KR100895749B1 - Ｎｋｇ２ｄ의 조절 - Google Patents

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루이스 엘. 래니어
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 자가면역 및/또는 염증성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 NKG2D를 조절함으로써 자가반응성 T 세포 및/또는 NK 세포의 팽창 및 기능을 손상시키기 위한 치료제를 제공한다.
NKG2D 조절, 자가면역 질환, 염증성 질환, 활성화 수용체, 자가반응성, T 세포

Description

ＮＫＧ２Ｄ의 조절 {MODULATION OF NKG2D}
본원은 2005년 3월 7일 출원된 미국 가출원 60/659,678, 2004년 6월 1일 출원된 60/576,242 및 2004년 4월 5일 출원된 60/559,919를 기초로 한 우선권을 주장한다.
본 발명은 부분적으로는 미국 국립 보건원 (NIH)으로부터 승인 CA89189, CA95137, P30 DK26743 및 P60 DK63720 하의 정부 지원에 의해 실행된 것이다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
본 발명은 특히 자가반응성 T 세포의 팽창 및 기능을 손상시킴으로써 염증성 증후군의 치료 및/또는 예방하기 위한 방법 및 조성물 및 이에 관련된 임의의 추가의 발명 특징에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 NK 세포-매개 이식 거부반응을 방지하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
NKG2D는 인간 및 마우스에서 NK 세포 및 특정 종류의 T 세포 상에서 발현되는 활성화 수용체이다. NKG2D는 인간에서 UL16 결합 단백질 (ULBP1), ULBP2, ULBP3, ULBP4, 및 MHC 클래스 I 사슬 관련 분자 (MICA 및 MICB), 및 부 조직적합성 복합체 항원 60 (H60), 레티노산 초기 유도성 전사체 (RAE-1), 마우스에서 뮤린 ULBP-유사 전사체 1 (MULT-1)을 인식한다. NKG2D 동종이량체는 컨센서스 p85 포스파티딜 이노시톨-3-키나제 (PI3-K) 결합 모티프 Tyr-Ile-Asn-Met (YINM, 서열 9로서 제시됨)을 함유하는 어댑터 분자 DAP10에 회합한다. NKG2D 및 DAP10은 그의 생합성 경로에서 초기에 상호작용하고, 이러한 상호작용은 NKG2D를 세포 표면에 수송하기 위해 필요하다.
<발명의 개요>
본 발명은 NKG2D-매개 활성화와 관련된 증후군의 치료 또는 예방 방법 및 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 상기 방법은 NKG2D를 발현하는 백혈구를 증후군의 치료 또는 예방에 적합한 조건 하에 세포의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제와 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 실시태양에서, 접촉은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 약 30％ 이상 감소시키고; 다른 실시태양에서, 감소는 대조군에 비해 약 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 또는 90％ 이상이다.
작용제는 비제한적으로 NKG2D의 DAP10과의 상호작용을 감소시키고(시키거나); 세포의 표면 상에 NKG2D의 양을 감소시키고(시키거나); 표면 NKG2D의 내재화 속도를 증가시키고(시키거나); NKG2D-NKG2D 리간드 복합체를 통한 신호전달을 감소시키고(시키거나); NKG2D-코딩 핵산의 전사 또는 번역을 감소시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 작용제는 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, 또는 ULBP4 중 1종 이상 이 세포-표면 NKG2D의 양을 (치료제의 경우에) 치료상 이점을 제공하기 위해 필요할 정도로 감소시킬 수 없는 조건 (예를 들어 만성 염증성 증후군에서 존재하는 것) 하에 표면 NKG2D 폴리펩티드의 내재화를 향상시킨다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 방법에서 사용된 작용제는 NKG2D에 결합하는 항체 또는 그의 NKG2D-결합 단편을 포함한다. 항체는 모노클로날 항체, 예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.
본 발명의 실시에 있어서, 표적 백혈구는 NKG2D+ CD8+ T 세포, NKG2D+CD4+ T 세포, NKG2D+γδ T 세포; 및 NKG2D+ NK 세포 중 1종 이상일 수 있거나; 표적 세포는 대식세포를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 방법은 포유동물, 예를 들어 인간 환자에서 NKG2D-매개 활성화와 관련된 염증성 증후군을 치료하고(하거나) 예방하는데 사용할 수 있다. 인간 환자는 상기 염증성 증후군에 걸리거나 발병할 실질적인 위험이 있는 것으로 진단될 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명의 방법은 인간 환자에서 진단된 상태의 치료에 관한 것이다.
별개의 측면에서, 본 발명은 또한 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 복강 질환, 염증성 장질환, 예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염, 건선 또는 이식 거부반응의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명이 적용될 수 있는 증후군은 I형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선염, 중증 근육무력증, 길랑 바레 (Guillain-Barre) 증후군, 자가면역 포도막염, 원발성 담즙성 간경변, 자가면역 간염, 자가면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 그레이브스병, 자가 면역 난소염, 자가면역 고환염, 측두동맥염, 항-인지질 증후군, 베게너 육아종증, 베체트 (Behcet) 병, 공피증, 다발성 근염, 피부근육염, 강직척추염, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 포진피부염, 심상성 천포창, 백반증, 건선 관절염, 골관절염, 스테로이드-내성 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 아테롬성 동맥경화증을 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 특정 측면에서, 증후군은 I형 당뇨병이 아니다.
다른 측면에서, 본 발명은 NKG2D 조절자, 예를 들어 항-NKG2D 항체 또는 항체 단편을 포함하는 제약 제제 및 키트를 제공한다. 한 일련의 실시태양에서, 키트는 NKG2D 조절자, 및 백혈구의 NKG2D-매개 활성화와 관련된 증후군의 치료 또는 예방에 적합한 조건 하에 백혈구를 NKG2D 조절자와 접촉시키기 위한 지시서를 포함한다.
본 발명은 또한 NKG2D+ 백혈구를 시험 작용제와 접촉시키고; 백혈구에 의한 NKG2D 발현을 측정하는 것을 포함하는, NKG2D 조절제의 확인 방법을 제공한다. 몇몇 바람직한 실시태양에서, NKG2D 발현을 측정하는 것은 NKG2D 전사, 번역 및 내재화를 측정하는 것 중 하나 이상을 포함한다. 이들 실시태양의 서브세트는 FDA 지침에 따라 시험 작용제를 임상 시험하는 것을 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 NKG2D+ 백혈구를 시험 작용제와 접촉시키고; 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 측정하는 것을 포함하는, NKG2D 조절제의 확인 방법을 제공한다. 몇몇 바람직한 실시태양에서, 리간드-유도 NKG2D 활성화를 측정하는 것은 DAP10 포스포릴화, p85 PI3 키나제 활성, Akt 키나제 활성, IFN-γ의 생산, 및 NKG2D+ 표적 세포의 세포용해를 측정하는 것 중 하나 이상을 포함한다. 이들 실시 태양의 서브세트는 FDA 지침에 따른 시험 작용제의 임상 시험을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 NKG2D 활성화와 관련된 염증성 질환 및/또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방용 치료제 또는 예방제의 확인 방법을 제공한다. 상기 방법은 유망한 작용제 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)를 NKG2D에 특이적으로 결합하고 세포, 적합한 모델, 숙주 또는 환자의 집단에서 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 손상시키는 능력에 대해 스크리닝하는 것을 포함한다 (예를 들어, 상기 항체를 본원에 기재된 실험 전략을 이용하여 분석함으로써). 스크리닝은 또한 또는 별법으로 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 NKG2D의 내재화를 유도하는 능력에 대해 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다.
다른 특정 측면에서, 본 발명은 NKG2D에 특이적이고 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 작용제 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)의 류마티스성 관절염의 치료용 의약품의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
또다른 특정 측면에서, 본 발명은 NKG2D에 특이적이고 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 작용제 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)의 다발성 경화증의 치료용 의약품의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
다른 예시적인 측면에서, 본 발명은 NKG2D에 특이적이고 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 작용제 (예 를 들어, 항체 또는 항체 단편)의 염증성 장질환의 치료용 의약품의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 예시적인 측면은 NKG2D에 특이적이고 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 작용제 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)의 건선의 치료용 의약품의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 NKG2D에 특이적이고 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 작용제 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)의 이식 거부반응의 치료용 의약품의 제조를 위한 용도에서 실현된다.
본 발명은 부분적으로는 CD8+ T 세포, NK 세포, 및 특정 활성화된 CD4+ T 세포 상의 활성화 수용체인 NKG2D의 조절이 자가면역 및 염증성 증후군의 예방 및/또는 치료에 효과적인 수단이라는 놀라운 발견에 기초한다. 한 측면에서, 본 발명자들은 NKG2D의 내재화를 자극하는 작용제 및 방법을 발견하고, 상기 작용제가 NKG2D 활성화와 관련된 증후군을 치료하는데 유용한 작용제임을 확인하였다. 상기 작용제 및 방법은 천연 가용성 NKG2D 리간드가 내재화를 자극할 수 없는 조건 (예를 들어 만성 염증성 증후군에 존재하는 것으로 생각되는 것) 하에서 특히 유용하다. 본 발명은 추가로 상기 염증성 증후군을 치료하기 위해 NKG2D의 기능적 발현을 감 소시키기 위한 임의의 수단을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 그의 활성화를 위해 주로 NKG2D에 의존하는 백혈구의 서브세트에만 영향을 준다.
본 발명은 백혈구의 NKG2D-매개 활성화와 관련된 증후군을 치료하거나 예방하는데 효과적인 방법 및 조성물을 포함한다. 상기 방법은 NKG2D를 발현하는 백혈구를 증후군의 예방 또는 치료에 적합한 조건 하에 세포의 NKG2D-매개 활성화를 감소시키는 작용제와 접촉시킴으로써 수행한다. 접촉은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 작용제 또는 작용제를 포함하는 조성물을 NKG2D 경로(들)에 의해 활성화된 세포를 포함하는 환자 또는 숙주에게 환자 또는 숙주 내의 세포에 작용제 전달을 허용하는 조건 하에 투여하는 것에 의해 수행할 수 있다. NKG2D 활성화는 본 발명에 따라 (i) 세포 표면 상에 기존재하는 NKG2D 분자의 세포 표면을 고갈시키고; (ii) NKG2D와 DAP10의 기능적 상호작용을 저해하거나 NKG2D의 신호전달 기능을 차단하고; (iii) NKG2D의 생산을 전사, 번역, 또는 번역후 수준에서 저해하는 것을 포함하여, NKG2D 분자가 세포 표면에 도달하는 것을 방지하는 것 중 하나 이상에 의해 감소될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 NKG2D-보유 백혈구의 효과기 기능을 촉발시킬 유의한 활성화를 동시에 유발시키지 않으면서 그들의 내재화를 자극함으로써 기존재하는 세포-표면 NKG2D 분자를 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "NKG2D", "NKG2-D", "D12S2489E", "KLRK1" 및 "킬러 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 K, 멤버 1"은 야생형 및 돌연변이체 산물을 포함하여 인간 킬러 세포 활성화 수용체 유전자, cDNA (예를 들어, 호모 사피엔스 (Homo sapiens) - GENBANK 기탁 번호 NM-007360) 및 그의 유전자 산물, 및 그의 포유동물 대응물을 의미한다. 인간 NKG2D 코딩 영역은 서열 3에 제시되고, 인간 NKG2D 단백질 서열은 서열 4에 제시된다. NKG2D의 포유동물 대응물은 마우스 NKG2D (예를 들어 무스 무스쿨루스 (Mus musculus) - GENBANK 기탁 번호 NM-033078), 래트 NKG2D (예를 들어 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus) - GENBANK 기탁 번호 NM-133512), 돼지 NKG2D (예를 들어 수스 스크로파 (Sus scrofa) - GENBANK 기탁 번호 AF285448), 원숭이 NKG2D (예를 들어 마카카 물라타 (Macaca mulatta) - GENBANK 기탁 번호 AJ554302) 및 오랑우탄 NKG2D (예를 들어 폰고 피그마에우스 (Pongo pygmaeus) - GENBANK 기탁 번호 AF470403)를 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 NKG2D 조절제, 예를 들어 NKG2D 길항제 및 부분 길항제를 포함한다.
달리 언급되지 않으면, 본 발명의 방법은 임의의 종류의 NKG2D 활성과 관련된 염증성 질환, 예를 들어 NKG2D 활성과 관련된 임의의 염증성 자가면역 질환의 치료 (예를 들어 그 증상/상태가 존재하는 시기, 상기 상태/증상의 전파, 상기 상태/증상의 심도 등의 측면에서 병의 원인이 되는 것으로 생각되는 상태와 관련되고(되거나) 그 상태의 기초가 되는 증상을 감소시킴) 또는 예방 (예를 들어 발병 가능성 감소, 발병 지연, 발병후 심도의 지연, 발병시의 심도의 감소 등)의 측면에서 실시될 수 있다. 그러나, 상기 상태는 다양한 상태의 치료 방법이 본 발명의 특유한 측면으로 간주될 수 있도록 상당히 변경될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
I. NKG2D 조절제
본원에서 달리 언급되지 않거나 분명하게 제시되지 않으면, 본 발명의 실시에 있어서, NKG2D-매개 세포 활성화를 감소시키는 임의의 작용제를 사용할 수 있다. 상기 작용제의 비제한적인 예는 NKG2D 리간드 또는 그의 NKG2D-결합 단편, 변이체 또는 유도체; 항체, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체 (예를 들어 NKG2D-결합 항체); 세포에서 NKG2D 또는 DAP10 생산을 억제하는 핵산 (또는 그의 변이체 또는 유도체), 또는 소분자; NKG2D-DAP10 복합체의 형성 또는 기능을 저해하는 펩티드 또는 소분자; NKG2D 신호 전달을 변경시키는 소분자, 및 상기 작용제의 임의의 조합물을 포함한다. 예시적인 NKG2D 리간드는 예를 들어 미국 특허 6,653,447; 문헌 [Carayannopoulos et al., J Immunol, 169(8):4079-83, 2002]; [Carayannopoulos et al., Eur J Immunol, 32 (3):597-605, 2002]; [Sutherland et al., J Immunol, 168(2):671-9, 2002]; [Sutherland et al., Immunol Rev, 181:185-92, 2001]; 및 [Cosman et al., Immunity, 14(2):123-33, 2001]에서 볼 수 있다.
본 발명은 외부로부터의 NKG2D-발현 세포와 접촉하고 NKG2D-리간드 보유 세포 또는 재조합 NKG2D 리간드에 추후 노출시에 NKG2D-보유 세포의 활성화를 감소시키는 작용제를 포함한다. DAP10 포스포릴화의 자극, p85 PI3 키나제의 자극, Akt의 활성화, 인터페론-감마 (IFN-γ) 또는 다른 시토킨 또는 케모킨의 NKG2D-의존 생산, NKG2D-리간드 함유 표적 세포의 NKG2D-의존 치사 등을 비제한적으로 포함하는 상기 활성화의 임의의 표시를 모니터링할 수 있다. NKG2D 활성화 수준을 평가 하는 한 수단은 NKG2D 리간드 보유 표적 세포 (예를 들어 하기 실시예 1 참조)의 인간 NK 세포 치사를 측정하는 것이다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 유용한 NKG2D 조절제는 예를 들어 실시예 1에서 설명하는 모델 시스템에서 NKG2D 리간드-유도 NKG2D 활성화의 약 20％ 이상의 감소를 야기하는 것이고, 다른 실시태양에서 작용제는 리간드-유도 NKG2D 활성화를 적어도 약 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 그 이상으로 감소시킨다. 예를 들어, NKG2D 리간드-유도 활성화는 대조군에 비해 작용제의 존재 하에 약 30％ 이상 감소할 수 있다. 대조군은 예를 들어 (a) 개체, (b) 대조군으로서 평균값을 사용하는, 실질적으로 유사한 유기체의 집단, 또는 (c) 둘 모두에서 실질적으로 동일한 조건 하에서 작용제의 부재 하에서의 NKG2D-활성화일 수 있다. NKG2D 활성화 수준을 평가하는 다른 수단은 NKG2D 리간드, 예를 들어 MICA 또는 ULBP의 존재 또는 부재 하에 IFN-γ 생산을 측정하는 것이다. 비제한적으로 면역분석 또는 IFN-γ 단백질을 측정하는 다른 분석; IFN-γ 활성을 측정하는 생물학적 분석 등을 포함하여 IFN-γ 생산을 측정하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 유용한 NKG2D 조절제는 NKG2D-매개 IFN-γ 생산을 약 20％ 이상 감소시키는 것이고, 다른 실시태양에서, 작용제는 NKG2D-매개 IFN-γ 생산을 적어도 약 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 그 이상으로 감소시킨다.
한 일련의 실시태양에서, 본 발명에 따른 NKG2D 조절제는 NKG2D의 세포 내재화를 자극한다. 내재화는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 유동 세포측정 (예를 들어 하기 실시예 2 참조); 면역형광 현미경 검사 (예를 들어 공초점 현미경 검사에 의한 항체 내재화의 모니터링); 세포-표면 NKG2D를 검출하는 결합 분석 등에 의해 평가할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 유용한 NKG2D 조절제는 예를 들어 실시예 2에 설명된 모델 시스템에서 시험될 때 대조군에 비해 NKG2D의 세포-표면 수준의 적어도 약 10％ 감소 또는 세포 표면으로부터 NKG2D의 소실율의 10％ 증가를 야기하는 것이다. 다른 실시태양에서, 작용제는 세포-표면 수준의 적어도 약 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 초과의 감소 또는 NKG2D 소실율의 적어도 약 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 증가를 야기한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 NKG2D 조절제는 예를 들어 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, γδ-TcR+ T 세포 및 CD56/16+ NK 세포 중 1종 이상을 포함하는 NKG2D-발현 세포의 유의한 세포용해 또는 고갈을 야기하지 않는다. NKG2D-발현 세포를 치사시키는 물질의 능력은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 아넥신 V 또는 프로피듐 요오다이드 염색을 이용하는 유동 세포측정 또는 현미경 검사에 의한 사멸 세포의 검출, 트리판 (Trypan) 블루의 도입, 유로퓸 분석 또는 크롬 방출 분석을 사용하여 평가할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 유용한 NKG2D 조절제는 NKG2D-발현 세포의 약 90％ 이상의 생존성을 보존하는 조건 하에서 검출가능한 치료상 이점을 보이는 것이다. 다른 실시태양에서, 작용제는 NKG2D-발현 세포의 수를 약 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 또는 80％ 미만으로 감소시킨다.
하기 표는 본 발명에 따른 NKG2D 조절제의 특징의 비제한적 예를 포함한다.
NKG2D 조절제의 특징
NKG2D 내재화의 자극 (대조군에 비교시 NKG2D 표면 수준의 감소％ 또는 소실율의 증가％) NKG2D 활성화 (NKG2D-리간드 보유 세포에 노출한 후 NKG2D-보유 세포의 활성화 감소％) NKG2D-발현 세포의 고갈 (대조군에 비교시 NKG2D 발현 세포의 감소％)
20％ 30％ <5％
20 50 <5
20 70 <5
20 90 <5
20 70 10
20 70 20
20 70 30
20 70 50
40 30 <5
40 50 <5
40 70 <5
40 90 <5
40 70 10
40 70 20
40 70 30
40 70 50
90 30 <5
90 50 <5
90 70 <5
90 90 <5
90 70 10
90 70 20
90 70 30
90 70 50
본 발명은 NKG2D의 천연 가용성 리간드 (예를 들어, MICA 또는 ULBP)가 만성 염증이 없는 개체에서 발생할 수 있는 내재화와 유사한 방식으로 만성 염증 환자에서 NKG2D의 내재화를 자극할 수 없는 것에 관한 것이고; 이론에 매이기를 바라지 않지만, 상기 현상은 적어도 부분적으로 만성 염증 상태를 동반하는 고수준의 시토킨으로 인한 것으로 생각된다. (상기 현상은 만성 염증 환자 및 건강한 환자에서 T 세포 또는 NK 세포 상의 NKG2D 수준을 비교함으로써 증명될 수 있고; 만성 염증에 NKG2D 리간드의 높은 순환 수준이 동반한다는 사실에도 불구하고, 2개의 군에서 유사한 NKG2D 수준은 NKG2D 내재화의 결함을 반영한다). 본 발명은 천연 가용성 NKG2D 리간드가 그렇게 하기에 효과적이지 않거나 덜 효과적일 조건 하에 NKG2D의 내재화를 자극하는 작용제, 및 본원에 제공된 본 발명의 다양한 방법에서 상기 작용제의 용도를 포함한다. 상기 효과를 조사하기 위한 임의의 적합한 모델 시스템이, 예를 들어 NKG2D-발현 세포가 내재화에 대한 천연 가용성 리간드의 효과를 방해하는 것으로 알려진 조건 하에 시토킨 (예를 들어 비제한적으로 인터루킨-2, 인터루킨-15, 종양 괴사 인자, 또는 이들의 조합물)에 노출되는 조건 하에 천연 가용성 리간드 및 본 발명에 따른 조절제의 NKG2D 내재화에 대한 효과를 비교함으로써, 상기 특징을 갖거나 나타내는 특정 작용제를 증명하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 NKG2D 조절제는 내재화를 매개하는 천연 가용성 리간드의 능력을 저해하는 조건 하에 (예를 들어, 1종 이상의 시토킨의 존재 하에) 내재화가 측정될 때, 천연 가용성 NKG2D 리간드에 의한 표면 NKG2D 수준 감소보다 적어도 10％ 더 크게 표면 NKG2D 수준을 감소시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, NKG2D 조절제는 NKG2D 내재화를 매개하는데 있어서 천연 가용성 NKG2D 리간드보다 적어도 약 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 또는 99％ 초과로 더 효과적이다.
