CZ294359B6

CZ294359B6 - Monoklonální protilátka způsobující apoptózu buněk kostní dřeně, její fragment, hybridom ji produkující a farmaceutický prostředek, který ji obsahuje

Info

Publication number: CZ294359B6
Application number: CZ1996617A
Authority: CZ
Inventors: Naoshi Fukushima
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 2004-12-15
Also published as: HU9600206D0; US5840344A; FI960567A; US6267959B1; NO960684D0; FI960567A0; NO960684L; HUT74594A; US6759043B2; SK25596A3; WO1995006748A1; EP0721015B1; ATE280835T1; CZ61796A3; US20030147894A1; KR100241863B1; TW426687B; CN1130405A; PL181783B1; CN1046314C

Abstract

Monoklonální protilátka a její fragment způsobující apoptózu buněk kostní dřeně, rozpoznávající antigen, který je rozpoznávaný monoklonální protilátkou BMAO-1 produkovanou hybridomem FERM BP-4382 nebo jeho lidským homologem. Hybridom produkující tuto monoklonální protilátku a farmaceutický prostředek, který ji obsahuje.ŕ

Description

Monoklonální protilátka způsobující apoptózu buněk kostní dřeně, její fragment, hybridom ji produkující a farmaceutický prostředek, který ji obsahuje

Oblast techniky

Vynález se týká nové monoklonální protilátky způsobující apoptózu myeloidních buněk vázáním na myeloidní buňky, užitečné jako léčivo pro myelocytámí leukémii, jejích framentů ahybridomu, který produkuje tuto monoklonální protilátku.

Jelikož monoklonální protilátky podle vynálezu jsou užitečné jakožto protilátky rozpoznávající a identifikující antigeny způsobující specificky apoptózu myeloidních buněk a mají kromě toho schopnost apoptózy myeloidních buněk, jsou užitečné jako léčivo pro myelocytámí leukémii.

Dosavadní stav techniky

Faktory stimulující kolonie granulocytů, například rekombinantní faktory stimulující kolonie granulocytů (rG-CSF = recombinant granulocyte colony-stimulating factor) jsou především známé jakožto humorální faktory ke stimulaci diferenciace a proliferace buněk granulocytů, a při zkouškách na myších in vivo bylo popsáno, že podávání rG-CSF podporuje krvetvorbu kostní dřeně a kromě toho způsobuje výraznou extramedulámí krvetvorbu ve slezině k proliferaci krvetvorných kmenových buněk a všech krvetvorných prekurzorových buněk ve slezině. Existovala domněnka, že extramedulámí krvetvorný mechanismus ve slezině, kde krvetvorba probíhá v důsledku modifikací slezinového krvetvorného mikroprostředí, nastává vlivem stimulace rGCSF podpora krvetvorného potenciálu.

Proto se zaměřilo úsilí na slezinové stromální buňky při podávaní rG-CSF s nadějí na objasnění krvetvorného potenciálu ve slezině a získání krvetvorné slezinové stromální buněčné linie (CF-1 buněk) ze sleziny myší s podaným rG-CSF se zřetelem na dosažení analýzy zvýšení krvetvorného potenciálu stromálními buňkami s rG-CSF a zkoušení potenciálního vlivu na krvetvorbu za použití krvetvorných stromálních buněk ajako výsledek byly seznány kolonie stimulující aktivity in vitro a podpůrné síly krvetvorných kmenových buněk in vivo (Blood, 80, str. 1914, 1992).

Jakkoliv však byly získány některé slezinové stromální buňky jakožto buněčná linie (CF-1 buňky) a byly přezkoušeny jejich cytologické vlastnosti, nebyla dosud připravena žádná specifická protilátka rozpoznávající jejich povrchové antigeny ajejich vlastnosti jsou dosud jen spoře známy.

Vynález se proto zaměřuje na vývoj specifické protilátky schopné rozpoznat slezinové stromální buňky na základě shora uvedené informace o slezinových stromálních buňkách a studie vedly k přípravě monoklonálních protilátek používajících slezinových stromálních buněčných linií pro imunizaci, ajako výsledek se získaly nové, dosud nepopsané monoklonální protilátky.

S překvapením se zjistilo, že získané monoklonální protilátky způsobují apoptózu myeloidních buněk.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je monoklonální protilátka způsobující apoptózu buněk kostní dřeně, rozpoznávající antigen, který je rozpoznávaný monoklonální protilátkou BMAO-1 produkovanou hybridomem FERM BP-4382 nebo jeho lidským homologem.

-1 CZ 294359 B6

Vynález se také týká fragmentu monoklonální protilátky způsobující apoptózu buněk kostní dřeně.

