SK16762000A3 - Protilátky proti cd23, farmaceutický prostriedok s ich obsahom, sekvencie dna kódujúce reťazec protilátok a použitie protilátok - Google Patents

Description

Protilátky proti CD23, farmaceutický prostriedok s ich obsahom, sekvencie DNA kódujúce reťazec protilátok a použitie protilátok

Oblasť techniky

Vynález sa týka protilátok, ktoré sa viažu na molekulu CD23 (FCeRII) typ II, ich obzvlášť upravené formy, prípravy takých protilátok, farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú uvedené protilátky a ich použitia pri terapii.

Doterajší stav techniky

CD23 (FCeRII) je molekula typu II a patrí do rodiny C-lektínov. Táto rodina tiež zahrnuje receptor pre lymfocyty (MEL-14) a molekulu 1 adhézie endoteliálnych leukocytov (ELAM-1). Je to receptor vhodný pre IgE s nízkou afinitou. V prípade človeka mnoho krvotvorných typov buniek exprimuje na svojom povrchu molekuly CD23. Tieto bunky zahrnujú folikulárne dendritické bunky, B bunky, T bunky a makrofágy. Molekuly CD23 sa tiež nachádzajú v rozpustných formách v biologických tekutinách. Rozpustné molekuly CD23 (sCD23) vznikajú proteolytickým štiepením transmembránových receptorov. Molekula CD23 vykazuje pleiotropné účinky, ktoré zahrnujú sprostredkovanie adhézie buniek, reguláciu IgE a uvoľnenie histamínu, záchranu B buniek pred apoptózou a reguláciu rastu myeloidných buniek. Tieto funkčné aktivity prebiehajú prostredníctvom naviazania špecifických ligandov buniek spojených sCD23 alebo sCD23, neskôr pôsobia spôsobom podobným ako cytokíny (opisuje sa v publikácii Conrad, D. H., Annu Rev. Immunol. 8, 623 až 645 (1990), Delespesse, G. a ďalší, Adv. Immunol. 49. 149 až 191 (1991), Bonnefoy, J. Y., a ďalší, Curr. Opin. Immunol. 5, 944 až 47 (1993)).

V mnohých ďalších zápalových bunkách sa sledovala zvýšená expresia CD23. Molekuly CD23 sa tiež nachádzajú v synoviáinych biopsiách získaných od pacientov s chronickou synovitídou a tiež sCD23 sa tu nachádza v koncentráciách, ktoré presahujú normálny rozsah séra a synoviáinych tekutín pacientov s reumatoidnou artritídou (opisuje sa v publikácii Bansal, A. S., Oliver, W. Marsh, M.

N., Pumphrey, R. S., a Wilson P. B„ Immunology 79, 285 až 289 (1993), Helien E.

-2• *0 ·· ···· ·· ···· · · · ·00 • *0000 · 000 0 • 0 0*0* 0· *00 00 00 ·· ·· ·

A., Rowlands, D. C., Hansel, T. T., Kitas, G. D., a Crocker, J. J., Clin. Pathol. 44,

293 až 296 (1991), Chomarat, P., Brioloay, J., Bancherau, J., a Miossec, P., Arthritis Rheum. 86, 234 až 242 (1993), Baansal, A., a ďalší., Clin. Exp. Immunol. 89, 452 až 455 (1992), Rezonzew, R., a Newkirk, M. N., Clin. Immunol Immuopathol., 71, 156 až 163 (1994)). Množstvo sérového sCD23 u pacientov s reumatoidnou artritídou sa vzťahuje ku štatútu ochorenia a koreluje so sérovým reumatoidným faktorom (opisuje sa v publikácii Bansal, A. S. a ďalší, Clin. Exp. Reumathol., 12, 281 až 285 (1994). Pro-zápalové cytokíny sú obzvlášť dôležité pri rematoidnej artritíde a ústrednú úlohu majú v prípade TNF-a alL-1b pri poškodení artritických kĺbov (opisuje sa v publikácii Brennan, F. M., Chantry, D., Jackson, A., Maini, R., a Feldman, M., , Lancet 2, 244 až 247 (1989), Brennan, F. M., Maini, R. M., a Feldman M., Br. J. Reumathol 31, 293 až 298 (1992)).

Protilátky v typickom prípade obsahujú dva ťažké reťazce, ktoré sú spolu spojené disulfidovými väzbami a dva ľahké reťazce. Každý ľahký reťazec je spojený s určitým ťažkým reťazcom disulfidovou väzbou. Každý ťažký reťazec má na jednom konci variabilnú oblasť, po ktorej nasleduje určitý počet konštantných oblastí. Každý ľahký reťazec obsahuje na jednom konci variabilnú oblasť a na druhom konci konštantnú oblasť. Variabilná oblasť ľahkého reťazca je spojená s variabilnou oblasťou ťažkého reťazca. Konštantná oblasť ľahkého reťazca ja spojená s prvou konštantnou oblasťou ťažkého reťazca. Konštantné oblasti ľahkých a ťažkých reťazcov sa priamo nepodieľajú na naviazanie protilátok na antigén.

Variabilné oblasti každého páru ľahkého a ťažkého reťazca tvorí väzobné miesto pre antigén. Oblasti ľahkého a ťažkého reťazca vykazujú rovnakú všeobecnú štruktúru a každá oblasť obsahuje kostru štyroch oblastí, ktorých sekvencie sú relatívne konzervatívne a sú spojené tromi oblasťami, ktorí určujú komplementaritu (CDR). Štyri oblasti kostry tvoria usporiadanie beta-listu a CDR tvorí slučky, ktoré sú spojené a v niektorých prípadoch tvoria časť štruktúry beta-listu. CDR sa nachádzajú v blízkosti základných oblastí a spolu s CDR, ktoré pochádzajú z inej oblasti, sa podieľajú na vytvorení väzobného miesta pre antigén. CDR a oblasti kostry protilátok sa môžu stanoviť na základe publikácie Kabat a ďalší, „Sequences of proteins of immunological interest“ US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).

-3·· ·· ···· • · · · · • ··· · · · · • · · · · · ··· ·· ·· ··

Príprava upravených protilátok, ktorých variabilná oblasť protilátok hlodavcov sa kombinuje s konštantou oblasťou ľudských protilátok je dobre známa v danej oblasti techniky (publikácia Oi a Morrison (1986) Biotechniques 4, 214 až 212). Protilátky vhodné pre človeka, v ktorých sa CDR získali zo zdroja odlišného od zdroja kostry variabilných oblastí protilátok, sa opisujú v publikácii EP-A-0239400. CDR sa môžu získať s monoklonálnych protilátok hlodavcov alebo primátov, i Základná kostra variabilných oblastí a konštantných oblastí protilátok sa zvyčajne získa z ľudských protilátok. Takto upravené protilátky by nemali vyvolať tak veľkú imunitnú odozvu, keď sa aplikujú človeku v porovnaní s imunitnou odozvou u človeka, ktorá vzniká proti celým cudzorodným protilátkam, ako sú protilátky získané z hlodavcov.

Myšie monoklonálne protilátky vznikli proti receptoru CD23 (FCeRII) PCT/EP/95/04109). Takéto monoklonálne protilátky nie sú však ideálne na použitie na liečenie ľudí, pretože sú potencionálne immunogénne, keď sa aplikujú človeku injekciou a môžu byť lytické. Ďalej bežne dostupné protilátky, ktoré sa viažu na receptor CD23 rozoznávajú odlišné epitopy, ktoré sa exprimujú na receptore CD23. Špecificita naviazania na epitop môže hrať podstatnú časť účinnosti protilátok pre určitý účel. Výber protilátok s vysokou afinitou v prípade cieľového receptora môže byť terapeuticky výhodný, pretože požadovaná dávka bude nižšia ako v prípade monoklonálnych protilátok, ktoré vykazujú nižšiu afinitu v prípade rovnakého receptora.

Podstata vynálezu k

Podstatou vynálezu sú protilátky, ktoré obsahujú podstatnú aminokyselinovú sekvenciu každého CDR, ktorá je uvedená ďalej v texte. Uvedené protilátky sú schopné viazať molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanú na povrchu krvotvorných buniek:

ľahký reťazec

RSSKSLLY KDGKTYLN CDRĽ1 (SEQ ID NO: 3)

• 44	44	4444	44
·· · ·	•	4	4	•	4 4
• ··· · • 4 ··· 44	• • • 4	4 •	4 4 4 4·	4 4 4 44	4 4 4

LMSTRAS......

QQLVEYPFT ťažký reťazec GYWMS....

CDRL2 (SEQ ID NO: 5)

CDRL3 (SEQ ID NO: 7)

CDRH1 (SEQ ID NO: 9)

EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2 (SEQ ID NO: 11)

FID...... CDRH3 (SEQ ID NO: 13)

Vynález ďalej opisuje protilátky, ktoré sa viažu na rovnaký epitop ako protilátky, ktoré majú CDR opísaný vyššie v texte. Testy kompetitívnej inhibície sa použili na mapovanie epitopov na antigéne, ako je molekula CD23. Kompetitívna analýza FACS zahrnuje použitie buniek, ktoré exprimujú molekulu ako cieľ. Testované protilátky sa značia jedným fluórchrómom a sekundárne protilátky, ktoré sa viažu sa rovnaký antigén, sa značia druhým odlišne zafarbeným fluórchrómom. Ak sú prítomné oba fluórchrómy, potom protilátky nevykazujú vzájomnú kompetitívnu inhibíciu a preto sa domnievame, že rozoznávajú na cieľovej molekule odlišné epitopy. Mapovanie epitopu je možné tiež uskutočniť za použitia priamych testov naviazania peptidovej knižnice, kde sa exprimujú peptidové sekvencie z cieľového antigénu a testujú sa za použitia protilátok značených fluórchrómom, ako sa uvádza vyššie v teste. Pri štúdiách mapovania epitopu sa ukázalo, že použitím protilátok je možné definovať nový epitop na molekule CD23. Vynález preto opisuje protilátky, ktoré kompetitívne inhibujú naviazanie protilátok, ktoré majú sekvencie CDR uvedené vyššie v texte, na molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovaných na krvotvorných bunkách.

Výhodnými protilátkami podľa vynálezu sú upravené protilátky. Môžu to byť chimerické protilátky, ktoré obsahujú dostatočnú časť variabilných sekvencii ťažkého a ľahkého reťazca myších protilátok C11 uvedených na obrázku č. 1 a 2 (SEQ ID NO: 1 a 2 a SEQ ID NO: 46, 47, 50, 51), ktoré sú schopné viazať sa na molekulu CD23 a ľudskú konštantnú oblasť. Protilátky môžu byť chimerické protilátky typu, ktorý sa opisuje v publikácii WO 86/01533, a ktoré obsahujú oblasť viažucu antigén a oblasť, ktorá nepochádza z imunoglobulínu. Oblasť viažuca antigén je variabilná oblasť ľahkého reťazca protilátok a/alebo variabilná oblasť

-5• ·· ·· ···· ·· ···· · · · ··· ··« · · ·· • ··· · · · · · · · • 9 ···· ·· «·· ·· · ·· ·· · ťažkého reťazca. V typickom prípade chimerické protilátky obsahujú variabilnú oblasť ľahkého i ťažkého reťazca. Oblasť, ktorá nepochádza z imunoglobulínu sa fúzuje s C-koncom oblasti viažucej antigén. Oblasť, ktorá nepochádza z imunoglobulínu je v typickom prípade neimunoglobuiínový proteín a môže to byť oblasť enzýmu získaná z proteínu, ktorý vykazuje známu väzobnú špecificitu, alebo z proteínového toxínu alebo z ľubovoľného proteínu exprimovaného génom. V neimunoglobulínovej oblasti sa môže nachádzať sacharidová oblasť. Dve oblasti chimerických protilátok sa môžu spojiť cez štiepiteľnú linkerovú sekvenciu. Upravené protilátky môžu tiež byť bišpecifické protilátky.

Upravené protilátky môžu byť humanizované protilátky, v ktorých dostatočná časť jednej alebo viacerých aminokyselinových sekvencií každej CDR (a ak sú nutné zvyšky kostry) sú prítomné na kostre ľudských protilátok tak, že je schopná viazať molekulu CD23.

Je vhodné, aby CDR protilátok podľa vynálezu boli CDR L1 a L3 ľahkého reťazca a CDR H1 a H3 ťažkého reťazca, ako sa uvádza hore v texte. Aminokyselinové sekvencie týchto CDR sa však môžu zmeniť. Aminokyselinové sekvencia každého CDR sa môže zmeniť substitúciou, začlenením a/alebo deléciou aminokyselín.

Každé CDR môže preto zahrnovať substitúcie, inzercie a/alebo delécie jednej alebo dvoch aminokyselín. V ľahkom reťazci CDRL3 alebo v ťažkom reťazci CDRH3 môžu existovať substitúcie, inzercie a/alebo delécie až troch aminokyselín. V ľahkom reťazci CDRL1 sa môžu vyskytovať až štyri substitúcie, inzercie a/alebo delécie aminokyselín. V ťažkom reťazci CDRH2 môže byť prítomných až šesť substitúcií, inzercií a/alebo delécií aminokyselín. Je výhodné, aby aminokyselinová sekvencia každého CDR bola v podstate homológna so sekvenciou každého CDR, ako sa uvádza vyššie v texte.

Je výhodné, aby stupeň zhody sekvencie bol aspoň 50 %. Výhodnejšie je, aby stupeň zhody sekvencie bol aspoň 75 %. Najvýhodnejšie je, aby stupeň zhody sekvencie bol aspoň 95 %.

Je výhodné, že nie je nutné, aby stupeň zhody sekvencií bol vysoký, pretože rôzne aminokyseliny sa môžu často substituovať inými aminokyselinami, ktoré majú podobné vlastnosti, bez toho aby sa podstatne menili alebo negatívne ovplyvňovali

-6·· ·· ···· ··· · · · • · · · ·· ·· ·· ·· · isté vlastnosti proteínu. Tieto zmeny sa často nazývajú konzervatívne zmeny aminokyselín. Tak aminokyseliny glycín, valín, leucín alebo izoleucín sa môžu často vzájomne substituovať. Iné aminokyseliny, ktoré je možné často substituovať zahrnujú: fenylalanín, tyrozín a tryptofán (aminokyseliny, ktoré majú aromatické bočné reťazce), lyzin, arginín a histidín (aminokyseliny, ktoré majú bázický bočný reťazec), aspartát a glutamát (aminokyseliny, ktoré majú kyslý bočný reťazec), asparagín a glutamín (aminokyseliny, ktoré majú amidový bočný reťazec) a cysteín a metionín (aminokyseliny, ktoré majú bočný reťazec obsahujúci síru). Termín derivát môže tiež zahrnovať variantu aminokyselinovej sekvencie, ktorá obsahuje jedno alebo viac konzervatívnych” zmien vzťahujúcich sa k uvedenej sekvencii.

Kostru a konštantnú oblasť protilátok tvorí prednostne kostra a konštantné oblasti ľudských protilátok. Je výhodné, aby kostra variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátok bola v podstate homologná so zodpovedajúcou kostrou ľudského proteínu KOL (opisuje sa v publikácii Schmidt a ďalší, Hoppe-Seyper's Z. Physiol. Chem., 364, 713 až 747, 1983). Homológia s ohľadom na kostru je vo všeobecnom prípade 80 % alebo viac s ohľadom na KOL. Je to napríklad 90 % alebo viac alebo 95 % alebo viac. Ďalej je výhodné, aby siedmy zvyšok kostry 4 v KOL bol Thr alebo Leu, pričom výhodne je Leu. Tento zvyšok je zvyšok 109 (opisuje sa v publikácii Kabat a ďalší, Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987). Existuje tu mnoho substitúcií, inzercií a/alebo delécií aminokyselín. Napríklad je možné zmeniť jeden alebo viac zvyškov v polohách 49, 66, 76, 77 a 94, aby sa získal ekvivalentný zvyšok v myších protilátkach. Inými kandidátmi zmien na kostre, ktoré sa môžu uskutočniť, aby sa obnovilo naviazanie, sú aminokyselinové zvyšky 27, 30, 48, 67, 71, 91 a 93. Aminokyseliny sa číslujú spôsobom, ktorý sa opisuje v publikácii Kabat a ďalší, Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).

Kostra variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátok je v typickom prípade podstatne homologná s variabilnou oblasťou kostry proteínu HSIGKVII (databáza EMBL: Klobeck, H. G., knižnica dát podaná 7.4.1986). Existuje tu posun tejto sekvencie do polohy 452. Aby sa rektifikoval čítací rámec, uskutočnila sa defécia bázy 452 (T).

-7·· · · • · · • ·· · • · ··· ·· ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· • · ·· ·

Homológia s ohľadom na kostru je vo všeobecnom prípade 80 % alebo viac s ohľadom na vybranú sekvenciu. Výhodne je homológia 90 % alebo viac alebo 95 % alebo viac. Mnoho substitúcií, inzercií a/alebo delécií aminokyselín sa môže vyskytovať v aminokyselinovom zvyšku 64, ale tiež alebo namiesto zvyšku 71 podľa číslovania, ktoré sa opisuje v publikácii Kabat a ďalší, Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).