A. NKG2D 리간드
본 발명에 따른 한 종류의 NKG2D 조절제는 NKG2D 리간드를 포함한다. 전형적으로, 상기 리간드는 천연 가용성 리간드가 무효한 조건 하에 NKG2D 내재화를 자극하는데 효과적으로 만드는 천연 가용성 NKG2D 리간드 (예를 들어 가용성 형태의 MICA, MICB 및 ULBP)에 비해 몇몇 변형을 나타낸다. 예를 들어, 가용성 형태의 MICA 및 MICB 단백질 (즉, 막관통 및 세포질 도메인이 결핍되는, 예를 들어 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 US2003/0165835 참조), 또는 NKG2D-결합 활성을 보유하는 그로부터의 단편은 하나 이상의 NKG2D 분자에 결합하여 내재화를 자극할 수 있는 다량체성 NKG2D 리간드를 형성하기 위해 통상적인 방법을 이용하여 화학적으로 가교결합될 수 있다. NKG2D-결합 활성은 임의의 수단, 예를 들어, 경쟁적 결합, 유동 세포측정 등을 이용하여 평가될 수 있다. 다른 일련의 실시태양에서, 다량체성 NKG2D 리간드는 MICA, MICB, 또는 ULBP로부터 유래된 NKG2D-결합 도메인의 직렬 반복체 (tandem repeat) (적절한 스페이서로 분리된)를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현에 의해 생산될 수 있다. 다른 일련의 실시태양에서, 리간드는 추가의 화학기, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
B. 항체
본 발명은 NKG2D-매개 활성화를 감소시키는데 사용될 수 있는 임의의 항체, 예를 들어, NKG2D-매개 신호전달 경로를 통한 유의한 활성화 없이 NKG2D의 내재화를 자극하는 것의 사용을 포함한다. 상기 항체의 비제한적인 예는 NKG2D의 임의의 적합한 세포외 또는 세포내 에피토프에 대해 작용하는 항체; DAP10의 임의의 적합한 세포외 또는 세포내 에피토프에 대해 작용하는 항체; 및 가용성 NKG2D 리간드 또는 NKG2D-NKG2D 리간드 복합체에 대해 작용하는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체, 즉, 2개의 결합 도메인이 각각 상이한 결합 에피토프를 인식하는 항체도 또한 포함된다. NKG2D의 아미노산 서열은 예를 들어 미국 특허 6,262,244에 개시되고, DAP10의 아미노산 서열은 문헌 [Wu et al., Science 285:730, 1999]에 개시되고, MICA 및 MICB 폴리펩티드의 아미노산 서열은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 US 2003/0165835에 개시되며, 상기 문헌들은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 테트라머를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 테트라머는 각 쌍이 하나의 "경쇄" (약 25 kDa)와 하나의 "중쇄" (약 50 내지 70 kDa)를 갖는, 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍을 포함한다. 각 사슬의 아미노-말단부는 주로 항원 인식을 하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함할 수 있다. 각 사슬의 카르복시-말단부는 주로 효과기 기능을 하는 불변 영역을 규정할 수 있다.
전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 또한, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역과 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다 (일반적으로 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, ed., 2nd ed. Raven Press, NY, 1989)] 참조).
각각의 경쇄/중쇄쌍의 가변 영역은 전형적으로 항체-결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 무손상 IgG 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이중관능성 또는 이중특이적 항체를 제외하고는, 2개의 결합 부위는 일반적으로 동일하다. 정상적으로, 사슬은 모두 3개의 초가변영역 (또한, 상보성 결정 영역 또는 CDR로 불림)에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 중쇄 및 경쇄의 CDR은 보통 특이적 에피토프에 결합할 수 있도록 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. 일반적으로, N-말단부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄는 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 지정은 일반적으로 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat et al., National Institutes of Health, Bethesda, MD, 5th ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991]; [Kabat, Adv Prot Chem, 32:1-75, 1978; Kabat et al., J Biol Chem, 252:6609-6616, 1977]; [Chothia et al., J Mol Biol, 196:901-917, 1987]; 및 [Chothia et al., Nature, 342:878-883, 1989]의 정의에 따른다.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이중특이적 항체, Fab 항체 단편, F(ab)2 항체 단편, Fv 항체 단편 (예를 들어, VH 또는 VL), 단쇄 Fv 항체 단편 및 dsFv 항체 단편을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 분자는 완전 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 실시태양에서, 항체 분자는 모노클로날, 완전 인간 항체이다. 모노클로날 항체는 실질적으로 균질 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 포함하고, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 집단을 구성하는 개별 항체가 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 작용하여 고도로 특이적이다. 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해 본질적으로 오염되지 않는 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적인 균질 집단으로 존재하는 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다.
본 발명의 항체는 임의의 면역글로불린 불변 영역에 연결된 (성숙 또는 가공되지 않은) 임의의 항체 가변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 영역이 불변 영역에 연결되면, 바람직하게는 카파 사슬이다. 중쇄 가변 영역이 불변 영역에 연결되면, 바람직하게는 인간 감마 1, 감마 2, 감마 3 또는 감마 4 불변 영역, 보다 바람직하게는 감마 1, 감마 2 또는 감마 4, 훨씬 더 바람직하게는 감마 1 또는 감마 4이다.
일부 실시태양에서, 예를 들어, NKG2D 또는 DAP10에 대해 작용하는 완전 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 갖는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성된다. 이들 트랜스제닉 마우스 (본원에서 "HuMAb" 마우스로 칭할 수 있음)는 내인성 뮤린 뮤 및 카파 사슬 좌위를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 소좌위 (minilocus)를 포함한다. 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 카파의 감소된 발현을 보이고, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 면역화에 반응하여 클래스 스위칭 (class switching) 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도 인간 IgG/카파 모노클로날 항체를 생성시킨다. HuMAb 마우스에서 완전 인간 항체의 생성은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495, 1975]에 처음 설명된 하이브리도마 방법을 이용하여 또는 다른 공지의 후속적으로 개발된 방법에 의해 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 이어서 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 모골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 바람직하게 함유하는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모골수종 세포에 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마 배양용 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를, 항원에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사선 면역분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA) 또는 면역형광 및 유동 세포측정 또는 웨스턴 블롯에 의해 결정할 수 있다. 요구되는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 희석 과정을 제한함으로써 클론을 서브클로닝하여 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다. 상기 목적을 위한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다. 서브클론에서 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 방법, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 원료로서 기능한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 넣어질 수 있고, 이어서 숙주 세포, 예를 들어 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜리 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 인간 293T 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 합성된 모노클로날 항체를 얻는다.
항체 또는 항체 단편은 또한 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 전략으로서 사슬 셔플링 (shuffling) 및 조합적 감염 및 생체 내 재조합을 사용하거나 사용하지 않으면서 공지의 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
아미노산 서열의 변동이 서열의 적어도 75％, 보다 바람직하게는 적어도 80％, 90％, 95％, 가장 바람직하게는 99％를 유지한다면, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열의 근소한 변동이 본 발명에 포함된다. 특히, 보존적 아미노산 교환이 고려된다. 보존적 교환은 그들의 측쇄에 관련된 아미노산의 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 아미노산 변화가 기능적 펩티드를 초래할 수 있는지 여부는 폴리펩티드 유도체의 특이적인 활성을 분석함으로써 쉽게 결정될 수 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 (또는 유사체)은 당업계의 통상의 기술자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노 말단 및 카르복시 말단은 기능적 도메인의 경계 가까이에 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이타를 공공 또는 사유 서열 데이타베이스와 비교함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게는, 공지의 구조 및/또는 기능을 갖는 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 형태 도메인을 확인하기 위해 컴퓨터화된 비교 방법이 사용된다. 공지의 3차원 구조로 접히는 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지되어 있다. 서열 모티프 및 구조적 형태는 본 발명에 따른 구조적 및 기능적 도메인을 규정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고(시키거나), (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고(시키거나), (3) 단백질 복합체를 형성하는데 대한 결합 친화도를 변경시키고(시키거나), (4) 결합 친화도를 변경시키고(시키거나) (4) 상기 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 조절하는 아미노산 치환이 이루어진다.
일반적으로, 본 발명에 따른 유용한 항-NKG2D 항체는 가용성 NKG2D 리간드의 친화도와 적어도 동일한 인간 NKG2D에 대한 친화도 (Kd)를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 항체는 인간 NKG2D에 나노몰 친화도, 또는 훨씬 더 바람직하게는 피코몰 친화도로 결합한다. 일부 실시태양에서, 항체는 인간 NKG2D에 약 100 nM, 50 nM, 20 nM, 20 nM 또는 1 nM 미만의 Kd로 결합한다.
일부 실시태양에서, 유용한 항체는 인간 NKG2D와, 1종 이상의 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 및 ULBP4 사이의 상호작용을 감소시키는 것을 포함한다. 상기 차단 항체는 통상적인 경쟁 분석을 이용하여 확인할 수 있다.
C. 핵산 조절자
본 발명은 전사, 번역, 또는 번역후 수준에서 NKG2D 세포 표면 발현의 조절을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조절자는 핵산계, 예를 들어 비제한적으로 DNA, RNA, 키메릭 RNA/DNA, 단백질 핵산 및 다른 핵산 유도체이다.
일부 실시태양에서, NKG2D 조절자는 NKG2D-발현 세포 내로 도입될 때 NKG2D 생산을 억제할 수 있는 RNA 분자 (RNAi로 부름), 예를 들어 짧은 헤어핀 이중가닥 RNA (shRNA)를 포함한다. NKG2D 발현을 조절하기 위한 유용한 RNAi 서열의 비제한적인 예는 서열 5'-GGATGGGACT AGTACACATT CC-3' (서열 10); 5'-TGGCAGTGGG AAGATGGCTC C-3' (서열 11); 및 5'-CAGAAGGGAG ACTGTGCACT CTATGCCTC-3' (서열 12)에 의해 코딩되는 것을 포함한다. NKG2D의 세포 표면 발현을 감소시킬 수 있는 임의의 서열이 본 발명의 실시에 있어서 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
RNAi 구성체의 생산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 핵산 기술에 의해 수행될 수 있다. 처리된 세포의 내인성 RNA 폴리머라제는 생체 내에서 전사를 매개할 수 있거나, 클로닝된 RNA 폴리머라제는 시험관 내에서 전사에 사용될 수 있다. RNAi 구성체는 예를 들어, 세포 뉴클레아제에 대한 감수성을 감소시키고(시키거나), 생체이용성을 개선시키고(시키거나), 제제 특징을 개선시키고(시키거나), 다른 약물운동학적 특성을 변화시키기 위해 인산염-당 주쇄 또는 뉴클레오시드에 대한 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 천연 RNA의 포스포디에스테르 결합은 적어도 하나의 질소 헤테로원자 또는 황 헤테로원자를 포함하도록 변형될 수 있다. RNA 구조에서 변형은 dsRNA에 대한 일반적인 반응을 피하면서 특이적인 유전적 억제를 허용하도록 맞추어질 수 있다. 마찬가지로, 염기는 아데노신 데아미나제의 활성을 차단하도록 변형될 수 있다. RNAi 구성체는 효소적으로 또는 부분적/완전 유기 합성에 의해 생산될 수 있고, 임의의 변형된 리보뉴클레오티드는 시험관 내에서 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다.
RNA 분자를 화학적으로 변형하는 방법이 RNAi 구성체를 변형하기 위해 채택될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Heidenreich et al., Nucleic Acids Res, 25:776-780, 1977]; [Wilson et al., J Mol Recog, 7:89-98, 1994]; [Chen et al., Nucleic Acids Res, 23:2661-2668, 1995]; 및 [Hirschbein et al., Antisense Nucleic Acids Res Drug Dev, 7:55-61, 1997] 참조). 예를 들어, RNAi 구성체의 주쇄는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포디티오에이트, 키메릭 메틸포스포네이트-포스포디에스테르, 펩티드 핵산, 5-프로피닐-피리미딘 함유 올리고머 또는 당 변형체 (예를 들어, 2'-치환 리보뉴클레오시드, a-형상)으로 변형될 수 있다.
이중가닥 구조는 단일 자가-상보성 RNA 가닥 또는 2개의 상보성 RNA 가닥으로부터 형성될 수 있다. RNA 이중나선 형성은 세포 내에서 또는 밖에서 개시될 수 있다. RNA는 세포당 적어도 1 카피의 전달을 허용하는 양으로 도입될 수 있다. 보다 고 용량 (예를 들어, 세포당 적어도 5, 10, 100, 500 또는 1000 카피)의 이중가닥 물질은 보다 효과적인 억제를 일으킬 수 있는 반면, 보다 낮은 용량이 또한 특수한 용도에 유용할 수 있다. RNA의 이중나선 영역에 대응하는 뉴클레오티드 서열이 유전적 억제에 표적화된다는 점에서, 억제는 서열-특이적이다.
특정 실시태양에서, 대상 RNAi 구성체는 "소 간섭 RNA" 또는 "siRNA"이다. 이들 핵산의 길이는 보다 긴 이중가닥 RNA의 뉴클레아제 "다이싱 (dicing)"에 의해 생성된 단편의 길이에 대응하는 약 19 내지 30 뉴클레오티드, 예를 들어, 약 21 내지 23 뉴클레오티드이다. siRNA는 뉴클레아제 복합체를 모으고 특이적인 서열과 페어링시켜 복합체를 표적 mRNA에 유도하는 것으로 이해된다. 그 결과, 표적 mRNA는 단백질 복합체 내의 뉴클레아제에 의해 분해된다. 특정 실시태양에서, 21 내지 23개 뉴클레오티드의 siRNA 분자는 3' 히드록실 기를 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 siRNA는 당업자에게 공지된 많은 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, siRNA는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성되거나 재조합 방법으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 짭은 센스 및 안티센스 RNA 올리고머는 합성되고 어닐링되어 각 말단에서 2-뉴클레오티드 오버행을 갖는 이중가닥 RNA 구조체를 형성할 수 있다 ([Caplen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 98:9742-9747, 2001]; 및 [Elbashir et al., EMBO J, 20:6877-88, 2001]). 이들 이중가닥 siRNA 구조체는 이어서 선택되는 수동적인 흡수 또는 전달 시스템에 의해 세포에 직접 도입될 수 있다.
특정 실시태양에서, siRNA 구성체는 예를 들어 효소 다이서 (dicer)의 존재 하에 보다 긴 이중가닥 RNA의 프로세싱을 통해 생성될 수 있다. 한 실시태양에서, 초파리 시험관내 시스템이 사용된다. 상기 실시태양에서, dsRNA는 초파리 배아로부터 유도된 가용성 추출물과 조합되어 조합체를 생성시킨다. 조합체는 dsRNA가 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드의 RNA 분자로 프로세싱되는 조건 하에 유지된다.
siRNA 분자는 통상적인 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 겔 전기영동을 사용하여 siRNA를 정제할 수 있다. 별법으로, 비-변성 방법, 예를 들어 비-변성 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 siRNA를 정제할 수 있다. 또한, 크로마토그래피 (예를 들어 크기 배제 크로마토그래피), 글리세롤 구배 원심분리, 항체를 사용한 친화도 정제를 사용하여 siRNA를 정제할 수 있다.
일부 실시태양에서, 플라스미드는 예를 들어, 전사 생성물로서 이중가닥 RNA를 전달하기 위해 사용된다. 상기 실시태양에서, 플라스미드는 RNAi 구성체의 각각의 센스 및 안티센스 가닥에 대한 "코딩 서열"을 포함하도록 설계된다. 코딩 서열은 예를 들어 역전된 프로모터에 인접된 동일한 서열일 수 있거나, 각각 별개의 프로모터의 전사 제어 하의 2개의 별개의 서열일 수 있다. 코딩 서열이 전사된 후, 상보성 RNA 전사체는 염기쌍을 지어 이중가닥 RNA를 형성한다. PCT 출원 공개 WO01/77350에서는 진핵 세포에서 동일한 트랜스진의 센스 및 안티센스 RNA 전사체를 얻기 위해 트랜스진의 양방향 전사를 위한 예시적인 벡터를 설명하고 있다.
II. 치료 방법
본 발명은 염증성 질환, 예를 들어 NKG2D 활성화와 관련된 다양한 염증성 자가면역 질환 및 증후군의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 증후군은 스트레스-관련 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA, MICB 및 ULBP)의 유도가 자가반응성 T 세포 및/또는 NK 세포의 과도한 활성화 및/또는 팽창을 일으키는 (이는 시토킨, 예를 들어 IL-2, TNF-α 및 IL-15의 증가된 수준으로 반영될 수 있다) 임상 상황을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
따라서, 특정 측면에서, 본 발명은 류마티스성 관절염 (RA)의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제의 유효량을 RA에 걸리거나 RA가 발병할 실질적인 위험이 있는 것으로 확인되거나/진단된 환자에게 RA가 치료되거나 예방되도록 전달하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 RA 치료/예방 방법은 NKG2D에 "대한" (즉, NKG2D"에 특이적인" 또는 NKG2D"에 특이적으로 결합하는" 또는 NKG2D"에 우선적으로 결합하는") 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 단편의 사용에 의해 실시된다. 한 측면에서, 작용제 (예를 들어 항-NKG2D mAb 또는 mAb 단편)은 예를 들어 미국 특허 6,414,218 및 미국 특허 출원 공개 20030005469에 설명된 바와 같이 RA의 허용되는 모델에서 RA를 개선시키는데 효과적인 것으로 증명된 작용제이다 (관련 원리 및 모델은 예를 들어 문헌 [Wooley, P. H., Animal Models of Arthritis, eds. J. H. Klippel and P. A. Dieppe, Mosby Publishers (London), 1998]; [Eming et al., Arthritis Res, 4 Suppl 3:S 133-40, 2002]; [Holmdahl et al., Ageing Res Rev, 1(1):135-47, 2002]; [Anthony et al., Clin Exp Rheumatol, 17(2):240-4, 1999]; [Durie et al., Clin Immunol Immunopathol, 73(1):11-8, 1994]; 및 [Muller-Ladner et al., Drugs Today (Barc), 35(4-5):379-88, 1999]에 기재되어 있다). 다른 측면에서, 작용제는 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출가능하게 감소시키고(시키거나) NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 (예를 들어, 적합한 대조군에 비교할 때 상기 세포를 약 10％ 이하로 감소시키면서) 손상시킬 수 있는 (예를 들어 자가반응성 CD8+ T 세포의 팽창 및/또는 기능을 손상시킬 수 있는) 항체이다 (예를 들어 미국 특허 출원 공개 20040115198에 설명된 항체의 적어도 일부에 대조적으로). 한 측면에서, 방법은 RA의 치료 또는 예방 (적용가능한 경우)과 일치하는 방식으로 1종 이상의 바이오마커의 조절을 일으킨다 (예를 들어, 혈청 IL-6, TNF R, IL-2R, shed CD4, shed CD8, 및/또는 C 반응성 단백질). 다른 측면에서, 방법의 실시는 환자/숙주의 말초 관절에서 활막염의 검출가능한 감소를 일으킨다. 한 측면에서, 방법은 예를 들어, 환자 또는 숙주에서 방사선촬영 진행의 감소, 붓고 아픈 관절의 감소 (허용되는 분석 기준에 의해 결정), 및/또는 유의하게 개선된 삶의 질 (예를 들어, RA Health Assessment Questionnaire 상의 장애 점수의 감소로 결정됨)로 나타나는 바와 같이 환자 또는 숙주에서 방사선 촬영에 의한 쇠약을 예방하고 신체 기능을 개선시킨다.
다른 예시적인 특정 측면에서, 본 발명은 다발성 경화증 (MS)의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 방법은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제의 유효량을 MS에 걸리거나 MS가 발병할 실질적인 위험이 있는 것으로 확인되거나/진단된 인간 환자 또는 포유동물 숙주에게 환자 또는 숙주에서 MS가 치료되거나 예방되도록 전달하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 MS 치료/예방 방법은 NKG2D에 대한 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 단편 ("항-NKG2D 항체")을 사용하여 실시된다. 보다 구체적인 측면에서, 작용제는 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출가능하게 감소시키고(시키거나) NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체이다.
또다른 예시적인 측면에서, 본 발명은 염증성 장질환 (IBD), 예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 방법은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제의 유효량을 IBD에 걸리거나 IBD가 발병할 실질적인 위험이 있는 것으로 확인되거나/진단된 인간 환자 또는 포유동물 숙주에게 환자 또는 숙주에서 IBD가 치료되거나 예방되도록 전달하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 IBD 치료/예방 방법은 NKG2D에 대한 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 단편을 사용하여 실시된다. 보다 특정한 측면에서, 작용제는 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출가능하게 감소시키고(시키거나) NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체이다.
다른 면에서, 본 발명은 건선의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 방법은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제의 유효량을 건선에 걸리거나 건선이 발병할 실질적인 위험이 있는 것으로 확인되거나/진단된 인간 환자 또는 포유동물 숙주에게 환자 또는 숙주에서 건선이 치료되거나 예방되도록 전달하는 것을 포함한다. 전형적으로, 방법은 NKG2D에 대한 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 단편의 유효량을 환자에게 전달하여 수행된다. 보다 특정한 측면에서, 작용제는 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출가능하게 감소시키고(시키거나) NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체이다.
또다른 면에서, 본 발명은 이식 거부반응의 가능성을 감소시키는 (또는 이식 거부반응-관련 상태의 심도 또는 발병 시간을 감소시키는) 방법을 제공한다. 방법은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제의 유효량을 조직/기관 이식편의 수여자가 될 예정이거나, 수여자이거나, 최근에 수여자였던 인간 환자 또는 포유동물 숙주에게 거부반응의 가능성이 검출가능하게 감소되도록 (예를 들어 대조군에 비해) 전달하는 (예를 들어, 직접 투여하거나 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물에 의해 투여하는 등) 것을 포함한다. 특정 측면에서, 방법은 항-NKG2D mAb 또는 항-NKG2D mAb 단편의 전달에 의해 실시된다. 보다 특정한 측면에서, 작용제는 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출가능하게 감소시키고(시키거나) NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 항-NKG2D mAb 또는 단편이다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 작용제, 예를 들어 항-NKG2D mAb 또는 항-NKG2D mAb 단편은 I형 당뇨병에 걸리거나 I형 당뇨병이 발병할 실질적인 위험이 있는 환자 또는 숙주에게 환자 또는 숙주에서 상태를 치료하거나 예방하기 위해 충분한 양으로 충분한 조건 하에 전달된다.
본 발명의 방법은 유사하게 NKG2D와 관련된 다양한 다른 자가면역 질환 및 염증성 질환, 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선염, 중증 근육무력증, 길랑 바레 증후군, 자가면역 포도막염, 원발성 담즙성 간경변, 자가면역 간염, 자가면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 그레이브스병, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 측두동맥염, 항-인지질 증후군, 베게너 육아종증, 베체트병, 공피증, 다발성 근염, 피부근육염, 강직척추염, 쇼그렌 증후군, 포진피부염, 심상성 천포창, 백반증, 건선 관절염, 골관절염, 스테로이드-내성 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 아테롬성 동맥경화증에 적용될 수 있다. 몇몇 바람직한 실시태양에서, 이식편은 골수 (BM) 또는 말초 혈액 줄기세포 (PBSM) 이식편이다. 일부 실시태양에서, BMT 또는 PBSCT 이식편은 백혈병 또는 림프종의 치료제로서 투여되는 반면, 다른 실시태양에서, 이식편은 다른 종류의 암, 예를 들어 신경모세포종 또는 다발 골수종에 대한 치료제로서 투여된다.
