

ACGATITCrr CTTCCCCATA GGTACCGATT CTCTAAGCAA TTGGTTGTGA 350

ACACGCCAAG GGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC GCCACTTTCT 400

CCAAAGAAGA TGTGAGGATT CAGACTGCTA CGATTCCCAT AACAGCTCGT 450

TACGACATGG AGGTAGACGA GGAACATGGT TAACCTTTTG ATGACGTTGA 500

TCTGCGTCGG GCGTCCGAGA TCT 523

2.1nformáciao sekvencii id. č.: 44:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 535 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie: 77...511 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 44:

GAATTCCATT CAAGAÄTAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT 50

CATACACAAT ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT 99

Met Arg Phe Pro Ser íle Phe

1

5

ACT 1

GCA

GTT

TTA

TTC

GCA

TCC

GCA

TTA

GCT

CCA

141

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ser

Ala

Leu

Ala

Pro

10

15

20

GTC

AAC

ACT

ACA

GAA

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

183

Val

Asn

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

íle

Pro

Ala

25

30

35

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

GAT

225

Glu

Ala

Val

íle

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

G1U

Gly Asp

Phe

ÄSp

40

45

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

AAT

AAC

GGG

TTA

267

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Gly

Leu

50

55

60

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

AAA

GAA

309

Leu

Phe

íle

Asn

Thr

íle

Ala

Ser

íle

Ala

Lys

Glu

65

70

75

GAA

GGG

GTA

TCC

ATG

GCT

AAG

AGA

GAA

GCT

GAA

GCT

GAA

351

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

80

85

90

GCT

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

GTT

393

Ala

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

HIS

Leu

Cys

Gly

Ser

H1S

Leu

Val

95

100

105

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TAC

435

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg Gly

Phe

Tyr

110

115

ACT

CCA

AAG

ACT

AGA

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

ACT

TCT

477

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

íle

val

G1U

Gin

Cys

Thr

ser

120

125

130

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

519

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

13S 140 145

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA 535

Ž.Informácia o sekvencii id. č.: 45:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 145 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: íineáma ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 45:

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

íle

Phe

Thr

Ala

val

Leu

Phe

Ala

Ser

1

5

10

15

Ser

Ala

Leu

Ala

Pro

val

Asn

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

20

25

30

Ala

Gin

íle

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

íle

Gly

Tyr

Ser

ASp

Leu

Glu

35

40

45

Gly

Asp

Phe

Asp

Val

Ala

val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

ser

Thr

Asn

50

55

60

Aen

Gly

Leu

Phe

íle

Asn

Thr

Zle

Ala

Ser

íle

Ala

65

70

75

Lys

Glu

G1U

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Glu

Ala

Glu

Ala

BO

BS

90

Glu

Ala

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

95

100

105

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

110

115

120

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

Tie

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

íle

Cys

125

130

135

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

140

145

SK 282495 Β6

2. Informácia o sekvencii id. č.: 46:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 535 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 46:

CTTAAGGTAA	GTTCTTATCA	agtttgttct	TCTAAreTTT	GATAGTTAAA	50
GTATGTGTTA	TATTTGCTAA	TTrTCTTACT	CTAAAGGAAG	TTAAAAATGA	100
CGTCAAAATA	AGCGTCGTAG	GAGGCGTAAT	CGACGAGGTC	AGTTGTGATG	150
TTGTCTTCTA	CTTTGCCGTG	TTTAAGGCCG	ACTTCGACAG	TAGCCAATGA	200
GTCTAAATCT	TCCCCTAAAG	CTACAACGAC	AAAACGGTAA	AAGGTTGTCG	350
TGTTTATTGC	CCAATAACAA	ATATTTATGA	TGATAACGGT	CGTAACGACG	300
ATTTCTTCTT	CCCCATAGGT	ACCGATTCTC	TcrrcTTCGA	CTTCGACTTC	350
GATCTAAGCA	ATTCGTTGTG	AACACGCCAA	GGGTGAACCA	ACTTCGAAAC	400
ATGAACCAAÄ	CACCACTTTC	tccaaagaag	ATGTGAGGTT	TCTCATCTCC	450
ATAGCAACTT	GTTACAACAT	GAAGATAGAC	ÄAGAAACATG	GTTAACCTTT	500
TOATGAOGTT	GATCTGCGTC	GGGCGTCCGA	GATCT		535

2. Informácia o sekvencii id. č.: 47:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 538 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestenie: 77...514 xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 47:

