SK281964B6 - Monoklonálna protilátka schopná vyvolať apoptózu myeloidných buniek, jej fragmenty a hybridóm - Google Patents
Monoklonálna protilátka schopná vyvolať apoptózu myeloidných buniek, jej fragmenty a hybridóm Download PDFInfo
- Publication number
- SK281964B6 SK281964B6 SK255-96A SK25596A SK281964B6 SK 281964 B6 SK281964 B6 SK 281964B6 SK 25596 A SK25596 A SK 25596A SK 281964 B6 SK281964 B6 SK 281964B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- cells
- bmap
- antibody
- monoclonal antibody
- cell
- Prior art date
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title description 124
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 title description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 230000031957 myeloid cell apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 18
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 abstract 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 24
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 15
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 14
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 11
- 210000003887 myelocyte Anatomy 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 10
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 10
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 6
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 2
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 2
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108010052621 fas Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000018823 fas Receptor Human genes 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001167 myeloblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 101150064015 FAS gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- BGSOJVFOEQLVMH-UHFFFAOYSA-N Hydrocortisone phosphate Natural products O=C1CCC2(C)C3C(O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)COP(O)(O)=O)C4C3CCC2=C1 BGSOJVFOEQLVMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 101000648740 Mus musculus Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 108010052989 Naphthol AS D Esterase Proteins 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000000006 cell growth inhibition assay Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- BGSOJVFOEQLVMH-VWUMJDOOSA-N cortisol phosphate Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)COP(O)(O)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 BGSOJVFOEQLVMH-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 229950000785 hydrocortisone phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- -1 β-glucouronidase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Monoklonálna protilátka, ktorá má schopnosť spôsobiť apoptózu myeloidných buniek, jej fragmenty a hybridóm produkujúci uvedenú monoklonálnu protilátku. Opísané monoklonálne protilátky sú užitočné ako protilátky rozoznávajúce a určujúce antigény a tým špecificky spôsobujúce apoptózu myeloidných buniek, pričom môžu byť použité ako liečivo na liečenie myelocytovej leukémie.ŕ
Description
Oblasť techniky
Vynález sa vzťahuje na novú monoklonálnu protilátku, ktorá má schopnosť spôsobiť apoptózu (programové hynutie buniek) myeloidných buniek a ktorá je užitočná ako liečivo myelocytovej leukémie, ďalej sa vzťahuje na fragmenty uvedenej monoklonálnej protilátky a na hybridóm produkujúci uvedenú protilátku.
Pretože monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sú užitočné ako protilátky špecificky rozoznávajúce a identifikujúce antigény spôsobujúce apoptózu myeloidných buniek a popritom sú schopné spôsobiť apoptózu myeloidných buniek, môžu sa s využitím ich vlastností použiť ako užitočné liečivo v oblasti liekov myelocytovej leukémie.
Doterajší stav techniky
Stimulačné faktory granulocytových kolónií, napríklad rekombinantné stimulačné faktory granulocytových kolónií (rG-CSF) boli doteraz známe ako humorálne faktory stimulujúce diferenciáciu a proliferáciu granulocytových buniek. Bolo zverejnené, že v pokusoch s myšami in vivo zvyšuje podávanie rG-CSF krvotvorbu kostnej drene a navyše spôsobuje významnú mimodreňovú krvotvorbu v slezine množením krvotvomých kmeňových buniek a všetkých krvotvomých prekurzorov v slezine. Za mimodreňový krvotvomý mechanizmus v slezine sa považuje krvotvorba, ktorá nastáva v dôsledku zmien krvotvomého okolitého mikroprostredia v slezine, stimulovaných s rG-CSF a zvyšujúcich krvotvomý potenciál.
Autori vynálezu preto pozorovali slezinové stromálne bunky s podávaným rG-CSF z hľadiska vyjasnenia krvotvomého potenciálu v slezine. Z hľadiska analýzy zvýšenia krvotvomého potenciálu stromálnymi bunkami ovplyvnenými s rG-CSF a z hľadiska vyskúšania potenciálneho účinku na krvotvorbu autori zistili, že použitím krvotvomých stromálnych buniek s krvotvomou stromálnou bunkovou líniou (bunky CF-1 ) zo sleziny myši, ktorým sa podávali rG-CSF, sa dosiahla in vitro stimulácia aktivít kolónií a in vivo sa dosiahla podpora účinnosti krvotvomých kmeňových buniek [Blood, 80,1914 (1992)].
Preto autori tohto vynálezu neúnavným štúdiom v oblasti vývoja špecifickej protilátky schopnej rozoznávať stromálnu slezinovú bunku, ktorá má podpornú účinnosť na zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek, na základe uvedených informácií o stromálnych slezinových bunkách a z výsledkov štúdií, pri ktorých pripravili stromálnu slezinovú bunku ako bunkovú líniu, ktorá má podpornú účinnosť na zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek, a súčasne prípravou monoklonovej protilátky s použitím stromálnej bunkovej línie sleziny ako antigénu na imunizáciu, získali ako výsledok štúdia doteraz neopísané nové monoklonové protilátky. Autori vynálezu pri štúdiu vlastností získaných monoklonových protilátok prekvapivo zistili, že uvedené monoklonálne protilátky majú schopnosť spôsobovať apoptózu myeloidných buniek, čo viedlo k vytvoreniu tohto vynálezu.
Podstata vynálezu
Predmetom a účelom tohto vynálezu je nová monoklonálna protilátka, ktorá má schopnosť vyvolať apoptózu myeloidných buniek a ktorá je užitočná ako liečivo myelocytovej leukémie, predmetom a účelom tohto vynálezu ďalej sú fragmenty uvedenej monoklonálnej protilátky a tiež hybridóm produkujúci uvedenú monoklonálnu protilátku.
Monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu je významne užitočná ako protilátka rozoznávajúca antigény spôsobujúce apoptózu [tiež označovanú ako samodeštrukcia buniek, alebo programové hynutie buniek, jav, pri ktorom sa odbúrava chromatín DNA jadra v polohe nukleozómovej jednotky (tzv. vznik rebríka), čo vyúsťuje do hynutia buniek] myeloidných buniek a ktorá má schopnosť identifikavať takéto bunky, alebo spôsobovať apoptózu myeloidných buniek. Myeloidné bunky zahrnujú iné bunky ako lymfoidné; zahrnujú neutrofily, megakaryocyty, myeloblasty, myelocyty, žime bunky (masty), makrofágy, monocyty a erytroblasty. Myeloidné bunky podľa tohto vynálezu znamenajú rovnaké bunky, ako boli práve uvedené. Doteraz nebola známa nijaká monoklonálna protilátka, ktorá by mala schopnosť spôsobovať apoptózu myeloidných buniek, a preto monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sú určené tak, že zahrnujú všetky monoklonálne protilátky, ktoré majú schopnosť spôsobiť apoptózu myeoloidných buniek.
Monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu sa môže pripraviť v podstate tak, ako je uvedené ďalej.
Monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu sa môže napríklad pripraviť použitím stromálnych slezinných buniek odvodených zo zvieraťa, ktorému sa podávali rG-CSF ako antigény, ktoré zviera imunizujú bežným imunizačným spôsobom; fúziou imunizovaných buniek bežným spôsobom fúzie a klonovaním fuzovaných buniek bežným spôsobom klonovania.
Ako spôsob prípravy monoklonálnej protilátky podľa tohto vynálezu sa môže výhodne uviesť príklad zahrnujúci použitie uvedených CF-1 buniek, slezinných stromálnych buniek zvieraťa, ktorému boli podávané ako antigén rG-CSF pripravené ako bunková línia autormi tohto vynálezu [Blood, Vol. 80, 1914, (1992)]. Spôsob ďalej zahrnuje íuziu plazmových buniek (imunocytov) cicavca, imunizovaného antigénom s myelómovými bunkami cicavca, napríklad myši, klonovanie získaných fúzovaných buniek (hybridómy), vyhľadávanie uvedenej bunkovej linie a výber klonov produkujúcich protilátku podľa tohto vynálezu, kultiváciu vybraných klonov na získanie predmetnej protilátky. Uvedený spôsob je uvedený ako príklad a na produkciu predmetnej protilátky sa môžu použiť nielen napríklad CF-1 bunky, ale vhodne aj iné stromálne bunky krvotvorného tkaniva získaného podobne ako u buniek CF-1, alebo stromálne bunky krvotvomého tkaniva odvodeného od ľudských stromálnych buniek. Použijú sa rovnakým spôsobom ako v prípade uvedených CF-1 buniek.
Pri príprave uvedených monoklonálnych protilátok nie je výber cicavcov na imunizáciu uvedeným antigénom osobitne vymedzený; pri ich výbere sa berie do úvahy najmä vhodnosť na ich použitie s myelómovými bunkami, s ktorými sa má vykonať fúzia. Výhodne sa použije myš, krysa alebo škrečok.
Imunizácia sa vykoná bežným spôsobom, napríklad podávaním slezinných stromálnych buniek, ako sú uvedené CF-1 bunky, injekciou do abdominálnej dutiny cicavca. Podrobnejšie, uvedené bunky sa zvieraťu podávajú najmä zriedené alebo suspendované vo vhodnom množstve PBS alebo v izotonickom roztoku chloridu sodného niekoľkokrát za mesiac. Výhodne sa použijú slezinné bunky získané po poslednom podávaní uvedených buniek ako imunocytov.
Myelómové bunky cicavca sa môžu využiť ako ďalšie východiskové bunky na fúziu s uvedenými imunocytmi. Výhodne sa môžu použiť rôzne známe bunky zahrnujúce
SK 281964 Β6
P3(P3X63Ag8.653) [J. Immunol., 123, 1548, (1978)], p3-Ul [Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81, 1 až 7, (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6, 511 až 519 (1976)], MPC-11 [Celí, 8, 405 až 415, (1976)], Sp2/0-Agl4 [Náture, 276, 269 až 270 (1978)], FO [J. Immunol. Meth., 35,1 až 21 (1980)], S194 [J. Exp. Med., 148, 313 až 323, (1978)] aR210 [Náture, 277,131 až 133 (1979)].
Bunková fúzia uvedeného imunocytu a myelómovej bunky sa môže vykonať v podstate bežnými spôsobmi, napríklad spôsobom podľa Milsteina et al., [Methods Enzymol., 73,3 až 46 (1981)].
Podrobnejšie, uvedená fúzia buniek sa môže vykonať napríklad v bežnom výživnom prostredí za prítomnosti urýchľovačov fúzie. Ako urýchľovač fúzie sa môže výhodne pridávať polyetylénglykol (PEG) a vírus Sendai (HVJ), ďalej adjuvans, ako je dimetylsulfoxid, ak sa vyžaduje zvýšiť účinnosť fúzie. Čo sa týka pomerov imunocytov k myelómovým bunkám, výhodné je 1 až 10-násobné množstvo imunocytov ako myelómových buniek. Príklady prostredí použitých pri uvedenej bunkovej fúzii zahrnujú prostredie RPMI-1640 a prostredie MEM vhodné na proliferáciu uvedených myelómových buniek a ďalšie prostredia bežne používané pri kultivácii takýchto druhov buniek a navyše sa spolu s nimi môže použiť doplnkové sérum, ako je fetálne bovinné sérum (FBS).
Fúzia buniek sa vykoná zmiešaním určených množstiev uvedených imunocytov a myelómových buniek v uvedenom prostredí, pridaním roztoku PEG, predhriateho na 37 °C, napríklad polyetylénglykolu s priemernou molekulovou hmotnosťou poriadku 1000 až 6000, do prostredia, bežne v koncentrácii asi 30 až 60 % (hmotnosť/objem) a miešaním. Predmetné hybridómy sa potom môžu vytvoriť postupným opakovaním operácii pridávania vhodného prostredia, odstredením reakčnej zmesi a odstránením supematantov.
Uvedené hybridómy sa selektujú kultiváciou v bežnom selekčnom prostredí, napríklad v prostredí HAT (stredne doplnené s hypoxantínom, aminopterínom a tymidínom). Kultivácia v prostredí HAT pokračuje v čase, dostatočnom na to, aby vyhynuli iné než predmetné hybridómy (nefúzované bunky), bežne niekoľko dní až niekoľko týždňov. Potom sa vykoná výber a monoklonovanie hybridómov produkujúcich predmetné protilátky bežným spôsobom obmedzeného riedenia.
Vytvorené hybridómy produkujúce monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu subkultivovať v bežnom prostredí. V tekutom dusíku sa môžu uchovávať dlhý čas.
Na získanie monoklonálnych protilátok podľa tohto vynálezu od hybridómu sa môže použiť spôsob zahrnujúci kultiváciu hybridómov bežným spôsobom a ich oddelenie z prostredia supematanta, alebo spôsob zahrnujúci podávanie hybridómov vhodným cicavcom na proliferáciu hybridómov a ich oddelenie z ascitu cicavcov. Prvý z uvedených spôsobov je vhodný na získanie vysoko čistých protilátok, druhý spôsob je vhodný na hromadnú výrobu protilátok.
Protilátky získané podľa uvedeného spôsobu sa môžu ďalej bežným spôsobom čistiť do vysokého stupňa použitím bežných prostriedkov, ako je technika vysoľovaním, gélová filtrácia a afmitná chromatografia.