Vynález se rovněž týká hybridomů produkujícího monoklonální protilátku podle vynálezu a farmaceutického prostředku, který obsahuje monoklonální protilátku podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Monoklonální protilátka podle vynálezu je výrazně užitečná jakožto protilátka rozpoznávající antigeny způsobující apoptózu myeloidních buněk a je schopná je identifikovat a ničit. Apoptóza se označuje také jakožto spontánní destrukce buněk, při které se nukleární chromatinová DNA stravuje na nukleosomové jednotce (tak zvané ladder formation) s úmrtím buněk jako výsledkem. Myeloidní buňky zahrnují buňky jiné než lymfoidní, například neutrofily, megakaryocyty, myeloblasty, myelocyty, mastocyty, makrofágy, monocyty a erythroblasty, přičemž myeloidní buňky podle vynálezu zahrnují tyto shora uvedené buňky. Dosud nebyly známy žádné monoklonální protilátky způsobující apoptózu myeloidních buněk, a proto monoklonální protilátky podle vynálezu zahrnují všechny monoklonální protilátky způsobující apoptózu myeloidních buněk.

Monoklonální protilátka podle vynálezu se v zásadě může připravit tak, jak je níže uvedeno.

Zvláště se monoklonální protilátka podle vynálezu může připravit například použitím slezinových stromálních buněk živočichů, kterým byl podán rG-CSF jakožto antigen, imunizací o sobě známými imunizačními způsoby, fúzí imunizovaných buněk o sobě známým způsobem a klonováním fúzovaných buněk o sobě známým způsobem.

Jakožto způsob přípravy monoklonální protilátky podle vynálezu se příkladně uvádí způsob, při kterém se používá shora uvedených CF-1 buněk, slezinových stromálních buněk živočichů, kterým byl podán rG-CSF, získaných jako kultura buněčné linie podle vynálezu, jakožto antigen (Blood, 80, str. 1914, 1992), fúzují se plazmové buňky (imunocyty) savců, imunizovaných antigenem, s myelomovými buňkami savců například myší, klonují se získané fúzované buňky (hybridomy), selektují se klony produkující protilátku podle vynálezu rozpoznávající shora uvedenou buněčnou linii mezi nimi a kultivují se k získání protilátky podle vynálezu. Toto je však toliko příkladný způsob, a v tomto případě například nejen shora uvedené CF-1 buňky, ale také jiné stromální buňky krvetvorné tkáně získané podle případu CF-1 buněk nebo stromální buňky krvetvorné tkáně odvozené od lidských slezinových stromálních buněk se mohou vhodně užít pro přípravu protilátek podle vynálezu stejným způsobem, jako v případě CF-1 buněk.

Při způsobu přípravy takových monoklonálních protilátek se savci pro imunizaci shora uvedeným antigenem nijak neomezují; s výhodou se pro selekci bere v úvahu vhodnost buněk myelomu pro použití při fúzi buněk a s výhodou se používá myší, krys a křečků.

Imunizace se provádí o sobě známým způsobem například podáváním slezinových stromálních buněk stejně jako shora uvedených CF-1 buněk do břišní dutiny savců vstřikováním. Zvláště je výhodné podávání ve zředěné formě v PBS, nebo jako suspenze ve vhodném množství PBS nebo v izotonickém roztoku chloridu sodného, živočichům několikrát každý měsíc. Je výhodné používat slezinových buněk odstraněných po konečném podání shora uvedených buněk jako imunocytů.

Jako myelomové buňky savce nabo jiné mateřské buňky fúzované se shora uvedenými imunocyty se mohou s výhodou používat různé buňky ze souboru zahrnujícího P3(P3X63Ag8, 653 (J. Immunol., 123, str. 1548, 1978), p3-Ul (Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81, str. 1 až 7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol., 6, str. 511 až 519, 1976), MPC-11 (Cell, 8, str. 405 až 415, 1976), Sp2/O-Agl4 (Nátuře, 276, str. 269 až 270, 1978), FO (J. Immunol. Met., 35,

-2CZ 294359 B6 str. 1 až 21, 1980), S194 (J. Exp. Med., 148, str. 313 až 323, 1978) a R210 (Nátuře, 277, str. 131 až 133, 1979).

Buněčná fůze shora uvedeného imunocytu a myelomové buňky se může provádět v zásadě o sobě známým způsobem, například způsobem, který popsali Milstein a kol. (Methods Enzymol., 73, str. 3 až 46, 1981).

Zvláště se taková fúze může provádět například v obvyklém živném prostředí v přítomnosti činidla urychlujícího fúzi. Jakožto činidla urychlujícího fúzi se může používat polyethylenglykolu (PEG) a viru Sendai (HVJ) a mohou se vhodně přidávat pomocná činidla, jako dimethylsulfoxid, pokud se jev fúze má podpořit. S výhodou se používá 1 až 10 krát více imunocytů než buněk myelomu. Jakožto příklady živného prostředí pro takovou fúzi buněk se uvádí prostředí RPMI1640 a prostředí MEM vhodné pro proliferaci shora uvedených buněk myelomu a další prostředí běžně používaná pro kultivaci tohoto druhu buněk, a kromě toho se současně může použít doplňkové sérum například fetální hovězí sérun (FBS).

