SK23394A3

SK23394A3 - New isosteric peptides

Info

Publication number: SK23394A3
Application number: SK233-94A
Authority: SK
Inventors: Butrus Airash; David M Jones; Michael Szelke
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1991-08-28
Filing date: 1992-08-25
Publication date: 1994-08-10
Also published as: BG98583A; TNSN92076A1; HU9400589D0; DZ1613A1; WO1993005069A1; CZ38094A3; NO940669L; NZ243675A; AP313A; FI940945A0; IL102840A0; IS3906A; DE69232394D1; CA2116527A1; JPH06510059A; SE9102462D0; MX9204767A; EP0605462A1; EP0605462B1; ZA925737B

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka nových kompetitívnych inhibítorov trombínu, spôsobov ich syntézy, farmaceutických prostriedkov obsahujúcich tieto zlúčeniny ako účinné látky a použitia zlúčenín ako antikoagulantov pre profylaxiu a ošetrovanie tromboembolických ochorení, ako je trombóza žíl, plúcna embólia, arteriálna trombóza, predovšetkým infarkt myokardu a mozgová trombóza, všeobecne hyperkoagulovatelné stavy a miestne hyperkoagulovatelné stavy, napríklad po angioplastických operáciách a koronárnyych operáciách premostením.

Doterajší stav techniky

Koagulácia krvi je klúčovým procesom zahrňujúcim ako hemostázu (to znamená prevenciu straty krvi z poškodenej cievy), tak trombózu (to znamená patologické uzatvorenie krvnej cievy krvnou zrazeninou). Koagulácia je výsledkom komplexného radu enzymatických reakcií naznačených v schéme 1 ďalej, kde rôzne faktory sú označené rímskymi číslicami.

Trombín hrá stredovú úlohu pri koagulácii, pokial sa proces iniciuje' vnútornou alebo vonkajšou cestou: táto látka aktivuje krvné doštičky, transformuje fibrinogén na monomérny fibrín, ktorý spontánne polyméruje na vlákna a aktivuje koagulačný faktor XIII, ktorý naopak zosieťuje polymér na nerozpustný fibrín. Trombín ďalej aktivuje koagulačné faktory V a VIII v reakcii s pozitívnou spätnou väzbou.

Preto sa očakáva, že inhibítory trombínu budú účinnými antikoagulantmi.

VNÚTORNÝ

SYSTÉM

FII

SCHÉMA 1

Prvé inhibítory trombínu založené na elekrofilných ketónoch boli vyvinuté ako popísal M. Szelke a D. M. Jones v EP-A1-0118280 A1, s britským dátumom priority 4. marca 1983. Tieto skoršie zlúčeniny sú odvodené od P₃ - P₂' pentapeptidovej sekvencie fibrinogénového Aa reťazca, v ktorom lahko odštiepitelná P-jl - P j' peptidová väzba je nahradená zvyškom -CO-CH₂~ f ktorý tvorí keto izoster ku zodpovedajúcim peptidom.

Iné známe príklady serín proteinázových inhibítorov, založených na elektrofilných ketónoch, sú uvedené v týchto prácach:

a) M. Kôlb a kol. (Merrel-Dow), EP-A2-0 195 212 (dátum priority

4.februára 1986), popisujúci peptidické α-ketoestery a a-ketoamidy,

b) B. Imperiáli a R. H. Abeles, Biochemistry 25, 3760 (1986) (peptidylfluóralkylketóny),

c) Ueda a kol., Biochem. J. 265. 539 (1990) (peptidylfluóralkylketóny ),

d) D. Schirlin a kol. (Merrel-Dow) EP-A1-0 362 002 (dátum priority 1. septembra 1988), popisujúci fluóralkylamidketóny,

e) P. Bey a kol. (Merrel-Dow), EP-A2-0 364 344 (dátum priority

7. októbra 1988), popisujúci α,β,δ-triketozlúčeniny a

f) E. N. Shaw a kol. (Research Corporation), US 4 318 904 (dátum priority 25. apríla 1980), popisujúci peptidchlórmetylketóny, napríklad H-DPhe-Pro-Arg-CH₂Cl.

Inhibítory trombínu založené na peptidaldehydoch uvádza S. Bajusz a kol. v J. Med. Chem.. 33, 1729 (1990) a Richter Gedeon

Vegyeszeti Gyar R T v EP-A 0 185 390 (dátum priority 21. decembra 1984). Trombínové inhibítory ako peptidy zahrňujúce C-terminálne deriváty kyseliny ortoboritej odvodené od arginínových a izotiouróniových analógov popisuje A. D. Kettner a kol. (Du Pont), EP A2-0 293 881 (dátum priority 5. júna 1987 a 6. apríla 1988).

Príklady trombínového inhibítora na báze arginínových derivátov alebo analógov, ktoré neobsahujú elektrofilné ketóny, uvádzajú napríklad:

a) S. Okamoto a kol. (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) v EP Al-0 008 746 (dátum priority 31. augusta 1978), kde sa popisujú arylsulfonylarginínamidy, napríklad argatroban a

b) J. Sturzbecher a kol., Pharmazie 36, 639 (1981) (arylsulfonyl-p-amidinofenylalanínamidy).

Predmet tohoto vynálezu sa týka nových a účinných trombínových inhibítorov s kompetitívnym inhibítorovým účinkom proti svojmu enzýmu, to znamená, že je spôsobená reverzibilná inhibícia. Ďalším znakom je získanie inhibítorov, ktoré sú orálne biologicky dostupné a selektívne pri inhibícii trombínu viac ako iné serínové proteázy. Stabilita, trvanie účinku a nízka toxicita pri terapeutických dávkach sú ešte ďalšie znaky tohoto vynálezu.

Podstata vynálezu

Zlúčeniny

Zistilo sa, že zlúčeniny všeobecného vzorca 1 buď ako také alebo vo forme fyziologicky prijateľných solí a vrátane stereomérov, sú účinnými inhibítormi trombínu.

Zlúčeniny majú všeobecný vzorec 1

Vo všeobecnom vzorci 1 a texte, pokial ďalej nebude významy:

taktiež v prípade výskytu v ďalšom

I uvedené inak, platia nasledujúce

A predstavuje skupinu vzorca -CH₂-, -CH=CH-, -CH₂~CH₂- alebo -CH₂-CH₂-CH₂-,

R¹ a R² sú rovnaké alebo rozdielne a každý z nich predstavuje atóm vodíka alebo skupinu vzorca X-B-, kde B znamená priamu alebo rozvetvenú alkylénovú skupinu obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka a X znamená atóm vodíka, metyl, etyl, cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až 6 atómov uhlíka alebo skupinu vzorca R'CO-, kde R' znamená hydroxyskupinu, priamu alebo rozvetvenú alkoxyskupinu obsahujúcu 1 až 4 atómy uhlíka, aminoskupinu alebo skupinu vzorca NHR'', kde R'' znamená priamu alebo rozvetvenú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 atómy uhlíka alebo

X znamená zvyšok karboxylovej skupiny známy ako taký, zvolený z -PO(OR')₂, -SO₃H alebo 5-(lH)-tetrazolyl a

R'''znamená atóm vodíka, metyl alebo etyl alebo

B predstavuje skupinu vzorca -S0₂~ a

X znamená metyl alebo etyl, m predstavuje číslo 0, 1 alebo 2,

R³ znamená cyklohexylovú skupinu a r3A predstavuje atóm vodíka alebo m predstavuje číslo 1,

R³ znamená cyklohexylovú alebo fenylovú skupinu a

R^3A tvorí etylénový mostík spolu s R¹,

Y znamená atóm kyslíka alebo skupinu vzorca S(O)p, kde p predstavuje číslo 0, 1 alebo 2 a

R⁴ znamená atóm vodíka, priamu alebo rozvetvenú alkylovú alebo cylkoalkylovú skupinu obsahujúcu od 1 do 6 atómov uhlíka, ne substituovanú alebo substituovanú jedným alebo väčším počtom atómov fluóru a/alebo substituovanú fenylovú skupinu, substituovaný alebo nesubstituovaný aromatický kruh zvolený z fenylu,4-metoxyfenylu, 4-terc.-butylfenylu, 4-metylfenylu,

2-, 3- alebo 4-trifluórmetylfenylu a fenylu substituovaného 1 až 5 atómami uhlíka, alebo znamená -CH(CF₃)-fenyl.

Zlúčeniny všeobecného vzorca 1 sa vzťahujú ku peptidovej sekvencii ľudského fibrinogénového Aa reťazca, predstavujúceho modifikované polohy P₃ - Pj':

H-Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-

1	5	10
^P3 ^P2	^P1		^Pl' ^P2'	^P3 '
-Gly-Val·	-Arg—		—Gly-Pro·	-Arg-Val-
14 15	16		17	20

Táto sekvencia súhlasí so SEQ ID čís. 1 v súhrne sekvencii.