Uvedená monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu môže byť ktorákoľvek protilátka, pokiaľ má špecifickú vlastnosť, ktorá bude opísaná neskoršie v príklade, bližšie, schopnosť spôsobovať apoptózu myeloidných buniek. Tie protilátky, ktoré majú uvedenú schopnosť, sú zahrnuté v rámci tohto vynálezu bez ohľadu na druh antigénov; monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu sa môže použiť ako užitočné liečivo pri myelocytovej leukémii v zhode s využitím uvedenej schopnosti.
Vytvorenie špecifického systému na identifikáciu a rozoznávanie antigénov spôsobujúcich apoptózu myeloidných buniek v zhode s využitím monoklonálnej protilátky podľa tohto vynálezu, alebo na jej použitie ako liečiva pri myelocytovej leukémii v zhode s využitím jej špecifickej schopnosti, ako aj jej modifikácia a použitie sú samozrejme zahrnuté v rámci tohto vynálezu, pokiaľ sa zavedú na bežné použitie v praxi, známe skúseným v danej oblasti.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 znázorňuje záznam imunofluorescenčnej analýzy (kontrolnej vzorky buniek CF-1 v neprítomnosti protilátky).
Obr. 2 znázorňuje výsledky imunofluorscenčnej analýzy väzbových vlastností GSPST-1 protilátky k CF-1 bunkám.
Obr. 3 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy väzbových vlastností protilátky BMAP-1 k CF-1 bunkám.
Obr. 4 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy (kontrolnej vzorky buniek kostnej drene za neprítomnosti protilátky).
Obr, 5 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy väzbových vlastnosti protilátky GSPST-1 k bunkám kostnej drene.
Obr. 6 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy väzbových vlastností protilátky BMAP-1 k bunkám kostnej drene.
Obr. 7 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy (kontrolnej vzorky NFS-60 za neprítomnosti protilátky).
Obr. 8 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy väzbových vlastnosti protilátky GSPST-1 k bunkám NSF-60.
Obr. 9 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy (kontrolnej vzorky NFS-60 podľa krysí IgG 1).
Obr. 10 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy väzbových vlastností protilátky BMAP-1 k bunkám NSF-60.
Obr. 11 znázorňuje výsledky skúšky inhibície rastu buniek NFS-60 monoklonálnou protilátkou (BMAP-1).
Obr. 12 znázorňuje výsledky skúšky inhibície transplantácie kostnej drene monoklonálnou protilátkou (GSPST-1).
Obr. 13 znázorňuje výsledky skúšky inhibície transplantácie kostnej drene monoklonálnou protilátkou (BMAP-1).
Obr. 14 je názorný pohľad [mikrofotografie (farbené s H. E.) na vzorky kostnej drene (zväčšenie 400-násobné)] na uhynuté bunky kostnej drene (2) šiesty deň po podaní monoklonálnej protilátky BMAP-1 podľa tohto vynálezu a na kontrolnú vzorku (1) bez prítomnosti protilátky.
Obr. 15 je názorný pohľad (migračná fotografia záznamu elektroforetickej chromatografie) na „vznik rebríka“ z DNA buniek kostnej drene, pozorovaný, keď sa podala monoklonálna protilátka BMAP-1 podľa tohto vynálezu.
Obr. 16 znázorňuje výsledky skúšky cytotoxicity s použitím buniek L929 s TNF a.
Obr. 17 znázorňuje výsledky skúšky cytotoxocity monoklonálnou protilátkou (BMAP-1).
Obr. 18 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy (kontrolná vzorka BWV1 podľa krysej IgG2a).
Obr. 19 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy väzbových vlastností protilátky protimyšacej MHC triedy I k BWV1 bunkám.
Obr. 20 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy (kontrolnej vzorky BWV1 podľa krysejlgGl).
Obr. 21 znázorňuje výsledky imunofluorescenčnej analýzy väzbových vlastností protilátky BMAP-1 k bunkám BWV1.
drene drene drene myši, ktorej myši, ktorej myši, ktorej sa sa sa podala podala podala
BMAP-1
BMAP-1
BMAP-1
Označenie a význam symbolov:
a: DNA týmusu myši, ktorej sa podala BMAP-1 (24 hodín) b: DNA kostnej (24 hodín), c: DNA kostnej (8 hodín), d: DNA kostnej (4 hodiny), e: DNA kostnej drene myši bez liečby (bunky kostnej drene), f: značkovač molekulovej hmotnosti.
V ďalšom texte sa tento vynález opisuje podrobnejšie pomocou základného príkladu a príkladu, ktorými však nie je nijako obmedzený.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1 - základný príklad
Získanie slezinných stromálnych buniek a ich charakteristika
1. Získanie slezinných stromálnych buniek
Línia slezinných stromálnych buniek sa pripravila z prvotnej kultúry slezinných buniek myši C57BL/6J, ktorej bolo podávané 100 gg. kg-1 rG-CSF počas 5 dní.
Po ukončení podávania rG-CSF sa slezina v sterilných podmienkach vyňala. Bunky sleziny sa kultivovali v 25 ml plastikových fľašiach (Corning Co.) počas 6 týždňov v Isocoveho modifikácii Dulbeccovho prostredia (IMDM) (Boehring-Mannheim Co.) s 10 % teplom inaktivovavného fetálneho bovinného séra (FBS) (Sanko Junyaku, Tokyo), 100 jednotkami. ml’1 penicilínu a 100 gg . mľl streptomycínu. Kultivácia prebiehala pri 37 °C v inkubátore s 5 % oxidu uhličitého. Prostredie sa menilo za čerstvé prostredie vždy dvakrát za týždeň.
V tekutej kultúre sa vypestovali a z kultivačnej nádoby sa získali príslušné bunkové populácie (stromálne bunky). Pomocou 0,05 %-ného trypsínu a 0,02 %-nej EDTA (Sigma Chemical Co.) v bez Ca- a bez Mg-PBS sa bunkové populácie preniesli do nových fliaš. Tieto prenášania sa opakovali približne raz alebo dva razy za týždeň. Pri počiatočných prenášaniach (od prvého po desiate prenesenie) bol pomer riedenia buniek 1/4 až 1/8, potom bol tento pomer 1/16 až 1/32. Približne po desiatom prenesení boli stromálne bunky homogénne a fibroplastoidné.
Pri dvadsiatom prenesení sa stromálne bunky získali rovnakým spôsobom, ako je opísaný, a preniesli sa na klonovanie s využitím techniky obmedzeného riedenia. Klonovanie buniek sa dva razy opakovalo, čim sa získala stromálna bunková línia (CF-1 bunková línia).