Vynález ďalej opisuje protilátky, ktoré obsahujú variabilnú sekvenciu ťažkého a ľahkého reťazca uvedené na obrázku č. 3 a 4 (SEQ ID NO: 17 a 18).

Protilátky výhodne vykazujú štruktúru prirodzených protilátok alebo jeho fragment. Protilátky preto môžu obsahovať celé protilátky, fragment (Fab')₂, fragment Fab, dimér ľahkého reťazca alebo dimér ťažkého reťazca. Protilátky môžu byť IgG, ako je lgG1, lgG2, lgG3 alebo lgG4 alebo IgM, IgA, IgE alebo IgD alebo ich upravená varianta. Konštantná oblasť ťažkého reťazca protilátok sa môže vybrať podobným spôsobom. Konštantná oblasť ľahkého reťazca môžu byť oblasť kapa alebo lambda.

Konštantná oblasť sa vybrala podľa požadovanej funkčnosti. V normálnom prípade lgG1 bude demonštrovať lytickú schopnosť prostredníctvom naviazania na komplement a bude sprostredkovávať ADCC (bunkovú cytotoxicitu závislú na protilátkach). Ak sú nutné necytotoxické blokačné protilátky, výhodné sú lgG4. Protilátky lgG4 môžu demonštrovať nestabilitu pri produkcii a preto je výhodná úprava vo všeobecnom prípade viac stabilných lgG1. Naznačené úpravy sa opisujú v publikácii EP0307434, ktoré sú v polohách 235 a 237. Vynález ďalej opisuje lytickú alebo nelytickú formu protilátok podľa vynálezu.

Každý reťazec protilátok je možné pripraviť náhradou CDR. CDR variabilné oblasti ľahkého a ťažkého reťazca ľudských protilátok sa nahradia dostatočnou časťou aminokyselinovej sekvencie každého CDR anti-CD23 protilátok, kedy sú výsledné protilátky schopné viazať sa na molekulu CD23. Oblasti DNA kódujúce CDR, ktoré kódujú hypervariabilnú oblasť reťazca ľudských protilátok, sa nahradili DNA kódujúcou požadovaný CDR. Ak je to vhodné, táto zmenená DNA sa viaže na DNA kódujúcu konštantnú oblasť protilátkového reťazca. DNA sa klonovala do expresného vektora. Expresný vektor sa zaviedol do kompatibilnej hostiteľskej • ·· ·· 4444 ··

4 4 4 4 · · • 444 · · · · · · · « 4 4 · · · · ·

444 44 44 44 44

-8bunky, ktorá sa kultivovala za takých podmienok, aby sa exprimoval reťaz protilátok. Reťazce komplementárnych protilátok, ktoré sa spoločne exprimujú týmto spôsobom môžu potom tvoriť humanizované protilátky.

Humanizácia monoklonálnych protilátok zahrnuje štyri kroky. Sú to:

1) stanovenie nukleotidovej a predpokladanej aminokyselinovej sekveneie počiatočných variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca protilátok,

2) navrhnutie humanizovaných protilátok, to znamená rozhodnúť, ktorá oblasť kostry protilátok sa použije počas procesu humanizácie,

3) metóda/technika skutočnej humanizácie,

4) transfekcia a expresia humanizovaných protilátok.

Vynález opisuje sekvenciu DNA, ktorá kóduje reťazec protilátok obsahujúci jednu alebo viac sekvencií podľa:

páry báz CDRL1 číslo 70 až 117, zobrazené na obrázku č. 3 (SEQ ID NO:4) páry báz CDRL2 číslo 163 až 183, zobrazené na obrázku č. 3 (SEQ ID NO:6) páry báz CDRL3 číslo 280 až 306, zobrazené na obrázku č. 3 (SEQ ID NO:8) páry báz CDRH1 číslo 91 až 105, zobrazené na obrázku č. 4 (SEQ ID NO: 10) páry báz CDRH2 číslo 148 až 204, zobrazené na obrázku č. 4 (SEQ ID NO: 12) páry báz CDRH3 číslo 301 až 309, zobrazené na obrázku č. 4 (SEQ ID NO: 14) alebo sekvencia DNA kódujúca reťazec protilátok, ktorý obsahuje jednu alebo obidve sekveneie podľa obrázku č. 3 alebo 4 (SEQ ID NO: 17 alebo 18 a SEQ ID NO: 48 a 49).

Krok 1

Stanovenie nukleotidovej a predpovedanej aminokyselinovej sekveneie variabilných oblastí ľahkého a ťažkého reťazca protilátok

Aby sa mohli protilátky humanizovať, je nutné poznať aminokyselinovú sekvenciu variabilných oblastí ťažkého alebo ľahkého reťazca protilátok. Sekvencia konštantných oblastí je irelevantná, pretože neprospieva k stratégii obnovenia. Najjednoduchšia metóda stanovenia aminokyselinovej sekveneie variabilnej oblasti

-9• · ·· · · · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ·· ·· ···· ·· • · · · • · · · • · · · ·· ·· · protilátok pochádza z klonovanej eDNA kódujúcej variabilnú oblasť ťažkého a ľahkého reťazca.

Existujú dve všeobecné metódy klonovania eDNA variabilnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca: 1) prostredníctvom konvenčnej knižnice eDNA alebo 2) prostredníctvom polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR). Obidve tieto metódy sú známe v širokom rozsahu. Ak je daná nukleotidová sekvencia eDNA, je to jednoduchý spôsob ako preložiť túto informáciu do predpovedanej aminokyselinovej sekvencie variabilných oblastí protilátok. V tomto prípade nukleotidová sekvencia a predpovedaná aminokyselinová sekvencia reťazca protilátok C11 hlodavcov sú zobrazené na obrázku č. 1 a 2 (SEQ ID NO: 1 (ťažký reťazec) a 2 (ľahký reťazec) a SEQ ID NO: 45 a 47).

Krok 2

Navrhovanie humanizovaných protilátok

Existuje niekoľko faktorov, ktoré sa zvažujú pri rozhodovaní, ktorú sekvenciu použiť v prípade humanizácie. Humanizácia ľahkého a ťažkého reťazca sa zvažuje nezávisle na sebe, ale uvažovanie je v zásade podobné.

Tento spôsob výberu je založený na nasledujúcej úvahe: daná antigénová špecificita a afinita je primárne určená aminokyselinovou sekvenciou variabilnej oblasti CDR. Základné zvyšky variabilnej oblasti prispievajú iba málo alebo vôbec. Primárne funkcie základných oblastí je udržovať CDR v jeho správnej priestorovej orientácii, aby rozoznal antigén. Potom substitúcia CDR hlodavcov do variabilnej oblasti kostry ľudských protilátok je vysoko homologná s variabilnými oblasťami hlodavcov, z ktorých pochádzajú. Prednostne je možné vybrať ľudskú variabilnú oblasť, pretože je vysoko homologická s variabilnými oblasťami hlodavcov.

Vhodná sekvencia variabilnej oblasti ľudských protilátok sa môže vybrať nasledujúcim spôsobom:

1) Za použitia počítačového programu sa skúmajú všetky dostupné databázy proteínov (a DNA), aby sa zistili sekvencie variabilných oblastí ľudských protilátok, ktoré sú najviac homologické s variabilnými oblasťami protilátok hlodavcov. Výstup vhodného programu je zoznam sekveneii, ktoré sú najviac homologické s ·· ····

-10• «· «· · · • ··· • · ·· · ·· • · · • · · · ·· ·· • · ·· · protilátkami hlodavcov, percento homológie s každou sekvenciou a usporiadanie každej sekvencie so sekvenciou hlodavca. To sa uskutočňuje nezávisle na obidvoch sekvenciách variabilnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca. Vyššie opísaná analýza sa uskutoční jednoduchšie, ak sú zahrnuté iba sekvencie ľudského imunoglobulínu. 2) Zoznam sekvencii variabilných oblastí ľudských protilátok a porovnanie za účelom zistenia homológie. Najskôr sa uskutoční porovnanie dĺžky CDR mimo CDR3 ťažkého reťazca, ktorý je celkom variabilný. Ľudské ťažké reťazce a ľahké reťazca kapa a lambda sa rozdelili do podskupín: podskupina 3 ťažkého reťazca, podskupina 4 reťazca kapa, podskupina 6 reťazca lambda. Veľkosti CDR v každej v každej podskupine sú podobné, ale v skupinách sa líšia. Ako prvé priblíženie stupňa homológie je zvyčajne možné zrovnať do párov protilátky CDR hlodavcov s jednou z ľudských podskupín. Protilátky nesúce CDR podobnej dĺžky sa potom porovnali, aby sa zistila sekvenčná homológia aminokyselín, obzvlášť v CDR, ale tiež v okolitých oblastiach kostry protilátok. Ľudská variabilná oblasť, ktorá je najviac homológna, sa vybrala ako kostra v prípade humanizácie.

Krok 3

Súčasné humanizačné metódy/techniky

Protilátky je možné humanizovať zavedením štepu do požadovanej CDR do kostry ľudských protilátok podľa EP-A-0239400. Sekvencie DNA kódujúce požadované protilátky sa môže preto pripraviť tak, že začína ľudskou DNA, ktorej CDR má byť preformovaná. Aminokyselinová sekvencia variabilnej oblasti hlodavcov, obsahujúca požadovanú CDR sa porovnáva s vybranou sekvenciou variabilnej oblasti ľudských protilátok. Zvyšky v ľudskej variabilnej oblasti sú označené tak, že je nutné označiť, keď majú byť vymenené za zodpovedajúci zvyšok u hlodavcov, aby vznikla ľudská variabilná oblasť, ktorá obsahuje CDR hlodavcov. Tu sa tiež musia vyskytovať zvyšky, ktoré je potrebné substituovať, pridať alebo deletovať z ľudskej sekvencie.

Syntetizovali sa oligonukleotidy, ktoré sa môžu použiť pri mutagenáze kostry ľudskej variabilnej oblasti, aby obsahovali požadované zvyšky. Tieto oligonukleotidy sa môžu vyskytovať v ľubovoľnej vhodnej veľkosti. Veľkosť použitých

• ··	··	···· ··
• · · ·	•	• · ·	• ·
ä ··· · ·	•	• · · ·
• · ·	•	• · · ·
·· ··	··	·· ··	• ·

oligonukleotidov limitujú iba schopnosti určitého syntetizátora, ktorý je dostupný. Spôsob mutagenázy in vitro riadenej oligonukleotidom je dobre známy v danej oblasti techniky.

V inom prípade je možné dosiahnuť humanizáciu za použitia rekombinantnej polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR), ktorá sa opisuje v publikácii WO 92/07075. Za použitia tejto metódy sa môže CDR upraviť zostrihom medzi oblasťami kostry ľudských protilátok.

Vo všeobecnom prípade je možné uskutočniť techniku WO 92/07075 za použitia templátu, ktorý obsahuje dve oblasti kostry ľudských protilátok, AB a CD a medzi nimi je CDR, ktorá sa hradí donorovou CDR. Primery A a B sa používajú pri amplifikácii oblasti kostry AB a primérov C a D, ktoré sa používajú pri amplifikácii oblasti CD kostry. Primery B a C tiež obsahujú na svojom 5' konci ďalšiu sekvenciu zodpovedajúcu všetkým alebo častiam donorovej sekvencie CDR. Primery B a C prekrývajú dĺžku dostatočne, aby došlo k naviazaniu na ich 5' konce za podmienok, ktoré umožnia, aby prebehla PCR. Tak amplifikované oblasti B a CD podstúpili úpravu génu zostrihom extenzií presahu za vzniku humanizovaného produktu v jedinej reakcii.

Krok 4

Transfekcia a expresia upravených protilátok

Po reakciách, ktoré tvoria mutácie, aby vznikli upravené protilátky, sa môže mutagenizovaná DNA naviazať na vhodnú DNA kódujúcu konštantnú oblasť ľahkého alebo ťažkého reťazca klonovaného do expresného vektora a transfekovaných do hostiteľských buniek, pričom sa uprednostňujú cicavčie bunky. Tieto kroky môžu prebiehať rutinným spôsobom. Upravené protilátky sa môžu pripraviť spôsobom, ktorý zahrnuje:

a) prípravu prvého replikovateľného expresného vektora, ktorý zahrnuje vhodný promótor operatívne spojený so sekvenciou DNA, ktorá kóduje aspoň jednu variabilnú oblasť ťažkého alebo ľahkého reťazca lg, variabilnú oblasť obsahujúcu oblasť kostry, ktoré pochádzajú z ľudských protilátok a CDR požadovanú na humanizáciu protilátok podľa vynálezu, ·· ····

-12·· ··· • · · • · · • · · · • · · · • · ·· ·· • · · • · • · • · ·· ·

b) prípravu druhého replikovateľného expresného vektora, ktorý zahrnuje vhodný promótor operatívne spojený so sekvenciou DNA, ktorá kóduje aspoň variabilnú oblasť komplementárneho Ig ľahkého a ťažkého reťazca,

c) transformáciu bunkovej línie prvým alebo oboma pripravenými vektormi,

d) kultiváciu uvedenej transformovanej bunkovej línie za vzniku upravených protilátok.

Je výhodné, aby sekvencia DNA v kroku a) kódovala variabilnú oblasť a/alebo každú konštantnú oblasť reťazca ľudských protilátok. Humanizované protilátky sa môžu získať a čistiť. Bunková línia, ktorá sa transformuje, aby došlo k produkcii upravených protilátok môže byť línia buniek vaječníkov čínskych škrečkov (CHO) alebo imortalizovaná bunková línia cicavcov. Je výhodné, aby táto bunková línia bola lymfoidného pôvodu, ako je bunková línia myelómu, hybridomu, triómu alebo kvadrómu. Bunková línia môže tiež obsahovať normálne lymfoidné bunky, ako sú B bunky, ktoré neodumierajú po transformácii vírusom, ako je vírus EpsteinBarr. Najvýhodnejšie je, aby neodumierajúcou bunkovou líniou bola línia buniek myelómu alebo jej deriváty. Expresný systém prvej voľby je expresný systém glutamínsyntetázy, ktorý sa opisuje v publikácii WO 87/04462.

Aj keď bunková línia používaná pri produkcii humanizovaných protilátok je výhodne cicavčia bunková línia, môže sa tiež použiť ľubovoľná iná vhodná bunková línia, ako je bakteriálna bunková línia alebo kvasinková bunková línia. V prípade reťazcov jedinej protilátky sa predpokladá, že sa môžu použiť bakteriálne kmene odvodené od E. coli. U získaných protilátok sa kontroluje ich funkčnosť. Ak protilátky stratia svoju funkciu je nutné sa vrátiť ku kroku (2) a zmeniť kostru protilátok.

Vynález poskytuje expresný vektor obsahujúci DNA kódujúcu a adaptovanú na expresiu protilátok podľa vynálezu a hostiteľské bunky transformované uvedenými expresnými vektormi.

Po expresii sa celé protilátky, ich diméry, jednotlivé ľahké a ťažké alebo ich imunoglobulínové formy podľa vynálezu môžu čistiť podľa štandardných postupov, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Tieto postupy zahrnujú zrážanie síranom amónnym, afinitné klony, klonovú chromatografiu, gélovú elektroforézu a podobne (opisuje sa v publikácii Scopes, R., Proteín Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Pre farmaceutické využitie sú výhodné v podstate čisté

• ··	··	····	• e
·· · ·	•	•	•	• · ·
• ··· · • · • e · ··	• • ··	• •	• • · ··	• · · • ·· ·

imunoglobulíny, ktoré vykazujú 98 až 95 % homogenitu. Výhodnejšie sú imunoglobulíny, ktoré vykazujú 98 až 99 % homogenitu alebo vyššiu. Ak sa čistením protilátok dosiahne čiastočná alebo požadovaná čistota, protilátky sa potom môžu použiť v terapii alebo pri vývoji alebo uskutočnení testov, pri imunofluorescenčnom farbení a podobne (opisuje sa v publikácii Immunolgical methods, Zv. I a II, Lefkovits a Pernis, eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979 a 1981)).

Protilátky môžu fungovať blokovaním interakcií medzi molekulami CD23 viazanými na membráne a ligandom, ktorý sa na neho viaže. Pre štúdium takého blokačného účinku sa použijú in vitro testy, ako sú rádio-imunitné testy. Protilátky potom môžu fungovať tak, že sa naviažu na rozpustený CD23. Ja známe, že CD23 naviazaný na membráne podlieha štiepeniu, čím sa uvoľní z povrchu bunky za vzniku mnohých rozpustných fragmentov. Tieto fragmenty pôsobia ako cytokíny a hrajú dôležitú úlohu pri tvorbe IgE. Pri ochorení preto vzniká nadmerné množstvo rozpustného CD23. Naviazaním týchto fragmentov na protilátky podľa vynálezu môže interferovať so schopnosťou rozpusteného CD23 sprostredkovať svoje účinky. Verí sa, že protilátky podľa vynálezu bránia produkcii CD23 tým, že štiepia receptor viazaný na membránu. Vynález preto opisuje použitie anti-CD23 protilátok pri výrobe liečiva pre zablokovanie tvorby rozpustného CD23.