Podľa výhodného uskutočnenia sa tento vynález týka zlúčenín všeobecného vzorca 1, v ktorom

A znamená skupinu vzorca -CH₂-CH2“ alebo -CH2“CH2-CH₂-,

R¹ predstavuje atóm vodíka,

R² predstavuje skupinu vzorca HOCO(CH₂)_n- alebo

CH₃ch₂oco(ch₂)_n-, n je 1 alebo 2,

Y znamená atóm kyslíka, m znamená číslo 1,

R predstavuje cyklohexylovu skupinu a r3A predstavuje atóm vodíka.

Predovšetkým výhodné uskutočnenia vynálezov predstavujú zlúčeniny vzorcov:

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ , HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃, HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-nBu, H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu, H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ a H00C-CH₂~DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu.

Lekárske a farmaceutické použitie

Podľa ďalšieho stelesnenia sa tento vynález týka ošetrovania ľudského alebo zvieracieho organizmu pri stavoch, ktoré vyžadujú inhibíciu trombínu. Predpokladá sa, že zlúčeniny podľa tohoto vynálezu sú vhodné predovšetkým u živočíchov, vrátane človeka na ošetrovanie alebo profylaxiu trombózy a hyperkoagulovateľnosti v krvi a tkanivách. Chorobné stavy, pri ktorých zlúčeniny majú potenciálnu využiteľnosť pri ošetrovaní a/alebo profylaxii, zahrňujú trombózu žíl, pľúcnu embóliu, arteriálnu trombózu, ako pri infarkte myokardu, nestabilnej angíne, mŕtvici na základe trombózy a periférnej arteriálnej trombóze. Ďalej sa očakáva použitie v profylaxii arterosklerotických ochorení, ako sú koronárne arteriálne choroby. Ďalej sa pri zlúčeninách očakáva, že sú použiteľné spolu s trombolytikami pri infarkte myokardu. Okrem toho sa u zlúčeninín predpokladá, že sú využiteľné v profylaxii po reoklúzii po trombolýze, perkutánnej transluminárnej angioplastike (PTCA) a koronárnych operačných premosteniach. Ďalej sa u zlúčenín očakáva ich použiteľnosť pri prevencii retrombózy po drobných chirurgických zákrokoch. Ešte ďalej sa predpokladá, že zlúčeniny sú vhodné pri antikoagulačnom ošetrovaní v súvislosti s umelými náhradami orgánov a srdcových chlopní. Pre zlúčeniny sa ďalej očakáva, že sú použiteľné pri antikoagulačnom ošetrovaní pri hemodialýze a pri roztrúsenej intravaskulárnej koagulácii. Denná dávka účinnej látky búde zvyčajne v rozmedzí od 0,1 do 10 g. Intravenózne roztoky s výhodou obsahujú od 0,1 do 100 mg/ml účinnej látky, zatiaľ čo dávkové jednotky s výhodou obsahujú od 1 do 1000 mg účinnej látky a s výhodou sa podávajú jeden až štyrikrát denne.

Ďašie očakávané použitie je pri preplachovani cievok a mechanických zariadení používaných u pacientov in vivo, a ako antikoagulačný prostriedok pri uchovávaní krvi, plazmy a iných krvných produktov in vitro.

Spôsob výroby zlúčenín

Ďalším predmetom tohoto vynálezu je spôsob výroby zlúčenín podía vynálezu. Vynález sa ďalej týka spôsobu výroby zlúčenín všeobecného vzorca 1, pričom tento spôsob spočíva v tom, že (spôsob I) atóm halogénu sa nahradí skupinou R⁴Y“ (kde Y predstavuje atóm kyslíka alebo síry) v halogénmetylketóne všeobecného vzorca

v ktorom

W¹ znamená koncovú chrániacu skupinu aminoskupiny, ako je terc.-butoxykarbonyl a

W² znamená chrániacu skupinu, ako je benzyloxykarbonyl, ¹ i (ako je ilustrované na spôsoboch A, D a F), ketón sa. redukuje na alkohol, odstráni sa koncová chrániaca skupina aminoskupiny, uskutoční sa zvyčajná peptidová kopulácia, potom sa alkohol oxiduje a získa sa chránený tripeptidketón, odstráni sa koncová chrániaca skupina aminoskupiny, potom sa vykoná N-alkylácia (ako je ilustrované spôsobmi A, B, G a H) a odstránia chrániace skupiny alebo sa nahradí chránený dipeptid pri kopulačnej reakcii uvedenej vyššie a ilustrovanej (napríklad spôsobom A iii) amino-koncovým N-alkylovaným-N-trifluóracylom chráneným dipeptidom (spôsob

K), potom sa uskutočni oxidácia a odstránenie chrániacej skupiny, alebo (spôsob II) uskutoční sa alkylácia R⁴-halogenidom α-ketolu všeobecného vzorca

W¹ a W² majú významy uvedené vyššie, (ako je ilustrované v spôsobe E) a potom sa uskutočnia ďalšie reakcie ako pri spôsobe I, alebo (spôsob III) pri použití modifikovanej Dakin-Westovej reakcie (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 8, 981 /1969/), ktorá sa aplikuje na tripeptidy (J. Org. Chem. 50, 1112 /1985/), sa nechá reagovať zlúčenina (alebo pri inom uskutočnení sa priamo použije amino-koncový N-alkylovaný N-trifluóracylom chránený dipeptid) všeobecného vzorca

O v ktorom

Ί O

W a W maju významy uvedene vyššie, so zlúčeninou všeobecného vzorca (T-CH₂-CO)₂O, v ktorom

T predstavuje atóm halogénu, skupinu vzorca R⁴O alebo R⁴S, a 4-dimetylaminopyridínom a potom sa nechá reagovať, ako je popísané pri spôsobe I.

V tých prípadoch, kedy výsledkom reakcie je zmes stereomérov, tieto stereoméry sa poprípade delia zvyčajnými chromátografickými alebo rekryštalizačnými technickými postupmi, a ak je to žiadúce, izoluje sa jediný stereomér.

Teraz sa uvádza podrobný popis vynálezu.

Ďalší popis je ilustráciou znakov vynálezu.

Spôsob syntézy a farmácie

Chemické postupy používané pri výrobe inhibítorov v tomto patente nárokovaných sú naznačené na schémach syntézy (spôsoby A až H) a v postupoch I a K. Potrebné alkoxymetylketóny alebo fenoxymetylketóny arginínu sa vyrábajú predovšetkým

I) náhradou atómu brómu v brómmetylketónoch skupinou vzorca R⁴O-, budí pri použití zlúčeniny vzorca NaOR⁴ (spôsob A) alebo pri použití fluoridu draselného (spôsoby D a F) alebo

II) alkyláciou arginínu α-ketolom pri použití oxidu strieborného a zlúčeniny vzorca R⁴I (pozri spôsob E).

Zvyčajné peptidové kopulačné reakcie sa používajú pre zavedenie DCha, Pro a ich analógov. Karboxyalkylová skupina na koncovom atóme dusíka sa zavádza buď alkyláciou pri použití brómacetátov, Michaelovou adíciou na terciárny butylakrylát (spôsoby A a B) alebo použitím preinkorporácie karboxylalkylu do peptidovej časti (pozri spôsob K). Všetky chrániace skupiny sa potom odstránia (pozri spôsoby odstraňovania chrániacej skupiny a) až c) uvedené ďalej).

Všeobecné experimentálne spôsoby

Zvyčajné spracovanie sa vzťahuje na extrakcie uskutočnené etylacetátom, bežné premývanie 0,3-molárnym roztokom hydrogensíranu sodného, 1-molárnym roztokom hydrogenuhličitanu draselného, vodou a roztokom chloridu sodného, potom filtráciou cez filtračný papier Whatman Phase Separatory Páper a vysušenie azeotropickou destiláciou s toluénom. Chromatografia na tenkej vrstve sa uskutočňuje na komerčne dostupných poťahovaných sklenených doštičkách Merck Silikagél 60F254. Vizualizácia sa dosahuje kombináciou ultrafialového žiarenia, zahriatia s nasledujúcim postrekom fluoreskamínom alebo zahriatím s nasledujúcou chloráciou (zásobník chlóru) a postriekaním s 1 % škrobovým roztokom jodidu draselného. Velmi rýchla chromagrafia sa uskutočňuje na silikagéle (Merck Silikagél 60 ; 40 až 63 μη) za tlaku dusíka.. Analýza aminokyselín sa uskutočňuje za použitia systému Beckman Gold. Peptidy sa hydrolyzujú (6-normálnou kyselinou chlorovodíkovou a fenolom pri teplote 110 ’C počas 22 hodín), potom sa injekčné zavedú a kvantitatívne sa stanoví prolínový pík. Strednotlaková kvapalinová chromatografia sa uskutočňuje v sklenenej kolóne (Anachem) naplnenej oxidom kremičitým (Vydac C18, 15 až 25 μπι), pri použití gradientu od 1 % kyseliny trifluóroctovej v acetonitrile do 1 % kyseliny trifluóroctovej vo vode, s kontrolou pri vlnovej dĺžke 226 nm. Frakcie sa analyzujú vysokotlakovou kvapalinovou chromatograf iou a čisté frakcie sa spoja a lyofilizujú. Vysokotlaková kvapalinová chromatografia sa uskutočňuje pri použití chromatograf ického zariadenia Spectra-Physics 8700 Šerieš. Rozpúšťadlový systém, tak ako pre strednotlakovú kvapalinovú chromatografiu, sa podrobuje detekcii pri vlnovej dĺžke 210 nm a prietoku 1,5 ml/min na kolóne naplnenej Novapack C18 (4 μπι, patróna 8 x 100 mm, Wa12 ters). Všetky medziprodukty sú charakterizované NMR (zariadenie Hitachi-Perkin Elmer R24, 60 Hz alebo Jeol 270 MHz). Všetky finálne peptidy sú charakterizované svojimi FAB hmotnostnými spektrami (na zariadení M-Scan Ascot, Berks., Velká Británia).