GAATTCCMT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACXM CTATCAATTT 50

CATACACAAT ATAAACGATT AAÄAGA ATG AGA TTT CCT TCA ΑΊΤ TTT 97

Met Arg Phe Pro Ser íle Phe

1

5

ACT

GCA

GTT

ΊΤΑ

1TC

GCA

TCC

GCA

TTA

GCT

CCA

139

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ser

Ala

Leu

Ala

Pro

10

15

20

GTC

AAC

ACT

ACA

GAA

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

181

val

Asn

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

íle

Pro

Ala

25

30

35

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

GAT

223

G1U

Ala

Val

íle

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

G1U

Gly Asp

phe

Asp

40

45

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

AAT

AAC

GGG

TTA

265

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Gly

Leu

50

55

60

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

AAA

GAA

307

Leu

Phe

íle

Asn

Thr

íle

Ala

Ser

íle

Ala

Lys

Glu

65

70

75

GAA

GGG

GTA

TCC

ATG

GCT

AAG

AGA

GAA

GCT

GAA

GCT

GAA

349

G1U

Gly

val

Ser

Met

Ala

Lys Arg

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

80

85

90

GCT

GAA

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

391

Ala

Glu

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

95

100

105

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

433

val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cy8

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

110

115

TAC

ACT

CCA

AAG

ACT

AGA

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

ACT 475

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

120

125

130

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

514

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Αβη

135

140

145

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAflA 538

2. Informácia o sekvencii id. č.: 48:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 146 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 48:

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

íle

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ser

1

5

10

15

Ser

Ala

Leu

Ala

Pro

val

Asn

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

20

25

30

Ala

Gin

íle

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

íle

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

35

40

45

Gly

Asp

Phe

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

50

55

60

Asn

Gly

Leu

Phe

íle

Asn

Thr

íle

Ala

Ser

íle

Ala

65

70

75

Lys

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Glu

Ala

Glu

Ala

80

85

90

Glu

Ala

Glu

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

HÍS

Leu

Cys

Gly

Ser

HÍB

Leu

95

100

105

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

110

115

120

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

íle

125

130

135

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

cys

Asn

140

145

2. Informácia o sekvencii id. č.: 49:

i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 538 párov báz (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitosť: jednoduchá (D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA xi) Opis sekvencie: sekvencia id. č.: 49:

CTTAAGGTAA	GTTCTTATCA	AGTTTCTTCT	Γ0ΓΑΑΤ3ΊΤΤ	GATAGTTAAA	50
GTATGTGTTA	TATTTGCTAA	TTTTCTTACT	CTAAAGGAAG	TTAAAAATGA	100
CGTCAAAATA	AGCGTCGTAG	GAGGCGTAAT	CGACGAGGTC	AGTTGTGATG	150
TTGTCTTCTA	CTTTGCCGTG	TTTAAGGCCG	ACTTCGACAG	TAGCCAATGA	200
GTCTAAATCT	TCCCCTAAAG	CTACAACGAC	AAAACGGTAA	AAGGTTGTCG	250
TGTTTATTGC	CCAATAACAA	ATATTTATGA	TGATAACGGT	CGTAACGACG	300
ATTTCTTCTT	CCCCATAGGT	ACCGATTCTC	TCTTCTTCGA	CTTCGACTTC	350
GACTTTCTAA	GCAATTGGTT	GTGAACACGC	CAAGGGTGAA	CCAACTTCGA	400
ÄACATGAACC	AAACACCACT	TTCTCCAAAG	AAGATCTGAG	GTTTCTGATC	450
TCCATAGCAA	CTTGTTACAA	CATGAAGATA	GACAAGAAAC	ATGGTTAACC	500
TTTTGATGAC	GTTGATCTGC	GTCGGGCGTC	CGAGATCT		538

Priemyselná využiteľnosť

Prostriedky podľa predkladaného vynálezu sú priemyselne využiteľné pri príprave prostriedkov na liečbu diabetu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Acylovaný inzulínový derivát so sekvenciou:

A-reťazec s--- -S

J ' I Gly-Ile’Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-CyB-Ser1 2 3 4 5 6 β 9 10 1112

S ,I

B-retazecS

Xaa-Val-Xaa-GLn-Kis-Leu-CyB-Gly-Ser-His-Leu-val1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

Ά-reíazec (pokračovania)

20 beu-Tyr-Gln-Leu-Glu-ÄBn-Tyr-Cys-Xa* (sekvencia id. č.:l) 13 14 15 16 17 18 19 |21

H

8*reťazec (pokračovanie) Š

Glu-Ala-Leu-Tyr-l/eu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly'Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324

B-reťazec (pokračovanie) Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Xaa (sekvencia id. č.;2) 25 26 27 20 2930 > v ktorom

Xaa v polohách A21 a B3 sú nezávisle akékoľvek aminokyselinové zvyšky, ktoré sú kódované genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys;

Xaa v polohe BI je Phe alebo je vypustené;

Xaa v polohe B30 je (a) nekódovaná, lipofilná aminokyselina, ktorá sa skladá z 10 až 24 uhlíkových atómov, pričom acylová skupina karboxylovej kyseliny s až 5 uhlíkovými atómami je viazaná k ε-aminokyseline Lys⁸²⁹, (b) akýkoľvek aminokyselinový zvyšok, ktorý je kódovaný genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys, pričom ε-aminokyselina Lys⁸²⁹ má lipofilný substituent, alebo (c) je vypustená, pričom ε-aminokyselina Lys⁸²⁹ má lipofilný substituent; a jeho Zn²⁺ komplex, v ktorom 2 až 4 Zn²⁺ ióny sú naviazané na každý inzulínový hexamér, za predpokladu, že Xaa v polohe B30 je Thr alebo Ala, Xaa v polohách A21 a B3 sú Asn a Xaa v polohe BI je Phe, potom je inzulínový derivát Zn²⁺ komplex.
2. Inzulínový derivát podľa nároku 1, v ktorom Xaa v polohách A21 a B3 sú nezávisle akékoľvek aminokyselinové zvyšky, ktoré sú kódované genetickým kódom okrem lys, Arg a Cys;