Potom sa tieto bunky udržiavali v IMDM prostredí v 25 ml bankách (Corning Co.) a vždy po piatich dňoch sa podrobili subkultivácii pri riedení buniek 1/32. Línie slezinových stromálnych buniek sa môžu získať aj z iných živočíchov ako je myš. Napríklad sa môžu získať ľudské slezinné stromálne bunky rovnakým spôsobom, aký sa opísal, transformáciou buniek pomocou SV-40 adenovírusového vektora [J. Celí. Physiol., 148, 245 (1991)].
2. Charakteristika buniek CF-1
CF-1 bunky sa pripravili ako bunková línia uvedeným spôsobom a skúšali sa na alkalickú fosfatázu, kyslú fosfatázu, β-glukouronidázu, α-naftylacetátovú esterázu a olejovú červenú O bežnými spôsobmi cytochemickej techniky. Bunky CF-1 sa tiež charakterizovali pomocou imunoenzymatickej histochémie použitím nasledujúcich monoklonálnych a polyklonálnych protilátok: macl (Šero Tec.); antigén príbuzný faktoru VIII (Dakopatts); typ I kolagénu, typ III kolagénu a fíbrinonektín (Chemicon Intemational Inc.). Fagocyty sa skúšali absorpciou latexových perličiek (priemer častíc 1,09 gm; Sigma), a schopnosť premeny CF-1 buniek na adipocyty po kultivácii v tekutom prostredí sa skúšala štvortýždňovým vystavením buniek účinku 106 mol. dm'3 fosfátu hydrokortizónu (Sigma) v 25 ml bankách.
Podľa výsledkov boli bunky CF-1 negatívne na alkalickú fosfatázu, na antigén príbuzný faktoru VIII, macl a na fagocytózu, pričom boli pozitívne na kolagén typu I, kolagén typu III a fíbrinonektín. Bunky CF-1 sa v priebehu štyroch týždňov kultivácie v tekutom prostredí za prítomnosti 10‘6 mol . dm'3 hydrokortizónu nepremenili na adipocyty, hoci CF-1 bunky mali len stopy tukov. Z uvedených údajov je zrejmé, že uvedené CF-1 bunky nemajú vlastnosti preadipocytov, makrofágov alebo endoteliálnych buniek a z toho vyplýva, že sú odvodené od stromálnych buniek, ktoré sa od uvedených odlišujú.
3. Podpora krvotvomých kmeňových buniek bunkami CF-1
Aby sa zistilo, či sú alebo nie sú krvotvomé kmeňové bunky podporované bunkami CF-1, vykonali sa CFU-S skúšky (skúšky slezinových buniek na tvorbu kolónií) spôsobom podľa Tilla a McCullocha. Skupiny vždy desiatich myší sa ožiarili 900 cGy (MBR-1520R; Hitachi, Tokyo) a myši sa intravenózne injektovali s mononukleámymi bunkami kostnej drene (BM bunky) (1,0 . 105/hlavu, 5.0. 104/hlavu, alebo s 2,5 . 104/hlavu) a bunkami CF-1 (1,0 . 105/hlavu) a na dvanásty deň sa v slezine počítali CFU-S kolónie (slezinové kolónie).
Výsledkom bolo, že keď sa mononukleáme bunky kostnej drene (BM bunky) a CF-1 bunky transplantovali ožiareným myšiam, významne sa zvýšil počet slezinových kolónií v každej skupine s BM bunkami ( medzi 1,4- až 1,8-krát) v porovnaní s myšami bez transplantovaných CF-1 buniek. V dvanásty deň po transplantácii pomer prežitých myší s BM bunkami a s CF-1 bunkami bol vyšší ako uvedený pomer u myší len s BM bunkami, čo poukazuje na nižšiu úmrtnosť. Preto je zrejmé, že krvotvomé kmeňové bunky sú podporované bunkami CF-1.
Príklad 2 - najlepší spôsob uskutočnenia
Získanie monoklonálných protilátok
1. Antigény a imunizácia
Na imunizáciu sa ako antigény použili bunky CF-1 získané v uvedenom základnom príklade. Bunky sa subkultivovali v inkubátore v podmienkach: 5 % oxidu uhličitého pri 37 °C s použitím kultivačného Isocoveom modifikovaného Dulbeccovho prostredia (IMDM) (Boehring-Mann4
SK 281964 Β6 heim Co.), doplneného 10 %-ami fetálneho bovinného séra (FBS; Sanko Junyaku).
Na bunky sa pôsobilo 1 mM EDTA/PBS a bunky sa vybrali z kultivačnej nádoby pomocou pipety. Bunky sa suspendovali do 1 mM roztoku EDTA/PBS na koncentráciu 1 . 107 buniek v 1 ml a podávali sa krysám Wistar Imamich (7 týždňov staré, samičky; od Animal Breeding Research Laboratory). Na počiatočnú imunizáciu sa injektoval jeden mililiter suspenzie buniek s koncentráciou 10' buniek v 1 ml do abdominálnej dutiny krysy a potom po jednom mesiaci sa injekcia opakovala s rovnakou dávkou. Potom sa injekcia opakovala s rovnako koncentrovanou suspenziou ešte niekoľkokrát v jednomesačných intervaloch. Potom, ako sa zistila reaktivita medzi imunizovanou protilátkou krysy a CF-1 bunkami, sa na konečnú imunizáciu podal 1 ml suspenzie buniek s koncentráciou 1 . 108 v 1 mililitri. Tri dni po konečnej imunizácii sa krysy utratili a vyoperovala sa slezina.
2. Bunková fúzia
Vybratá slezina sa rozomlela, získané slezinné bunky sa odstredili, suspendovali v 1MDM prostredí (Boehringer-Mannheim Co.) a dôkladne sa premyli. Na druhej strane sa bunky získané kultivovanou myelómovou bunkovou líniou myší Sp2/O-Agl4 [Náture, 276, 269 až 270 (1978)] v IMDM prostredí (Boehringer-Mannheim Co.), doplnenom s 10 %-ným fetálnym bovinným sérom (FBS; Sanko Junyaku), premyli uvedeným IMDM prostredím rovnakým spôsobom a odobralo sa z nich 1 . 10® a spolu s 2 . 108 uvedených slezinových buniek sa vložili do nádoby odstredivky, miešali sa, aby nastala bunková fúzia pomocou polyetylénglykolu 4000 (Nakarai Kagaku) podľa zvyčajného postupu [Clin. Exp. Immunol., 42,458 až 462 (1980)].
Získané fúzované bunky sa potom nariedili IMDM prostredím doplneným s 20 % FBS a napipetovali sa do 96jamkovej platne. Kultivovali sa v inkubátore pri teplote 37 °C a pri 5 % oxidu uhličitého. Potom sa postupne prostredie nahradilo selektívnym HAT prostredím a pokračovalo sa v kultivácii.