Fúze buněk se provádí smísením předepsaného množství shora uvedených imunocytů a buněk myelomu ve shora uvedeném prostředí, přidáním roztoku PEG, předehřátého na teplotu 37 °C, například PEG o střední molekulové hmotnosti řádu 1000 až 6000 do prostředí zpravidla v koncentraci přibližně 30 až 60 % (hmotnost/objem) a promícháním. Následně opakováním operace přidání vhodných prostředí, jednoho po druhém, odstředěním reakční směsi a odstraněním supernatantů se mohou vytvořit předmětné hybridomy.

Tyto hybridomy se selektují kultivací v běžném selektivním prostředí, například prostředí HAT (prostředí doplněné hypoxanthinem, aminopterinem a thymidinem). Kultivace v prostředí HAT pokračuje po dostatečnou dobu pro buňky jiné než předmětného hybridomu (nefúzované buňky) k jejich zániku, zpravidla po dobu několika dní nebo týdnů. Následně se provede skríning a monoklonování hybridomů produkujících předmětné protilátky běžným limitujícím způsobem ředění.

Vytvořené hybridomy, produkující monoklonální protilátky podle vynálezu, se mohou subkultivovat v běžném prostředí a ukládat v kapalném dusíku po dlouhou dobu.

Za účelem shromáždění monoklonálních protilátek podle vynálezu z hybridomů se může použít způsobu zahrnujícího kultivaci hybridomů o sobě známým způsobem a získat je ze supematantů, nebo způsobu podávání hybridomů vhodnému savci za účelem proliferace a jejich získání z ascitu. První způsob je vhodný pro získání protilátek o vysoké čistotě, druhý způsob je vhodný z hlediska množství produkovaní protilátky.

Protilátky, získané uvedeným způsobem, se mohou čistit na vysoký stupeň za použití o sobě známých způsobů čištění, například způsobu vysolování, gelové filtrace a afmitní chromatografie.

Monoklonální látkou podle vynálezu může být jakákoliv monoklonální látka, která má specifické vlastnosti popsané v uvedeném příkladu, která zvláště způsobuje apoptózu myeloidních buněk a má vlastnosti podle vynálezu bez ohledu na druh antigenu. Monoklonální látka podle vynálezu se může používat jako léčivo pro myelocytámí leukémii.

Samozřejmě, specifický systém pro identifikaci a rozpoznání antigenů způsobujících apoptózu myeloidních buněk za použití monoklonální látky podle vynálezu, nebo její použití jako léčiva pro myelocytámí leukémii s využitím jejích specifických vlastností, a její modifikace a aplikace jsou pro odborníky v oboru při použití v praxi zřejmé, a jsou v rozsahu vynálezu zahrnuty.

-3 CZ 294359 B6

Vynález blíže objasňují bez záměru na jakémkoliv omezení srovnávací příklad a příklad a připojené obrázky.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je analýza (kontrola v nepřítomnosti protilátky, buněk CF-1) imunofluorescencí.

Na obr. 2 je analýza charakteristik vázání GSPST-1 protilátky na buňky CF-1 podle imunofluorescence.

Na obr. 3 je analýza charakteristik vázání BMAP-1 protilátky na buňky CF-1 podle imunofluorescence.

Na obr. 4 je analýza (kontrola prostá protilátky, buňky kostní dřeně) imunofluorescencí.

Na obr. 5 je analýza charakteristik vázání GSPST-1 protilátky na buňky kostní dřeně podle imunofluorescence.

Na obr. 6 je analýza charakteristik vázání BMAP-1 protilátky na buňky kostní dřeně podle imunofluorescence.

Na obr. 7 je analýza (kontrola prostá protilátky, NFS-60) imunofluorescencí.

Na obr. 8 je analýza charakteristik vázání GSPST-1 protilátky na buňky NFS-60 podle imunofluorescence.

Na obr. 9 je analýza (kontrola podle krysí IgGl, NFS-60) imunofluorescencí.

Na obr. 10 je analýza charakteristik vázání BMAP-1 protilátky na buňky NFS-60 podle imunofluorescence.

Na obr. 11 je zkouška inhibice proliferace buněk NFS-60 monoklonální protilátkou (BMAP-1). Na ose x je koncentrace monoklonální protilátky (BMAP-1), na ose y relativní počet buněk.

Na obr. 12 je zkouška inhibice transplantace kostní dřeně monoklonální protilátkou (GSPTS-1). Na ose x je monoklonální protilátka na ose y počet slezinných kolonií (12 dní).

Na obr. 13 je zkouška inhibice transplantace kostní dřeně monoklonální protilátkou (BMAP-1). Na ose x je monoklonální protilátka na ose y počet slezinných koloni (8 dní).

Na obr. 14 je vysvětlující mikrofotografíe (zabarveno H.E.) vzorku kostní dřeně při 400 násobném zvětšení ukazující mrtvé buňky kostní dřeně (2) šest dní po podání monoklonální protilátky BMAP-1 podle vynálezu a kontrolu (1) v nepřítomnosti protilátky.

