SK16762000A3 - Protilátky proti cd23, farmaceutický prostriedok s ich obsahom, sekvencie dna kódujúce reťazec protilátok a použitie protilátok - Google Patents
Protilátky proti cd23, farmaceutický prostriedok s ich obsahom, sekvencie dna kódujúce reťazec protilátok a použitie protilátok Download PDFInfo
- Publication number
- SK16762000A3 SK16762000A3 SK1676-2000A SK16762000A SK16762000A3 SK 16762000 A3 SK16762000 A3 SK 16762000A3 SK 16762000 A SK16762000 A SK 16762000A SK 16762000 A3 SK16762000 A3 SK 16762000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- antibodies
- seq
- ser
- sequence
- type
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Protilátky proti CD23, farmaceutický prostriedok s ich obsahom, sekvencie DNA kódujúce reťazec protilátok a použitie protilátok
Oblasť techniky
Vynález sa týka protilátok, ktoré sa viažu na molekulu CD23 (FCeRII) typ II, ich obzvlášť upravené formy, prípravy takých protilátok, farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú uvedené protilátky a ich použitia pri terapii.
Doterajší stav techniky
CD23 (FCeRII) je molekula typu II a patrí do rodiny C-lektínov. Táto rodina tiež zahrnuje receptor pre lymfocyty (MEL-14) a molekulu 1 adhézie endoteliálnych leukocytov (ELAM-1). Je to receptor vhodný pre IgE s nízkou afinitou. V prípade človeka mnoho krvotvorných typov buniek exprimuje na svojom povrchu molekuly CD23. Tieto bunky zahrnujú folikulárne dendritické bunky, B bunky, T bunky a makrofágy. Molekuly CD23 sa tiež nachádzajú v rozpustných formách v biologických tekutinách. Rozpustné molekuly CD23 (sCD23) vznikajú proteolytickým štiepením transmembránových receptorov. Molekula CD23 vykazuje pleiotropné účinky, ktoré zahrnujú sprostredkovanie adhézie buniek, reguláciu IgE a uvoľnenie histamínu, záchranu B buniek pred apoptózou a reguláciu rastu myeloidných buniek. Tieto funkčné aktivity prebiehajú prostredníctvom naviazania špecifických ligandov buniek spojených sCD23 alebo sCD23, neskôr pôsobia spôsobom podobným ako cytokíny (opisuje sa v publikácii Conrad, D. H., Annu Rev. Immunol. 8, 623 až 645 (1990), Delespesse, G. a ďalší, Adv. Immunol. 49. 149 až 191 (1991), Bonnefoy, J. Y., a ďalší, Curr. Opin. Immunol. 5, 944 až 47 (1993)).
V mnohých ďalších zápalových bunkách sa sledovala zvýšená expresia CD23. Molekuly CD23 sa tiež nachádzajú v synoviáinych biopsiách získaných od pacientov s chronickou synovitídou a tiež sCD23 sa tu nachádza v koncentráciách, ktoré presahujú normálny rozsah séra a synoviáinych tekutín pacientov s reumatoidnou artritídou (opisuje sa v publikácii Bansal, A. S., Oliver, W. Marsh, M.
N., Pumphrey, R. S., a Wilson P. B„ Immunology 79, 285 až 289 (1993), Helien E.
-2• *0 ·· ···· ·· ···· · · · ·00 • *0000 · 000 0 • 0 0*0* 0· *00 00 00 ·· ·· ·
A., Rowlands, D. C., Hansel, T. T., Kitas, G. D., a Crocker, J. J., Clin. Pathol. 44,
293 až 296 (1991), Chomarat, P., Brioloay, J., Bancherau, J., a Miossec, P., Arthritis Rheum. 86, 234 až 242 (1993), Baansal, A., a ďalší., Clin. Exp. Immunol. 89, 452 až 455 (1992), Rezonzew, R., a Newkirk, M. N., Clin. Immunol Immuopathol., 71, 156 až 163 (1994)). Množstvo sérového sCD23 u pacientov s reumatoidnou artritídou sa vzťahuje ku štatútu ochorenia a koreluje so sérovým reumatoidným faktorom (opisuje sa v publikácii Bansal, A. S. a ďalší, Clin. Exp. Reumathol., 12, 281 až 285 (1994). Pro-zápalové cytokíny sú obzvlášť dôležité pri rematoidnej artritíde a ústrednú úlohu majú v prípade TNF-a alL-1b pri poškodení artritických kĺbov (opisuje sa v publikácii Brennan, F. M., Chantry, D., Jackson, A., Maini, R., a Feldman, M., , Lancet 2, 244 až 247 (1989), Brennan, F. M., Maini, R. M., a Feldman M., Br. J. Reumathol 31, 293 až 298 (1992)).
Protilátky v typickom prípade obsahujú dva ťažké reťazce, ktoré sú spolu spojené disulfidovými väzbami a dva ľahké reťazce. Každý ľahký reťazec je spojený s určitým ťažkým reťazcom disulfidovou väzbou. Každý ťažký reťazec má na jednom konci variabilnú oblasť, po ktorej nasleduje určitý počet konštantných oblastí. Každý ľahký reťazec obsahuje na jednom konci variabilnú oblasť a na druhom konci konštantnú oblasť. Variabilná oblasť ľahkého reťazca je spojená s variabilnou oblasťou ťažkého reťazca. Konštantná oblasť ľahkého reťazca ja spojená s prvou konštantnou oblasťou ťažkého reťazca. Konštantné oblasti ľahkých a ťažkých reťazcov sa priamo nepodieľajú na naviazanie protilátok na antigén.
Variabilné oblasti každého páru ľahkého a ťažkého reťazca tvorí väzobné miesto pre antigén. Oblasti ľahkého a ťažkého reťazca vykazujú rovnakú všeobecnú štruktúru a každá oblasť obsahuje kostru štyroch oblastí, ktorých sekvencie sú relatívne konzervatívne a sú spojené tromi oblasťami, ktorí určujú komplementaritu (CDR). Štyri oblasti kostry tvoria usporiadanie beta-listu a CDR tvorí slučky, ktoré sú spojené a v niektorých prípadoch tvoria časť štruktúry beta-listu. CDR sa nachádzajú v blízkosti základných oblastí a spolu s CDR, ktoré pochádzajú z inej oblasti, sa podieľajú na vytvorení väzobného miesta pre antigén. CDR a oblasti kostry protilátok sa môžu stanoviť na základe publikácie Kabat a ďalší, „Sequences of proteins of immunological interest“ US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).
-3·· ·· ···· • · · · · • ··· · · · · • · · · · · ··· ·· ·· ··
Príprava upravených protilátok, ktorých variabilná oblasť protilátok hlodavcov sa kombinuje s konštantou oblasťou ľudských protilátok je dobre známa v danej oblasti techniky (publikácia Oi a Morrison (1986) Biotechniques 4, 214 až 212). Protilátky vhodné pre človeka, v ktorých sa CDR získali zo zdroja odlišného od zdroja kostry variabilných oblastí protilátok, sa opisujú v publikácii EP-A-0239400. CDR sa môžu získať s monoklonálnych protilátok hlodavcov alebo primátov, i Základná kostra variabilných oblastí a konštantných oblastí protilátok sa zvyčajne získa z ľudských protilátok. Takto upravené protilátky by nemali vyvolať tak veľkú imunitnú odozvu, keď sa aplikujú človeku v porovnaní s imunitnou odozvou u človeka, ktorá vzniká proti celým cudzorodným protilátkam, ako sú protilátky získané z hlodavcov.
Myšie monoklonálne protilátky vznikli proti receptoru CD23 (FCeRII) PCT/EP/95/04109). Takéto monoklonálne protilátky nie sú však ideálne na použitie na liečenie ľudí, pretože sú potencionálne immunogénne, keď sa aplikujú človeku injekciou a môžu byť lytické. Ďalej bežne dostupné protilátky, ktoré sa viažu na receptor CD23 rozoznávajú odlišné epitopy, ktoré sa exprimujú na receptore CD23. Špecificita naviazania na epitop môže hrať podstatnú časť účinnosti protilátok pre určitý účel. Výber protilátok s vysokou afinitou v prípade cieľového receptora môže byť terapeuticky výhodný, pretože požadovaná dávka bude nižšia ako v prípade monoklonálnych protilátok, ktoré vykazujú nižšiu afinitu v prípade rovnakého receptora.
Podstata vynálezu k
Podstatou vynálezu sú protilátky, ktoré obsahujú podstatnú aminokyselinovú sekvenciu každého CDR, ktorá je uvedená ďalej v texte. Uvedené protilátky sú schopné viazať molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanú na povrchu krvotvorných buniek:
ľahký reťazec
RSSKSLLY KDGKTYLN CDRĽ1 (SEQ ID NO: 3)
• 44 | 44 | 4444 | 44 | ||
·· · · | • | 4 | 4 | • | 4 4 |
• ··· · • 4 ··· 44 | • • • 4 | 4 • | 4 4 4 4· | 4 4 4 44 | 4 4 4 |
LMSTRAS......
QQLVEYPFT ťažký reťazec GYWMS....
CDRL2 (SEQ ID NO: 5)
CDRL3 (SEQ ID NO: 7)
CDRH1 (SEQ ID NO: 9)
EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2 (SEQ ID NO: 11)
FID...... CDRH3 (SEQ ID NO: 13)
Vynález ďalej opisuje protilátky, ktoré sa viažu na rovnaký epitop ako protilátky, ktoré majú CDR opísaný vyššie v texte. Testy kompetitívnej inhibície sa použili na mapovanie epitopov na antigéne, ako je molekula CD23. Kompetitívna analýza FACS zahrnuje použitie buniek, ktoré exprimujú molekulu ako cieľ. Testované protilátky sa značia jedným fluórchrómom a sekundárne protilátky, ktoré sa viažu sa rovnaký antigén, sa značia druhým odlišne zafarbeným fluórchrómom. Ak sú prítomné oba fluórchrómy, potom protilátky nevykazujú vzájomnú kompetitívnu inhibíciu a preto sa domnievame, že rozoznávajú na cieľovej molekule odlišné epitopy. Mapovanie epitopu je možné tiež uskutočniť za použitia priamych testov naviazania peptidovej knižnice, kde sa exprimujú peptidové sekvencie z cieľového antigénu a testujú sa za použitia protilátok značených fluórchrómom, ako sa uvádza vyššie v teste. Pri štúdiách mapovania epitopu sa ukázalo, že použitím protilátok je možné definovať nový epitop na molekule CD23. Vynález preto opisuje protilátky, ktoré kompetitívne inhibujú naviazanie protilátok, ktoré majú sekvencie CDR uvedené vyššie v texte, na molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovaných na krvotvorných bunkách.
Výhodnými protilátkami podľa vynálezu sú upravené protilátky. Môžu to byť chimerické protilátky, ktoré obsahujú dostatočnú časť variabilných sekvencii ťažkého a ľahkého reťazca myších protilátok C11 uvedených na obrázku č. 1 a 2 (SEQ ID NO: 1 a 2 a SEQ ID NO: 46, 47, 50, 51), ktoré sú schopné viazať sa na molekulu CD23 a ľudskú konštantnú oblasť. Protilátky môžu byť chimerické protilátky typu, ktorý sa opisuje v publikácii WO 86/01533, a ktoré obsahujú oblasť viažucu antigén a oblasť, ktorá nepochádza z imunoglobulínu. Oblasť viažuca antigén je variabilná oblasť ľahkého reťazca protilátok a/alebo variabilná oblasť
-5• ·· ·· ···· ·· ···· · · · ··· ··« · · ·· • ··· · · · · · · · • 9 ···· ·· «·· ·· · ·· ·· · ťažkého reťazca. V typickom prípade chimerické protilátky obsahujú variabilnú oblasť ľahkého i ťažkého reťazca. Oblasť, ktorá nepochádza z imunoglobulínu sa fúzuje s C-koncom oblasti viažucej antigén. Oblasť, ktorá nepochádza z imunoglobulínu je v typickom prípade neimunoglobuiínový proteín a môže to byť oblasť enzýmu získaná z proteínu, ktorý vykazuje známu väzobnú špecificitu, alebo z proteínového toxínu alebo z ľubovoľného proteínu exprimovaného génom. V neimunoglobulínovej oblasti sa môže nachádzať sacharidová oblasť. Dve oblasti chimerických protilátok sa môžu spojiť cez štiepiteľnú linkerovú sekvenciu. Upravené protilátky môžu tiež byť bišpecifické protilátky.
Upravené protilátky môžu byť humanizované protilátky, v ktorých dostatočná časť jednej alebo viacerých aminokyselinových sekvencií každej CDR (a ak sú nutné zvyšky kostry) sú prítomné na kostre ľudských protilátok tak, že je schopná viazať molekulu CD23.
Je vhodné, aby CDR protilátok podľa vynálezu boli CDR L1 a L3 ľahkého reťazca a CDR H1 a H3 ťažkého reťazca, ako sa uvádza hore v texte. Aminokyselinové sekvencie týchto CDR sa však môžu zmeniť. Aminokyselinové sekvencia každého CDR sa môže zmeniť substitúciou, začlenením a/alebo deléciou aminokyselín.
Každé CDR môže preto zahrnovať substitúcie, inzercie a/alebo delécie jednej alebo dvoch aminokyselín. V ľahkom reťazci CDRL3 alebo v ťažkom reťazci CDRH3 môžu existovať substitúcie, inzercie a/alebo delécie až troch aminokyselín. V ľahkom reťazci CDRL1 sa môžu vyskytovať až štyri substitúcie, inzercie a/alebo delécie aminokyselín. V ťažkom reťazci CDRH2 môže byť prítomných až šesť substitúcií, inzercií a/alebo delécií aminokyselín. Je výhodné, aby aminokyselinová sekvencia každého CDR bola v podstate homológna so sekvenciou každého CDR, ako sa uvádza vyššie v texte.
Je výhodné, aby stupeň zhody sekvencie bol aspoň 50 %. Výhodnejšie je, aby stupeň zhody sekvencie bol aspoň 75 %. Najvýhodnejšie je, aby stupeň zhody sekvencie bol aspoň 95 %.
Je výhodné, že nie je nutné, aby stupeň zhody sekvencií bol vysoký, pretože rôzne aminokyseliny sa môžu často substituovať inými aminokyselinami, ktoré majú podobné vlastnosti, bez toho aby sa podstatne menili alebo negatívne ovplyvňovali
-6·· ·· ···· ··· · · · • · · · ·· ·· ·· ·· · isté vlastnosti proteínu. Tieto zmeny sa často nazývajú konzervatívne zmeny aminokyselín. Tak aminokyseliny glycín, valín, leucín alebo izoleucín sa môžu často vzájomne substituovať. Iné aminokyseliny, ktoré je možné často substituovať zahrnujú: fenylalanín, tyrozín a tryptofán (aminokyseliny, ktoré majú aromatické bočné reťazce), lyzin, arginín a histidín (aminokyseliny, ktoré majú bázický bočný reťazec), aspartát a glutamát (aminokyseliny, ktoré majú kyslý bočný reťazec), asparagín a glutamín (aminokyseliny, ktoré majú amidový bočný reťazec) a cysteín a metionín (aminokyseliny, ktoré majú bočný reťazec obsahujúci síru). Termín derivát môže tiež zahrnovať variantu aminokyselinovej sekvencie, ktorá obsahuje jedno alebo viac konzervatívnych” zmien vzťahujúcich sa k uvedenej sekvencii.
Kostru a konštantnú oblasť protilátok tvorí prednostne kostra a konštantné oblasti ľudských protilátok. Je výhodné, aby kostra variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátok bola v podstate homologná so zodpovedajúcou kostrou ľudského proteínu KOL (opisuje sa v publikácii Schmidt a ďalší, Hoppe-Seyper's Z. Physiol. Chem., 364, 713 až 747, 1983). Homológia s ohľadom na kostru je vo všeobecnom prípade 80 % alebo viac s ohľadom na KOL. Je to napríklad 90 % alebo viac alebo 95 % alebo viac. Ďalej je výhodné, aby siedmy zvyšok kostry 4 v KOL bol Thr alebo Leu, pričom výhodne je Leu. Tento zvyšok je zvyšok 109 (opisuje sa v publikácii Kabat a ďalší, Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987). Existuje tu mnoho substitúcií, inzercií a/alebo delécií aminokyselín. Napríklad je možné zmeniť jeden alebo viac zvyškov v polohách 49, 66, 76, 77 a 94, aby sa získal ekvivalentný zvyšok v myších protilátkach. Inými kandidátmi zmien na kostre, ktoré sa môžu uskutočniť, aby sa obnovilo naviazanie, sú aminokyselinové zvyšky 27, 30, 48, 67, 71, 91 a 93. Aminokyseliny sa číslujú spôsobom, ktorý sa opisuje v publikácii Kabat a ďalší, Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).
Kostra variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátok je v typickom prípade podstatne homologná s variabilnou oblasťou kostry proteínu HSIGKVII (databáza EMBL: Klobeck, H. G., knižnica dát podaná 7.4.1986). Existuje tu posun tejto sekvencie do polohy 452. Aby sa rektifikoval čítací rámec, uskutočnila sa defécia bázy 452 (T).
-7·· · · • · · • ·· · • · ··· ·· ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· • · ·· ·
Homológia s ohľadom na kostru je vo všeobecnom prípade 80 % alebo viac s ohľadom na vybranú sekvenciu. Výhodne je homológia 90 % alebo viac alebo 95 % alebo viac. Mnoho substitúcií, inzercií a/alebo delécií aminokyselín sa môže vyskytovať v aminokyselinovom zvyšku 64, ale tiež alebo namiesto zvyšku 71 podľa číslovania, ktoré sa opisuje v publikácii Kabat a ďalší, Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).
Vynález ďalej opisuje protilátky, ktoré obsahujú variabilnú sekvenciu ťažkého a ľahkého reťazca uvedené na obrázku č. 3 a 4 (SEQ ID NO: 17 a 18).
Protilátky výhodne vykazujú štruktúru prirodzených protilátok alebo jeho fragment. Protilátky preto môžu obsahovať celé protilátky, fragment (Fab')2, fragment Fab, dimér ľahkého reťazca alebo dimér ťažkého reťazca. Protilátky môžu byť IgG, ako je lgG1, lgG2, lgG3 alebo lgG4 alebo IgM, IgA, IgE alebo IgD alebo ich upravená varianta. Konštantná oblasť ťažkého reťazca protilátok sa môže vybrať podobným spôsobom. Konštantná oblasť ľahkého reťazca môžu byť oblasť kapa alebo lambda.
Konštantná oblasť sa vybrala podľa požadovanej funkčnosti. V normálnom prípade lgG1 bude demonštrovať lytickú schopnosť prostredníctvom naviazania na komplement a bude sprostredkovávať ADCC (bunkovú cytotoxicitu závislú na protilátkach). Ak sú nutné necytotoxické blokačné protilátky, výhodné sú lgG4. Protilátky lgG4 môžu demonštrovať nestabilitu pri produkcii a preto je výhodná úprava vo všeobecnom prípade viac stabilných lgG1. Naznačené úpravy sa opisujú v publikácii EP0307434, ktoré sú v polohách 235 a 237. Vynález ďalej opisuje lytickú alebo nelytickú formu protilátok podľa vynálezu.