Schopnosť ľubovoľných protilátok sprostredkovať svoj účinok sa vzťahuje k ich afinite na cieľový antigén. Protilátky podľa vynálezu vykazujú veľmi vysokú afinitu pre receptor CD23. Afinitná konštanta takých protilátok je výhodne vyššia ako 1x10⁹ Ka/mol a výhodnejšie vyššia ako 1x10¹⁰ Ka/mol. Vynález preto poskytuje protilátky schopné naviazať sa na receptor CD23 alebo rozpustný CD23 charakterizované afinitnou konštantou rovnou alebo vyššou ako 1x10⁹ Ka/mol.

Protilátky, ktoré sa viažu na receptor CD23 sa môžu použiť in vivo na liečenie alebo profylaxiu zápalového alebo autoimunitného ochorenia. To je veľmi podstatné, pretože mnoho týchto ochorení navzdory dlhotrvajúcemu výskumu je veľmi ťažké alebo úplne nemožné účinne liečiť. To je obzvlášť prípad artritídy, ktorá často ovplyvňuje ľudí v strednom veku a môže im brániť v práci. Účinná liečba artritídy je dlhotrvajúca úloha pre mnoho výskumných skupín.

Protilátky podľa vynálezu sa môžu použiť na liečenie alebo profýlaxiu vážneho ochorenia, ktoré zahrnuje artritídu, lupus erythematosus, Hashimotovu

• ··	··	····	·
·· · ·	•	•	•	•	• ·
• ··· ·	•	•	•	• ·	•
• · ··· ··	• ··	•	• · ··	• ··	• •

tyreoiditídu, roztrúsenú sklerózu, cukrovku, uveitídu, dermatitídu, lupienku, žihľavku, nefrotický syndróm, glomerulonefritídu, zápalové ochorenie čriev, ulceratívnu kolitídu, Crohnovu chorobu, Sjogrenov syndróm, alergiu, alergickú astmu, intrinsickú astmu, akútnu astmatickú exacerbáciu, rinitídu, ekzém, GVH, COPD, inzulitídu, bronchitídu (najmä chronickú bronchitídu) alebo cukrovku (najmä cukrovku typu I).

Vynález opisuje použitie protilátok podľa vynálezu na výrobu lieku na liečenie jednej alebo viacerých porúch. Vynález ďalej opisuje spôsob liečby jednej alebo viacerých vyššie uvedených porúch, ktoré zahrnujú aplikáciu terapeuticky účinnej dávky protilátok podľa vynálezu.

Protilátky podľa vynálezu sa môžu použiť pri štúdiu interakcií medzi CD23 a rôznymi ligandami, napríklad medzi CD23 a CD21, medzi CD23 a CD11b, medzi CD23 a CD11, medzi CD23 a proteínom endoteliálnych buniek s molekulovou hmotnosťou 80 000 až 75 000 alebo medzi CD23 a proteínom s molekulovou hmotnosťou 115 000 (ktorý, ako sa predpokladá je príbuzný s endoteliálnym proteínom s molekulovou hmotnosťou 80 000 až 85 000). Verí sa, že jedna alebo viac vyššie uvedených interakcií sa vyskytuje in vivo. Obzvlášť sú výhodné protilátky alebo iné väzobné činidlá, ktoré sú schopné blokovať tieto interakcie. Predpokaldá sa, že tieto činidlá sú obzvlášť vhodné pre zníženie alebo zvýšenie zápalového účinku sprostredkovaného cytokínmi. Môžu sa použiť proti maligným nádorom B buniek, ako je chronická lymfocytárna leukémia a leukémia vlasových buniek.

Alternatívny mechanizmus pôsobenia anti-CD23 terapie sa môže podieľať na blokovaní IgE imunitnej odozvy.

Protilátky podľa vynálezu je tiež možné použiť na liečenie a profylaxiu alergického ochorenia, ktoré zahrnuje ochorenia, ktoré nie sú spôsobené IgE. Môžu sa použiť pri liečbe a profylaxii Crohnovej choroby.

Protilátky podľa vynálezu sa môžu použiť samé alebo v kombinácii s imunosupresívnymi činidlami, ako sú steroidy, cyklosporín alebo protilátky, ako sú anti-iymfocytárne protilátky alebo výhodnejšie sú činidlá vyvolávajúce toleranciu, anti-autoimunitné alebo protizápalové činidlá, ako sú činidlá inhibujúce CD4+T bunky, napríklad anti-CD4 protilátky (výhodné sú blokačné činidlá alebo protilátky, ktoré nie sú deplekačné), anti-CD8 protilátky, TNF antagonisty napríklad anti-TNF

• ·· 99 9 ·	··	9999 •	• 9
9	•	9	9 9
• 999 ·	•	•	•	9 9	9
• · ··· ··	• ··	•	• · ··	9 99	9 9

protilátky alebo TNF inhibítory, napríklad rozpustný TNF receptor alebo činidlá, ako je NSAID.

Vhodné dávky zlúčeniny podľa vynálezu budú kolísať v závislosti od faktorov, ako je liečené ochorenie alebo poruchy, spôsob aplikácie a vek a hmotnosť jednotlivca, ktorý sa lieči. Bez toho, aby došlo k obmedzeniu určitou dávkou sa predpokladá, že napríklad v prípade parenterálneho podávania sa denná dávka pohybuje v rozmedzí 0,01 až 20 mg/kg protilátok podľa vynálezu (zvyčajne je prítomná časť farmaceutického prostriedku) a táto dávka je vhodná na liečenie typickej dospelej osoby. Vhodnejšie je, že sa dávka môže pohybovať v rozmedzí 0,1 až 5 mg/kg, ako je rozmedzie 0,1 až 2 mg/kg. Jednotková vhodná dávka je 1 až 400 mg.

Protilátky sa môžu tiež použiť, ako oddelené aplikovateľné zlúčeniny v spojení s chemoterapeutickými alebo imunosupresívnymi činidlami. V typickom prípade činidlá budú zahrnovať cyklosporín A alebo purínový analóg (napríklad metotrexát, 6-merkaptopurín alebo podobne). Môže sa tiež použiť mnoho ďalších činidiel (napríklad cyklofosfamid, prednison, atď.), ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky.

Ak je nutné lyžovať bunky, na ktoré sa protilátky viažu, potom protilátky podľa vynálezu môže tvoriť časť imunotoxínu. Imunotoxíny sa charakterizujú dvoma komponentmi a sú obzvlášť použiteľné pri zabíjaní vybraných buniek in vitro a in vivo. Jednou zložkou je cytotoxické činidlo, ktoré je obvyklé pre bunky fatálne v prípade, že sa na nich viaže alebo absorbuje. Druhá zložka, ktorá je známa ako nástroj na zavádzanie poskytuje spôsob zavedenia toxického činidla do určitého typu buniek, ako sú bunky, ktoré sú obsiahnuté v karcinóme. Dve zložky sú bežne chemicky viazané spolu ľubovoľným dobre známym chemickým postupom. Napríklad v prípade, kedy je cytotoxickým činidlom proteín a druhou zložkou je intaktný imunoglobulín, väzba je uskutočnená spôsobom heterobifunkčných priečnych väzieb, napríklad SPDP, karbodiimid, glutaraldehyl a podobne. Produkcia rôznych imunotoxínov je dobre známa v danej oblasti techniky a je opísaná napríklad v publikácii Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Mágie Bullet, Thorpe a ďalší, Monoclonal Antibodies in Clinical Medicíne, Academic Press, str. 168 až 190 (1982).

• ·· ·· ···· ·· ••••·· · · • ··· · · · · · · · • ······· ··· ·· ·· ·· ·· ·

-16Rôzne toxické činidlá sú vhodné na použitie ako imunocytotoxíny. Cytotoxické činidlá môžu zahrnovať rádionukleotidy, ako je jodín-131, ytrium-90, rénium-188 a bizmut-212, mnoho chemoterapeutických liečiv, ako je vindesín, metotrexát, adriamycín a cisplantín a cytotoxické proteíny, ako sú ribozomálne inhibičné proteíny podobné antivírusovému proteínu, exotoxínu A baktérií Psedomonas, ricínu, toxínu diftérie, reťazce A ricínu atď. alebo činidlá aktívne na povrchu bunky, ako sú fosfolipázové enzýmy (napríklad fosfolipáza C) (opisuje sa v publikácii Chimaeric Toxins, Olsnes a Phil, Pharmac. Ther., 25: 335 až 381 (1982) a Monoclonal Antibodies for cancer Detection and Therapy, eds. Baldwin a Byers, str. 159 až 179, 224 až 266, Academic Press (1985).

Zavádzaná zložka imunotoxínu je protilátka podľa vynálezu. Výhodne sa používajú neporušené imunoglobulíny alebo ich väzobné fragmenty, ako je Fab. V typickom prípade protilátky v imunotoxínoch sú izotopy ľudských IgA, IgM alebo IgG, ale ak je to nutné, môžu sa využiť tiež aj iné konštantné oblasti.

Vynález ďalej opisuje farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje farmaceutický prijateľný nosič alebo riedidlo a ako účinnú zložku protilátky podľa vynálezu. Farmaceutický prostriedok môže obsahovať imunotoxín podľa vynálezu. Protilátky, imunotoxín a ich farmaceutické zlúčeniny podľa vynálezu je možné obzvlášť použiť pri parenterálnom podávaní, to znamená podkožné, do svalu alebo intravenózne.

Farmaceutické prostriedky na parenterálne podávanie môžu bežne obsahovať roztok protilátok ako ich zmes rozpustenú v prijateľnom nosiči, výhodný je vodný nosič. Môže sa použiť mnoho vodných nosičov, ako je napríklad voda, pufrovaná voda, 0,4% fyziologický roztok, 0,3% glycín a podobne. Tieto roztoky sú sterilné a vo všeobecnom prípade neobsahujú iné látky. Tieto farmaceutické prostriedky sa môžu sterilizovať bežnými sterilizačnými postupmi, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Prostriedky môžu obsahovať farmaceutický prijateľné auxiiiárne látky, ak si to vyžadujú fyziologické podmienky, ako sú činidlá na úpravu pH a činidlá slúžiace ako pufre, činidlá upravujúce toxicitu a podobne. Je to napríklad octan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, mliečnan sodný atď.. Koncentrácia protilátok v prípade týchto farmaceutických prostriedkov môže kolísať v širokom rozmedzí. Rozmedzie môže byť menej ako 0,5 %, zvyčajne

• ·· • · ·	·· • ·	4444 4	44 • 4	44
• ··· · • · ·· 44	4 · • 4 • 4	4 4 4 44	4 4 4 4 4 44	44

aspoň 1 % až 15 alebo 20 % hmotnostných. Koncentrácia sa vyberie na základe objemu kvapalín, viskozity, atď., v súlade s určitým spôsobom vybratého podávania.

Typický farmaceutický prostriedok v prípade injekcie do svalu sa môže pripraviť tak, že obsahuje až 1 ml sterilnej pufrovanej vody a 50 mg protilátok. Typický farmaceutický prostriedok v prípade vnútrožilovej infúzie sa môže pripraviť tak, že obsahuje 250 ml sterilného Ringerovho roztoku a 150 mg protilátok. Aktuálne metódy na prípravu aplikovateľných zlúčenín sú dobre známe v danej oblasti techniky a opisujú sa napríklad v publikácii Remington's Pharmaceutical Science, 15 th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).

Protilátky podľa vynálezu sa môžu lyofilizovať za účelom uloženia a pred použitím rozpustiť vo vhodnom nosiči. Ukázalo sa, že táto metóda je účinná s bežnými imunitnými globulínmi. Môže sa použiť ľubovoľný lyofilizačný postup a ľubovoľný postup rozpustenia. Je vhodné, aby lyofilizácia a rozpustenie viedlo k rôznemu stupňu straty aktivity protilátok (napríklad bežné imunitné globulíny, protilátky IgM majú tendenciu mať vyššie straty aktivity v porovnaní s protilátkami igG).

Jediné a opakované podanie farmaceutického prostriedku sa môže uskutočniť dávkou a paternom, ktorý vybral lekár. Farmaceutické prostriedky môžu poskytovať množstvo protilátok podľa vynálezu, ktoré je účinné na liečbu pacienta.

Protilátky podľa vynálezu môžu ďalej nachádzať široké uplatnenie in vitro. Protilátky sa môžu použiť pri typovaní T buniek, pri izolácii buniek, ktoré nesú špecifický antigén CD23 alebo fragmenty receptora, pri príprave vakcíny alebo podobne.

Na diagnostické účely sa protilátky môžu buď značiť a alebo sa neznačia. Neznačené protilátky sa môžu použiť v kombinácii s inými značenými protilátkami (sekundárne protilátky), ktoré reagujú s humanizovanými protilátkami, ako sú protilátky špecifické pre konštantné oblasti ľudského imunoglobulínu. V inom prípade protilátky sa môžu značiť priamo. Môže sa použiť široké rozmedzie značiek, ako sú rádionukleotidy, fluór, enzýmy, enzýmové substráty, enzýmové kofaktory, enzýmové inhibítory, ligandy (obzvlášť haptény) atď.. Je dostupných mnoho imunologických testov, ktoré sú známe priamo v danej oblasti techniky.

• ·· ·· · ·	··	···· •	•	··	• ·
•	•
• ··· ·	•	•	• e	•		•
• ·	•	•	• ·	•		•
··· ··	··		··		··	•

Sady sa môžu tiež použiť s protilátkami pri ochrane proti aktivite buniek alebo ich detekcii alebo detekcii prítomnosti vybraného antigénu. Protilátky podľa vynálezu sa môžu pripravovať obvykle v lyofilizovanej forme v nádobke, buď samé alebo spolu s ďalšími protilátkami, ktoré sú špecifické pre požadovaný typ bunky. Protilátky, ktoré sú spojené so značkou alebo toxínom alebo nie sú spojené sú zahrnuté v sadách s pufrom, ako je Tris, fosforečnan, uhličitan atď., stabilizátorom, biocidmi, inertnými proteínmi, napríklad sérovým albumínom alebo podobne a návodom na použitie. Vo všeobecnom prípade tento materiál bude prítomný v množstve menšom ako 5 % hmotnostných vztiahnuté na množstvo aktívnych protilátok a zvyčajne je prítomné v celkovom množstve aspoň 0,001 % hmotnostných vztiahnuté na koncentráciu protilátok. Často je nutné zahrnúť inertné plnivo alebo excipient, aby sa nariedili aktívne zložky. Excipient môže tvoriť 1 až 99 % hmotnostných celkového prostiredku. V prípade, že sekundárne protilátky sú schopné sa viazať na chimerické protilátky, ktoré sa používajú v teste, sú potom prítomné v oddelenej fľaštičke. Sekundárne protilátky sú v typickom prípade spojené so značkou a tvoria analogickým spôsobom s protilátkami prostriedky, ktoré sa opisujú vyššie v texte.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázku č. 1 je zobrazená aminokyselinová a nukleotidová sekvencia variabilnej oblasti ťažkého reťazca C11 myši.

Na obrázku č. 2 je zobrazená aminokyselinová a nukleotidová sekvencia variabilnej oblasti ľahkého reťazca C11 myši.

Na obrázku č. 3 je zobrazená aminokyselinová a nukleotidová sekvencia variabilnej oblasti ťažkého reťazca humanizovaných protilátok proti CD23.

Na obrázku č. 4 je zobrazená aminokyselinová a nukleotidová sekvencia variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátok proti CD23.

Na obrázku č. 5 je zobrazené polovičné maximálne naviazanie chimerickej CD23 lgG1m.

Na obrázku č. 6 je zobrazené polovičné maximálne naviazanie humanizovaných CD23 lgG1m.

• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ···

-19• ··· · · · · · · · • · ···· ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Klonovanie a sekvenovanie myších anti-CD23 monoklonálnych protilátok C11

Všeobecné postupy

Ak nie je uvedené inak, používajú sa nasledujúce štandardné postupy a podmienky. Ak to bolo možné používali sa protokoly doporučené výrobcom. Reštrikčné štiepenie a iné postupy molekulárnej biológie sa uskutočnili v podstate rovnako, ako sa opisuje v publikácii Maniatis a ďalší., Molecular Cloning- a laboratory manual 2^nd edition, Cold Spring Harbour Press).