본 발명의 실시에 있어서, NKG2D 조절자는 환자에게 염증성 또는 자가면역 증후군을 예방하거나 치료하기 위해 단일 투여 유효량을 포함하는 단일 용량으로서, 또는 함께 증후군을 예방하거나 치료하기 위한 유효량을 포함하는 일련의 단계적 용량으로 투여될 수 있다. NKG2D 조절자의 유효량은 단일 용량 또는 다수 용량의 집합체로 또는 임의의 다른 종류의 규정된 치료 방식의 일부로서 투여될 때 증후군과 관련된 적어도 하나의 임상 파라미터에 의해 입증되는 바와 같이 성과에서 측정가능한 통계학적 개선을 생성시키는 조절자의 양을 의미한다. NKG2D 조절자의 유효량은 NKG2D 조절자를 투여받지 않는 환자와 비교할 때 질환의 진행을 느리게 할 수 있다 .
NKG2D 조절자의 유효량과 전체 투여량 방식은 질환 및 환자의 임상 상태에 따라 변할 수 있고, 이는 다시 하나 이상의 임상 파라미터, 예를 들어 임상적으로 인정되는 질환 점수로 반영될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 류마티스성 관절염에 대해, 질환의 심도 및/또는 치료의 성과는 부은 관절; 통증; 이동성; 및/또는 공식적 질환 점수 ACR 20/50 또는 70의 수치를 모니터링함으로써 평가할 수 있다. I형 당뇨병에 대해, 질환의 심도 및/또는 치료의 성과는 혈당 수준 또는 그의 변형, Hb1C 수준 등을 측정함으로써 평가할 수 있다. 다발성 경화증에 대해, 뇌 염증은 뇌를 스캐닝하여 평가할 수 있다. 조혈 이식 거부반응에 대해, 질환의 심도 (융합의 실패) 및/또는 치료의 성과는 골수 소멸성 조건화를 겪은 환자에서 연장된 호중구감소, 저혈소판증, 및 적혈구 수혈 의존의 증거에 의해, 및 골수 비소멸성 조건화를 겪은 환자에서 키메라증을 관찰하지 못한 것에 의해 평가할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하는 치료 성과에 대한 검출가능한 효과는 다른 치료에 대한 필요성의 감소 (예를 들어, 다른 약물 또는 치료의 양 및/또는 지속기간의 감소), 입원 횟수 및/또는 기간의 감소, 병으로 인한 작업일 손실의 감소 등을 포함한다. 유효량은 당업계의 통상의 기술자가 일상적인 실험에 의해 값의 매트릭스를 작성하고 매트릭스 내에 상이한 지점을 시험함으로써 결정할 수 있음이 추가로 이해될 것이다.
본 발명은 NKG2D 조절자와 1종 이상의 추가의 작용제의 조합 투여를 포함한다. NKG2D 조절자와 다른 작용제의 조합물의 투여를 포함하는 실시태양에서, NKG2D 조절자의 투여량은 그 자체 상에 유효량을 포함할 수 있고, 추가의 작용제(들)은 환자에게 치료상 이점을 추가로 증대시킴이 이해될 것이다. 별법으로, NKG2D 조절자 및 제2 작용제의 조합물은 함께 증후군을 예방하거나 치료하기 위한 유효량을 포함할 수 있다. 유효량은 구체적인 치료 방식의 맥락에서, 예를 들어, 투여의 시기 및 횟수, 투여 방식, 제제화 등에서 규정될 수 있음이 또한 이해될 것이다
NKG2D-관련 증후군이 I형 당뇨병인 일부 실시태양에서, 추가의 작용제는 췌장 베타 세포의 성장을 촉진하거나 베타 세포 이식, 예를 들어, 베타 세포 성장 또는 생존 인자 또는 면역조절 항체를 증강시키는 1종 이상의 작용제를 포함한다. NKG2D-관련 증후군이 류마티스성 관절염인 일부 실시태양에서, 추가의 작용제는 메토트렉세이트; 항-TNF-α 항체; TNF-α 수용체-Ig 융합 단백질, 항-IL-15 항체, 비-스테로이드성 소염 약물 (NSAID), 및 질환 조절 항-류마티스 약물 (DMARD) 중 하나 이상이다. 예를 들어, 추가의 작용제는 생물학적 작용제, 예를 들어 항-TNF제 (예를 들어 ENBREL(등록상표)), 인플릭시맙 (REMICADE(등록상표)) 및 아달리무맙 (HUMIRA(등록상표)) 또는 리툭시맙 (RITUXAN(등록상표))일 수 있다. NKG2D-관련 증후군이 조혈 이식 거부반응인 일부 실시태양에서, 조혈 성장 인자(들) (예를 들어, 에리트로포이에틴, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, 트롬보포이에틴 등) 또는 항미생물제(들) (예를 들어, 항생제, 항바이러스제, 항진균제)가 보조 치료로서 투여될 수 있다. NKG2D-관련 증후군이 건선인 일부 실시태양에서, 추가의 작용제는 1종 이상의 타르 및 그의 유도체, 광선요법, 코르티코스테로이드, 시클로스포린 A, 비타민 D 유사체, 메토트렉세이트, p38 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 억제제, 및 생물학적 작용제, 예를 들어 항-TNF-알파제 및 RITUXAN(등록상표)이다. NKG2D-관련 증후군이 염증성 장질환 (IBD), 예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염인 일부 실시태양에서, 추가의 작용제는 1종 이상의 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 면역조절자, 항생제, 또는 생물학적 물질, 예를 들어 REMICADE(등록상표) 및 HUMIRA(등록상표)이다.
III. 제약 제제 및 투여 방식
본 발명은 또한 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있는, NKG2D 조절자를 포함하는 제약 제제를 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 본 발명에 의해 제공되는 NKG2D 조절자 또는 관련 조성물 또는 조합물과 생리학적으로 적합한 임의의 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약상 허용되는 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이들의 조합물 중 1종 이상을 포함한다. 많은 경우에, 상기 조성물 내에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 제약상 허용되는 물질은 또한 바람직하게 NKG2D 조절자, 관련 조성물 또는 조합물의 저장 수명 또는 효과를 향상시킬 수 있는 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 버퍼이다. 제약 조성물의 담체 및 다른 성분에 대한 적합성은 NKG2D 조절자, 관련 조성물 또는 조합물의 목적하는 생물학적 특성에 대한 유의한 부정적 효과의 결여를 기준으로 결정된다.
본 발명에 따른 NKG2D 조절자 조성물, 관련 조성물 및 조합물은 다양한 적합한 형태로 존재할 수 있다. 상기 형태는 예를 들어, 액체, 반-고체 및 고체 투여 형태, 예를 들어 액체 용액 (예를 들어, 주사가능 및 주입가능 용액), 분산액 또는 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 정제, 환제, 분말, 리포좀, 덴드리머 (dendrimer) 및 다른 나노입자 (예를 들어, 문헌 [Baek et al., Methods Enzymol, 362:240-9, 2003]; 및 [Nigavekar et al., Pharm Res, 21:476-83, 2004 참조), 마이크로입자, 및 좌제를 포함한다. 최적 형태는 의도된 투여 방식, 조성물 또는 조합물의 성질, 및 치료 용도에 따른다. 제제는 또한 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질 (양이온성 또는 음이온성) 함유 소포, DNA 컨쥬게이트, 무수 흡수 페이스트, 수중유성 및 유중수성 에멀젼, 에멀젼 카르보왁스 (각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 겔, 및 카르보왁스를 포함하는 반-고체 혼합물을 포함할 수 있다. 제제 내의 활성 성분이 제제에 의해 불활성화되지 않고 제제가 투여 경로에서 생리학적으로 적합하고 인용가능하다면, 임의의 상기한 혼합물은 본 발명에 따른 처리 및 치료에 적절할 수 있다 (또한 예를 들어 문헌 [Powell et al. "Compendium of exipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol, 52:238-311, 1998] 및 제약 화학자에게 잘 공지된 부형제 및 담체에 관한 추가 정보에 대한 상기 문헌의 인용문을 참조한다).
NKG2D 조절자 조성물은 또한 NKG2D 조절자 펩티드 및 그의 적합한 염의 임의의 적합한 조합물을 포함하는 조성물을 포함한다. 임의의 적합한 염, 예를 들어 임의의 적합한 형태 (예를 들어, 완충 염)의 알칼리 토금속염이 NKG2D 조절자의 안정화에 사용될 수 있다 (바람직하게는 염의 양은 NKG2D 조절자의 산화 및/또는 침전을 방지하는 양이다). 적합한 염은 전형적으로 염화나트륨, 숙신산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 및 염화칼슘을 포함한다. 염기 및 NKG2D 조절자를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 다른 측면에서, 본 발명은 등장(tonicifying) 양의 임의의 염이 결핍된 NKG2D 조절자 조성물을 제공한다.
제약 용도의 조성물은 또한 희석제, 충전제, 염, 완충액, 세정제 (예를 들어, 비이온성 세정제, 예를 들어 Tween-80), 안정화제 (예를 들어 당 또는 단백질-부재 아미노산), 보존제, 조직 고정액, 가용화제, 및/또는 제약 조성물에 포함시키기 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다. 적합한 성분의 예는 또한 예를 들어, 문헌 [Berge et al., J Pharm Sci, 6661:1-19, 1977]; [Wang and Hanson, J Parenteral Sci Tech, 42:S4-S6, 1988], 미국 특허 6,165,779 및 6,225,289; 및 이들에서 언급되는 다른 문헌에 설명되어 있다. 상기 제약 조성물은 또한 보존제, 항산화제, 또는 당업자에게 공지된 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 추가의 제약상 허용되는 담체는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Urquhart et al., Lancet, 16:367, 1980]; [Lieberman et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS, 2nd ed., vol. 3, 1998]; [Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS, 7th ed., 2000]; [Martindale, THE EXTRA PHARMACOPEIA, 31st ed.]; [Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th-20th editions]; [THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Goodman and Gilman, eds., 9th ed., 1996]; [Wilson and Gisvolds' TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado and Remers, eds., 10th ed., 1998]; 및 미국 특허 5,708,025 및 5,994,106에 설명된다. 제약상 허용되는 조성물을 제제화하는 원리는 또한 예를 들어, 문헌 [Platt, Clin Lab Med, 7:289-99, 1987]; [Aulton, PHARMACEUTICS: THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone, NY, 1988]; [EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP, 1998], 및 ["Drug Dosage," J Kans Med Soc, 70(1):30-32, 1969]에 설명된다. 벡터의 투여에 특히 적합한 추가의 제약상 허용되는 담체는 예를 들어 국제 특허 공개 WO 98/32859에 설명된다. 한 예시적인 측면에서, 활성 화합물 또는 조합물은 제어 방출 제제, 예를 들어 임플란트 (implant), 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템과 같은, 화합물을 신속한 방출에 대해 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 상기 제제의 제조를 위한 많은 방법은 특허받았거나 당업계의 숙련인에게 일반적으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [SUSTAINED AND CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, 1978] 참조).
다른 측면에서, 경구 투여용으로 의도된 본 발명의 조성물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 제제화될 수 있다. 화합물 (및 원하는 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐 내로 포함되거나, 정제로 압축되거나, 대상환자의 음식 내로 직접 포함될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 화합물은 부형제가 포함되고 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭서제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼제 (wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 외의 방법으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 그의 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅하거나 동시투여하는 것이 필요할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 NKG2D 조절자, 관련 조성물 또는 조합물, 제약학적 담체, 및 임의로 다른 제약 조성물 성분을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 NKG2D 조절자 외에 진단 또는 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 진단 또는 치료 방법에서 사용하기 위한 지시서를 포함할 수 있다. 한 일련의 실시태양에서, 키트는 NKG2D 조절자, 관련 화합물, 또는 조합 조성물을 고안정성 형태로 (예를 들어 동결건조된 형태로), 고도로 안정된 조성물과 혼합하여 주사가능한 조성물을 형성할 수 있는 제약상 허용되는 담체(들)과 조합하여 포함한다.
NKG2D 조절자 조성물, 관련 조성물 및 조합 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 경구, 점막, 구강, 비내, 흡입, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 종양내, 종양외 또는 국소 경로를 통해 투여될 수 있다. 이들은 또한 미니펌프 (minipump) 또는 다른 적합한 장치를 통해 연속 투여될 수 있다. 항체 또는 다른 NKG2D 조절자는 항체가 질환 상태가 악화되는 것을 중단시키거나 개선시킨다면 일반적으로 질환 상태가 존재하는 만큼 오랫동안 투여될 것이다. 항체 또는 다른 NKG2D 조절자는 일반적으로 본원에서 설명된 바와 같이 제약상 허용되는 조성물의 일부로서 투여될 것이다. 항체는 임의의 적합한 경로로 투여될 것이지만, 전형적으로 통상적인 제약상 허용되는 담체, 보조제 등 (안정화제, 붕해제, 항산화제 등)을 함유하는 투여 단위 제제로 비경구 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 동맥내, 근육내, 흉골내, 주두건내 (intratendinous), 척수강내, 두개내, 흉곽내, 주입 기술 및 복강내 전달을 포함한다. 가장 일반적으로, 항체는 정맥내 또는 피하 투여될 것이다. 주사 경로는 또한 근육 내 주사 (근육내, IM); 피부 하 주사 (피하, SC); 정맥 내 주사 (정맥내, IV); 복강 내 주사 (복강내, IP); 및 피부 내/통한 다른 전달 (피내, ID, 보통 다수 주사에 의한)를 포함한다.
본 발명은 임의의 상기하거나 본원에 설명된 측면에서 인용된 임의의 상태 또는 상태들의 조합의 예방 또는 치료에서 화합물의 사용에 관한 정보를, 잠재적으로 관심대상인 임의의 사람 또는 존재 (예를 들어, 제약회사 체인, 규정 관리자, 보험 회사, HMO, 병원 및 병원 체인, 다른 의료 회사, 약국 관리자, 잠재적인 환자, 완화 중의 환자, 일차 의료 치료자, 간호사, 약국의 의사, 및/또는 오피니언 리더)에게 배포하는 (예를 들어, 분배되거나, 우송되는 등의 인쇄물에 의해; 광고 신호에 의해; 텔레비전 프로그램 및 광고에 의해; 라디오 프로그램 및 광고에 의해; 인터넷 사이트 포스팅에 의해; 이메일에 의해; 통신판매에 의해; 방문 또는 개별 판매에 의해; 회의, 패널, 포럼 등에 자금을 제공하고(하거나) 주최함으로써, 판매원 및/또는 의학/학술 연락자의 서비스를 고용하고(하거나) 계약함으로써, 상기 용도에 관련된 학술 연구 및 출간에 자금을 제공하고(하거나) 주최함으로써) 것을 포함하는, 임의의 선행하는 측면에 따르거나 또는 달리 본원에 설명된 화합물의 판매 및/또는 사용을 촉진하는 방법을 추가로 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 실시태양 및 측면을 증명하고 추가로 설명하기 위해 제공되고, 그의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
본 발명은 NKG2D-매개 활성화와 관련된 증후군의 치료 또는 예방 방법 및 조 성물을 제공한다.
실시예 1
NKG2D 활성화에 대한 분석
IL-2 활성화된 인간 NK 세포를 적절한 51Cr-표지된 표적 세포 배양물, 예를 들어 MICA 폴리펩티드가 발현되는 조건 하에 인간 MICA를 코딩하는 cDNA로 형질감염된 마우스 Ba/F3 세포; 및 대조군 세포로서 형질감염되지 않은 동일한 표적 세포와 함께 동시배양하였다. 세포 용해를 나타내기 위해 51Cr 방출을 모니터링하였다. 대조군보다 높은 수준에서 활성화된 NK 세포에 의한 MICA-발현 세포의 용해는 NKG2D-특이적인 활성화를 나타낸다.
NKG2D 조절자에 대해 스크리닝하기 위해, 활성화된 NK 세포를 51Cr-표지된 표적 세포에 노출시키기 전에 후보 물질과 함께 인큐베이션하였다. NKG2D 리간드 보유 표적 세포의 사멸을 유의하게 감소시키는 화합물을 확인하고 추가로 평가하였다.
실시예 2
NKG2D 내재화에 대한 분석
인간 NKG2D를 발현하는 세포를 비오틴-표지된 항-NKG2D 항체의 존재 하에 37℃에서 1시간 이상 배양하였다. 대조군으로서, NKG2D+ 세포를 내재화를 방지하기 위해 0.05％ 나트륨 아지드의 존재하에 4℃에서 비오틴-표지된 항-NKG2D와 함께 배 양하였다. 세포를 세척하여 과잉의 항체를 제거한 다음, 비오틴-컨쥬게이션된 NKG2D 항체를 검출하기 위해 형광 염료-표지된 스트렙타비딘으로 염색하였다. 이어서 내재화를 형광 현미경 검사 또는 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 비오틴-표지된 항-NKG2D 항체와 함께 4℃에서 인큐베이션한 세포와 비교한, 비오틴-표지된 항-NKG2D 항체와 함께 37℃에서 배양한 후 세포 표면 상의 NKG2D의 양의 감소가 내재화의 하나의 표시이다. 이는 세포의 고정 및 투과, 및 일차 항-NKG2D 항체를 검출할 형광 염료-표지된 제2 단계 항체를 사용하는 염색에 의해 더욱 입증될 수 있다. 내재화되면, 제2 단계 항체는 형광 현미경 검사에 의해 가시화된 바와 같이 37℃에서 배양된 세포의 내부에 일차 항-NKG2D 항체를 검출할 것이다.
실시예 3
NKG2D 차단은 마우스에서 자가면역 당뇨병을 예방한다.
동물 모델 시스템, NOD 마우스에서 I형 당뇨병의 발병에 대한 NKG2D 차단의 효과를 시험하기 위해 다음 실험을 수행하였다 (Ogasawara et al., Immunity, 20:757-767, 2004).
마우스, 시약, 시토킨 및 항체
NOD 마우스는 타코닉 (Taconic, 미국 뉴저지주 저먼타운)으로부터 구입하였다. NOD.scid 마우스는 잭슨 래보래토리 (Jackson Laboratory, 미국 메인주 바 하버)로부터 구입하였다. 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD 마우스는 문헌에 설명되었다 (Verdaguer et al., J Exp Med, 186:1663-1676, 1997). 모든 마우스는 UCSF 동물 시설에서 특수한 무발열원 조건 하에 유지시키고 실험은 동물 연구에 대한 UCSF 위 원회의 지침에 따라 수행하였다. 당뇨병은 혈당 수준이 2회 연속 측정에서 300 mg/dL보다 클 때 진단되었다. 혈당 수준은 혈당 모니터 (왈그린즈 ( Walgreen's), 미국 일리노이주 디어필드)를 사용하여 측정하였다.
항-마우스 NKG2D mAb, 클론 CX5 및 CX6 (래트 IgG1 이소형)은 설명된 바와 같이 생성하고 (Ogasawara et al., Immunity, 18:41-51, 2003), 항-마우스 NKG2D mAb 클론 191004 (래트 IgG2a 이소형)는 알앤디 시스템즈 (R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스)로부터 입수하였다. 모든 항-NKG2D mAb는 NKG2D 세포외 도메인을 인식하고 그의 리간드에 대한 NKG2D의 결합을 효율적으로 차단한다. 생체내 주사를 위해, 검출가능한 엔도톡신 (<0.3 pg/주사)을 함유하지 않은 정제된 CX5 항체를 이용하였다. 대조군 래트 IgG는 시그마 (Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스)로부터 구입하였다. 항-마우스 pan RAE-1 mAb (클론 186107, 래트 IgG2b 이소형)은 RAE-1α, β, γ, δ 및 ε에 결합한다. NRP-V7/H-2Kd 및 TUMM-2Kd (대조군) 테트라머는 설명된 바와 같이 생산하거나 (Amrani et al., Nature, 406:739-742, 2000) 또는 엔아이에이치 테트라머 퍼실러티 (NIH Tetramer Facility, 미국 조지아주 애틀란타)로부터 입수하였다. TUM/H-2Kd 테트라머는 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 세포에 결합하지 않았다. 다른 항체는 비디 파밍겐 (BD PharMingen) 또는 이바이오사이언스 (eBioscience, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 구입하였다.
췌장으로부터 섬세포의 제조
마우스 소도를 다음과 같이 단리하였다. 간단히 설명하면, 0.3 mg/ml 콜라 게나제 P (로슈 몰레큘라 바이오케미칼즈 (Roche Molecular Biochemicals, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를 췌관 내로 주사하였다. 팽창된 췌장을 제거하고 37℃에서 13-17분 동안 인큐베이션하였다. 소도는 4가지 상이한 밀도 (1.108, 1.096, 1.069, 및 1.037)를 포함하는 유로콜린-피콜 (Eurocollin-Ficoll) 구배 상에서 원심분리에 의해 정제하였다. 원심분리 후, 1.069/1.096에서 조직 단편을 수집하고 세척하였다. 그 후, 단일 세포를 얻기 위해, 섬세포를 비-효소적 세포 해리 용액 (시그마)에 의해 해리시켰다.
면역형광, 유동 세포측정 및 현미경 검사
NKG2D의 검출을 위해, 세포 (~1x106)를 0.25 ㎍ 비오티닐화된 또는 PE-표지된 항-NKG2D mAb (클론 191004)로 염색하였다. 세포를 FITC-컨쥬게이션된 항-CD8, APC-컨쥬게이션된 항-CD8, FITC-컨쥬게이션된 항-CD44, 또는 FITC-컨쥬게이션된 항-Ly-6C로 동시염색하였다. RAE-1을 검출하기 위해, 세포를 5개의 모든 공지된 RAE-1 단백질 (Lodoen et al., J Exp Med, 197:1245-1253, 2003) 또는 항-RAE-1 mAb (클론 CX1) (Ogasawara et al., 상기 문헌, 2003)를 인식하는 비오티닐화된 항-pan RAE-1 mAb로 염색하였다. PE-컨쥬게이션된 스트렙타비딘 또는 APC-컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 사용하여 비오티닐화된 mAb를 검출하였다. 세포를 mAb와 함께 20분 동안 인큐베이션하고 0.01％ NaN3를 함유하는 PBS로 세척하였다. 세포를 FACSCalibur (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson), 미국 캘리포니아주 산 호세), 또는 Guava ViaCount™ 및 Guava Express™ 소프트웨어를 갖는 작은 데스크탑 Guava(등 록상표) Personal Cytometer (미국 캘리포니아주 헤이워드)를 사용하여 분석하였다. 생존하는 림프구 집단을 전방 및 측면 산란 프로파일에 기초하고 프로피듐 요오다이드 염색의 결핍에 의해 게이팅하였다. 면역조직화학을 위해, 기관을 OCT 매질 내에 급냉시키고 절편을 통상적인 기술로 제조하고 염색하였다. 화상은 Deltavision 현미경 (어플라이드 프리시전 (Applied Precision), 미국 와이오밍주 이사쿠아)을 사용하여 획득하고, 컴퓨터에 의한 디컨볼루션 (deconvolution)은 softWoRx 소프트웨어 (어플라이드 프리시전)를 사용하여 수행하였다.