Na obr. 15 je vysvětlující mikrofotografíe (podle elektroforetické chromatografie) ukazující jev ladder formation DNA buněk kostní dřeně pozorovaný po podání monoklonální protilátky BMAP-1 podle vynálezu.

Na obr. 16 je zkouška cytotoxicity za použití buněk L929 při TNFa. Na ose x je koncentrace TNF na ose y relativní počet buněk.

-4CZ 294359 B6

Na obr. 17 je zkouška cytotoxicity za použití monoklonální protilátky BMAP-1 podle vynálezu. Na ose x je koncentrace BMAP-1 na ose y relativní počet buněk.

Na obr. 18 je analýza (kontrola podle krysí IgG2a, BWV1) imunofluorescencí.

Na obr. 19 je analýza charakteristik vázání antimyší MHC třídy I protilátky na buňky BWV1 podle imunofluorescence.

Na obr. 20 je analýza (kontrola podle krysí IgGl, BWV1) imunofluorescencí.

Na obr. 21 je analýza charakteristik vázání BMAP-1 protilátky na buňky BWV1 podle imunofluorescence.

Jednotlivé používané symboly mají tento význam:

a: DNA thymu myši s podáním BMAP-1 (24 hodin) b: DNA kostní dřeně myši s podáním BMAP-1 (24 hodin) c: DNA kostní dřeně myši s podáním BMAP-1 (8 hodin) d: DNA kostní dřeně myši s podáním BMAP-1 (4 hodiny) e: DNA kostní dřeně neošetřené myši (buňky kostní dřeně) f: indikátor molekulové hmotnosti

Příklady provedení vynálezu

Příklad srovnávací

Příprava slezinných stromálních buněk a jejich charakteristiky

1) Příprava slezinných stromálních buněk

Slezinná stromální buněčná linie se ustavuje z primární kultury slezinných buněk myší C57BL/6J, kterým se podával rG-CSF v dávce 100 pg/kg po dobu pěti dní.

Slezina se odstraní po podání rG-CSF za podmínek prostých choroboplodných zárodků, kultivuje se v plastové baňce (Corning Co.) 25 cm² po dobu šesti týdnů a v prostředí Isocové modifikovaného Dulbecco (IMDM) (Boehringer-Mannheim Co.) s 10% teplem inaktivovaného hovězího fetálního séra (FBS) (Sanko Junyaku, Tokyo), 100 J/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu v inkubátoru za teploty 37 °C a v přítomnosti 5 % oxidu uhličitého a prostředí se vyměňuje za čerstvé růstové prostředí dvakrát týdně.

V konfluentní kultuře se shromáždí přilnuté populace buněk (stromální buňky) z baňky za použití 0,05 % trypsinu plus 0,02 % EDTA (Sigma Chemical Co.) v PBS prostém vápníku a hořčíku a převedou se do nových baněk. Tyto pasáže se opakují přibližně jednou nebo dvakrát týdně. V každé pasáži (v první až desáté pasáži) je poměr štěpení buněk 1/4 až 1/8 a následně je tento poměr 1/16 až 1/32. Stromální buňky se stanou homogenními a fibroblastoidními po přibližně deseti pasážích.

-5 CZ 294359 B6

Při dvacáté pasáži se stromální buňky shromáždí shora popsaným způsobem a převedou se do klonování buněk použitím limitujícího způsobu ředění. Klonování buněk se opakuje dvakrát k získání stromální buněčné linie (linie buněk CF-1).

Následně se tyto buňky udržují v 5 ml IMDM doplněném 10 % tepelně inaktivovaného hovězího fetačního séra (FBS) v baňce (Coming Co.) 25 cm² a subkultivují se každých 5 dní za poměru štěpení 1/32. Linie slezinných stromálních buněk se může připravit z jiných živočichů než z myší. Například se může připravit linie slezinových stromálních buněk lidských stejným způsobem jako shora popsáno transformováním buněk SV-40 adenovirovým vektorem (J. Cell. Physiol., 148, str. 245, 1991).

2) Charakteristiky CF-1 buněk

Buňky CF-1, získané jako buněčná linie shora popsaným způsobem, se zkoušejí na alkalickou fosfatázu, kyselou fosfatázu, β-glukuronidázu, α-naftylacetátesterázu a olejovou červeň O o sobě známými cytochemickými způsoby. Buňky CF-1 se také charakterizují imunoenzymatickou histochemií za použití následujících monoklonálních a polyklonálních protilátek: mači (Šero Tec.); antigen příbuzný faktoru VIII (Dakopatts); a kolagen typu I, kolagen typu III a fibronektin (Chemicon Intemational lne.). Fagocytosa se zkouší latexovými jímajícími kuličkami (průměr částic 1,09 pm, Sigma) a síla CF-1 buněk převádět se na adipocyty se zkouší vystavením ΚΓ⁶ mol/1 hydrokortisonfosfátu (Sigma) v 25 cm² baňce po 4 týdny po kunfluenci kultury.