PCR sa uskutočnilo za použitia programovateľného termálneho cyklovača (Trio, Biometra). V typickom prípade reakcia s objemom 100 μΙ obsahovala 2,5 jednotiek polymerázy AmpliTaq (Perkin-Elmer-Cetus, Beaconsfield, UK) v pufri, ktorý sa získal od výrobcu, 250 μΜ každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP amplifikačné priméry v koncentrácii 1 μΜ a templátovú DNA. Ak nie je uvedené inak, použili sa nasledujúce špecifikácie cyklu:

krok 0: teplota 95 °C počas 5 minút krok 1: teplota 95 °C počas 1 minúty krok 2: teplota 50 °C počas 1 minúty, skok na krok 3 pri teplote 0,4 °C/sekundu krok 3: teplota 72 °C počas 1 minúty, späť na krok 1, opakovať slučku 30 krát krok 4: teplota 72 °C počas 5 minút.

Sekvenovanie DNA sa uskutočnilo za použitia metódy dideoxyterminácie za použitia buď systému Sequenase v2 (USB, Cambridge, UK) alebo systému terminácie fluorescenčným farbivom (ABI).

Čistenie DNA na géli sa uskutočnilo oddelením reakcie na agarózovom géli s nízkou teplotou topenia (NuSieve GTG, FMC, Rockland, ME). Vybrané fragmenty sa vyrezali pod UV žiarením a DNA sa získala sa použitia preparačného kitu Wizard PCR (Promega, Suthampton, UK).

Číslovanie aminokyselinových zvyškov v reťazcoch protilátok sa uskutočňuje podľa schémy publikovanej v publikácii Kabat a ďalší, Sequences of proteins of

-20• ·· ·· ···· ·· · ···· · · · · · ·· • · · ··· ··· • ··· ··· ···· · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ··· immunological interest, US Dept of Health and Human Services, US Govt Printing

Office, 1991).

Príprava cDNA z hybridómu C11

Na extrakciu RNA sa použila kultivovaná kultúra buniek C11. Kultúra obsahujúca 1,3x10⁷ buniek sa odstredila a bunková peleta a supernatant sa získali na analýzu. V supernatante sa testovala prítomnosť myšieho imunoglobuiínu v rôznych izotopoch za použitia imunologickej metódy (kit ISO1, Sigma, Poole, UK) a zistilo sa, že monoklonálne C11 sú izotop lgG1.

Mediátorová RNA sa izolovala z pelety buniek sekvenčnou aplikáciou kitu na izoláciu celkovej RNA (Stratagene, Cambridge, UK (za vzniku celkovej RNA) a potom kitu mRNA Purification (Dynal, Oslo, Norway). Časti mRNA a celkové RNA sa potom previedli na jednoreťazcové cDNA za použitia Superscript Preamplification System (BRL, Paisley, Scotland, UK). Alikvóty výslednej cDNA sa použili pre PCR, ktorá je navrhnutá tak, aby sa oddelene amplifikovali variabilné oblasti ťažký a ľahký reťazec imunoglobulíny C11.

Klonovanie a sekvenovanie variabilnej oblasti ťažkého reťazca C11

Ťažký reťazec sa klonoval rôznymi variáciami metódy podľa Bendinga a Jonese (Bio/Technology 9: 88 až 89), kde sa pre PCR amplifikáciu celej variabilnej oblasti používa 12 forward primerov, ktoré sú špecifické pre oblasť signálneho peptidu ťažkého reťazca a 1 reverzný primer špecifický pre konštantnú oblasť myšieho γ1. Skôr ako pridať 12 forward primerov do jednej reakcie je lepšie uskutočniť 12 oddelených reakcií PCR. Kedy v každej reakcii sa použije jeden z forward primerov s reverzným γ1. Tieto reakcie sa uskutočnili pri teplote hybridizácie 42,5 °C (krok 2 opísaný v schéme uvedenej vyššie v texte).

Vzorky každej reakcie sa analyzovali na agarózovom géli a pruh vykazujúci očakávanú veľkosť s objavil iba pri reakcii, ktorá používala forward primer MHV11. Na základe uvedeného výsledku sa uskutočnili dve PCR za použitia MHV11 a reverzného primeru γ1 a cDNA, ktorá sa odvodila z mRNA a z celkovej RNA. Pri dvoch nezávislých reakciách PCR, ktoré majú slúžiť ako zdroj materiálu na klonovanie, sa použili bežné prístroje, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky • ·· ·· ···· ·· ···· ·· · · · ·

-21 • ·· · · · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ·· ·· ·· · a zabraňujú vzniku chýb v sekvencii, ktoré vznikajú chybným začlenením nukleotidov Tag polymerázou.

Výsledné fragmenty PCR sa potom štiepili reštrikčnými enzýmami Xmal a Sali, čistili sa na géli a klonovali sa do pUC18. Inzerty z počtu klonov z každej PCR sa sekvenovali a zistilo sa, že sú zhodné. To naznačuje, že sekvencia neobsahuje chyby, ktoré vznikli spôsobom PCR. Úplná sekvencia variabilnej oblasti je uvedená na obrázku č. 1 (SEQ ID NO: 1) a je úplne spárovaná ťažkým reťazcom skupiny IIC podľa Kabata.

Klonovanie a sekvenovanie variabilnej oblasti ľahkého reťazca C11

Variabilná oblasť ľahkého reťazca C11 sa klonovala podobným spôsobom. Zahrnuje sadu 11 forward primerov, ktoré sú špecifické pre oblasť signálneho peptidu, a 1 reverzný primer špecifický pre myšiu konštantnú oblasť k (Bending a Jones, (Bio/Technology 9: 88 až 89). Naviac, ako sa skôr stanovilo, tento primer neamplifikuje dostatočne účinne všetky myšie ľahké reťazce kapa, použili sme iný primer, ktorý tu nazývame MKV12 (sekvencia 5'ACTAGTCGACATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTC3') (SEQ ID NO: 41). Ako sa uvádza vyššie v texte v každej oddelenej reakcii PCR sa nachádza jeden forward primer a reverzný primer konštantnej oblasti kapa. Tieto reakcie prebehli a analyzovali sa alektroforézou na agarózovom géli.

Tri produkty, ktoré vznikli pri uvedených reakciách mali očakávanú veľkosť.

Tieto produkty sa oddelene štiepili reštrikčnými enzýmami Sali a Xmal, čistili sa a klonovali do pUC18, pričom vznikli klony označené VKI, VKJ a VKK. Tieto klony sa čiastočne sekvenovali za účelom stanovenia ich identity. Zistilo sa, že čiastočná sekvencia klonu VKI je zhodná so známou sekvenciou, ľahkým reťazcom získaným z myelómu M0PC21, ktorý vykazuje posun v rámci CDR3 (GenBank M35669) a tiež sa odstránil VKI. Tiež sa zistilo, že čiastočná sekvencia klonu VKK zahrnujúca CDR3 je zhodná s produktívne upraveným ľahkým reťazcom MOPC21 (GenBank J00560, J00552). To isté nebráni tomu, aby sa kloň VKK upravil na ľahký reťazec C11, pričom oba ľahké reťazce môžu zdieľať CDR3 v embryonálnej konfigurácii. Je dané, že myelomový predchodca hybridómu je derivát MOPC21 a tak sa

-22• ·· ·· ··· ·· ···· ·· · ··· • ·· · · · · · · · • · » · · · · · ··· ·· ·· ·· ·· · identifikovala iná sekvencia príbuzná M0PC21 (kloň VKI). Uvažuje sa, že kloň VKK je správny.

Uvažuje sa, že kloň VKJ s veľkou pravdepodobnosťou reprezentuje skutočnú variabilnú oblasť ľahkého reťazca C11, rovnako ako čiastočná sekvencia nebola zhodná s ľubovoľnou sekvenciou v génovej banke. Kloň VKJ sa úplne sekvenoval a zistilo sa, že ide o úplne funkčnú sekvenciu ľahkého reťazca, neobsahuje posun v rámci, s najväčšou pravdepodobnosťou používa gény VK167 alebo VK24, a je umiestnená ako netypická sekvencia skupiny II podľa Kabata. Úplná sekvencia klonu VKJ sa zobrazila na obrázku č. 2 (SEQ ID NO: 2). Ďalej sa uskutočnila druhá nezávislá PCR za použitia párov primerov, ktorá produkuje produkt, ktorý sa klonoval a sekvenoval, aby sa predišlo možnosti, že sekvencia VKJ zahrnuje chyby PCR. Klony z tejto druhej amplifikácie mali sekvenciu zhodnú s pôvodným klonom VKJ.

Definitívny dôkaz, že VKJ obsahoval variabilnú oblasť ľahkého reťazca C11 sa získal prostredníctvom konštrukcie chimerických protilátok za použitia VK a VH, ktoré sa opisujú vyššie v texte. Ukázalo sa, že protilátky viažu CD23.

Návrh chimerických protilátok

Aby sa overilo, že sa klonovali a sekvenovali správne variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca, skonštruovali sa chimerické anti-CD23. Variabilná oblasť ťažkého reťazca sa amplifikovala za použitia klonov z knižnice cDNA. Froward primér obsahoval 5* klonovacie miesto (Hind III), 5' neprekladanú sekvenciu zahrnujúcu funkčný Kozacov signál, spolu s prvými šiestimi kodónmi myšej variabilnej ťažkej oblasti. Reverzný primér zavádza reštrikčné miesto Spe I do rámca 4, aby sa fúzoval s ľudskou konštantnou oblasťou gama I. Za použitia týchto primerov vznikol produkt obsahujúci 430 párov báz.

anti-CD23 chimerické PCR oligonukleotidy ťažkého reťazca:

5' gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA Cag gAC CTC ACC ATg gAT TTT gggCtgATT3' SEQIDNO: 19

5' gAT ggA CTA gTg TCC CTT ggC CCC A 3'

SEQ ID NO: 20

• ·· ·· · ·	·· •	•	BBBB •	·· • ·	B
B BBB B	•	•	• ·	B ·
• ·	•	•	• ·	B B
BBB ··	BB		··	BB	B

Skonštruovali sa priméry na amplifikáciu variabilnej oblasti anti-CD23 ľahkého reťazca za účelom pripraviť chimerický ľahký reťazec. Tieto priméry obsahujú 5' klonovacie miesto (Hind III), 5' neprekladanú sekvenciu zahrnujúcu signál podľa Kozaca, spolu s prvými šiestimi kodónmi myšieho variabilného ľahkého reťazca. Reverzný primér obsahoval reštrikčné miesto BsiW 1 a antikodóny vhodné pre určité aminokyseliny.

Reduntantné kódy sú štandardné: Y = T alebo C, K = T alebo G, V = A, G alebo C. Produkt obsahoval 420 párov báz.

anti-CD23 chimerické PCR oligonukleotidy ľahkého reťazca:

5' gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA CAg gAC CTC ACC ATg Agg TTC TCT gTT CAg SEQ ID NO: 21

5'gAT gCg TAC gTY TKA TYT CCA VCT TKG T 3' SEQ ID NO: 22 (a SEQ ID NO: 42 až 45 a 52 a 53)

T R K I E L K T R V

Produkty ťažkého reťazca sa čistili, štiepili reštrikčnými enzýmami Hind III a Spe I, potom sa klonovali do vektora pUC štiepeného reštrikčnými enzýmami Hind III a Spe I, ktorý obsahuje konštantnú oblasť ľudského gama I. Používaná ľudská konštantná oblasť bola ťažký reťazec lgG1 opísaný v publikácii Reichman L a ďalší, (1988) Náture 322, 323 až 327, Page, M. J. a Sydenham, M. A. (1991) Biotechnology 9, 64 až 68 a Crowe J. S. a ďalší, Clinical Exp. Immunol. (1992) 87 až 105.

Variabilná a konštantná oblasť sa získala z vektora pUC reštrikčným enzýmom Hind III a EcoRI, potom sa klonovala do reštrikčného miesta Hind III EcoR 1 expresného vektoru pEE6, ktorý sa získal od firmy Celtech (Stephens & Cockett and Nucl. Acids, Res. (1989) 17, 7110).

Keď sa sekvenoval chimerický ťažký reťazec, chýbalo 100 párov báz 5' sekvencie. Po testovaní sekvencie myšieho variabilného reťazca sa objavilo vnútorné reštrikčné miesto Hind III. Aby vznikla variabilná sekvencia úplného

-24• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · · · • ··· · · · · · · · • ······· ··· ·· ·· ·· ·· · ťažkého reťazca vytvorená v produktoch PCR, produkt PCR sa štiepil reštrikčným enzýmom Hind III a malý fragment obsahujúci 100 párov báz sa klonoval do pEE6 tráveného enzýmom Hind III, ktorý obsahuje ťažký reťazec chimerických protilátok anti-CD23.

PCR produkty ľahkého reťazca sa čistili, potom sa štiepili reštrikčnými enzýmami Hind III a BsiW 1. Potom sa ligovali do vektora pUC, ktorý obsahuje konštantnú oblasť ľudského kapa. Použitie konštantnej oblasti ľudského kapa sa opisuje v publikácii Reichman L a ďalší, (1988) Náture 322, 323 až 327. Variabilná a konštantná oblasť sa odstránila z vektora pUC reštrikčným enzýmom Hind III a Eco Rl. Tento fragment sa klonoval do reštrikčného miesta Hind III - EcoR 1 expresného vektora pEE12, ktorý sa získal od firmy Celltech (Bebbington a Hentschel, In DNA Cloning Vol. 3, Chapter 8 IRL Press 1987).

Chimerický ťažký reťazec sa izoloval ako kazeta Bgl II - Sal I a začlenil sa do reštrikčného miesta Bam H1 - Sal I plazmidu ľahkého reťazca pEE12 tak, že gény ľahkého a ťažkého reťazca boli na rovnakom plazmide.

Konečná expresia plazmidu, ktorá obsahuje chimerický CD23 sa dočasne exprimovala v bunkách COS (bunky obličiek šedej opice). Transfektám (Promega) sa rekonštituoval v koncentrácii 1 mg/ml podľa doporučeného protokolu výrobcu. V deň pred transfékciou sa do jamky vnieslo 5x10⁵ buniek a pripravilo sa tak šesť platní (Costar) pri celkovom objeme 2,5 ml média. Ako médium sa použilo Dulbeccovo upravené Eagle Médium (Gibco/BRL) a 10% dialyzované fetálne teľacie sérum (Hyclone). Platne sa inkubovali cez noc pri teplote 37 °C. Pre každú jamku na platniach so 6 jamkami sa pripravila zmes, keď 20 μΙ transfektámu sa pridalo do 0,5 ml média bez séra v sterilnom polystyrénovom kontajneri, potom sa zmes rýchlo premiešala na vortexe. V prípade každej jamky, kde malo dôjsť k transfekcii sa do 0,5 ml roztoku transfektámu v médiu bez séra pridali 4 pg plazmidovej DNA. Potom sa jamky zamiešali a nechali sa stáť pri teplote miestnosti počas 10 minút. Zatiaľ sa pripravili bunky pre transfekciu. Z buniek, ktoré sa transfektujú, sa odstránilo kultivačné médium, potom sa buky v každej jamke opatrne premyli 1 alebo 2 krát 5 ml dopredu ohriateho kultivačného média bez séra. Potom sa pridalo do každej jamky 0,5 ml kultivačného média bez séra. Skôr pripravený roztok 0,5 ml DNA/transfektám sa pridal do každej jamky a potom sa bunky nechali rásť. Platne

-25• ·· ·· ··«· ·· · ···· ·· · ···· ··· · · · ··· • ··· ··· ···· · • ········ ··· · ·· ·· ·· ··· sa jemne miešali, potom sa vrátili do inkubátora na ďalšie štyri hodiny. Do transfekčného roztoku sa pridali dva mililitre úplného média (obsahujúce 1,5 násobok koncentrácie normálneho séra). Platne sa vrátili do inkubátora na dobu troch dní. Z platní sa zhromaždilo kultivačné médium a testovala sa aktivita protilátok.

V teste ELISA sa chimerické protilátky viazali na sCD23. V prípade testu ELISA, ktorý slúži na stanovenie naviazania sCD23, sa platne EIA/RIA (Costar) potiahli 100 μΙ na jednu jamku sCD23 v koncentrácii 2 pg/ml v roztoku 35 mM NaHCO3, 15 mM Na2CO3, pH 9,3 cez noc pri teplote 4 °C. Platne sa premyli trikrát 150 mM NaCl, 50 mM bázou Trizma, 0,1 % (objem.) Tween-20, pH 7,4 (TBS/Tween) a blokovali sa počas 1 až 2 hodín pri teplote 22 °C 2% bovinným sérovým albumínom v TBS/Tween v množstve 100 μΙ na jamku a premyli sa trikrát zmesou TBS/Tween.