정량적 RT-PCR
정량적 (실시간) PCR을 제조자 지시에 따라 ABI 7700 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems)) 기구를 사용하여 수행하였다. 프로브는 어플라이드 바이오시스템즈로부터 구입하였다. RAE-1 특이적 프로브 및 프라이머는 앞서 설명되었다 (Ogasawara et al., 상기 문헌, 2003). 모든 공지의 RAE-1 전사체를 검출하기 위해 사용된 범용 프라이머는: 센스, 5'-ctagtgccac ctgggaattc a-3' (서열 6); 안티센스 5'-catcattagc tgatctccag ctca-3' (서열 7)이고, 프로브는 5'-6-FAM-catcagtgac agttacttct tcaccttcta cacagaga-Tamra-3' (서열 8)이었다. 전체 RNA를 DNase I로 처리한 다음, 제1-가닥 cDNA를 랜덤 헥사머 프라이머를 사용하여 합성하였다. 실시간 PCR에 대한 사이클링 조건은: 10분 동안 50℃, 이어서 30초 동안 95℃ 및 2분 동안 60℃에서 50 사이클이었다. 데이타는 Sequence Detector v1.7 분석 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 분석하였다. 통계학적 분석은 2-샘플 t-테스트를 사용하여 수행하였다.
이입 전달 연구 - NOD.scid 마우스 내로 전달된 NOD T 세포
T 세포는 당뇨병 16-주령 NOD 마우스의 비장 및 림프절로부터 MACS (밀테니이 바이오테크 인크. (Miltenyi Biotec Inc.), 독일)을 사용하는 자기 세포 분리에 의해 단리하였다. T 세포 (순도 >98％)는 CD19+, CD24+, 및 MHC 클래스 II+ 세포의 고갈을 갖는 음성 선별에 의해 풍부화시켰다. 약 7.5 x106 T 세포를 4-5주령 NOD.scid 마우스에 꼬리 정맥 내로 주사하여 전달하였다. 이입 전달된 마우스에서 혈당 수준을 매주 검사하였다.
이입 전달 연구 - NOD 마우스 내로의 8.3 TcR-트랜스제닉 T 세포의 전달
이입 T 세포 전달을 앞서 설명된 바와 같이 수행하였다 (Serra et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99:15566-15571, 2002). 간단히 설명하면, 8.3 TcR-트랜스제닉 림프구를 림프절 및 비장으로부터 단리하였다. T 세포 (순도 >95％)는 MACS를 사용하는 자기 분류에 의해 음성 선별에 의해 풍부화시켰다. CFSE (5 μM)로 표지된 약 1 x 107 T 세포를 0일에 꼬리 정맥에 주사하여 10주령 NOD 마우스에 전달시켰다. 항-NKG2D mAb (CX5) 또는 cIg (200 ㎍/주사)를 -1, +1 및 +5일에 수여자 NOD 마우스에 주사하였다.
당뇨병전기 NOD 마우스의 췌장에서 RAE-1의 발현
NKG2D와 RAE-1 사이의 상호작용이 자가면역 당뇨병의 발병에 관여되는지 여부를 조사하기 위해, 모든 공지의 RAE-1 유전자의 전사체를 검출하도록 정량적 RT-PCR 분석을 개발하였다. 풍부 RAE-1 전사체가 후기 당뇨병전기 NOD 마우스 (12-16 주령)의 췌장에서 검출되지만, 주령을 일치시킨 BALB/c 마우스 (도 1a)의 췌장에서는 검출되지 않았다. 비교적 덜 뚜렷하지만, RAE-1 전사체는 또한 4-6주령 NOD 마우스의 췌장에서 검출되었다. RAE-1은 또한 어른 NOD.scid 마우스 (B 및 T 세포가 결핍되는)의 췌장에서 검출되었다 (도 1b). 이들 결과는 함께 RAE 발현이 진행하는 자가면역 반응에 독립적임을 나타낸다. RAE-1가 연령에 따라 췌장에서 선택적으로 상향 조절되는지 여부를 검사하기 위해, 어린 NOD 마우스의 특정 기관 내의 RAE-1 전사체 수준을 후기 당뇨병전기 NOD 마우스의 동일한 기관과 비교하였다. 상기 기준에서, RAE-1는 간, 비장, 신장 및 흉선에 비해 연령에 따라 당뇨병전기 마우스의 췌장에서 상대적으로 더 증가하였다 (도 1c).
RAE-1 단백질이 세포 표면 상에서 발현되었는지 여부를 결정하기 위해, 당뇨병전기 NOD 및 비당뇨병 BALB/c 마우스로부터 췌장 세포를 단리하였다. 췌장의 효소적 소화에 의해 단리된 세포를 항-RAE-1 및 항-CD45 mAb로 염색하였다 (침윤하는 CD45+ 조혈 세포를 CD45- 비-조혈 췌장 섬세포로부터 구분시킴). CD45-양성 조혈계 세포는 당뇨병전기 NOD 췌장을 침윤하지만, 비-당뇨병 BALB/c 췌장을 침윤하지 않는 것으로 검출되었다 (도 1d). RAE-1 단백질은 NOD 마우스의 CD45-음성 비-조혈 췌장 세포 상에서 주로 검출되었지만, BALB/c 마우스의 췌장 세포 상에서는 발견되지 않았다. 밀도 구배 분리 기술을 이용하여, 소도를 NOD 췌장으로부터 단리하고 또한 이들 마우스의 췌장 림프절 (PLN)로부터 회수하였다. 단리된 소도 및 PLN으로부터의 단일-세포 현탁액을 항-RAE-1 및 항-CD45 mAb로 염색하고 유동 세포측정 에 의해 분석하였다. RAE-1은 대부분의 CD45- 섬세포 상에 낮은 수준으로 존재하였지만, 췌장 또는 PLN에서 CD45+ 조혈 세포 상에 존재하지 않았다 (도 1d, e). 이들 결과는 RAE-1 전사체 및 단백질이 당뇨병전기 NOD 마우스의 췌장에 존재하였지만, 비-당뇨병 BALB/c 마우스에 존재하지 않았음을 나타내고, RAE-1의 발현이 NOD 마우스에서 질환 발병에 선행하고 질환 진행에 기여할 수 있음을 나타냈다.
NOD 췌장에 침윤하는 D8+ T 세포는 NKG2D를 발현한다
NOD 마우스에서 당뇨병의 발병에는 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 모두 요구되므로, NKG2D 발현을 말초 면역 조직으로부터 단리된 T 세포 및 NOD 마우스의 췌장에서 침윤하는 백혈구 상에서 분석하였다. 도 2a에 도시된 바와 같이, NKG2D는 10 및 25주령 NOD 마우스의 췌장에 침윤하는 CD8+ T 세포의 서브세트 상에서 검출되었다. 췌장-침윤하는 NKG2D+ CD8+ T 세포의 백분율은 질환 진행과 함께 증가하였다 (도 2a). 보다 적은 분획의 NKG2D+ CD8+ T 세포가 PLN 및 비장에서 검출되었다 (도 2a, b). 또한, 췌장 및 PLN에서 NKG2D+ CD8+ T 세포는 높은 수준의 CD44를 발현하지만, Ly-6C를 발현하지 않는 것으로 밝혀졌다 (도 2b). CD8- NKG2D+ 백혈구 (CD3을 발현하지 않은)의 집단이 또한 NOD 췌장에 침윤하는 백혈구에서 관찰되었고 (도 2a), 많은 이들 세포는 NK 세포 및 골수 세포 항원을 동시발현하였다. 정상 비-당뇨병 마우스주에 대해 보고된 바와 같이 (Jamieson et al., Immunity, 17:19-29, 2002), NKG2D는 10주령 또는 25주령 NOD 마우스의 췌장 또는 말초 림프계 조직에서 CD4+ T 세포 또는 220+ B 세포 상에서 검출되지 않았다.
최근 연구에서는 NOD 마우스에서 실질적인 비율의 자가반응성 CD8+ T 세포가 H-2Kd에 의해 제시되는 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛-관련 단백질 (IGRP)로부터 펩티드를 인식하는 것을 밝혔다. 미모토프 (mimotope) 펩티드, NRP-V7 (KYNKANVFL, 서열 5에 제시된)는 8.3 TcR을 발현하는 NOD 마우스에서 수퍼-효능제로서 기능한다. NRP-V7-반응성 CD8+ T 세포는 NOD 마우스의 췌장에 축적하고, 당뇨발병에서 중요한 역할을 한다. 췌장 및 PLN 내의 CD8+ T 세포를 NRP-V7/H-2Kd 테트라머 및 항-NKG2D로 동시염색하였다. 췌장에 침윤하는 거의 모든 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포가 NKG2D 및 CD44high를 발현하였다 (도 2c). 유사하게, 췌장 내의 NKG2D+ CD8+ T 세포는 CD44high, Ly-6C- (도 2b)이고, 표현형은 효과기 CD8+ T 세포와 일치하였다 (Cerwenka et al., J Immunol, 161:97-105, 1998). 특히, 소수의 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포가 PLN에서 검출되었다 (도 2c). 면역조직화학은 NKG2D+ CD8+ T 세포가 인슐린-생산 베타 세포에 가까운 당뇨병전기 NOD 마우스의 소도에 축적되었음을 밝혔다 (도 2d). CD8+ T 세포에 추가로, 췌장에서 CD68-양성 세포의 서브세트 (대식세포)가 또한 NKG2D를 발현하였다 (도 2d).
중화 항- NKG2D mAb 를 사용하는 생체내 처리는 자가면역 당뇨병을 예방한다
당뇨병전기 소도 상에서 침윤하는 CD8+ T 세포 및 NKG2D 리간드 상의 NKG2D의 발현은 당뇨 발병에서 이들 분자의 역할을 나타낸다. 상기 가설은 당뇨병전기 NOD 마우스를 중화 항-NKG2D mAb로 처리함으로써 시험하였다. CX5 항-마우스 NKG2D mAb는 NKG2D의 그의 리간드에 대한 결합을 차단하고, NKG2D-보유 세포를 CX5와 함께 인큐베이션하면 수용체의 조절 및 내재화를 일으켰다. 중요하게는, 생체 내에서 CX5를 사용한 마우스의 처리는 NKG2D+ NK 세포 또는 CD8+ T 세포를 고갈시키지 않았다. NOD 마우스를 7-25주령에서 항-NKG2D mAb로 처리하였다. 희석제로 처리된 마우스만 15주령에서 시작하여 당뇨병이 발병하였고, 모두 (n=7)가 28주에서 질환에 걸렸다 (도 3a, b). 이와 대조적으로, 항체 처리를 5주 더 일찍 중단하였지만 항-NKG2D로 처리된 NOD 마우스 (n=7)는 30주령에서 당뇨병이 발병하지 않았다 (도 3a, b).
보다 엄격한 분석으로서, 항-NKG2D mAb 처리는 확립된 췌도염에 걸린 13주령 당뇨병전기 마우스에서 질환 발병의 예방에 대해 시험되었다. 대조군 IgG로 처리된 마우스가 15주령에서 시작하여 당뇨병이 발병하였다. 대조적으로, 12주의 항-NKG2D 처리 동안 어떠한 NOD 마우스도 당뇨병이 발생하지 않았다 (도 3c, d). 현저하게, 대부분의 항-NKG2D 처리된 마우스는 치료 중단 7주 후 질환이 없는 상태로 유지되었다 (도 3c, d). 따라서, NKG2D 차단은 췌도염에 걸린 어린 마우스에서 뿐만 아니라 소도 파괴의 발병이 임박한 후기 당뇨병전기의 마우스에서도 당뇨병의 진행을 예방하였다. 항-NKG2D mAb 처리의 부작용은 육안 검사 또는 조직학적 분석에서 관찰되지 않았다. 따라서, 항-NKG2D mAb 처리는 적어도 항체가 지속적으로 투여된다면 당뇨병 예방을 위한 효율적인 요법이다.
항-NKG2D mAb-매개 요법의 메카니즘을 검사하기 위해, 대조군 Ig 및 항-NKG2D mAb-처리된 NOD 마우스의 췌장 및 PLN으로부터 단리된 백혈구를 분석하였다. NKG2D 및 높은 수준의 CD44를 동시발현하는 CD8+ T 세포가 대조군 Ig-처리된 마우스의 췌장에 존재하였다. 예상된 바와 같이, NKG2D 발현은 CD8+ T 세포 상에서 유의하게 감소하였지만, CD44 발현은 대조군 Ig로 처리된 마우스에 비해 항-NKG2D mAb로 처리된 마우스의 췌장에서 동일하였다 (도 4a). 대조적으로, NKG2D를 발현하는 CD8+ T 세포는 대조군 및 항-NKG2D mAb 처리된 마우스 모두의 PLN에서 비교적 드물었고, 이는 췌장에서 NKG2D+ CD8+ T 세포의 우선적인 편재화의 표시이다 (비처리 NOD 마우스에 대해 도 2에 제시된 결과와 일치함). 대조군 Ig 처리된 마우스로부터의 췌장의 냉동 절편의 면역조직화학적 분석은 대조군 Ig로 처리된 16주령 NOD 마우스의 췌장에서 NKG2D를 발현하는 CD8+ T 세포가 풍부함을 나타냈다 (도 4b). 이와 대조적으로, 훨씬 더 적은 CD8+ T 세포가 항-NKG2D로 9주 동안 처리된 16주령 마우스의 건강한 췌장에 존재하였다 (도 4c).
대조군 Ig 또는 항-NKG2D mAb로 처리된 NOD 마우스의 췌장 및 PLN으로부터 단리된 백혈구를 또한 항원-특이적 자가반응성 CD8+ T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 놀랍게도, 자가반응성 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포의 췌장 내로의 침윤이 항-NKG2D mAb로 처리된 마우스에서 크게 감소하였다 (~75％) (도 4d). NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포의 빈도는 대조군 Ig-처리된 마우스에 비해 항-NKG2D mAb-처리된 마우스의 PLN, 비장 및 말초 혈액에서 또한 감소하였다 (도 4d, e). NKG2D는 항-NKG2D mAb로 처리된 마우스에서 CD8+ T 세포 상에서 검출되지 않았다. CX5는 비-고갈 항-NKG2D mAb이기 때문에 (도 8 참조), 요법은 수용체의 조절 (도 7 참조) 및/또는 리간드 결합의 억제에 의해 작용하는 것으로 생각된다. 대조군 Ig 또는 항-NKG2D mAb로 생체내 처리된 마우스의 PLN으로부터 단리된 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 생산도 검사하였다. PMA 및 이오노마이신을 사용한 시험관내 자극시에, IFN-γ+ CD8+ T 세포가 cIg-처리된 NOD 마우스에서 검출된 반면, 항-NKG2D mAb 요법을 받는 마우스에서 보다 적은 IFN-γ+ CD8+ T 세포가 관찰되었다 (도 4f). 그럼에도 불구하고, 본 발명의 실행을 위해 메카니즘(들)에 대한 이해는 필요하지 않다.
NKG2D 차단은 당뇨병 NOD 마우스로부터 이입 전달된 T 세포를 수여하는 NOD . scid 마우스에서 당뇨병을 예방한다.
NKG2D 차단이 효과기 CD8+ T 세포에 영향을 미치는지 여부를 설명하기 위해, 당뇨병 16주령 NOD 마우스로부터 단리된 T 세포를 NOD.scid 수여자 (T 세포가 결핍되고 당뇨병이 발병하지 않는)에 이입 전달하였다. 전달 시기에, 단지 적은 비율의 CD8+ T 세포만이 NKG2D를 발현하였다 (도 5a). 그러나, 전달 5주 후, 상당수의 NKG2D+ CD8+ T 세포가 수여자 마우스의 췌장, PLN 및 비장에서 검출되었고 (도 5a), 이는 기존재하는 NKG2D+ T 세포의 팽창 또는 전달된 CD8+ T 세포 상의 NKG2D의 획득을 제시한다. cIg-처리된 수여자 마우스에서 췌장에 침윤하는 CD8+ T 세포의 약 15％가 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성인 반면, 유의하게 더 적은 수가 항-NKG2D mAb-처리된 마우스에서 발견되었다 (도 5b, c). NKG2D는 대조군 Ig-처리된 NOD 마우스에서 대부분의 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 자가반응성 CD8+ T 세포 상에 존재하였지만, 항-NKG2D mAb 요법을 받는 마우스에서 검출되지 않았다 (도 5c). 당뇨병 NOD 마우스로부터 T 세포를 받은 모든 대조군 Ig-처리된 NOD.scid 마우스에서 당뇨병이 발병되지만, 항-NKG2D mAb-처리된 마우스는 요법을 받는 동안 당뇨병이 발병하지 않았다 (도 5d).
항-NKG2D 처리가 NOD.scid 수여자 마우스에서 병원성 CD8+ T 세포의 팽창을 차단하였는지 결정하기 위해, 항-NKG2D mAb 처리를 모든 대조군 Ig-처리된 마우스 가 질환으로 쓰러졌을 때인 8주 후 중단하였다. 항-NKG2D 요법을 중단한 지 4주 후에, 당뇨병 NOD 공여자로부터 T 세포를 받은 대부분의 NOD.scid 마우스에서 당뇨병이 발병되었다 (도 5d). 또한, 이 때 NOD.scid 마우스에서 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 NKG2D+ CD8+ T 세포의 팽창에 대한 증거가 있었다 (도 5e). 이들 결과는 항-NKG2D mAb 처리가 췌장에서 NKG2D+ CD8+ T 세포의 팽창 및/또는 축적을 억제하였음을 나타낸다. 요법을 중단한 직후 당뇨병으로의 신속한 진행은 항체 처리 동안 효과기 T 세포가 고갈되기보다는 제어되었음을 나타낸다.
항- NKG2D mAb 요법은 췌장에서 자가반응성 CD8 + T 세포의 팽창을 방지한다.
항-NKG2D 처리 마우스의 췌장에서 보다 적은 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포가 발견된 것은 mAb 요법이 자가반응성 T 세포의 팽창을 차단했다는 가능성과 일치하였다. 상기 가설을 직접 시험하기 위해, 8.3 TcR-트랜스제닉 T 세포를 CSFE로 표지하고, 10주령 NOD 수여자에 이입 전달하고 대조군 Ig 또는 항-NKG2D mAb로 처리하였다 (도 6). 전달 전에, 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD 마우스의 림프절 및 비장으로부터 공여자 CD8+ T 세포는 >90％ NRP-V7/H2Kd 테트라머 양성이었지만 NKG2D를 발현하지 않았다 (도 6a). 2일 후, 대조군 Ig로 처리된 마우스의 췌장에 침윤하는 전달된 CSFE-표지된 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD CD8+ T 세포는 NKG2D를 발현하였고 (도 6b) 이미 증식하고 있었지만; 췌장 또는 장간막 림프절 내에 존재하는 전달된 T 세포에서 CSFE의 희석은 관찰되지 않았다 (도 6c). 전달 4 및 8일 후, 대조군 Ig로 처리된 마우스의 췌장 및 췌장 림프절 내의 CFSE-표지된 8.3 TcR-트랜스제닉 T 세포는 광범위한 증식을 보였지만 장간막 림프절에서는 보이지 않았다 (도 6c). 이와 뚜렷이 대조적으로, NKG2D는 항-NKG2D mAb로 처리된 NOD 마우스의 췌장 내의 전달된 CSFE-표지된 8.3 TcR-트랜스제닉 CD8+ T 세포의 세포 표면 상에서 검출되지 않았다 (도 6b). 또한, 췌장에서 이들 세포의 팽창은 대조군 Ig로 처리된 마우스에 비해 실질적으로 억제되었다 (도 6c).
흥미롭게도, 항-NKG2D mAb로 처리하면 림프절 내의 세포에 비해 췌장에 침윤하는 CSFE-표지된 8.3 TcR-트랜스제닉 T 세포의 증식에 대해 훨씬 더 현저한 효과를 나타냈다. NRP-V7/H2Kd 테트라머를 사용하여 검출된 췌장 내의 내인성 CSFE-비표지 T 세포의 팽창은 또한 대조군 Ig 처리 마우스에 비해 항-NKG2D mAb를 사용하는 처리에 의해 감소되었다. 대조군 Ig 및 항-NKG2D mAb 처리 NOD 마우스에서 췌장에 침윤하는 이입 전달된 8.3 TcR-트랜스제닉 T 세포의 증식을 정량하면 자가반응성 항원-특이적 CD8+ T 세포의 팽창에 대한 항-NKG2D 요법의 현저한 효과를 보여주었다 (도 6d).
데이타는 RAE-1이 NOD 마우스의 당뇨병전기 췌장 소도에 존재하고, 췌장에 침윤하는 자가반응성 CD8+ T 세포가 NKG2D를 발현하는 것을 나타낸다. 당뇨병전기 동안 비-고갈 항-NKG2D 모노클로날 항체 (mAb)로 처리하면 자가반응성 CD8+ T 세포 의 팽창 및 기능을 손상시킴으로써 질환을 완전히 예방하였다. 이들 발견은 NKG2D가 질환 진행에 필수적이고 자가면역 I형 당뇨병에 대한 새로운 치료 표적을 제공하는 것을 증명한다. 이들 데이타는 NKG2D 수용체를 병원성 CD8+ T 세포의 효과기 기능의 기능 발달에 직접 관련시키고, 이는 항-NKG2D mAb가 수용체-매개 신호를 차단하여 치료 효과를 보이도록 기능함을 나타낸다.