Zjištěno, že CF-1 buňky jsou negativní na alkalickou fosfatázu, na antigen odvozený od faktoru VIII, na mac I a na fagocytózu a jsou pozitivní na kolagen typ I, kolagen typ III a fibronektin. Buňky CF-1 se nepřevádějí na adipocyty v průběhu čtyř týdnů v kunfluentní kultuře s 10^-6 mol/1 hydrokortisonu, jakkoliv buňky CF-1 vykazují pouze stopy lipidu. Proto buňky CF-1 nemají charakteristiky preadipocytů, makrofágů a endotheliálních buněk, a proto je zřejmé, že jsou odvozeny od stromálních buněk od nich odlišných.

3) Udržování krvetvorných kmenových buněk buňkami CF-1

K vyzkoušení zdali jsou nebo nejsou udržovány krvetvorné kmenové buňky buňkami CF-1 se provádí zkouška CFU-S (Spleen colonies-forming cells = zkouška slezinových buněk vytvářejících kolonie) způsobem, který popsal Till a McCulloch. Deset myší na skupinu se ozáří 900 cGy (MBR-152OR, Hitachi, Tokyo) a intravenózně se jim vstřikují mononukleámí buňky kostní dřeně (BM buňky) (1,0 x 10⁵/hlava, 5,0 x 10⁴/hlava nebo 2,5 x 10⁴/hlava) a CF-1 buňky (1 x 10⁵/hlava) a počítají se kolonie ve slezině 12. den jakožto CFU-S kolonie (slezinné kolonie).

Jestliže mononukleámí buňky kostní dřeně (BM buňky) a CF-1 buňky se transplantují ozářeným myším, počet slezinných kolonií každé skupiny BM buněk výrazně vzroste (1,4 až 1,8 krát) ve srovnání s myšmi bez transplantovaných CF-1 buněk a dvanáctý den po transplantaci je počet přeživších myší s transplantovanými buňkami BM a CF-1 vyšší než myší pouze s buňkami BM, což dokládá nižší úmrtnost. Proto je zřejmé, že krvetvorné kmenové buňky jsou udržovány buňkami CF-1.

Příklad popisující nejlepší provedení vynálezu

Příprava monoklonálních protilátek

-6CZ 294359 B6

1) Protilátky a imunizace

Imunizace se provádí za použití buněk CF-1 získaných podle srovnávacího příkladu jakožto antigenu. Buňky se subkultivují v inkubátoru v přítomnosti 5 % oxidu uhličitého za teploty 37 °C za použití prostředí Isocove modifikovaného Dulbecco (IMDM) (Boehringer-Mannheim Co.) doplněného 10 % hovězího fetálního séra (FBS) (Sanko Junyaku, Tokyo).

Buňky se zpracovávají lmM EDTA/PBS a pipetováním se vyjmou z kultivační baňky. Buňky se suspendují do lmM EDTA/PBS na počet buněk přibližně 1 x 10⁷/ml a podají se kryse Wistar Imamich (7 týdnů staré samičce, Animal Breeding Research Laboratory). Jeden ml buněk s přibližně 1 x 10⁷/ml se vstřikuje do břišní dutiny krysy při počáteční imunizaci a 1 ml buněk s přibližně 1 x 10⁷/ml se pak podá přídavně zajeden měsíc. Dále se podává přídavně 1 x 10⁷/ml několikrát v intervalu měsíce a rozeznává se reaktivita mezi protilátkou imunizovaných krys a CF-1 buňkami, 1 ml buněk 1 x 10⁸/ml se podává jako konečná imunizace. Tři dny po konečné imunizaci se krysy usmrtí k odebrání sleziny.

2) Fúze buněk

Po odejmutí krysám se slezina rozkrájí, izolované slezinové buňky se odstředí, suspendují se v prostředí IMDM (Boehringer-Mannheim Co.) a intenzivně se promyjí. Na druhé straně buňky získané kultivací myší linie myelomových buněk Sp2/O-Agl4 (Nátuře, 276, str. 249 až 270, 1978) v prostředí IMDM (Boehringer-Mannheim Co.) doplněném 10 % hovězího fetálního séra (FBS, Sanko Junyaku) se promyjí ve shora uvedeném prostředí IMDM stejným způsobem a 1 x 10⁸ a 2 x 10⁸ shora uvedených slezinných buněk se vnese do odstředivkové zkumavky a mísí se k dosažení fúze buněk s polyethylenglykolem 4000 (Nakarai Kagaku) o sobě známým způsobem (Exp. Immunol., 42, str. 458 až 462, 1980).

Následně se fúzované buňky vnesou na 96 důlkovou destičku s prostředím IMDM doplněným 20 % hovězího fetálního séra a kultivují se v inkubátoru v přítomnosti 5 % oxidu uhličitého a při teplotě 37 °C. Přemístí se do HAT selektivního prostředí postupně od následujícího dne a pokračuje se v kultivaci.