Riedenie supematantov z myších hybridómov C11 sa pridalo v množstve 100 μΙ/jamku do jednej časti platne s 96 jamkami a do ďalšej časti s 96 jamkami sa pridali nariedené chimerické protilátky anti-CD23 exprimované v supernatantoch buniek COS. Myšie protilátky C11 sa detekovali konjugátom anti-myší IgG (celá molekula) - peroxidáza, ktorý pochádza z kôz a je možné ho získať od firmy Sigma A4416. Konjugát sa riedil v pomere 1:1000 v PBS/BSA (bovinný sérový albumín) (1%). Chimerické protilátky anti-CD23 sa detekovali za použitia konjugátu protilátok proti ľahkému reťazcu ľudského kapa (viazaného a voľného) a peroxidázou (Sigma A-7164), ktorý sa riedi v pomere 1:5000 v PBS/BSA (1 %). Chimerické anti-CD23 sa v teste ELISA viažu na sCD23.

Chimerické protilátky proti CD23 sa tiež viažu na membránu CD23, ako sa stanovilo pomocou FACS. Tieto dáta ukázali, že správne variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca C11 sa klonovali a sekvenovali. Tieto myšie sekvencie sa potom použili na vývoj humanizovaných protilátok proti CD23.

Konštrukcia génov humanizovaného ťažkého a ľahkého reťazca

Humanizované ťažké a ľahké reťazce sa skonštruovali podľa nasledujúcej metódy, ktorá sa opisuje v publikácii Lewis a Crowe (Gene 101, 297 až 302,1991).

-26• ·· ·· ··· 99

9999 99 9 999

99999 9 999 9

999 99 99 99 99 9 (i) ľahký reťazec

Sekvencie variabilnej oblasti kostry myších protilátok sa porovnali so sekvenciami ľudských protilátok v databáze GenBank. Homológia kostry ľudského ľahkého reťazca sa porovnala s homológiou sekvencie variabilnej kostry ľahkého reťazca myších anti-ľudských anti-CD23 protilátok. Kostra vykazujúca najväčšiu homológiu sa vybrala ako templát na extenziu pomocou PCR.

Lokus: HSIGKVII 490 bp mRNA

Definícia: Ľudská upravená DNA pre vedúci peptid imunoglobínu kapa a variabilná oblasť

Zdroj: Homo sapiens

Autor: Klobeck, H. G a ďalší, Contribution of human V kappa II germ-line genes to light chain diversity, náture, 309, 73 až 76,1984.

Testovala sa každá aminokyselina, ktorá sa líši v rovnakej polohe od kostry myších a ľudských protilátok. Ľudská aminokyselina zostala, ak naviazanie antigénu nie je ovplyvnené, pretože ľudské zvyšky sú menej imunogénne ako myšie zvyšky. Označenie špecifických zvyškov, ktoré ovplyvňujú naviazanie je hypotetické a je založené na dátach získaných z iných interakciou protilátka - antigén. Z publikovaných dát sa ukázalo, že zvyšky 71, 91 a 94 v kostre ťažkého reťazca interagujú s naviazaním antigénu (Tramontano, A., Chothia, C., a A. M. Lesk, J. Mol. Biol., 215, 175 až 182, 1990, Kettleborough, C. A., Saldanha, J., Heath, V. J., Morrison, C. J. a M. M. Bending, Protein Eng, 4, 773 až 783, 1991). Tieto zvyšky môžu byť preto rovnaké v humanizovanej kostre ako myšej kostre. Každá zmena aminokyseliny sa zvažuje z hľadiska veľkosti, kydrofobicity, hydrofility a náboja. Ak ľudská aminokyselina je podobná s myšou aminokyselinou v týchto charakteristikách, potom sa na tomto mieste použije ľudská aminokyselina.

Pri porovnaní variabilnej aminokyselinovej sekvencie kostry myšieho ľahkého reťazca a variabilnej sekvencie ľudského ľahkého reťazca, ktorá vykazuje najväčšiu homológiu, sa zistilo 13 rozdielov. Nezachoval sa žiadny z myších zvyškov. Vytvorila sa variabilná sekvencia humanizovnaého ľahkého reťazca a program GCG sa použil na identifikáciu tichých miest v prípade nasledujúcich enzýmov: Accl, Hael, Nhel, Pvull, Xbal, Xhol, Xmal.

• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · · · ·

-27V nukleotidovej sekvencii sa uskutočnili zmeny tak, aby boli zahrnuté uvedené miesta reštrikčných enzýmov, bez toho, aby došlo k zmene aminokyselinovej sekvencie. Prítomnosť uvedených miest umožňuje ľahšie štiepenie a spojenie fragmentov PCR klonov.

Humanizovaný variabilný ľahký reťazec sa vytvoril vnesením CDR myšieho ľahkého reťazca do existujúceho templátu (napríklad HSIGKVII, opisuje sa v poblikácii Klobek, H. G. a ďalší, Náture (1984) 309, 73 až 76), ktorý obsahuje vybranú sekvenciu kostry ľudského reťazca za použitia zostrihu presahu pomocou PCR (opisuje sa v publikácii Crowe J. S. a ďalší, Clinical Exp. Immunol. (1992) 87 až 105. Pripravili sa plazmidy kódujúce variabilné sekvencie humanizovaného ľahkého reťazca:

Sekvencia podľa Kozaca pre transkripciu a signálnu sekvenciu (MGWSCIILFLVATATGVHS-SEQ ID NO: 15) sa zahrnula do templátovej sekvencie ľahkého reťazca. Na 5' koniec produktu PCR vhodného na klonovanie sa pridalo reštrikčné miesto Hind III a na jeho 3' koniec sa pridalo reštrikčné miesto Bswi I. Oligonukleotidy vhodné na PCR extenziu sú:

A_L: SEQ ID NO: 23. 5' gAT CAA gCT TCT CTA CAg TTA CTg AgC ACA 3'

B_L: SEQ ID NO: 24. 5' AAT CAA gTA TgT CTT CCC ATC CTT ATA CAg gAg ACT CTT ACT CgA gCg ACA ggA gAT ggA ggC 3'

C_L: SEQ ID NO: 25. 5' CgC TCg AgT AAg AgT CTC CTg TAT AAg gAT ggg AAg ACA TAC TTg AAT Tgg TAC CTg CAg AAg 3'

D_l: SEQ ID NO: 26. 5' TgA TgC CCg ggT ggA CAT CAA ATA gAT Cag gAg CTg 3'

E_l: SEQ ID NO: 27. 5' TTg ATg TCC ACC Cgg gCA TCA ggg gTC CCT gAC Agg 3'

F_L: SEQ ID NO: 28. 5' AgC CAC CTg Acg TTT gAT CTC CAC CTT ggT CCC TTg gCC gAA CgT gAA Tgg ATA CTC TAC CAg CTg TTg ACA gTA ATA AAC CCC 3' • ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ···

-28• ··· ··· ···· · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ···

Reakcie PCR (opisuje sa v publikácii Saiki a ďalší, Science 239, 487 až 491, 1988) sa uskutočnili v programovateľnom zahrievanom bloku (Perkin Elmer, GeneAmp 9600) za použitia 25 cyklov pri cyklizácii teplôt (94 °C počas 1 minúty, 50 °C počas 2 minút, 72 °C počas 3 minút), potom nasleduje konečný 5 minútový krok pri teplote 72 °C. V konečnom reakčnom objeme 50 μΙ sú obsiahnuté priméry (každý v koncentrácii 40 μΜ), špecifikované množstvo templátu a 2,5 jednotiek Taq polymerázy (Perkin Elmer Cetus) a reakčný pufor podľa doporučenia výrobcu.

Uskutočnili sa tri primárne reakcie PCR, keď sa pri každej reakcii použilo 10 ng templátu, páry primérov A_Ls B_L, Cl s D_l, E_l s F_l. Produkty uvedených reakcií, čo sú fragmenty AB_L, CD_l a EF_L sa čistili za použitia sady Qiaquick OCR Purification Kit (Qiagen Ltd., Surrey, UK, produkt #28104) podľa protokolu doporučeného výrobcom. Fragmenty AB_Ľ a CD_L sa kombinovali za použitia jednej desatiny každého čisteného produktu a uskutočnila sa rekombinantné reakcia PCR a primermi A_L a D_L. Produkt tejto reakcie, čo je fragment AD_L, sa čistil ako je uvedené vyššie v texte. Jedna desatina produktu sa kombinovala v rekombinantnej reakcii PCR s jednou desatinou čisteného EF_Ľ za použitia primérov A_L a F_L. Konečný produkt rekombinantnej PCR humanizovaného ľahkého reťazca AFl sa ligoval do pCR™ II, ktorý pochádza zo sady TA Cloning Kit (Invitrogen BV, Leek, The Netherlands, produkt #K2000-01), pričom sa postupuje podľa protokolu doporučeného výrobcom. Plazmidové izoláty sa sekvenovali za použitia fluorescenčného sekvenátora ABI.

(ii) Ťažký reťazec

Identifikovala sa sekvencia kostry ľudských protilátok, ktorá vykazuje najväčšiu homológiu so sekvenciou kostry myších protilátok, vhodná pre ťažký reťazce. Sekvencia vykazujúca najväčšiu homológiu v databáze v prípade ťažkého reťazca je:

Lokus: HUMSIGVS 423 BP MRNA

Definícia: mRNA reťazca ľudského Ig mu oblasť 5' konca V3b-D-J4

Zdroj: cDNA k mRNA Homo Sapiens

-29• ·· · ···· ·· ·· · · ·· · ··· • ·· ··· · · · · · • · · · · · ··· ··· ·· ·· ·· ·· ···

Autori: Sanz, I a ďalší, VH sequence of human autoantibody. Evidence That autoantibodies can be unmutated copies of germline genes. J. Immuno. 142, 883 až 887,1989.

Pri porovnávaní variabilnej aminokyselinovej sekvencie kostry myšieho ťažkého reťazca a variabilnej sekvencie ľudského ťažkého reťazca, ktorá vykazuje najväčšiu homológiu, sa zistilo 17 rozdielov. V piatich pozíciách 49, 66, 76, 77 a 94 sa zachovala myšia aminokyselina. Vo všetkých ďalších polohách sa pri humanizácii kostry ťažkého reťazca použili ľudské aminokyseliny.

Vytvoril sa súbor variabilnej sekvencie humanizovaného ťažkého reťazca a program GCG sa použil na identifikáciu tichých miest v prípade nasledujúcich enzýmov: Eagll, Nhel, Xbal, Xhol, Xmal.

V nukleotidovej sekvencii sa uskutočnili zmeny tak, aby boli zahrnuté uvedené miesta reštrikčných enzýmov, bez toho, aby došlo k zmene aminokyselinovej sekvencie. Prítomnosť uvedených miest umožňuje ľahšie štiepenie a spojenie fragmentov PCR klonov.

Na 5' koniec sekvencie variabilnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca sa pridalo reštrikčné miesto Hind III vhodné na klonovanie, sekveneia podľa Kozaca vhodná na iniciáciu transkripcie a myšia signálna sekveneia (MAWWTLLFLMAAAQSAQA - SEQ ID NO: 16) na účely vylučovania proteinu. Na 3' koniec sekvencie sa pridalo reštrikčné miesto Spel, ktoré je vhodné na klonovanie.

Variabilná kostra humanizovaného ťažkého reťazca, ktorý obsahuje myšiu CDR sa pripravila pomocou PCR za použitia dlhých prekrývajúcich sa oligonukleotidov. Syntetizovalo sa osem oligonukleotidov, ktoré tvoria približne 60 párov báz s presahom 15 párov báz. Tieto oligonukleotidy sú nasledujúce:

AH: SEQ ID NO: 29. 5' ACA CgA AgC TTC ACC Atg gCT Tgg gTg Tgg ACC TTg CTA TTC CTg ATg gCg gCC gCC CAA 3'

BH: SEQ ID NO: 30. 5' CTT TAC CAA gCC TCC CCC AgA CTC CAC Cag CTg

CAC CTC TgC TTg ggC ACT TTg ggC ggC CgC CAT 3’ • ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ···

-30·· · · · · · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···

CH: SEQ ID NO: 31. 5' TTg gTA AAg CCC ggg ggg TCC CTT AgA CTC TCC TgT gCA gCT AgC ggA TTC ACT TTC AgT 3'

DH: SEQ ID NO: 32. 5' CCC CTT CCC Tgg AgC CTg gCg gAC CCA ggA CAT CCA gTA gCC gAA AgT gAA TCC gCT 3'

EH: SEQ ID NO: 33. 5' ggg AAg ggg CTC gAg Tgg gTT gCT gAA ATT AgA TTg AAA TCT gAT AAT TAT gCA ACA CAT 3'

FH: SEQ ID NO: 34. 5' ATC ATC TCT TgA gAT ggT gAA TTT CCC CTT CAC AgA CTC CgC ATA ATg TgT TgC ATA ATT 3'

GH: SEQ ID NO: 35. 5' ATC TCA AgA gAT gAT TCA AAA TCT AgA CTg TAT CTg CAA ATg AAC AgC CTg AAA ACC gAg gAC ACA 3'

HH: SEQ ID NO: 36. 5' ggT gAC TAg TgT TCC CTg gCC CCA gTC TAT gAA ATC TgT ACA gTA ATA CAC ggC TgT gTC CTC ggT TTT 3'

Myšie CDR sa vnieslo do templátu za použitia rekombinantnej PCR. PCR sa uskutočnila za použitia programovateľného termálneho cyklovača (Trio, Biometra). Reakcia s objemom 50 μΙ obsahovala 2,5 jednotiek polymerázy AmpliTaq (PerkinElmer-Cetus, Beaconsfield, UK) v pufri, ktorý poskytol výrobca. Tento pufor zaručuje výhodné pH a ionovú silu vhodnú na amplifikáciu (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCI a 1,5 mM MgCb), 200 μΜ každého dATP, dCTP, dGTP a dTTP a amplifikačné primery v koncentrácii 1 pg/pl. Vzorky sa zahriali na teplotu 94 °C počas 2 minút v zahrievacom bloku, odstredili sa počas 30 sekúnd pri 16000xg. Vzorky sa umiestnili na ľad počas 1 minúty, potom sa pridala Taq polymeráza a kvapka minerálneho oleja. Vzorky sa miešali na vortexe, potom sa 30 sekúnd odstredili pri 16000xg. Vzorky sa potom umiestnili do programovateľného termálneho cyklovača a prebehla reakcia za nasledujúcich podmienok:

Krok 1: teplota 94 °C počas 1 minúty

Krok 2: teplota 50 °C počas 2 minút, skok na krok 3 pri teplote 0,4 °C/sekundu

• ·· ·· · ·	··	···· •	•	··	•	··
•	•
• ··· ·	•	•	•	• ·		•
• ·	•	•	• ·	•		•
··· ··	··		• ·		··		··

Krok 3: teplota 72 °C počas 3 minút, späť na krok 1, opakovať slučku 25 krát.

Uskutočnilo sa sedem primárnych reakcií PCR, kedy sa pri každej reakcii použilo 1 Mg/μΙ každého priméru za použitia kombinácií primérov A_H s B_H, Ch s D_h, Eh s Fh, Gh s Hh, Ah Bh Ch e Dh Eh Fh Gh a Hh, Ah Bh Ch Dh Eh Fh Gh a HhAlikvóty s objemom 1 μΙ primárnych produktov PCR sa kombinovali s primermi (1 Mg/μΙ) a vystavili sa rovnakým podmienkam reakcie PCR, ktoré sa opisujú pre primárnu reakciu PCR, pri ktorých vzniká variabilná oblasť ťažkého reťazca v plnej dĺžke. Primárne fragmenty PCR AF_H a EH_h, fragment AHh, fragmenty AB_H, CDh a EF_h a GH_h, fragmenty ABh, CDh, EFh, GH_h a AH_h sa kombinovali s primermi Ah a H_h. Všetky reakcie PCR produkovali fragmenty celej dĺžky. PCR produkt variabilnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca z reakcií AB_H, GHh a AHh sa čistil použitím DNA Wizard PCR Preps (Promega) podľa protokolu, ktorý doporučuje výrobca. Čistené produkty sa štiepili reštrikčným enzýmom Hind III a Spe I a potom sa klonovali do vektora pUC, ktorý obsahuje mutovanú konštantnú oblasť lgG1 (opisuje sa ďalej v texte).

Konštrukcia humanizovaných protilátok

PCR produkty variabilnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca sa štiepili reštrikčnými enzýmami Hind III a Spe I a potom sa klonovali do vektora pUC, ktorý obsahuje mutovanú konštantnú oblasť lgG1 (opisuje sa ďalej v texte). Variabilná oblasť klonov sa sekvenovala. Sekveneia je uvedená na obrázku č. 3 a 4 (SEQ ID NO: 17 a 18). Vybral sa kloň obsahujúci správnu variabilnú aminokyselinovú sekvenciu humanizovaného ťažkého reťazca. Tento kloň má jednu skrytú zmenu nukleotidu z modelovej variabilnej sekvencie humanizovaného ťažkého reťazca.