Každý reťazec protilátok je možné pripraviť náhradou CDR. CDR variabilné oblasti ľahkého a ťažkého reťazca ľudských protilátok sa nahradia dostatočnou časťou aminokyselinovej sekvencie každého CDR anti-CD23 protilátok, kedy sú výsledné protilátky schopné viazať sa na molekulu CD23. Oblasti DNA kódujúce CDR, ktoré kódujú hypervariabilnú oblasť reťazca ľudských protilátok, sa nahradili DNA kódujúcou požadovaný CDR. Ak je to vhodné, táto zmenená DNA sa viaže na DNA kódujúcu konštantnú oblasť protilátkového reťazca. DNA sa klonovala do expresného vektora. Expresný vektor sa zaviedol do kompatibilnej hostiteľskej • ·· ·· 4444 ··
4 4 4 4 · · • 444 · · · · · · · « 4 4 · · · · ·
444 44 44 44 44
-8bunky, ktorá sa kultivovala za takých podmienok, aby sa exprimoval reťaz protilátok. Reťazce komplementárnych protilátok, ktoré sa spoločne exprimujú týmto spôsobom môžu potom tvoriť humanizované protilátky.
Humanizácia monoklonálnych protilátok zahrnuje štyri kroky. Sú to:
1) stanovenie nukleotidovej a predpokladanej aminokyselinovej sekveneie počiatočných variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca protilátok,
2) navrhnutie humanizovaných protilátok, to znamená rozhodnúť, ktorá oblasť kostry protilátok sa použije počas procesu humanizácie,
3) metóda/technika skutočnej humanizácie,
4) transfekcia a expresia humanizovaných protilátok.
Vynález opisuje sekvenciu DNA, ktorá kóduje reťazec protilátok obsahujúci jednu alebo viac sekvencií podľa:
páry báz CDRL1 číslo 70 až 117, zobrazené na obrázku č. 3 (SEQ ID NO:4) páry báz CDRL2 číslo 163 až 183, zobrazené na obrázku č. 3 (SEQ ID NO:6) páry báz CDRL3 číslo 280 až 306, zobrazené na obrázku č. 3 (SEQ ID NO:8) páry báz CDRH1 číslo 91 až 105, zobrazené na obrázku č. 4 (SEQ ID NO: 10) páry báz CDRH2 číslo 148 až 204, zobrazené na obrázku č. 4 (SEQ ID NO: 12) páry báz CDRH3 číslo 301 až 309, zobrazené na obrázku č. 4 (SEQ ID NO: 14) alebo sekvencia DNA kódujúca reťazec protilátok, ktorý obsahuje jednu alebo obidve sekveneie podľa obrázku č. 3 alebo 4 (SEQ ID NO: 17 alebo 18 a SEQ ID NO: 48 a 49).
Krok 1
Stanovenie nukleotidovej a predpovedanej aminokyselinovej sekveneie variabilných oblastí ľahkého a ťažkého reťazca protilátok
Aby sa mohli protilátky humanizovať, je nutné poznať aminokyselinovú sekvenciu variabilných oblastí ťažkého alebo ľahkého reťazca protilátok. Sekvencia konštantných oblastí je irelevantná, pretože neprospieva k stratégii obnovenia. Najjednoduchšia metóda stanovenia aminokyselinovej sekveneie variabilnej oblasti
-9• · ·· · · · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ·· ·· ···· ·· • · · · • · · · • · · · ·· ·· · protilátok pochádza z klonovanej eDNA kódujúcej variabilnú oblasť ťažkého a ľahkého reťazca.
Existujú dve všeobecné metódy klonovania eDNA variabilnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca: 1) prostredníctvom konvenčnej knižnice eDNA alebo 2) prostredníctvom polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR). Obidve tieto metódy sú známe v širokom rozsahu. Ak je daná nukleotidová sekvencia eDNA, je to jednoduchý spôsob ako preložiť túto informáciu do predpovedanej aminokyselinovej sekvencie variabilných oblastí protilátok. V tomto prípade nukleotidová sekvencia a predpovedaná aminokyselinová sekvencia reťazca protilátok C11 hlodavcov sú zobrazené na obrázku č. 1 a 2 (SEQ ID NO: 1 (ťažký reťazec) a 2 (ľahký reťazec) a SEQ ID NO: 45 a 47).
Krok 2
Navrhovanie humanizovaných protilátok
Existuje niekoľko faktorov, ktoré sa zvažujú pri rozhodovaní, ktorú sekvenciu použiť v prípade humanizácie. Humanizácia ľahkého a ťažkého reťazca sa zvažuje nezávisle na sebe, ale uvažovanie je v zásade podobné.
Tento spôsob výberu je založený na nasledujúcej úvahe: daná antigénová špecificita a afinita je primárne určená aminokyselinovou sekvenciou variabilnej oblasti CDR. Základné zvyšky variabilnej oblasti prispievajú iba málo alebo vôbec. Primárne funkcie základných oblastí je udržovať CDR v jeho správnej priestorovej orientácii, aby rozoznal antigén. Potom substitúcia CDR hlodavcov do variabilnej oblasti kostry ľudských protilátok je vysoko homologná s variabilnými oblasťami hlodavcov, z ktorých pochádzajú. Prednostne je možné vybrať ľudskú variabilnú oblasť, pretože je vysoko homologická s variabilnými oblasťami hlodavcov.
Vhodná sekvencia variabilnej oblasti ľudských protilátok sa môže vybrať nasledujúcim spôsobom:
1) Za použitia počítačového programu sa skúmajú všetky dostupné databázy proteínov (a DNA), aby sa zistili sekvencie variabilných oblastí ľudských protilátok, ktoré sú najviac homologické s variabilnými oblasťami protilátok hlodavcov. Výstup vhodného programu je zoznam sekveneii, ktoré sú najviac homologické s ·· ····
-10• «· «· · · • ··· • · ·· · ·· • · · • · · · ·· ·· • · ·· · protilátkami hlodavcov, percento homológie s každou sekvenciou a usporiadanie každej sekvencie so sekvenciou hlodavca. To sa uskutočňuje nezávisle na obidvoch sekvenciách variabilnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca. Vyššie opísaná analýza sa uskutoční jednoduchšie, ak sú zahrnuté iba sekvencie ľudského imunoglobulínu. 2) Zoznam sekvencii variabilných oblastí ľudských protilátok a porovnanie za účelom zistenia homológie. Najskôr sa uskutoční porovnanie dĺžky CDR mimo CDR3 ťažkého reťazca, ktorý je celkom variabilný. Ľudské ťažké reťazce a ľahké reťazca kapa a lambda sa rozdelili do podskupín: podskupina 3 ťažkého reťazca, podskupina 4 reťazca kapa, podskupina 6 reťazca lambda. Veľkosti CDR v každej v každej podskupine sú podobné, ale v skupinách sa líšia. Ako prvé priblíženie stupňa homológie je zvyčajne možné zrovnať do párov protilátky CDR hlodavcov s jednou z ľudských podskupín. Protilátky nesúce CDR podobnej dĺžky sa potom porovnali, aby sa zistila sekvenčná homológia aminokyselín, obzvlášť v CDR, ale tiež v okolitých oblastiach kostry protilátok. Ľudská variabilná oblasť, ktorá je najviac homológna, sa vybrala ako kostra v prípade humanizácie.
Krok 3
Súčasné humanizačné metódy/techniky
Protilátky je možné humanizovať zavedením štepu do požadovanej CDR do kostry ľudských protilátok podľa EP-A-0239400. Sekvencie DNA kódujúce požadované protilátky sa môže preto pripraviť tak, že začína ľudskou DNA, ktorej CDR má byť preformovaná. Aminokyselinová sekvencia variabilnej oblasti hlodavcov, obsahujúca požadovanú CDR sa porovnáva s vybranou sekvenciou variabilnej oblasti ľudských protilátok. Zvyšky v ľudskej variabilnej oblasti sú označené tak, že je nutné označiť, keď majú byť vymenené za zodpovedajúci zvyšok u hlodavcov, aby vznikla ľudská variabilná oblasť, ktorá obsahuje CDR hlodavcov. Tu sa tiež musia vyskytovať zvyšky, ktoré je potrebné substituovať, pridať alebo deletovať z ľudskej sekvencie.
Syntetizovali sa oligonukleotidy, ktoré sa môžu použiť pri mutagenáze kostry ľudskej variabilnej oblasti, aby obsahovali požadované zvyšky. Tieto oligonukleotidy sa môžu vyskytovať v ľubovoľnej vhodnej veľkosti. Veľkosť použitých
• ·· | ·· | ···· ·· | |
• · · · | • | • · · | • · |
ä ··· · · | • | • · · · | |
• · · | • | • · · · | |
·· ·· | ·· | ·· ·· | • · |
oligonukleotidov limitujú iba schopnosti určitého syntetizátora, ktorý je dostupný. Spôsob mutagenázy in vitro riadenej oligonukleotidom je dobre známy v danej oblasti techniky.
V inom prípade je možné dosiahnuť humanizáciu za použitia rekombinantnej polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR), ktorá sa opisuje v publikácii WO 92/07075. Za použitia tejto metódy sa môže CDR upraviť zostrihom medzi oblasťami kostry ľudských protilátok.
Vo všeobecnom prípade je možné uskutočniť techniku WO 92/07075 za použitia templátu, ktorý obsahuje dve oblasti kostry ľudských protilátok, AB a CD a medzi nimi je CDR, ktorá sa hradí donorovou CDR. Primery A a B sa používajú pri amplifikácii oblasti kostry AB a primérov C a D, ktoré sa používajú pri amplifikácii oblasti CD kostry. Primery B a C tiež obsahujú na svojom 5' konci ďalšiu sekvenciu zodpovedajúcu všetkým alebo častiam donorovej sekvencie CDR. Primery B a C prekrývajú dĺžku dostatočne, aby došlo k naviazaniu na ich 5' konce za podmienok, ktoré umožnia, aby prebehla PCR. Tak amplifikované oblasti B a CD podstúpili úpravu génu zostrihom extenzií presahu za vzniku humanizovaného produktu v jedinej reakcii.
Krok 4
Transfekcia a expresia upravených protilátok
Po reakciách, ktoré tvoria mutácie, aby vznikli upravené protilátky, sa môže mutagenizovaná DNA naviazať na vhodnú DNA kódujúcu konštantnú oblasť ľahkého alebo ťažkého reťazca klonovaného do expresného vektora a transfekovaných do hostiteľských buniek, pričom sa uprednostňujú cicavčie bunky. Tieto kroky môžu prebiehať rutinným spôsobom. Upravené protilátky sa môžu pripraviť spôsobom, ktorý zahrnuje:
a) prípravu prvého replikovateľného expresného vektora, ktorý zahrnuje vhodný promótor operatívne spojený so sekvenciou DNA, ktorá kóduje aspoň jednu variabilnú oblasť ťažkého alebo ľahkého reťazca lg, variabilnú oblasť obsahujúcu oblasť kostry, ktoré pochádzajú z ľudských protilátok a CDR požadovanú na humanizáciu protilátok podľa vynálezu, ·· ····
-12·· ··· • · · • · · • · · · • · · · • · ·· ·· • · · • · • · • · ·· ·
b) prípravu druhého replikovateľného expresného vektora, ktorý zahrnuje vhodný promótor operatívne spojený so sekvenciou DNA, ktorá kóduje aspoň variabilnú oblasť komplementárneho Ig ľahkého a ťažkého reťazca,
c) transformáciu bunkovej línie prvým alebo oboma pripravenými vektormi,
d) kultiváciu uvedenej transformovanej bunkovej línie za vzniku upravených protilátok.
Je výhodné, aby sekvencia DNA v kroku a) kódovala variabilnú oblasť a/alebo každú konštantnú oblasť reťazca ľudských protilátok. Humanizované protilátky sa môžu získať a čistiť. Bunková línia, ktorá sa transformuje, aby došlo k produkcii upravených protilátok môže byť línia buniek vaječníkov čínskych škrečkov (CHO) alebo imortalizovaná bunková línia cicavcov. Je výhodné, aby táto bunková línia bola lymfoidného pôvodu, ako je bunková línia myelómu, hybridomu, triómu alebo kvadrómu. Bunková línia môže tiež obsahovať normálne lymfoidné bunky, ako sú B bunky, ktoré neodumierajú po transformácii vírusom, ako je vírus EpsteinBarr. Najvýhodnejšie je, aby neodumierajúcou bunkovou líniou bola línia buniek myelómu alebo jej deriváty. Expresný systém prvej voľby je expresný systém glutamínsyntetázy, ktorý sa opisuje v publikácii WO 87/04462.
Aj keď bunková línia používaná pri produkcii humanizovaných protilátok je výhodne cicavčia bunková línia, môže sa tiež použiť ľubovoľná iná vhodná bunková línia, ako je bakteriálna bunková línia alebo kvasinková bunková línia. V prípade reťazcov jedinej protilátky sa predpokladá, že sa môžu použiť bakteriálne kmene odvodené od E. coli. U získaných protilátok sa kontroluje ich funkčnosť. Ak protilátky stratia svoju funkciu je nutné sa vrátiť ku kroku (2) a zmeniť kostru protilátok.
Vynález poskytuje expresný vektor obsahujúci DNA kódujúcu a adaptovanú na expresiu protilátok podľa vynálezu a hostiteľské bunky transformované uvedenými expresnými vektormi.
Po expresii sa celé protilátky, ich diméry, jednotlivé ľahké a ťažké alebo ich imunoglobulínové formy podľa vynálezu môžu čistiť podľa štandardných postupov, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Tieto postupy zahrnujú zrážanie síranom amónnym, afinitné klony, klonovú chromatografiu, gélovú elektroforézu a podobne (opisuje sa v publikácii Scopes, R., Proteín Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Pre farmaceutické využitie sú výhodné v podstate čisté
• ·· | ·· | ···· | • e | |
·· · · | • | • | • | • · · |
• ··· · • · • e · ·· | • • ·· | • • | • • · ·· | • · · • ·· · |
imunoglobulíny, ktoré vykazujú 98 až 95 % homogenitu. Výhodnejšie sú imunoglobulíny, ktoré vykazujú 98 až 99 % homogenitu alebo vyššiu. Ak sa čistením protilátok dosiahne čiastočná alebo požadovaná čistota, protilátky sa potom môžu použiť v terapii alebo pri vývoji alebo uskutočnení testov, pri imunofluorescenčnom farbení a podobne (opisuje sa v publikácii Immunolgical methods, Zv. I a II, Lefkovits a Pernis, eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979 a 1981)).
Protilátky môžu fungovať blokovaním interakcií medzi molekulami CD23 viazanými na membráne a ligandom, ktorý sa na neho viaže. Pre štúdium takého blokačného účinku sa použijú in vitro testy, ako sú rádio-imunitné testy. Protilátky potom môžu fungovať tak, že sa naviažu na rozpustený CD23. Ja známe, že CD23 naviazaný na membráne podlieha štiepeniu, čím sa uvoľní z povrchu bunky za vzniku mnohých rozpustných fragmentov. Tieto fragmenty pôsobia ako cytokíny a hrajú dôležitú úlohu pri tvorbe IgE. Pri ochorení preto vzniká nadmerné množstvo rozpustného CD23. Naviazaním týchto fragmentov na protilátky podľa vynálezu môže interferovať so schopnosťou rozpusteného CD23 sprostredkovať svoje účinky. Verí sa, že protilátky podľa vynálezu bránia produkcii CD23 tým, že štiepia receptor viazaný na membránu. Vynález preto opisuje použitie anti-CD23 protilátok pri výrobe liečiva pre zablokovanie tvorby rozpustného CD23.
Schopnosť ľubovoľných protilátok sprostredkovať svoj účinok sa vzťahuje k ich afinite na cieľový antigén. Protilátky podľa vynálezu vykazujú veľmi vysokú afinitu pre receptor CD23. Afinitná konštanta takých protilátok je výhodne vyššia ako 1x109 Ka/mol a výhodnejšie vyššia ako 1x1010 Ka/mol. Vynález preto poskytuje protilátky schopné naviazať sa na receptor CD23 alebo rozpustný CD23 charakterizované afinitnou konštantou rovnou alebo vyššou ako 1x109 Ka/mol.
Protilátky, ktoré sa viažu na receptor CD23 sa môžu použiť in vivo na liečenie alebo profylaxiu zápalového alebo autoimunitného ochorenia. To je veľmi podstatné, pretože mnoho týchto ochorení navzdory dlhotrvajúcemu výskumu je veľmi ťažké alebo úplne nemožné účinne liečiť. To je obzvlášť prípad artritídy, ktorá často ovplyvňuje ľudí v strednom veku a môže im brániť v práci. Účinná liečba artritídy je dlhotrvajúca úloha pre mnoho výskumných skupín.
Protilátky podľa vynálezu sa môžu použiť na liečenie alebo profýlaxiu vážneho ochorenia, ktoré zahrnuje artritídu, lupus erythematosus, Hashimotovu
• ·· | ·· | ···· | · | ||
·· · · | • | • | • | • | • · |
• ··· · | • | • | • | • · | • |
• · ··· ·· | • ·· | • | • · ·· | • ·· | • • |
tyreoiditídu, roztrúsenú sklerózu, cukrovku, uveitídu, dermatitídu, lupienku, žihľavku, nefrotický syndróm, glomerulonefritídu, zápalové ochorenie čriev, ulceratívnu kolitídu, Crohnovu chorobu, Sjogrenov syndróm, alergiu, alergickú astmu, intrinsickú astmu, akútnu astmatickú exacerbáciu, rinitídu, ekzém, GVH, COPD, inzulitídu, bronchitídu (najmä chronickú bronchitídu) alebo cukrovku (najmä cukrovku typu I).
Vynález opisuje použitie protilátok podľa vynálezu na výrobu lieku na liečenie jednej alebo viacerých porúch. Vynález ďalej opisuje spôsob liečby jednej alebo viacerých vyššie uvedených porúch, ktoré zahrnujú aplikáciu terapeuticky účinnej dávky protilátok podľa vynálezu.
Protilátky podľa vynálezu sa môžu použiť pri štúdiu interakcií medzi CD23 a rôznymi ligandami, napríklad medzi CD23 a CD21, medzi CD23 a CD11b, medzi CD23 a CD11, medzi CD23 a proteínom endoteliálnych buniek s molekulovou hmotnosťou 80 000 až 75 000 alebo medzi CD23 a proteínom s molekulovou hmotnosťou 115 000 (ktorý, ako sa predpokladá je príbuzný s endoteliálnym proteínom s molekulovou hmotnosťou 80 000 až 85 000). Verí sa, že jedna alebo viac vyššie uvedených interakcií sa vyskytuje in vivo. Obzvlášť sú výhodné protilátky alebo iné väzobné činidlá, ktoré sú schopné blokovať tieto interakcie. Predpokaldá sa, že tieto činidlá sú obzvlášť vhodné pre zníženie alebo zvýšenie zápalového účinku sprostredkovaného cytokínmi. Môžu sa použiť proti maligným nádorom B buniek, ako je chronická lymfocytárna leukémia a leukémia vlasových buniek.
Alternatívny mechanizmus pôsobenia anti-CD23 terapie sa môže podieľať na blokovaní IgE imunitnej odozvy.
Protilátky podľa vynálezu je tiež možné použiť na liečenie a profylaxiu alergického ochorenia, ktoré zahrnuje ochorenia, ktoré nie sú spôsobené IgE. Môžu sa použiť pri liečbe a profylaxii Crohnovej choroby.
Protilátky podľa vynálezu sa môžu použiť samé alebo v kombinácii s imunosupresívnymi činidlami, ako sú steroidy, cyklosporín alebo protilátky, ako sú anti-iymfocytárne protilátky alebo výhodnejšie sú činidlá vyvolávajúce toleranciu, anti-autoimunitné alebo protizápalové činidlá, ako sú činidlá inhibujúce CD4+T bunky, napríklad anti-CD4 protilátky (výhodné sú blokačné činidlá alebo protilátky, ktoré nie sú deplekačné), anti-CD8 protilátky, TNF antagonisty napríklad anti-TNF
• ·· 99 9 · | ·· | 9999 • | • 9 | ||
9 | • | 9 | 9 9 | ||
• 999 · | • | • | • | 9 9 | 9 |
• · ··· ·· | • ·· | • | • · ·· | 9 99 | 9 9 |
protilátky alebo TNF inhibítory, napríklad rozpustný TNF receptor alebo činidlá, ako je NSAID.