Po začátku kultivace se supematanty přemisťují do nového HAT prostředí dvakrát týdně kpokračování kultivace a k udržování proliferace.

Potom se získané buňky klonují o sobě známým způsobem za použití limitujícího zřeďovacího způsobu. O sobě známým způsobem se klonují pouze klony vykazující silné charakteristiky vázání na antigeny za použití limitující zřeďovací analýzy za zkoušení jejich charakteristik vázání na antigeny za použití protilátek v supematantech shora uvedených fúzovaných buněk.

3) Skríning

Skríning fúzovaných buněk (hybridomů) se provádí nepřímým fluorescenčním proti látkovým způsobem za použití průtokové cytometrie.

Skríning klonů, produkujících protilátky podle vynálezu, se provádí za použití CF-1 buněk, jakožto cílových buněk. Buňky se suspendují v reakčním pufru (PBS doplněné 2 % FBS a 0,02 % nitridu sodného), odstředí se a získané pelety se suspendují ve 100 μΐ supematantů kultury hybridomů (přibližně 1 x 10⁶/l 00 μΐ) a nechávají se reagovat po dobu jedné hodiny. Po promytí jednou shora uvedeným pufrem FITX se přidá značená kozí protikrysí IgG (FC) protilátka (Chemicon) a inkubuje se po dobu jedné hodiny. Opět se promyje a analyzuje se průtokovou cytometrií (FACScan, Becton Dickinson).

-7CZ 294359 B6

4) Čištění protilátek

Fúzované buňky, skrínované způsobem podle odstavce 3), se kultivují o sobě známým způsobem a produkované protilátky v supematantech se oddělí o sobě známým způsobem a čistí se.

Hybridomy se získají z důlků o vysokém titru protilátky kantigenům, rozprostřou se na tkáňových plastových miskách (Coming, Co.), kultivují se v přítomnosti 5% oxidu uhličitého při teplotě 37 °C, proliferují a čistí se o sobě známým způsobem kzískání monoklonálních protilátek GSPST-1 aBMAP-1.

Se zřetelem na GSPST-1 protilátku se získané buňky vstřikují do břišní dutiny BALB/aAJcl-nu holé myši (nudě mouše) (ve věku osmi týdnů, sameček, Nippon Kurea). Po 10 až 14 dnech se od nich získá ascit, vysolí se 33% síranem amonným a dialyzují se s PBS. Protilátka BMAP-1 se kultivuje ve velkém měřítku v prostředí Iscove modifikovaném MEMm doplněném 10 % hovězího fetálního séra (PBS) supematanty se zkoncentrují, vysolí se 33% síranem amonným, dialyzují se s PBS, opět se čistí sadou protein A navázaným na sloupec (Amersham) a dialyzují se sPBS.

V tomto příkladu se popisuje způsob, podle kterého se používá CF-1 buněk jakožto antigenů pro imunizaci. Je však možné ustavit monoklonální protilátku stejným způsobem také v případě použití jiných slezinových stromálních buněk podporujících krvetvorné kmenové buňky a vynález se tedy neomezuje na shora uvedené monoklonální protilátky, nýbrž zahrnuje všechny monoklonální protilátky mající stejné charakteristiky a připravené stejným způsobem a všechny hybridomy produkující takové monoklonální protilátky.

Hybridomem, produkujícím monoklonální protilátku BMAP-1 podle vynálezu, je nová fúzovaná buňka, připravená za použití slezinových buněk krysy Wistar Imamich a linie myších myelomových buněk SP2/O-Agl4 jakožto mateřských buněk, která byla uložena 9. srpna 1993 pod označením BMAP-1 (krysí myší hybridom) pod ukládacím číslem FERM BP-4382 v ústavu National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology v Japonsku (adresa: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305, Japan) podle mezinárodní Budapešťské dohody týkající se uložení mikroorganismů pro účely vynálezu.

5) Vlastnosti protilátek (i) Reaktivita protilátek

Reaktivita k buňkám CF-1

Výsledky zkoušek reaktivity získaných monoklonálních protilátek GSPST-1 aBMAP-1 kbuňkám CF-1 podle imunofluorescenční analýzy jsou na obr. 1 až 3. Na obr. 1 jsou výsledky analýzy kontroly v nepřítomnosti protilátky, na obr. 2 jsou výsledky analýzy schopnosti vázání GSPST-1 na buňky CF-1 a na obr. 3 jsou výsledky analýzy schopnosti vázání BMAP-1 na buňky CF-1. Na svislé oseje vždy relativní počet buněk a na vodorovné oseje fluorescenční intenzita.

Z obr. 1 až 3 je zřejmé, že monoklonální protilátky GSPST-1 a BMAP-1 vykazují schopnosti vázání na buňky CF-1 a rozpoznávají povrchové antigeny buněk CF-1.

Reaktivita k buňkám kostní dřeně

Výsledky zkoušek reaktivity získaných monoklonálních protilátek GSPST-1 aBMAP-1 na normální buňky kostní dřeně podle průtokové cytometrie (FACScan, Becton Dickinson) jsou na obr. 4 až 6. Na obr. 4 jsou výsledky analýzy kontroly v nepřítomnosti protilátky, na obr. 5 jsou

-8 CZ 294359 B6 výsledky analýzy schopnosti vázání GSPST-1 na buňky kostní dřeně a na obr. 6 jsou výsledky analýzy schopnosti vázání BMAP-1 na buňky kostní dřeně. Na svislé oseje vždy relativní počet buněk a na vodorovné oseje fluorescenční intenzita.

Z obr. 4 až 6 je zřejmé, že monoklonální protilátka GSPST-1 nevykazuje vůbec schopnost vázání na buňky kostní dřeně, přičemž BMAP-1 vykazuje schopnost vázání na některé buňky kostní dřeně. (Reaktivita k myelocytové leukemické buněčné linii [NSF-60])

Výsledky zkoušek reaktivity získaných monoklonálních protilátek GSPST-1 a BMAP-1 na buňky NFS-60 (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, str. 6687 až 6691, 1985) podle průtokové cytometrie (FACScan, Becton Dickinson) jsou na obr. 7 až 10. Na obr. 7 jsou výsledky analýzy kontroly v nepřítomnosti protilátky, na obr. 8 jsou výsledky analýzy schopnosti vázání GSPST-1 na buňky NSF-60, na obr. 9 jsou výsledky analýzy kontroly za použití krysí IgGl na značkovač (Zymed) a na obr. 10 jsou výsledky analýzy schopnosti vázání BMAP-1 na buňky NFS-60. Na svislé ose je vždy relativní počet buněk a na vodorovné oseje fluorescenční intenzita.

Z obr. 7 až 10 je zřejmé, že monoklonální protiláta GSPST-1 nereaguje vůbec s buňkami NFS60, přičemž BMAP-1 vykazuje schopnost vázání na buňky NFS-60. (Zkouška pro BMAP-1 k inhibici proliferace NFS-60 buněk)

Výsledky zkoušek působení BMAP-1 na buňky NFS-60 v přítomnosti G-CSF 100 ng/ml a cyklohexylimidu ΙΟ’⁹ M podle zkoušky MTT jsou na obr. 11. Za použití kultivační destičky s96 důlky se přidá 10 μΐ/důlek roztoku BMAP-1 v koncentraci 0, 10, 100 ng/ml a 1, 10, 100 μg/ml do 4 x 10³/důlek/l00 μΐ buněk NFS-60 a za dva dny se zjišťuje počet živých buněk způsobem MTT. Jak je z obr. 11 zřejmé, je proliferace buněk NFS-60 výrazně inhibována BMAP-1.

(ii) Typizace protilátek

Výsledkem typizace podtřídy IgG získaných monoklonálních protilátek (za použití krysy Mono Ab-ID-Sp [Zymed] a biotinem značené myší antikrysí protilátky [Zymed]) je zřejmé, že GSPST1 je IgG2a a BMAP-1 je IgG 1.

(iii) Inhibiční síla transplantace kostní dřeně

Provádí se zkouška inhibice transplantace kostní dřeně za použití protilátek ke zjištění jejich charakteristik. Výsledky jsou na obr. 12 a 13. Z obr. 12 a 13 je zřejmé, že zatímco BMAP-1 inhibuje transplantaci kostní dřeně, nebylo zjištěno toto působení v případě GSPST-1. Tyto výsledky se získaly při podání ocasní žílou 1,0 x 10⁵/hlavu buněk kostní dřeně a monoklonálních protilátek C57BL/6J myši, ozářené smrtící dávkou záření (900 cGy) a počítáním slezinných kolonií. Výrazem neošetřené se na obr. 13 míní případ, kdy nebyly podány buňky kostní dřeně.

Jak je zřejmé z obr. 13, potvrdilo se, že v důsledku reakce BMAP-1 s buňkami kostní dřeně dochází k apoptóze, takže monoklonální protilátka inhibuje kompletně transplantaci v testu po inhibici transplantace kostní dřeně. Jestliže se hybridom, produkující BMAP-1, podá do břišní dutiny holé myši, zemře ve chvíli, kdy se ascit uloží v malém množství. Kromě toho se zjistilo, že všechny buňky kostní dřeně se usmrtí po intravenózním podání 50 pg/hlavu BMAP-1 normální C57BL/6J myši a na obr. 14 je mikrofotografie dokládající, že buňky kostní dřeně 6 dní po intravenózním podání BMAP-1 zahynuly. Z mikrofotografie je zřejmé, že nejen lymfoidní buňky avšak také neutrofily, megakaryocyty, myeloblasty, myelocyty, mastocyty, makrofágy, monocyty a erythroblasty (tak zvané myeloidní buňky) zahynuly. Kromě toho se jako výsledek zkoušky DNA buněk kostní dřeně myši po podání 30 pg/hlavu BMAP-1 pozoruje jasný jev ladder for

-9CZ 294359 B6 mation, jak je zřejmé z obr. 15, přičemž shora uvedená reakce BMAP-1 s buňkami kostní dřeně způsobuje apoptózu.

Fc oblast IgG BMAP-1 protilátky se digeruje s pepsinem (Sigma) a čistí se GPC sloupcem jako F(ab')2 a 33,5 pg/hlava (odpovídá 50 pg/hlava úplného IgG se podává intravenózně - C57BL/6J myši; pozoruje se uhynuti buněk kostní dřeně v kostní dřeni. Na základě shora popsaných poznatků je zřejmé, že ani na protilátce závislá cytotoxicita ani na komplementu závislá buněčná cytotoxicia se nepodílí na uhynutí buněk kostní dřeně vlivem BMAP-1.

Jakožto antigen působící apoptózu je popsán Fas antigen buněčného povrchového proteinu. Se zřetelem na Fas antigen zjišťuje se exprese mRNA v thymu, srdci, játrech, plicích a vaječnících avšak málo mRNA se zjistilo v kostní dřeni (J. Immunol., 148, str. 1274 až 1279, 1992), a proto je zřejmé, že antigeny rozpoznávané BMAP-1 jsou odlišné od běžně známého Fas antigenu.

Kromě toho ke zjištění, zdali antigen rozpoznávaný BMAP-1 je nebo není TNF receptorem, se zkoumá funkce BMAP-1 za použití L-929 buněk reagujících s TNF za způsobení smrti buňky. Konečná koncentrace myší TNF a (Genzyme) je 0, 1, 10, 100 pg/ml, 1, 10, 100 ng/ml a 1 pg/ml a konečná koncentrace BMAP-1 je 0, 1, 10, 100 pg/ml, 1, 10, 100 ng/ml a 1 pg/ml, přičemž se počty živých buněk L-929 měří způsobem MTT druhý den po podání TNF a a BMAP-1. Výsledky jsou uvedeny na obr. 16 a 17, přičemž L-929 buňky se redukují TNF a výrazně a BMAP-1 nemá na buňky L-929 žádného vlivu. Proto je zřejmé, že antigen rozeznávaný BMAP-1 není TNF receptorem.

Výsledky zkoušky, zda-li antigeny rozeznávané BMAP-1 by mohly být MHC třídou I antigenů nebo nikoliv, podle průtokové cytometrie (FACScan, Becton Dickinson) jsou na obr. 18 až 21. Na obr. 18 jsou výsledky analýzy kontroly používající krysí IgGl (Zymed), na obr. 19 jsou výsledky analýzy charakteristik vázání antimyší MHC třídy I protilátky (krysí IgG2a, BMA) k buňkám BWV1 (myší lymphom odvozený od BW5147 buněk), na obr. 20 jsou výsledky analýzy kontroly za použití krysí IgGl (Zymed) a na obr. 21 jsou výsledky analýzy charakteristik vázání BMAP-1 na BWV1 buňky. Na výkresech je na svislé ose relativní počet buněk a na vodorovné ose fluorescenční intenzita. Tak se zjistilo, že BMAP-1 nerozpoznávají BWV1 buňky, avšak protilátka MHC třídy I reaguje s BWV1 buňkami.

Jak shora uvedeno, potvrdilo se experimentálně, že BMAP-1 způsobuje apoptózu myeloidních buněk. Jak shora uvedeno, dosud nebyla popsána žádná monoklonální protilátka způsobující apoptózu myeloidních buněk, a proto monoklonální protilátky, mající takovou funkci, jsou nové. A jelikož je domněnka, že monoklonální protilátky podle vynálezu, představované BMAP-1, mohou způsobovat úmrtí myelocytových leukemických buněk pro vysokou expresi antigenů využitím apoptózy monoklonální protilátky na buňkách kostní dřeně, je monoklonální protilátka podle vynálezu mající schopnost apoptózy myeloidních buněk užitečná jakožto léčivo pro myelocytámí leukémii.

Monoklonální protilátky podle vynálezu jsou popsány specificky na případě shora uvedeného příkladu. Monoklonální protilátky podle vynálezu zahrnují tuto příkladnou protilátku, přičemž však vynález není na ni omezen nýbrž zahrnuje všechny monoklonální protilátky, které mají stejné charakteristiky a stejnou funkci a jsou připraveny stejným způsobem bez zřetele na druh antigenů.

Průmyslová využitelnost

Monoklonální protilátka způsobující apoptózu buněk kostní dřeně pro výrobu farmaceutických prostředků pro léčení myelocytové leukemie.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Monoklonální protilátka, způsobující apoptózu buněk kostní dřeně, rozpoznávající antigen, který je rozpoznávaný monoklonální protilátkou BMAO-1 produkovanou hybridomem FERM BP-4382 nebo jeho lidským homologem.
2. Fragment monoklonální protilátky podle nároku 1 způsobující apoptózu buněk kostní dřeně.
3. Hybridom produkující monoklonální protilátku podle nároku 1.
4. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.