V prípade konštantnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca sa použili lgG1 s mutáciami, aby sa eliminovalo naviazanie C1q a Fc. Tieto mutácie sú založené na nasledujúcich dvoch publikáciách: Duncan, A. R. a Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Náture 332, 738 až 740, 1988 a Duncan, A. R., Woolf, J. M., Partrige, Ľ. J., Burton, D. R. a Winter, G. Localization of the binding for human FcR1 on IgG. Náture 332, 563 až 564, 1988.

• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ···

-32• ····· · ··· · · • · ···· ··· ··· ·· ·· ·· ·· ···

Mutácia zvyškov sa opisuje v publikácii Kabat, A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S. a C. Foeller, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Volume, strana 680.

Zmeny uskutočnené v lgG1 za vzniku izotopu, ktorý nie je cytotoxický sú nasledujúce: 248 Leu (Ctg) na Ala (gCg) a 250 Gly (ggA) na Ala (gCA).

Tieto mutácie sa pripravili miestne riadenou mutagenázou ľudského lgG1 ·. nasledujúcim spôsobom:

Konštantné oblasti oligonukleotidov PCR používané k vzniku lgG1 s mutáciami boli nasledujúce:

SEQ ID NO: 37: Ac gCT CCT TTT AAg CTT Tgg ggT CAA ggC TCA CTA gTC ACA gTC TCC

SEQ ID NO: 38: B_c TgA Cgg TgC CCC CgC gAg TTC Agg

SEQ ID NO: 39: Cc CCT gAA CTC gCg ggg gCA CCg TCA

SEQ ID NO: 40: D_c AAg CTT CCg TCg AAT TCA TTT ACC Cgg AgA CAg

Oligonukleotid Ac obsahuje reštrikčné miesto Hind/Spe. Oligonukeotidy Bc a Cc obsahujú mutácie v polohách 248 a 250. Oligonukleotid Dc obsahuje reštrikčné miesto EcoR1. Oligonukleotidy Ac a Bc sa použili na vytvorenie fragmentu AB za použitia podmienok PCR, ktoré sa špecifikujú sekcii všeobecnej metodológie. Ako templát sa použila klonovaná konštantná oblasť ľudského lgG1 (Reichman. L., Clark, M., Waldman, H., a Winter, G., (1988) Reshaping human antibodies for therapy, Náture 322, 323 až 327). Oligonukleotidy Cc a Dc sa použili na vytvorenie fragmentu CD za použitia rovnakých podmienok PCR a templátu ako v prípade AB. Fragmenty PCR AB a CD sa čistili za použitia čistiaceho systému určeného pre DNA Wizard PCR Preps (Promega). PCR fragmenty AB (5,0 μΙ) a CDc (5,0 μΙ) sa kombinovali s oligonukleotidmi Ac a D_c za vzniku fragmentu AD_C, ktorý obsahuje konštantnú oblasť lgG1 s mutáciami. Fragment ADc sa čistil za použitia čistiaceho systému určeného pre DNA Wizard PCR Preps (Promega), štiepili sa reštrikčnými enzýmami Hind III a Ecorl, potom sa ligovali do plzamidu pEE6 štiepeného reštrikčnými enzýmami Hind III a EcoRI, ktorý obsahuje variabilnú oblasť humanizovnaného anti-CD23 ťažkého reťazca.

-339 99 99 9999

9 · 9 9 9 • 9 9 9 9 9

999 999 9 • 99

999 99 99 99

99 9

Konštantná oblasť sa sekvenovala, aby sa potvrdili mutácie. Fragment obsahujúci tieto mutácie sa preniesol do expresného plazmidu pEE6, ktorý obsahuje variabilnú oblasť humanizovaného anti-CD23 ťažkého reťazca.

PCR produkty ľahkého reťazca sa štiepili reštrikčnými enzýmami Hind III a BsiW 1, potom sa klonovali do expresného plazmidu pEE12, ktorý obsahuje konštantnú oblasť ľahkého reťazca ľudského kapa, ako sa opisuje vyššie v texte. Klony sa sekvenovali za použitia fluorescenčného sekvenátora ABI a vybral sa kloň obsahujúci správnu aminokyselinovú sekvenciu pre variabilnú oblasť humanizovaného ľahkého reťazca.

Fragment Bgl II - Sal I obsahujúci humanizovaný ťažký reťazec anti-CD23 z plazmidu pEE6 sa ligoval do miesta Bam H1 - Sal I plazmidu pEE12, ktorý obsahuje humanizovaný ľahký reťazec anti-CD23 za vzniku jedného plazmidu, ktorý obsahuje humanizovaný ťažký reťazec a ľahký reťazec anti-CD23. Variabilná a konštantná oblasť humanizovaného ťažkého a ľahkého reťazca obsiahnuté v konečnom plazmide sa sekvenovali.

Dočasná expresia humanizovaných protilátok

Plazmid s humanizovanými anti-CD23 sa transfekoval do buniek a dočasne sa exprimoval za použitia rovnakého protokolu, ako sa opisuje v prípade chimerických protilátok vyššie v texte. Expresný plazmid s humanizovanými antiCD23 sa transfektoval do buniek COS a dočasne sa exprimoval, ako sa opisuje v prípade dočasnej expresie chimerických anti-CD23.

Koncentrácie chimerických a humanizovaných anti-CD23 protilátok nutných na polovičné maximálne naviazanie na CD23 sa testovali za použitia testu ELISA s sCD23, ktorý sa opisuje vyššie v texte. Absorbancia pri vlnovej dĺžke 405 nm sa vyniesla do grafu proti rozmedziu koncentrácií protilátok za vzniku sigmoidálnej krivky. Absorbancia sa odčítala za použitia zariadenia na odčítanie platní Molecular Devices (Menlo Park, Calif., USA) a softvéru Softmax (Molecular Device Corp.), aby sa stanovila krivka najlepšie vyhovujúca log-logit algorimu, parametre rovnice a korelačný koeficient. Krivka sa opisuje v publikácii Data Analysis and Quality Control of Assays: A Practical Primer, R P Channing Pogers in Practical Immuno Assay, editor Wilfrid R. Butt, publikuje Marcel Dekker, Inc. New York 1984.

• ·· ·· ···· ·· ···· · · · ···

-34• ··· · · · · · · · • · ···· · · ··· ·· ·· ·· ·· ·

Algoritmus zodpovedajúci log-logit rovnici bol založený na metóde LovenbergMarquardtt. Táto metóda sa opisuje v publikácii Numerical Principles in C: The Art of Science computing, William H. Press, Brian P. Flannery, Saul A. Teukolski a William T. Vetterling, publikovanej Cambridge University Press, New York, 1988. Hodnoty pre premennú x vyjadrené v ng/ml sa vypočítali pre nasledujúcu rovnicu:

x = cx [a - y] 1/b [Y-b] keď y + d - c 2 a kde symbol d je hodnota y zodpovedajúca asymptote pri vysokých hodnotách osi x, symbol a je hodnota y zodpovedajúca asymptote pri nízkych hodnotách osi x, symbol c je hodnota x zodpovedajúca stredu medzi a a d, symbol b opisuje ako rýchlo krivka vykonáva prechod od asymptót v strede krivky. V typickom prípade nadobúda hodnotu 1.

Polovičné maximálne naviazanie sCD23 chimerickými anti-CD23 je 16,28 ng/ml (zobrazené na obrázku č. 5). Konštanta pre polovičné maximálne naviazanie humanizovaných anti-CD23 je 15,03 ng/ml (zobrazené na obrázku č. 6). Tieto dáta ukazujú, že humanizované anti-CD23 majú ekvivalentné naviazanie s chimerickými anti-CD23, ktoré majú kompletnú myšiu C11 variabilnú oblasť.

Stabilná expresia

Za použitia amplifikačného systému génu glutamínovej syntetázy získaného od firmy Celtech sa vybrali stabilné bunkové línie exprimujúce humanizované antiCD23. Pracuje sa podľa základného systému, ktorý je opísaný v publikácii Bebbington a ďalší, 1992, Biotechnology 10, 169 až 175. Tento systém opisuje prípravu stabilných bunkových línií zavedením linearizovaných expresných vektorov, ktoré obsahujú eDNA kódujúcu glutamínovú syntetázu škrečkov, ktorú riadi počiatočný promótor SV40 a zostrih SV40 a polyadenylačný signál a eDNA ťažkého a ľahkého reťazca protilátok, do buniek cicavcov elektroporáciou.

-359 99 99 9999 99

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9 9 999 9

999 99 ·· ·· ·· ···

Transfekované bunky sa potom vybrali na základe ich schopnosti rastu v kultivačnom médiu bez glutamínu. Bunky NSO (bunky B myšieho myelómu, ktoré nevylučujú imunoglobín) sa použili na prípravu humanizovaných anti-CD23. Stabilné bunkové línie sa kultivovali v Iscovom upravenom Dulbeccovom kultivačnom médiu (Sigma) s 2mM glutamínom (GIBCO/BRL) a 10% fetálnym teľacím sérom (Hyclone) (Non-Select médiu). Bunkové línie anti-CD23 sa pripravili nasledujúcim spôsobom. Expresný plazmid obsahujúci humanizované anti-CD23 (40 pg) sa linearizoval FsP1 (New England Biolabs), zrážal sa etanolom a resuspendoval sa v sterilnej vode s objemom 50 μΙ. Stanovil sa počet exponenciálne rastúcich buniek NSO. Bunky (10⁷) sa odstredili a premyli vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosforečnanom (PBS). Bunky sa resuspendovali v 950 μΙ sterilného PBS. DNA sa pridala do elektroporačných kyviet (0,4 mm, Bio-Rad), ktoré sa uchovávali na ľade. Kyvety sa umiestnili do elektroporátora Bio-Rad a prebehlo zavedenie dvoma konzekutívnymi pulzmi pri napätí 1500 voltov a 3 pF. Kyveta sa odstránila a umiestnila na ľad. Bunky sa nariedili na koncentráciu 10⁴, 10³, 10² buniek v mililitri neselekčného kultivačného média a naniesli sa na platne s 96 jamkami (Costar) v množstve 50 μΙ na jednu jamku. Nasledujúci deň sa do každej jamky pridalo 150 μΙ Iscovho Dulbeccovho upraveného média (Sigma) so 60 μΙ/ml kyseliny glutámovej (Sigma), 60 μΙ/ml asparagínu (Sigma), 7 μΙ/ml každého aenozínu (Sigma), guanozínu (Sigma), cytidínu (Sigma), uridínu (Sigma) a tymidínu (Sigma) a 10% fetálne teľacie sérum (Hyclone) (seiekčné médium). Platne sa vrátili do inkubátora s teplotou 37 °C a nechali sa kultivovať až sa prejavilo podstatné odumieranie buniek a zostalo pár živých kolónií.

Kolónie sa preniesli z konfluentných platní s 96 jamkami do jednej jamky na platni, ktorá obsahuje 24 jamiek. Po niekoľkých dňoch sa konfluentná kultúra použila pri inokulácii kultivačnej fľaše s objemom 25 cm². K použitému kultivačnému médiu sa pridalo čerstvé seiekčné médium. Kultúry sa udržiavali v koncentrácii 10⁵ až 10⁶ buniek/ml. Stanovila sa rýchlosť špecifickej produkcie (SPR) 144 klonov, aby sa porovnala produkcia protilátok u každého klonu tak, že sa vybral kloň s najvyššou produkciu ako produkčná línia. SPR sa stanovilo tak, že sa vzalo 10⁶ buniek konfluentnej fľaše, bunky sa premyli PBS a potom sa bunky pridali do 10 • ·· ·· fl··· flfl ···· ·· · ···

-36• ··· ··· · · · · · • · · · · · ··· ··· ·· ·· ·· ·· ··· ml čerstvého média a kultivovali sa počas 24 hodín pri teplote 37 °C. Produkcia protilátok sa hodnotila testom ELISA.

U klonov sa najskôr testovala produkcia ľudského IgG za použitia testu ELISA. Platne EIA/RIA (Costar) sa potiahli 100 μΙ kozieho anti-ľudského IgG v koncentrácii 5 μΙ/ml (Jackson Immunosearch Labs #109-001-003) v 35 mM NaHCO₃, 15 mM Na₂CO3, pH 9,3 a nechali sa stáť cez noc pri teplote 4 °C. Platne i sa trikrát premyli 150 mM NaCl, 50 mM bázou Trizma, 0,1 % (objem.) Tween-20, pH 7,4 (TBS/Tween), blokovali sa počas 1 až 2 hodín pri teplote 22 °C so 100 μΙ na jednu jamku 2% bovinného albumínového séra v TBS/Tween a trikrát sa premyli TBS/Tween. Do jamôk sa pridalo 100 μΙ kontrolného štandardu Campath-1H lgG1 (opisuje sa v publikácii Page, M. J. a Sydenham, M. A. (1991) Biotechnology 9, 64 až 68) (1000 ng/ml až 1 ng/ml) v kontrolnom médiu alebo v supernatantoch vzoriek v troch sadách. Platne sa nechali inkubovať cez noc počas 4 °C. Platne sa premyli päťkrát TBS/Tween a pridalo sa 100 μΙ riedenia 1:5000 kozieho anti-ľudského konjugátu alkalickej fosfatázy (Jackson Immunoresearch Labs #109-055-088) a inkubovali sa počas 2 hodín pri teplote 22 °C alebo cez noc pri teplote 4 °C. Platne sa premyli päťkrát TBS/Tween a pridalo sa 100 μΙ 3 mM pNPP v substrátovom pufri (Sigma 104-0) platne sa odčítali pri vlnovej dĺžke 405 nm na odčítacom zariadení pre mikrotitračné doštičky (Molecular Devices) za použitia 20 minútového kinetického programu. Štandardné krivky a koncentrácie IgG vo vzorke sa vypočítali a hodnoty priamo spracoval program. SPR sa vyjadruje v pg/10⁶ buniek /24 hodín. SPR 144 klonov sa pohybovala v rozmedzí 14 až 0 pg/10⁶ buniek/24 hodín. Klony , exprimujúce aspoň 5 pg/10⁶ buniek/24 hodín sa testovali na naviazanie sCD23 za použitia už opísaného testu ELISA. Chimerické CD23 sa v týchto testoch použili ako • štandardy.

Lýzy komplementu a testy ADCC

Humanizované anti-CD23 značené FITC sa použili na potvrdenie expresie povrchových CD23 na bunkách RPMI 8866 prietokovou cytometriou. Rovnaká bunka sa zafarbila FITC značenými humanizovanými anti-Cdw52 protilátkami

• 00 • · ·	·· •	····	0	00 0	00
•	•
• ··· 0	•	•	• ·	0	0
• ·	•	•	• ·	0	0
00 ··	··		00		00	00

(hCD52) a zistilo sa, že nevykazujú expresiu CD52. Naopak bunky Wein 133 vykazujú expresiu hCD52, ale nevykazujú expresiu anti-CD23.

Bunky RPMI 8866 sa zafarbili európÍumdietyléntriaminopentaacetátom (Eu/DTPA) zatiaľ čo bunky Wein 133 sa značili samáriumdietyléntriaminopentaacetátom (Sm/DTPA) spôsobom, ktoré sa opisujú v publikácii Blomberg, K, 1993, J. Immunol. Methods. 168, 267 Patel a ďalší, 1995, J. Immunil. Methods, 184, 29). Zmes 1:1 značených buniek Wein 133 a buniek RPMI 8866 sa potom lyžovala buď hCD52 alebo anti-CD23 v prítomnosti NHS, ako zdroja komplementu. Aktivácia komplementu prostredníctvom klasickej dráhy pomocou hCD52 spôsobuje uvoľnenie Sm/DTPA. V prítomnosti anti-CD23 sa neuvoľnilo žiadne Sm/DTPA. Dáta potvrdzujú že iba hCD52 a nie anti-CD23 volávajú lýzu buniek Wein 133. Dáta ďalej potvrdzujú, že dráha komplementu sa môže aktivovať, aby došlo k lýzy buniek. Ako sa predpokladalo, pomocou hCD52 sa neuvoľnilo z buniek RPMI 8866 žiadne Eu/DTPA. Aj keď bunky RPMI 8866 exprimujú CD23, pomocou anti-CD23 sa neuvoľnilo žiadne Eu/DTPA, čo ukazuje, že protilátky nie sú schopné aktivovať komplement.

Lýza zmesi značených buniek Wein 133 a RPMI 8866 v pomere 1:1 pomocou bunkovej toxicity závislej na protilátkach (ADCC) sa uskutočnila buď antiCD23 alebo hCD52 v prítomnosti periférnych krvných jednojadrových buniek (PBMC). Uvoľnenie Sm/DTPA pomocou hCD52 a nie anti-CD23 potvrdilo, že iba anti-CD23 nie sú schopné sprostredkovať ADCC lýzu buniek Wein 133. To nebolo prekvapujúce, pretože bunky Wein 133 neexprimujú CD23. Ani protilátky nespôsobujú uvoľnenie Eu/DTPA. To naznačuje, že aj keď expresia CD23 sa potvrdila u buniek RPMI 8866 prietokovou cytometriou, v súvislosti s anti-CD23 sa nedetekovala žiadna lýza buniek sprostredkovaná ADCC.