Vhodné dávky zlúčeniny podľa vynálezu budú kolísať v závislosti od faktorov, ako je liečené ochorenie alebo poruchy, spôsob aplikácie a vek a hmotnosť jednotlivca, ktorý sa lieči. Bez toho, aby došlo k obmedzeniu určitou dávkou sa predpokladá, že napríklad v prípade parenterálneho podávania sa denná dávka pohybuje v rozmedzí 0,01 až 20 mg/kg protilátok podľa vynálezu (zvyčajne je prítomná časť farmaceutického prostriedku) a táto dávka je vhodná na liečenie typickej dospelej osoby. Vhodnejšie je, že sa dávka môže pohybovať v rozmedzí 0,1 až 5 mg/kg, ako je rozmedzie 0,1 až 2 mg/kg. Jednotková vhodná dávka je 1 až 400 mg.
Protilátky sa môžu tiež použiť, ako oddelené aplikovateľné zlúčeniny v spojení s chemoterapeutickými alebo imunosupresívnymi činidlami. V typickom prípade činidlá budú zahrnovať cyklosporín A alebo purínový analóg (napríklad metotrexát, 6-merkaptopurín alebo podobne). Môže sa tiež použiť mnoho ďalších činidiel (napríklad cyklofosfamid, prednison, atď.), ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky.
Ak je nutné lyžovať bunky, na ktoré sa protilátky viažu, potom protilátky podľa vynálezu môže tvoriť časť imunotoxínu. Imunotoxíny sa charakterizujú dvoma komponentmi a sú obzvlášť použiteľné pri zabíjaní vybraných buniek in vitro a in vivo. Jednou zložkou je cytotoxické činidlo, ktoré je obvyklé pre bunky fatálne v prípade, že sa na nich viaže alebo absorbuje. Druhá zložka, ktorá je známa ako nástroj na zavádzanie poskytuje spôsob zavedenia toxického činidla do určitého typu buniek, ako sú bunky, ktoré sú obsiahnuté v karcinóme. Dve zložky sú bežne chemicky viazané spolu ľubovoľným dobre známym chemickým postupom. Napríklad v prípade, kedy je cytotoxickým činidlom proteín a druhou zložkou je intaktný imunoglobulín, väzba je uskutočnená spôsobom heterobifunkčných priečnych väzieb, napríklad SPDP, karbodiimid, glutaraldehyl a podobne. Produkcia rôznych imunotoxínov je dobre známa v danej oblasti techniky a je opísaná napríklad v publikácii Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Mágie Bullet, Thorpe a ďalší, Monoclonal Antibodies in Clinical Medicíne, Academic Press, str. 168 až 190 (1982).
• ·· ·· ···· ·· ••••·· · · • ··· · · · · · · · • ······· ··· ·· ·· ·· ·· ·
-16Rôzne toxické činidlá sú vhodné na použitie ako imunocytotoxíny. Cytotoxické činidlá môžu zahrnovať rádionukleotidy, ako je jodín-131, ytrium-90, rénium-188 a bizmut-212, mnoho chemoterapeutických liečiv, ako je vindesín, metotrexát, adriamycín a cisplantín a cytotoxické proteíny, ako sú ribozomálne inhibičné proteíny podobné antivírusovému proteínu, exotoxínu A baktérií Psedomonas, ricínu, toxínu diftérie, reťazce A ricínu atď. alebo činidlá aktívne na povrchu bunky, ako sú fosfolipázové enzýmy (napríklad fosfolipáza C) (opisuje sa v publikácii Chimaeric Toxins, Olsnes a Phil, Pharmac. Ther., 25: 335 až 381 (1982) a Monoclonal Antibodies for cancer Detection and Therapy, eds. Baldwin a Byers, str. 159 až 179, 224 až 266, Academic Press (1985).
Zavádzaná zložka imunotoxínu je protilátka podľa vynálezu. Výhodne sa používajú neporušené imunoglobulíny alebo ich väzobné fragmenty, ako je Fab. V typickom prípade protilátky v imunotoxínoch sú izotopy ľudských IgA, IgM alebo IgG, ale ak je to nutné, môžu sa využiť tiež aj iné konštantné oblasti.
Vynález ďalej opisuje farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje farmaceutický prijateľný nosič alebo riedidlo a ako účinnú zložku protilátky podľa vynálezu. Farmaceutický prostriedok môže obsahovať imunotoxín podľa vynálezu. Protilátky, imunotoxín a ich farmaceutické zlúčeniny podľa vynálezu je možné obzvlášť použiť pri parenterálnom podávaní, to znamená podkožné, do svalu alebo intravenózne.
Farmaceutické prostriedky na parenterálne podávanie môžu bežne obsahovať roztok protilátok ako ich zmes rozpustenú v prijateľnom nosiči, výhodný je vodný nosič. Môže sa použiť mnoho vodných nosičov, ako je napríklad voda, pufrovaná voda, 0,4% fyziologický roztok, 0,3% glycín a podobne. Tieto roztoky sú sterilné a vo všeobecnom prípade neobsahujú iné látky. Tieto farmaceutické prostriedky sa môžu sterilizovať bežnými sterilizačnými postupmi, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Prostriedky môžu obsahovať farmaceutický prijateľné auxiiiárne látky, ak si to vyžadujú fyziologické podmienky, ako sú činidlá na úpravu pH a činidlá slúžiace ako pufre, činidlá upravujúce toxicitu a podobne. Je to napríklad octan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, mliečnan sodný atď.. Koncentrácia protilátok v prípade týchto farmaceutických prostriedkov môže kolísať v širokom rozmedzí. Rozmedzie môže byť menej ako 0,5 %, zvyčajne
• ·· • · · | ·· • · | 4444 4 | 44 • 4 | 44 |
• ··· · • · ·· 44 | 4 · • 4 • 4 | 4 4 4 44 | 4 4 4 4 4 44 | 44 |
aspoň 1 % až 15 alebo 20 % hmotnostných. Koncentrácia sa vyberie na základe objemu kvapalín, viskozity, atď., v súlade s určitým spôsobom vybratého podávania.
Typický farmaceutický prostriedok v prípade injekcie do svalu sa môže pripraviť tak, že obsahuje až 1 ml sterilnej pufrovanej vody a 50 mg protilátok. Typický farmaceutický prostriedok v prípade vnútrožilovej infúzie sa môže pripraviť tak, že obsahuje 250 ml sterilného Ringerovho roztoku a 150 mg protilátok. Aktuálne metódy na prípravu aplikovateľných zlúčenín sú dobre známe v danej oblasti techniky a opisujú sa napríklad v publikácii Remington's Pharmaceutical Science, 15 th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).
Protilátky podľa vynálezu sa môžu lyofilizovať za účelom uloženia a pred použitím rozpustiť vo vhodnom nosiči. Ukázalo sa, že táto metóda je účinná s bežnými imunitnými globulínmi. Môže sa použiť ľubovoľný lyofilizačný postup a ľubovoľný postup rozpustenia. Je vhodné, aby lyofilizácia a rozpustenie viedlo k rôznemu stupňu straty aktivity protilátok (napríklad bežné imunitné globulíny, protilátky IgM majú tendenciu mať vyššie straty aktivity v porovnaní s protilátkami igG).
Jediné a opakované podanie farmaceutického prostriedku sa môže uskutočniť dávkou a paternom, ktorý vybral lekár. Farmaceutické prostriedky môžu poskytovať množstvo protilátok podľa vynálezu, ktoré je účinné na liečbu pacienta.
Protilátky podľa vynálezu môžu ďalej nachádzať široké uplatnenie in vitro. Protilátky sa môžu použiť pri typovaní T buniek, pri izolácii buniek, ktoré nesú špecifický antigén CD23 alebo fragmenty receptora, pri príprave vakcíny alebo podobne.
Na diagnostické účely sa protilátky môžu buď značiť a alebo sa neznačia. Neznačené protilátky sa môžu použiť v kombinácii s inými značenými protilátkami (sekundárne protilátky), ktoré reagujú s humanizovanými protilátkami, ako sú protilátky špecifické pre konštantné oblasti ľudského imunoglobulínu. V inom prípade protilátky sa môžu značiť priamo. Môže sa použiť široké rozmedzie značiek, ako sú rádionukleotidy, fluór, enzýmy, enzýmové substráty, enzýmové kofaktory, enzýmové inhibítory, ligandy (obzvlášť haptény) atď.. Je dostupných mnoho imunologických testov, ktoré sú známe priamo v danej oblasti techniky.
• ·· ·· · · | ·· | ···· • | • | ·· | • · | |
• | • | |||||
• ··· · | • | • | • e | • | • | |
• · | • | • | • · | • | • | |
··· ·· | ·· | ·· | ·· | • |
Sady sa môžu tiež použiť s protilátkami pri ochrane proti aktivite buniek alebo ich detekcii alebo detekcii prítomnosti vybraného antigénu. Protilátky podľa vynálezu sa môžu pripravovať obvykle v lyofilizovanej forme v nádobke, buď samé alebo spolu s ďalšími protilátkami, ktoré sú špecifické pre požadovaný typ bunky. Protilátky, ktoré sú spojené so značkou alebo toxínom alebo nie sú spojené sú zahrnuté v sadách s pufrom, ako je Tris, fosforečnan, uhličitan atď., stabilizátorom, biocidmi, inertnými proteínmi, napríklad sérovým albumínom alebo podobne a návodom na použitie. Vo všeobecnom prípade tento materiál bude prítomný v množstve menšom ako 5 % hmotnostných vztiahnuté na množstvo aktívnych protilátok a zvyčajne je prítomné v celkovom množstve aspoň 0,001 % hmotnostných vztiahnuté na koncentráciu protilátok. Často je nutné zahrnúť inertné plnivo alebo excipient, aby sa nariedili aktívne zložky. Excipient môže tvoriť 1 až 99 % hmotnostných celkového prostiredku. V prípade, že sekundárne protilátky sú schopné sa viazať na chimerické protilátky, ktoré sa používajú v teste, sú potom prítomné v oddelenej fľaštičke. Sekundárne protilátky sú v typickom prípade spojené so značkou a tvoria analogickým spôsobom s protilátkami prostriedky, ktoré sa opisujú vyššie v texte.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obrázku č. 1 je zobrazená aminokyselinová a nukleotidová sekvencia variabilnej oblasti ťažkého reťazca C11 myši.
Na obrázku č. 2 je zobrazená aminokyselinová a nukleotidová sekvencia variabilnej oblasti ľahkého reťazca C11 myši.
Na obrázku č. 3 je zobrazená aminokyselinová a nukleotidová sekvencia variabilnej oblasti ťažkého reťazca humanizovaných protilátok proti CD23.
Na obrázku č. 4 je zobrazená aminokyselinová a nukleotidová sekvencia variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátok proti CD23.
Na obrázku č. 5 je zobrazené polovičné maximálne naviazanie chimerickej CD23 lgG1m.
Na obrázku č. 6 je zobrazené polovičné maximálne naviazanie humanizovaných CD23 lgG1m.
• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ···
-19• ··· · · · · · · · • · ···· ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Klonovanie a sekvenovanie myších anti-CD23 monoklonálnych protilátok C11
Všeobecné postupy
Ak nie je uvedené inak, používajú sa nasledujúce štandardné postupy a podmienky. Ak to bolo možné používali sa protokoly doporučené výrobcom. Reštrikčné štiepenie a iné postupy molekulárnej biológie sa uskutočnili v podstate rovnako, ako sa opisuje v publikácii Maniatis a ďalší., Molecular Cloning- a laboratory manual 2nd edition, Cold Spring Harbour Press).
PCR sa uskutočnilo za použitia programovateľného termálneho cyklovača (Trio, Biometra). V typickom prípade reakcia s objemom 100 μΙ obsahovala 2,5 jednotiek polymerázy AmpliTaq (Perkin-Elmer-Cetus, Beaconsfield, UK) v pufri, ktorý sa získal od výrobcu, 250 μΜ každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP amplifikačné priméry v koncentrácii 1 μΜ a templátovú DNA. Ak nie je uvedené inak, použili sa nasledujúce špecifikácie cyklu:
krok 0: teplota 95 °C počas 5 minút krok 1: teplota 95 °C počas 1 minúty krok 2: teplota 50 °C počas 1 minúty, skok na krok 3 pri teplote 0,4 °C/sekundu krok 3: teplota 72 °C počas 1 minúty, späť na krok 1, opakovať slučku 30 krát krok 4: teplota 72 °C počas 5 minút.
Sekvenovanie DNA sa uskutočnilo za použitia metódy dideoxyterminácie za použitia buď systému Sequenase v2 (USB, Cambridge, UK) alebo systému terminácie fluorescenčným farbivom (ABI).
Čistenie DNA na géli sa uskutočnilo oddelením reakcie na agarózovom géli s nízkou teplotou topenia (NuSieve GTG, FMC, Rockland, ME). Vybrané fragmenty sa vyrezali pod UV žiarením a DNA sa získala sa použitia preparačného kitu Wizard PCR (Promega, Suthampton, UK).
Číslovanie aminokyselinových zvyškov v reťazcoch protilátok sa uskutočňuje podľa schémy publikovanej v publikácii Kabat a ďalší, Sequences of proteins of
-20• ·· ·· ···· ·· · ···· · · · · · ·· • · · ··· ··· • ··· ··· ···· · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ··· immunological interest, US Dept of Health and Human Services, US Govt Printing
Office, 1991).
Príprava cDNA z hybridómu C11
Na extrakciu RNA sa použila kultivovaná kultúra buniek C11. Kultúra obsahujúca 1,3x107 buniek sa odstredila a bunková peleta a supernatant sa získali na analýzu. V supernatante sa testovala prítomnosť myšieho imunoglobuiínu v rôznych izotopoch za použitia imunologickej metódy (kit ISO1, Sigma, Poole, UK) a zistilo sa, že monoklonálne C11 sú izotop lgG1.
Mediátorová RNA sa izolovala z pelety buniek sekvenčnou aplikáciou kitu na izoláciu celkovej RNA (Stratagene, Cambridge, UK (za vzniku celkovej RNA) a potom kitu mRNA Purification (Dynal, Oslo, Norway). Časti mRNA a celkové RNA sa potom previedli na jednoreťazcové cDNA za použitia Superscript Preamplification System (BRL, Paisley, Scotland, UK). Alikvóty výslednej cDNA sa použili pre PCR, ktorá je navrhnutá tak, aby sa oddelene amplifikovali variabilné oblasti ťažký a ľahký reťazec imunoglobulíny C11.
Klonovanie a sekvenovanie variabilnej oblasti ťažkého reťazca C11
Ťažký reťazec sa klonoval rôznymi variáciami metódy podľa Bendinga a Jonese (Bio/Technology 9: 88 až 89), kde sa pre PCR amplifikáciu celej variabilnej oblasti používa 12 forward primerov, ktoré sú špecifické pre oblasť signálneho peptidu ťažkého reťazca a 1 reverzný primer špecifický pre konštantnú oblasť myšieho γ1. Skôr ako pridať 12 forward primerov do jednej reakcie je lepšie uskutočniť 12 oddelených reakcií PCR. Kedy v každej reakcii sa použije jeden z forward primerov s reverzným γ1. Tieto reakcie sa uskutočnili pri teplote hybridizácie 42,5 °C (krok 2 opísaný v schéme uvedenej vyššie v texte).
Vzorky každej reakcie sa analyzovali na agarózovom géli a pruh vykazujúci očakávanú veľkosť s objavil iba pri reakcii, ktorá používala forward primer MHV11. Na základe uvedeného výsledku sa uskutočnili dve PCR za použitia MHV11 a reverzného primeru γ1 a cDNA, ktorá sa odvodila z mRNA a z celkovej RNA. Pri dvoch nezávislých reakciách PCR, ktoré majú slúžiť ako zdroj materiálu na klonovanie, sa použili bežné prístroje, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky • ·· ·· ···· ·· ···· ·· · · · ·
-21 • ·· · · · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ·· ·· ·· · a zabraňujú vzniku chýb v sekvencii, ktoré vznikajú chybným začlenením nukleotidov Tag polymerázou.
Výsledné fragmenty PCR sa potom štiepili reštrikčnými enzýmami Xmal a Sali, čistili sa na géli a klonovali sa do pUC18. Inzerty z počtu klonov z každej PCR sa sekvenovali a zistilo sa, že sú zhodné. To naznačuje, že sekvencia neobsahuje chyby, ktoré vznikli spôsobom PCR. Úplná sekvencia variabilnej oblasti je uvedená na obrázku č. 1 (SEQ ID NO: 1) a je úplne spárovaná ťažkým reťazcom skupiny IIC podľa Kabata.
Klonovanie a sekvenovanie variabilnej oblasti ľahkého reťazca C11
Variabilná oblasť ľahkého reťazca C11 sa klonovala podobným spôsobom. Zahrnuje sadu 11 forward primerov, ktoré sú špecifické pre oblasť signálneho peptidu, a 1 reverzný primer špecifický pre myšiu konštantnú oblasť k (Bending a Jones, (Bio/Technology 9: 88 až 89). Naviac, ako sa skôr stanovilo, tento primer neamplifikuje dostatočne účinne všetky myšie ľahké reťazce kapa, použili sme iný primer, ktorý tu nazývame MKV12 (sekvencia 5'ACTAGTCGACATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTC3') (SEQ ID NO: 41). Ako sa uvádza vyššie v texte v každej oddelenej reakcii PCR sa nachádza jeden forward primer a reverzný primer konštantnej oblasti kapa. Tieto reakcie prebehli a analyzovali sa alektroforézou na agarózovom géli.
Tri produkty, ktoré vznikli pri uvedených reakciách mali očakávanú veľkosť.
Tieto produkty sa oddelene štiepili reštrikčnými enzýmami Sali a Xmal, čistili sa a klonovali do pUC18, pričom vznikli klony označené VKI, VKJ a VKK. Tieto klony sa čiastočne sekvenovali za účelom stanovenia ich identity. Zistilo sa, že čiastočná sekvencia klonu VKI je zhodná so známou sekvenciou, ľahkým reťazcom získaným z myelómu M0PC21, ktorý vykazuje posun v rámci CDR3 (GenBank M35669) a tiež sa odstránil VKI. Tiež sa zistilo, že čiastočná sekvencia klonu VKK zahrnujúca CDR3 je zhodná s produktívne upraveným ľahkým reťazcom MOPC21 (GenBank J00560, J00552). To isté nebráni tomu, aby sa kloň VKK upravil na ľahký reťazec C11, pričom oba ľahké reťazce môžu zdieľať CDR3 v embryonálnej konfigurácii. Je dané, že myelomový predchodca hybridómu je derivát MOPC21 a tak sa
-22• ·· ·· ··· ·· ···· ·· · ··· • ·· · · · · · · · • · » · · · · · ··· ·· ·· ·· ·· · identifikovala iná sekvencia príbuzná M0PC21 (kloň VKI). Uvažuje sa, že kloň VKK je správny.