실시예 4
shRNA에 의한 NKG2D의 세포 표면 발현의 조절
NKG2D 발현에 대한 억제성 RNA의 효과를 검사하기 위해 다음 실험을 수행하였다. IRES-eGFP 성분을 함유하는 벡터 내의 인간 NKG2D를 코딩하는 DNA를 CHO 세포 내로 안정하게 형질감염시켰다. 이어서 안정하게-형질감염된 NKG2D-발현 세포를 마우스 CD8 (mCD8)을 코딩하는 cDNA, 및 인간 NKG2D의 세그먼트 (shDNA03으로 지정됨)에 상동성인 22 염기쌍 (bp) cDNA (서열 10으로 설명된 5'-ggatgggact agtacacatt cc-3')를 함유한 플라스미드 (pCR2.1-TOPO 벡터, 인비트로겐 (InVitroGen))로 형질감염시켰다 (리포펙타민 (Lipofectamine) 및 표준 방법을 이용하여). 특이성을 증명하기 위한 대조군으로서, NKG2D 발현 CHO 세포를 또한 mCD8, 및 인간 NKG2D에 유사하지만 3개의 돌연변이된 뉴클레오티드를 갖는 22 bp cDNA (서열 13으로 설명된 5'-ggatgggatt agtatagatt cc-3')로 이중 형질감염시켰다. 좌측 패널 내의 세포는 마우스 CD8 cDNA (mCD8)를 함유하는 플라스미드로만 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 마우스 CD8에 대한 및 인간 NKG2D에 대한 모 노클로날 항체로 염색하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. (i) 마우스 CD8 대 인간 NKG2D 및 (ii) eGFP (인간 NKG2D-IRES-eGFP 벡터의 발현에 의한 고유한 녹색 형광) 대 인간 NKG2D를 나타내는 형광을 나타내는 이변량 점 플롯을 얻었다.
결과는 먼저 세포 표면 상에 마우스 CD8를 발현한 세포가 쉽게 검출될 수 있었음을 나타냈고, 이는 이들이 CHO 세포 내로 도입된 플라스미드로 형질감염되었음을 밝힌다. 또한, 마우스 CD8-발현 세포 상에서 인간 NKG2D의 발현은 마우스 CD8 플라스미드 단독 또는 돌연변이체 NKG2D 구성물을 함유하는 플라스미드를 사용하는 동시 형질감염에 의해 영향을 받지 않았다. 대조적으로, 상동성 NKG2D 서열을 사용하는 동시 형질감염은 NKG2D의 발현을 실질적으로 방지하였다.
실시예 5
항-NKG2D 모노클로날 항체 사용에 의한 세포-표면 NKG2D의 조절
NKG2D에 대해 작용하는 모노클로날 항체가 NKG2D의 세포 표면 발현을 조절하는 능력을 평가하기 위해 다음 실험을 수행하였다.
인간 NK 세포주 (NKL)를 30분 동안 얼음 상에서 비오틴-컨쥬게이션된 대조군 IgG (cIg bio) 또는 비오틴 컨쥬게이션된 마우스 항-인간 NKG2D mAb (알앤디 시스템즈 클론 149810)로 염색하고, 세척하고, 분취물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 배양 전에 (0h) 또는 배양 후에 (16h) 알로피코시아닌-컨쥬게이션된 스트렙타비딘으로 염색하고, 후속적으로 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 배양 후 61에 비해 배양 전 항-NKG2D 염색된 세포의 평균 형광 강도 (임의 단위)는 186이었고, 이는 16시간 동안 항-NKG2D mAb로 처리한 NK 세포의 세포 표면 상에서 NKG2D 발현의 67％ 감소를 나타낸다.
NKL 세포를 16시간 동안 37℃에서 대조군 IgG 또는 마우스 항-인간 NKG2D IgG (알앤디 시스템즈 클론 149810)와 함께 배양하였다. 인큐베이션의 끝에, 세포를 세척하고 표면 항체를 제거하기 위해 pH 3.5에서 산성 매질로 15분 동안 처리하였다. 이어서 세포를 표면 NKG2D를 검출하기 위해 항-NKG2D 항체에 이어 PE-표지된 염소 항-마우스 IgG 2차 항체로 염색하였다. 도 12는 상기 항-NKG2D 항체가 이들 인간 세포 상의 표면 NKG2D의 내재화를 자극하는데 효과적임을 보여준다.
실시예 6
NKG2D 차단은 F1 마우스에서 모골수 이식 거부반응을 예방한다.
동물 모델 시스템 (C57BL/6 x BALB/c) F1 (CB6F1) 마우스에서 하이브리드 저항 (F1 수여자에 의한 모골수 이식편의 거부) 발생에 대한 NKG2D 차단의 효과를 시험하기 위해 다음 실험을 수행하였다.
마우스
약 6-8 주령의 C57BL/6, BALB/c 및 CB6F1 마우스를 내셔날 캔서 인스티튜트 애니멀 프로그램 (National Cancer Institute Animal Program, 미국 매릴랜드주 프레데릭)으로부터 구입하였다. RAE-1ε 트랜스제닉 마우스를 생성하고 C57BL/6 배경 상으로 역교배시켰다 (Ehrlich et al., 미간행된 관찰). C57BL/6 배경에 대한 DAP12-/- 마우스 (역교배된 9 세대)는 문헌에 제시된 바 있고 (Bakker et al., Immunity, 13:345-353, 2000), DAP10-/-가 C57BL/6 배아 줄기세포로부터 생성되었다 (Phillips et al., 미간행된 관찰). 모든 실험은 동물 연구에 대한 UCSF 위원 회의 지침에 따라 수행하였다.
시약, 시토킨 및 항체
문헌 (Ogasawara et al., Immunity, 18:41-51, 2003)에 기재된 바와 같이 래트를 정제된 마우스 NKG2D 단백질로 면역화시켜 항-마우스 NKG2D mAb, 클론 CX5 (래트 IgG1 이소형)을 생성시켰다. 재조합 마우스 NKG2D 세포외 도메인 (알앤디 시스템즈)으로 면역화시킨 래트로부터의 B 세포와 마우스 골수종을 융합시켜 얻은 하이브리도마로부터 항-마우스 NKG2D, 클론 191004 (래트 IgG2a 이소형)를 생성시켰다. 모든 항-NKG2D mAb는 NKG2D 세포외 도메인을 인식하고, NKG2D의 그의 리간드에 대한 결합을 효율적으로 차단한다. 생체내 주사를 위해, 검출가능한 엔도톡신을 함유하지 않는 (<0.3 pg/주사) 정제된 항-NKG2D mAb CX5 및 항-NK1.1 mAb PK136을 사용하였다. 항-NKG2D mAb CX5는 생체 내에 주사될 때 NKG2D-보유 NK 세포 또는 T 세포를 고갈시키지 않는 차단 항체이다 (Ogasawara et al., Immunity, 20, 757-7567, 2004; Lodoen et al., J Exp Med, 197:1245-1253, 2003; 및 Lodoen et al., J Exp Med, 200:1075-108, 2004). 대조군 래트 IgG는 시그마로부터 구입하였다. 항-마우스 pan-RAE-1 mAb (클론 186107, 래트 IgG2b 이소형), 항-마우스 H60 mAb (클론 205310) 및 항-마우스 MULT1 mAb (클론 237104)는 문헌 (Lodoen et al., 상기 문헌, 2003; 및 Lodoen et al., 상기 문헌, 2004)에 기재된 바와 같이 생성시켰다. 다른 항체는 파밍겐 또는 이바이오사이언스로부터 구입하였다.
골수 이식
뮤린 골수를 문헌에 설명된 바와 같이 이식하였다 (George et al., J Immunol, 163:1859-1867, 1999). 간단히 설명하면, mAb 처리 (200 ㎍/마우스)는 골수 전달 2일 전에 수행하였고, 골수 세포 주사 1일 전에 NK 세포 매개 이식 거부반응을 촉진하기 위해 수여자를 폴리 I:C (시그마, 200 ㎍/마우스)로 처리하였다 (Murphy et al., J Exp Med, 166:1499-1509, 1987). 0일에, 마우스를 치사량 (11 Gy)의 137Cs 감마선에 노출시켜 방사선 조사한 후, 4 x 106 BM 세포에게 정맥내 주사하였다. 전달 5일 후에, 내인성 티미딘 합성을 억제하기 위해 마우스에게 26 ㎍의 5-플루오로-2'-데옥시우리딘 (시그마)을 정맥내 주사하였다 (George et al., 상기 문헌, 1999). 30분 후에, 마우스에게 3μ Ci의 5-[125I]요오도-2'-데옥시우리딘 (아머샴 라이프 사이언스 (Amersham Life Science, 미국 일리노이주 알링턴 하이츠)을 정맥내 주사하였다. 6일에, 비장을 수여자 마우스로부터 제거하여 감마 계수기로 계수하였다.
BM 키메라 마우스의 생성
간단히 설명하면, 1x107 Ly5.2 B6 BM 세포를 문헌 (Ogasawara et al., Nature, 391:701-703, 1998)에 기재된 바와 같이 NK 세포-고갈되고 방사선 조사된 수여자 마우스 (흡수된 방사선 선량 = 11 Gy) 내로 정맥내 전달하였다. 재구성 동안, 마우스를 항생제로 유지시켰다.
NK 세포의 제조
NK 세포는 문헌 (Ogasawara et al., J Immunol, 169:3676-3685, 2002)에 기재된 바와 같이 풍부화시켰다. 간단히 설명하면, 비장 세포를 항-마우스 CD4 mAb (클론 GK1.5) 및 항-마우스 CD8 mAb (클론 53-6.7)과 함께 인큐베이션한 후, 이들 세포를 염소 항-마우스 Ig 및 염소 항-래트 Ig으로 코팅된 자기 비드 (어드밴스트 마그네틱, 인크 (Advanced Magnetic, Inc), 미국 매사추세츠주 캠브리지)와 혼합하였다. CD4, CD8 및 표면 Ig (sIg)-양성 세포를 자기 세포 분리에 의해 제거하였다.
유동 세포측정 분석
인간 IgG1 Fc에 융합된 마우스 NKG2D (mNKG2D-Ig)의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 사용하여 NKG2D 리간드를 검출하였다 (Cerwenka et al., Immunity, 12:721-727, 2000). PE-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편 (잭슨 이뮤노리써치 (Jackson ImmunoResearch), 미국 펜실배니아주 웨스트 그로브)을 제2 단계 시약으로 사용하였다. 세포 (1 x 106)를 0.5 ㎍의 mNKG2D-Ig 및 0.25 ㎍의 다른 mAb로 염색하였다. 어떠한 NKG2D 리간드가 발현되었는지 결정하기 위해, 세포를 5개의 모든 공지된 RAE-1 단백질 (즉 RAE-1α, β, γ, δ 및 ε), 비오티닐화된 항-H60 mAb 또는 항-MULT1 mAb를 인식하는 비오티닐화된 항-pan RAE-1 mAb로 염색하였다. PE-컨쥬게이션된 스트렙타비딘 또는 APC-컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 비오티닐화된 mAb를 검출하기 위해 사용하였다. NKG2D 검출을 위해, 세포 (~1x106)를 0.25 ㎍ 비오티닐화된 또는 PE-표지된 항-NKG2D mAb (클론 191004)로 염색하였다. 세포를 항-CD43, 항-Ly6C/G, 항-CD11c, 항-B220, 항-CD3, 항-TER119, 항-NK1.1 및 항-CD49d (DX5) mAb로 동시염색하였다. 세포를 mAb와 함께 20분 동안 인큐베이션하고, 0.01 ％ NaN3을 함유하는 PBS로 세척하였다. FACS Calibur (벡톤 디킨슨) 유동 세포측정기를 사용하여 세포를 분석하였다. 생존하는 림프구 군집은 전방향 및 측면 산란 프로필을 기초로 하여 프로피듐 요오다이드 염색 결여에 의해 게이팅되었다.
세포독성 분석
모노클로날 항체-매개 재지정 (redirected) 세포독성 분석을 문헌 (Lanier et al., J Immunol, 141:3478-3485, 1988)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 10％ FCS를 포함하는 RPMI-1640 배지 중에서 37℃에서 2시간 동안 표적 세포를 50 μCi의 Na2(51Cr)04로 표지하고, 배지로 3회 세척하여 세포독성 분석에 사용하였다. 51Cr-표지된 표적 세포 (5 x 103) 및 효과기 세포를 나타낸 효과기/표적 (E/T) 비율로 96웰 마이크로타이터 플레이트의 U자 바닥 웰에서 3회 혼합하였다. 4시간의 인큐베이션 기간 후에, 세포가 없는 상등액을 수집하고, Micro-베타 계수기 (월락 (Wallac, 핀란드 터쿠))로 방사성을 측정하였다. 자연 방출은 최대 방출의 15％ 미만이었다. 특이적인 51Cr 방출 비율은 다음 식에 따라 계산하였다: ％ 특이적인 용해율 = (실험 - 자연)방출 x 100/(최대-자연)방출.
마우스 BM 세포 상에서 NKG2D 리간드의 발현
NKG2D 리간드를 코딩하는 유전자는 다형성이고, BALB/c (B/c) 마우스는 RAE-1α, β 및 γ 유전자를 갖고, C57BL/6 (B6) 마우스는 RAE-1δ 및 ε 유전자를 갖 는다 (Cerwenka and Lanier, Tissue Antigens, 61:335-343, 2003). 유사하게, B/c 마우스는 H60을 발현하지만 B6 마우스는 발현하지 않는다 (Malarkannan et al., J Immunol, 161:3501-3509, 1998). B/c, B6 및 (BALB/c x C57BL/6) F1 (CB6F1) 마우스로부터 단리된 BM 세포를 NKG2D 리간드가 BM 세포 상에서 발현되는지를 결정하기 위해 분석하였다. 세포를 마우스 NKG2D-IgG Fc 융합 단백질로 염색하고, 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 낮은 수준의 NKG2D 리간드가 새로 단리된 B/c BM 세포의 표면에서 검출되었지만, B6 BM 세포에서는 검출되지 않았다 (도 13a). NKG2D 리간드가 발현되었는지 조사하기 위해서, BM 세포를 항-pan RAE-1, 항-H60 및 항-MULT1 모노클로날 항체 (mAb)로 염색하였다. RAE-1 및 H60은 새로 단리된 B/c BM 세포 상에서 낮은 수준으로 발현되었지만, MULT1은 검출되지 않았다 (도 13b). 대조적으로, RAE-1은 B/c, B6 또는 CB6F1 마우스로부터 새로 단리된 비장세포 상에서 검출되지 않았다.
기존 연구는 F1 수여자의 NK 세포가 모골수 이식편을 거부할 수 있음을 확립하였다 (Kiessling et al., Eur J Immunol, 7:655-663, 1977; Lotzova et al., Transplantation, 35:490-494, 1983; Murphy et al., J Exp Med, 165, 1212-1217, 1987; 및 Murphy et al., Eur J Immunol, 20:1729-1734, 1990). 본 발명자들은 방사선 조사된 CB6F1 수여자에서 비장에 재군집하는 B/c BM 세포가 NKG2D 리간드를 발현한다고 생각하였다. 따라서, 본 발명의 연구 동안, 잔여 NK 세포를 고갈시켜 이식된 B/c BM 세포의 거부를 억제하기 위해 수여자 CB6F1 마우스를 항-NK1.1 mAb로 예비처리하였다. 대조군으로서, 일군의 방사선 조사된 CB6F1 마우스를 유전적 동계 CB6F1 BM 세포로 재구성하였다. 이식 7일 후에, CB6F1 마우스의 비장에서 재군집하는 조혈 세포를 단리하고 NKG2D 리간드의 발현에 대해 분석하였다. 도 13c에 도시된 바와 같이, NKG2D 리간드는 B/c BM -> CB6F1 마우스의 비장으로부터 단리된 조혈 세포 상에서 검출되었지만, CB6F1 BM -> CB6F1 마우스의 비장으로부터 단리된 세포에서는 검출되지 않았다. 방사선 조사된 CB6F1 수여자의 비장을 재구성하는 B/c 조혈 세포는 RAE-1을 우세하게 발현하였지만, H60 또는 MULT1은 발현하지 않았다 (도 13d).
RAE-1을 발현한 조혈세포의 군집을 확인하기 위해서, CB6F1 BM -> CB6F1 및 B/c BM -> CB6F1 수여자의 비장으로부터 단리된 세포를 조혈계 마커에 대한 mAb로 염색하였다. 이식 후 7일에, RAE-1는 CB6F1 BM -> CB6F1 수여자의 비장으로부터 단리된 대다수의 세포 상에서 검출되었다. 이와 대조적으로, RAE-1은 CB6F1 BM -> CB6F1 수여자의 비장으로부터 단리된 실질적인 비율의 세포 상에서 검출되지 않았다. B/c BM -> CB6F1 수여자로부터 단리된 본질적으로 모든 RAE-1-양성 세포는 CD43을 발현하였다 (도 13e). RAE-1은 과립구-관련 Gr-1 (Ly-6C/G) 단백질 및 골수 세포-관련 마커 CD11b (Mac-1)를 발현하는 대부분의 세포 상에도 존재하였다. 단지 작은 분획의 B220 (B 세포-관련 마커)-양성 세포 및 Ter119 (적혈구-관련 마커)-양성 세포가 RAE-1을 발현하였고, RAE-1은 CD3+ T 세포 상에서 검출되지 않았다 (도 13e). T 세포 또는 B 세포는 이식 후 1주 미만 내에 공여자 골수 세포로부터 발생할 가능성이 없기 때문에, 비장에서 검출된 B 세포 및 T 세포는 숙주 기원의 잔류하는 방사선 저항 세포인 것으로 생각된다. RAE-1은 c-kit 및 Sca-1을 발현하는 세포의 작은 서브세트 상에서 검출되었지만, 대부분의 RAE-1-양성 세포는 이들 마커를 갖지 않았다 (도 13f). B/c BM -> CB6F1 수여자에서 RAE-1을 발현하는 세포의 증식 상태는 이식 7일 후에 비장 세포를 회수하기 2시간 전 및 12시간 전에 BrdU를 이들 마우스에 주사함으로써 평가하였다. 도 13g에 도시된 바와 같이, RAE-1은 이식편 수여자의 비장에서 증식 전구세포의 큰 비율 (전부는 아니지만) 상에서 쉽게 검출되었다.
초기 실험에서, CB6F1 마우스에 B/c 공여자로부터 단리된 전체 골수를 이식하였다. RAE-1가 조혈 줄기세포 (HSC)의 자손체 상에서 발현되는지를 조사하기 위해서, HSC를 풍부하게 하기 위해 골수 수거 전에 공여자 B/c 마우스를 5-플루오로우라실 (5-FU)로 처리하고, 잔여 숙주 NK 세포를 고갈시키기 위해서 항-NK1.1 mAb로 예비처리된 CB6F1 수여자에게 5-FU-처리된 공여자로부터의 골수를 이식하였다. 5-FU-처리된 공여자로부터 수거된 골수 세포는 RAE-1을 발현하지 않았다. B/c 5-FU BM -> CB6F1 수여자의 비장 세포를 이식 8일 후에 분석할 때, 본질적으로 모든 RAE-1-양성 세포는 Ly-6C/G, CD11b 및 CD43을 발현하였지만, CD3, Ter119 또는 B220은 발현하지 않았다. 작은 집단의 RAE-1-양성 세포는 낮은 수준의 c-kit 및 Sca-1을 발현하였지만, 대다수의 RAE-1-양성 세포에는 이들 마커가 모두 결여되었다 (도 13i). 이들 결과는 NK 세포 고갈된 CB6F1 수여자에서 대다수의 증식 B/c 전구세포가 RAE-1을 발현함을 나타내었다.
본 발명의 개발 이후에, 증식 인간 골수 세포 상에서 NKG2D 리간드의 발현이 보고되었다 (Nowbakht et al., Blood, 2005년 1월 18일 전자 출판됨). 따라서, 본 발명자들은 본원에서 설명된 마우스에서의 실험이 또한 인간 (및 다른 포유동물)에도 관련되는 것으로 생각한다.
NKG2D 는 하이브리드 저항에 관련된다.
본 발명의 연구 동안, RAE-1이 B/c 골수로 재구성된 CB6F1 마우스의 비장에서 증식 전구세포 상에서 발현된다는 발견은 본 발명자들에게 NKG2D가 하이브리드 저항에 관련됨을 제시하였다. 이것은 대조군 항체 (cIg), 중화 비-고갈 항-NKG2D mAb (CX5) (Ogasawara et al., Immunity, 20:757-767, 2004) 또는 NK 세포-고갈 항-NK1.1 mAb (PK136)로 예비처리된 방사선 조사된 CB6F1 마우스 내로 B/c BM 세포의 전달에 의해 확인하였다. 수여자 마우스의 조혈세포 재구성은 7일에 비장 회수 12시간 전에 125IUdR을 주사하여 평가하였다. cIg-처리된 마우스는 B/c BM 세포를 거부하였고, 기존 보고 (Lotzova et al., Transplantation, 35:490-494, 1983)와 일치하게 CB6F1 마우스에서 NK 세포의 고갈은 B/c 골수 세포의 거부를 효율적으로 억제하고, 이것은 비장에서 방사성 표지의 도입을 실질적으로 증가시켰다 (도 14a). 비-고갈, 중화 항-NKG2D mAb도 고갈 NK 세포의 효과에 견줄 정도로 125IUdR의 도입을 크게 증가시켰다.
항-NKG2D mAb 처리가 B/c 골수 세포의 거부를 억제하는 능력은 이식 후 8일에 비장에서 재군집하는 세포를 조사하여 확인하였다. 도 14b에 도시된 바와 같이, CD43, Ly-6C/G 및 CD11b를 우세하게 동시 발현하는 RAE-1-양성 세포는 항- NKG2D mAb로 처리된 CB6F1 마우스의 비장에서 검출되었다. 이와 대조적으로, 훨씬 더 적은 세포가 cIg-처리된 마우스에서 회복되었고, 이들 세포 중 매우 적은 세포가 RAE-1을 발현하였다. 이들 데이타는 CB6F1 마우스에서 RAE-1-양성 B/c BM 세포의 거부가 NK 세포의 고갈 또는 NKG2D 수용체의 차단에 의해 효율적으로 억제됨을 나타내었다.
NK 세포는 높은 수준의 RAE -1을 발현하는 유전적 동계 BM 세포를 제거한다.
항-NKG2D mAb 처리가 F1 수여자에서 모골수 융합의 거부를 차단하는 능력은 F1 NK 세포에 의한 모 H-2의 인식이 NKG2D-의존 거부에 필요한지 또는 RAE-1가 충분히 높은 수준으로 발현될 경우 NK 세포가 유전적 동계 골수 세포도 거부할 수 있는지에 대한 의문을 제기하였다. 유전적 동계 방사선 조사된 CB6F1 수여자에서 재군집하는 CB6F1 골수 세포 (도 13c, e) 및 유전적 동계 방사선 조사된 B6 수여자에서 재군집하는 B6 골수 세포는 B/c 재군집 골수 세포 (도 13d, e)에 비해 단지 낮은 수준의 RAE-1을 발현하였다. 따라서, B6 또는 CB6F1 골수 세포 상에서 RAE-1의 발현이 유전적 동계 골수 이식편의 거부를 야기하는지 조사하기 위해서, 인간 β-액틴 프로모터에 의해 유도되는 RAE-1ε을 발현하여 모든 조직에서 RAE-1ε을 발현하는 트랜스제닉 마우스를 생성시켰다. 도 15a에 도시된 바와 같이, B6 RAE-1ε 트랜스제닉 마우스로부터 새로 단리된 골수 세포 상에서 RAE-1ε의 발현 수준은 재군집 B/c 골수 세포 상에 존재하는 RAE-1의 수준과 유사하였다 (도 13d, e).