Spôsob výroby východiskových zlúčenín

Boc-Arg (Z 2) -CH₂Br

i) 10 mmol Boc-Arg(Z₂)-0H v 50 ml suchého tetrahydrofuránu a 10 mmol N-metylmorfolínu sa ochladí na teplotu -10 ’C a prikvapká sa 10 mmol izobutylchloroformiátu pri udržiavaní teploty -10 ’C počas 45 minút. Po ďalších 10 minútach sa pri teplote -10 ’C zmesný anhydrid vyleje na zmes 25 mmol CH₂N₂ v 150 ml éteru. Po 3 hodinách sa prebytok CH₂N₂ rozloží kyselinou octovou a roztok sa trikrát premyje vodou a potom roztokom chloridu sodného. Vysušením a odparením sa získa diazoketón vo forme žltého oleja. IČ spektrum 2100 cnT^ (000ΗΝ₂).

ii) 10 mmol diazoketónu v 200 ml suchého etylacetátu sa ochladí na teplotu -15 ’C a potom sa prikvapká približne 11 ml 1-molárnej kyseliny bromovodíkovej v etylacetáte KedĹ žltá farba zmizne, chromatografia na tenkej vrstve (zmes etylacetátu a hexánu) ukáže úplnú konverziu diazoketónu na brómmetylketón. Roztok sa rýchle prenesie do deliaceho lievika a premyje 1-molárnym roztokom hydrogénuhličitanu sodného, roztokpm chloridu sodného, vysuší a odparí, čím poskytne tuhú látku. Rozpúšťaním v horúcom etanole a ochladením sa získa brómmetylketón, ktorý je tvorený amorfným bielym práškom.

NMR spektrum (CDCI3): 8 1,3 (5, 9H) , 1,5 až 1,85 (m, 4H) , 3,75 až 3,95 (m + s, 4H), 4,3 (m, 1H), 5,05 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,65 (d, 2H), 7,30 (m, 10H), 9,2 (široký singlet, 1H), 9,3 (široký singlet, 1H) ppm. Teplota topenia: mäknutie pri 50 ’C, potom pomalý rozklad pri > 70 ’C.

Boc-DCha-X-ONSu (X = Pro, Pic alebo Aze)

i) 10 mmol Boc-DCha-OH v 50 ml zmesi metylénchloridu a dime13 tylformamidu v pomere 1 : 5 sa spracuje s 11 mmol N-hydroxysukcínimidu, ochladí na teplotu 0 °C a pridá sa 13 mmol karbodiimidu rozpustného vo vode. Po 30 minútach sa reakčná zmes zahreje na laboratórnu teplotu. Po ďalších 3 hodinách chromatografia na tenkej vrstve ukáže kvantitatívny vznik Boc-DCha-ONSu. K reakčnej zmesi sa pridá 200 ml dietyléteru a všetko sa premyje trikrát vodou, roztokom chloridu sodného a vysuší. Získa sa ester vo forme bezfarebnej peny.

ii) 10 mmol N-hydroxysukcínimidoesteru v 50 ml metylénchloridu sa spracuje s 11 mmol H-Pro-OBzl.HC1, H-Pic-OBzl.HC1 alebo H-Aze-OBzl.HC1 a 20 mmol diizopropyletylamínu. Všetko sa mieša počas 3 hodín a potom spracuje zvyčajným spôsobom s etylacetátom a 0,3-molárnym hydrogensíranom draselným. Získa sa dipeptidester, ktorý je dostatočne čistý pre použitie v nasledujúcom stupni.

iii) Boc-DCha-X-OBzl v tetrahydrofuráne sa hydrogenuje na 5 % paládiu na uhlí pri laboratórnej teplote a normálnom tlaku počas 4 hodín. Filtráciou a odparením sa získa kyselina, ako tuhá látka alebo pena. Rekryštalizáciou z diizopropyléteru alebo zmesi dietyléteru a hexánu sa získajú čisté zlúčeniny.

Boc-DCha-Pro-OH (tuhá látka, teplota topenia 163 až 166 ’C): NMR spektrum (CDC1₃): δ 0,8 až 2,05 (m + s, pri 1,4, 26H), 3,4 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 4,5 (m, 2H), 5,2 (m, 1H) ppm.

Boc-DCha-Pic-OH (tuhá látka, teplota topenia 121 až 122 ’C): NMR spektrum (CDC1₃): δ 0,8 až 2,05 (m + s, pri 1,45, 28H), 3,35 (m, 1H), 3,95 (m, 1H), 4,6 až 4,9 (m, 1H), 5,4 (m, 1H), 5,6 (m, 1H), 8,8 (široký singlet, 1H) ppm.

Boe-(Me)DCha-Pro-ONSu

Boc-(Me)DPhe-OH sa hydrogenuje na 5 % ródiu na uhlí v 90 % vodnej kyseline octovej pri tlaku 410 kPa počas 3 dní. V kvantitatívnom výťažku sa získa Boc-(Me)DCha-OH. 10 mmol

Boc-(Me)DCha-OH a 10 mmol N-metylmorfolínu v 50 ml metylénchloridu sa ochladí na teplotu -15 ’C a pridá sa 10 mmol Ph₂PO-Cl. Po minútach sa pridá 11 mmol H-Pro-OBzl .HC1 a 20 mmol

- 14 N-metylmorfolínu. Po jednej hodine sa reakčná zmes nechá zahriať na laboratórnu teplotu a po dvojhodinovom odstátí sa reakčná zmes spracuje zvyčajným spôsobom. Veľmi rýchlou chromatografiou (pri eluovaní zmesou 40 % etylacetátu v hexáne) sa získa Boc-(Me)DCha-Pro-OBzl ako bezfarebný olej (80 % teórie).

NMR spektrum (CDC1₃): δ 0,5 až 2,2 (m + s, pri 1,4, 26H), 2,65 (s, 3H), 3,5 (m, 2H), 4,3 až 5,0 (m, 2H), 5,1 (s, 2H), 7,30 (s, 5H) ppm.

Táto zlúčenina sa konvetuje na N-hydroxysukcínimidoester ako je popísané ďalej pre Boc-DCha-X-ONSu.

Schéma syntézy

Spôsob A

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br + “OR⁴ (i)

DMF

-----> Boc-Arg(Z ₂)-CH₂OR⁴-20 ^e napríklad R⁴ = CH₂CF₃, CH(Ph)CF₃, aryl

		(ii)		NaBH₄
				MeOH, 0 °C
	(iii)		r
R*	1) HCl-dioxán			R* ,
Boc-DCha-X-N	OR⁴ <--------------------	Boc-N	OR⁴
H OH	2) Boc-DCha-X-ONSu alebo	H	OH
	[Boe-(Me)DCha-X-ONSu]

(iv)

Dess-Martinov perjodistan (v)

1) HCl-dioxán

2) RO₂CCH₂Br

Boc-DCha-X-Arg(Z ₂)-CH₂OR⁴ ----------------->

alebo iPr₂NEt,MeCN,a [Boe-(Me)DCha-X-Arg(Z ₂)-CH₂OR⁴]

Y'-DCha-X-Arg(Z ₂)CH₂OR⁴

X = Pro, Pic, Aze

R = (CH₂)₃-NZ-C(NH)-NHZ alebo vynechané alebo spôsob G alebo spôsob H Y'= H, RO₂CCH₂ (R0₂CCH₂)2 (R-Bzl, tBu alebo Et)

Spôsob B

1) HCl-dioxán

2) EtOAc/

IM KHCO₃

Boc-DCha-X-Arg(z₂ )-CH₂OR⁴ -------------> tBuO₂CCH₂CH₂-DCha-X-Arg(Z₂ )CH₂OR

3) tBu-akrylát

MeOh,Δ napríklad R⁴ = nBu,CH₂F₃

Spôsob C

Rh₂(OAo)₄Boc-Arg(Z₂)CHN₂ + HOR₄ -----------> Boc-Agr(Z₂)-CH₂OR₄

Potom sa pokračuje ako pri spôsobe A napríklad R₄ = CH₂CF₃, CH(Ph)CF₃, CH(CF₃)₂

Spôsob D (i) C1₃CCH₂-OH ch₂ci₂Boc-Arg(Z₂)-OH -----------WSCDI (ii)

1) HCl-dioxán

2) Boc-DCha-X-ONSu > Boc-Arg(Z₂)-OTce

4-DMAP

D

2)

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-OH (iv)

DMF

R⁴YH

--------------> Boc-DCha-X-Arg(Z ₂)-CH₂YR⁴

KF, laboratórna teplota, 24 hodín Potom sa pokračuje ako pri spôsobe A

Y = o, S

R⁴ = nBu, aryl, pre príklad 1: R⁴YH = HO₂CCOPh

Spôsob E (i)

KF

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br + HO₂CCOPh ----DMF > Boc-Arg(Z₂)-CH₂O₂CC0Ph hod.

(ii)

THF

IM KHCO₃

--------------> Boc-Arg(Z ₉)-CH^OH 24 hod.

(iii)

Ag₂° ch₂ci₂

--------—> Boc-Arg(Z 2)-CH₂OR⁴r⁴i napríklad

R₄ = Me, Et, nPr, nBu Potom sa pokračuje ako pri spôsobe A

Spôsob F

KF

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br + R⁴OH ----------->

DMF, 24 hod.

Boc-Arg(Z ₂)-CH₂OR⁴ napríklad r⁴ = ch₂cf₃, ch₂(cf₂)₂cf₃,

Ph(4-0Me)

Potom sa pokračuje ako pri spôsobe A

Spôsob G

Boc-DCha-X-Arg-(Z₂)-CH₂OR⁴

1) HCl-dioxán

------------> Me-SO₂-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

2) MeSO₂Cl napríklad R⁴ = CH₂CF₃ napríklad R⁴ = CH₂CF₃

Spôsob H

1) HCl-dioxán

Boc-DCha-X-Arg-(Z₂)-CH₂OR⁴ ------------> ChCH₂-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

2) ChCHO/NaCNBH₃

Spôsob výroby finálnych zlúčenín

Ďalej uvedené spôsoby výroby ilustrujú vyššie popísané spôsoby I až II rovnako ako nasledujúce stupne až do získania finálnych zlúčenín.

Spôsob A mmol Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br sa pridá ako tuhá látka k vopred pripravenému roztoku alkoxidu alebo fenoxidu (10 mmol alkoholu alebo fenolu a 10 mmol 80 % nátriumhydridu v oleji) v 40 ml dimetylformamidu pri teplote -20 ’C pod dusíkovou atmosférou. Po 2 hodinách sa k reakčnej zmesi pridá 0,3-molárny roztok hydrogensíranu draselného pre neutralizáciu poprípade zostávajúcej časti alkoxidu a potom sa dimetylformamid odparí za zníženého tlaku. Surová látka sa rozdelí medzi acetát a vodu, etylacetátová vrstva sa premyje roztokom chloridu sodného, vysuší a odparí. Veľmi rýchlou chromatografiou alebo kryštalizáciou sa získajú čisté alkoxyketóny.

Boc-Arg(Z₂)-CH₂OPh (tuhá látka): NMR spektrum (CDC1₃): δ 1,41 (s, 10H), 1,64 až 1,68 (m, 3H) , 3,92 (dd, 2H), 4,5 (m, 1H) , 4,62 (q, 2H), 5,1 (s, 2H), 5,2 (s, 2H), 5,5 (d, 1H), 6,8 (d, 2H), 6,95 (t, 1H), 7,2 až 7,45 (m, 12H), 9,2 (široký singlet, 1H), 9,3 (široký singlet, 1H) ppm. Teplota topenia: 115 až 118 ’C.

Boc-Arg(Z₂)-CH₂OCH₂CF₃ (tuhá látka): NMR spektrum (CDC1₃): δ

1.35 (S, 10H), 1,55 až 1,75 (m, 3H), 3,7 (q, 2H) 3,85 (m, 2H),

4,2 (q + m, 3H), 5,05 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,7 (d, 1H), 7,15 až

7.35 (m, 10H), 9,15 (široký singlet, 1H), 9,3 (široký singlet,

1H) ppm. Teplota topenia: 87 až 90 ’C.

ii) Alkoxymetylketón alebo fenoxymetylketón v zmesi metanolu a tetrahydrofuránu v pomere 1 : 1 sa pri teplote 0 'C spracuje s 1 ekvivalentom nátriumbórhydridu. Po 10 minútach sa k reakčnej zmesi pridáva 0,3-molárny roztok hydrogensíranu draselného až do hodnoty pH 7 a zmes sa odparí, aby sa odstránil metanol a tetrahydrofurán. K odparku sa pridá etylacetát a po zvyčajnom spracovaní (s etylacetátom a 0,3-molárnym roztokom hydrogensíranu dra- selného) sa izoluje alkohol ako zmes diastereomérov.

iii) Alkohol sa spracuje so 4-molárnou kyselinou chlorovodíkovou v dioxáne počas 15 minút pri laboratórnej teplote a rozpúšťadlo sa odparí. 1 mmol odparku sa rozpustí v 5 ml metylénchloridu a spracuje s 1 ekvivalentom Boc-DCha-X-ONSu a diizopropylamínom (do hodnoty pH 9 podlá vlhkého indikátorového papierika). Po 3 hodinách státia sa zvyčajným spracovaním získa modifikovaný tripeptid, ktorý sa čistí velmi rýchlou chromatografiou (pri eluovaní zmesou etylacetátu a hexánu, ktorá obsahujew 1 % kyseliny octovej). Výťažok zodpovedá 50 až 85 % teórie.

iv) Tripeptidalkohol v metylénchloride sa spracuje s 3 ekvivalentami Dess-Martinovho perjodátu (D. B. Dess a J. C. Martin, J. Org. Chem. 48, 4155 - 4156 /1983/). Reakčná zmes sa nechá stáť pri laboratórnej teplote počas 2 hodín a po zvyčajnom spracovaní (s etanolom, 1-molárnym roztokom hydrogénuhličitanu draselného a tiosiričitanom sodným) sa získajú surové tripeptidketóny, ktoré sa čistia velmi rýchlou chromatografiou (pri eluovaní zmesou etylacetátu a hexánu).

v) Ketón sa spracuje so 4-molárnym dioxánovým roztokom chlorovodíka počas 15 minút pri laboratórnej teplote a odparí sa.

mmol odparku v 5 ml acetonitrilu sa spracuje s 1,2 ekvivalentu benzylbrómacetátu alebo terc.-butylbrómacetátu a 3 ekvivalentami diizopropyletylamínu. Všetko sa varí pod spätným chladičom počas hodín, roztok sa odparí a podrobí velmi rýchlej chromatografii (eluovanie zmesou etylacetátu a hexánu). Získajú sa benzyloxykarbonylmetylpeptidy alebo terc.-butoxykarbonylmetylpeptidy vo forme oleja. Výťažok zodpovedá 40 až 50 % teórie.

V príkladoch 30 a 31 sa používa 2,5 ekvivalentu brómacetátu na dosiahnutie bis-alkylácie.

Spôsob B

Peptid-alkoxymetylketón sa spracuje s prebytkom 4-molárneho dioxánového roztoku chlorovodíka počas 15 minút pri laboratórnej teplote. Odparením sa získa hydrochlorid a táto sol sa rozdelí medzi etylacetát a 1-molárny roztok hydrogénuhličitanu draselného. Etylacetátová fáza sa oddelí, vysuší a odparením poskytne voľný amín, ktorý sa vyberie do metanolu a pridá sa 1,5 ekvivalentu čerstvo destilovaného terc.-butylakrylátu. Všetko sa varí pod spätným chladičom počas 4 hodín a získa sa terc.-butoxykarbonyletylpeptid, ktorý sa čistí veľmi rýchlou chromatografiou pri použití zmesi etylacetátu a hexánu na eluovanie.

Spôsob c mmol Boc-Arg(Z₂)-CHN₂ sa rozpustí v 5 ml alkoholu všeobecného vzorca R⁴OH a spracuje sa s octanom rodičitým ako katalyzátorom. Po niekoľkých hodinách pri laboratórnej teplote sa podľa analytického stanovenia chromatografiou na tenkej vrstve stanoví, že nie je prítomný žiaden diazoketón. Alkohol sa odparí za zníženého tlaku a zlúčenina sa izoluje veľmi rýchlou chromatografiou, za použitia zmesi etylacetátu a hexánu na eluovanie.

Spôsob D mmol Boc-Arg( Z₂)-0H v 50 ml suchého metylénchloridu sa spracuje s 11 mmol 2,2,2-trichlóretanolu a 1 mmol 4-dimetylaminopyridínu, ochladí na teplotu 0 °C a pridá sa 13 mmol karbodiimidu rozpustného vo vode. Po 30 minútach sa reakčná zmes nechá zahriať na laboratórnu teplotu a mieša sa počas 24 hodín. Odparením, rozdelením odparku medzi etylacetát a 0,3-molárny roztok hydrogensíranu draselného, potom trojnásobným premytím 0,3-molárnym hydrogensíranom draselným, jedným premytím vodou a jedným premytím roztokom chloridu sodného, vysušením a odparením sa získa

2,2,2-trichlóretylester, ktorý sa použije ako taký.

ii) 10 mmol 2,2,2-trichlóretylesteru sa spracuje s 50 ml

4-molárneho dioxánového roztoku chlorovodíka pri laboratórnej teplote počas 20 minút a potom sa odparí. Po vysušení sa odparok v 50 ml metylénchloridu spracuje postupne s 10 mmol Boc-DCha-X-ONSu (X znamená Pro, Pic) a diizopropyletylamínu (do hodnoty pH 9 podľa vlhkého indikátorového papierika). Všetko sa nechá stáť počas 3 hodín, potom sa spracuje zvyčajným spôsobom (etylacetát, 0,3-molárny roztok hydrogensíranu draselného) a zís- ka sa tripeptid ako olej. 10 mmol 2,2,2- trichlóretylesteru v 50 ml 90 % vodnej kyseline octovej sa spracováva v 5 minútových intervaloch s malými podielmi čerstvo aktivovaného zinku počas 1 hodiny. Po ďalšej hodine sa zmes filtruje a filtrát sa odparí. Zvyčajným spracovaním (s etylacetátom a 0,3-molárnym roztokom hydrogensíranu draselného) sa získa tripeptid a táto kyselina sa čistí velmi rýchlou chromátografiou na oxide kremičitom (eluovanie zmesou 2 % kyseliny octovej v etylacetáte). Získa sa tripeptid-kyselina ako bezfarebná pena (výťažok 80 % teórie v 3 stupňoch).

iii) Tripeptid-kyselina sa konvertuje v brómmetylketóne za použitia rovnakého spôsobu, ako je popísaný pre Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br. Tripeptid-brómmetylketón sa získa ako bezfarebný olej veľmi rýchlou chromátografiou pri použití zmesi etylacetátu a hexánu na eluovanie.

NMR spektrum (CDC1₃): δ 0,9 (m), 1,15 (m), 1,25 (m), 1,35 (s), 1,6 (m), 1,85 (m), 2,1 (m) (celkom 30H), 3,3 (m, 1H), 3,7 (m, 1H), 3,95 {m, 2H), 4,15 (s, 2H) , 4,25 (m, 1H) , 4,4 (m, 1H) , 4,5 (m, 1H), 5,0 (d, 1H) , 5,1 (dd, 2H), 5,2 (s, 2H), 7,2 až 7,4 (s, m, 10H), 9,2 až 9,5 (2 široké singlety, 2H) ppm.

iv) 1 mmol tripeptidbrómmetylketónu v 5 ml suchého dimetylformamidu sa spracuje s 1,2 mmol fluórovaného alkoholu, fenolu alebo tiolu a 1,5 mmol bezvodého fluoridu draselného a mieša pri laboratórnej teplote počas 24 hodin. Odparením, potom zvyčajným spracovaním a velmi rýchlou chromátografiou sa získajú tripeptidketóny.

Boc-DCha-Pro-Arg(Z₂)-CH₂0-Ph(4-Me): NMR spektrum (CDC1₃): δ 0,9 (m), 1,15 (m), 1,25 (m), 1,35 (s), 1,6 (m), 1,85 (m), 2,1 (m) (celkom 30H), 2,38 (s, 3H), 3,4 (m, 1H), 3,9 (m, 1H), 4,1 (široký singlet, 2H) , 4,4 (m, 1H), 4,6 (m, 1H), 4,7 (m, 1H) , 4,9 (q, 2H) ,

6,9 (d, 1H), 7,15 (d, 1H), 7,4 až 7,5 (m, 2H), 7,45 (s, 10H), 9,4 (široký singlet, 1H), 9,6 ( široký singlet, 1H) ppm.

V príklade 37 sa chránený sulfid oxiduje na sulfón pri použití kyseliny m-chlórperbenzoovej v metylénchloride pri laboratórnej teplote.

Spôsob E

i) 10 mmol Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br a 12 mmol kyseliny benzoylmravčej v 40 ml dimetylformamidu sa uvedie do styku so 14 mmol fluoridu draselného. Všetko sa mieša počas 3 hodín, dimetylformamid sa odparí a produkt sa rozdelí medzi etylacetát a vodu. Vyysušením a odparením sa získa surový ester, benzoylformiát, ktorý sa čistí kryštalizáciou zo zmesi metylénchloridu a hexánu. Získa sa pripravovaná zlúčenina ako biela tuhá látka. Výťažok zodpovedá 86 % teórie.

NMR spektrum (CDC1₃): δ 1,4 (s, 9H), 1,65 až 1,9 (m, 4H), 3,95 (m, 2H), 4,3 (m, 1H), 4,95 (q, 2H), 5,15 (ABq, 2H), 5,25 (s, 2H), 5,9 (d, 1H), 7,35 (m, 10H), 7,5 (t, 2H), 7,65 (t, 1H), 8,15 (t, 2H), 9,25 (široký singlet, 1H), 9,45 (široký singlet, 1H) ppm. Teplota topenia: 130 až 132 ’C.

ii) 5 mmol benzoylformiátu v 200 ml tetrahydrofuránu a 200 ml 1-molárneho roztoku hydrogénuhličitanu draselného sa intenzívne mieša pri laboratórnej teplote počas 24 hodín. Tetrahydrofuránová fáza sa oddelí a odparí a vodná fáza sa extrahuje etylacetátom. Extrakt sa spojí s látkou získanou po odparení tetrahydrofuránu. Kryštalizáciou zo zmesi metylénchloridu a hexánu sa získa α-ketol vo forme bielej tuhej látky. Výťažok zodpovedá 90 % teórie.

NMR spektrum (CDC1₃): δ 1,4 (s, 9H), 1,7 (m, 4H), 2,95 (t, 1H), 3,95 (m, 2H), 4,25 (m, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,25 (s, 2H), 5,6 (d, 1H), 7,35 (m, 10H), 9,25 (široký singlet, 1H), 9,4 (široký singlet, 1H) ppm. Teplota topenia: 101 až 103 ’C.

iii) 1 mmol α-ketolu v 5 ml suchého metylénchloridu sa spracuje s 5 až 10 mmol alkyljodidu a 2 mmol oxidu strieborného. Zmes sa varí pod spätným chladičom v tme počas 2 až 17 hodín (napríklad v prípade metyljodidu, etyljodidu a n-propyljodidu počas 2 hodín a v prípade n-butyljodidu počas 5 hodín). Odparením a potom veľmi rýchlou chromatografiou (za eluovania zmesou etylacetátu a hexánu) sa získajú alkoxymetylketóny, ako bezfarebný olej. Výťažok zodpovedá 50 až 85 % teórie.

Boc-Arg(Z₂)-CH₂OEt (olej): NMR spektrum (CDC1₃): δ 1,15 (t, 3H), 1,4 (s, 9H), 1,5 až 1,8 (m, 4H), 3,4 (q, 2H), 3,95 (t, 2H), 4,1 (q, 2H), 4,45 (m, 1H), 5,15 (s, 2H), 5,25 (s, 2H), 5,4 (d, 1H) , 7,35 (m, 10H), 9,25 (široký singlet, 1H), 9,4 (široký singlet, 1H) ppm.

Boc-Arg(Z₂)-CH₂NBu (olej): NMR spektrum (CDC1₃): δ 0,9 (t, 3H), 1,25 až 1,8 (m) + 1,4 (s) (17H), 3,3 (dd, 2H), 3,95 (t, 2H), 4,05 (q, 2H), 4,45 (m, 1H), 5,1 (s, 2H), 5,2 (s, 2H), 5,35 (d, 1H), 7,35 (m, 10H), 9,25 (široký singlet, 1H), 9,4 (široký singlet, 1H) ppm.

Spôsob F

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br sa spracuje s CF₃CH₂OH, CF₃(CF₂)₂CH₂OH alebo Ar-OH a fluoridom draselným v dimetylformamide pri použití postupu vyznačeného v spôsobe D iv).

Spôsob G

Peptidy chránené Boe sa spracujú so 4-molárnym dioxánovým roztokom chlorovodíka pri leboratórnej teplote počas 15 minút a odparia. Odparok sa rozpustí v metylénchloride a uvedie do styku s 1 ekvivalentom metylsulfonylchloridu a 2,5 ekvivalentami diizopropylamínu. Reakčná zmes sa nechá stáť počas 1 hodiny, spracuje sa zvyčajným spôsobom a podrobí veľmi rýchlej chromátografii. Odstránenie chrániacej skupiny sa uskutoční ako je popísané pri spôsobe chrániacej skupiny a).

Spôsob H

Peptidy sa zbavia chrániacej skupiny Boe ako je uvedené vyššie, premyjú kyselinou chlorovodíkovou a potom sa rozdelia medzi etylacetát a 1-molárny roztok hydrogénuhličitanu draselné23 ho. Voľné ámíny v studenom metanole sa ochladia na teplotu 0 °C a spracujú s 1,5 ekvivalentom aldehydu všeobecného vzorca Ch-CHO a 1 ekvivalentom nátriumkyánbórhydridu. Po jednej hodine sa reakčná zmes odparí za studená a podrobí veľmi rýchlej chromatograf ii, aby sa získal N-alkylovaný peptid. Odstránenie chrániacej skupiny sa uskutoční za použitia spôsobu ako pre odstránenie chrániacej skupiny a).

Spôsob I

Boc-(3-trans-fenyl)-D,L-prolin sa vyrobí ako popísal Chung a kol. v J. Org. Chem. 55, 270 (1990) a kopuluje s H-Pro-OBzl, ako je popísané vyššie pre Boc-(Me)DCha-Pro-OBzl. Dipeptid sa potom konvertuje na -ONSu ester ako je popísané ďalej.

Boc-(3-trans-cyklohexyl)-D,L-prolín sa vyrobí z fenylového analógu hydrogenáciou na 5 % ródiu na uhlí v 90 % vodnej kyseline octovej pri tlaku 410 kPa počas 3 dní.

Spôsob K

Spôsob syntézy medziproduktu

N-(BzlO₂C-CH₂-),N-(CF₃CO)-DCha-Pro-ONSu (i) H₂ -Pd/C (ii) BZ1O₂C-CHO NaCNBHg

Z-DCha-Pro-OtBu ----------------> N-(BzlO₂C-CH₂-) ,N-(CF₃CO)DCha-Pro-ONSu (iii) (CF₃CO)₂O (ÍV) TFA (v) HONSu, WSCDI

i) Z-DCha-Pro-OtBu (vyrobený zvyčajnou kopulačnou reakciou pre výrobu peptidov) sa hydrogenuje v tetrahydrofuráne v prítomnosti 5 % paládia na uhlí pri zvyčajnej teplote a normálnom tlaku počas 24 hodín. Filtráciou a odparením sa vo výťažku 100 % teórie získa požadovaný H-DCha-Pro-OtBu, ktorý tvorí olej.

ii) Zmes 2 mmol vyššie uvedenej zlúčeniny a 1 ekvivalent benzylglyoxylátu v benzéne sa pre odstránenie vody podrobí trojnásobnému odparovaniu, pričom vždy sa pridá čerstvý benzén. 2 mmol výsledného imínu v 8 ml 1 % kyseliny octovej v metanole sa spracujú s 2 mmol nátriumkyánbórhydridu. Po jednej hodine sa reakčná zmes odparí a odparok sa podrobí veľmi rýchlej chromatografii na oxide kremičitom, pri eluovaní 60 % etylacetátom v hexáne. Získa sa 385 mg Bzl0₂C-CH₂-DCha-Pro-0tBu. Výťažok zodpovedá 41 % teórie.

iii) 380 mg vyššie uvedenej zlúčeniny v 8 ml suchého metylénchloridu sa spracuje s 2 ekvivalentami trietylamínu a 1,2 ekvivalentom anhydridu kyseliny trifluóroctovej. Po 40 minútach sa reakčná zmes odparí a odparok sa podrobí veľmi rýchlej chromatografii. Vo forme oleja sa získa 390 mg N-(BzlO₂C-CH₂-), N-(CF₃CO)-DCha-Pro-OtBu. Výťažok zodpovedá 86 % teórie.

spektrum (CDC1₃) - komplex v dôsledku prítomnosti 4 rotamérov - napríklad terc.-butylovej skupiny pri & 1,4 až 1,5 sa štyrikrát štiepi v pomere 1 : 0,25 : 0,8 : 0,4 ; 0,9 (m), 1,1 (m), 1,65 (m), 1,95 (m), 2,2 (m) (17H), 1,4 až 1,5 (4xs, 9H), 3,1 (m), 3,5 (m), 3,7 (m), (2H), 4,3 až 4,6 (m, 3H), 5,05 až 5,4 (m, 3H), 7,35 (S, 5H) ppm.

iv) 335 mg vyššie uvedenej zlúčeniny sa spracuje s 8 ml zmesi metylénchloridu a kyseliny trifluóroctovej v pomere 1 : 1 pri laboratórnej teplote počas 2,5 hodiny. Reakčná zmes sa odparí a potom ešte trikrát odparí s toluénom. Získa sa voľná kyselina vo výťažku zodpovedajúcom 100 % teórie.

v) Vyššie uvedená kyselina sa konvertuje na svoj -ONSu ester vo výťažku 100 % teórie za použitia N-hydroxysukcínimidu, ako je popísané vyššie pre Boc-DCha-OH.

Medziprodukt sa môže kopulovať na H-Arg(Z₂)-CH₂-Y-R⁴ za použitia všeobecných spôsobov, ktoré už boli uvedené. Spôsob odstránenia chrániacich skupín poskytne peptid chránený skupinou vzorca -N-CF₃-CO-. Táto skupina sa odstráni spôsobom popísaným pod d).

Spôsoby odstránenia chrániacej skupiny

a) Chránený peptid v zmesi metanolu a vody v pomere 3:1, ktorá obsahuje 2 ekvivalenty 1-molárnej kyseliny chlorovodíkovej, sa hydrogenuje v prítomnosti 5 % paládia na uhlí, pri zvyčajných teplotných a tlakových podmienkach počas 40 minút. Filtráciou (0,2 μπι) a odparením s následujúcou lyofilizáciou z vody sa získajú peptidy ako vločkové tuhé látky. Čistenie, pokial je potrebné, sa uskutočňuje strednotlakovou kvapalinovou chromatografiou (pozri všeobecné spôsoby).

b) Chránený peptid sa najskôr uvádza do styku so zmesou kyseliny trifluóroctovej a metylénchloridu v pomere 1 : 1 počas 1 hodiny a odparí. Potom sa uskutoční hydrogenácia, ako je popísané pod a).

c) Skupina vzorca COCOPh sa najskôr hydrolyzuje, ako je popísané pod E ii), a potom hydrogenuje vodíkom v prítomnosti paládia na uhlí, ako je popísané pod a).

d) Odstránenie N-CF₃-CO-(N-trifluóracetylu)

N-Trifluóracetylpeptid sa rozpustí v zmesi acetonitrilu, vody a amoniaku s hustotou 0,880 v pomere 1:1:1a udržuje pri laboratórnej teplote počas 24 hodín. Odparením a potom čistením, pokiaľ je to potrebné, sa získa požadovaný peptid.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklady uvedené ďalej ilustrujú podrobnejšie podstatu tohto vynálezu.

Príklady zlúčenín sú uvedené v tabuľke 1. Tabuľka 2 uvádza spôsoby použité pri ich výrobe v časti označenej nadpisom spôsob výroby. Tabuľka 3 obsahuje charakterizujúce hodnoty zhrnutých zlúčenín.

Príklady 1 až 37

- 26 Tabuľka 1

Príklad č.

Vzorec

H-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-OH

H-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Me

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH(CF₃)₂

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-C*H(Ph)-CF₃

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃

Et-00C-CH₂-DCha-Pro~D,LArg-CH₂-0-CH₂-CF₃

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₂-CF₂-CF₃

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph HOOC-CH₂-DCha-Pro-D, LArg-CH₂-O-Ph( 4-OMe) H00C-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-Ph( 4-tBu) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D, LArg-CH₂-O-Ph (4-Me) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(4-F) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-Ph(3-F) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(2-F) H00C-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-Ph( 3-CF₃) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D, LArg-CH₂-O-Ph (4-CF₃) H00C-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-Ph( 2-CF₃) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D, LArg-CH₂-O-CgH₅HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Et H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nPr H00C-CH₂-DCha~Pro-Arg-CH₂-0-nBu H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-iBu HOOC-CH₂-DCha-Aze-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃HOOC-CH₂-DCha-PÍC-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-nBu Me-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃Me-S0₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃Ch-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃(HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃(HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-iBu HOOC-CH₂-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-nBu H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃H-(3-trans-Ph)-D,LPro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃H- ( 3-trans-Ch) -D, LPro-D, LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃ .T.’

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-S-nBu

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-SO₂~nBu * absolútna konfigurácia R alebo S

Tabulka 2

Príklad č

Spôsob výroby

Spôsob odstránenia chrániacej skupiny alebo alebo alebo alebo

29	A a	H	a
30	A		a
31	E		a
32	E a	B	b
33	A a	B	b
34	I a	A	b
35	I a	A	b
36	D		a
37	D		a

Tabuľka 3

Mol. hmôt.

Príklad	retencia**	FAB MS	AAA:peptid	HPLC
č.	(min)/systém	(M +1)	Obsah (%)*	čas
1	438,57	439	56/Pro	10,3/E
2	452,60	453	65/Pro	9,9/E
3	520,6	521	59/Pro	8,6/A
4	588,6	589	60/Pro	10,7/A
5	596,7	597	61/Pro	12,2/A
6	578,64	579	72/Pro	14,8/C
7	606,69	607,7	65/Pro	22,0/B
8	678,65	679,8	76/Pro	18,2/G
9	572,71	573,3	73/Pro	19,9/B
10	602,74	603,8	76/Pro	13,4/G
11	628,82	629,5	77/Pro	22,0/G
12	586,74	587,2	75/Pro	16,0/G
13	590,70	591,4	76/Pro	15,2/G
14	590,70	591,4	63/Pro	15,0/G
15	590,70	591,4	54/Pro	14,0/G
16	640,71	641,5	68/Pro	19,0/G
17	640,71	641,6	70/Pro	20,0/G
1.8	640,71	641,4	65/Pro	18,4/G
19	662,66	663	49/Pro	21,0/G
20	524,67	525,4	79/Pro	15,5/B
21	538,69	539	67/Pro	9,2/F

22	552,72	553	69/Pro	19,3/B
23	552,72	553,4	56/Pro	9,2/F
24	564,61	565	67/Aze	13,6/D
25	592,66	593	90/Pic	8,4/D
26	566,75	567,4	86/Pic	17,0/G
27	534,63	535,6	70/Pro	18,8/B
28	598,69	599	71/Pro	11,2/D
29	616,77	617	64/Pro	14,5/C
30	636,67	637,6	70/Pro	12,0/A
31	610,76	611,2	67/Pro	10,0/F
32	566,75	567,5	65/Pro	19,7/B
33	592,66	593	46/Pro	10,6/F
34	540,59	541	56/Pro	14,3/C
35	546,64	547	49/Pro	15,9/C
36	568,78	569,4	45/Pro	17,4/G
37	600,78	601,3	62/Pro	14,6/G
* **	Vztiahnuté na aminokyselinu, ako je uvedené. Pozri všeobecné experimentálne postupy. Časy sú	uvedené pre
	epiméry L-Arg. D-	-epiméry (minoritné	zložky) zvyčajne pretekajú

približne o 30 sekúnd skôr.

Systém A: 20 - 80 %, 25 min (z 20 % sa zvyšuje na 80 %, 1 % kyselina trifluóroctová/acetonitril v 1 % kyseline trifluóroctovej /voda, počas 25 minút),

Systém	B:	10 - 60	%,	30 min.
Systém	C:	10 - 90	%,	30 min.
Systém	D:	30 - 100	%,	30 min.
Systém	E:	10 - 90	%,	20 min.
Systém	F:	20 - 100		20 min.
Systém	B:	20 - 70		30 min.

Príklad 38

Roztok pre kontinuálne intravenózne podanie

Roztok sa pripraví z týchto zložiek:

Inhibítor trombínu Chlorid sodný pre Voda pre injekcie injekcie mg

4,5 g do 500 ml

Účinná látka roztok filtruje, ciou cez sterilný do sterilných flaštičiek pre infúziu.

a chlorid sodný sa rozpustia vo vode a potom sa ďalej sterilizuje autoklávovaním filter 0,2 μιη a plní za alebo filtráaseptických podmienok

Príklad 39

Roztok pre injekcie

Roztok sa pripraví z týchto zložiek:

Inhibítor trombínu Chlorid sodný pre Voda pre injekcie injekcie do

1000 g g ml

Účinná látka roztok filtruje, ciou cez sterilný do sterilných ampúl s objemom 5 ml.

a chlorid sodný sa rozpustia vo vode a potom sa ďalej sterilizuje autoklávovaním filter 0,2 μιη a plní alebo filtráza aseptických podmienok

Príklad 40

Roztok pre nasálne podanie

Roztok sa pripraví z týchto zložiek:

Inhibítor trombínu

Glycerol

Metyl-p-hydroxybenzoát

Propyl-p-hydroxybenzoát

Voda pre injekcie g

200 g g

0,2 g do 1000 ml

Účinná látka a konzervačné prostriedky sa rozpustia v glycerole a hlavnej podiele vody. Potom sa objem upraví na 1000 ml a roztok sa plní do sterilných polyetylénových zásobničkov.

Príklad 41

Tablety pre orálne podanie

1000 tabliet sa pripraví z týchto zložiek:

Inhibítor trombínu

Laktóza

Polyvinylpyrolidón Mikrokryštalická celulóza Stearát hoŕečnatý

100 g

200 g g

g g

Účinná látka a laktóza sa zmiešajú s vodným roztokom polyvinylpyrolidónu. Zmes sa suší a melie za vzniku granúl. K zmesi sa potom primieša mikrokryštalická celulóza a potom stearát horečnatý. Potom sa zmes lisuje na tabletovacom stroji a získa sa 1000 tabliet, z ktorých každá obsahuje 100 mg účinnej látky.

Príklad 42

Želatínové kapsule pre orálne podanie

Želatínové kapsule sa naplnia zmesou, ktorá pozostáva z týchto zložiek:

Inhibítor trombínu 50g

Stearát hoŕečnatý 3g

Laktóza 100g

Biologické hodnotenie

Stanovenie zrážanlivosti trombínu a IC_5QTT

Ľudský trombín (T 6769, Sigma Chem. Co.) v 100 μΐ tlmivého roztoku s hodnotou pH 7,4 a 100 μΐ inhibítorového roztoku sa inkubuje počas 1 minúty. K roztoku sa potom pridá 100 μΐ zásobnej normálnej íudskej plazmy spracovanej s citrátom a zrážanlivosť sa meria na automatickom prístroji KC 10 (Amelung).

Zrážanlivosť vyyjadrená v sekundách sa vynesie oproti koncentrácii inhibítora a hodnoty IC_5QTT sa stanovia interpoláciou.

IC₅₀TT predstavuje koncentráciu inhibítora, ktorá vedie k dvojnásobnej trombínovej zrážanlivosti pre ľudskú plazmu. ρΙΟ^θΤΤ je -log 10 z IC₅₀TT v mol/1. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.

Tabuľka 4

Príklad č.

pIC₅₀TT

1	7,71
2	7,81
3	7,92
4	7,38
5	7,77
6	8,04
7	7,70
8	7,64
9	8,45
10	7,90
11	7,86
12	8,25
13	8,22
14	8,15
15	8,12
16	7,77
17	8,68
18	7,30
19	8,27
20	8,17
21	8,14
22	8,69
23	7,64
24	8,01
25	8,00
26	7,89
27	7,52

28	6,85
29	6,47
30	7,38
31	6,88
32	7,63
33	7,78
34	7,03
35	7,25
36	7,57
37	7,72

Vysvetlenie skratiek

V popisnej časti, patentových nárokoch a predovšetkým v schémach a tabuľkách sa používajú skratky, ktoré majú tieto významy:

4-DMAP =	4-dimetylaminopyridín
AAA =	analýza aminokyseliny
Arg = Arg(Z₂) = Aze =	L-arginín ÚN, N-dibenzyloxykarbonyl-L-arginín kyselina L-azetidín-2-karboxylová
Boe =	terc.-butoxykarbonyl
Bu =	butyl
Bzl =	benzyl
Ch =	cyklohexyl
Cha =	L-p-cyklohexylalanín
DMF =	dimetylformamid
Et =	etyl
EtOAc =	etylacetát
FAB =	bombardovanie rýchlymi atómami

FI až FXIII = koagulačný faktor I až XIII

FIl_a až FXIII_a = aktivovaná forma koagulačných faktorov II až

Gly = HMW-K = '

XIII glycín kininogén s vysokou molekulovou hmotnosťou

HOAc =	kyselina octová
HONSu =	N-hydroxysukcínimid
ÍBC =	izobutylchloroformiát
Kalí =	kalíikrein
Me =	metyl
NMM =	N-metylmorfolín
Nph =	naftyl
Ph =	fenyl
Pic =	kyselina L-pipekolínová
PL =	fosfolipidy
Pr =	propyl
Prekall =	prekallikrein
Pro =	L-prolín
Tce =	2,2,2-trichlóretyl
TFA =	kyselina trifluóroctová
THF =	tetrahydrofurán
Val =	L-valín
WSCDI =	karbiimid rozpustný vo vode
Z =	benzyloxykarbonyl

Prefixy n, izo a terc, majú svoje zvyčajné významy a znamenajú normálny, izo a terciárny.

Prehlad sekvencií

Počet sekvencií: 1 (1) Informácie pre SEQ ID čís.: 1 (i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 20 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) Molekulárny typ: peptid (iii) Hypoteticky: nie (vij Pôvod zdroja:

- 35 (A) Organizmus: Homo sapiens (ix) Znaky:

(A) Názov/kíúč: peptid (B) Poloha: 1..20 (D) Ďalšie informácie:/poznámka = Peptidová sekvencia obsahujúca miesto štiepenia trombínu v ludskom fibrinogénovom Α-α-reťazci.

(ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: štiepiace miesto (B) Poloha: 16..17 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID čís. 1 =

Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg

10 15

Gly Pro Arg Val pľ 12'5-77

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Zlúčenina všeobecného vzorca 1 v ktorom

A predstavuje skupinu vzorca -CH₂-, -CH=CH~, -CH₂-CH₂- alebo

-ch₂-ch₂-ch₂-,

R¹ a R² sú rovnaké alebo rozdielne a každý z nich predstavuje atóm vodíka alebo skupinu vzorca X-B-, kde B znamená priamu alebo rozvetvenú alkylénovú skupinu obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka a

X znamená atóm vodíka, metyl, etyl, cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až 6 atómov uhlíka alebo skupinu vzorca R'CO-, kde R' znamená hydroxyskupinu, priamu alebo rozvetvenú alkoi xyskupinu obsahujúcu 1 až 4 atómy uhlíka, aminoskupinu alebo skupinu vzorca NHR'', kde R' · znamená priamu alebo rozvetvenú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 atómy uhlíka alebo

X znamená zvyšok karboxylovej skupiny známy ako taký, zvolený z -PO(OR''')₂, -SO^H alebo 5-(lH)-tetrazolyl a

R'''znamená atóm vodíka, metyl alebo etyl alebo

B predstavuje skupinu vzorca -S0₂- a

X znamená metyl alebo etyl, m predstavuje číslo 0, 1 alebo 2,

R³ znamená cyklohexylovú skupinu a r³A predstavuje atóm vodíka alebo m predstavuje číslo 1,

R³ znamená cyklohexylovú alebo fenylovú skupinu a

R^3A tvorí etylénový mostík spolu s R¹,

Y znamená atóm kyslíka alebo skupinu vzorca S(0)_p, kde p predstavuje číslo 0, 1 alebo 2 a

R⁴ znamená atóm vodíka, priamu alebo rozvetvenú alkylovú alebo cylkoalkylovú skupinu obsahujúcu od 1 do 6 atómov uhlíka, nesubstituovanú alebo substituovanú jedným alebo väčším počtom atómov fluóru a/alebo substituovanú fenylovú skupinu, substituovaný alebo nesubstituovaný aromatický kruh zvolený z fenylu, 4-metoxyfenylu, 4-terc.-butylfenylu,4-metylfenylu, 2-, 3- alebo 4-trifluórmetylfenylu a fenylu substituovaného 1 až 5 atómami uhlíka, alebo znamená -CH(CF₃)-fenyl.

buď alebo ako taká alebo vo forme fyziologicky prijateľnej soli a zahrňujúcej stereoméry.
2. Zlúčenina podľa nároku 1, kde

A znamená skupinu vzorca -CH₂-CH₂- alebo -CH₂-CH₂-CH₂-,

R¹ predstavuje atóm vodíka,

R² predstavuje skupinu vzorca HOCO(CH₂)_n- alebo ch₃ch₂oco(ch₂)_n-, n je 1 alebo 2,

Y znamená atóm kyslíka, m znamená číslo 1,

R³ predstavuje cyklohexylovú skupinu a r3A predstavuje atóm vodíka.
3. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorá je zvolená z

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-OH H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Me H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH(CF₃)₂

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-(R aleebo S)CH(Ph)-CF₃H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃Et-00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₂-CF₂-CF₃H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(4-OMe) H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(4-tBu) H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(4-Me) H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(4-F) H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(3-F) H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph( 2-F) H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(3-CF₃) H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(4-CF₃) H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(2-CF₃) H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-C₆H₅H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Et H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nPr H00C-CH₂~DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-iBu HOOC-CH₂-DCha-Aze-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-nBu Me-DCha-Pro~Arg-CH₂-0~CH₂-CF₃

Me-S0₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃

Ch-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ (HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-Arg-CH₂~0-CH₂-CF₃ (HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-ÍBu H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃

H-(3-trans-Ph)-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃

H-(3-trans-Ch)-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-S-nBu H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-S0₂-nBu buď ako taká alebo vo forme fyziologicky prijateľnej soli vrátane stereomérov.
4. Zlúčenina podía nároku 1, ktorá je zvolená z

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃,

HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃, HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-nBu,

HOOC-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu, H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ a

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu.

buď ako taká alebo vo forme fyziologicky prijateínej soli vrátane stereomérov.
5. Zlúčenina podía niektorého z nárokov 1 až 4 pre použitie v terapii.
6. Spôsob výroby zlúčeniny podía niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že (spôsob I) atóm halogénu sa nahradí skupinou R₄Y” (kde Y predstavuje atóm kyslíka aleebo síry) v halogénmetylketóne všeobecného vzorca v ktorom η

W znamená koncovú chrániacu skupinu aminoskupiny a

W² znamená chrániacu skupinu, ketón sa redukuje na alkohol, odstráni sa koncová chrániaca skupina aminoskupiny, uskutoční sa zvyčajná peptidová kopulácia, potom sa alkohol oxiduje a získa sa chránený tripeptidketón, odstráni sa koncová chrániaca skupina aminoskupiny, potom sa uskutoční N-alkylácia a odstránia chrániace skupiny alebo sa nahradí chránený dipeptid pri kopulačnej reakcii uvedenej vyššie dipeptidom chráneným amino-koncovým N-alkylovaným N-trifluóracylom, potom sa uskutoční oxidácia a odstránenie chrániacej skupiny, alebo (spôsob II) uskutoční sa alkylácia R⁴-halogenidom a-ketolu všeobecného vozrca v ktorom

Ί P ,

W a W majú významy uvedene vyššie, a potom sa uskutočnia ďalšie reakcie ako pri spôsobe I, alebo (spôsob III) nechá sa reagovať zlúčenina všeobecného vzorca v ktorom

W¹ a W² majú významy uvedené vyššie, so zlúčeninou všeobecného vzorca (t-ch₂co)₂o, v ktorom

T predstavuje atóm halogénu, skupinu vzorca R⁴ O alebo R⁴S, a 4-dimetylaminopyridinom a potom sa uskutočnia reakcie ako je popísané pri spôsobe I a pokial je to žiadúce, vyrobí sa fyziologicky prijatreíná sol a v tých prípadoch, keď výsledkom reakcie je zmes stereomérov, tieto stereoméry sa poprípade delia zvyčajnými chromátografickými alebo rekryštalizačnými technickými postupmi, a pokiaí je to žiadúce, izoluje sa jediný stereomér.
7. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým_fže obsahuje účinné množstvo niektorej zlúčeniny podlá nárokov

I až 4a okrem toho najmenej jednu farmaceutický prijatelnú nosnú látku.
8. Použitie zlúčeniny podlá niektorého z nárokov 1 až 4 ako účinnej zložky pre výrobu farmaceutického prostriedku pre inhibíciu trombínu v ludskom alebo zvieracom organizme.
9. Použitie zlúčeniny podlá niektorého z nárokov 1 až 4 ako antikoagulačného prostriedku.
10.Spôsob dosahovania inhibície trombínu v ludskom alebo zvieracom organizme vyžadujúcom takúto inhibíciu, vyznačujúci sa t ý m, že sa tomuto organizmu podáva inhibične účinné množstvo zlúčeniny podlá niektorého z nárokov 1 až 4.
11.Spôsob ošetrovania lebo profylaxie trombózy a hyperkoagulovatelnosti v krvi a tkanivách ludského alebo zvieracieho organizmu, vyznačujúci sa tým, že sa podáva pacientovi vyžadujúcemu takéto ošetrenie alebo profylaxiu účinné množstvo zlúčeniny podlá niektorého z nárokov 1 až 4.
12.Zlúčenina, spôsob, farmaceutický prostriedok, použitie a spôsob použitia, ako sú nárokované v ktoromkoľvek z nárokov 1 až

II a ako sú v podstate popísané.