Uvažuje sa, že kloň VKJ s veľkou pravdepodobnosťou reprezentuje skutočnú variabilnú oblasť ľahkého reťazca C11, rovnako ako čiastočná sekvencia nebola zhodná s ľubovoľnou sekvenciou v génovej banke. Kloň VKJ sa úplne sekvenoval a zistilo sa, že ide o úplne funkčnú sekvenciu ľahkého reťazca, neobsahuje posun v rámci, s najväčšou pravdepodobnosťou používa gény VK167 alebo VK24, a je umiestnená ako netypická sekvencia skupiny II podľa Kabata. Úplná sekvencia klonu VKJ sa zobrazila na obrázku č. 2 (SEQ ID NO: 2). Ďalej sa uskutočnila druhá nezávislá PCR za použitia párov primerov, ktorá produkuje produkt, ktorý sa klonoval a sekvenoval, aby sa predišlo možnosti, že sekvencia VKJ zahrnuje chyby PCR. Klony z tejto druhej amplifikácie mali sekvenciu zhodnú s pôvodným klonom VKJ.
Definitívny dôkaz, že VKJ obsahoval variabilnú oblasť ľahkého reťazca C11 sa získal prostredníctvom konštrukcie chimerických protilátok za použitia VK a VH, ktoré sa opisujú vyššie v texte. Ukázalo sa, že protilátky viažu CD23.
Návrh chimerických protilátok
Aby sa overilo, že sa klonovali a sekvenovali správne variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca, skonštruovali sa chimerické anti-CD23. Variabilná oblasť ťažkého reťazca sa amplifikovala za použitia klonov z knižnice cDNA. Froward primér obsahoval 5* klonovacie miesto (Hind III), 5' neprekladanú sekvenciu zahrnujúcu funkčný Kozacov signál, spolu s prvými šiestimi kodónmi myšej variabilnej ťažkej oblasti. Reverzný primér zavádza reštrikčné miesto Spe I do rámca 4, aby sa fúzoval s ľudskou konštantnou oblasťou gama I. Za použitia týchto primerov vznikol produkt obsahujúci 430 párov báz.
anti-CD23 chimerické PCR oligonukleotidy ťažkého reťazca:
5' gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA Cag gAC CTC ACC ATg gAT TTT gggCtgATT3' SEQIDNO: 19
5' gAT ggA CTA gTg TCC CTT ggC CCC A 3'
SEQ ID NO: 20
• ·· ·· · · | ·· • | • | BBBB • | ·· • · | B |
B BBB B | • | • | • · | B · | |
• · | • | • | • · | B B | |
BBB ·· | BB | ·· | BB | B |
Skonštruovali sa priméry na amplifikáciu variabilnej oblasti anti-CD23 ľahkého reťazca za účelom pripraviť chimerický ľahký reťazec. Tieto priméry obsahujú 5' klonovacie miesto (Hind III), 5' neprekladanú sekvenciu zahrnujúcu signál podľa Kozaca, spolu s prvými šiestimi kodónmi myšieho variabilného ľahkého reťazca. Reverzný primér obsahoval reštrikčné miesto BsiW 1 a antikodóny vhodné pre určité aminokyseliny.
Reduntantné kódy sú štandardné: Y = T alebo C, K = T alebo G, V = A, G alebo C. Produkt obsahoval 420 párov báz.
anti-CD23 chimerické PCR oligonukleotidy ľahkého reťazca:
5' gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA CAg gAC CTC ACC ATg Agg TTC TCT gTT CAg SEQ ID NO: 21
5'gAT gCg TAC gTY TKA TYT CCA VCT TKG T 3' SEQ ID NO: 22 (a SEQ ID NO: 42 až 45 a 52 a 53)
T R K I E L K T R V
Produkty ťažkého reťazca sa čistili, štiepili reštrikčnými enzýmami Hind III a Spe I, potom sa klonovali do vektora pUC štiepeného reštrikčnými enzýmami Hind III a Spe I, ktorý obsahuje konštantnú oblasť ľudského gama I. Používaná ľudská konštantná oblasť bola ťažký reťazec lgG1 opísaný v publikácii Reichman L a ďalší, (1988) Náture 322, 323 až 327, Page, M. J. a Sydenham, M. A. (1991) Biotechnology 9, 64 až 68 a Crowe J. S. a ďalší, Clinical Exp. Immunol. (1992) 87 až 105.
Variabilná a konštantná oblasť sa získala z vektora pUC reštrikčným enzýmom Hind III a EcoRI, potom sa klonovala do reštrikčného miesta Hind III EcoR 1 expresného vektoru pEE6, ktorý sa získal od firmy Celtech (Stephens & Cockett and Nucl. Acids, Res. (1989) 17, 7110).
Keď sa sekvenoval chimerický ťažký reťazec, chýbalo 100 párov báz 5' sekvencie. Po testovaní sekvencie myšieho variabilného reťazca sa objavilo vnútorné reštrikčné miesto Hind III. Aby vznikla variabilná sekvencia úplného
-24• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · · · • ··· · · · · · · · • ······· ··· ·· ·· ·· ·· · ťažkého reťazca vytvorená v produktoch PCR, produkt PCR sa štiepil reštrikčným enzýmom Hind III a malý fragment obsahujúci 100 párov báz sa klonoval do pEE6 tráveného enzýmom Hind III, ktorý obsahuje ťažký reťazec chimerických protilátok anti-CD23.
PCR produkty ľahkého reťazca sa čistili, potom sa štiepili reštrikčnými enzýmami Hind III a BsiW 1. Potom sa ligovali do vektora pUC, ktorý obsahuje konštantnú oblasť ľudského kapa. Použitie konštantnej oblasti ľudského kapa sa opisuje v publikácii Reichman L a ďalší, (1988) Náture 322, 323 až 327. Variabilná a konštantná oblasť sa odstránila z vektora pUC reštrikčným enzýmom Hind III a Eco Rl. Tento fragment sa klonoval do reštrikčného miesta Hind III - EcoR 1 expresného vektora pEE12, ktorý sa získal od firmy Celltech (Bebbington a Hentschel, In DNA Cloning Vol. 3, Chapter 8 IRL Press 1987).
Chimerický ťažký reťazec sa izoloval ako kazeta Bgl II - Sal I a začlenil sa do reštrikčného miesta Bam H1 - Sal I plazmidu ľahkého reťazca pEE12 tak, že gény ľahkého a ťažkého reťazca boli na rovnakom plazmide.
Konečná expresia plazmidu, ktorá obsahuje chimerický CD23 sa dočasne exprimovala v bunkách COS (bunky obličiek šedej opice). Transfektám (Promega) sa rekonštituoval v koncentrácii 1 mg/ml podľa doporučeného protokolu výrobcu. V deň pred transfékciou sa do jamky vnieslo 5x105 buniek a pripravilo sa tak šesť platní (Costar) pri celkovom objeme 2,5 ml média. Ako médium sa použilo Dulbeccovo upravené Eagle Médium (Gibco/BRL) a 10% dialyzované fetálne teľacie sérum (Hyclone). Platne sa inkubovali cez noc pri teplote 37 °C. Pre každú jamku na platniach so 6 jamkami sa pripravila zmes, keď 20 μΙ transfektámu sa pridalo do 0,5 ml média bez séra v sterilnom polystyrénovom kontajneri, potom sa zmes rýchlo premiešala na vortexe. V prípade každej jamky, kde malo dôjsť k transfekcii sa do 0,5 ml roztoku transfektámu v médiu bez séra pridali 4 pg plazmidovej DNA. Potom sa jamky zamiešali a nechali sa stáť pri teplote miestnosti počas 10 minút. Zatiaľ sa pripravili bunky pre transfekciu. Z buniek, ktoré sa transfektujú, sa odstránilo kultivačné médium, potom sa buky v každej jamke opatrne premyli 1 alebo 2 krát 5 ml dopredu ohriateho kultivačného média bez séra. Potom sa pridalo do každej jamky 0,5 ml kultivačného média bez séra. Skôr pripravený roztok 0,5 ml DNA/transfektám sa pridal do každej jamky a potom sa bunky nechali rásť. Platne
-25• ·· ·· ··«· ·· · ···· ·· · ···· ··· · · · ··· • ··· ··· ···· · • ········ ··· · ·· ·· ·· ··· sa jemne miešali, potom sa vrátili do inkubátora na ďalšie štyri hodiny. Do transfekčného roztoku sa pridali dva mililitre úplného média (obsahujúce 1,5 násobok koncentrácie normálneho séra). Platne sa vrátili do inkubátora na dobu troch dní. Z platní sa zhromaždilo kultivačné médium a testovala sa aktivita protilátok.
V teste ELISA sa chimerické protilátky viazali na sCD23. V prípade testu ELISA, ktorý slúži na stanovenie naviazania sCD23, sa platne EIA/RIA (Costar) potiahli 100 μΙ na jednu jamku sCD23 v koncentrácii 2 pg/ml v roztoku 35 mM NaHCO3, 15 mM Na2CO3, pH 9,3 cez noc pri teplote 4 °C. Platne sa premyli trikrát 150 mM NaCl, 50 mM bázou Trizma, 0,1 % (objem.) Tween-20, pH 7,4 (TBS/Tween) a blokovali sa počas 1 až 2 hodín pri teplote 22 °C 2% bovinným sérovým albumínom v TBS/Tween v množstve 100 μΙ na jamku a premyli sa trikrát zmesou TBS/Tween.
Riedenie supematantov z myších hybridómov C11 sa pridalo v množstve 100 μΙ/jamku do jednej časti platne s 96 jamkami a do ďalšej časti s 96 jamkami sa pridali nariedené chimerické protilátky anti-CD23 exprimované v supernatantoch buniek COS. Myšie protilátky C11 sa detekovali konjugátom anti-myší IgG (celá molekula) - peroxidáza, ktorý pochádza z kôz a je možné ho získať od firmy Sigma A4416. Konjugát sa riedil v pomere 1:1000 v PBS/BSA (bovinný sérový albumín) (1%). Chimerické protilátky anti-CD23 sa detekovali za použitia konjugátu protilátok proti ľahkému reťazcu ľudského kapa (viazaného a voľného) a peroxidázou (Sigma A-7164), ktorý sa riedi v pomere 1:5000 v PBS/BSA (1 %). Chimerické anti-CD23 sa v teste ELISA viažu na sCD23.
Chimerické protilátky proti CD23 sa tiež viažu na membránu CD23, ako sa stanovilo pomocou FACS. Tieto dáta ukázali, že správne variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca C11 sa klonovali a sekvenovali. Tieto myšie sekvencie sa potom použili na vývoj humanizovaných protilátok proti CD23.
Konštrukcia génov humanizovaného ťažkého a ľahkého reťazca
Humanizované ťažké a ľahké reťazce sa skonštruovali podľa nasledujúcej metódy, ktorá sa opisuje v publikácii Lewis a Crowe (Gene 101, 297 až 302,1991).
-26• ·· ·· ··· 99
9999 99 9 999
99999 9 999 9
999 99 99 99 99 9 (i) ľahký reťazec
Sekvencie variabilnej oblasti kostry myších protilátok sa porovnali so sekvenciami ľudských protilátok v databáze GenBank. Homológia kostry ľudského ľahkého reťazca sa porovnala s homológiou sekvencie variabilnej kostry ľahkého reťazca myších anti-ľudských anti-CD23 protilátok. Kostra vykazujúca najväčšiu homológiu sa vybrala ako templát na extenziu pomocou PCR.
Lokus: HSIGKVII 490 bp mRNA
Definícia: Ľudská upravená DNA pre vedúci peptid imunoglobínu kapa a variabilná oblasť
Zdroj: Homo sapiens
Autor: Klobeck, H. G a ďalší, Contribution of human V kappa II germ-line genes to light chain diversity, náture, 309, 73 až 76,1984.
Testovala sa každá aminokyselina, ktorá sa líši v rovnakej polohe od kostry myších a ľudských protilátok. Ľudská aminokyselina zostala, ak naviazanie antigénu nie je ovplyvnené, pretože ľudské zvyšky sú menej imunogénne ako myšie zvyšky. Označenie špecifických zvyškov, ktoré ovplyvňujú naviazanie je hypotetické a je založené na dátach získaných z iných interakciou protilátka - antigén. Z publikovaných dát sa ukázalo, že zvyšky 71, 91 a 94 v kostre ťažkého reťazca interagujú s naviazaním antigénu (Tramontano, A., Chothia, C., a A. M. Lesk, J. Mol. Biol., 215, 175 až 182, 1990, Kettleborough, C. A., Saldanha, J., Heath, V. J., Morrison, C. J. a M. M. Bending, Protein Eng, 4, 773 až 783, 1991). Tieto zvyšky môžu byť preto rovnaké v humanizovanej kostre ako myšej kostre. Každá zmena aminokyseliny sa zvažuje z hľadiska veľkosti, kydrofobicity, hydrofility a náboja. Ak ľudská aminokyselina je podobná s myšou aminokyselinou v týchto charakteristikách, potom sa na tomto mieste použije ľudská aminokyselina.
Pri porovnaní variabilnej aminokyselinovej sekvencie kostry myšieho ľahkého reťazca a variabilnej sekvencie ľudského ľahkého reťazca, ktorá vykazuje najväčšiu homológiu, sa zistilo 13 rozdielov. Nezachoval sa žiadny z myších zvyškov. Vytvorila sa variabilná sekvencia humanizovnaého ľahkého reťazca a program GCG sa použil na identifikáciu tichých miest v prípade nasledujúcich enzýmov: Accl, Hael, Nhel, Pvull, Xbal, Xhol, Xmal.
• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · · · ·
-27V nukleotidovej sekvencii sa uskutočnili zmeny tak, aby boli zahrnuté uvedené miesta reštrikčných enzýmov, bez toho, aby došlo k zmene aminokyselinovej sekvencie. Prítomnosť uvedených miest umožňuje ľahšie štiepenie a spojenie fragmentov PCR klonov.
Humanizovaný variabilný ľahký reťazec sa vytvoril vnesením CDR myšieho ľahkého reťazca do existujúceho templátu (napríklad HSIGKVII, opisuje sa v poblikácii Klobek, H. G. a ďalší, Náture (1984) 309, 73 až 76), ktorý obsahuje vybranú sekvenciu kostry ľudského reťazca za použitia zostrihu presahu pomocou PCR (opisuje sa v publikácii Crowe J. S. a ďalší, Clinical Exp. Immunol. (1992) 87 až 105. Pripravili sa plazmidy kódujúce variabilné sekvencie humanizovaného ľahkého reťazca:
Sekvencia podľa Kozaca pre transkripciu a signálnu sekvenciu (MGWSCIILFLVATATGVHS-SEQ ID NO: 15) sa zahrnula do templátovej sekvencie ľahkého reťazca. Na 5' koniec produktu PCR vhodného na klonovanie sa pridalo reštrikčné miesto Hind III a na jeho 3' koniec sa pridalo reštrikčné miesto Bswi I. Oligonukleotidy vhodné na PCR extenziu sú:
AL: SEQ ID NO: 23. 5' gAT CAA gCT TCT CTA CAg TTA CTg AgC ACA 3'
BL: SEQ ID NO: 24. 5' AAT CAA gTA TgT CTT CCC ATC CTT ATA CAg gAg ACT CTT ACT CgA gCg ACA ggA gAT ggA ggC 3'
CL: SEQ ID NO: 25. 5' CgC TCg AgT AAg AgT CTC CTg TAT AAg gAT ggg AAg ACA TAC TTg AAT Tgg TAC CTg CAg AAg 3'
Dl: SEQ ID NO: 26. 5' TgA TgC CCg ggT ggA CAT CAA ATA gAT Cag gAg CTg 3'
El: SEQ ID NO: 27. 5' TTg ATg TCC ACC Cgg gCA TCA ggg gTC CCT gAC Agg 3'
FL: SEQ ID NO: 28. 5' AgC CAC CTg Acg TTT gAT CTC CAC CTT ggT CCC TTg gCC gAA CgT gAA Tgg ATA CTC TAC CAg CTg TTg ACA gTA ATA AAC CCC 3' • ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ···
-28• ··· ··· ···· · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ···
Reakcie PCR (opisuje sa v publikácii Saiki a ďalší, Science 239, 487 až 491, 1988) sa uskutočnili v programovateľnom zahrievanom bloku (Perkin Elmer, GeneAmp 9600) za použitia 25 cyklov pri cyklizácii teplôt (94 °C počas 1 minúty, 50 °C počas 2 minút, 72 °C počas 3 minút), potom nasleduje konečný 5 minútový krok pri teplote 72 °C. V konečnom reakčnom objeme 50 μΙ sú obsiahnuté priméry (každý v koncentrácii 40 μΜ), špecifikované množstvo templátu a 2,5 jednotiek Taq polymerázy (Perkin Elmer Cetus) a reakčný pufor podľa doporučenia výrobcu.
Uskutočnili sa tri primárne reakcie PCR, keď sa pri každej reakcii použilo 10 ng templátu, páry primérov ALs BL, Cl s Dl, El s Fl. Produkty uvedených reakcií, čo sú fragmenty ABL, CDl a EFL sa čistili za použitia sady Qiaquick OCR Purification Kit (Qiagen Ltd., Surrey, UK, produkt #28104) podľa protokolu doporučeného výrobcom. Fragmenty ABĽ a CDL sa kombinovali za použitia jednej desatiny každého čisteného produktu a uskutočnila sa rekombinantné reakcia PCR a primermi AL a DL. Produkt tejto reakcie, čo je fragment ADL, sa čistil ako je uvedené vyššie v texte. Jedna desatina produktu sa kombinovala v rekombinantnej reakcii PCR s jednou desatinou čisteného EFĽ za použitia primérov AL a FL. Konečný produkt rekombinantnej PCR humanizovaného ľahkého reťazca AFl sa ligoval do pCR™ II, ktorý pochádza zo sady TA Cloning Kit (Invitrogen BV, Leek, The Netherlands, produkt #K2000-01), pričom sa postupuje podľa protokolu doporučeného výrobcom. Plazmidové izoláty sa sekvenovali za použitia fluorescenčného sekvenátora ABI.
(ii) Ťažký reťazec
Identifikovala sa sekvencia kostry ľudských protilátok, ktorá vykazuje najväčšiu homológiu so sekvenciou kostry myších protilátok, vhodná pre ťažký reťazce. Sekvencia vykazujúca najväčšiu homológiu v databáze v prípade ťažkého reťazca je:
Lokus: HUMSIGVS 423 BP MRNA
Definícia: mRNA reťazca ľudského Ig mu oblasť 5' konca V3b-D-J4
Zdroj: cDNA k mRNA Homo Sapiens
-29• ·· · ···· ·· ·· · · ·· · ··· • ·· ··· · · · · · • · · · · · ··· ··· ·· ·· ·· ·· ···
Autori: Sanz, I a ďalší, VH sequence of human autoantibody. Evidence That autoantibodies can be unmutated copies of germline genes. J. Immuno. 142, 883 až 887,1989.
Pri porovnávaní variabilnej aminokyselinovej sekvencie kostry myšieho ťažkého reťazca a variabilnej sekvencie ľudského ťažkého reťazca, ktorá vykazuje najväčšiu homológiu, sa zistilo 17 rozdielov. V piatich pozíciách 49, 66, 76, 77 a 94 sa zachovala myšia aminokyselina. Vo všetkých ďalších polohách sa pri humanizácii kostry ťažkého reťazca použili ľudské aminokyseliny.
Vytvoril sa súbor variabilnej sekvencie humanizovaného ťažkého reťazca a program GCG sa použil na identifikáciu tichých miest v prípade nasledujúcich enzýmov: Eagll, Nhel, Xbal, Xhol, Xmal.
V nukleotidovej sekvencii sa uskutočnili zmeny tak, aby boli zahrnuté uvedené miesta reštrikčných enzýmov, bez toho, aby došlo k zmene aminokyselinovej sekvencie. Prítomnosť uvedených miest umožňuje ľahšie štiepenie a spojenie fragmentov PCR klonov.