RAE-1ε 트랜스제닉 B6 마우스로부터 새로 단리된 골수 세포는 표준 시험관내 세포독성 분석에서 IL-2-활성화된 유전적 동계, 비트랜스제닉 NK 세포에 대한 표적으로서 시험하였다. 도 15b에 도시된 바와 같이, 활성화된 NK 세포가 새로 단리된 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 골수 세포를 치사시켰으나, RAE-1-음성 비트랜스제닉 B6 골수 세포는 치사시키지 않았다. 세포독성은 항-NKG2D mAb에 의해 차단되었고, 이는 치사가 NKG2D에 의존적임을 의미한다. 시험관내 결과에 따르면, 방사선 조사된 비트랜스제닉 B6 마우스는 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 공여자로부터의 골수 세포를 거부하였다. 중요하게는, 중화 항-NKG2D mAb로 처리된 마우스에서 거부가 억제되었으나, 대조군 Ig로 처리된 마우스에서는 억제되지 않았다 (도 15c). RAE-1ε 트랜스제닉 B6을 B/c 마우스와 교배시키고 RAE-1ε 트랜스제닉 CB6F1 골수를 비트랜스제닉 CB6F1 수여자에게 이식할 때 유사한 결과를 얻었다. 비트랜스제닉 CB6F1 골수 세포와는 달리 (도 13c, e), RAE-1ε 트랜스제닉 CB6F1 골수 세포는 높은 수준의 RAE-1ε을 발현하였고, 유전적 동계 비트랜스제닉 CB6F1 수여자에 의해 거부되었다 (도 15d). 거부는 중화 비-고갈 항-NKG2D mAb의 투여에 의해 또는 항-NK1.1 mAb를 갖는 NK 세포의 고갈에 의해 억제되었다. 전체적으로, 상기 발견은 골수 세포가 RAE-1을 발현하면 B6 및 CB6F1 NK 세포가 H-2 동일 골수 세포를 거부할 수 있음을 입증한다.
NKG2D -매개 BM 거부에서 DAP10 및 DAP12
마우스에서, NKG2D 전사체의 선택적 RNA 스플라이싱은 NKG2D-S 및 NKG2D-L로 불리는 2개의 단백질 이소형을 생성시킨다. NKG2D-L은 휴지 NK 세포에서 우세하게 발현되고 DAP10 어댑터 단백질과 회합하고, NKG2D-S는 NK 세포의 활성화에 의해 유도되고 DAP10 또는 DAP12와 회합한다 (Diefenbach et al., Nat Immunol, 3:1142- 1149, 2002). RAE-1ε 트랜스제닉 B6 마우스로부터의 골수 세포는 DAP10 또는 DAP12 또는 두 어댑터 모두가 NKG2D-매개 거부에 관련되는지를 결정하기 위해서 방사선 조사된 야생형, DAP10-/- 및 DAP12-/- C57BL/6 수여자에게 이식된다. 마우스에게 5일에 125IUdR을 주사하고, 비장을 6일에 회수하고 계수하였다. 야생형 B6 마우스에 비해, DAP10-/- B6 마우스는 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 골수 이식편 거부가 유의하게 결여되었다 (도 16a). 대조적으로, DAP12-/- B6 수여자는 야생형 B6 마우스보다 경미하게 더 작았지만 DAP10-/- B6 마우스보다 더 효율적으로 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 골수를 거부하였다 (도 16b). 야생형, DAP10-/- 및 DAP12-/-B6 마우스는 고갈 항-NK1.1 mAb 또는 비-고갈, 중화 항-NKG2D mAb로 처리시에 모두 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 골수 이식편 거부에 실패하였다. 상기 결과는 NKG2D-의존 골수 거부시에 DAP10의 우세한 역할 및 DAP12의 작은 역할을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 실행을 위해 메카니즘에 대한 이해는 필요하지 않다.
RAE -1ε 트랜스제닉 마우스에서 결함 하이브리드 저항
NOD 마우스로부터 NK 세포의 활성화는 RAE-1의 발현을 유도하여 NK 세포 상의 NKG2D의 리간드-의존 조절을 야기한다 (Ogasawara et al., Immunity, 18, 41-51,2003). RAE-1ε 트랜스제닉 B6 마우스로부터의 NK 세포의 표면 상의 NKG2D의 발현 분석을 통해 야생형 마우스로부터의 NK 세포에 비해 NKG2D의 발현이 감소됨이 밝혀졌다 (도 17a). RAE-1ε 트랜스제닉 B6 상의 NKG2D의 양이 실질적으로 감소하지만, 비장에서 NK 세포의 수 및 NK 세포 상의 NK1.1, Ly-49D, Ly-49A, Ly-49C/I, Ly-49F/I/C/H 및 Ly-49G2의 발현은 야생형 NK 세포와 유사하였다. NKG2D 기능이 RAE-1ε 트랜스제닉 NK 세포에서 손상되는지 조사하기 위해, cIg, 항-NKG2D mAb 및 항-NK1.1 mAb를 사용하여 항체-재지정 세포독성 분석을 수행하였다. RAE-1ε 트랜스제닉 NK 세포의 NK1.1-의존 세포독성 활성은 야생형 B6 NK 세포와 동일하였지만, NKG2D-의존 세포독성은 RAE-1ε 트랜스제닉 NK 세포에서 손상되었다 (도 17b).
RAE-1ε 트랜스진은 이들 트랜스제닉 마우스에서 β-액틴 프로모터에 의해 유도되고, 따라서 이들 동물의 NK 세포는 리간드와 수용체를 동시발현한다. 야생형 (비트랜스제닉) NK 세포가 NKG2D 리간드에 일정하게 노출시에 생체 내에서 불활성화되는지 조사하기 위해서, 야생형 Ly5.2 유사유전자형 B6 골수를 치사량의 방사선이 조사된 RAE-1ε B6 (Ly5.1) 트랜스제닉 수여자에게 이식하여 골수 키메라를 생성시켰다. 이식 3달 후, Ly5.2 BM -> RAE-1ε 트랜스제닉 마우스에서 비장 내의 NK 세포의 수 및 NK1.1 (도 17c), Ly-49D, Ly-49A, Ly-49 C/I, Ly-49F/I/C/H 및 Ly-49G2의 발현은 Ly5.2 BM -> 야생형 B6 마우스에서와 유사하였다. 이와 대조적으로, NK 세포 상의 NKG2D 발현은 Ly-5.2 BM -> RAE-1ε 트랜스제닉 마우스에서 크게 감소하였다 (도 17c). NK 세포 상의 NKG2D의 감소된 수준과 일치하게, NKG2D-의존 세포독성 활성은 시험관내 항체-재지정 세포독성 분석에서 결정된 Ly-5.2 BM -> RAE-1ε 트랜스제닉 마우스에서 손상되었다 (도 17d). 또한, 본 발명자들은 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 BM 세포가 Ly-5.2 B6 BM -> RAE-1ε B6 트랜스제닉 수여자에서 거부되었는지를 조사하였다. 예상된 바와 같이, 야생형 Ly5.2 B6 -> 야생형 B6 마우스에서 NK 세포는 RAE-1ε 트랜스제닉 BM 세포를 효율적으로 거부하였다 (도 17e). 이와 대조적으로, Ly-5.2 B6 BM -> RAE-1ε 트랜스제닉 마우스에서 발생한 NK 세포는 RAE-1ε 트랜스제닉 BM 세포 거부에 실패하였다 (도 17). 이러한 발견은 NK 세포의 NKG2D 조절이 생체 내에서 세포를 발현하는 방사선 저항성 수여자 RAE-1과의 상호작용에 의해 야기되고 이에 의해 생체내 NKG2D 기능을 손상시킨다는 것을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 실행을 위해 메카니즘에 대한 이해는 필요하지 않다.
F1 하이브리드 저항이 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 마우스에서 NK 세포 상의 NKG2D의 감소된 수준에 의해 영향받는지 조사하기 위해서, 트랜스제닉 마우스를 B/c 마우스와 교배시키고, RAE-1ε 트랜스제닉 CBF1 마우스를 모 B/c BM 세포 거부 능력에 대해 시험하였다. 야생형 CB6F1 마우스와 달리, RAE-1ε 트랜스제닉 CB6F1 마우스는 B/c BM 세포 거부에 실패하였다 (도 17f). 또한, 항-NK1.1 mAb 또는 항-NKG2D mAb를 사용한 처리는 RAE-1ε 트랜스제닉 CB6F1 수여자에서 B/c BM 세포의 125IUdR 흡수에 영향을 주지 않았다. 그러나, NK 세포의 고갈 또는 NKG2D의 차단은 야생형 CB6F1 수여자에서 B/c 골수 세포의 융합을 허용하였다. 따라서, 본원에서 입증되는 바와 같이, NKG2D는 F1 하이브리드 저항에 중요한 성분으로서 관련된다.
실시예 7
류마티스성 관절염의 예방 및 치료를 위한 NKG2D 차단
이것은 NKG2D가 염증 부위에 존재하는 것을 입증할 수 있는 관절염의 만성 동물 모델에서 시험할 수 있다. 상기 모델의 예는 만성 콜라겐 유도 관절염이다 (Malfait et al., Arthritis and Rheumatism 44:1215-1224, 2001).
최근에, 인간 류마티스성 관절염 환자의 말초 혈액 및 윤활 조직에서 CD4+CD28- T 세포는 NKG2D를 발현하는 것으로 밝혀진 반면, 염증이 발생한 윤활막 세포는 NKG2D의 MIC 리간드를 이상 발현하는 것으로 밝혀졌다 (Groh et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100:9452-9457, 2003). 따라서, 본 발명자들은 본원에서 설명된 바와 같은 NKG2D 차단을 위한 조성물 및 방법이 류마티스성 관절염의 예방 및 치료에도 적합한 것으로 생각하였다. 다음 실험은 동물 모델 시스템 DBA/1 마우스에서 류마티스성 관절염 (RA)의 발생에 대한 NKG2D 차단 효과를 시험하기 위해 수행하였다.
간단히 설명하면, 콜라겐 타입 II (CII)-유발 관절염 (CIA)는 문헌 [Seo et al., Nat Med, 10:1088-1094, 2004]에 기재된 바와 같이 완전 프로인트 보강제에 유화된 2.0 mg/ml의 미코박테리아 튜베르큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis) H37RA로 보충된 100 ㎍ 소 콜라겐 II의 피내 꼬리 기부 주사에 의해 6 내지 7주령 수컷 DBA/1 마우스에서 유발하였다. 관절염은 1 내지 4로 점수를 매기고, 마우스당 최대 점수는 16이었다. 관절염의 임상 심도는 다음과 같이 등급을 매긴다: 0, 정상; 1, 가벼운 부기 및/또는 홍반; 2, 실질적인 부종성 부기; 3, 실질적인 부종성 부기 + 가벼운 관절 경직; 또는 4, 이완증 (예를 들어, Williams et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89:9784-9788, 1992 참조). 각각의 팔다리에 대해 점수를 매기고, 최대 임상 점수는 각 동물에 대해 16이었다. 뒷발의 부기는 한쌍의 캘리퍼 스로 측정하였다.
면역화 후 0, 2, 4, 6 및 8일 또는 0, 3, 7 및 10일에 마우스에게 200 ㎍의 항-NKG2D mAb 또는 대조군 이소형-매칭된 mAb를 IP 주사하였다. 본 발명자들은 대조군 IgG 처리가 면역화 후 약 28일로부터 시작하여 중증의 관절염 (예를 들어, 심도 10 초과; 발생률 80％ 초과, 발 두께 3.5 mm 초과) 발생을 야기한다고 생각한다. 이와 대조적으로, 항-NKG2D mAb 처리는 대조군 mAb-처리된 동물에 비해 관절염 심도 및 발생률의 감소, 및 발 두께의 감소 및 관절 조직의 병적 변화의 감소 (예를 들어, 심도 10 미만, 바람직하게는 5 미만, 가장 바람직하게는 2 미만; 발생률 80％ 미만, 바람직하게는 50％ 미만, 가장 바람직하게는 20％ 미만; 및 발 두께 3.5 mm 미만, 바람직하게는 3.0 mm 미만, 가장 바람직하게는 2.5 mm 미만)를 보이는 질환의 억제를 야기할 것으로 예상된다.
확립된 CIA를 치료하기 위해서, 면역화 후 28, 30, 32, 34 및 36 또는 28, 31, 35 및 38일에 마우스에게 주사하였다. 이어서, 마우스를 면역화 후 28일에 동일한 평균 관절염 점수를 갖는 2개의 군으로 나누고, 면역화 후 28, 30, 32, 34 및 36일에 대조군 mAb 또는 항-NKG2D mAb로 처리하였다. 관절염은 항-NKG2D mAb-처리된 군에서만 회복되는 것으로 생각된다 (예를 들어 질환 심도, 발생률, 발 두께 및 관절 조직의 병적 변화의 감소). 또한, 본 발명자들은 항-NKG2D mAb 처리가 관절염 환자의 관절에 존재하는 NKG2D-발현 세포수의 감소 및 활액 내의 염증성 시토킨 (예를 들어 TNF-α, IL-15 등)의 감소를 야기할 것으로 생각한다.
실시예 8
복강 질환의 예방 치료를 위한 NKG2D 차단
MIC는 복강 질환 (CD) 환자에서 창자 상피 표면에서 강하게 발현되고, 이는 다시 NKG2D를 통해 상피내 T 림프구 (IEL)에서 동시 활성화되어 상피세포 표적의 세포용해를 야기한다 (Meresse et al., Immunity, 21:357-366, 2004; 및 Hue et al., Immunity, 21:367-377, 2004). 본 발명자들은 본원에서 설명된 NKG2D의 차단을 위한 조성물 및 방법이 복강 질환의 예방 및 치료에도 적합하다고 생각한다. 염증성 장질환 (IBD) 발생에 대한 NKG2D 차단의 효과는 적합한 작은 동물 모델, 예를 들어 두개의 대장염 마우스 모델인 SCID 마우스에서 TNB 유발 모델 (Chin et al., Digestive Diseases and Sciences 39:513-525, 1994) 또는 T 세포 전달된 모델 (Powrie et al., Int Immunol 5:1461 et seq., 1993)의 하나에서 시험될 것이다.
본원에서 언급된 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고 문헌은 각각의 문헌이 개별적으로 및 특이적으로 본원에 참고로 포함된 것으로 언급되고 그 전부가 (법률이 허용하는 최대 수준까지) 본원에 제시된 바와 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 모든 표제 및 하위 표제는 단지 편의상 본원에 사용되고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 이해하지 않아야 한다. 그의 모든 가능한 변형에서 상기한 성분의 임의의 조합은 본원에서 달리 표시되지 않거나 그와 반대되는 의미를 분명하게 제시하지 않는 한 본원에 포함된다.
본 발명의 설명시에 (특히 하기 청구의 범위에서) 용어 부정관사 ("a" 및 "an") 및 정관사 ("the") 및 유사한 지시어의 사용은 본원에서 달리 표시되지 않거 나 그와 반대되는 의미를 분명하게 제시하지 않는 한 단수 및 복수 모두를 포함하는 것이다. 본원에서 언급하는 수치 범위는 본원에서 달리 표시되지 않으면 단지 그 범위 내에 포함되는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 포괄적인 방법으로서 사용되는 것을 의도하고, 각각의 별개의 값은 본원에 개별적으로 언급되는 것처럼 본원 명세서에 포함된다. 달리 언급되지 않으면, 모든 정확한 수치는 대응하는 근사치를 나타낸다 (예를 들어, 특정 팩터 또는 측정치에 대해 제시된 모든 정확한 예시적인 수치는 또한 적절한 경우 "약"으로 변형된, 대응하는 근사 측정치를 제공하는 것으로 생각될 수 있다). 본원에서 설명되는 모든 방법은 본원에서 달리 표시되지 않거나 그와 반대되는 의미를 분명하게 제시하지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 임의의 모든 예 또는 예시적인 용어 (예를 들어 "예를 들어")의 사용은 달리 청구되지 않는 한 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위에 대한 제한을 제시하는 것이 아니다. 본원의 어떠한 용어도 본 발명의 실시에 있어서 필수적인 임의의 청구되지 않은 성분을 나타내는 것으로서 이해하지 않아야 한다. 본원에서 특허 문헌은 단지 편의상 인용 및 포함된 것이며, 특허 문헌의 유효성, 특허성 및/또는 강제집행성을 반영하는 것은 아니다.
특정 성분을 "포함하는", "갖는" 또는 "함유하는"과 같은 용어를 사용하여 본 발명의 측면 또는 실시태양을 본원에서 설명하는 것은 본원에서 달리 표시되지 않거나 그와 반대되는 의미를 분명하게 제시하지 않는 한 특정 성분으로 "이루어지는', "본질적으로 이루어지는' 또는 특정 성분을 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 측면 또는 실시태양에 대한 지지를 제공하고자 한 것이다. 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용되는, 본원에 첨부되는 청구항에 제시된 특허청구 대상의 모든 변형 및 동등물을 포함한다.
도 1은 당뇨병전기 NOD 마우스에서 췌장 세포 상의 RAE-1 발현의 그래프이다. 도 1(a)는 12 내지 16주령 NOD 및 BALB/c 마우스의 췌장 조직에서 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 RAE-1 mRNA를 보여준다. 도 1(b)는 4 내지 6주령 및 12 내지 16주령의 NOD 및 NOD.scid 마우스의 췌장 조직에서 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 RAE-1 mRNA를 보여준다. 도 1(c)는 당뇨병전기 NOD의 상이한 조직에서 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 RAE-1 mRNA를 보여준다. 대표적인 데이타를 RAE-1 전사의 유도 배수 (fold-induction)로서 표현하고 나타낸다. 유도 배수는 다음 식에 따라 계산하였다: 유도 배수 = HPRT로 표준화된 당뇨병전기 NOD 기관에서 RAE-1 전사체의 양을 HPRT로 표준화된 어린 NOD 기관에서 RAE-1 전사체의 양으로 나눈 값. 도 1(d)는 항-CD45 및 항-RAE-1 mAb를 사용하는 유동 세포측정에 의해 분석된 CD45-NOD 췌장 세포 상의 RAE-1 발현을 보여준다. 도 1(e)는 항-CD45 및 항-RAE-1 mAb로 염색된 NOD 마우스에서 췌장 (상부 패널) 및 유출 췌장 림프절 (PLN) (하부 패널)로부터 단리된 CD45-섬세포 상의 RAE-1 발현을 보여준다.
도 2(a)는 CD8+ T 세포 상의 NKG2D 발현의 그래프이다. 10주령 및 25주령 NOD 마우스의 비장, 간, 췌장 림프절 (PLN) 및 췌장으로부터 백혈구를 단리하고, CD8 및 NKG2D에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 표준 방법에 의해 염색하였다. NKG2D+ CD8+ T 세포의 표시된 백분율 (총 CD8+ T 세포의 백분율으로서 표현됨)을 나타낸다. 도 2(b)는 췌장 및 PLN NKG2D+ CD8+ T 세포 상의 CD44 및 Ly-6C의 발현 그 래프이다. 세포는 CD8, NKG2D, 및 CD44 또는 Ly6C에 대한 모노클로날 항체로 염색하였고, 결과를 CD8+ T 세포에 대해 나타낸다. 도 2(c)는 췌장 및 PLN NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포 상의 NKG2D 및 CD44의 발현 그래프이다. 세포는 NRP-V7/H-2Kd 테트라머로, 및 CD8 및 CD44 또는 NKG2D에 대한 모노클로날 항체로 염색하였다. NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포의 표시된 백분율 (CD8+ T 세포 상에 게이팅된)을 나타낸다. 도 2(d)는 섬세포 근처에 축적된 NKG2D+ CD8+ T 세포의 현미경사진이다. 16주령 당뇨병전기 NOD 마우스로부터 단리된 췌장의 순차적 냉동 절편을 항-CD8, 항-CD68 (대식세포 마커), 항-NKG2D 및 항-인슐린 항체로 염색하였다. 좌측: 위상차 시계열 영상, 중앙: CD8 (적색), NKG2D (녹색), 및 인슐린 (청색); 우측: CD68 (적색), NKG2D (녹색), 및 인슐린 (청색). 이중-양성 CD8+ NKG2D+ T 세포 및 CD68+ NKG2D+ 대식세포는 황색이다.
도 3(a)는 당뇨병이 발병한 NOD 마우스 집단에 대한 7 내지 25주령의 항-NKG2D mAb를 사용하는 처리 효과의 그래프이다. 어두운 원: 항-NKG2D mAb로 처리된 NOD 마우스 (n=7) (200 ㎍/마우스 IP로 1주 2회); 밝은 원, 무균 비-발열원성 PBS로 처리된 NOD 마우스 (n=7). 당뇨병은 혈당 수준이 2회 연속 측정에서 300 mg/dL보다 클 때 진단되었다. 도 3(b)는 도 3a에 나타낸 동물에서 6주 내지 40주령에서 매주 측정된 혈당 수준의 그래프이다. 도 3(c)는 후기 당뇨병전기 단계에 서 항-NKG2D mAb로 처리한 후 당뇨병이 발병한 NOD 마우스의 비율의 그래프이다. NOD 마우스는 13주령부터 25주령에서 항-NKG2D mAb (200 ㎍/마우스 IP로 1주 2회, 어두운 원; n=14) 또는 대조군 Ig (밝은 원; n=14)로 처리하였다. 25주령에서, 7마리의 항-NKG2D mAb-처리된 마우스는 30주령까지 계속 처리하였다 (어두운 삼각형). 도 3(d)는 도 3c에 나타낸 동물에서 12주령부터 36주령에서 매주 측정된 혈당 수준의 그래프이다.