Potom, ako začala kultivácia, sa supematant nahradil novým HAT prostredím dvakrát za týždeň, aby kultivácia pokračovala a podporila sa proliferácia.
V ďalšom postupe sa získané fúzované bunky klonovali bežným spôsobom s použitím postupu obmedzeného riedenia. Podrobnejšie, zvyčajným postupom sa klonovali len tie klony, ktoré mali vysokú väzbovú schopnosť k antigénom, čo sa skúšalo bežným spôsobom zrieďovacej analýzy s použitím protilátok v supematantoch uvedených fúzovaných buniek.
3. Výber
Výber fúzovaných buniek (hybridómov) sa vykonal nepriamou fluorescenčnou protilátkovou technikou s použitím cytometrie.
Výber klonov, produkujúcich predmetné protilátky sa vykonal s použitím CF-1 buniek ako terčových buniek. Podrobnejšie, bunky sa suspendovali v reakčnom pufri (PBS doplnený 2 % FBS a 0,02 % NaN3), odstredili sa a získali sa tak tablety, ktoré sa potom suspendovali v 100 mikrolitroch supematantov kultúry hybridómov (asi 1 . 106 na 100 mikrolitrov) a nechali sa reagovať pri 4 °C počas 1 hodiny. Po premytí uvedeným pufrom sa pridala značená kozia protikrysia IgG (FC) protilátka (Chemicon) a inkubovalo sa 1 hodinu. Po premytí sa vykonali analýzy prietokovou cytometriou (FACScan, Becton Dickinson).
4. Čistenie protilátok
Fúzované bunky, vytriedené spôsobom opísaným v bode 3 sa kultivovali bežným spôsobom a vznikajúce protilátky sa zo supematantov oddelili bežnými spôsobmi a čistili.
Podrobnejšie, z jamiek s vysokým protilátkovým titrom na antigény sa získali hybridómy, rozptýlili sa do tkanivovej kultúry v plastovej miske (Coming Co.), kultivovali sa v podmienkách s 5 % oxidu uhličitého pri 37 °C, proliferovali a čistili sa bežným spôsobom, čím sa získali monoklonálne protilátky GSPST-1 a BMAP-1.
Vo vzťahu k protilátke GSPST-1 získané bunky sa injektovali do abdominálnej dutiny myší BALB/cAJcl-nu (osemtýždňovým samčekom, Nippon Kurea), z ktorých sa získal ascit po 10 až 14 dňoch, vysolil sa 33 %-ným síranom amónnym a dialyzoval s PBS. Vo vzťahu k protilátke BMAP-1, táto sa kultivovala vo veľkom v prostredí Iscoveom upraveného MEM média, doplneného 10 % FBS; supematanty sa skoncentrovali, vysolili sa 33 %-ným síranom amónnym, dialyzovali s PBS, znova čistili pomocou stĺpcovej súpravy proteín A (Amersham), dialyzovali s PBS.
V uvedenom príklade sa opísal prípad, v ktorom sa na imunizáciu ako antigény použili CF-1 bunky; rovnakým spôsobom možno pripraviť monoklonálnu protilátku v prípade, že sa použijú stromálne slezinné bunky vrátane stromálnej bunkovej línie krvotvomého tkaniva odvodeného z ľudských stromálnych buniek. Tento vynález nie je obmedzený na uvedené monoklonálne protilátky, ale zahrnuje všetky monoklonálne protilátky, ktoré majú rovnaké vlastnosti pripravené rovnakým spôsobom a všetky hybridómy produkujúce takéto monoklonálne protilátky.
Hybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku BMAP-1 podľa tohto vynálezu je nová fúzovaná bunka pripravená z rodičovských buniek Wistar Imamich - krysej slezinovej bunky a z myelómovej bunkovej línie SP2/O-Agl4 myší, a bola uložená 9. augusta 1993 pod označením BMAP-1 (krysí-myšací hybridóm) s prístupovým číslom FERM BP-4382 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Japan [adresa: 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305, Japonsko], na medzinárodnom úrade podľa Budapeštianskej dohody o medzinárodnom prieskume uloženia mikroorganizmov na patentové účely.
5. Vlastnosti protilátok
i) (Reaktivita s CF-1 bunkami)
Výsledky skúšok reaktivity získaných monoklonálnych protilátok GSPST-1 a BMAP-1 s CF-1 bunkami imunofluorescenčnou analýzou sú znázornené na obr. 1 až 3. Na obr. 1 sú uvedené výsledky analýzy kontrolnej vzorky v neprítomnosti protilátky. Obr. 2 znázorňuje výsledky analýzy väzbových vlastností GPSPT-1 s CF-1 bunkami a obr. 3 znázorňuje výsledky analýzy väzbových vlastností BMAP-1 s bunkami CF-1. Zvislá os na obrázkoch znázorňuje relatívny počet buniek a vodorovná os intenzitu fluorescencie.
Ako je zrejmé z obr. 1 až 3, ukázalo sa, že monoklonálne protilátky GSPST-1 a BMAP-1 majú väzbové vlastnosti k CF-1 bunkám a rozoznávajú povrchové antigény CF-1 buniek.
Reaktivita k bunkám kostnej drene
Výsledky analýzy reaktivity GPSPT-1 a BMAP-1 s normálnymi bunkami kostnej drene pomocou prietokovej
SK 281964 Β6 cytometrie (FACScan, Becton, Dickinson) sú znázornené na ďalších obr. 4 až 6. Obr. 4 znázorňuje výsledky analýzy kontrolnej vzorky v neprítomnosti protilátky. Obr. 5 znázorňuje výsledky analýzy väzbových vlastností GSPST-1 k bunkám kostnej drene a obr. 6 uvádza výsledky analýzy väzbových vlastností BMAP-1 k bunkám kostnej drene. Na obr. na zvislej osi je opäť vynesený relatívny počet buniek a na vodorovnej osi intenzita fluorescencie.
Ako je zrejmé z obr. 4 až 6, ukázalo sa, že GSPST-1 nemá schopnosť viazať sa na akékoľvek bunky kostnej drene a že BMAP-1 má schopnosť viazať sa na niektoré bunky kostnej drene.
Reaktivita k línii myelocytových leukemických buniek (NSF-60)
Výsledky analýzy reaktivity GSPST-1 a BMAP-1 k bunkám NFS-60 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6687 až 6691 (1985)] pomocou prietokovej cytometrie (FACScan, Becton Dickinson) sú znázornené na obr. 7 až 10. Na obr. 7 sú znázornené výsledky analýzy kontrolnej vzorky za neprítomnosti protilátky. Obr. 8 znázorňuje výsledky analýzy väzbových vlastností GSPST-1 k bunkám NSF-60. Obr. 9 znázorňuje výsledky analýzy kontrolnej vzorky pomocou IgGl (Zymed) a obr. 10 znázorňuje výsledky analýzy väzbových vlastností BMAP-1 k bunkám NFS-60. Na zvislú os na obrázkoch sú vynášané relatívne počty buniek a na vodorovnú os intenzita fluorescencie.