Na 5' koniec sekvencie variabilnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca sa pridalo reštrikčné miesto Hind III vhodné na klonovanie, sekveneia podľa Kozaca vhodná na iniciáciu transkripcie a myšia signálna sekveneia (MAWWTLLFLMAAAQSAQA - SEQ ID NO: 16) na účely vylučovania proteinu. Na 3' koniec sekvencie sa pridalo reštrikčné miesto Spel, ktoré je vhodné na klonovanie.
Variabilná kostra humanizovaného ťažkého reťazca, ktorý obsahuje myšiu CDR sa pripravila pomocou PCR za použitia dlhých prekrývajúcich sa oligonukleotidov. Syntetizovalo sa osem oligonukleotidov, ktoré tvoria približne 60 párov báz s presahom 15 párov báz. Tieto oligonukleotidy sú nasledujúce:
AH: SEQ ID NO: 29. 5' ACA CgA AgC TTC ACC Atg gCT Tgg gTg Tgg ACC TTg CTA TTC CTg ATg gCg gCC gCC CAA 3'
BH: SEQ ID NO: 30. 5' CTT TAC CAA gCC TCC CCC AgA CTC CAC Cag CTg
CAC CTC TgC TTg ggC ACT TTg ggC ggC CgC CAT 3’ • ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ···
-30·· · · · · · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···
CH: SEQ ID NO: 31. 5' TTg gTA AAg CCC ggg ggg TCC CTT AgA CTC TCC TgT gCA gCT AgC ggA TTC ACT TTC AgT 3'
DH: SEQ ID NO: 32. 5' CCC CTT CCC Tgg AgC CTg gCg gAC CCA ggA CAT CCA gTA gCC gAA AgT gAA TCC gCT 3'
EH: SEQ ID NO: 33. 5' ggg AAg ggg CTC gAg Tgg gTT gCT gAA ATT AgA TTg AAA TCT gAT AAT TAT gCA ACA CAT 3'
FH: SEQ ID NO: 34. 5' ATC ATC TCT TgA gAT ggT gAA TTT CCC CTT CAC AgA CTC CgC ATA ATg TgT TgC ATA ATT 3'
GH: SEQ ID NO: 35. 5' ATC TCA AgA gAT gAT TCA AAA TCT AgA CTg TAT CTg CAA ATg AAC AgC CTg AAA ACC gAg gAC ACA 3'
HH: SEQ ID NO: 36. 5' ggT gAC TAg TgT TCC CTg gCC CCA gTC TAT gAA ATC TgT ACA gTA ATA CAC ggC TgT gTC CTC ggT TTT 3'
Myšie CDR sa vnieslo do templátu za použitia rekombinantnej PCR. PCR sa uskutočnila za použitia programovateľného termálneho cyklovača (Trio, Biometra). Reakcia s objemom 50 μΙ obsahovala 2,5 jednotiek polymerázy AmpliTaq (PerkinElmer-Cetus, Beaconsfield, UK) v pufri, ktorý poskytol výrobca. Tento pufor zaručuje výhodné pH a ionovú silu vhodnú na amplifikáciu (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCI a 1,5 mM MgCb), 200 μΜ každého dATP, dCTP, dGTP a dTTP a amplifikačné primery v koncentrácii 1 pg/pl. Vzorky sa zahriali na teplotu 94 °C počas 2 minút v zahrievacom bloku, odstredili sa počas 30 sekúnd pri 16000xg. Vzorky sa umiestnili na ľad počas 1 minúty, potom sa pridala Taq polymeráza a kvapka minerálneho oleja. Vzorky sa miešali na vortexe, potom sa 30 sekúnd odstredili pri 16000xg. Vzorky sa potom umiestnili do programovateľného termálneho cyklovača a prebehla reakcia za nasledujúcich podmienok:
Krok 1: teplota 94 °C počas 1 minúty
Krok 2: teplota 50 °C počas 2 minút, skok na krok 3 pri teplote 0,4 °C/sekundu
• ·· ·· · · | ·· | ···· • | • | ·· | • | ·· | |
• | • | ||||||
• ··· · | • | • | • | • · | • | ||
• · | • | • | • · | • | • | ||
··· ·· | ·· | • · | ·· | ·· |
Krok 3: teplota 72 °C počas 3 minút, späť na krok 1, opakovať slučku 25 krát.
Uskutočnilo sa sedem primárnych reakcií PCR, kedy sa pri každej reakcii použilo 1 Mg/μΙ každého priméru za použitia kombinácií primérov AH s BH, Ch s Dh, Eh s Fh, Gh s Hh, Ah Bh Ch e Dh Eh Fh Gh a Hh, Ah Bh Ch Dh Eh Fh Gh a HhAlikvóty s objemom 1 μΙ primárnych produktov PCR sa kombinovali s primermi (1 Mg/μΙ) a vystavili sa rovnakým podmienkam reakcie PCR, ktoré sa opisujú pre primárnu reakciu PCR, pri ktorých vzniká variabilná oblasť ťažkého reťazca v plnej dĺžke. Primárne fragmenty PCR AFH a EHh, fragment AHh, fragmenty ABH, CDh a EFh a GHh, fragmenty ABh, CDh, EFh, GHh a AHh sa kombinovali s primermi Ah a Hh. Všetky reakcie PCR produkovali fragmenty celej dĺžky. PCR produkt variabilnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca z reakcií ABH, GHh a AHh sa čistil použitím DNA Wizard PCR Preps (Promega) podľa protokolu, ktorý doporučuje výrobca. Čistené produkty sa štiepili reštrikčným enzýmom Hind III a Spe I a potom sa klonovali do vektora pUC, ktorý obsahuje mutovanú konštantnú oblasť lgG1 (opisuje sa ďalej v texte).
Konštrukcia humanizovaných protilátok
PCR produkty variabilnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca sa štiepili reštrikčnými enzýmami Hind III a Spe I a potom sa klonovali do vektora pUC, ktorý obsahuje mutovanú konštantnú oblasť lgG1 (opisuje sa ďalej v texte). Variabilná oblasť klonov sa sekvenovala. Sekveneia je uvedená na obrázku č. 3 a 4 (SEQ ID NO: 17 a 18). Vybral sa kloň obsahujúci správnu variabilnú aminokyselinovú sekvenciu humanizovaného ťažkého reťazca. Tento kloň má jednu skrytú zmenu nukleotidu z modelovej variabilnej sekvencie humanizovaného ťažkého reťazca.
V prípade konštantnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca sa použili lgG1 s mutáciami, aby sa eliminovalo naviazanie C1q a Fc. Tieto mutácie sú založené na nasledujúcich dvoch publikáciách: Duncan, A. R. a Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Náture 332, 738 až 740, 1988 a Duncan, A. R., Woolf, J. M., Partrige, Ľ. J., Burton, D. R. a Winter, G. Localization of the binding for human FcR1 on IgG. Náture 332, 563 až 564, 1988.
• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ···
-32• ····· · ··· · · • · ···· ··· ··· ·· ·· ·· ·· ···
Mutácia zvyškov sa opisuje v publikácii Kabat, A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S. a C. Foeller, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Volume, strana 680.
Zmeny uskutočnené v lgG1 za vzniku izotopu, ktorý nie je cytotoxický sú nasledujúce: 248 Leu (Ctg) na Ala (gCg) a 250 Gly (ggA) na Ala (gCA).
Tieto mutácie sa pripravili miestne riadenou mutagenázou ľudského lgG1 ·. nasledujúcim spôsobom:
Konštantné oblasti oligonukleotidov PCR používané k vzniku lgG1 s mutáciami boli nasledujúce:
SEQ ID NO: 37: Ac gCT CCT TTT AAg CTT Tgg ggT CAA ggC TCA CTA gTC ACA gTC TCC
SEQ ID NO: 38: Bc TgA Cgg TgC CCC CgC gAg TTC Agg
SEQ ID NO: 39: Cc CCT gAA CTC gCg ggg gCA CCg TCA
SEQ ID NO: 40: Dc AAg CTT CCg TCg AAT TCA TTT ACC Cgg AgA CAg
Oligonukleotid Ac obsahuje reštrikčné miesto Hind/Spe. Oligonukeotidy Bc a Cc obsahujú mutácie v polohách 248 a 250. Oligonukleotid Dc obsahuje reštrikčné miesto EcoR1. Oligonukleotidy Ac a Bc sa použili na vytvorenie fragmentu AB za použitia podmienok PCR, ktoré sa špecifikujú sekcii všeobecnej metodológie. Ako templát sa použila klonovaná konštantná oblasť ľudského lgG1 (Reichman. L., Clark, M., Waldman, H., a Winter, G., (1988) Reshaping human antibodies for therapy, Náture 322, 323 až 327). Oligonukleotidy Cc a Dc sa použili na vytvorenie fragmentu CD za použitia rovnakých podmienok PCR a templátu ako v prípade AB. Fragmenty PCR AB a CD sa čistili za použitia čistiaceho systému určeného pre DNA Wizard PCR Preps (Promega). PCR fragmenty AB (5,0 μΙ) a CDc (5,0 μΙ) sa kombinovali s oligonukleotidmi Ac a Dc za vzniku fragmentu ADC, ktorý obsahuje konštantnú oblasť lgG1 s mutáciami. Fragment ADc sa čistil za použitia čistiaceho systému určeného pre DNA Wizard PCR Preps (Promega), štiepili sa reštrikčnými enzýmami Hind III a Ecorl, potom sa ligovali do plzamidu pEE6 štiepeného reštrikčnými enzýmami Hind III a EcoRI, ktorý obsahuje variabilnú oblasť humanizovnaného anti-CD23 ťažkého reťazca.
-339 99 99 9999
9 · 9 9 9 • 9 9 9 9 9
999 999 9 • 99
999 99 99 99
99 9
Konštantná oblasť sa sekvenovala, aby sa potvrdili mutácie. Fragment obsahujúci tieto mutácie sa preniesol do expresného plazmidu pEE6, ktorý obsahuje variabilnú oblasť humanizovaného anti-CD23 ťažkého reťazca.
PCR produkty ľahkého reťazca sa štiepili reštrikčnými enzýmami Hind III a BsiW 1, potom sa klonovali do expresného plazmidu pEE12, ktorý obsahuje konštantnú oblasť ľahkého reťazca ľudského kapa, ako sa opisuje vyššie v texte. Klony sa sekvenovali za použitia fluorescenčného sekvenátora ABI a vybral sa kloň obsahujúci správnu aminokyselinovú sekvenciu pre variabilnú oblasť humanizovaného ľahkého reťazca.
Fragment Bgl II - Sal I obsahujúci humanizovaný ťažký reťazec anti-CD23 z plazmidu pEE6 sa ligoval do miesta Bam H1 - Sal I plazmidu pEE12, ktorý obsahuje humanizovaný ľahký reťazec anti-CD23 za vzniku jedného plazmidu, ktorý obsahuje humanizovaný ťažký reťazec a ľahký reťazec anti-CD23. Variabilná a konštantná oblasť humanizovaného ťažkého a ľahkého reťazca obsiahnuté v konečnom plazmide sa sekvenovali.
Dočasná expresia humanizovaných protilátok
Plazmid s humanizovanými anti-CD23 sa transfekoval do buniek a dočasne sa exprimoval za použitia rovnakého protokolu, ako sa opisuje v prípade chimerických protilátok vyššie v texte. Expresný plazmid s humanizovanými antiCD23 sa transfektoval do buniek COS a dočasne sa exprimoval, ako sa opisuje v prípade dočasnej expresie chimerických anti-CD23.
Koncentrácie chimerických a humanizovaných anti-CD23 protilátok nutných na polovičné maximálne naviazanie na CD23 sa testovali za použitia testu ELISA s sCD23, ktorý sa opisuje vyššie v texte. Absorbancia pri vlnovej dĺžke 405 nm sa vyniesla do grafu proti rozmedziu koncentrácií protilátok za vzniku sigmoidálnej krivky. Absorbancia sa odčítala za použitia zariadenia na odčítanie platní Molecular Devices (Menlo Park, Calif., USA) a softvéru Softmax (Molecular Device Corp.), aby sa stanovila krivka najlepšie vyhovujúca log-logit algorimu, parametre rovnice a korelačný koeficient. Krivka sa opisuje v publikácii Data Analysis and Quality Control of Assays: A Practical Primer, R P Channing Pogers in Practical Immuno Assay, editor Wilfrid R. Butt, publikuje Marcel Dekker, Inc. New York 1984.
• ·· ·· ···· ·· ···· · · · ···
-34• ··· · · · · · · · • · ···· · · ··· ·· ·· ·· ·· ·
Algoritmus zodpovedajúci log-logit rovnici bol založený na metóde LovenbergMarquardtt. Táto metóda sa opisuje v publikácii Numerical Principles in C: The Art of Science computing, William H. Press, Brian P. Flannery, Saul A. Teukolski a William T. Vetterling, publikovanej Cambridge University Press, New York, 1988. Hodnoty pre premennú x vyjadrené v ng/ml sa vypočítali pre nasledujúcu rovnicu:
x = cx [a - y] 1/b [Y-b] keď y + d - c 2 a kde symbol d je hodnota y zodpovedajúca asymptote pri vysokých hodnotách osi x, symbol a je hodnota y zodpovedajúca asymptote pri nízkych hodnotách osi x, symbol c je hodnota x zodpovedajúca stredu medzi a a d, symbol b opisuje ako rýchlo krivka vykonáva prechod od asymptót v strede krivky. V typickom prípade nadobúda hodnotu 1.
Polovičné maximálne naviazanie sCD23 chimerickými anti-CD23 je 16,28 ng/ml (zobrazené na obrázku č. 5). Konštanta pre polovičné maximálne naviazanie humanizovaných anti-CD23 je 15,03 ng/ml (zobrazené na obrázku č. 6). Tieto dáta ukazujú, že humanizované anti-CD23 majú ekvivalentné naviazanie s chimerickými anti-CD23, ktoré majú kompletnú myšiu C11 variabilnú oblasť.
Stabilná expresia
Za použitia amplifikačného systému génu glutamínovej syntetázy získaného od firmy Celtech sa vybrali stabilné bunkové línie exprimujúce humanizované antiCD23. Pracuje sa podľa základného systému, ktorý je opísaný v publikácii Bebbington a ďalší, 1992, Biotechnology 10, 169 až 175. Tento systém opisuje prípravu stabilných bunkových línií zavedením linearizovaných expresných vektorov, ktoré obsahujú eDNA kódujúcu glutamínovú syntetázu škrečkov, ktorú riadi počiatočný promótor SV40 a zostrih SV40 a polyadenylačný signál a eDNA ťažkého a ľahkého reťazca protilátok, do buniek cicavcov elektroporáciou.
-359 99 99 9999 99
9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 9 999 9
999 99 ·· ·· ·· ···
Transfekované bunky sa potom vybrali na základe ich schopnosti rastu v kultivačnom médiu bez glutamínu. Bunky NSO (bunky B myšieho myelómu, ktoré nevylučujú imunoglobín) sa použili na prípravu humanizovaných anti-CD23. Stabilné bunkové línie sa kultivovali v Iscovom upravenom Dulbeccovom kultivačnom médiu (Sigma) s 2mM glutamínom (GIBCO/BRL) a 10% fetálnym teľacím sérom (Hyclone) (Non-Select médiu). Bunkové línie anti-CD23 sa pripravili nasledujúcim spôsobom. Expresný plazmid obsahujúci humanizované anti-CD23 (40 pg) sa linearizoval FsP1 (New England Biolabs), zrážal sa etanolom a resuspendoval sa v sterilnej vode s objemom 50 μΙ. Stanovil sa počet exponenciálne rastúcich buniek NSO. Bunky (107) sa odstredili a premyli vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosforečnanom (PBS). Bunky sa resuspendovali v 950 μΙ sterilného PBS. DNA sa pridala do elektroporačných kyviet (0,4 mm, Bio-Rad), ktoré sa uchovávali na ľade. Kyvety sa umiestnili do elektroporátora Bio-Rad a prebehlo zavedenie dvoma konzekutívnymi pulzmi pri napätí 1500 voltov a 3 pF. Kyveta sa odstránila a umiestnila na ľad. Bunky sa nariedili na koncentráciu 104, 103, 102 buniek v mililitri neselekčného kultivačného média a naniesli sa na platne s 96 jamkami (Costar) v množstve 50 μΙ na jednu jamku. Nasledujúci deň sa do každej jamky pridalo 150 μΙ Iscovho Dulbeccovho upraveného média (Sigma) so 60 μΙ/ml kyseliny glutámovej (Sigma), 60 μΙ/ml asparagínu (Sigma), 7 μΙ/ml každého aenozínu (Sigma), guanozínu (Sigma), cytidínu (Sigma), uridínu (Sigma) a tymidínu (Sigma) a 10% fetálne teľacie sérum (Hyclone) (seiekčné médium). Platne sa vrátili do inkubátora s teplotou 37 °C a nechali sa kultivovať až sa prejavilo podstatné odumieranie buniek a zostalo pár živých kolónií.
Kolónie sa preniesli z konfluentných platní s 96 jamkami do jednej jamky na platni, ktorá obsahuje 24 jamiek. Po niekoľkých dňoch sa konfluentná kultúra použila pri inokulácii kultivačnej fľaše s objemom 25 cm2. K použitému kultivačnému médiu sa pridalo čerstvé seiekčné médium. Kultúry sa udržiavali v koncentrácii 105 až 106 buniek/ml. Stanovila sa rýchlosť špecifickej produkcie (SPR) 144 klonov, aby sa porovnala produkcia protilátok u každého klonu tak, že sa vybral kloň s najvyššou produkciu ako produkčná línia. SPR sa stanovilo tak, že sa vzalo 106 buniek konfluentnej fľaše, bunky sa premyli PBS a potom sa bunky pridali do 10 • ·· ·· fl··· flfl ···· ·· · ···
-36• ··· ··· · · · · · • · · · · · ··· ··· ·· ·· ·· ·· ··· ml čerstvého média a kultivovali sa počas 24 hodín pri teplote 37 °C. Produkcia protilátok sa hodnotila testom ELISA.
U klonov sa najskôr testovala produkcia ľudského IgG za použitia testu ELISA. Platne EIA/RIA (Costar) sa potiahli 100 μΙ kozieho anti-ľudského IgG v koncentrácii 5 μΙ/ml (Jackson Immunosearch Labs #109-001-003) v 35 mM NaHCO3, 15 mM Na2CO3, pH 9,3 a nechali sa stáť cez noc pri teplote 4 °C. Platne i sa trikrát premyli 150 mM NaCl, 50 mM bázou Trizma, 0,1 % (objem.) Tween-20, pH 7,4 (TBS/Tween), blokovali sa počas 1 až 2 hodín pri teplote 22 °C so 100 μΙ na jednu jamku 2% bovinného albumínového séra v TBS/Tween a trikrát sa premyli TBS/Tween. Do jamôk sa pridalo 100 μΙ kontrolného štandardu Campath-1H lgG1 (opisuje sa v publikácii Page, M. J. a Sydenham, M. A. (1991) Biotechnology 9, 64 až 68) (1000 ng/ml až 1 ng/ml) v kontrolnom médiu alebo v supernatantoch vzoriek v troch sadách. Platne sa nechali inkubovať cez noc počas 4 °C. Platne sa premyli päťkrát TBS/Tween a pridalo sa 100 μΙ riedenia 1:5000 kozieho anti-ľudského konjugátu alkalickej fosfatázy (Jackson Immunoresearch Labs #109-055-088) a inkubovali sa počas 2 hodín pri teplote 22 °C alebo cez noc pri teplote 4 °C. Platne sa premyli päťkrát TBS/Tween a pridalo sa 100 μΙ 3 mM pNPP v substrátovom pufri (Sigma 104-0) platne sa odčítali pri vlnovej dĺžke 405 nm na odčítacom zariadení pre mikrotitračné doštičky (Molecular Devices) za použitia 20 minútového kinetického programu. Štandardné krivky a koncentrácie IgG vo vzorke sa vypočítali a hodnoty priamo spracoval program. SPR sa vyjadruje v pg/106 buniek /24 hodín. SPR 144 klonov sa pohybovala v rozmedzí 14 až 0 pg/106 buniek/24 hodín. Klony , exprimujúce aspoň 5 pg/106 buniek/24 hodín sa testovali na naviazanie sCD23 za použitia už opísaného testu ELISA. Chimerické CD23 sa v týchto testoch použili ako • štandardy.