Xaa v polohe BI je Phe alebo je vypustené;

Xaa v polohe B30 je (a) nekódovaná, lipofilná aminokyselina, ktorá sa skladá z 10 až 24 uhlíkových atómov a acylová skupina je acylovou skupinou monokarboxylovej kyseliny s až 4 uhlíkovými atómami alebo dikarboxylovej kyseliny s až 5 uhlíkovými atómami.
3. Inzulínový derivát podľa nároku 1, v ktorom Xaa v polohách A21 a B3 sú nezávisle akékoľvek aminokyselinové zvyšky, ktoré sú kódované genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys;

Xaa v polohe BI je Phe alebo je vypustené;

Xaa v polohe B30 je vypustené alebo je to akýkoľvek aminokyselinový zvyšok, ktorý je kódovaný genetickým kódom okrem Lys, Arg a Cys a ε-aminoskupina Lys⁸²⁹ má lipofilný substituent, ktorý sa skladá najmenej zo 6 atómov uhlíka.
4. Inzulínový derivát podľa nároku 2, v ktorom Xaa v polohe B30 je vybrané zo skupiny, ktorá sa skladá zaaminodekánovej kyseliny, α-aminododekánovej kyseliny, α-aminotetradekánovej kyseliny a ct-aminohexadekánovej kyseliny.
5. Inzulínový derivát podľa nároku 2, v ktorom je acylová skupina viazaná na ε-aminoskupinu Lys⁸²⁹ vybraná zo skupiny, ktorá sa skladá z formylu, acetylu, propionylu a n-butyrylu.
6. Inzulínový derivát podľa nároku 2, v ktorom je acylová skupina viazaná na ε-aminoskupinu Lys⁸²⁹ acylovou skupinou kyseliny jantárovej.
7. Inzulínový derivát podľa nároku 3, v ktorom je Xaa v polohe B30 vypustené.
8. Inzulínový derivát podľa nároku 3, v ktorom Xaa v polohe B30 je Asp, Glu alebo Thr.
9. Inzulínový derivát podľa nároku 3, v ktorom je lipofilný substituent viazaný na ε-aminoskupinu Lys⁸²⁹ acylovou skupinou odvodenou od karboxylovej kyseliny, ktorá sa skladá najmenej zo 6 atómov uhlíka.
10. Inzulínový derivát podľa nároku 3, ktorým je N⁶⁸²⁹-tetradekanoyl des(B30) ľudský inzulín.
11. Inzulínový derivát podľa nároku 3, ktorým je Zn²⁺komplex N^e829-tetradekanoylu des(B30) ľudský inzulín obsahujúci 2,3 alebo 4 Zn²⁺ ióny na každý inzulínový hexamér.
12. Inzulínový derivát podľa nároku 3, ktorým je N*⁸²⁹-litocholoyl-glutamyl)des(B30) ľudský inzulín.
13. Inzulínový derivát podľa nároku 9, v ktorom acylová skupina, ktorá je pripadne rozvetvená, obsahuje hlavný reťazec, ktorý má dĺžku 8 až 24 atómov uhlíka.
14. Inzulínový derivát podľa nároku 9, v ktorom je acylová skupina acylovou skupinou mastnej kyseliny, ktorá má najmenej 6 atómov uhlíka.
15. Inzulínový derivát podľa nároku 9, v ktorom je acylová skupina acylovou skupinou lineárnej, nasýtenej karboxylovej kyseliny, ktorá má 6 až 24 atómov uhlíka.
16. Inzulínový derivát podľa nároku 9, v ktorom je acylová skupina vybraná zo skupiny, ktorá zahŕňa kyselinu dodekánovú, kyselinu tridekánovú a kyselinu tetradekánovú.
17. Inzulínový derivát podľa nároku 1, v ktorom Xaa v polohe A21 je Ala, Gin, Gly alebo Ser.
18. Inzulínový derivát podľa nároku 1, v ktorom Xaa v polohe B3 je Asp, Gin alebo Thr.
19. Inzulínový derivát podľa nároku 1, v ktorom Xaa v polohe BI je vypustené.
20. Farmaceutický prostriedok na liečbu cukrovky, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo inzulínového derivátu podľa nároku 1 spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.
21. Farmaceutický prostriedok na liečbu cukrovky, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo inzulínového derivátu podľa nároku 1 v zmesi s inzulínom alebo inzulínovým analógom, ktorý účinkuje rýchlo spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.