Ako je zrejmé z obr. 7 až 10, zistilo sa, že GSPST-1 nereaguje s bunkami NFS-60 a BMAP má väzbovú schopnosť k bunkám NFS-60. (Skúška BMAP-1 na inhibíciu proliferácie buniek NFS-60.)
Výsledky skúšok účinku BMAP-1 na bunky NFS-60 za prítomnosti G-CSF 100 ng . mľ1 a cyklohexaimidu 10’9 M spôsobom MTT sú znázornené na obr. 11. Pri skúške sa použili kultivačné platne s 96 jamkami, do každej jamky sa pridal 1 μΐ roztoku BMAP-1 s koncentráciami 0, 10, 100 ng . ml'1 a 1, 10, 100 μg . ml'1 k 100 μΐ 4 . 103 buniek NFS-60 na jednu jamku. Počet živých buniek sa meral po dvoch dňoch MTT spôsobom. Zistilo sa, že BMAP-1 významne potláča proliferáciu buniek NFS-60, čo je ilustrované obr. 11.
ii) Zatriedenie protilátok
Výsledkom zatriedenia (s použitím krysej Mono AbID-Sp súpravy (Zymed)) získaných monoklonálnych protilátok a biotínom značenej protikrysej IgGl myšej protilátky (Zymed) v podskupine IgG je pravdepodobnosť, že GSPST-1 je IgG2a a že BMAP-1 je IgGl.
iii) Schopnosť inhibovať transplantáciu kostnej drene
Na posúdenie vlastností uvedených protilátok sa vykonali pokusy inhibovať týmito protilátkami transplantáciu kostnej drene. Výsledky pokusov sú znázornené na obr. 12 a 13. Ako je zrejmé z obr. 12 a z obr. 13, BMAP-1 má inhibičný vplyv na transplantáciu kostnej drene, ale tento vplyv sa nezaznamenal u GSPST-1. Podrobnejšie, uvedené výsledky sa získali podaním 1,0 . 105/hlavu buniek kostnej drene a monoklonálnej protilátky do chvostovej žily myšiam C57BL/6J ožiareným smrteľnými dávkami (900 cGy) a sledovaním tvorby slezinných kolónií. „Neliečené“ („Non-treated“) na obr. 13 znázorňuje prípady, keď sa nepodali nijaké bunky kostnej drene.
Ako je zrejmé z obr. 13, pretože BMAP-1 reaguje s bunkami kostnej drene a spôsobuje apoptózu, tak monoklo nálna protilátka pri skúške na transplantáciu kostnej drene celkom inhibuje transplantáciu. Podrobnejšie, ak sa do abdominálnej dutiny myši podal hybridóm produkujúci BMAP-1, myš uhynula v čase, keď sa v malom množstve nahromadil jej ascit Zistilo sa ďalej, že všetky bunky kostnej drene vyhynuli v zhode s intravenóznym podaním 50 pg/hlavu BMAP-1 hormálnym myšiam C57BL/6J a na obr. 14 je mikrofotografiami znázornená skutočnosť, že bunky kostnej drene vyhynuli na 6. deň po intravenóznom podaní BMAP-1. Z mikrofotografií je zrejmé, že vyhynuli nielen lymfoidné bunky, ale aj neutrofily, megakaiyoty, myeloblasty, myelocyty, žírne bunky (masty), makrofágy, monocyty a erytroblasty (tzv. myeloidné bunky). Výsledkom výskumu DNA buniek kostnej drene myši, ktorej sa podávalo 30 μ BMAP-1 na hlavu, sa navyše pozoroval tzv. vznik rebríka, čo je znázornené na obr. 15. Zistilo sa, že uvedená reakcia BMAP-1 s bunkami kostnej drene je dôsledkom apoptózy.
Oblasť Fc v IgG protilátky BMAP-1 sa odbúrala pepsínom (Sigma) a čistila sa pomocou GPC chromatografie ako F(ab°)2. Myšiam sa intravenózne podávalo 33,5 pg/hlavu produktu (čo zodpovedalo 50 pg/hlavu celkovej IgG); výsledkom tohto pozorovania bolo, že bunky kostnej drene v tejto kostnej dreni vyhynuli. Podľa tejto skutočnosti je zrejmé, že sa na vyhynutí buniek kostnej drene účinkom BMAP-1 nezúčastňuje ani protilátkovo závislá cytotoxicita, ani komplementárne závislá cytotoxicita.
Ako antigén spôsobujúci apoptózu sa uvádza Fas antigén proteínu bunkového povrchu; vo vzťahu k antigénu Fas sa zistila expresia jeho mRNA v týmuse, srdci, pečeni, pľúcach a vaječníku, ale málo jeho mRNA sa našlo v kostnej dreni [J. Immunol., 148, 1274 až 1279 (1992)], a preto je zrejmé, že antigény rozoznávané BMAP-1 sa odlišujú od bežne známeho anigénu Fas.
Aby sa ďalej vyjasnilo, či antigén rozoznávaný BMAP-1 môže alebo nemôže byť TNP receptor, skúmal sa účinok antigénu MBAP-1 použitím buniek L-929, ktoré reagujú s TNF a tým spôsobujú hynutie buniek. Výsledné koncentrácie myšacieho TNF a (Genzyme) boli 0, 1, 10, 100 pg. ml'1,1,10,100 ng . mľ1 a 1 pg. mľ1 a kocentrácie BMAP-1 boli 0, 10, 100 pg . mľ1, 1, 10, 100 ng . mľ1 a 1,10 pg. mľ1. Určoval sa počet živých buniek L-929 MTT spôsobom na druhý deň po pridaní TNF a a BMAP-1. Výsledky sú znázornené na obr. 16 a 17 a vyplýva z nich, že počet buniek L-929 sa významne znížil účinkom TNF a, kým BMAP-1 nemal na bunky L-929 nijaký vplyv. Je teda zrejmé, že antigén rozoznávaný BMAP-1 nie je TNF receptor.
Výsledky skúmania pomocou prietokovej cytometrie (FACScan, Becton Dickinson), či antigény rozoznávané BMAP-1 môžu alebo nemôžu byť MHC antigény triedy I, sú znázornené na obr. 18 až 21. Obr. 18 znázorňuje výsledky analýzy kontrolnej vzorky s použitím krysej IgGl (Zymed), obr. 19 znázorňuje výsledky analýzy väzbových schopností uvedenej protimyšacej MHC protilátky triedy I (krysia IgG2a, BMA) proti BWV1 bunkám (myšacie lymfómy odvodené od buniek BW147), obr. 20 znázorňuje výsledky analýzy kontrolnej vzorky s použitím krysej IgGl (Zymed) a obr. 21 znázorňuje výsledky analýzy väzbových vlastností BMAP-1 k bunkám BWV1. Na obrázkoch sa na zvislej osi uvádza relatívny počet buniek a na vodorovnej osi intenzita fluorescencie. Záverom analýzy je, že BMAP-1 nerozoznáva bunky BWV1, kým protilátka MHC triedy I s bunkami BWV1 reaguje.
Ako je z uvedeného opisu zrejmé, experimentálne sa potvrdilo, že BMAP-1 spôsobuje apoptózu myeloidných buniek; podľa vedomostí autorov tohto vynálezu nebola doteraz opísaná nijaká monoklonálna protilátka, ktorá má schopnosť spôsobovať apoptózu myeloidných buniek tak, ako sa opisuje v tomto vynáleze, a preto monoklonálna protilátka, ktorá má uvedené vlastnosti, je novou protilátkou, nájdenou autormi tohto vynálezu. Pretože sa uznáva, že monoklonálne látky podľa tohto vynálezu reprezentované protilátkou BMAP-1 môžu spôsobiť smrť myelocytových leukemických buniek predpokladateľne vysokou expresiou jej antigénov využitím mechanizmu apoptózy monoklonálnej protilátky na bunky kostnej drene, majú monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu schopnosť spôsobiť apoptózu myeloidných buniek a sú vhodné ako liečivo pri myelocytovej leukémii.
Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sú opísané pomocou špecifického príkladu; keďže sa monoklonálne protilátky, ktoré majú schopnosť vyvolať apoptózu myeloidných buniek, podľa tohto vynálezu môžu predstaviť monoklonälnou protilátkou, uvedenou v uvedenom príklade, ale týmto príkladom nie sú uvedené monoklonálne protilátky obmedzené, vynález zahrnuje všetky monoklonálne protilátky, ktoré majú rovnaké vlastnosti a účinok, pripravené rovnakým spôsobom, bez ohľadu na druh antigénov.
Priemyselná využiteľnosť vynálezu
Pretože monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sú užitočné ako protilátky rozoznávajúce a identifikujúce antigény, ktoré špecificky spôsobujú apoptózu myeloidných buniek a majú schopnosť spôsobiť apoptózu myeloidných buniek, môžu sa použiť ako liečivo použiteľné v oblasti liekov myelocytovej leukémie na základe využitia ich vlastností.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (3)
1. Monoklonálna protilátka schopná vyvolať apoptózu myeloidných buniek väzbou na antigény myeloidných buniek.
2. Fragmenty monoklonálnej protilátky, ktoré majú schopnosť spôsobiť apoptózu myeloidných buniek väzbou na antigény myeloidných buniek.
3. Hybridom produkujúci monoklonálnu protilátku podľa nároku 1. *
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05242110 | 1993-09-03 | ||
| PCT/JP1994/001453 WO1995006748A1 (fr) | 1993-09-03 | 1994-09-02 | Anticorps monoclonal permettant d'induire une apoptose |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK25596A3 SK25596A3 (en) | 1996-10-02 |
| SK281964B6 true SK281964B6 (sk) | 2001-09-11 |
Family
ID=17084452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK255-96A SK281964B6 (sk) | 1993-09-03 | 1994-09-02 | Monoklonálna protilátka schopná vyvolať apoptózu myeloidných buniek, jej fragmenty a hybridóm |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5840344A (sk) |
| EP (1) | EP0721015B1 (sk) |
| KR (1) | KR100241863B1 (sk) |
| CN (1) | CN1046314C (sk) |
| AT (1) | ATE280835T1 (sk) |
| AU (1) | AU692466B2 (sk) |
| CA (1) | CA2169950A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ294359B6 (sk) |
| DE (1) | DE69434097T2 (sk) |
| FI (1) | FI960567A (sk) |
| HU (1) | HU222989B1 (sk) |
| NO (1) | NO960684D0 (sk) |
| PL (1) | PL181783B1 (sk) |
| RU (1) | RU2202615C2 (sk) |
| SK (1) | SK281964B6 (sk) |
| TW (1) | TW426687B (sk) |
| UA (1) | UA50708C2 (sk) |
| WO (1) | WO1995006748A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA946767B (sk) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5840344A (en) * | 1993-09-03 | 1998-11-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Monoclonal antibodies having property of causing apoptosis |
| AU2232597A (en) * | 1996-03-06 | 1997-09-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of screening apoptosis inducing substances |
| DE69733204T3 (de) | 1996-07-15 | 2012-03-08 | Chugai Seiyaku K.K. | Neuartige vegf-ähnliche faktoren |
| US7531643B2 (en) | 1997-09-11 | 2009-05-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Monoclonal antibody inducing apoptosis |
| CN1198845C (zh) * | 1997-09-11 | 2005-04-27 | 中外制药株式会社 | 诱导编程性细胞死亡的单克隆抗体 |
| US7696325B2 (en) * | 1999-03-10 | 2010-04-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Polypeptide inducing apoptosis |
| WO2000053634A1 (fr) * | 1999-03-10 | 2000-09-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fv monocatenaire induisant l'apoptose |
| US20040058393A1 (en) * | 2000-04-17 | 2004-03-25 | Naoshi Fukishima | Agonist antibodies |
| CN1308448C (zh) | 2000-10-20 | 2007-04-04 | 中外制药株式会社 | 低分子化的tpo激动剂抗体 |
| EP2351838A1 (en) * | 2000-10-20 | 2011-08-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Crosslinking agonistic antibodies |
| US7195771B1 (en) | 2000-11-21 | 2007-03-27 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Water-soluble lotions for paper products |
| WO2003044482A2 (en) * | 2001-11-16 | 2003-05-30 | The University Of Tennessee Research Corporation | Recombinant antibody fusion proteins and methods for detection of apoptotic cells |
| EP1561759B9 (en) | 2002-10-11 | 2009-08-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cell death-inducing agent |
| JP2004279086A (ja) * | 2003-03-13 | 2004-10-07 | Konica Minolta Holdings Inc | 放射線画像変換パネル及び放射線画像変換パネルの製造方法 |
| EP1609803A4 (en) * | 2003-03-31 | 2006-05-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | MODIFIED ANTIBODY AGAINST CD22 AND ITS USE |
| TW200530269A (en) | 2003-12-12 | 2005-09-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Mpl antibodies |
| TW200530266A (en) * | 2003-12-12 | 2005-09-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method of reinforcing antibody activity |
| EP1712565A4 (en) * | 2003-12-12 | 2009-03-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | AGENTS INDUCING CELL DEATH |
| WO2005056602A1 (ja) * | 2003-12-12 | 2005-06-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法 |
| US9493569B2 (en) * | 2005-03-31 | 2016-11-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Structural isomers of sc(Fv)2 |
| WO2006123724A1 (ja) * | 2005-05-18 | 2006-11-23 | The University Of Tokushima | 抗hla抗体を利用した新規医薬品 |
| KR101360671B1 (ko) | 2005-06-10 | 2014-02-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | ｓｃ（Ｆｖ）２를 함유하는 의약조성물 |
| EP1908482B1 (en) | 2005-06-10 | 2017-09-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof |
| WO2007100892A2 (en) * | 2006-02-28 | 2007-09-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Trojan horse immunotherapy |
| KR20090038896A (ko) * | 2006-07-13 | 2009-04-21 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 세포사 유도제 |
| CL2008000719A1 (es) * | 2007-03-12 | 2008-09-05 | Univ Tokushima Chugai Seiyaku | Agente terapeutico para cancer resistente a agentes quimioterapeuticos que comprende un anticuerpo que reconoce hla de clase i como ingrediente activo; composicion farmaceutica que comprende dicho anticuerpo; y metodo para tratar cancer resistente a |
| CN109072199B (zh) | 2014-12-05 | 2022-10-28 | 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 | 靶向Fc受体样5的嵌合抗原受体及其用途 |
| CN109071654B (zh) | 2015-12-04 | 2022-09-23 | 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 | 靶向Fc受体样5的抗体及使用方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5840344A (en) * | 1993-09-03 | 1998-11-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Monoclonal antibodies having property of causing apoptosis |
| AU2232597A (en) * | 1996-03-06 | 1997-09-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of screening apoptosis inducing substances |
| CN1198845C (zh) * | 1997-09-11 | 2005-04-27 | 中外制药株式会社 | 诱导编程性细胞死亡的单克隆抗体 |
| WO2000053634A1 (fr) * | 1999-03-10 | 2000-09-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fv monocatenaire induisant l'apoptose |
-
1994
- 1994-09-02 US US08/605,059 patent/US5840344A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-02 CZ CZ1996617A patent/CZ294359B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 AU AU75466/94A patent/AU692466B2/en not_active Ceased
- 1994-09-02 EP EP94925618A patent/EP0721015B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-02 UA UA96030813A patent/UA50708C2/uk unknown
- 1994-09-02 HU HU9600206A patent/HU222989B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 RU RU96107203/13A patent/RU2202615C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 CN CN94193260A patent/CN1046314C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 AT AT94925618T patent/ATE280835T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 ZA ZA946767A patent/ZA946767B/xx unknown
- 1994-09-02 SK SK255-96A patent/SK281964B6/sk unknown
- 1994-09-02 DE DE69434097T patent/DE69434097T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 KR KR1019960700821A patent/KR100241863B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 PL PL94313260A patent/PL181783B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 WO PCT/JP1994/001453 patent/WO1995006748A1/ja active IP Right Grant
- 1994-09-02 CA CA002169950A patent/CA2169950A1/en not_active Abandoned
- 1994-11-19 TW TW083110887A patent/TW426687B/zh not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-02-07 FI FI960567A patent/FI960567A/fi not_active Application Discontinuation
- 1996-02-21 NO NO960684A patent/NO960684D0/no not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-09-17 US US09/154,498 patent/US6267959B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-12-15 US US09/736,146 patent/US6759043B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-03-03 US US10/376,628 patent/US20030147894A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL313260A1 (en) | 1996-06-24 |
| CN1046314C (zh) | 1999-11-10 |
| EP0721015B1 (en) | 2004-10-27 |
| HU222989B1 (hu) | 2004-01-28 |
| ZA946767B (en) | 1995-04-03 |
| CN1130405A (zh) | 1996-09-04 |
| WO1995006748A1 (fr) | 1995-03-09 |
| EP0721015A1 (en) | 1996-07-10 |
| US20030147894A1 (en) | 2003-08-07 |
| DE69434097T2 (de) | 2006-02-02 |
| CZ294359B6 (cs) | 2004-12-15 |
| FI960567A0 (fi) | 1996-02-07 |
| HU9600206D0 (en) | 1996-03-28 |
| DE69434097D1 (de) | 2004-12-02 |
| FI960567A (fi) | 1996-02-07 |
| SK25596A3 (en) | 1996-10-02 |
| KR100241863B1 (ko) | 2000-03-02 |
| ATE280835T1 (de) | 2004-11-15 |
| UA50708C2 (uk) | 2002-11-15 |
| US5840344A (en) | 1998-11-24 |
| AU7546694A (en) | 1995-03-22 |
| HUT74594A (en) | 1997-01-28 |
| CA2169950A1 (en) | 1995-03-09 |
| CZ61796A3 (en) | 1996-06-12 |
| AU692466B2 (en) | 1998-06-11 |
| NO960684L (no) | 1996-02-21 |
| US6267959B1 (en) | 2001-07-31 |
| US6759043B2 (en) | 2004-07-06 |
| PL181783B1 (pl) | 2001-09-28 |
| NO960684D0 (no) | 1996-02-21 |
| RU2202615C2 (ru) | 2003-04-20 |
| EP0721015A4 (en) | 1999-03-31 |
| US20010001712A1 (en) | 2001-05-24 |
| TW426687B (en) | 2001-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK281964B6 (sk) | Monoklonálna protilátka schopná vyvolať apoptózu myeloidných buniek, jej fragmenty a hybridóm | |
| US6579692B1 (en) | Method of screening apoptosis inducing substances | |
| KR100895749B1 (ko) | Ｎｋｇ２ｄ의 조절 | |
| KR20040106585A (ko) | 아포토시스를 유기하는 모노클로날 항체 | |
| IE50420B1 (en) | Monoclonal antibody to human t cells,method for preparing it,therapeutic composition comprising it and diagnostic method using it | |
| US4818689A (en) | Late differentiation antigen associated with helper T lymphocyte function | |
| JP3725653B2 (ja) | アポトーシスを誘起する物質のスクリーニング方法 | |
| JP3984688B2 (ja) | アポトーシスを誘起するモノクローナル抗体を有効成分とする医薬 | |
| SK281965B6 (sk) | Monoklonálna protilátka inhibujúca zachytávanie krvotvorných kmeňových buniek a hybridóm | |
| JP2741483B2 (ja) | アポトーシスを誘起するモノクローナル抗体 | |
| JPS6363556B2 (sk) | ||
| JPH08208697A (ja) | アポトーシスを誘起するモノクローナル抗体を有効成分とする医薬 | |
| JPH07118299A (ja) | 間質細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体 |