도 4(a)는 항-CD8, 항-NKG2D, 및 항-CD44로 염색하고 유동 세포측정한 대조군 Ig (cIg) 또는 항-NKG2D mAb (7주령에서 시작하여 200 ㎍/마우스 IP 1주 2회)로 처리한 11주령 NOD 마우스의 췌장 및 췌장 림프절에 침윤하는 백혈구의 분석 그래프이다. 도시된 결과는 CD8+ T 세포 상에 게이팅된다. 도 4(b)는 7주령부터 대조군 Ig로 처리한 16주령 NOD 마우스의 췌장 섬세포의 현미경사진이다. 대조군 Ig로 처리한 16주령 NOD 마우스로부터 냉동 췌장 절편을 제조하고 염색하였다. 좌측: DAPI (핵) 염색; 우측: CD8 (적색), NKG2D (녹색) 및 인슐린 (청색). 도 4(c)는 패널 (b)에서와 같이 제조하고 염색된, 7주령부터 항-NKG2D mAb 처리 (200 ㎍/마우스 IP 1주 2회)로 처리한 16-주령 NOD 마우스의 췌장 섬세포의 현미경사진이다. 도 4(d)는 췌장에서 자가반응성 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포의 축적에 대한 항-NKG2D 항체 처리 효과의 그래프이다. 백혈구를 13주령부터 항-NKG2D mAb (200 ㎍/마우스 IP 1주 2회) 또는 대조군 Ig로 처리한 18주령 NOD 마우스의 췌장 및 PLN으로부터 단리하였다. NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포의 표시된 백 분율 (CD8+ T 세포 상에 게이팅된)을 나타낸다. 도 4(e)는 대조군 Ig 또는 항-NKG2D (200 ㎍/마우스 IP 1주 2회, NRP-V7/H-2Kd 테트라머 및 항-CD8 mAb로 염색된)로 처리한 마우스에서 비장 및 말초 혈액으로부터 림프구의 그래프이다. 표시된 백분율은 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 세포 (CD8+ T 세포 집단 상에 게이팅된)이었다. 도 4(f)는 지시된 바와 같이 13주령에서 시작하여 대조군 Ig (cIg) 또는 항-NKG2D (200 ㎍/마우스 IP 1주 2회)로 처리한 25주령 NOD 마우스로부터 단리되고 PMA (20 ng/ml) 및 이오노마이신 (500 ng/ml) 및 브레펠딘 A (5 ㎍/ml)과 함께 6시간 동안 배양된 췌장 림프절 세포의 그래프이다. 세포내 IFN-γ는 CD8+ T 세포에서 면역형광 염색 및 유동 세포측정에 의해 검출하였다.
도 5는 NOD.scid 수여자 내로 NOD T 세포의 이입 (adoptive) 전달 실험으로부터 유동 세포측정법 측정치의 그래프이다. 도 5(a)는 NOD T 세포를 이식한 NOD.scid 마우스의 췌장, PLN 및 비장 내의 NKG2D+ CD8+ T 세포를 보여준다. 이입 전달에 앞서, 당뇨병 NOD 공여자로부터 정제된 T 세포를 항-CD8 및 항-NKG2D로 염색하였다 (a, 상부 좌측 패널). 전달 5주 후, 췌장, PLN 및 비장으로부터 회수한 세포를 항-CD8 및 항-NKG2D (a, 상부 패널) 또는 항-NKG2D 및 항-CD44 (a, 하부 패널)로 염색하였다. NKG2D+ CD8+ T 세포의 백분율 (CD8+ T 세포 상에 게이팅된)을 나타낸다. 도 5(b)는 전달 시기에 시작하여 항-NKG2D mAb (200 ㎍/마우스 IP 1주 2회) 또는 대조군 Ig로 처리하고 전달 10주 후 분석된 당뇨병 NOD 마우스로부터, 이입 전달된 T 세포를 받은 NOD.scid 마우스에서 자가반응성 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포의 축적을 도시한 것이다. 살아있는 세포 상에 게이팅된 자가반응성 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포의 표시된 백분율을 검출하였다. 도 5(c)는 CD8+ T 세포 상에 게이팅된, 이들 동일한 처리 마우스로부터 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 T 세포 상의 NKG2D의 검출을 보여준다. 도 5(d)는 당뇨병이 발병한 당뇨병 NOD 마우스로부터 T 세포를 이식시킨 NOD.scid 마우스의 비율의 그래프이다. 이입 전달된 T 세포를 당뇨병 NOD 마우스로부터 받은 5주령 NOD.scid 마우스를 5주령부터 14주령까지 항-NKG2D mAb (어두운 원; n=6) 또는 대조군 Ig (밝은 원; n=7)로 처리하였다. 마우스에 200 ㎍ 항-NKG2D mAb CX5를 1주 2회 복강내 주사하였다. 혈당 수준이 2회 연속 측정에서 300 mg/dL보다 클 때 당뇨병으로 진단되었다. 도 5(e)는 항-NKG2D mAb를 사용하는 처리를 중단한 후 자가반응성 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 CD8+ T 세포의 팽창의 그래프이다. 당뇨병 NOD 마우스로부터 T 세포를 이식시킨 NOD.scid 마우스에서 항-NKG2D mAb 처리를 중단한 4주 후, 동물을 희생시키고 췌장을 NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성, NKG2D+ CD8+ T 세포에 침윤하는 것에 대해 분석하였다. 비교하기 위해, 당뇨병이 발병한 대조군 Ig로 처리한 마우스를 또한 분석하였다.
도 6(a)는 이입 전달 전 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD T 세포 상에서 NKG2D 발현 의 결핍의 그래프이다. 림프구는 어린 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD 마우스의 림프절 및 비장으로부터 단리하였다. 이어서 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD T 세포를 자기(magnetic) 세포 분리에 의해 정제하였다. T 세포 전달에 앞서, 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD T 세포를 항-CD8 및 NRP-V7/H-2Kd 테트라머 또는 항-NKG2D로 염색하고 나타낸 바와 같이 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 도 6(b)는 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD T 세포의 이입 전달 2일 후 췌장에서 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD T 세포 상의 NKG2D 발현의 그래프이다. 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD T 세포의 이입 전달 2일 후, 백혈구를 세포 전달 시점에서 대조군 Ig 또는 항-NKG2D mAb CX5로 처리한 마우스의 췌장으로부터 단리하였다. 세포를 NRP-V7/H-2Kd 테트라머 및 항-NKG2D로 염색하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 이입 전달된 T 세포 상의 NKG2D의 발현 (NRP-V7/H-2Kd 테트라머-양성 세포 상의 게이팅에 의해 확인됨)이 제시된다. 도 6(c)는 췌장에서 8.3 TcR-트랜스제닉 CD8+ NOD T 세포의 증식에 대한 항-NKG2D mAb CX5의 효과의 그래프이다. CFSE-표지된 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD T 세포 (1x107)를 10주령 야생형 NOD 마우스 내로 전달하였다 (0일). 수여자 NOD 마우스를 -1일, 1일 및 5일에 cIg 또는 항-NKG2D mAb CX5 (200 ㎍)로 처리하였다. 전달 후, 수여자 NOD 마우스를 희생시키고 백혈구를 췌장, 췌장 림프절 (PLN), 및 장간막 림프절 (MLN)로부터 단리하고 분석하였다. (c)에 나타낸 세포는 생존하는 CD8-양성 림프구 상에 게이팅되었다. 도 6(d)는 다음 식에 의해 계산된, 전달 후 2, 3 및 4일에 1회 이 상 분할한 (즉, 증식하는 세포) 대조군 Ig (열린 막대) 및 항-NKG2D mAb (닫힌 막대)-처리된 마우스에서 CSFS-표지된 세포의 백분율의 그래프이다: 증식하는 세포 ％ = (총 CFSE+ NRP-V7/H-2Kd 테트라머+ CD8+ 세포 - 비분할 CFSE+ NRP-V7/H-2Kd 테트라머+ CD8+ 세포) x 100/총 CFSE+ NRP-V7/H-2Kd 테트라머+ CD8+ 세포.
도 7은 100 nM IGRP (글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛-관련 단백질) 펩티드와 함께 3일 동안 배양한 다음 200 U/ml 인간 재조합 IL-2 및 4 ng/ml IL-7의 존재 하에 추가로 5일 동안 성장시킨 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD 림프구의 현미경사진이다. 활성화된 8.3 TcR-트랜스제닉 CD8+ T 세포를 얼음 상에서 항-NKG2D mAb CX5로 염색하고 콜레라 독소 B로 대비염색하여 세포 표면 멤브레인을 표지하였다. 이들 염색된 세포의 분취물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하고 다른 분취물을 얼음 상에 유지시켰다. 세포를 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 현미경사진에서, NKG2D 발현은 녹색 형광으로 표시되고, 적색 형광은 콜레라 독소 B (멤브레인) 염색을 나타낸다. NKG2D는 얼음 상에서 인큐베이션된 세포의 세포 표면 상에 존재하지만, 37℃에서 배양된 세포에서 조절되고 내재화되었음을 주목한다.
도 8은 생체 내에서 NKG2D-보유 CD8+ T 세포에 대한 항-NKG2D mAb의 효과의 그래프이다. OT-1 난알부민 (OVA)-특이적 TcR-트랜스제닉 CD8+ T 세포를 100 nM OVA 펩티드를 사용하여 3일 동안 활성화시킨 다음 200 U/ml 인간 재조합 IL-2 및 4 ng/ml IL-7과 함께 추가로 5일 동안 배양하였다. NKG2D는 활성화된 OT-1 T 세포 (>95％) 상에서 발현되었고, 이를 CFSE로 표지하고 C57BL/6 마우스 내로 이입 전달하였다 (2x107 세포). 전달된 CD8+ NKG2D+ OT-1 TcR-트랜스제닉 T 세포를 수여한 마우스를 항-NKG2D mAb 또는 대조군 래트 Ig로 -2, 0 및 +2일에 처리하였다 (복강내 주사당 200 ㎍). 도 8(a): 전달 4일 후, 혈액 샘플을 수집하고, 마우스 CD8 및 NKG2D에 대한 mAb로 염색하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. CSFE로 표지된 CD8+ T 세포의 백분율을 표시한다. 도 8(b): CFSE-표지된 OT-1 TcR-트랜스제닉 T 세포의 이입 전달 및 (a)에 나타낸 바와 같이 대조군 Ig 또는 항-NKG2D mAb CX5를 사용한 처리 21일 후에, 마우스를 희생시키고, 비장세포를 단리하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 도 8(c): CFSE-표지된 CD8+ NKG2D+ OT-1 T 세포의 이입 전달 7일 후에, 마우스에 고갈하는 래트 항-마우스 CD8 mAb (2.43 하이브리도마, 래트 IgG2b 이소형)을 주사하였다. 3일 후에, 말초 혈액 세포를 대조군 Ig, 항-CD8 또는 항-NKG2D mAb로 염색하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 상기 실험의 목적은 CX5 항-NKG2D 모노클로날 항체가, 항체가 생체내 투여될 때 NKG2D+ CD8+ T 세포를 고갈시키지 않음을 증명하기 위한 것이다.
도 9는 자가반응성 CD8+ T 세포 증식에 대한 항-NKG2D mAb의 효과의 그래프이다. 8.3 TcR-트랜스제닉 NOD T 세포를 CSFE로 표지하고, 도 6에 설명된 바와 같이 대조군 Ig 또는 항-NKG2D mAb CX5로 처리된 야생형 NOD 마우스에 전달시켰다. 췌장, 췌장 림프절, 장간막 림프절 및 비장으로부터 회수된 세포를 NRP-V7/H-2Kd 테 트라머 및 항-CD8 mAb로 염색하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. CD8-양성 NRP-V7/H-2Kd 테트라머 양성 세포 상에 게이팅된 림프구의 막대그래프를 도시한다. 증식하는 (1회 이상 분할) 세포 및 증식하지 않는 세포의 백분율 (CFSE+ CD8+ NRP-V7/H-2Kd 테트라머+ T 세포 상에 게이팅된)을 각각의 막대그래프에 표시한다. 이소형-매칭된 (matched) 대조군 Ig로 염색된 세포 또는 테트라머 염색에 대한 대조군은 시약의 결합 특이성을 증명하였다.
도 10은 NOD 췌장 세포 상에 NKG2D 리간드에 대한 염색의 특이성을 도시한 것이다. 도 10(a): 췌장 세포를 단리하고 항-CD45 mAb 및 대조군 Ig, 항-pan RAE-1 mAb (클론 186107),항-RAE-1γ mAb (클론 CX1) 또는 마우스 NKG2D-Ig 융합 단백질 (인간 IgG1 Fc에 융합된 마우스 NKG2D의 세포외 도메인)로 염색한 후, 가시화를 위해 적절한 제2 단계 시약으로 염색하였다. 세포를 유동 세포측정에 의해 분석하고 CD45-음성 및 프로피듐 요오다이드-음성의 생존하는 세포를 평가하였다. 이소형-매칭된 대조군 Ig (cIg)로 염색된 세포는 mAb 결합의 특이성을 증명하였다 (가는 선). 도 10(b): 순수한 항-RAE-1 mAb는 비오틴-표지된 항-RAE-1 mAb의 염색을 차단하였고, 이는 결합의 특이성을 증명한다. 췌장 세포를 0.25 ㎍ 정제된 cIg, 항-pan RAE-1 mAb 클론 186107 또는 항-RAE-1γ mAb 클론 CX1 (이는 또한 RAE-1α 및 RAE-1β와 상호반응한다)과 함께 예비인큐베이션하였다. 얼음 상에서 20분 인큐베이션 후, 이들 세포를 추가 20분 동안 0.25 ㎍ 비오티닐화된 대조군 Ig, 비오티닐화된 항-RAE-1 mAb 클론 186107, 비오티닐화된 항-RAE-1γ mAb 클론 CX1 및 FITC-컨쥬게이션된 항-CD45 mAb로 염색하였다. 비오티닐화된 mAb를 검출하기 위해, 세포를 세척하고 PE-컨쥬게이션된 스트렙타비딘과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 유동 세포측정에 의해 분석하였고, 나타낸 데이타는 CD45-음성, 프로피듐 요오다이드-음성의 생존하는 세포 상에 게이팅되었다. 따라서, NKG2D 리간드는 2가지 독립적인 시약을 사용하여 NOD 췌장 세포 상에서 검출된다: 항-RAE-1 mAb 클론 186107, 항-RAE-1 mAb 클론 CX1, 및 마우스 NKG2D-Ig 융합 단백질. 비오티닐화된 항-RAE-1 mAb 염색이 정제된 항-RAE-1 mAb에 의해 완전히 차단되지만 대조군 래트 IgG에 의해 차단되지 않는다는 점에서, 항-RAE-1 mAb 염색은 특이적이다.
도 11(a)는 뮤린 NKG2D의 cDNA 서열 (서열 1)을 도시한 것이다. 도 11(b)는 뮤린 NKG2D의 아미노산 서열 (서열 2)를 도시한 것이다. 도 11(c)는 인간 NKG2D의 cDNA 서열 (서열 3)을 도시한 것이다. 도 11(d)는 인간 NKG2D의 아미노산 서열 (서열 4)을 도시한 것이다.
도 12는 NKG2D 내재화를 자극하기 위해 마우스 항-인간 NKG2D 항체 (클론 149810)과 함께 16시간 동안 인큐베이션한 NKL 세포 (인간 NK 백혈병 세포주)의 유동 세포측정 분석의 그래프이다 (우측 패널). 좌측 패널은 대조군 항체와 함께 16시간 동안 인큐베이션한 세포를 도시한 것이다. 각 경우에, 세포를 임의의 잔류하는 결합된 항체를 제거하기 위해 산성 완충액 (pH 3.5)에서 일시 세척한 다음 대조군 Ig 또는 항-NKG2D mAb, 이어서 피코에리트린-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG 항체로 염색하였다. 실험은 항-인간 NKG2D 모노클로날 항체가 NKG2D의 내재화 (조절)를 유도한 반면, 대조군 Ig와 함께 인큐베이션하면 NKG2D의 내재화를 일으키지 않았음을 보여준다.
도 13은 RAE-1이 B/c BM 세포 상에서 발현되지만 B6 BM 세포 상에서 발현되지 않음을 보여준다. 도 13(a): 새로 단리된 BM 세포를 마우스 NKG2D-인간 Ig Fc 융합 단백질 (NKG2D Ig) 또는 대조군 인간 Ig (cIg)로 염색하였다. NKG2D-Ig의 결합을 검출하기 위해, PE-컨쥬게이션된 항-인간 IgG 항체 (항-인간 Ig PE)를 제2 단계 항체로서 사용하였다. 점선은 BM 세포 상의 cIg 염색을 나타낸다. 굵은 선은 BM 세포 상의 NKG2D 리간드 발현을 보여준다. 도 13(b): BM 세포를 비오티닐화된 항-pan RAE-1 mAb, 비오티닐화된 항-H60 mAb, 비오티닐화된 항-MULT1 mAb 또는 비오티닐화된 이소형-매칭된 cIg로 염색한 다음, PE-컨쥬게이션된 스트렙타비딘으로 염색하였다. 점선은 cIg 염색을 보여주고, 굵은 선은 BM 세포 상의 RAE-1, H60 및 MULT1 발현을 보여준다. 도 13(c 및 d): CB6F1 수여자를 항-NK1.1 mAb로 -2일에 처리하였다. 0일에, 수여자를 방사선 조사한 (11 Gy) 다음 B/c 또는 CB6F1 BM 세포 (4x106)으로 재구성하였다. 7일에, 수여자 비장으로부터 세포를 단리하고 패널 a 및 b에 대해 설명된 바와 같이 분석하였다. 점선은 BM 세포 상의 cIg 염색을 나타낸다. 굵은 선은 BM 세포 상의 NKG2D 리간드, RAE-1, H60 및 MULT1 발현을 보여준다. 수치는 염색된 세포의 평균 형광 (임의의 선형 단위)을 나타낸다. 도 13(e 및 f): RAE-1-발현 세포의 표현형을 그래프로 도시한 것이다. BM 세포를 항-NK1.1 mAb로 예비처리된 방사선 조사된 수여자에 전달하였다. 세포를 단리하고 패널 c에 대해 설명된 바와 같이 염색하였다. 도 13(g): 증식하는 세포가 RAE-1을 발현하는 것을 도시한 것이다. B/c BM 세포를 항-NK1.1 mAb로 예비처리된 방사선 조사된 CB6F1 마우스에 전달하였다. 전달 6일 후, BrdU (0.8 mg/마우스)를 마우스에 주사하였다. 2시간 또는 12시간 후, 수여자 비장으로부터 세포를 수집하고 항-pan-RAE-1 mAb 및 항-BrdU로 염색하였다. 도 13(h 및 I): RAE-1이 5-FU-처리된 BM의 자손체 상에서 발현됨을 도시한 것이다. 5-플루오로우라실-처리된 B/c 마우스로부터 BM 세포를 항-NK1.1 mAb로 예비처리된 방사선 조사된 CB6F1 마우스에 전달하였다. 전달 8일 후, 세포를 단리하고 패널 c 및 e에 대해 설명된 바와 같이 분석하였다. 도 13(i): RAE-1-양성 게이팅된 세포의 c-kit 및 Sca-1 염색을 보여준다. 패널 e 내지 i에서, cIg로 염색된 세포의 98％ 초과가 하부 좌측 사분면 내에 있었다 (도시하지 않음). 각각의 상부 2개의 사분면 내의 세포의 백분율이 제시된다. 이들 결과는 적어도 2개의 독립적인 실험에서 재현가능하였다 (대표적인 데이타를 도시한 것이다).
도 14(a): 항-NKG2D mAb가 CB6F1 하이브리드 마우스에서 B/c BM의 거부반응을 차단하는 것을 설명한다. 약 4x106 BM 세포를 방사선 조사된 CB6F1 수여자에 전달하였다. 5일에 수여자 마우스에 125IUdR을 주사하고, 6일에 비장을 회수하고 계수하였다. 흑색 막대는 B/c BM -> CB6F1 마우스에서 비장의 125IUdR 흡수를 보여주고, 백색 막대는 CB6F1 BM -> CB6F1 수여자에서 방사성 표지의 흡수를 보여준다. 마우스를 지시된 바와 같이 비-고갈, 중화 항-NKG2D mAb 또는 NK 세포-고갈 항-NK1.1 mAb (-2일에 200 ㎍/마우스)로 처리하였다. 결과를 평균±S.D. cpm으로 나 타낸다 (5 마우스/군). 실험은 동등한 결과를 가지면서 2회 수행하였다. 도 14(b): 항-NKG2D mAb 또는 대조군 Ig로 처리된 방사선 조사된 CB6F1 수여자에 재군집한 B/c 공여자 세포의 표현형을 도시한 것이다. 패널 a에 설명된 바와 같이 마우스를 처리하고, 이식 8일 후에 비장세포를 회수하면서, 도 13에 대해 설명된 바와 같이 세포를 염색하고 데이타를 제시하였다.
도 15는 RAE-1을 발현하는 유전적 동계 BM 세포의 거부반응을 도시한 것이다. 도 15(a)는 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 마우스에서 골수 세포 상의 RAE-1ε의 발현을 보여준다. 야생형 B6 및 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 마우스로부터 새로 단리된 골수를 cIg 또는 항-pan-RAE-1 mAb로 염색하였다. 도 15(b)는 B6 NK 세포가 유전적 동계 RAE-1ε 트랜스제닉 BM 세포를 시험관 내에서 치사시킴을 설명한다. 야생형 B6 및 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 마우스로부터 새로 단리된 BM을 10 ㎍/ml로 사용된 cIg 또는 항-NKG2D mAb (클론 191004)의 존재 하에, 효과기로서 IL-2-활성화된 야생형 NK 세포 (7일 동안 내셔날 캔서 바이올로지칼 리소스 브랜치 프리-클리니칼 레포지토리 (National Cancer Institute Biological Resources Branch Pre-clinical Repository)의 2000 U/ml 재조합 인간 IL-2 내에서 배양된 B6 NK 세포)를 사용하는 표준 시험관내 세포독성 분석에서 표적으로 사용하였다. 도 15(c)는 B6 마우스가 RAE-1ε를 발현하는 유전적 동계 골수를 거부하는 것을 설명한다. 약 4x106 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 BM 세포를 방사선 조사된 B6 수여자에 전달하였다. 5일에 수여자 마우스에 125IUdR을 주사하고, 6일에 비장을 회수하고 계수하였다. 흑 색 막대는 RAE-1ε 트랜스제닉 BM -> B6 마우스에서 비장의 125IUdR 흡수를 보여주고, 백색 막대는 야생형 B6 BM -> B6 수여자에서 방사성 표지의 흡수를 보여준다. 마우스를 지시된 바와 같이 비-고갈, 중화 항-NKG2D mAb 또는 NK 세포-고갈 항-NK1.1 mAb (-2일에 200 ㎍/마우스)로 처리하였다. 결과를 평균±S.D. cpm으로 나타낸다 (5 마우스/군). 실험은 동등한 결과를 가지면서 2회 수행하였다. 도 15(d)는 CB6F1 마우스가 RAE-1ε를 발현하는 유전적 동계 골수를 거부하는 것을 설명한다. 약 4x106 RAE-1ε 트랜스제닉 CB6F1 BM 세포를 방사선 조사된 CB6F1 수여자에 전달하였다. 5일에 마우스에 125IUdR을 주사하고, 6일에 비장을 회수하고 계수하였다. 흑색 막대는 RAE-1ε 트랜스제닉 CB6F1 BM -> CB6F1 마우스에서 비장의 125IUdR 흡수를 보여주고, 백색 막대는 야생형 CB6F1 BM -> CB6F1 수여자에서 방사성 표지의 흡수를 보여준다. 패널 c에서 설명된 바와 같이 마우스를 처리하였고 데이타를 나타낸다.