Lýzy komplementu a testy ADCC
Humanizované anti-CD23 značené FITC sa použili na potvrdenie expresie povrchových CD23 na bunkách RPMI 8866 prietokovou cytometriou. Rovnaká bunka sa zafarbila FITC značenými humanizovanými anti-Cdw52 protilátkami
• 00 • · · | ·· • | ···· | 0 | 00 0 | 00 | |
• | • | |||||
• ··· 0 | • | • | • · | 0 | 0 | |
• · | • | • | • · | 0 | 0 | |
00 ·· | ·· | 00 | 00 | 00 |
(hCD52) a zistilo sa, že nevykazujú expresiu CD52. Naopak bunky Wein 133 vykazujú expresiu hCD52, ale nevykazujú expresiu anti-CD23.
Bunky RPMI 8866 sa zafarbili európÍumdietyléntriaminopentaacetátom (Eu/DTPA) zatiaľ čo bunky Wein 133 sa značili samáriumdietyléntriaminopentaacetátom (Sm/DTPA) spôsobom, ktoré sa opisujú v publikácii Blomberg, K, 1993, J. Immunol. Methods. 168, 267 Patel a ďalší, 1995, J. Immunil. Methods, 184, 29). Zmes 1:1 značených buniek Wein 133 a buniek RPMI 8866 sa potom lyžovala buď hCD52 alebo anti-CD23 v prítomnosti NHS, ako zdroja komplementu. Aktivácia komplementu prostredníctvom klasickej dráhy pomocou hCD52 spôsobuje uvoľnenie Sm/DTPA. V prítomnosti anti-CD23 sa neuvoľnilo žiadne Sm/DTPA. Dáta potvrdzujú že iba hCD52 a nie anti-CD23 volávajú lýzu buniek Wein 133. Dáta ďalej potvrdzujú, že dráha komplementu sa môže aktivovať, aby došlo k lýzy buniek. Ako sa predpokladalo, pomocou hCD52 sa neuvoľnilo z buniek RPMI 8866 žiadne Eu/DTPA. Aj keď bunky RPMI 8866 exprimujú CD23, pomocou anti-CD23 sa neuvoľnilo žiadne Eu/DTPA, čo ukazuje, že protilátky nie sú schopné aktivovať komplement.
Lýza zmesi značených buniek Wein 133 a RPMI 8866 v pomere 1:1 pomocou bunkovej toxicity závislej na protilátkach (ADCC) sa uskutočnila buď antiCD23 alebo hCD52 v prítomnosti periférnych krvných jednojadrových buniek (PBMC). Uvoľnenie Sm/DTPA pomocou hCD52 a nie anti-CD23 potvrdilo, že iba anti-CD23 nie sú schopné sprostredkovať ADCC lýzu buniek Wein 133. To nebolo prekvapujúce, pretože bunky Wein 133 neexprimujú CD23. Ani protilátky nespôsobujú uvoľnenie Eu/DTPA. To naznačuje, že aj keď expresia CD23 sa potvrdila u buniek RPMI 8866 prietokovou cytometriou, v súvislosti s anti-CD23 sa nedetekovala žiadna lýza buniek sprostredkovaná ADCC.
Kinetická analýza
Rýchlosť asociácie, disociácie a disociačná rýchlostná konštanta pre naviazanie humanizovaných anti-CD23 na antigén CD23 sa hodnotila biosenzorom Baicore. Čistený rekombinantný CD23 sa imobilizoval na povrchu senzora CM5. Karboxylové skupiny na povrchu dextránu sa aktivovali 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbimidom (EDCO/N-hydroxysukcínimid (NHS)). Po aktivácii prešli
• ·· • · · | • · • | • | ···· • | ·· | ·· | |
• | • | |||||
• ··· | • · | • | • · | • | • | |
• · | • | • | • · | • | • | |
·· ·· | ·· | ·· | ·· | ·· |
rekombinantné CD23 cez povrch, aby iniciovali imobilizáciu. Potom sa pridal etanolamín, aby sa deaktivovali zvyšné aktívne skupiny. Humanizované anti-CD23 riedené v pufri HBS prešli cez povrch senzora. Naviazanie anti-CD23 na imobilizovaný CD23 sa monitoroval v reálnom čase, aby sa odhadla rýchlosť asociácie (M1 s'1). Tiež sa monitorovala disociácia CD23 a anti-CD23 komplexu v pufri, aby sa odhadla rýchlosť disociácie (s1). Disociačná konštanta (nM) sa vypočítala s disociačnou a asociačnou rýchlosťou. V prípade 6-tich vsádzok antiCD23 dáta ukazujú asociačnú rýchlosť v rozmedzí 1,5 až 1,85x106 M1s1 a disociačná rýchlosť 1 až 2x105 s1. Zistilo sa, že disociačná konštanta v prípade protilátok anti-CD23 je v rozmedzí 8 až 12 pM. Stanovilo sa, že afinitná konštanta je približne 9x1010 Ka.moľ1.
-39• ·· ·· ···· tt tttt tt t ttt ··· ttt t· t tt· «t · ttt t t t tttt tt ttt tt tt tt tt t
Zoznam sekvencii (2) Informácie o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca: Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 3 ..413 (D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:
aa get tta cag tta ctc age aca cag gac ctc acc atg gat ttt ggg 47
Ala Leu Gin Leu Leu Ser Thr Gin Asp Leu Thr Het Asp Phe Gly
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
ctg | att | ttt | ttt | , att | gtt | ctt | tta | aaa | ggg | gtc | cag | agt | gaa | gtg | aag | 95 |
Leu | íle | Phe | Phe | , íle | Val | Leu | Leu | Lys | Gly | val | Gin | Ser | Glu | Val | Lys | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
ctt | gag | gag | tet | gga | gga | ggc | ttg | gtg | caa | cct | gga | gga | tcc | atg | aaa | 143 |
Leu | Glu | Glu | Ser | Gly Gly | Gly | Leu | Val | Gin | Pro | Gly | Gly | Ser | Met | Lys | ||
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
ctc | tcc | tgt | gta | gcc | tet | gga | ttt | act | ttc | agt | ggc | tac | tgg | atg | tet | 191 |
Leu | Ser | Cys | Val | Ala | Ser | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser | Gly | Tyr | Trp | Met | Ser | |
SO | 55 | 60 | ||||||||||||||
tgg | gtc | ege | cag | tet | cca | gag | aag | ggg | ctt | gag | tgg | gtt | get | gaa | att | 239 |
Trp | Val | Arg | Gin | Ser | Pro | Glu | Lys | Gly | Leu | Glu | Trp | Val | Ala | Glu | íle | |
65 | 70 | 75 |
-40• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ··· • ··· · · · · · · · • · · · · · ··
999 99 99 99 99 9
aga ttg Arg Leu 80 | aaa tet gat | aat tat gca aca cat tat gcg gag tet gtg | aaa Lys 95 | 287 | ||||||||||||
Lys | Ser Asp | Asn Tyr 85 | Ala | Thr | His Tyr 90 | Ala | Glu | Ser | Val | |||||||
999 | aag | ttc | acc | atc | tca | aga | gat | gat | tcc | aaa | agt | cgt | ctc | tac | ctg | 335 |
Gly | Lys | Phe | Thr | íle | Ser | Arg | Asp | Asp | Ser | Lys | Ser | Arg | Leu | Tyr | Leu | |
100 | 105 | 11® | ||||||||||||||
caa | atg | aac | age | tta | aga | get | gaa | gac | agt | gga | gtt | tat | tac | tgt | aca | 383 |
Gin | Met | Asn | Ser | Leu | Arg | Ala | Glu | Asp | Ser | Gly | Val | Tyr | Tyr | Cys | Thr | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
gat | ttc | ata | gac | tgg | ggc | caa | 999 | aca | cta | gt | 415 | |||||
Asp | Phe | íle | Asp | Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Leu | |||||||
130 | 135 |
(2) Informácie o SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 437 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 3 ..437 (D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:
aa get tta cag tta ctc age aca cag gac ctc acc atg agg ttc tet 47
Ala Leu Gin Leu Leu Ser Thr Gin Asp Leu Thr Met Arg Phe Ser 10
-41 • ·· ·· BBBB BB ·
BB B B B B · B B BB • · · · · · ··· • ··· ··· BBBB B • · BBBB BBB
BBB BB BB BB BB BBB
gtt cag | ttt ctg ggg gtg ctt atg ttc tgg atc tet gga gtc agt | ggg Gly | 95 | |||||||||||||
Val | Gin | Phe Leu | Gly Val Leu Met Phe Trp | íle Ser | Gly | Val | Ser 30 | |||||||||
20 | 25 | |||||||||||||||
gat | att | gtg | ata | acc | cag | gat | gaa | ctc | tcc | aat | cct | gtc | act | tet | gga | 143 |
Asp | íle | Val | íle | Thr | Gin | Asp | Glu | Leu | Ser | Asn | Pro | Val | Thr | Ser | Gly | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
gaa | tca | gtt | tcc | atc | tcc | tgc | agg | tet | agt | aag | agt | ctc | ctg | tat | aag | 191 |
Glu | Ser | Val | Ser | íle | Ser | Cys | Arg | Ser | Ser | Lys | Ser | Leu | Leu | Tyr | Lys | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
gat | 999 | aag | aca | tac | ttg | aat | tgg | ttt | ctg | cag | aga | cca | gga | caa | tet | 239 |
Asp | Gly | Lys | Thr | Tyr | Leu | Asn | Trp | Phe | Leu | Gin | Arg | Pro | Gly | Gin | Ser | |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
cct | cag | ctc | ctg | atg | tat | ttg | atg | tcc | acc | cgt | gca | tca | gga | gtc | tca | 287 |
Pro | Gin | Leu | Leu | Met | Tyr | Leu | Met | Ser | Thr | Arg | Ala | Ser | Gly | Val | Ser | |
80 | 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
jgac | cgg | ttt | agt | ggc | agt | ggg | tca | ggc | aca | gat | ttc | acc | ctg | gaa | atc | 335 |
Asp | Arg | Phe | Ser | Gly | Ser | Gly | Ser | Gly | Thr | Asp | Phe | Thr | Leu | Glu | íle | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
agt | aga | gtg | aag | get | gag | gat | gtg | ggt | gtg | tat | tac | tgt | caa | caa | ctt | 383 |
Ser | Arg | Val | Lys | Ala | Glu | Asp | Val | Gly | Val | Tyr | Tyr | Cys | Gin | Gin | Leu | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
gta | gag | tat | cca | ttc | acg | ttc | ggc | tcg | ggg | aca | aag | ttg | gaa | ata | aaa | 431 |
Val | Glu | Tyr | Pro | Phe | Thr | Phe | Gly | Ser | Gly | Thr | Lys | Leu | Glu | íle | Lys | |
130 | 135 | 140 |
cgt acg Arg Thr
145
-42• ·· ······ ·· ·· · · ·· · ··· • ··· · · · ···· · • · · · · · ··· ··· ·· ·· ·· ·· ··· (2) Informácie o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 16 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(ii) Druh molekuly: protein (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 15 10 15 (2) Informácie o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 48 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..48 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:
cgc tcg agt aag agt ctc ctg tat aag gat ggg aag aca tac ttg aat 48
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
10 15 (2) Informácie o SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 7 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: protein
4 44 44 | 4444 4 | 44 4 4 | 44 | |
4 4 4 4 | 4 | |||
4 444 · 4 | 4 | 4 4 | 4 4 | |
4 4 · | • | 4 4 | 4 4 | |
44 44 44 | 44 | 44 | 44 |
(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:
Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 21 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(A) Názov/kľúč: CDS (C) Pozícia: 3 ..413 (D) lné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:
ttg atg tcc acc cgg gca tca Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser
5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 9 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia: lineárna (II) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:
(A) Názov/kľúč:
(B) Pozícia:
(D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 7:
-44• 99 ·· ···· 99 · ·· · · 9 9 φ 99 99 ••9 999 999 • 999 999 9999 9 • 9 9999 999
999 99 99 99 99 999
Gin Gin Leu Val Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..27 (D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:
caa cag ctg gta gag tat cca ttc acg 27
Gin Gin Leu Val Glu Tyr Pro Phe Thr
5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 5 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: protein (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:
Gly Tyr Trp Met Ser 1 5
-45• ·· ·· ···· ·· · ·· · · ·· · ···· ······ ··· • ··· ··· ···· · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ··· (2) Informácie o SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 15 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..15 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:
ggc tac tgg atg tcc 3-5
Gly Tyr Trp Met Ser
5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 19 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:
(D) iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 11:
Glu íle Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 (2) Informácie o SEQ ID NO: 12:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 57 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
·· ·· ···· ·· • · · ····
-46• ··· ··· ···· · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ··· (D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..57 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:
gaa att aga ttg aaa tct gat aat tat gca aca cat tat gcg gag tct 48
Glu íle Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
5 10 15 gtg aag ggg 57
Val Lys Gly (2) Informácie o SEQ ID NO: 15:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 19 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:
(D) iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: opis umelej sekvencie: syntetická sekvencia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 15:
Met Gly Trp Ser Cys íle íle Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 (2) Informácie o SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 19 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina
-Μ • ·· ······ ·· · ···· ·· · ···· ······ ··· • ··· ··· ···· • · · · · · ··· ··· ·· ·· ·· ·· ··· (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: opis umelej sekvencie: syntetická sekveneia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 16:
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gin Ser 15 10 15
Ala Gin Ala (2) Informácie o SEQ ID NO: 17:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 348 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: variabilná oblasť ľahkého reťazca humanizovaných protilátok anti-CD23 (ix) Znaky:
(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..348 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 17:
gat att gtg atg act cag tet cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48
Asp íle Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
10 15
-48·· « · ··· • · ···· ·· ···· • · · ·· ··
gag ccg gcc tcc atc | tcc Ser | tgt Cys | ege tcg agt aag agt ctc ctg tat Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr | aag Lys | 96 | |||||||||||
Glu Pro Ala Ser | íle | |||||||||||||||
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
gat | ggg | aag | aca | tac | ttg | aat | tgg | tac | ctg | cag | aag | cca | ggg | cag | tet | 144 |
Asp | Gly | Lys | Thr | Tyr | Leu | Asn | Trp | Tyr | Leu | Gin | Lys | Pro | Gly | Gin | Ser | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
cca | cag | cfcc | ctg | atc | tat | ttg | atg | tcc | acc | cgg | gca | tca | ggg | gtc | cct | 192 |
Pro | Gin | Leu | Leu | íle | Tyr | Leu | Met | Ser | Thr | Arg | Ala | Ser | Gly | Val | Pro | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
gac | agg | ttc | agt | ggc | agt | gga | tca | ggc | aca | gat | ttt | aca | ctg | aaa | atc | 240 |
Asp | Arg | Phe | Ser | Gly | Ser | Gly | Ser | Gly | Thr | Asp | Phe | Thr | Leu | Lys | íle | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
age | aga | gtg | gag | get | gag | gat | gtt | ggg | gtt | tat | tac | tgt | caa | cag | ctg | 288 |
Ser | Arg | Val | Glu | Ala | Glu | Asp | Val | Gly | Val | Tyr | Tyr | Cys | Gin | Gin | Leu | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
gta | gag | tat | cca | ttc | acg | ttc | ggc | caa | ggg | acc | aag | gtg | gag | atc | aaa | 336 |
Val | Glu | Tyr | Pro | Phe | Thr | Phe | Gly | Gin | Gly | Thr | Lys | Val | Glu | íle | Lys |
100 105 110 cgt acg gtg get 348
Arg Thr Val Ala
115 (2) Informácie o SEQ ID NO: 18:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 1335 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
·· ···· ·· ···· ·· · · · ·· ······ t 4 · • ··· ··· ···· · • ···!»··· ··· ·· ·· ·· «· «··
-49(D) Iné informácie: variabilná oblasť ťažkého reťazca humanizovaných protilátok anti-CD23 (ix) Znaky:
(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..1335 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 18:
gag Glu 1 | gtg cag ctg | gtg gag tet ggg | gga ggc ttg gta aag ccc ggg ggg | 48 | ||||||||||||
Val | Gin Leu | Val 5 | Glu | Ser Gly | Gly | Gly 10 | Leu | Val | Lys | Pro | Gly 15 | Gly | ||||
tcc | ctt | aga | ctc | tcc | tgt | gca | get | age | gga | ttc | act | ttc | agt | ggc | tac | 96 |
Ser | Leu | Arg | Leu | Ser | cys | Ala | Ala | Ser | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser | Gly | Tyr | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
tgg | atg | tcc | tgg | gtc | ege | cag | get | cca | ggg | aag | ggg | ctc | gag | tgg | gtt | 144 |
Trp | Met | Ser | Trp | Val | Arg | Gin | Ala | Pro | Gly | Lys | Gly | Leu | Glu | Trp | Val | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
get | gaa | att | aga | ttg | aaa | tet | gat | aat | tat | gca | aca | cat | tat | gcg | gag | 192 |
Ala | Glu | íle | Arg | Leu | Lys | Ser | Asp | Asn | Tyr | Ala | Thr | His | Tyr | Ala | Glu | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
tet | gtg | aag | ggg | aaa | ttc | acc | atc | tca | aga | gat | gat | tca | aaa | tet | aga | 240 |
Ser | Val | Lys | Gly | Lys | Phe | Thr | íle | Ser | Arg | Asp | Asp | Ser | Lys | Ser | Arg | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
ctg | tat | ctg | caa | atg | aac | age | ctg | aaa | acc | gag | gac | aca | gcc | gtg | tat | 288 |
Leu | Tyr | Leu | Gin | Met | Asn | Ser | Leu | Lys | Thr | Glu | Asp | Thr | Ala | Val | Tyr | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
tac | tgt | aca | gat | ttc | ata | gac | tgg | ggc | cag | gga | aca | cta | gtc | acc | gtc | 336 |
Tyr | Cys | Thr | Asp | Phe | íle | Asp | Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Leu | Val | Thr | Val | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
tcc | tca | gcc | tcc | acc | aag | ggc | cca | tcg | gtc | ttc | ccc | ctg | gca | ccc | tcc | 384 |
Ser | Ser | Ala | Ser | Thr | Lys | Gly | Pro | Ser | Val | Phe | Pro | Leu | Ala | Pro | Ser |
lis 120
125 ····
-50• ·· • 9 9 9 • 99 • 999
9
999 99
9 9
9 9
9 9
9 9 9
99
9
9
9 9
9
9
tcc aag | agc Ser | acc tct ggg ggc | aca Thr | gcg gcc Ala Ala | ctg Leu | ggc Gly 140 | tgc Cys | ctg Leu | gtc Val | aag Lys | 432 | |||||
Ser | Lys 130 | Thr | Ser | Gly | Gly 135 | |||||||||||
gac | tac | ttc | CCC | gaa | ccg | gtg | acg | gtg | tcg | tgg | aac | tca | ggc | gcc | ctg | 480 |
Asp | Tyr | Phe | Pro | Glu | Pro | Val | Thr | Val | Ser | Trp | Asn | Ser | Gly | Ala | Leu | |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
acc | agc | ggc | gtg | cac | acc | ttc | ccg | get | gtc | cta | cag | tcc | tca | gga | ctc | 528 |
Thr | Ser | Gly | Val | His | Thr | Phe | Pro | Ala | Val | Leu | Gin | Ser | Ser | Gly | Leu | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
tac | tcc | ctc | agc | agc | gtg | gtg | acc | gtg | CCC | tcc | agc | agc | ttg | ggc | acc | 576 |
Tyr | Ser | Leu | Ser | Ser | Val | Val | Thr | Val | Pro | Ser | Ser | Ser | Leu | Gly | Thr | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
cag | acc | tac | atc | tgc | aac | gtg | aat | cac | aag | CCC | agc | aac | acc | aag | gtg | 624 |
Gin | Thr | Tyr | Zle | Cys | Asn | Val | Asn | His | Lys | Pro | Ser | Asn | Thr | Lys | Val | |
195 | 200 | 295 | ||||||||||||||
gac | aag | aaa | gtg | gag | CCC | aaa | tct | tgt | gac | aaa | act | cac | aca | tgc | cca | 672 |
Asp | Lys | Lys | Val | Glu | Pro | Lys | Ser | Cys | Asp | Lys | Thr | His | Thr | Cys | Pro | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
ccg | tgc | cca | gca | cct | gaa | ctc | gcg | ggg | gca | ccg | tca | gtc | ttc | ctc | ttc | 720 |
Pro | Cys | Pro | Ala | Pro | Glu | Leu | Ala | Gly | Ala | Pro | Ser | Val | Phe | Leu | Phe | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
CCC | cca | aaa | CCC | aag | gac | acc | ctc | atg | atc | tcc | cgg | acc | cct | gag | gtc | 768 |
Pro | Pro | Lys | Pro | Lys | Asp | Thr | Leu | Met | íle | Ser | Arg | Thr | Pro | Glu | Val | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
aca | tgc | gtg | gtg | gtg | gac | gtg | agc | cac | gaa | gac | cct | gag | gtc | aag | ttc’ | 816 |
Thr | Cys | Val | Val | Val | Asp | Val | Ser | His | Glu | Asp | Pro | Glu | Val | Lys | Phe |
260
265
270
-51 ···· • ·· ·· ·· · · · · · ··· • 1 · ·«· · · • e·· · · · · · · 9 • ······· *·· ·· ·· ·· ·· ·
aac tgg tac gtg gac | ggc Gly | gtg Val | gag gtg cat aat gcc aag aca aag | ccg Pro | 864 | |||||||||||
Asn | Trp | Tyr Val 275 | Asp | Glu 280 | Val | His | Asn Ala | Lys Thr 285 | Lys | |||||||
cgg | gag | gag | cag | tac | aac | agc | acg | tac | cgt | gtg | gtc | agc | gtc | ctc | acc | 912 |
Arg | Glu | Glu | Gin | Tyr | Asn | Ser | Thr | Tyr | Arg | Val | Val | Ser | Val | Leu | Thr | |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
gtc | ctg | cac | cag | gac | tgg | ctg | aat | ggc | aag | gag | tac | aag | tgc | aag | gtc | 960 |
Val | Leu | His | Gin | Asp | Trp | Leu | Asn | Gly | Lys | Glu | Tyr | Lys | Cys | Lys | Val | |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
tcc | aac | aaa | gcc | ctc | cca | gcc | CCC | atc | gag | aaa | acc | atc | tcc | aaa | gcc | 1008 |
Ser | Asn | Lys | Ala | Leu | Pro | Ala | Pro | íle | Glu | Lys | Thr | íle | Ser | Lys | Ala | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
aaa | ggg | cag | CCC | ega | gaa | cca | cag | gtg | tac | acc | ctg | ccc | cca | tcc | cgg | 1056 |
Lys | Gly | Gin | Pro | Arg | Glu | Pro | Gin | Val | Tyr | Thr | Leu | Pro | Pro | ser | Arg | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
gat | gag | ctg | acc | aag | aac | cag | gtc | agc | ctg | acc | tgc | ctg | gtc | aaa | ggc | 1104 |
Asp | Glu | Leu | Thr | Lys | Asn | Gin | Val | Ser | Leu | Thr | Cys | Leu | Val | Lys | Gly | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
ttc | tat | CCC | agc | gac | atc | gcc | gtg | gag | tgg | gag | agc | aat | ggg | cag | ccg | 1152 |
Phe | Tyr | Pro | Ser | Asp | íle | Ala | Val | Glu | Trp | Glu | Ser | Asn | Gly | Gin | Pro | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
gag | aac | aac | tac | aag | acc | acg | cct | CCC | gtg | ctg | gac | tcc | gac | ggc | tcc | 1200 |
Glu | Asn | Asn | Tyr | Lys | Thr | Thr | Pro | Pro | Val | Leu | Asp | Ser | Asp | Gly | Ser | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
ttc | ttc | ctc | tac | agc | aag | ctc | acc | gtg | gac | aag | agc | agg | tgg | cag | cag | 1248 |
Phe | Phe | Leu | Tyr | Ser | Lys | Leu | Thr | Val | Asp | Lys | Ser | Arg | Trp | Gin | Gin |
405 410
415 ·· ·· 4444
-52• 4 ·· · · · · • · · » · r · • 44 4 4 · · é 4
4 · f 4 4 4
ggg aac gtc | ttc tca tgc tcc | gtg atg cat gag get | ctg cac aac cac | 1296 | ||||||||||||
Gly | Asn | Val | Phe Ser 420 | Cys | Ser | Val | Met 425 | His | Glu | Ala | Leu His 430 | Asn | His | |||
tac | acg | cag | aag | agc | ctc | tcc | ctg | tet | ccg | ggt | aaa | tga | 1335 | |||
Tyr | Thr | Gin | Lys | Ser | Leu | Ser | Leu | Ser | Pro | Gly | Lys | |||||
435 | 440 |
(2) Informácie o SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 57 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 19:
gatgaagctt tacagttact cagcacacag gacctcacca tggattttgg gctgatt (2) Informácie o SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 25 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) iné informácie: oligonukleotid
-53• ·· ·· ···· ·· • B · B · · B · B · (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 20:
gatggactag tgtcccttgg cccca (2) Informácie o SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 57 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 21:
gatgaagctt tacagttact cagcacacag gacctcacca tgaggttctc tgttcag (2) Informácie o SEQ ID NO: 22:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 28 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 22:
gatgcgtacg tytkatytcc avcttkgt • t ·· ···· ·· • · · · ····
-54(2) Informácie o SEQ ID NO: 23:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 23:
gatcaagctt ctctacagtt actgagcaca 30 (2) Informácie o SEQ ID NO: 24:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 63 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 24:
aatcaagtat gtcttcccat ccttatacag gagactctta ctcgagcgac aggagatgga 60 „nr, 63 ggc (2) Informácie o SEQ ID NO: 25:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 63 párov báz
-54• ·· ·· ···· 99
9 9 99 9 999
999 999 9999 9 • · 9999 99 9 • 99 99 99 99 99 ··· (2) Informácie o SEQ ID NO: 23:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 23:
gatcaagctt ctctacagtt actgagcaca 30 (2) Informácie o SEQ ID NO: 24:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 63 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 24:
aatcaagtat gtcttcccat ccttatacag gagactctta ctcgagcgac aggagatgga 60 „„„ 63 ggc (2) Informácie o SEQ ID NO: 25:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 63 párov báz
-55• ·· • β · · • · · • ··· • · ··· ·· ·· ···· • · · í · · • 6 · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · : t ·· · (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 25:
cgctcgagta agagtctcct gtataaggat gggaagacat acttgaattg gtacctgcag 60 aag 63 (2) Informácie o SEQ ID NO: 26:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 36 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 26:
tgatgcccgg gtggacatca aatagatcag gagctg (2) Informácie o SEQ ID NO: 27:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 36 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
• ·· ·· • · · · · | ·»·· • | ·· • 9 | • · |
• ··· · · · • · · · ·· ·· ·· | • · • · ·· | 9 9 9 9 99 | ·· |
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 27:
ttgatgtcca cccgggcatc aggggtccct gacagg 36 (2) Informácie o SEQ ID NO: 28:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 84 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 28:
agccacctga cgtttgatct ccaccttggt cccttggccg aacgtgaatg gatactctac 60 cagctgttga cagtaataaa cccc 84 (2) Informácie o SEQ ID NO: 29:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 60 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia
-57• ·· ·· ···· ·· · ···· ·· · · · ·· • · · ··· ··· • ··· ··· ···· · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ··· (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 29:
acacgaagct tcaccatggc ttgggtgtgg accttgctat tcctgatggc ggccgcccaa 60 (2) Informácie o SEQ ID NO: 30:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 66 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 30:
ctttaccaag cctcccccag actccaccag ctgcacctct gcttgggcac tttgggcggc 60 cgccat (2) Informácie o SEQ ID NO: 31:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 60 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 31:
-58ttggtaaagc ccggggggtc ccttagactc tcctgtgcag ctagcggatt cacťttcagt 60 • ·· ·· ···· ·· · ······ ····« ······ e · · • ··· · · · · · · o · • ········ ··· ·· ·· ·· ·· ··· (2) Informácie o SEQ ID NO: 32:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 60 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 32:
ccccttccct ggagcctggc ggacccagga catccagtag ccactgaaag tgaatccgct 60 (2) Informácie o SEQ ID NO: 34:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 60 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvenciaO (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 34:
atcatctctt gagatggtga atttcccctt cacagactcc gcataatgtg ttgcataatt 60 (2) Informácie o SEQ ID NO: 35:
(i) Charakteristika sekvencie:
• ·· • · · | ·· • · | ···· • | ·· • · | ·· |
• ··· | • · · | • · | • · | |
• · | • · | • · | • · | |
·· ·· | ·· | ·· | ·· | ·· |
(A) Dĺžka: 66 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 35:
atctcaagag atgattcaaa atctagactg tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag 60 gacaca 66 (2) Informácie o SEQ ID NO: 36:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 69 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 36:
ggtgactagt gttccctggc cccagtctat gaaatctgta cagtaataca cggctgtgtc 60 ctcggtttt 69 (2) Informácie o SEQ ID NO: 37:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 48 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina
• ·· • · · | ·· | ···· • | ·· • · | ·· | |
• | • | ||||
• ··· | • · | • | • · | • · | |
• · ·· ·· | • ·· | • | • · ·· | • · ·· | ·· |
(C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 37:
gctgctcctt ttaagctttg gggtcaaggc tcactagtca cagtctcc 48 (2) Informácie o SEQ ID NO: 38:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 38:
tgacggtgcc cccgcgagtt cagg 24 (2) Informácie o SEQ ID NO: 39:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
• ·· • · · | ·· • | • | ···· • | ·· • · | • · |
• ··· · | • | • | • · | • · | |
• · | • | • | • · | • · | |
·· ·· | ·· | ·· | ·· | ·· |
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 39:
cctgaactcg cgggggcacc gtca (2) Informácie o SEQ ID NO: 40:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 33 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 40:
aagcttccgt cgaattcatt tacccggaga cag 33 (2) Informácie o SEQ ID NO: 41:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 37 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: primér (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 41:
• ·· • · · | ·· • | • | ···· • | ·· • · | ·· |
• ··· · | • | • | • · | • · | |
• · ·· ·· | • ·· | • | • · ·· | • · ·· | ·· |
actagtcgac atgaagtttc cttctcaact tctgctc 37 (2) Informácie o SEQ ID NO: 42:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 42:
Thr Lys Leu Glu Xle Lys Arg Thr 1 5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 43:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: syntetická sekvencia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 43:
Thr Lys Val Glu íle Lys Arg Thr
• ·· • · · | ·· | 9999 9 | ·· • · | ·· | |
• | • | ||||
• ··· · | • | • | 9 9 | • · | |
• · • · · · | • • · | • | 9 · ·· | • · ·· | • · |
(2) Informácie o SEQ ID NO: 44:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: syntetická sekveneia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 44:
Thr Lys Leu Glu íle Arg Arg Thr 1 5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 45:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 8 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekveneia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: syntetická sekveneia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 45:
Thr Lys Val Glu íle Arg Arg Thr 1 5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 46:
(i) Charakteristika sekvencie:
·· ···· ·· ·· · · ·· · ··· • · · ··· · · • ··· · · · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·
-64(A) Dĺžka: 415 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 46:
actagtgtcc cttggcccca gtctatgaaa tctgtacagt aataaactcc actgtcttca 60 gctcttaagc tgttcatttg caggtagaga cgacttttgg aatcatctct tgagatggtg 120 aacttccctt tcacagactc cgcataatgt gttgcataat tatcagattt caatctaatt 180 tcagcaaccc actcaagccc cttctctgga gactggcgga cccaagacat ccagtagcca 240 ctgaaagtaa atccagaggc tacacaggag agtttcatgg atcctccagg ttgcaccaag 300 cctcctccag actcctcaag cttcacttca ctctggaccc cttttaaaag aacaataaaa 360 aaaatcagcc caaaatccat ggtgaggtcc tgtgtgctga gtaactgtaa agctt 415 (2) Informácie o SEQ ID NO: 47:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 437 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 47:
cgtacgtttt atttccaact ttgtccccga gccgaacgtg aatggatact ctacaagttg 60 ttgacagtaa tacacaccca catcctcagc cttcactcta ctgatttcca gggtgaaatc 120 tgtgcctgac ccactgccac taaaccggtc tgagactcct gatgcacggg tggacatcaa 180 atacatcagg agctgaggag attgtcctgg tctctgcaga aaccaattca agtatgtctt 240 cccatcctta tacaggagac tcttactaga cctgcaggag atggaaactg attctccaga 300 agtgacagga ttggagagtt catcctgggt tatcacaata tccccactga ctccagagat 360 ccagaacata agcaccccca gaaactgaac agagaacctc atggtgaggt ectgtgtgct 420 gagtaactgt aaagctt
437 ·· ····
-65·· ·· ···· • · · · · • · · · · ·· · · · · • · · · · ·· ·· ·· (2) Informácie o SEQ ID NO: 48:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 348 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: variabilná oblasť ľahkého reťazca humanizovaných protilátok anti-CD23 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 48:
agccaccgta cagctgttga aaaatctgtg catcaaatag tgtcttccca tccaggggtg cgtttgatct cagi. aataaa cctgatccac atcaggagct tccttataca acgggcaggg ccaccttggt ccccaacatc tgccactgaa gtggagactg ggagactctt agagtggaga cccttggccg ctcagcctcc cctgtcaggg ccctggcttc actcgagcga ctgagtcatc aacgtgaatg actctgctga acccctgatg tgcaggtacc caggagatgg acaatatc gatactctac 60 ttttcagtgt 120 cccgggtgga 180 aattcaagta 240 aggccggctc 300
348 (2) Informácie o SEQ ID NO: 49:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 1335 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: DNA (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: variabilná oblasť ťažkého reťazca humanizovaných protilátok anti-CD23
-66• ·· ·· ···· ·· ···· · · · · · · ··· ··· ·· • ··· · · · · · · · • ······· ··· ·· ·· ·· ·· · (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 49:
tcatttaccc | ggagacaggg | agaggctctt | ctgcgtgtag | tggttgtgca | gagcctcatg | 60 |
catcacggag | catgagaaga | cgttcccctg | ctgccacctg | ctcttgtcca | cggtgagctt | 120 |
gctgtagagg | aagaaggagc | cgtcggagtc | cagcacggga | ggcgtggtct | tgtagttgtt | 180 |
ctccggctgc | ccattgctct | cccactccac | ggcgatgtcg | ctgggataga | agcctttgac | 240 |
caggcaggtc | aggctgacct | ggttcttggt | cagctcatcc | cgggatgggg | gcagggtgta | 300 |
cacctgtggt | tctcggggct | gccctttggc | tttggagatg | gttttctcga | tgggggctgg | 360 |
gagggctttg | ttggagacct | tgcacttgta | ctccttgcca | ttcagccagt | cctggtgcag | 420 |
gacggtgagg | acgctgacca | cacggtacgt | gctgttgtac | tgctcctccc | gcggctttgt | 480 |
cttggcatta | tgcacctcca | cgccgtccac | gtaccagttg | aacttgacct | cagggtcttc | 540 |
gtggctcacg | tccaccacca | cgcatgtgac | ctcaggggtc | cgggagatca | tgagggtgtc | 600 |
cttgggtttt | ggggggaaga | ggaagactga | cggtgccccc | gcgagttcag | gtgctgggca | 660 |
cggtgggcat | gtgtgagttt | tgtcacaaga | tttgggctcc | actttcttgt | ccaccttggt | 720 |
gttgctgggc | ttgtgattca | cgttgcagat | gtaggtctgg | gtgcccaagc | tgctggaggg | 780 |
cacggtcacc | acgctgctga | gggagtagag | tcctgaggac | tgtaggacag | ccgggaaggt | 840 |
gtgcacgccg | ctggtcaggg | cgcctgagtt | ccacgacacc | gtcaccggtt | cggggaagta | 900 |
gtccttgacc | aggcagccca | gggecgctgt | gcccccagag | gtgctcttgg | aggagggtgc | 960 |
cagggggaag | accgatgggc | ccttggtgga | ggctgaggag | acggtgacta | gtgttccctg | 1020 |
gccccagtct | atgaaatctg | tacagtaata | cacggctgtg | tcctcggttt | tcaggctgtt | 1080 |
catttgcaga | tacagtctag | attttgaatc | atctcttgag | atggtgaatt | tccccttcac | 1140 |
agactccgca | taatgtgttg | cataattatc | agatttcaat | ctaatttcag | caacccactc | 1200 |
gagccccttc | cctggagcct | ggcggaccca | ggacatccag | tagccactga | aagtgaatcc | 1260 |
gctagctgca | caggagagtc | taagggaccc | cccgggcttt | accaagcctc | ccgcagactc | 1320 |
caccagctgc | acctc | 1335 |
(2) Informácie o SEQ ID NO: 50:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 137 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 50:
·· ···· • · • 9
Ala 1 Íle | Leu Gin Leu Leu Ser Thr Gin Asp Leu Thr Met Asp Phe Gly Leu | |||||||||||||||
Phe | Phe | Zle 20 | 5 Val | 10 | 15 Lys Leu | |||||||||||
Leu | Leu | Lys | Gly 25 | Val | Gin | Ser Glu | Val 30 | |||||||||
• | Glu | Glu | Ser | Gly | Gly Gly | Leu | Val | Gin | Pro | Gly | Gly | Ser | Met | Lys | Leu | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
Ser | Cys | Val | Ala | Ser | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser | Gly | Tyr | Trp | Met | Ser | Trp | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
Val | Arg | Gin | Ser | Pro | Glu | Lys | Gly | Leu | Glu | Trp | Val | Ala | Glu | Zle | Arg | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
Leu | Lys | Ser | Asp | Asn | Tyr | Ala | Thr | His | Tyr | Ala | Glu | Ser | Val | Lys | Gly | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
Lys | Phe | Thr | íle | Ser | Arg | Asp | Asp | Ser | Lys | Ser | Arg | Leu | Tyr | Leu | Gin | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
Met | Asn | Ser | Leu | Arg | Ala | Glu | Asp | Ser | Gly | Val | Tyr | Tyr | Cys | Thr | Asp |
115 120 125
Phe íle Asp Trp Gly Gin Gly Thr Leu 130 135 (2) Informácie o SEQ ID NO: 51:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 145 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: Mus musculus (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 51:
Ala Leu Gin Leu Leu Ser Thr Gin Asp Leu Thr Met Arg Phe Ser Val • ·· 44 44·· ·· ·· · · · 4 4 ··· • · · ··· ·· • ··· · 4 4 · · 4 · • · ···· ·· ··· ·· 44 44 «· ·
-68Gln Phe Leu Gly Val Leu Met Phe Trp íle Ser Gly Val Ser Gly Asp 20 25 30 íle Val íle Thr Gin Asp Glu Leu Ser Asn Pro Val Thr Ser Gly Glu
40 45
Pro Gin Leu Leu íle Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro
55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys íle
70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu
90 95
Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys 100 105 no
Arg Thr Val Ala
115 (2) Informácie o SEQ ID NO: 53:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 444 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh reťazca:
(D) Topológia:
(ii) Druh molekuly: proteín (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: umelá sekvencia (ix) Znaky:
(D) Iné informácie: opis umelej sekvencie: variabilná oblasť ťažkého reťazca humanizovaných protilátok anti-CD23 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 53:
• · · ·· • · • I ·· ···!
• fl • · • · · · · » · · fl ·· ··
69Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Glu íle Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr íle Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr. Ala Val Tyr
90 95
Tyr Cys Thr Asp Phe íle Asp Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190
Gin Thr Tyr íle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 ·· ····
-70• ·· ·· · · • · · • ··· • · ··· ·· • · · · • · · · • · · · · • · · · · · ··
Asp Lys Lys Val Glu 210
Pro Cys Pro Ala Pro 225
Pro Pro Lys Pro Lys 245
Thr Cys Val Val Val 260
Asn Trp Tyr Val Asp 275
Arg Glu Glu Gin Tyr 290
Val Leu His Gin Asp 305
Ser Asn Lys Ala Leu 325
Lys Gly Gin Pro Arg 340
Asp Glu Leu Thr Lys 355
Phe Tyr Pro Ser Asp 370
Pro Lys Ser cys Asp Lys 215
Glu Leu Ala Gly Ala Pro 230 235
Asp Thr Leu Het íle Ser 250
Asp Val Ser His Glu Asp 265
Gly Val Glu Val His Asn 280
Asn Ser Thr Tyr Arg Val 295
Trp Leu Asn Gly Lys Glu 310 315
Pro Ala Pro íle Glu Lys 330
Glu Pro Gin Val Tyr Thr 345
Asn Gin Val Ser Leu Thr 360 íle Ala Val Glu Trp Glu 375
Thr His Thr Cys Pro 220
Ser Val Phe Leu Phe 240
Arg Thr Pro Glu Val 255
Pro Glu Val Lys Phe 270
Ala Lys Thr Lys Pro 285
Val Ser Val Leu Thr 300
Tyr Lys Cys Lys Val 320
Thr íle Ser Lys Ala 335
Leu Pro Pro Ser Arg 350
Cys Leu Val Lys Gly
365
Ser Asn Gly Gin Pro 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin
405 410 415 ·· ···· ·· • · ··· · · • · • ·· fl • · · 4 • · · · 4 • · · 14 » ·· ··
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430
Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 ·· ···*
Claims (14)
1. Protilátky, ktoré obsahujú dostatočnú časť aminokyselinovej sekvencie každej CDR uvedenej ďalej tak, že protilátky sú schopné viazať sa na molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanú na krvotvorných bunkách:
RSSKSLLY KDGKTYLN CDRL1 (SEQ ID NO: 3
LMSTRAS...... CDRL2 (SEQ ID NO: 5)
QQLVEYPFT CDRL3 (SEQ ID NO: 7)
GYWMS.... CDRH1 (SEQ ID NO: 9)
EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2 (SEQ ID NO: 11)
FID...... CDRH3 (SEQ ID NO: 13)
2. Protilátky, ktoré sa viažu na molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanú na krvotvorných bunkách alebo na rozpustný CD23, charakterizované afinitnou konštantou, ktorej hodnota je rovná alebo vyššia ako 1x109 Ka.moľ1.
3. Protilátky, ktoré kompetitívne inhibujú naviazanie protilátok, ktoré majú sekvencie CDR uvedené v nároku 1, na molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanú na krvotvorných bunkách.
4. Protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktoré sú zmenené protilátky.
5. Protilátky podľa nároku 4, ktoré sú humanizované protilátky.
6. Protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde kostra ťažkého reťazca zahrnuje aminokyselinové zvyšky z myších protilátok v ľubovoľnej z polôh 49, 66, 76, 77 a 94.
7. Protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde kostra ľahkého reťazca zahrnuje aminokyselinové zvyšky myších protilátok v polohe 64.
-738. Protilátky obsahujúce jednu alebo dve aminokyselinové sekvencie podľa
SEQ ID NO: 1 a 2.
·· ···· ·· · · • · · • ··· · • · ··· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · · ·· ·
9. Protilátky obsahujúce jednu alebo dve aminokyselinové sekvencie podľa SEQ ID NO: 17 a 18.
10. Protilátky podľa ktoréhokoľvek z predchádzjúcich nárokov, kde konštantná oblasť obsahuje Ala v polohe 235 a Ala v polohe 237 podľa systému číslovania podľa Kabata.
11. Protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, na použitie na liečenie ľudí.
12. Použitie protilátok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 na výrobu lieku na liečenie porúch vybraných zo skupiny zahrnujúcej artritídu, lupus erythematosus, Hashimotovu tyreoiditídu, roztrúsenú sklerózu, cukrovku, uveitídu, dermatitídu, lupienku, žihľavku, nefrotický syndróm, glomerulonefritídu, zápalové ochorenie čriev, ulceratívnu kolitídu, Crohnovu chorobu, Sjogrenov syndróm, alergiu, alergickú astmu, intrinsickú astmu, akútnu astmatickú exacerbáciu, rinitídu, ekzém, GVH, COPD, inzulitídu, bronchitídu, najmä chronickú bronchitídu alebo cukrovku, najmä cukrovku typu I a maligné nádory B-buniek.
13. Použitie protilátok, ktoré sa viažu na molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanú na krvotvorných bunkách na výrobu lieku na blokovanie tvorby rozpustného CD23.
14. Použitie protilátok podľa nároku 13, kde protilátkou je protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10.
15. Sekveneia DNA kódujúca reťazec protilátok, ktorý obsahuje jednu alebo viac sekvencii podľa:
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9809839.5A GB9809839D0 (en) | 1998-05-09 | 1998-05-09 | Antibody |
PCT/GB1999/001434 WO1999058679A1 (en) | 1998-05-09 | 1999-05-07 | Antibodies to cd23, derivatives thereof, and their therapeutic uses |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK16762000A3 true SK16762000A3 (sk) | 2001-07-10 |
Family
ID=10831668
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK1676-2000A SK16762000A3 (sk) | 1998-05-09 | 1999-05-07 | Protilátky proti cd23, farmaceutický prostriedok s ich obsahom, sekvencie dna kódujúce reťazec protilátok a použitie protilátok |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7008623B1 (sk) |
EP (1) | EP1076701A1 (sk) |
JP (1) | JP2002514421A (sk) |
KR (1) | KR20010043470A (sk) |
CN (1) | CN1308676A (sk) |
AP (1) | AP1547A (sk) |
AU (1) | AU763491B2 (sk) |
BR (1) | BR9910327A (sk) |
CA (1) | CA2328606A1 (sk) |
EA (1) | EA200001041A1 (sk) |
EE (1) | EE200000658A (sk) |
GB (1) | GB9809839D0 (sk) |
HR (1) | HRP20000762A2 (sk) |
HU (1) | HUP0102005A3 (sk) |
ID (1) | ID28088A (sk) |
IL (1) | IL139384A0 (sk) |
IS (1) | IS5696A (sk) |
NO (1) | NO20005632L (sk) |
NZ (1) | NZ507879A (sk) |
PL (1) | PL344019A1 (sk) |
SK (1) | SK16762000A3 (sk) |
TR (1) | TR200003281T2 (sk) |
WO (1) | WO1999058679A1 (sk) |
YU (1) | YU69000A (sk) |
ZA (1) | ZA200006312B (sk) |
Families Citing this family (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6696550B2 (en) | 1998-07-23 | 2004-02-24 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor |
GEP20063752B (en) | 2000-10-13 | 2006-02-27 | Biogen Inc | Humanized Anti-LT-Beta-R Antibodies |
US20040151721A1 (en) | 2001-10-19 | 2004-08-05 | O'keefe Theresa | Humanized anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor |
WO2004002431A2 (en) * | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Biogen, Inc. | Humanized anti-lymphotoyin beta receptor antibodies |
AR040778A1 (es) | 2002-08-06 | 2005-04-20 | Glaxo Group Ltd | Anticuerpos alterados o fragmentos funcionales que se unen a mag (glicoproteina asociada a mielina). |
GB0306309D0 (en) | 2003-03-19 | 2003-04-23 | Glaxo Group Ltd | Method of treatment |
WO2005000898A2 (en) | 2003-06-27 | 2005-01-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions |
CA2434668A1 (en) | 2003-07-04 | 2005-01-04 | Laurence Mulard | Novel approach to design glycopeptides based on o-specific polysaccharide of shigella flexneri serotype 2a |
EP1631311A4 (en) * | 2003-12-10 | 2007-04-11 | Millennium Pharm Inc | HUMANIZED ANTI-CCR2 ANTIBODIES AND METHOD OF USE |
US7435799B2 (en) * | 2004-01-08 | 2008-10-14 | Applied Molecular Evolution | TNF-α binding molecules |
CA2560742A1 (en) | 2004-03-23 | 2005-10-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof |
US20060246075A1 (en) * | 2004-09-29 | 2006-11-02 | Marc Mercken | Anti-amyloid antibodies, compositions, methods and uses |
WO2006074399A2 (en) | 2005-01-05 | 2006-07-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Multispecific binding molecules comprising connecting peptides |
CN101309704B (zh) | 2005-11-14 | 2012-10-10 | 礼纳特神经***科学公司 | 针对降钙素基因相关肽的拮抗剂抗体及其使用方法 |
GB0525662D0 (en) | 2005-12-16 | 2006-01-25 | Glaxo Group Ltd | Immunoglobulins |
US7680868B2 (en) * | 2005-12-20 | 2010-03-16 | Roche Molecular Systems, Inc. | PCR elbow determination by use of a double sigmoid function curve fit with the Levenburg-Marquardt algorithm and normalization |
EP1804172B1 (en) * | 2005-12-20 | 2021-08-11 | Roche Diagnostics GmbH | PCR elbow determination using curvature analysis of a double sigmoid |
WO2009043051A2 (en) * | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Biogen Idec Ma Inc. | Cd23 binding molecules and methods of use thereof |
US20090148905A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-11 | Claire Ashman | Antigen-binding constructs |
CA2716424C (en) | 2008-03-04 | 2015-04-28 | Pfizer Limited | Methods of treating chronic pain |
EP2271323A2 (en) | 2008-05-06 | 2011-01-12 | Glaxo Group Limited | Encapsulation of biologically active agents |
CA2753332A1 (en) | 2009-02-24 | 2010-09-02 | Glaxo Group Limited | Antigen-binding constructs |
EP2401298A1 (en) | 2009-02-24 | 2012-01-04 | Glaxo Group Limited | Antigen-binding constructs |
WO2010097394A1 (en) | 2009-02-24 | 2010-09-02 | Glaxo Group Limited | Multivalent and/or multispecific rankl-binding constructs |
JP2012522749A (ja) | 2009-04-01 | 2012-09-27 | グラクソ グループ リミテッド | 抗il−23免疫グロブリン |
WO2010122090A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Glaxo Group Limited | Fgfr1c antibody combinations |
AU2010288194B2 (en) | 2009-08-28 | 2013-08-29 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide |
FR2957598B1 (fr) * | 2010-03-17 | 2015-12-04 | Lfb Biotechnologies | Nouveau peptide signal, et son utilisation pour la production de proteines recombinantes |
KR101947356B1 (ko) | 2010-11-23 | 2019-02-12 | 글락소 그룹 리미티드 | 온코스타틴 m (osm)에 대한 항원 결합 단백질 |
MX2013005847A (es) | 2010-11-24 | 2013-12-12 | Glaxo Group Ltd | Proteinas de union a antigeno multiespecificas que eligen como blanco a hgf. |
US8974782B2 (en) | 2011-02-07 | 2015-03-10 | Glaxo Group Limited | Treatment of stroke comprising anti-MAG antibodies |
LT3415531T (lt) | 2011-05-27 | 2023-09-25 | Glaxo Group Limited | Bcma (cd269/tnfrsf17) – surišantys baltymai |
WO2014029752A1 (en) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Glaxo Group Limited | Anti lrp6 antibodies |
US10176293B2 (en) | 2012-10-02 | 2019-01-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | Universal method to determine real-time PCR cycle threshold values |
SI2970464T1 (sl) | 2013-03-15 | 2020-08-31 | Glaxosmithkline Intellectual Propety Development Limited | Anti-LAG-3 vezavni proteini |
CA2917661C (en) * | 2013-07-10 | 2023-09-12 | Onconox Aps | Antibodies to .beta.2-glycoprotein i and therapeutic uses thereof |
US10556945B2 (en) | 2014-03-21 | 2020-02-11 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
US9896502B2 (en) | 2014-03-21 | 2018-02-20 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
KR20180042412A (ko) | 2015-09-02 | 2018-04-25 | 이뮤텝 에스.에이.에스. | 항-lag-3 항체 |
JP6935184B2 (ja) * | 2016-05-31 | 2021-09-15 | シスメックス株式会社 | 糖ペプチドと反応するモノクローナル抗体およびその用途 |
US10479827B2 (en) * | 2016-05-31 | 2019-11-19 | Sysmex Corporation | Monoclonal antibody reacting with glycopeptide, and use thereof |
AU2017281830B2 (en) | 2016-06-20 | 2023-04-06 | Kymab Limited | Anti-PD-L1 antibodies |
KR20190066607A (ko) | 2016-09-23 | 2019-06-13 | 테바 파마슈티컬스 인터내셔널 게엠베하 | 불응성 편두통의 치료 |
AU2020308053A1 (en) | 2019-06-26 | 2022-01-20 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | IL1RAP binding proteins |
CN112552403A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-26 | 南京英瀚斯生物科技有限公司 | 一种人源抗人CD23抗体的Fab片段、药物组合物及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0605442T3 (da) * | 1991-07-25 | 2003-08-04 | Idec Pharma Corp | Rekombinante antistoffer til human terapi |
MX9204374A (es) * | 1991-07-25 | 1993-03-01 | Idec Pharma Corp | Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion. |
CA2203363A1 (en) * | 1994-10-25 | 1996-05-02 | Jean-Yves Marcel Paul Bonnefoy | Binding agents to cd23 |
US6011138A (en) | 1997-02-20 | 2000-01-04 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Gamma-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies |
-
1998
- 1998-05-09 GB GBGB9809839.5A patent/GB9809839D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-05-07 AP APAP/P/2000/001983A patent/AP1547A/en active
- 1999-05-07 PL PL99344019A patent/PL344019A1/xx unknown
- 1999-05-07 EE EEP200000658A patent/EE200000658A/xx unknown
- 1999-05-07 SK SK1676-2000A patent/SK16762000A3/sk unknown
- 1999-05-07 AU AU38367/99A patent/AU763491B2/en not_active Ceased
- 1999-05-07 US US09/674,716 patent/US7008623B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-07 WO PCT/GB1999/001434 patent/WO1999058679A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-05-07 IL IL13938499A patent/IL139384A0/xx unknown
- 1999-05-07 NZ NZ507879A patent/NZ507879A/xx unknown
- 1999-05-07 BR BR9910327-3A patent/BR9910327A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-05-07 CN CN99808452A patent/CN1308676A/zh active Pending
- 1999-05-07 CA CA002328606A patent/CA2328606A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-07 JP JP2000548470A patent/JP2002514421A/ja not_active Ceased
- 1999-05-07 ID IDW20002573A patent/ID28088A/id unknown
- 1999-05-07 EA EA200001041A patent/EA200001041A1/ru unknown
- 1999-05-07 TR TR2000/03281T patent/TR200003281T2/xx unknown
- 1999-05-07 HU HU0102005A patent/HUP0102005A3/hu unknown
- 1999-05-07 YU YU69000A patent/YU69000A/sh unknown
- 1999-05-07 KR KR1020007012530A patent/KR20010043470A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-05-07 EP EP99920991A patent/EP1076701A1/en not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-10-31 IS IS5696A patent/IS5696A/is unknown
- 2000-11-03 ZA ZA200006312A patent/ZA200006312B/xx unknown
- 2000-11-08 NO NO20005632A patent/NO20005632L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-11-09 HR HR20000762A patent/HRP20000762A2/hr not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1999058679A1 (en) | 1999-11-18 |
AU3836799A (en) | 1999-11-29 |
YU69000A (sh) | 2003-08-29 |
CN1308676A (zh) | 2001-08-15 |
EA200001041A1 (ru) | 2001-06-25 |
EP1076701A1 (en) | 2001-02-21 |
CA2328606A1 (en) | 1999-11-18 |
KR20010043470A (ko) | 2001-05-25 |
AP1547A (en) | 2006-01-13 |
IS5696A (is) | 2000-10-31 |
NZ507879A (en) | 2004-02-27 |
EE200000658A (et) | 2002-04-15 |
HUP0102005A2 (hu) | 2001-10-28 |
TR200003281T2 (tr) | 2001-03-21 |
GB9809839D0 (en) | 1998-07-08 |
ID28088A (id) | 2001-05-03 |
BR9910327A (pt) | 2001-01-30 |
PL344019A1 (en) | 2001-09-24 |
HRP20000762A2 (en) | 2001-06-30 |
AP2000001983A0 (en) | 2000-12-31 |
JP2002514421A (ja) | 2002-05-21 |
US7008623B1 (en) | 2006-03-07 |
IL139384A0 (en) | 2001-11-25 |
NO20005632D0 (no) | 2000-11-08 |
ZA200006312B (en) | 2003-02-26 |
NO20005632L (no) | 2001-01-08 |
HUP0102005A3 (en) | 2003-10-28 |
AU763491B2 (en) | 2003-07-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU763491B2 (en) | Antibodies to CD23, derivatives thereof, and their therapeutic uses | |
AU730326B2 (en) | Humanized immunoglobulin reactive with alpha4beta7 integrin | |
KR100249937B1 (ko) | 인간 인터루킨-6 수용체에 대한 재구성 인간 항체 | |
EP3050899B1 (en) | Antibodies binding human collagen ii | |
SK332792A3 (en) | Humanized and chimeric monoclonal antibodies | |
US20070116707A1 (en) | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors | |
JPH04505398A (ja) | 人体化抗体 | |
EP1098979A2 (en) | Fap alpha-specific antibody with improved producibility | |
JP2012517806A (ja) | ヒト化抗cd20抗体および使用方法 | |
CA3067597C (en) | Chimeric antibodies for treatment of amyloid deposition diseases | |
KR20230034960A (ko) | Lag3에 결합하는 항체 및 그 용도 | |
KR20180030917A (ko) | 항-cd154 항체 및 그의 사용 방법 | |
WO2023061063A1 (zh) | 靶向cd70的抗体及其制备和用途 | |
KR20230010691A (ko) | St2 항원 결합 단백질 | |
CN111788229A (zh) | Csf1r结合剂 | |
CZ20004164A3 (cs) | Protilátky proti CD23, jejich dertiváty a jejich terapeutické použití | |
WO2023066267A1 (en) | Antibodies binding cldn18.2 and uses thereof | |
MXPA00011013A (en) | Antibodies to cd23, derivatives thereof, and their therapeutic uses | |
AU2005201265B2 (en) | Humanized immunoglobulin reactive with alpha4beta7 integrin | |
AU2012216702B2 (en) | Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity | |
AU2008203508A1 (en) | Humanized immunoglobulin reactive with a4B7 integrin | |
MXPA99001462A (es) | Inmunoglobulina humanizada reactiva con (alfa4beta7) integrina |