Kinetická analýza

Rýchlosť asociácie, disociácie a disociačná rýchlostná konštanta pre naviazanie humanizovaných anti-CD23 na antigén CD23 sa hodnotila biosenzorom Baicore. Čistený rekombinantný CD23 sa imobilizoval na povrchu senzora CM5. Karboxylové skupiny na povrchu dextránu sa aktivovali 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbimidom (EDCO/N-hydroxysukcínimid (NHS)). Po aktivácii prešli

• ·· • · ·	• · •	•	···· •	··	··
•	•
• ···	• ·	•	• ·	•	•
• ·	•	•	• ·	•	•
·· ··	··		··	··		··

rekombinantné CD23 cez povrch, aby iniciovali imobilizáciu. Potom sa pridal etanolamín, aby sa deaktivovali zvyšné aktívne skupiny. Humanizované anti-CD23 riedené v pufri HBS prešli cez povrch senzora. Naviazanie anti-CD23 na imobilizovaný CD23 sa monitoroval v reálnom čase, aby sa odhadla rýchlosť asociácie (M¹ s'¹). Tiež sa monitorovala disociácia CD23 a anti-CD23 komplexu v pufri, aby sa odhadla rýchlosť disociácie (s¹). Disociačná konštanta (nM) sa vypočítala s disociačnou a asociačnou rýchlosťou. V prípade 6-tich vsádzok antiCD23 dáta ukazujú asociačnú rýchlosť v rozmedzí 1,5 až 1,85x10⁶ M¹s¹ a disociačná rýchlosť 1 až 2x10⁵ s¹. Zistilo sa, že disociačná konštanta v prípade protilátok anti-CD23 je v rozmedzí 8 až 12 pM. Stanovilo sa, že afinitná konštanta je približne 9x10¹⁰ Ka.moľ¹.

-39• ·· ·· ···· tt tttt tt t ttt ··· ttt t· t tt· «t · ttt t t t tttt tt ttt tt tt tt tt t

Zoznam sekvencii (2) Informácie o SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca: Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 3 ..413 (D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

aa get tta cag tta ctc age aca cag gac ctc acc atg gat ttt ggg 47

Ala Leu Gin Leu Leu Ser Thr Gin Asp Leu Thr Het Asp Phe Gly

1

5

10

15

ctg

att

ttt

ttt

, att

gtt

ctt

tta

aaa

ggg

gtc

cag

agt

gaa

gtg

aag

95

Leu

íle

Phe

Phe

, íle

Val

Leu

Leu

Lys

Gly

val

Gin

Ser

Glu

Val

Lys

20

25

30

ctt

gag

gag

tet

gga

gga

ggc

ttg

gtg

caa

cct

gga

gga

tcc

atg

aaa

143

Leu

Glu

Glu

Ser

Gly Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

Gly

Ser

Met

Lys

35

40

45

ctc

tcc

tgt

gta

gcc

tet

gga

ttt

act

ttc

agt

ggc

tac

tgg

atg

tet

191

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

Trp

Met

Ser

SO

55

60

tgg

gtc

ege

cag

tet

cca

gag

aag

ggg

ctt

gag

tgg

gtt

get

gaa

att

239

Trp

Val

Arg

Gin

Ser

Pro

Glu

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Glu

íle

65

70

75

-40• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ··· • ··· · · · · · · · • · · · · · ··

999 99 99 99 99 9

aga ttg Arg Leu 80

aaa tet gat

aat tat gca aca cat tat gcg gag tet gtg

aaa Lys 95

287

Lys

Ser Asp

Asn Tyr 85

Ala

Thr

His Tyr 90

Ala

Glu

Ser

Val

999

aag

ttc

acc

atc

tca

aga

gat

gat

tcc

aaa

agt

cgt

ctc

tac

ctg

335

Gly

Lys

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

Lys

Ser

Arg

Leu

Tyr

Leu

100

105

11®

caa

atg

aac

age

tta

aga

get

gaa

gac

agt

gga

gtt

tat

tac

tgt

aca

383

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Ser

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Thr

115

120

125

gat

ttc

ata

gac

tgg

ggc

caa

999

aca

cta

gt

415

Asp

Phe

íle

Asp

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

130

135

(2) Informácie o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 437 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 3 ..437 (D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

aa get tta cag tta ctc age aca cag gac ctc acc atg agg ttc tet 47

Ala Leu Gin Leu Leu Ser Thr Gin Asp Leu Thr Met Arg Phe Ser 10

-41 • ·· ·· BBBB BB ·

BB B B B B · B B BB • · · · · · ··· • ··· ··· BBBB B • · BBBB BBB

BBB BB BB BB BB BBB

gtt cag

ttt ctg ggg gtg ctt atg ttc tgg atc tet gga gtc agt

ggg Gly

95

Val

Gin

Phe Leu

Gly Val Leu Met Phe Trp

íle Ser

Gly

Val

Ser 30

20

25

gat

att

gtg

ata

acc

cag

gat

gaa

ctc

tcc

aat

cct

gtc

act

tet

gga

143

Asp

íle

Val

íle

Thr

Gin

Asp

Glu

Leu

Ser

Asn

Pro

Val

Thr

Ser

Gly

35

40

45

gaa

tca

gtt

tcc

atc

tcc

tgc

agg

tet

agt

aag

agt

ctc

ctg

tat

aag

191

Glu

Ser

Val

Ser

íle

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

Leu

Leu

Tyr

Lys

50

55

60

gat

999

aag

aca

tac

ttg

aat

tgg

ttt

ctg

cag

aga

cca

gga

caa

tet

239

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Phe

Leu

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

65

70

75

cct

cag

ctc

ctg

atg

tat

ttg

atg

tcc

acc

cgt

gca

tca

gga

gtc

tca

287

Pro

Gin

Leu

Leu

Met

Tyr

Leu

Met

Ser

Thr

Arg

Ala

Ser

Gly

Val

Ser

80

85

90

95

jgac

cgg

ttt

agt

ggc

agt

ggg

tca

ggc

aca

gat

ttc

acc

ctg

gaa

atc

335

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Glu

íle

100

105

110

agt

aga

gtg

aag

get

gag

gat

gtg

ggt

gtg

tat

tac

tgt

caa

caa

ctt

383

Ser

Arg

Val

Lys

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Leu

115

120

125

gta

gag

tat

cca

ttc

acg

ttc

ggc

tcg

ggg

aca

aag

ttg

gaa

ata

aaa

431

Val

Glu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

130

135

140

cgt acg Arg Thr

145

-42• ·· ······ ·· ·· · · ·· · ··· • ··· · · · ···· · • · · · · · ··· ··· ·· ·· ·· ·· ··· (2) Informácie o SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 16 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(ii) Druh molekuly: protein (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 15 10 15 (2) Informácie o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 48 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..48 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

cgc tcg agt aag agt ctc ctg tat aag gat ggg aag aca tac ttg aat 48

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

10 15 (2) Informácie o SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 7 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: protein

4 44 44	4444 4	44 4 4	44
4 4 4 4	4
4 444 · 4	4	4 4	4 4
4 4 ·	•	4 4	4 4
44 44 44		44	44	44

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:

Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 21 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (C) Pozícia: 3 ..413 (D) lné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:

ttg atg tcc acc cgg gca tca Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser

5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 9 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia: lineárna (II) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč:

(B) Pozícia:

(D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 7:

-44• 99 ·· ···· 99 · ·· · · 9 9 φ 99 99 ••9 999 999 • 999 999 9999 9 • 9 9999 999

999 99 99 99 99 999

Gin Gin Leu Val Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..27 (D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:

caa cag ctg gta gag tat cca ttc acg 27

Gin Gin Leu Val Glu Tyr Pro Phe Thr

5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 5 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: protein (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:

Gly Tyr Trp Met Ser 1 5

-45• ·· ·· ···· ·· · ·· · · ·· · ···· ······ ··· • ··· ··· ···· · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ··· (2) Informácie o SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 15 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..15 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:

ggc tac tgg atg tcc ^3-5

Gly Tyr Trp Met Ser

5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 19 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:

(D) iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 11:

Glu íle Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 (2) Informácie o SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 57 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

·· ·· ···· ·· • · · ····

-46• ··· ··· ···· · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ··· (D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..57 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:

gaa att aga ttg aaa tct gat aat tat gca aca cat tat gcg gag tct 48

Glu íle Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

5 10 15 gtg aag ggg 57

Val Lys Gly (2) Informácie o SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 19 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:

(D) iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: opis umelej sekvencie: syntetická sekvencia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 15:

Met Gly Trp Ser Cys íle íle Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 (2) Informácie o SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 19 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina

-Μ • ·· ······ ·· · ···· ·· · ···· ······ ··· • ··· ··· ···· • · · · · · ··· ··· ·· ·· ·· ·· ··· (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: opis umelej sekvencie: syntetická sekveneia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 16:

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gin Ser 15 10 15

Ala Gin Ala (2) Informácie o SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 348 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: variabilná oblasť ľahkého reťazca humanizovaných protilátok anti-CD23 (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..348 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 17:

gat att gtg atg act cag tet cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48

Asp íle Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

10 15

-48·· « · ··· • · ···· ·· ···· • · · ·· ··

gag ccg gcc tcc atc

tcc Ser

tgt Cys

ege tcg agt aag agt ctc ctg tat Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr

aag Lys

96

Glu Pro Ala Ser

íle

20

25

30

gat

ggg

aag

aca

tac

ttg

aat

tgg

tac

ctg

cag

aag

cca

ggg

cag

tet

144

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

35

40

45

cca

cag

cfcc

ctg

atc

tat

ttg

atg

tcc

acc

cgg

gca

tca

ggg

gtc

cct

192

Pro

Gin

Leu

Leu

íle

Tyr

Leu

Met

Ser

Thr

Arg

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

gac

agg

ttc

agt

ggc

agt

gga

tca

ggc

aca

gat

ttt

aca

ctg

aaa

atc

240

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

íle

65

70

75

80

age

aga

gtg

gag

get

gag

gat

gtt

ggg

gtt

tat

tac

tgt

caa

cag

ctg

288

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Leu

85

90

95

gta

gag

tat

cca

ttc

acg

ttc

ggc

caa

ggg

acc

aag

gtg

gag

atc

aaa

336

Val

Glu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

100 105 110 cgt acg gtg get 348

Arg Thr Val Ala

115 (2) Informácie o SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 1335 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

·· ···· ·· ···· ·· · · · ·· ······ t 4 · • ··· ··· ···· · • ···!»··· ··· ·· ·· ·· «· «··

-49(D) Iné informácie: variabilná oblasť ťažkého reťazca humanizovaných protilátok anti-CD23 (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..1335 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 18:

gag Glu 1

gtg cag ctg

gtg gag tet ggg

gga ggc ttg gta aag ccc ggg ggg

48

Val

Gin Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

tcc

ctt

aga

ctc

tcc

tgt

gca

get

age

gga

ttc

act

ttc

agt

ggc

tac

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

tgg

atg

tcc

tgg

gtc

ege

cag

get

cca

ggg

aag

ggg

ctc

gag

tgg

gtt

144

Trp

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

get

gaa

att

aga

ttg

aaa

tet

gat

aat

tat

gca

aca

cat

tat

gcg

gag

192

Ala

Glu

íle

Arg

Leu

Lys

Ser

Asp

Asn

Tyr

Ala

Thr

His

Tyr

Ala

Glu

50

55

60

tet

gtg

aag

ggg

aaa

ttc

acc

atc

tca

aga

gat

gat

tca

aaa

tet

aga

240

Ser

Val

Lys

Gly

Lys

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

Lys

Ser

Arg

65

70

75

80

ctg

tat

ctg

caa

atg

aac

age

ctg

aaa

acc

gag

gac

aca

gcc

gtg

tat

288

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

85

90

95

tac

tgt

aca

gat

ttc

ata

gac

tgg

ggc

cag

gga

aca

cta

gtc

acc

gtc

336

Tyr

Cys

Thr

Asp

Phe

íle

Asp

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

100

105

110

tcc

tca

gcc

tcc

acc

aag

ggc

cca

tcg

gtc

ttc

ccc

ctg

gca

ccc

tcc

384

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

lis 120

125 ····

-50• ·· • 9 9 9 • 99 • 999

9

999 99

9 9

9 9

9 9

9 9 9

99

9

9

9 9

9

9

tcc aag

agc Ser

acc tct ggg ggc

aca Thr

gcg gcc Ala Ala

ctg Leu

ggc Gly 140

tgc Cys

ctg Leu

gtc Val

aag Lys

432

Ser

Lys 130

Thr

Ser

Gly

Gly 135

gac

tac

ttc

CCC

gaa

ccg

gtg

acg

gtg

tcg

tgg

aac

tca

ggc

gcc

ctg

480

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

145

150

155

160

acc

agc

ggc

gtg

cac

acc

ttc

ccg

get

gtc

cta

cag

tcc

tca

gga

ctc

528

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

165

170

175

tac

tcc

ctc

agc

agc

gtg

gtg

acc

gtg

CCC

tcc

agc

agc

ttg

ggc

acc

576

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

180

185

190

cag

acc

tac

atc

tgc

aac

gtg

aat

cac

aag

CCC

agc

aac

acc

aag

gtg

624

Gin

Thr

Tyr

Zle

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

195

200

295

gac

aag

aaa

gtg

gag

CCC

aaa

tct

tgt

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

672

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

210

215

220

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

ctc

gcg

ggg

gca

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

ttc

720

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Ala

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

225

230

235

240

CCC

cca

aaa

CCC

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

768

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

íle

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

245

250

255

aca

tgc

gtg

gtg

gtg

gac

gtg

agc

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc’

816

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

260

265

270

-51 ···· • ·· ·· ·· · · · · · ··· • 1 · ·«· · · • e·· · · · · · · 9 • ······· *·· ·· ·· ·· ·· ·

aac tgg tac gtg gac

ggc Gly

gtg Val

gag gtg cat aat gcc aag aca aag

ccg Pro

864

Asn

Trp

Tyr Val 275

Asp

Glu 280

Val

His

Asn Ala

Lys Thr 285

Lys

cgg

gag

gag

cag

tac

aac

agc

acg

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

912

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

290

295

300

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

960

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

305

310

315

320

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

gcc

CCC

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

1008

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

íle

Glu

Lys

Thr

íle

Ser

Lys

Ala

325

330

335

aaa

ggg

cag

CCC

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

cgg

1056

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

ser

Arg

340

345

350

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

1104

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

355

360

365

ttc

tat

CCC

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

ccg

1152

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

íle

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

370

375

380

gag

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

CCC

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

1200

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

385

390

395

400

ttc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

cag

1248

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

405 410

415 ·· ·· 4444

-52• 4 ·· · · · · • · · » · r · • 44 4 4 · · é 4

4 · f 4 4 4

ggg aac gtc

ttc tca tgc tcc

gtg atg cat gag get

ctg cac aac cac

1296

Gly

Asn

Val

Phe Ser 420

Cys

Ser

Val

Met 425

His

Glu

Ala

Leu His 430

Asn

His

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tet

ccg

ggt

aaa

tga

1335

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

435

440

(2) Informácie o SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 57 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 19:

gatgaagctt tacagttact cagcacacag gacctcacca tggattttgg gctgatt (2) Informácie o SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 25 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) iné informácie: oligonukleotid

-53• ·· ·· ···· ·· • B · B · · B · B · (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 20:

gatggactag tgtcccttgg cccca (2) Informácie o SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 57 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 21:

gatgaagctt tacagttact cagcacacag gacctcacca tgaggttctc tgttcag (2) Informácie o SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 28 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 22:

gatgcgtacg tytkatytcc avcttkgt • t ·· ···· ·· • · · · ····

-54(2) Informácie o SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 23:

gatcaagctt ctctacagtt actgagcaca 30 (2) Informácie o SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 63 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 24:

aatcaagtat gtcttcccat ccttatacag gagactctta ctcgagcgac aggagatgga 60 „_nr, 63 ggc (2) Informácie o SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 63 párov báz

-54• ·· ·· ···· 99

9 9 99 9 999

999 999 9999 9 • · 9999 99 9 • 99 99 99 99 99 ··· (2) Informácie o SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 23:

gatcaagctt ctctacagtt actgagcaca 30 (2) Informácie o SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 63 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 24:

aatcaagtat gtcttcccat ccttatacag gagactctta ctcgagcgac aggagatgga 60 „„„ 63 ggc (2) Informácie o SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 63 párov báz

-55• ·· • β · · • · · • ··· • · ··· ·· ·· ···· • · · í · · • 6 · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · : t ·· · (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 25:

cgctcgagta agagtctcct gtataaggat gggaagacat acttgaattg gtacctgcag 60 aag 63 (2) Informácie o SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 36 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 26:

tgatgcccgg gtggacatca aatagatcag gagctg (2) Informácie o SEQ ID NO: 27:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 36 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