도 16(a)는 DAP10-/-마우스가 RAE-1ε을 발현하는 유전적 동계 골수를 비효율적으로 거부하는 것을 설명한다. 약 4x106 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 BM 세포를 방사선 조사된 수여자에 전달하였다. 5일에 마우스에 125IUdR을 주사하고, 6일에 비장을 회수하고 계수하였다. 흑색 막대는 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 BM -> 야생형 B6 마우스에서 비장의 125IUdR 흡수를 보여주고, 백색 막대는 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 BM -> DAP10-/- B6 수여자에서 방사성 표지의 흡수를 보여준다. 마우스를 지시된 바와 같이 비-고갈, 중화 항-NKG2D mAb 또는 NK 세포-고갈 항-NK1.1 mAb (-2일에 200 ㎍/마우스)로 처리하였다. 결과를 평균±S.D. cpm으로 나타낸다 (5 마우스/군). 도 16(b)는 DAP12-/- 마우스 (Bakker et al., Immunity, 13:345-353, 2000)가 RAE-1ε을 발현하는 유전적 동계 골수를 거부하는 것을 설명한다. 약 4x106 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 BM 세포를 방사선 조사된 수여자에 전달하였다. 5일에 마우스에 125IUdR을 주사하고, 6일에 비장을 회수하고 계수하였다. 흑색 막대는 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 BM -> 야생형 B6 마우스에서 비장의 125IUdR 흡수를 보여주고, 백색 막대는 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 BM -> DAP12-/- B6 수여자에서 방사성 표지의 흡수를 보여준다. 패널 a에 대해 설명된 바와 같이 마우스를 처리하였고 결과를 나타낸다.
도 17(a)는 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 마우스에서 NK 세포 상의 NKG2D의 조절을 도시한 것이다. 야생형 및 RAE-1ε 트랜스제닉 B6 마우스로부터 비장세포를 항-pan-RAE-1 mAb (좌측 패널) 또는 항-NKG2D 및 항-NK1.1 mAb (우측 패널)로 염색하였다. RAE-1 발현을 비장 세포 상에서 분석하였고, NKG2D 발현을 NK1.1+ 세포 상에 게이팅함으로써 분석하였다. 가는 선은 cIg로 염색된 세포를 보여주는 반면, 굵은 선은 RAE-1 또는 NKG2D 특이적 염색을 보여준다. 수치는 염색된 세포의 평균 형광 (임의의 선형 단위)을 나타낸다. 도 17(b)는 NKG2D-의존 세포독성이 RAE-1ε 트랜스제닉 (Tg) NK 세포에서 손상됨을 그래프로 도시한 것이다. 풍부화된 NK 세포를 회수 1일 전에 폴리I:C (100 ㎍/마우스)를 IP-주사한 야생형 또는 RAE-1ε Tg B6 마우스의 비장으로부터 제조하였다. CD32-형질감염된 721.221 표적 세포에 대한 모노클로날 항체-의존 재지정 (re-direct) 치사 분석을 대조군 Ig (cIg), 항-NKG2D, 또는 항-NK1.1 mAb를 사용함으로써 설명된 바와 같이 수행하였다 (Lanier et al., J Immunol, 141:3478-3485, 1998). 도 17(c): RAE-1ε 트랜스제닉 숙주에서 발달하는 야생형 NK 세포 상의 NKG2D의 조절을 설명한다. Ly 5.2 B6 BM 세포 (1x107/마우스)를 방사선 조사된 야생형 (WT) 또는 RAE-1ε Tg B6 마우스에 전달하였다. 이식 3달 후, NKG2D (좌측 패널) 및 NK1.1 (우측 패널)의 발현 수준을 비장 NK 세포 상에서 분석하였다 (CD3-, NK1.1+ 림프구 상에 게이팅된). 가는 선은 cIg로 염색된 세포를 보여주는 반면, 굵은 선은 RAE-1 또는 NKG2D 특이적 염색을 보여준다. 수치는 염색된 세포의 평균 형광 (임의의 선형 단위)을 나타낸다. 도 17(d)는 Ly5.2 B6 BM -> RAE-1 Tg 키메라 마우스에서 NK 세포의 NKG2D-의존 세포독성을 도시한 것이다. 풍부화된 NK 세포를 회수 1일 전에 폴리I:C (100 ㎍/마우스)를 IP-주사한 Ly5.2 B6 BM -> RAE-1 Tg 및 Ly5.2 B6 BM -> B6 마우스의 비장으로부터 제조하였다. mAb-의존 재지정된 세포독성 분석을 패널 b에 설명된 바와 같이 수행하였다. 도 17(e)는 RAE-1 Tg 마우스에서 발달하는 야생형 NK 세포가 손상된 NKG2D-의존 골수 거부반응을 나타냄을 설명한다. 흑색 막대는 RAE-1+ Tg BM 세포 -> 키메라 마우스 (Ly5.2 B6 BM -> 야생형 B6)의 비장에서 125IUdR 흡수를 보 여주고, 백색 막대는 RAE-1+ Tg BM 세포 -> 키메라 마우스 (Ly5.2 B6 BM -> RAE-1 Tg 키메라 마우스)의 비장에서 방사성 표지의 흡수를 보여준다. 도 17(f)는 RAE-1ε 트랜스제닉 CB6F1 마우스에서 하이브리드 저항이 손상됨을 설명한다. 약 4x106 B/c BM 세포를 방사선 조사된 수여자에 전달하였다. 5일에 수여자 마우스에 125IUdR을 주사하고, 6일에 비장을 회수하고 계수하였다. 흑색 막대는 B/c BM -> 야생형 CB6F1 마우스에서 비장의 125IUdR 흡수를 보여주고, 백색 막대는 B/c BM -> RAE-1ε 트랜스제닉 CB6F1 수여자에서 방사성 표지의 흡수를 보여주고, 회색 막대는 CB6F1 BM -> CB6F1 마우스를 보여준다. 마우스를 지시된 바와 같이 비-고갈, 중화 항-NKG2D mAb 또는 NK 세포-고갈 항-NK1.1 mAb (-2일에 200 ㎍/마우스)로 처리하였다. 결과를 평균±S.D. cpm으로 나타낸다 (5 마우스/군). 실험은 동등한 결과를 가지면서 2회 수행하였다.
<110> Lanier, Lewis L. Ogasawara, Koetsu Bluestone, Jeffrey A. <120> Modulation of NKG2D <130> UCSF-09805 <140> PCT/US2005/011487 <141> 2005-04-05 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 699 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atggcattga ttcgtgatcg aaagtctcat cactcagaga tgagcaaatg ccataattac 60 gacctcaagc cagcaaagtg ggatacttct caagaacaac agaaacaaag attagcacta 120 actaccagtc aacctggaga aaatggtatc ataagaggaa gataccctat agaaaaactc 180 aaaatatctc caatgttcgt tgttcgagtc cttgctatag ccttggcaat tcgattcacc 240 cttaacacat tgatgtggct tgccattttc aaagagacgt ttcagccagt attgtgcaac 300 aaggaagtcc cagtttcctc aagagagggc tactgtggcc catgccctaa caactggata 360 tgtcacagaa acaactgtta ccaatttttt aatgaagaga aaacctggaa ccagagccaa 420 gcttcctgtt tgtctcaaaa ttccagcctt ctgaagatat acagtaaaga agaacaggat 480 ttcttaaagc tggttaagtc ctatcactgg atgggactgg tccagatccc agcaaatggc 540 tcctggcagt gggaagatgg ctcctctctc tcatacaatc agttaactct ggtggaaata 600 ccaaaaggat cctgtgctgt ctatggctca agctttaagg cttacacaga agactgtgca 660 aatctaaaca 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Leu Thr Leu Val Glu Ile Pro Lys Gly Ser Cys Ala Val Tyr 195 200 205 Gly Ser Ser Phe Lys Ala Tyr Thr Glu Asp Cys Ala Asn Leu Asn Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys Met Lys Arg Ala Val 225 230 <210> 3 <211> 651 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggggtgga ttcgtggtcg gaggtctcga cacagctggg agatgagtga atttcataat 60 tataacttgg atctgaagaa gagtgatttt tcaacacgat ggcaaaagca aagatgtcca 120 gtagtcaaaa gcaaatgtag agaaaatgca tctccatttt ttttctgctg cttcatcgct 180 gtagccatgg gaatccgttt cattattatg gtagcaatat ggagtgctgt attcctaaac 240 tcattattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 300 aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 360 tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 420 gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 480 ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 540 ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 600 gaaaactgtt caactccaaa tacatacatc tgcatgcaaa ggactgtgta a 651 <210> 4 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr 20 25 30 Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu 35 40 45 Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly 50 55 60 Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn 65 70 75 80 Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys 85 90 95 Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln 100 105 110 Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met 115 120 125 Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp 130 135 140 Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile 145 150 155 160 Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro 165 170 175 Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr 180 185 190 Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr 195 200 205 Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val 210 215 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 5 Lys Tyr Asn Lys Ala Asn Val Phe Leu 1 5 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 6 ctagtgccac ctgggaattc a 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 7 catcattagc tgatctccag ctca 24 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 8 catcagtgac agttacttct tcaccttcta cacagaga 38 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 9 Tyr Ile Asn Met 1 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 10 ggatgggact agtacacatt cc 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 11 tggcagtggg aagatggctc c 21 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 12 cagaagggag actgtgcact ctatgcctc 29 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 13 ggatgggatt agtatagatt cc 22

Claims (29)

  1. 다량체성 MICA, MICA의 다량체성 NKG2D-결합 단편, 다량체성 MICB, MICB의 다량체성 NKG2D-결합 단편, 다량체성 ULBP, ULBP의 다량체성 NKG2D-결합 단편, 및 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 RNAi 분자로 이루어진 군으로부터 선택되며 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키고 백혈구의 표면 상에서 NKG2D의 양을 감소시키는 작용제를 포함하며, I형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 복강 질환, 염증성 장질환, 건선, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선염, 중증 근육무력증, 길랑 바레 (Guillain-Barre) 증후군, 자가면역 포도막염, 원발성 담즙성 간경변, 자가면역 간염, 자가면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 그레이브스병, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 측두동맥염, 항-인지질 증후군, 베게너 육아종증, 베체트 (Behcet) 병, 공피증, 다발성 근염, 피부근육염, 강직척추염, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 포진피부염, 심상성 천포창, 백반증, 건선 관절염, 골관절염, 스테로이드-내성 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 아테롬성 동맥경화증, 골수 이식 거부반응 및 말초 혈액 줄기세포 이식 거부반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약.
  2. 제1항에 있어서, 리간드-유도 NKG2D 활성화의 감소가 NKG2D를 발현하는 백혈구를 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 의약.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제와의 접촉에 의해 리간드-유도 NKG2D 활성화가 30％ 이상 감소되는 의약.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제가 NKG2D와 DAP10의 상호작용을 감소시키는 것인 의약.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제가 세포-표면 NKG2D의 내재화 속도를 증가시키는 것인 의약.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포-표면 NKG2D의 양의 상기 감소가, 천연 가용성 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, 또는 ULBP4 중 1종 이상이 세포-표면 NKG2D의 양을 감소시킬 수 없는 조건 하에 일어나는 것인 의약.
  7. 제5항에 있어서, NKG2D 내재화 속도의 상기 증가가, 천연 가용성 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, 또는 ULBP4 중 1종 이상이 NKG2D의 내재화 속도를 증가시킬 수 없는 조건 하에 일어나는 것인 의약.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제와의 접촉에 의해 NKG2D-NKG2D 리간드 복합체를 통한 신호전달이 감소되는 의약.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 백혈구가 NKG2D+ CD8+ T 세포, NKG2D+CD4+ T 세포, NKG2D+γδ T 세포, NKG2D+ NK 세포, 및 대식세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 의약.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제가 대조군에 비해 NKG2D-발현 백혈구의 수를 10％ 미만으로 감소시키는 것인 의약.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제가 NKG2D-코딩 핵산의 전사 또는 번역을 감소시키는 RNAi 분자인 의약.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, NKG2D 리간드 발현이 상기 질환에 걸린 기관 또는 조직의 세포에서 상승되는 의약.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제가 상기 질환에 걸린 기관 또는 조직에 침윤하는 림프구를 감소시키는 것인 의약.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제가 상기 질환에 걸린 기관 또는 조직에서 인터페론-감마 수준을 감소시키는 것인 의약.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제가 상기 백혈구의 증식을 감소시키는 것인 의약.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 질환에 걸린 것으로 진단된 인간 환자를 치료하기 위한 의약.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 의약.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, I형 당뇨병을 치료 또는 예방하기 위한 의약.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다발성 경화증을 치료 또는 예방하기 위한 의약.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 복강 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 염증성 장질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전신성 홍반성 루푸스를 치료 또는 예방하기 위 한 의약.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 골수 이식 거부반응을 치료 또는 예방하기 위한 의약.
  24. 다량체성 MICA, MICA의 다량체성 NKG2D-결합 단편, 다량체성 MICB, MICB의 다량체성 NKG2D-결합 단편, 다량체성 ULBP, ULBP의 다량체성 NKG2D-결합 단편, 및 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 RNAi 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 NKG2D 조절자; 및 I형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 복강 질환, 염증성 장질환, 건선, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선염, 중증 근육무력증, 길랑 바레 (Guillain-Barre) 증후군, 자가면역 포도막염, 원발성 담즙성 간경변, 자가면역 간염, 자가면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 그레이브스병, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 측두동맥염, 항-인지질 증후군, 베게너 육아종증, 베체트 (Behcet) 병, 공피증, 다발성 근염, 피부근육염, 강직척추염, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 포진피부염, 심상성 천포창, 백반증, 건선 관절염, 골관절염, 스테로이드-내성 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 아테롬성 동맥경화증, 골수 이식 거부반응 및 말초 혈액 줄기세포 이식 거부반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위하여 백혈구를 상기 NKG2D 조절자와 접촉시키기 위한 지시서를 포함하는, 상기 질환의 치료 또는 예방용 키트.
  25. 제24항에 있어서, 상기 백혈구가 인간 백혈구이고, 상기 지시서가 질환에 걸린 것으로 진단된 인간 환자의 치료용인 키트.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, NKG2D 조절자가 백혈구의 표면 상에서 NKG2D의 양을 감소시키는 것인 키트.
  27. i) NKG2D+ 백혈구를 시험 조절제와 접촉시키고;
    ii) 상기 백혈구에 의한 NKG2D 발현을 측정하거나, 상기 백혈구에 의한 리간드-유도 NKG2D 활성화를 측정하는 것
    을 포함하는, 다량체성 MICA, MICA의 다량체성 NKG2D-결합 단편, 다량체성 MICB, MICB의 다량체성 NKG2D-결합 단편, 다량체성 ULBP, ULBP의 다량체성 NKG2D-결합 단편, 및 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 RNAi 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 NKG2D 조절제의 확인 방법.
  28. 제27항에 있어서, NKG2D 발현의 측정이 NKG2D 전사, 번역, 및 내재화를 측정하는 것 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 리간드-유도 NKG2D 활성화의 측정이 DAP10 포스포릴화, p85 PI3 키나제 활성, Akt 키나제 활성, IFN-γ의 생산, 및 NKG2D 리간드+ 표적 세포의 세포용해를 측정하는 것 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7998481B2 (en) * 2004-04-05 2011-08-16 The Regents Of The University Of California Modulation of NKG2D for treating or preventing solid organ allograft rejection
WO2005115517A2 (en) * 2004-04-28 2005-12-08 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of treating diabetes
US20070248607A1 (en) * 2005-11-03 2007-10-25 Thomas Spies Negative immunomodulation of immune responses by nkg2d-positive cd4+ cells
WO2008014035A2 (en) * 2006-07-25 2008-01-31 The Regents Of The University Of California Modulation of nkg2d and method for treating or preventing solid organ allograft rejection
CN105001333B (zh) * 2007-12-14 2019-05-17 诺沃—诺迪斯克有限公司 抗人nkg2d抗体及其用途
ES2550384T3 (es) 2008-12-18 2015-11-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. NKG2D-Fc para la inmunoterapia
RU2566264C2 (ru) * 2009-08-17 2015-10-20 Дзе Пенн Стейт Рисерч Фаундейшн Применение ингибиторов nkg2d для лечения сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний, таких как диабет 2 типа
EP2621514B1 (en) 2010-09-28 2016-09-21 KAHR Medical (2005) Ltd Compositions and methods for treatment of hematological malignancies
KR101240206B1 (ko) 2010-10-05 2013-03-06 고려대학교 산학협력단 자연살상 세포-매개 면역반응 억제용 조성물
EP2747785A4 (en) * 2011-08-26 2015-04-15 Univ California METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING RESPIRATORY DISEASES THROUGH NKG2D INHIBITION
EP3628329B1 (en) * 2011-09-30 2022-08-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Therapeutic peptides comprising antibodies binding to mhc class 1 polypeptide related sequence a (mica)
GB201218195D0 (en) * 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
KR102228828B1 (ko) * 2014-03-11 2021-03-16 셀렉티스 동종이형 이식에 양립성인 t-세포들을 만들어내는 방법
BR112017018224A2 (pt) * 2015-03-11 2018-04-17 Cellectis métodos para manipulação de célula t alogênica para aumentar sua persistência e/ou implante em pacientes
EP4006146B1 (en) * 2015-09-03 2023-09-06 The UAB Research Foundation Genetically-engineered drug resistant t cells and methods of using the same
EP3373952A4 (en) 2015-11-10 2019-05-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center NKG2D decoys
CN114853907A (zh) 2015-11-13 2022-08-05 达纳-法伯癌症研究所有限公司 用于癌症免疫疗法的nkg2d-ig融合蛋白
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
WO2018175390A1 (en) * 2017-03-20 2018-09-27 Washington University Cells and methods of uses and making the same
JP2021505207A (ja) * 2017-12-05 2021-02-18 セリアド エス．アー．Ｃｅｌｙａｄ Ｓ．Ａ． Ｎｋｇ２ｄベースの受容体を発現する免疫細胞のフラトリサイドの減少
EP3806888B1 (en) 2018-06-12 2024-01-31 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
CN110713977B (zh) * 2018-07-12 2022-05-27 上海赛傲生物技术有限公司 一种cd8 t细胞的培养扩增方法
WO2020123716A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Obsidian Therapeutics, Inc. Membrane bound il12 compositions and methods for tunable regulation
EP3935159A1 (en) 2019-03-08 2022-01-12 Obsidian Therapeutics, Inc. Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation
KR20220044266A (ko) 2019-06-12 2022-04-07 옵시디안 테라퓨틱스, 인크. 조정 가능한 조절을 위한 ca2 조성물 및 방법
US20220267398A1 (en) 2019-06-12 2022-08-25 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
US20220323541A1 (en) * 2019-08-13 2022-10-13 Courier Therapeutics, Inc. Orthopoxvirus major histocompatibility complex (mhc) class-i like protein (omcp) for treatment of autoimmune disease

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA89189A (en) 1904-03-10 1904-09-13 Frederick Palm Valve
CA95137A (en) 1905-07-25 1905-09-19 William E. Hingston Envelope
DK26743C (da) 1918-10-14 1920-10-04 Fabrikanter Og Forhandlere Af Symaskine.
DK63720C (da) 1944-02-26 1945-07-23 Jes Hansen Lauritzen Anordning ved Maksimalafbrydere med en alt efter Overbelastningens Størrelse forsinket eller øjeblikkelig Afbrydelse af Forbrugsstrømmen.
US6541610B1 (en) * 1989-09-05 2003-04-01 Immunex Corporation Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
JPH06506358A (ja) 1991-03-28 1994-07-21 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ ナチュラルキラー細胞に特異的なｄｎａおよびアミノ酸配列
US5635532A (en) 1991-10-21 1997-06-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Compositions and methods for therapy and prevention of pathologies including cancer, AIDS and anemia
ATE336587T1 (de) 1994-06-10 2006-09-15 Genvec Inc Adenoviren-vektor systeme und zelllinien
US5789244A (en) 1996-01-08 1998-08-04 Canji, Inc. Compositions and methods for the treatment of cancer using recombinant viral vector delivery systems
WO1998019167A2 (en) 1996-10-29 1998-05-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center, Inc. Cell stress regulated human mhc class i gene
HUP0001964A3 (en) 1997-01-29 2002-01-28 Cornell Res Foundation Inc Ith Multiple site delivery of adenoviral vector for the induction of angiogenesis
IL136621A0 (en) * 1997-12-17 2001-06-14 Immunex Corp Cell surface glycoproteins associated with human b cell lymphomas
US6225289B1 (en) 1998-12-10 2001-05-01 Genvec, Inc. Methods and compositions for preserving adenoviral vectors
US6414218B1 (en) 2000-01-18 2002-07-02 The General Hospital Corporation Mouse model for rheumatoid arthritis
WO2001077350A2 (en) 2000-04-07 2001-10-18 Large Scale Biology Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expression
US20040031066A9 (en) 2001-01-18 2004-02-12 Faustman Denise L. Mouse model for rheumatoid arthritis
US20040115198A1 (en) 2001-02-28 2004-06-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Activation of lymphocyte populations expressing NKG2D using anti-NKG2D antibodies and ligand derivatives
US20030095965A1 (en) * 2001-05-02 2003-05-22 Katrien Van Beneden Antibodies to Ly49E and CD94/NKG2 receptors
US6821522B2 (en) * 2001-05-31 2004-11-23 The Regents Of The University Of California Tumor Therapy
US20030171280A1 (en) * 2001-07-31 2003-09-11 Soderstrom Karl Petter Compositions and methods for modulation of immune responses
WO2003089616A2 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Soluble mic polypeptides as markers for diagnosis, prognosis and treatment of cancer and autoimmune diseases or conditions
US7666417B2 (en) * 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
US7998481B2 (en) * 2004-04-05 2011-08-16 The Regents Of The University Of California Modulation of NKG2D for treating or preventing solid organ allograft rejection

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Immunity, Vol.18, No.1, pp41-51 (2003.1.)
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