• ·· ·· • · · · ·	·»·· •	·· • 9	• ·
• ··· · · · • · · · ·· ·· ··	• · • · ··	9 9 9 9 99	··

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 27:

ttgatgtcca cccgggcatc aggggtccct gacagg 36 (2) Informácie o SEQ ID NO: 28:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 84 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 28:

agccacctga cgtttgatct ccaccttggt cccttggccg aacgtgaatg gatactctac 60 cagctgttga cagtaataaa cccc 84 (2) Informácie o SEQ ID NO: 29:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 60 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia

-57• ·· ·· ···· ·· · ···· ·· · · · ·· • · · ··· ··· • ··· ··· ···· · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ··· (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 29:

acacgaagct tcaccatggc ttgggtgtgg accttgctat tcctgatggc ggccgcccaa 60 (2) Informácie o SEQ ID NO: 30:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 66 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 30:

ctttaccaag cctcccccag actccaccag ctgcacctct gcttgggcac tttgggcggc 60 cgccat (2) Informácie o SEQ ID NO: 31:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 60 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 31:

-58ttggtaaagc ccggggggtc ccttagactc tcctgtgcag ctagcggatt cacťttcagt 60 • ·· ·· ···· ·· · ······ ····« ······ e · · • ··· · · · · · · o · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ··· (2) Informácie o SEQ ID NO: 32:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 60 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 32:

ccccttccct ggagcctggc ggacccagga catccagtag ccactgaaag tgaatccgct 60 (2) Informácie o SEQ ID NO: 34:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 60 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvenciaO (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 34:

atcatctctt gagatggtga atttcccctt cacagactcc gcataatgtg ttgcataatt 60 (2) Informácie o SEQ ID NO: 35:

(i) Charakteristika sekvencie:

• ·· • · ·	·· • ·	···· •	·· • ·	··
• ···	• · ·	• ·	• ·
• ·	• ·	• ·	• ·
·· ··	··	··	··	··

(A) Dĺžka: 66 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 35:

atctcaagag atgattcaaa atctagactg tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag 60 gacaca 66 (2) Informácie o SEQ ID NO: 36:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 69 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 36:

ggtgactagt gttccctggc cccagtctat gaaatctgta cagtaataca cggctgtgtc 60 ctcggtttt 69 (2) Informácie o SEQ ID NO: 37:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 48 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina

• ·· • · ·	··	···· •	·· • ·	··
•	•
• ···	• ·	•	• ·	• ·
• · ·· ··	• ··	•	• · ··	• · ··	··

(C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 37:

gctgctcctt ttaagctttg gggtcaaggc tcactagtca cagtctcc 48 (2) Informácie o SEQ ID NO: 38:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 38:

tgacggtgcc cccgcgagtt cagg ₂₄ (2) Informácie o SEQ ID NO: 39:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

• ·· • · ·	·· •	•	···· •	·· • ·	• ·
• ··· ·	•	•	• ·	• ·
• ·	•	•	• ·	• ·
·· ··	··		··	··	··

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 39:

cctgaactcg cgggggcacc gtca (2) Informácie o SEQ ID NO: 40:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 33 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 40:

aagcttccgt cgaattcatt tacccggaga cag 33 (2) Informácie o SEQ ID NO: 41:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 37 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: primér (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 41:

• ·· • · ·	·· •	•	···· •	·· • ·	··
• ··· ·	•	•	• ·	• ·
• · ·· ··	• ··	•	• · ··	• · ··	··

actagtcgac atgaagtttc cttctcaact tctgctc 37 (2) Informácie o SEQ ID NO: 42:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 42:

Thr Lys Leu Glu Xle Lys Arg Thr 1 5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 43:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: syntetická sekvencia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 43:

Thr Lys Val Glu íle Lys Arg Thr

• ·· • · ·	··	9999 9	·· • ·	··
•	•
• ··· ·	•	•	9 9	• ·
• · • · · ·	• • ·	•	9 · ··	• · ··	• ·

(2) Informácie o SEQ ID NO: 44:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: syntetická sekveneia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 44:

Thr Lys Leu Glu íle Arg Arg Thr 1 5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 45:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 8 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: syntetická sekveneia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 45:

Thr Lys Val Glu íle Arg Arg Thr 1 5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 46:

(i) Charakteristika sekvencie:

·· ···· ·· ·· · · ·· · ··· • · · ··· · · • ··· · · · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·

-64(A) Dĺžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 46:

actagtgtcc cttggcccca gtctatgaaa tctgtacagt aataaactcc actgtcttca 60 gctcttaagc tgttcatttg caggtagaga cgacttttgg aatcatctct tgagatggtg 120 aacttccctt tcacagactc cgcataatgt gttgcataat tatcagattt caatctaatt 180 tcagcaaccc actcaagccc cttctctgga gactggcgga cccaagacat ccagtagcca 240 ctgaaagtaa atccagaggc tacacaggag agtttcatgg atcctccagg ttgcaccaag 300 cctcctccag actcctcaag cttcacttca ctctggaccc cttttaaaag aacaataaaa 360 aaaatcagcc caaaatccat ggtgaggtcc tgtgtgctga gtaactgtaa agctt 415 (2) Informácie o SEQ ID NO: 47:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 437 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 47:

cgtacgtttt atttccaact ttgtccccga gccgaacgtg aatggatact ctacaagttg 60 ttgacagtaa tacacaccca catcctcagc cttcactcta ctgatttcca gggtgaaatc 120 tgtgcctgac ccactgccac taaaccggtc tgagactcct gatgcacggg tggacatcaa 180 atacatcagg agctgaggag attgtcctgg tctctgcaga aaccaattca agtatgtctt 240 cccatcctta tacaggagac tcttactaga cctgcaggag atggaaactg attctccaga 300 agtgacagga ttggagagtt catcctgggt tatcacaata tccccactga ctccagagat 360 ccagaacata agcaccccca gaaactgaac agagaacctc atggtgaggt ectgtgtgct 420 gagtaactgt aaagctt

437 ·· ····

-65·· ·· ···· • · · · · • · · · · ·· · · · · • · · · · ·· ·· ·· (2) Informácie o SEQ ID NO: 48:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 348 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: variabilná oblasť ľahkého reťazca humanizovaných protilátok anti-CD23 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 48:

agccaccgta cagctgttga aaaatctgtg catcaaatag tgtcttccca tccaggggtg cgtttgatct cagi. aataaa cctgatccac atcaggagct tccttataca acgggcaggg ccaccttggt ccccaacatc tgccactgaa gtggagactg ggagactctt agagtggaga cccttggccg ctcagcctcc cctgtcaggg ccctggcttc actcgagcga ctgagtcatc aacgtgaatg actctgctga acccctgatg tgcaggtacc caggagatgg acaatatc gatactctac 60 ttttcagtgt 120 cccgggtgga 180 aattcaagta 240 aggccggctc 300

348 (2) Informácie o SEQ ID NO: 49:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 1335 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: variabilná oblasť ťažkého reťazca humanizovaných protilátok anti-CD23

-66• ·· ·· ···· ·· ···· · · · · · · ··· ··· ·· • ··· · · · · · · · • ······· ··· ·· ·· ·· ·· · (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 49:

tcatttaccc	ggagacaggg	agaggctctt	ctgcgtgtag	tggttgtgca	gagcctcatg	60
catcacggag	catgagaaga	cgttcccctg	ctgccacctg	ctcttgtcca	cggtgagctt	120
gctgtagagg	aagaaggagc	cgtcggagtc	cagcacggga	ggcgtggtct	tgtagttgtt	180
ctccggctgc	ccattgctct	cccactccac	ggcgatgtcg	ctgggataga	agcctttgac	240
caggcaggtc	aggctgacct	ggttcttggt	cagctcatcc	cgggatgggg	gcagggtgta	300
cacctgtggt	tctcggggct	gccctttggc	tttggagatg	gttttctcga	tgggggctgg	360
gagggctttg	ttggagacct	tgcacttgta	ctccttgcca	ttcagccagt	cctggtgcag	420
gacggtgagg	acgctgacca	cacggtacgt	gctgttgtac	tgctcctccc	gcggctttgt	480
cttggcatta	tgcacctcca	cgccgtccac	gtaccagttg	aacttgacct	cagggtcttc	540
gtggctcacg	tccaccacca	cgcatgtgac	ctcaggggtc	cgggagatca	tgagggtgtc	600
cttgggtttt	ggggggaaga	ggaagactga	cggtgccccc	gcgagttcag	gtgctgggca	660
cggtgggcat	gtgtgagttt	tgtcacaaga	tttgggctcc	actttcttgt	ccaccttggt	720
gttgctgggc	ttgtgattca	cgttgcagat	gtaggtctgg	gtgcccaagc	tgctggaggg	780
cacggtcacc	acgctgctga	gggagtagag	tcctgaggac	tgtaggacag	ccgggaaggt	840
gtgcacgccg	ctggtcaggg	cgcctgagtt	ccacgacacc	gtcaccggtt	cggggaagta	900
gtccttgacc	aggcagccca	gggecgctgt	gcccccagag	gtgctcttgg	aggagggtgc	960
cagggggaag	accgatgggc	ccttggtgga	ggctgaggag	acggtgacta	gtgttccctg	1020
gccccagtct	atgaaatctg	tacagtaata	cacggctgtg	tcctcggttt	tcaggctgtt	1080
catttgcaga	tacagtctag	attttgaatc	atctcttgag	atggtgaatt	tccccttcac	1140
agactccgca	taatgtgttg	cataattatc	agatttcaat	ctaatttcag	caacccactc	1200
gagccccttc	cctggagcct	ggcggaccca	ggacatccag	tagccactga	aagtgaatcc	1260
gctagctgca	caggagagtc	taagggaccc	cccgggcttt	accaagcctc	ccgcagactc	1320
caccagctgc	acctc					1335

(2) Informácie o SEQ ID NO: 50:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 137 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 50:

·· ···· • · • 9

Ala 1 Íle

Leu Gin Leu Leu Ser Thr Gin Asp Leu Thr Met Asp Phe Gly Leu

Phe

Phe

Zle 20

5 Val

10

15 Lys Leu

Leu

Leu

Lys

Gly 25

Val

Gin

Ser Glu

Val 30

•

Glu

Glu

Ser

Gly

Gly Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

Gly

Ser

Met

Lys

Leu

35

40

45

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

Trp

Met

Ser

Trp

50

55

60

Val

Arg

Gin

Ser

Pro

Glu

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Glu

Zle

Arg

65

70

75

80

Leu

Lys

Ser

Asp

Asn

Tyr

Ala

Thr

His

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

85

90

95

Lys

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

Lys

Ser

Arg

Leu

Tyr

Leu

Gin

100

105

110

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Ser

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Asp

115 120 125

Phe íle Asp Trp Gly Gin Gly Thr Leu 130 135 (2) Informácie o SEQ ID NO: 51:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 145 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 51:

Ala Leu Gin Leu Leu Ser Thr Gin Asp Leu Thr Met Arg Phe Ser Val • ·· 44 44·· ·· ·· · · · 4 4 ··· • · · ··· ·· • ··· · 4 4 · · 4 · • · ···· ·· ··· ·· 44 44 «· ·

-68Gln Phe Leu Gly Val Leu Met Phe Trp íle Ser Gly Val Ser Gly Asp 20 25 30 íle Val íle Thr Gin Asp Glu Leu Ser Asn Pro Val Thr Ser Gly Glu

40 45

Pro Gin Leu Leu íle Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro

55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys íle

70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu

90 95

Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys 100 105 no

Arg Thr Val Ala

115 (2) Informácie o SEQ ID NO: 53:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 444 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:

(D) Topológia:

(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:

(D) Iné informácie: opis umelej sekvencie: variabilná oblasť ťažkého reťazca humanizovaných protilátok anti-CD23 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 53:

• · · ·· • · • I ·· ···!

• fl • · • · · · · » · · fl ·· ··

69Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Glu íle Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60

Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr íle Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr. Ala Val Tyr

90 95

Tyr Cys Thr Asp Phe íle Asp Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190

Gin Thr Tyr íle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 ·· ····

-70• ·· ·· · · • · · • ··· • · ··· ·· • · · · • · · · • · · · · • · · · · · ··

Asp Lys Lys Val Glu 210

Pro Cys Pro Ala Pro 225

Pro Pro Lys Pro Lys 245

Thr Cys Val Val Val 260

Asn Trp Tyr Val Asp 275

Arg Glu Glu Gin Tyr 290

Val Leu His Gin Asp 305

Ser Asn Lys Ala Leu 325

Lys Gly Gin Pro Arg 340

Asp Glu Leu Thr Lys 355

Phe Tyr Pro Ser Asp 370

Pro Lys Ser cys Asp Lys 215

Glu Leu Ala Gly Ala Pro 230 235

Asp Thr Leu Het íle Ser 250

Asp Val Ser His Glu Asp 265

Gly Val Glu Val His Asn 280

Asn Ser Thr Tyr Arg Val 295

Trp Leu Asn Gly Lys Glu 310 315

Pro Ala Pro íle Glu Lys 330

Glu Pro Gin Val Tyr Thr 345

Asn Gin Val Ser Leu Thr 360 íle Ala Val Glu Trp Glu 375

Thr His Thr Cys Pro 220

Ser Val Phe Leu Phe 240

Arg Thr Pro Glu Val 255

Pro Glu Val Lys Phe 270

Ala Lys Thr Lys Pro 285

Val Ser Val Leu Thr 300

Tyr Lys Cys Lys Val 320

Thr íle Ser Lys Ala 335

Leu Pro Pro Ser Arg 350

Cys Leu Val Lys Gly

365

Ser Asn Gly Gin Pro 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin

405 410 415 ·· ···· ·· • · ··· · · • · • ·· fl • · · 4 • · · · 4 • · · 14 » ·· ··

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 ·· ···*

Claims (14)

1. Protilátky, ktoré obsahujú dostatočnú časť aminokyselinovej sekvencie každej CDR uvedenej ďalej tak, že protilátky sú schopné viazať sa na molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanú na krvotvorných bunkách:

RSSKSLLY KDGKTYLN CDRL1 (SEQ ID NO: 3

LMSTRAS...... CDRL2 (SEQ ID NO: 5)

QQLVEYPFT CDRL3 (SEQ ID NO: 7)

GYWMS.... CDRH1 (SEQ ID NO: 9)

EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2 (SEQ ID NO: 11)

FID...... CDRH3 (SEQ ID NO: 13)

2. Protilátky, ktoré sa viažu na molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanú na krvotvorných bunkách alebo na rozpustný CD23, charakterizované afinitnou konštantou, ktorej hodnota je rovná alebo vyššia ako 1x10⁹ Ka.moľ¹.

3. Protilátky, ktoré kompetitívne inhibujú naviazanie protilátok, ktoré majú sekvencie CDR uvedené v nároku 1, na molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanú na krvotvorných bunkách.

4. Protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktoré sú zmenené protilátky.

5. Protilátky podľa nároku 4, ktoré sú humanizované protilátky.

6. Protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde kostra ťažkého reťazca zahrnuje aminokyselinové zvyšky z myších protilátok v ľubovoľnej z polôh 49, 66, 76, 77 a 94.

7. Protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde kostra ľahkého reťazca zahrnuje aminokyselinové zvyšky myších protilátok v polohe 64.

-738. Protilátky obsahujúce jednu alebo dve aminokyselinové sekvencie podľa

SEQ ID NO: 1 a 2.

·· ···· ·· · · • · · • ··· · • · ··· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · · ·· ·

9. Protilátky obsahujúce jednu alebo dve aminokyselinové sekvencie podľa SEQ ID NO: 17 a 18.

10. Protilátky podľa ktoréhokoľvek z predchádzjúcich nárokov, kde konštantná oblasť obsahuje Ala v polohe 235 a Ala v polohe 237 podľa systému číslovania podľa Kabata.

11. Protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, na použitie na liečenie ľudí.

12. Použitie protilátok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 na výrobu lieku na liečenie porúch vybraných zo skupiny zahrnujúcej artritídu, lupus erythematosus, Hashimotovu tyreoiditídu, roztrúsenú sklerózu, cukrovku, uveitídu, dermatitídu, lupienku, žihľavku, nefrotický syndróm, glomerulonefritídu, zápalové ochorenie čriev, ulceratívnu kolitídu, Crohnovu chorobu, Sjogrenov syndróm, alergiu, alergickú astmu, intrinsickú astmu, akútnu astmatickú exacerbáciu, rinitídu, ekzém, GVH, COPD, inzulitídu, bronchitídu, najmä chronickú bronchitídu alebo cukrovku, najmä cukrovku typu I a maligné nádory B-buniek.

13. Použitie protilátok, ktoré sa viažu na molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanú na krvotvorných bunkách na výrobu lieku na blokovanie tvorby rozpustného CD23.

14. Použitie protilátok podľa nároku 13, kde protilátkou je protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10.

15. Sekveneia DNA kódujúca reťazec protilátok, ktorý obsahuje jednu alebo viac sekvencii podľa: