HRP20000762A2 - Antibodies to cd23, derivatives thereof, and their therapeutic uses - Google Patents
Antibodies to cd23, derivatives thereof, and their therapeutic uses Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20000762A2 HRP20000762A2 HR20000762A HRP20000762A HRP20000762A2 HR P20000762 A2 HRP20000762 A2 HR P20000762A2 HR 20000762 A HR20000762 A HR 20000762A HR P20000762 A HRP20000762 A HR P20000762A HR P20000762 A2 HRP20000762 A2 HR P20000762A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- antibodies
- sequence
- sequences
- Prior art date
Links
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 71
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 claims description 57
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 claims description 57
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 31
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 20
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 claims description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 claims description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 5
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 claims description 2
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 2
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024716 acute asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 claims description 2
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 claims description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 claims description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 241000024188 Andala Species 0.000 claims 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 15
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 8
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 8
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 4
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 3
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 2
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 1
- WUAPFZMCVAUBPE-NJFSPNSNSA-N 188Re Chemical compound [188Re] WUAPFZMCVAUBPE-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 206010009137 Chronic sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101001042415 Cratylia mollis Mannose/glucose-specific lectin Cramoll Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 108010036941 Cyclosporins Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 101100310856 Drosophila melanogaster spri gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091060210 Heavy strand Proteins 0.000 description 1
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001012787 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101000643378 Homo sapiens Serine racemase Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000157426 Pernis Species 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 102100035717 Serine racemase Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N Yttrium-90 Chemical compound [90Y] VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- YPIPCJRLGTUGFD-UHFFFAOYSA-N [Sm].C=C.C=C Chemical group [Sm].C=C.C=C YPIPCJRLGTUGFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000781 anti-lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- JCXGWMGPZLAOME-AKLPVKDBSA-N bismuth-212 Chemical compound [212Bi] JCXGWMGPZLAOME-AKLPVKDBSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- GZUXJHMPEANEGY-UHFFFAOYSA-N bromomethane Chemical compound BrC GZUXJHMPEANEGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- AIXMJTYHQHQJLU-UHFFFAOYSA-N chembl210858 Chemical compound O1C(CC(=O)OC)CC(C=2C=CC(O)=CC=2)=N1 AIXMJTYHQHQJLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000027157 chronic rhinosinusitis Diseases 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000013104 docking experiment Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- -1 etc. Substances 0.000 description 1
- FJBCLXDYGPXPFE-UHFFFAOYSA-N ethene europium Chemical group [Eu].C=C.C=C FJBCLXDYGPXPFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000285 follicular dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940002004 the magic bullet Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Predmetni izum govori o antitijelima koja se spajaju na CD23 (FCεRII) tip II molekule naročito promijenjenih antitijela, o načinu dobivanja takvih antitijela, farmaceutskom sastavu koji sadrži ta antitijela i njegovoj upotrebi u liječenju.
CD23 (FCeRII) tip II molekule potječe iz C-lecitinske porodice u koju je također uključen limfocitni ulazni receptor (MEL-14) i adhezijska molekula-1 endotelijalnih leukocita (ELAM-1). To je receptor koji ima niski afinitet za IgE. Kod ljudi je raznolikost hematopoetskih staničnih tipova izražena na površini CD23, uključujući folikularno dendritske stanice, B stanice, T stanice i makrofage. CD23 molekule su također nađene u topivom obliku u biološkim tekućinama. Topive CD23 (sCD23) molekule su napravljene proteolitskim cijepanjem transmembranskih receptora. CD23 posjeduje pleiotropsku aktivnost uključujući posredovanje u adheziji stanica, regulaciju IgE i histaminskog otpuštanja, spašavanje B stanica od apoptoze i regulaciju mieloida u rastu stanica. Te funkcionalne aktivnosti su posredovane preko spajanja specifičnog liganda CD23 združenih–stanica, ili sCD23, koje kasnije djeluju na principu poput-citokina (Conrad, D.H., Annu Rev Immunol 8, 623-645, (1990); Delespesse, G., i sur., Adv Immunol 49, 149-191 (1991); Bonnefoy, J.Y., i sur., Curr Opin Imunnol 5, 944-47 (1993).
Povećana ekspresija CD23 je primijećena u brojnim imflamatornim bolestima. CD23 su dokazana u sinovijalnoj biopsiji kod pacijenta sa kroničnom upalom sinusa, i sCD23 se mogu mjeriti u povišenim koncentracijama u serumu i sinovijalnoj tekućini kod pacijenta sa reumatoidnim artritisom (Bansal, A.S, Oliver, W., Marsh, M.N., Pumphrey, R.S., i Wilson, P.B., Immunology 79, 285-289 (1993); Hellen, E.A., Rowlands, D.S., Hansel, T.T., Kitas, G.D., i Crocker, J.J., Clin Path 44, 293-296 (1991); Chromat, P., Brioloay, J., Banchereau, J., & Miossec, P., Arthritis Rheum 86, 234-242 (1993); Bansal, A., i sur., Clin Exp Immunol 89, 452-455 (1992); Rezonzow, R., & Newkirk, M.N., Clin Immunol Immunopathol 71, 156-163 (1994). Nadalje, nivo sCD23 u serumu kod pacijenta sa reumatoidnim artritisom je u vezi sa stanjem bolesti i povezan je sa serum reumatoidnim faktorom (Bansal, A.S., i sur., Clin Exp Rheumatol 12, 281-285 (1994). Pro-inflamatorni citokini se pojavljuju kao naročito važni čimbenici kod reumatoidnog artritisa, i igraju glavnu ulogu u TNF-a i IL-1b u razaranju artritisnih promjena koje su bile prisutne (Brennan, F.M., Chantry, D., Jackson, A., Maini, R., & Feldman, M., Lancet 2, 244-247 (1989); Brennan, F.M., Maini, R.M., & Feldman M.., Br J Rheumatol 31, 293-298 (1992).
Antitijela tipično sadrže dva teška lanca koja su vezana zajedno na disulfidni spoj i dva lagana lanca. Svaki lagani lanac je vezan sa pojedinim teškim lancem sa disulfidnim spojem. Svaki teški lanac ima na jednom kraju promjenjivu domenu nakon čega slijede brojne konstantne domene. Svaki lagani lanac ima promjenjivu domenu na jednom kraju i konstantnu domenu na njegovom drugom kraju. Promjenjiva domena laganog lanca je poravnata sa promjenjivom domenom teškog lanaca. Konstantna domena laganog lanca je poravnata sa prvom konstantnom domenom teškog lanca. Konstantna domena laganog i teškog lanca nije izravno uključena u spajanje antitijela i antigena.
Promjenjiva domena svakog para laganih i teških lanaca oblikuje mjesto za spajanje antigena. Domene laganih i teških lanaca imaju istu opću strukturu i svaka domena obuhvaća poredak od četiri regije, čije sekvence su razmjerno zaštićene i povezane sa tri komplementarne određene regije (CDRma). Četvrta regija u poretku uvelike prihvaća beta-slojno prilagođenje i CDR oblik koji je povezan petljom, i u nekim slučajevima oblikuje dio beta-slojne strukture. CDRi su zadržani u blizini sa poretkom regijama, sa CDRima iz drugih domena, pridonose oblikovanju mjesta za spajanje antigena. CDRi i poredak regija antitijela su određeni u referencama koje su opisali Kabat i sur («Sequences of proteins of immunological interest» SAD Ministarstvo zdravlja i ljudske usluge, US Government Printing Office, 1987).
Pripravljanje izmijenjenih antitijela, od antitijela glodavaca čija je promjenjiva regija spojena sa konstantnom regijom ljudskog antitijela, a to je sada već vrlo uhodano u području imunologije (Oi i Morrison (1986) Biotechniques 4, 214-212). Humanizirana antitijela u kojima su CDRi dobiveni iz različitih izvora nego oni u poretku u promjenjivoj domeni antitijela otkrivena su u EP-A-0239400. CDRi mogu biti dobiveni iz monoklonskih antitijela glodavaca ili primata. Poredak promjenjivih domena, i konstantnih domena, antitijela se obično dobiva iz ljudskih antitijela. Ta izmijenjena antitijela ne smiju izazivati jaki imunološki odgovor prilikom davanja ljudima, u usporedbi sa imunim odgovorom dobivenim na ljudima protiv čitavog niza stranih antitijela kao što su ona dobivena od glodavaca.
Štakorska monoklonska antitijela su bila uzgajana protiv CD23 receptora (FCεRII) (PCT/EP/95/04109). Iako, takva monoklonska antitijela nisu idealna za ljudsku terapiju kao što su potencijalno imunogenska kada se ubrizgaju u ljudskog pacijenta i stoga će možda biti razorena. Nadalje komercijalno prisutna antitijela koja se spajaju na CD23 receptor prepoznaju različite epitope izražene na CD23 receptoru; specifičnost spajanja epitopa može odigrati značajnu ulogu u efikasnosti antitijela za određene namjene. I više od toga, selekcija antitijela koja imaju visoki afinitet za ciljni receptor mogu se, kao terapeutska prednost, kod zahtijevane doze smanjiti u odnosu na monoklonska antitijela sa manjim afinitetom za isti receptor.
U skladu sa predmetnim izumom, dana su izmijenjena antitijela koja sadrže dovoljno amino kiselinskih sekvenci od svakog CDR prikazanog niže i to se je antitijelo sposobno spojiti na CD23 (FCeRII) tip II molekule ekspresionirane na hematopoetskim stanicama:
Lagani lanac
RSSKSLLY KDGKTYLN CDRL1 (SEKV. ident. broj: 3)
LMSTRAS… CDRL2 (SEKV. ident. broj: 5)
QQLVEYPFT CDRL3 (SEKV. ident. broj: 7)
Teški lanac
GYWMS… CDRH1 (SEKV. ident. broj: 9)
EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2 (SEKV. ident. broj: 11)
FID… CDRH3 (SEKV. ident. broj: 13)
Predmetni izum također govori o antitijelima koja se spajaju na isti epitop kao antitijela koja imaju CDRe a koja su opisana iznad. Pokus kompetetivne inhibicije je iskorišten za pravljenje mapa antigenih epitopa kao što su molekule CD23. Na primjer kompeticijska FACS analiza uključuje upotrebu stanica koje ekspresioniraju molekulu kao metu, a testirana antitijela su obilježena sa fluorokromom a druga su se poznata antitijela spajala na isti antigen koji je obilježen sa drugim drugačije obojenim florokromom. Ako su oba flurokroma prisutna, antitijelo kompetitivno ne inhibira svaki od njih i stoga se smatra da prepoznaje odvojene epitope ciljne molekule. Mapiranje epitopa može također biti napravljeno uz korištenje pokusa peptidnog spajanja u kojem je svaka peptidna sekvenca ciljnog antigena izražena na pinu i promatrana je korištenjem flourokrom-obilježenih antitijela kao i ranije. U studijama mapiranja epitopa, antitijela su imala CDRe koji su opisani ranije a koji su bili prikazani na način da odrede novi epitop na CD23 molekuli. Izum stoga osigurava antitijelo koje kompetativno inhibira spajanje antitijela koje ima CDR sekvence prikazane izvan CD23 (FCεRII) tipa II molekule ekspresionirane na hematopoetskim stanicama.
Antitijela u skladu sa izumom su naročito promijenjena, a to može biti kimerno antitijelo koje sadržava dovoljno promjenjivih teških i laganih lančanih sekvenci mišjih C11 antitijela prikazano je na crtežu 1 i 2 (SEKV. ident. broj 1 i 2 i SEKV. ident. broj 46, 47, 50 i 51) kao i ta koja su sposobne spojiti CD23 molekule i ljudsku konstantnu regiju. Antitijelo može biti kimerno antitijelo u tipu koje je opisano u WO 86/01533 i koje sadrži regiju spajanja antigena i ne-imunoglobulinsku regiju. Regija spajanja antigena je promjenjiva domena laganog lanaca antitijela i/ili promjenjiva domena teškog lanca. Kimerna antitijela tipično sadrže obje i laganu i tešku promjenjivu domenu. Ne-imunoglobulinska regija je spojena na C-kraj antigene regije spajanja. Ne-imunoglobulinska regija je tipičan ne-imunoglobulinski protein koji može biti i enzimska regija izvedena iz proteina koji ima poznatu specifičnost spajanja, iz proteina toksina ili dapače iz bilo kojeg proteina ekspresioniranog sa genom. Ne-imunoglobulinska regija može biti i ugljikohidratna regija. Dvije regije kimernog antitijela mogu biti povezane preko rascijepljenih sekvenci za spajanje. Promijenjeno antitijelo može biti i bi-specifično antitijelo.
Izmijenjeno antitijelo može biti i humanizirano antitijelo u kojem ima dovoljno jedne ili više amino kiselinskih sekvenci svakog od CDRa (i ako je neophodno, poredak rezidua), a koja su nazočna u ljudskom poretku kao i ta koja su sposobna spajati CD23 molekule.
Podesno je da su CDRi antitijela u skladu sa izumom i da imaju laki lanac CDRa od L1 do L3 i teški lanac CDRa od H1 do H3 (iznad). Međutim, amino kiselinske sekvence tih CDRa se mogu promijeniti. Amino kiselinske sekvence svakog CDRa se mogu promijeniti sa amino kiselinskom zamjenom, umetanjem i/ili brisanjem.
Svaki CDR stoga uključuje jednu ili dvije amino kiselinske zamjene, umetanje i/ili brisanje. Može biti i više od tri amino kiselinske zamjene, umetanja i/ili brisanja u laganom lancu CDRL3 ili u teškom lancu CDRH3. Više od četiri amino kiselinske zamjene, umatanja i/ili brisanja može biti prisutno u laganom lancu CDRL1. Više od šest amino kiselinskih zamjena, umetanja i/ili brisanja može biti prisutno u teškom lancu CDRH2. Poželjna amino kiselinska sekvenca svakog CDR je stvarno homologna sa svakim od CDR iznad.
Poželjni stupanj sekvencijskog prepoznavanja je najmanje 50% i više, a poželjno je najmanje 75%. Sekvencijsko prepoznavanje od najmanje 90% ili od najmanje 95% je još poželjnije.
Bit će jasno stručnjacima područja taj visoki stupanj prepoznavanja sekvenci nije neophodno zahtijevan otkad se različite amino kiseline mogu često zamijeniti za druge amino kiseline koje imaju slične osobine bez stvarne promijene ili štetnog djelovanja na neka svojstva proteina. To nas ponekad upućuje na «konzervativnu» amino kiselinsku promjenu. Stoga, amino kiseline glicinin, valin, leucin ili izoleucin često mogu zamijeniti jedna drugu. Ostale amino kiseline koje često mogu zamijeniti jedna drugu su: fenilalanin, tirozin, triptofan (amino kiseline koje imaju aromatski vanjski lanac); lizin, arginin i histidin (amino kiseline koje imaju osnovni lanac); aspartat i glutamat (amino kiseline koje imaju kiselinski vanjski lanac) i cistin i metionin (amino kiseline koje sadrže sumpor u vanjskom lancu). Stoga izraz «izveden» također uključuje varijantu amino kiselinske sekvence koja sadrži jednu ili više takvih «konzervativnih» promjena povezanih sa navedenom sekvencom.
Poželjno je da je poredak konstantnih domena antitijela ljudskog poretka i ljudskih konstantnih domena. Poželjno je da je poredak promjenjivih regija antitijela teškog lanaca stvarno homologan sa odgovarajućim poretkom ljudskog proteina KOL (Schmidt i sur, Hoppe-Seyer`s Z. Physiol. Chem., 364 713-747, 1983). Homolognost u odnosu na poredak je općenito 80% ili više sa u odnosu na KOL, na primjer 90% ili više od 95% ili još više. Nadalje, sedma rezidua poretka 4 u KOLu odgovara triptofanu ili leucinu, poželjnije leucinu. Ta je rezidua KOL rezidua i numerirana je kao 109 po Kabatu i sur, 1987. Bit će prezentiran broj amino kiselinskih zamjena, umetanja i/ili brisanja. Na primjer, jedna ili više rezidua na poziciji 49, 66, 76, 77 i 94 mogu biti promijenjene sa ekvivalentnom reziduom u mišjem antitijelu. Ostali kandidatski poredak promjena koje se mogu napraviti da obnove spajanje uključuju amino kiselinske rezidue 27, 30, 48, 67, 71, 91 i 93. Amino kiselinski brojevi su numerirani u skladu sa Kabatom i sur (iznad).
Poredak promjenjivih regija laganog lanca antitijela je obično stvarno homologan sa poretkom promjenjive domene proteina HSIGKVII (EMBL baza podataka: Klobeck, H.G., EMBL knjižnica baza koja je predložena 7. travnja 1986). Tamo je dana promjena u poretku u toj sekvenci na poziciji 452. Ispravljen je poredak čitanja, a napravljeno je brisanje u bazi 452(T).
Homolognost u odnosu na poredak je općenito 80% ili više u odnosu na izabranu sekvencu, na primjer 90% ili više od 95% ili još više. Broj amino kiselinskih zamjena, umetanja i/ili brisanja bit će prezentiran, na primjer na amino kiselinskoj rezidui 64 ali također ili umjesto na 71 u skladu sa numeriranjem po Kabatu i sur.
Izum također daje antitijela koja sadržavaju promjenjivu tešku i laganu sekvencu namještenu u crtežu 3 i 4 (SEKV. ident. broj 17 i 18).
Za antitijela je poželjno da imaju strukturu prirodnih antitijela ili njihovih fragmenata. Antitijela stoga sadržavaju kompletno antitijelo, (Fab`)2 fragment, Fab fragment, lagani lanac koji ima dvostruko veći broj atoma ili teški lanac sa dvostruko većim brojem atoma. Antitijela mogu biti i IgG kao IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4; ili IgM, IgA, IgE ili IgD ili njihove modificirane varijante. I prema tome može biti izabrana konstantna domena teškog lanca antitijela. Konstantna domena laganog lanca može biti kappa ili lambda konstantna domena.
Konstantna regija je odabrana u skladu sa funkcionalnim zahtjevima. Normalni IgG1 će pokazati sposobnost lize kroz spajanje sa komplementom uz posredovanje ADCC (stanična citotoksičnost ovisna o antitijelu). Poželjan je IgG4 ako se zahtijeva ne-citotoksički blokirano antitijelo. Kao i obično, IgG4 antitijela će pokazati nestabilnost kod dobivanja, i stoga, bit će još poželjnije da se modificiraju u općenito stabilnije IgG1. Predložena modifikacija je opisna u EP0307434 a poželjna modifikacija je uključena na poziciji 235 i 237. Izum nadalje daje lizijski ili ne-lizijski oblik antitijela koji je u skladu sa izumom.
Svaki lanac antitijela može biti napravljen sa zamjenom CDRa. CDRi promjenjive regije od lakog ili teškog lanca ljudskog antitijela su zamijenjeni sa dovoljnom amino kiselinskom sekvencom svakog CDRa od anti-CD21 antitijela tako da je to rezultirano antitijelo sposobno vezati CD23 molekulu. CDR-kodirana regija hiper promjenjive regije lanca ljudskog antitijela kodirane DNK je zamijenjena sa kodiranom DNK željenog CDRa. Ako je odgovarajuće, ta promijenjena DNK je vezana na kodiranu DNK konstantnu domenu za lanac antitijela. DNK je klonirana u ekspresiju vektora. Ekspresija vektora je uvedena u kompatibilnu stanicu-domaćin koja je kultivirana pod takvim uvjetima da je lanac antitijela ekspresioniran. Komplementarni lanci antitijela su ko-ekspresionirani na način da se mogu sakupiti tako da oblikuju ljudska antitijela.
Postoje četiri osnovna koraka da se humanizira monoklonsko antitijelo. I to su:
- određivanje nukleotida i predviđene amino kiselinske sekvence početnog laganog i teškog lanca promjenjive domene antitijela;
- napraviti humanizirano antitijelo, na primjer odlučiti koji će se sustav regije antitijela upotrijebiti u postupku humaniziranja;
- aktualni postupci/tehnike humaniziranja; i
- transfekcija i ekspresija humaniziranog antitijela.
Izum nadalje osigurava DNK kodiranu sekvencu lanca antitijela koja sadrži jednu ili više sekvenci u skladu sa:
CDRL1 baza brojevi parova 70-117 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj: 4)
CDRL2 baza brojevi parova 163-183 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj: 6)
CDRL3 baza brojevi parova 280-306 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj: 8)
CDRH1 baza brojevi parova 91-105 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj: 10)
CDRH2 baza brojevi parova 148-204 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj: 12)
CDRH3 baza brojevi parova 301-309 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj: 14)
ili DNK Sekvencu koja kodira lanac antitijela koji sadrži jednu ili obije sekvence prema crtežima 3 ili 4 (SEKV. ident. broj 17 ili 18 i SEKV. ident. broj 48 i 49).
Korak 1: Određivanje nukleotida i predviđene amino kiselinske sekvence laganog i teškog lanaca promjenjivih domena antitijela
Za humaniziranje antitijela potrebno je poznavati samo amino kiselinsku sekvencu teškog i lakog lanca promjenjive domene antitijela. Sekvence konstantnih domena su irelevantne zbog toga jer one ne pridonose poboljšanju strategije. Jednostavni postupak određivanja promjenjive domene antitijela amino kiselinske sekvence je iz klonirane kodirane cDNK teških i laganih lančanih promjenjivih domena.
Dva su glavna postupka za kloniranje koje daje teški i lagani lanac promjenjivih domena antitijela od cDNK: (1) preko konvencionalne cDNK kolekcije, ili (2) preko reakcije lanca polimeraze (PCR). Ta oba postupka su širom poznata. Dobivši nukleotidnu sekvencu cDNK, jednostavno je prevesti tu informaciju u predviđenu amino kiselinsku sekvencu promjenjive domene antitijela. U sadašnjem primjeru, nukleotidna sekvenca i predviđena amino kiselinska sekvenca štakorskog lanca C11 antitijela je prikazana u crtežu 1 i 2 (SEKV. ident. broj: 1 (teškog) i 2 (laganog) i SEKV. iden. broj 46 i 47).
Korak 2: Napraviti humanizirano antitijelo
Postoje mnogi čimbenici prilikom razmatranja i odlučivanja koja će se ljudska sekvenca antitijela upotrebljavati za vrijeme humanizacije. Humanizacija laganog i teškog lanca je razmatrana neovisno jedna od druge, ali su zaključci u biti slični za svaku od njih.
Taj postupak selekcije je baziran na slijedećem principu: dajući antitijelu antigenu specifičnost i afinitet koji je primarno određen sa amino kiselinskim sekvencama promjenjive regije CDRa. Poredak promjenjivih domena rezidue ima mali ili nikakav doprinos. Primarna uloga poretka regija je da zadrži CDRe u njihovom vlastitoj prostornoj orijentaciji tako da prepoznaju antigen. Stoga supstitucija štakorskih CDRa u poretku ljudske promjenjive domene više nalikuje na rezultat u zadržavanju njihovih ispravnih prostornih orijentacija u poretku promjenjivih ljudskih domena koji je visoko homologan sa štakorskim promjenjivim domenama iz kojih one potječu. Ljudske promjenjive domene bi poželjno trebale biti izabrane tako da su visoko homologne sa štakorskim promjenjivim domena(ma).
Prikladna sekvenca ljudske promjenjive domene antitijela može se izabrati kako slijedi:
Koristeći se kompjutorskim programom, pretražujući sve dostupne proteinske (i DNK) baze podataka za te sekvence ljudske promjenjive domene antitijela na način da su vrlo homologne sa štakorskim promjenjivim domena antitijela. Završni izlaz tog prikladnog programa je lista sekvenci koje su vrlo homologne sa štakorskim antitijelom, postotak homolognosti svake sekvence, i usklađenost svake sekvence sa štakorskom sekvencom. To je napravljeno nezavisno za oba, i za teški i za lagani lanac promjenjive domene sekvence. Gornje analize su izrazito lagane i potpune ako su uključene ljudske imunoglobulinske sekvence.
Lista sekvenca ljudske promjenjive domene antitijela koja je uspoređena zbog homolognosti. Primarno uspoređivanje je izvedeno na dužini CDRa, osim teškog lanca CDR3 koji je u potpunosti promjenjiv. Ljudski teški lanac i kappa i lambda lagani lanci su podijeljeni u pod skupine; 3 podskupine teškog lanca, 4 podskupine kappa lanca, 6 podskupina lambda lanca. Veličina CDR unutar svake skupine je slična ali varira između podskupina. Obično je moguće pripasati CDR štakorskog antitijela na jednu ljudsku podskupinu kao prvu aproksimativnu homolognost. Antitijela nose CDRe slične dužine i zatim se uspoređuju na homolognost amino kiselinskih sekvenci, posebno unutar CDRa, ali također i u okruženju poretka regije. Ljudska promjenjiva domena koja je najviše homologna je izabrana kao početak za humanizaciju.
Korak 3: Aktualni postupci/tehnike humaniziranja
Antitijelo se može humanizirati pomoću kalemljenja CDRa na ljudski poredak u skladu sa EP-A-0239400. DNK sekvenca kodira željene različite oblike antitijela koja, stoga, mogu biti u početku napravljena sa ljudskom DNK sa čijim CDRima se želi promijeniti oblik. Promjenjiva domena štakorske amino kiselinske sekvence sadrži željene CDRe koji su uspoređeni sa tim izabranim sekvencama ljudske promjenjive domene antitijela. Rezidue u ljudskim promjenjivim domenama su označene tako da budu promijenjene u odgovarajuće rezidue u štakoru na način da dobijemo ljudsku promjenjivu regiju uključenu u štakorske CDRe. Također postoje rezidue koje je potrebno zamijeniti, dodati ili izbrisati iz ljudske sekvence.
Oligonukleotidi su sintetizirani tako da se mogu upotrijebiti u mutageniranju poretka promjenjive ljudske domene i da sadrže željene rezidue. Ti oligonukleotidi mogu biti bilo koje konvencionalne veličine. Normalna je jedna koja je samo ograničena u dužini sa sposobnošću određene sinteze one koja je dostupna. Dobro je poznat postupak oligonukleotidne-usmjerene mutageneze in vitro.
Alternativno, humaniziranje se može postići korištenjem lančane reakcije rekombinantne polimeraze (PCR), postupkom opisanim u WO92/07075. Korištenjem tog postupka, CDR se može spojiti između poretka regija ljudskog antitijela.
Općenito, tehnika u WO92/07075 se može izvesti korištenjem predloška koji sadrži dva poretka ljudskih regija, AB i CD, i između njih CDR koji se može zamijeniti sa donatorskim CDRom. Primeri A i B su iskorišteni da pojačaju poredak regije AB, i primeri C i D se koriste da pojačaju poredak u regiji CD. Međutim, svaki od primera B i C sadrži, na njegovom 5` kraju, dodatnu sekvencu odgovarajuću sa svim ili bar nekim dijelovima donorske CDR sekvence. Primeri B i C prekrivaju svojom dovoljnom dužinom i dozvoljavaju rekombiniranje lanaca nukleotida nakon zagrijavanja njegovog 5` kraja sa ostalim, pod uvjetima koji dopuštaju da PCR bude izveden. Stoga su pojačane regije AB i CD iskusile umetanje gena sa prekrivenom ekstenzijom da se dobije humanizirani produkt u jednoj reakciji.
Korak 4: Transfekcija i ekspresija promijenjenih antitijela
Slijedeći mutagensku reakciju preoblikovanih antitijela, mutagenirana DNK se veže na odgovarajuću kodiranu DNK konstantnu regiju laganog ili teškog lanca, kloniranu u ekspresiju vektora, i transfekciranu u stanicu domaćin, poželjno stanice sisavaca. Taj će korak biti izveden rutinski. Promijenjena antitijela će stoga biti dobivena sa postupkom koji sadržava:
- dobivanje prve replikabilne ekspresije vektora uključujući i prikladnog promotora operativno vezanog na DNK sekvencu koja kodira najmanje promjenjivu domenu jednog teškog ili laganog lanca Ig, a promjenjiva domena obuhvaća poredak regija ljudskog antitijela i zahtijevani CDR za humanizirana antitijela izuma;
- dobivanje druge replikabilne ekspresije vektora uključujući i prikladnog promotora operativno vezanog na DNK sekvencu koja kodira najmanje promjenjivu domenu komplementarnog jednog teškog ili laganog lanca Ig pojedinačno;
- transformacija stanične linije sa prvim ili oba dobivena vektora; i
- kulturiranje navedene transformirane stanice da dobijemo navedeno promijenjeno antitijelo.
Poželjna DNK sekvenca u koraku (a) kodira obije promjenjive varijable domena i svaku konstantnu domenu lanca ljudskog antitijela. Bit će obnovljeno i pročišćeno svako humanizirano antitijelo. Linija stanica koja je transformirana da proizvodi promijenjena antitijela može biti linija stanica ovarija kineskog zamorca (CHO) ili besmrtna linija stanica sisavaca, koja je poželjno limfoidnog porijekla, kao što je mielom, hibridom, triom ili kvadrom linija stanica. Linija stanica također sadržava normalne limfoidne satnice, kao što su B-stanice, koje su postale besmrtne transformacijom sa virusom, kao što je Epstein-Barr virus. Još poželjnije, da je besmrtna stanična linija mielomska stanična linija ili od nje potječe. Ekspresijski poredak izbora je glutamin sintetaza ekspresijskog poretka koji je opisan u WO87/04462.
Linija stanica koja je korištena za dobivanje humaniziranih antitijela je linija stanica sisavaca, ali može biti i druga prikladna linija, kao što je bakterijska linija stanica ili kvaščeva linija stanica koje se mogu alternativno upotrijebiti. Za jednostavni lanac antitijela, vidljivo je da je E. coli – izveden bakterijski pravac koji se može upotrijebiti. Dobivenim antitijelima se provjerava njihova funkcionalna sposobnost. Ako je funkcionalnost izgubljena, potrebno je vratiti se na korak (2) i promijeniti poredak antitijela.
Izum stoga daje ekspresiju vektora koji sadržava kodiranu DNK i koja je adaptirana za ekspresiju bilo kojeg antitijela u skladu sa izumom i stanice domaćina transformirane navedenom ekspresijom vektora.
Jednom izražena antitijela, i njihovi spojevi sa dvostruko većim brojem molekula, samostalni lagani i teški lanci, ili ostali imunoglobulinski oblici predmetnog izuma će se pročistiti u skladu sa standardnim postupcima u području, uključujući precipitaciju s amonijakovim sulfatom, afinitetni stupac, kolumnu kromatografiju, gel elektroforezu i slične (vidi, općenito, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982)). Poželjni su supstancionalni čisti imunoglobulini od najmanje 90 do 95% homogenosti, a još poželjniji su sa 98 do 99% homogenosti, za farmaceutsku upotrebu. Kada su jednom pročišćena, a poželjno je djelomično ili do homogenosti, ta se antitijela mogu zatim upotrijebiti terapeutski ili u razvoju i izvedbi pokusnih postupaka, imunoflourescentnih bojila, i slično (vidi, općenito, Immunological Methods, Volumeni I i II, Lefkovits i Pernis, eds., Academic Press, New York, N. Y. (1979 i 1981)).
Antitijela mogu funkcionirati na način da blokiraju interakciju između spojene membrane CD23 i liganda koji je spojen na nju. U pokusima in vitro na primjer, radio-imuni pokus se može upotrijebiti za proučavanje tog blokirajućeg učinka. Antitijela mogu također funkcionirati tako da se spajaju na topivi CD23. Membrana spajanja CD23 zna iskusiti cijepanje površine stanice koje vodi do formiranja brojnih topivih fragmenata. Ti fragmenti se ponašaju kao citokini i igraju glavnu ulogu u formiranju IgE. Pretjerani nivo topivih CD23 će stoga biti upleten u bolest. Spajanjem tih fragmenata antitijela, u skladu s izumom. može se dovesti u pitanje sposobnost topivih CD23 u posredovanju u njegovog učinka. Za antitijela u skladu sa izumom se vjeruje da preveniraju proizvodnju topivih CD23 sa prevencijom cijepanja membrane spajanja receptora. Izum stoga daje uporabu anti-CD23 antitijela kao i proizvodnju medikamenata za blokiranje topivih CD23 formacija.
Sposobnost bilo kojeg antitijela da posreduje njegovom učinku bit će povezana sa afinitetom ciljnog antigena. Antitijela u skladu sa izumom imaju visoki afinitet za CD23 receptore. Poželjno je da je konstantni afinitet tih antitijela veći od 1x109 Ka Mo1-1 i još poželjnije je da je veći od 1x1010 Ka Mo1-1. Ovaj izum stoga osigurava antitijela koja su se sposobna spajati na CD23 receptor ili topivi CD23, a antitijela su karakterizirana sa konstantnim afinitetom koji je jednak ili veći od 1x109 Ka Mo1-1.
Antitijela koja se spajaju na CD23 receptor se koriste in vivo u liječenju ili profilaksi inflamatornih autoimunih bolesti. To je od velikog značenja imajući u vidu činjenice da je mnoge od tih bolesti teško ili nemoguće liječiti, usprkos dugim istraživanjima o prirodi uzroka. To je naročito važno u slučajevima artritisa, koji često pogađa ljude u srednjim godinama i uzrokuje preuranjene odlaske u mirovinu. Učinkoviti tretman artritisa bio je dugo cilj mnogih istraživačkih skupina.
Za antitijela koja su opisana u predmetnom izumu se vjeruje da su korisna u liječenju ili profilaksi nekoliko bolesti uključujući artritis, lupus erythematosus, Hashimoto tiroiditis, multipla skleroza, diabetes, uveitis, dermatitis, psorijaza, urtikarija, nefrotični sindrom, glomerulonefritis, upale potrbušnice, ulcerativni kolitis, Kronova bolest, Sjorgenov sindrom, alergije, specifične astme, alergijska ili urođena astma, akutna asmatska egzarcebacija, rinitis, ekcem, GVH, COPD, inzulitis, bronhitis (naročito kronični bronhitis) ili dijabetes (naročito Tip 1 dijabetes).
Predmetni izum stoga daje upotrebu antitijela u skladu sa izumom u proizvodnji medikamenata za liječenje bilo koje ili više bolesti a koje su opisane iznad. Izum također daje postupak za liječenje jedne ili više bolesti, a koje su opisane iznad, sadržavajući davanje terapeutski učinkovite doze antitijela u skladu sa izumom.
Antitijela u skladu sa izumom mogu također biti korisna u proučavanju interakcije između CD23 i različitih liganda na primjer, između CD23 i CD21, između CD23 i CD11b, između CD23 i CD11c, između CD23 i 80 do 85 KDa endotelijalnog staničnog proteina (koji može biti 80 ili 85 KDa endotelijalni stanični protein) ili između CD23 i 115 KDa protein (za kojeg se vjeruje da je povezan sa 80 do 85 KDa endotelijalnim proteinom). Za jednu ili više gornjih interakcija se vjeruje da se zbivaju in vivo. Antitijela ili druga sredstva za spajanje a koja su sposobna blokirati te interakcije naročito su poželjna otkad se vjeruje da su ona možda specijalno prikladna za smanjenje ili za pomoć pri inflamatornom efektu uzrokovanom citokinima. Ona mogu biti korisna protiv malignih B-stanica kao što je kronična limfatična leukemija, i ostali oblici leukemije.
Jedan alternativni mehanizam djelovanja anti CD23 terapije je možda uključen u blokiranju IgE imunog odgovora.
Antitijela u ovom izumu se naročito mogu koristiti za liječenje ili profilaksu alergijskih bolesti, uključujući bolesti posredovanu ne-IgE. Ona se mogu koristiti u liječenju i profilaksi ulcerativnog kolitisa a, također se mogu upotrijebiti u liječenju ili profilaksi Kronove bolesti.
Antitijela u predmetnom izumu se mogu upotrebljavati sama ili u kombinaciji sa imunosupresivnim sredstvima kao što su steroidi, ciklosporini, ili antitijela kao što su anti-limfocitna antitijela ili još poželjnije sa induciranom –tolerancijom, anti-autoimuna ili anti-inflamatornim sredstvima kao što je CD4+T sredstvo stanične inhibicije na primjer anti-CD4 antitijelo (poželjno je da blokira ili ne-iscrpljuje antitijelo), anti-CD8 antitijelo, antagonist TNF na primjer anti-TNF antitijelo ili inhibitor TNF na primjer topivi TNF receptor, ili sredstva kao što su NSAIDi.
Prikladne doze za supstancu predmetnog izuma će varirati, te će ovisiti o raznim faktorima kao što je stupanj bolesti ili poremećaj koji treba liječiti, način davanja i starosna dob, te težina pacijenta koji će se liječiti. Bez vezanja na naročitu dozu, vjeruje se da na primjer dnevna doza za parenteralno davanje se kreće u opsegu 0,01 do 20 mg/kg antitijela predmetnog izuma (obično prisutna kao dio farmakološkog sastava kako je naznačeno iznad) će biti dovoljna za liječenje normalnog odraslog čovjeka. Još prikladnije doza će biti u opsegu od 0,1 do 5 mg/kg, kao i 0,1 do 2 mg/kg. Jedinična doza će biti od 1-400 mg.
Antitijela se također mogu upotrebljavati kao zasebno davani sastavci koji se daju združeni sa kemoterapeuticima ili imunosupresivnim sredstvima. Obično, ta sredstva uključuju ciklosporin A ili analog purina (na primjer metotreksat, 6-merkaptopurin, ili slična), ali i brojne druge dodane sastojke (na primjer ciklofosfamid, prednizon itd.) koji su dobro poznati stručnjacima područja i koji se također mogu upotrijebiti.
Ukoliko se želi liza stanice na koju je antitijelo spojeno, antitijela predmetnog izuma mogu biti oblika imunotoksina. Imunotoksini su karakterizirani sa dvije komponente i naročito su korisni za ubijanje određenih stanica in vitro ili in vivo. Jedna komponenta je citotoksično sredstvo koje je obično smrtonosno za stanicu koja se prihvati ili apsorbira. Druga komponenta, poznata je kao "transportno sredstvo", daje sredstvo za isporuku toksičkog sredstva za određeni tip stanice, kao što su stanice koje sadrže karcinom. Dvije komponente su obično kemijski spojene zajedno sa nekom od bilo koje varijante dobro poznatog kemijskog postupka. Na primjer, kada je citotoksičko sredstvo protein a druga komponenta je intaktni imunoglobulin, vezanje može biti na način da je to heterobifunkcionalno poprečno vezanje, na primjer SPDP, karbodimid, glutaraldehid, ili slično. Dobivanje različitih imunotoksina je dobro poznato u tom području, i može se naći, na primjer u "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe i sur, Monoclonal Antibodeies in Clinical Medicine, Academic press, strane 168-190 (1982).
Varijante citotoksičkog sredstva su prikladne za uporabu u imunotoksinima. Citotoksička sredstva uključuju radionukleide, kao što je Jod-131, Itrij-90, Renium-188, i Bizmut-212; brojne kemoterapeutske lijekove, kao što su vindesin, metotreksat, adriamicin i cisplatin, i citotoksičke proteine kao što su slični proteini inhibirani ribosomima kao bockajući antiviralni protein, Pseudomonas egzotoksin A, ricin, difterija toksin, ricin A lanac, itd, ili aktivno sredstvo na površini stanice, kao što su fosfolipazni enzimi (na primjer fosfolipaza C). Vidi, općenito, "Chimeric Toxinsi", Olsnes i Phil, Pharmac. Ther., 25: 335-381 (1982), i "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy", eds. Baldwin i Byers, strane 159-179, 224-266, Academic Press (1985).
Komponenta za isporuku imunotoksina je antitijelo u skladu sa predmetnim izumom. Poželjno se koriste intaktni imunoglobulini ili njihovi spojeni fragmenti, kao što je Fab. Tipično, antitijela u imunotoksinima bit će ljudski IgA, IgM ili IgG izotopi, ali i ostale konstantne regije sisavaca se mogu upotrijebiti po želji.
Izum nadalje daje farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljive nosače ili diluente i, kao aktivnu supstancu, antitijelo u skladu sa izumom. Sastav može sadržavati imunotoksin u skladu sa izumom. Antitijela, imunotoksin i njihov farmaceutski sastav tog izuma su naročito korisni za parenteralno davanje, na primjer supkutano, intramuskularno ili intravenozno.
Sastav za parenteralno davanje normalno sadrži otopinu antitijela ili njihov koktel otopljen na prihvatljivom nosaču, poželjno u vodenom nosaču. Varijante vodenog nosača koji se mogu upotrijebiti su, na primjer; voda, puferirana voda, 0,4% soli, 0,3% glicina i slično. Te otopine su sterilne i općenito su slobodne od raznih čestica. Ti sastojci se moraju sterilizirati po konvencionalnim postupcima, i po dobro poznatim tehnikama sterilizacije. Sastojci mogu sadržavati farmaceutski prihvatljive vanjske supstance koje su zahtijevane uz fiziološke uvjete kao što je podešeni pH i puferska sredstva, sredstva prilagođena toksicitetu i slična, na primjer natrij acetat, natrij klorid, kalijev klorid, kalcijev klorid, natrij laktat, itd. Koncentracija antitijela u tim sastojcima može jako varirati, na primjer od manje od 0,5%, obično na ili manje od 1% do visokih 15 ili 20% po težini i bit će primarno izabrana i bazirana na volumenu tekućine, viskozitetu, itd., i u skladu sa naročitom upotrebom i davanjem koje je određeno.
Stoga tipični farmaceutski sastav za intramuskularnu injekcijsku primjenu može se napraviti tako da sadrži 1 ml sterilne puferirane vode i 50 mg antitijela. Tipični sastav za intravenoznu infuziju može sadržavati 250 ml sterilne Ringerove otopine i 150 mg antitijela. Aktualni postupak za pripravljanje parenteralnog sastava za davanje bit će poznat ili očit stručnjacima područja i opisan je detaljnije u, na primjer, Remington`s Pharmaceutical Sience, 15to izdanje., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).
Antitijela u izumu mogu se liofilizirati za pohranjivanje i mogu se ponovo vratiti u oblik pomoću prikladnog nosača poznatog u području. Tehnike koje su bile prikazane su efektivne sa konvencionalnim imuno globulinima. Bit će upotrijebljena bilo koja prikladna tehnika liofilizacije te postupci vraćanja. Bit će jasno stručnjacima područja da liofilizacija i rekonstitucija vodi k različitom stupnju smanjenja aktivnosti antitijela (na primjer, sa konvencionalnim imunoglobulinima, IgM antitijela imaju tendenciju ka većem gubitku aktivnosti u odnosu na IgG antitijela) i taj nivo gubitka se može podesiti tako da se na početku odmah kompenzira.
Jednostruko ili višestruko davanje sastava bit će izvedeno sa količinom doze i uzorkom koji će odrediti doktor. U svakom slučaju, farmaceutski sastav će dati kvantitetu antitijela izuma koja su dostatna za liječenje pacijenta.
Antitijela u predmetnom izumu će nadalje pokazivati razne varijante u korištenju in vitro. Na primjera, antitijela u primjerima se mogu iskoristiti za tipizaciju T-stanica, za izolaciju specifičnog CD23 antigena koji nosi stanice ili fragmente receptora, za dobivanje vakcina, ili sličnog.
Iz dijagnostičkih razloga, antitijela se nadalje mogu označavati ili ne. Neoznačena antitijela se mogu upotrijebiti u kombinaciji sa ostalim obilježenim antitijelima (druga antitijela) koja reagiraju sa humaniziranim antitijelima, kao što su antitijela specifična za ljudsku imunoglobulinsku konstantnu regiju. Alternativno, antitijela se mogu direktno označavati. Mogu se upotrijebiti različite varijante označivača (markera) kao što su radionukleidi, fluor, enzimi, enzimski supstrati, kofaktori enzima, inhibitori enzima, ligandi (naročito hapteni), itd. Dostupni su brojni tipovi imuno pokusa koji su poznati stručnjacima područja.
Sredstva za dijagnostiku bit će korištena u svrhu zaštite za predmetna antitijela i detekciju stanične aktivnosti ili u svrhu nazočnosti određenih antigena. Stoga će antitijela predmetnog izuma obično bit dana u liofilizarnom obliku u specijalnim spremnicima, a mogu biti sama ili u združena sa dodanim antitijelima koja su specifična za željeni stanični tip. Antitijela, se mogu združiti sa označivaćem ili toksinom, ili se razdružiti, te su uključena u sredstvo sa puferima, kao što su Tris, fosfati, karbonati, itd., stabilizatori, biocidi, inertni proteini, na primjer serum albumini, ili sličnim te će biti određena njihova uporaba pomoću pratećih instrukcija. Općenito, ova sredstva bit će nazočna u najmanje 5% težine koja je bazirana na iznosu aktivnih antitijela, i obično je prisutna u ukupnoj količini od najmanje 0,001% težine koja je bazirana na koncentraciji antitijela. Poželjno je učestalo uključivanje inertnog ekstendera ili ekscipienta da razrijedi aktivnu supstancu, gdje ekscipient može biti prisutan u svom obliku od 1 do 99% težine u ukupnom sastavu. Kada se koriste druga antitijela koja su se sposobna spajati sa kimerna antitijelima u pokusu, ona će se obično nalaziti u zasebnim bočicama. Druga antitijela se obično združuju sa označivačima i formuliraju se na isti način kao i antitijela koja su formulirana i opisana iznad.
Crteži
Crtež 1 prikazuje amino kiselinu i nukleotidnu sekvencu mišje C11 teškog lanca promjenjive regije.
Crtež 2 prikazuje amino kiselinu i nukleotidnu sekvencu mišje C11 laganog lanca promjenjive regije.
Crtež 3 prikazuje amino kiselinu i nukleotidnu sekvencu humaniziranog anti-CD23 antitijela teškog lanca promjenjive regije.
Crtež 4 prikazuje amino kiselinu i nukleotidnu sekvencu humaniziranog anti-CD23 antitijela laganog lanca promjenjive regije.
Crtež 5 prikazuje polovicu maksimalnog spajanja kimernih CD23 IgG1m
Crtež 6 prikazuje polovicu maksimalnog spajanja humaniziranih CD23 IgG1m
Slijedeći primjeri ilustriraju izum.
Kloniranje i sekvencioniranje mišjeg anti-CD23 monoklonskog antitijela C11
Općenito postupanje
Ukoliko nije drugačije naznačeno u izjavi, korišteni su standardni postupci i uvjeti. Proizvođačka specifikacija je upotrijebljena i primijenjena. Izvedeno je ukidanje digestije i ostalih rutinskih molekularno-bioloških postupaka a sustavno je opisano u Maniatis i sur («Molecular Cloning – a laboratory manual» drugo izdanje, Cold Spring Harbour Press).
PCR je izveden uz upotrebu programibilnog termalnog brojača (Trio; Biometra). Tipična 100 μm reakcija sadrži 2,5 jedinica AmpliTaq polimeraze (Perkin-Elmer-Cetus, Beaconsfield, UK) u puferu koji opskrbljuje proizvođač; 250 μM od svakog dATP, dCTP, dGTP i dTTP; pojačani su primeri na 1 μM i predložena DNK. Ukoliko nije drugačije navedeno, korišten je slijedeći ciklus specifikacija:
Korak 0: 95°C za 5 minuta
Korak 1: 95°C za 1 minutu
Korak 2: 50°C za 1 minutu, uz približavanje koraku 3 sa 0,4°C/s
Korak 3: 72°C za 1 minutu, idi na korak 1, ponavljati kružni postupak 30 puta
Korak 4: 72°C za 5 minuta
Sekvencioniranje DNK je izvedeno uz korištenje dideoksi završnog postupka upotrebom oba Sequenase v2 poretka (USB, Cambridge, UK) ili fluorescentnog dyeterminator sistema (ABI).
Gel pročišćavanje DNK je izvedeno sa odvojenim reakcijama na agaroznom gelu sa malom točkom topljenja (NuSieve GTG, FMC, Rockland, ME). Izabrani fragment je uklonjen pod UV osvjetljenjem, i DNK je oporavljena upotrebom Wizard PCR Preps kit (Promega, Southampton, UK).
Brojne amino-kiselinske rezidue u lancu antitijela slijede sheme koje su opisane u Kabat i sur («Sequnces of proteins of immunological interest), SAD Ministarstvo zdravlja i ljudskih službi, US Govt Printing Office, 1991).
Dobivanje cDNK iz C11 hibridoma
Rastuća kultura stanica C11 je upotrijebljena za ekstrakciju RNK. Kultura sadrži 1,2x107 stanica koje su centrifugirane i obje mase stanica i supernatanta su uzete za analizu. Supernatant je testiran na prisutnost različitih izotopa u mišjim imunoglobulinima pomoću imunološkog postupka (ISO1 kit; Sigma, Poole, UK) i postavljeno je da su u C11 izotopi IgG1.
Glasnička RNK je izolirana iz stanične mase sa sekvencijskom aplikacijom Total RNK Isolation Kit (Stratagene, Cambridge, UK) (proizvodnja ukupne RNK) i zatim sa mRNK Purification Kit (Dynal, Oslo, Norway). Dijelovi obiju mRNK i ukupne RNK su zatim promijenjeni u jedno nukleotidnu cDNK uz upotrebu Superscript Preamplification System (BRL, Paisley, Scotland, UK). Uzorci rezultirajuće cDNK su upotrijebljeni u PCRu da se naprave i posebno pojačaju promjenjive regije C11 imunoglobulinskih teških i laganih lanaca.
Kloniranje i sekvencioniranje promjenjive regije teškog lanca C11
Teški lanac je kloniran pomoću varijacije postupka Bendig i Jones (Bio-Technology 9:88-89) u kojem su 12 prednjih primera koji su specifični za signalnu peptidnu regiju glasnika teškog lanca i 1 zadnji primer specifičan za mišju γ1 konstantnu regiju upotrijebljeni u PCRu za pojačavanje cijele promjenjive regije. Radije nego svih 12 prednjih primera u samoj reakciji, izvedeno je 12 pojedinačnih PCR, a za svaki je upotrijebljen jedan od primera u kombinaciji sa γ1 okrenutim primerom. Ova reakcija je izvedena sa zagrijavanjem na temperaturi 42,5°C (korak 2 u shemi iznad).
Uzorci svake od reakcija su analizirani na agaroznom gelu, i reakcijska traka očekivane veličine je viđena u reakciji koja je koristila prednje primere MHV11. Bazirano na tim rezultatima, dva PCRa koriste MVH11 a g1 okrenuti primer koji je izveden uz upotrebu cDNK koja je izvedena iz mRNK i iz ukupne RNK pojedinačno. Upotreba dva nezavisna PCRa da služe kao izvor materijala za kloniranje je uobičajeni postupak koji je poznat stručnjacima tako da bi se izbjegle serkvencijske greške uzrokovane pogrešnim rasporedom nukleotida sa Taq polimerazom.
Rezultirajući PCR fragmenti su napravljeni sa Xmal i Sall, gel pročišćavanjem, i zatim su klonirani u pUC18. Umetanje velikog broja klona iz svakog PCRa, a koji su sekvencionirani i identično su postavljeni, predlažući da sekvence ne sadrže greške koje su povezane sa PCR postupkom. Kompletne sekvence promjenjive regije su prikazane na crtežu 1 (SEKV. ident. broj 1), i potpuno se poklapaju sa Kabat Group III C suglasnim teškim lancem.
Kloniranje i sekvencioniranje promjenjive regije laganog lanca C11
Promjenjiva regija laganog lanca C11 je klonirana po sličnom postupku, ponovno uključujući set od 11 prednjih primera specifičnih za signalnu peptidnu regiju glasnika laganog lanca i 1 obrnuti primer specifičan za mišju κ konstantnu regiju (Bending i Jones, op cit). U dodatku, kako je prije određeno da taj set primer nedovoljno pojačava sve mišje kappa lagane lance, uključen je još jedan primer, ovdje označen kao MKV12 (sekvenca 5` ACTAGTCGACATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTC3`) (SEKV. ident. broj 41). Kao i iznad, odvojeni PCRi, svaki uključuje jedan prednji primer i κ konstantni okrenuti primer, koji je izveden, i analiziran sa elektroforezom na agaroza gelu.
Tri dobivena reakcijska produkta su očekivane veličine. Na njih je odvojeno djelovano sa enzimima sa Small i Xmal, zatim su pročišćeni i klonirani u pUC18 da dobijemo klonove označene kao VKI, VKJ iVKK. Oni su djelomično sekvencionirani tako da se odredi njihov identitet. Djelomična sekvenca za klon VKI je postavljena da bude identična sa poznatom sekvencom laganog lanca izvedenog iz MOPC21 mieloma koji je dio u CDR3 (Genbank M35669), a VKI je odbačen. Djelomična sekvenca za klon VKK, uključujući CDR3, postavljena je da identična sa produktivnim promijenjenim MOPC21 laganog lanca (Genbank J00560, J00552). To samo za sebe unaprijed ne isključuje da je VKK klon od ispravnog C11 laganog lanca kao i da oba lagana lanca mogu dijeliti CDR3 u zametnoj konfiguraciji, ali dajući to mielomima srodnim hiridomima za koje je poznato da su MOPC21 izvedeni, i drugim MOPC21 povezanim sekvencama koje su već dokazane (klon VKI), a za klon VKK je mišljenje da je za razliku ispravan.
Za klon VKJ se smatralo da najviše predstavlja pravi C11 lagani lanac promjenjive regije, a kao djelomična sekvenca nije identičan sa sekvencama u Genbangu. VKJ je sekvencioniran potpuno, te je postavljen da bude potpuno-funkcionalna sekvenca laganog lanca, bez dijelova, nalik na korištenje VK167 ili VK24 gena, smještajući ih kao atipične u Kabat group II sekvence. Kompletna sekvenca VKJ klona je prikazana u crtežu 2 (SEKV. ident. broj 2). Drugi nezavisni PCR koristi primerski par koji proizvodi VKJ klon je također izveden , i dobiveni produkt je kloniran i sekvencioniran kao i iznad da se unaprijed isključe mogućnosti da VKJ sekvenca sadrži PCR greške. Klonovi tog drugog pojačavanja imaju sekvencu identičnu sa izvornim VKJ klonom.
Definitivni dokaz da VKJ sadrži C11 promjenjivu regiju laganog lanca je dobiven kroz izradu kimerskih antitijela koja koriste taj VK i VH koji su opisani iznad. Ta su antitijela prikazana spojena na CD23.
Pravljenje kimernih antitijela
Da se potvrde ispravne promjenjive regije teškog i laganog lanca one su klonirane i sekvencionirane, a kimerni anti-CD23 je napravljen. Promjenjiva regija teškog lanca je pojačana uz upotrebu kolonova iz cDNK knjižnice. Prednji primer sadrži 5` kloniranih mjesta (Hind III), 5` ne translatiranih sekvenci uključujući i funkcionalni Kozac signal, zajedno sa prvih šest kodona mišjeg promjenjivog teškog lanca. Okrenuti primer stvara Spe I mjesto u poretku 4 u okviru da spoji ljudsku gamma I konstantnu regiju. Ti primeri pokreću 430 parova baza produkta.
Teški lanac anti-CD23 kimernog oligo PCRa
5` gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA CAg gAC CTC ACC ATg gAT TTT ggg CTg aTT 3` SEKV. ident. broj 19
5` gAT ggA CTA gTg TCC CTT ggC CCC A 3` SEKV. iden. broj 20
Primeri za pojačavanje anti-CD23 promjenjive regije laganog lanca za pravljenje kimernih laganih lanca su napravljeni da sadržavaju 5` kloniranih mjesta (Hind III), 5` ne translatiranih sekvenci uključujući funkcionalni Kozak signal, zajedno sa prvih šest kodona mišje promjenjivog laganog lanca. Okrenuti primer sadrži BsiW 1 mjesto i antikodone za indikaciju amino kiselina. Provjereni kodovi su standardni: Y = T ili C; K = T ili G; V = A, G ili C. Produkt je 420 baznih parova.
Lagani lanac anti-CD23 kimernog oligo PCRa
5` gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA CAg gAC CTC ACC ATg Agg TTC TCT gTT CAg 3` SEKV. ident. broj 21
5` gAT gCg TAC gTY TKA TYT CCA VCT TKG T 3` SEKV. iden. broj 22 ( i SEKV. ident. broj sekvenci 42 do 45 i 52 i 53)
T R K I E L K T
R V
PCR produkti teškog lanca su očišćeni, odrezani sa Hind III i Spe I, i zatim su klonirani u pUC vektor koji je odrezan sa Hind III a Spe I sadrži ljudsku gamma I konstantnu regiju. Ljudska konstantna regija upotrebljavala je IgG1 teškog lanca a opisao ju je Reichmann L i sur (1988) Nature 322, 323-327 ali u cDNK kontekstu ju je opisao Page, M. J. Sydenham, M. A. (1991) Biotechnology 9, 64-68 i Crowe J. S. i sur. u Clinical Exp Immunol (1992) 87-105.
Promjenjiva i konstantna regija su uklonjene iz pUC vektora sa Hind III i Eco R1, a zatim su klonirana u Hind II – Eco R1 mjesto ekspresije vektora pEE6 dobiveno je iz Celltech (Stephens & Cockett i Nucl. Acids. Res. (1989) 17, 7110).
Kada je kimerni teški lanac sekvencioniran, nedostajalo je 100 parova baza od 5` sekvenci. Nakon pregleda mišje promjenjive sekvence teškog lanca, zapaženo je jedno Hind III mjesto. Da bi se stvorila kompletna promjenjiva sekvenca teškog lanca stvorena u PCR produktu, na PCR produkt je djelovano sa Hind III i mali fragmenti 100 parova baza su klonirani u Hind III uz djelovanje pEE6 koji sadrži teški lanac kimernog anti-CD23.
Lagani lanac PCR produkta je očišćen, zatim je odrezan sa Hind III i BsiW 1, te je zatim je ligiran u pUC vektor koji sadrži ljusku kappa konstantnu regiju. Ljudska kappa konstantna regija je upotrijebljena kako je opisao Reichmann L. i sur (1988) Nature (iznad). Promjenjiva i konstantna regija laganog lanca je uklonjena iz pUC vektora sa Hind III i Eco R1. Fragment je kloniran u Hind III – Eco R1 mjesto ekspresije vektora pEE12 koje je dobiveno iz Celtech (Bebbington i Hentschel, In DNA cloning, Vol 3, poglavlje 8 IRL PRESS 1987).
Kimerni teški lanac je izoliran kao Bgl II – Sal I kazeta koja je umetnuta u Bam H1 – Sal I mjesto u pEE12 plazmidu laganog lanca, tako da su se geni laganog i teškog lanca našli u istom plazmidu.
Završna ekspresija plazmida sadrži kimerni CD23 koji je prolazno ekspresioniran u COS stanicama (bubrežne stanice zelenog majmuna) kako slijedi. Transfectam (Promega) je otopljen u 1mg/ml u skladu sa proizvođačkim uputstvima. Dan prije transfekcije, 5,0 x 105 stanica je stavljeno u šest posuda (Costar) u ukupnom volumenu od 2,5 ml u sredstvu. Sredstvo je Dulbecco`s Modified Eagle medium (Gibco/BRL) i 10% dijalizirani fetalni serum teleta (Hyclone). Posude su inkubirane preko nići na 37°C. U svaku od 6-prikladnih posudica, dodano je 20μl Transfectama u 0,5 ml sredstva, koje je slobodno od seruma, u sterilni polistirenski maleni spremnik, i zatim je brzo vrtloženo. Za svaki tekući sastojak koji će biti transfekcioniran, dodano je 4 μg plazmida DNK u 0,5 ml Transfectam otopine u sredstvo slobodno od seruma, zatim je miješano i ostavljeno na sobnoj temperaturi kroz 10 min dok su se dobivale stanice za transfekciju. Sredstvo je aspirirano iz stanica koje su tranfektirane i zatim su stanice pažljivo isprane 1 do 2 puta sa 5 ml pred-zagrijanog sredstva slobodnog od seruma po svakom tekućem sastojku, i zatim je 0,5 sredstva slobodnog od seruma dodano tekućem sastojku. Ranije dobiveno 0,5 ml DNK/Transfektam otopine je dodano u svako tekuće sredstvo i kada je sredstvo kompletirano, posudice su nježno uzburkane da bi se postiglo miješanje. Posudice su vraćene u inkubator kroz 4 sata. 2 ml kompletnog sredstva (koje sadrži 1,5 puta normalne koncentracije seruma) je dodano u transfekcijsku otopinu. Posudice su vraćene u inkubator kroz tri dana kad je sredstvo koje je sakupljeno iz posudica ubačeno u pokuse za mjerenje aktivnosti antitijela.
Kimerna antitijela su spojena sa sCD23 u ELISA pokusu. U ELISA pokusu za određivanje sCD23 spajanja, EIA/RIA posudice (Costar) su prekrivene sa 100 μl/sastojka od 2 μg/ml sCD23 u 35 mM NaHCO3, 15 mM Na2CO3, pH 9,3 i ostavljeno je preko noći na 4°C. Posudice su isprane tri puta sa 150mM NaCl, 50 mM Trizma bazom, 0,1% (v/v)nTween-20, pH 7,4 (TBS/Tween), i blokirana su kroz 1-2 sata na 22°C sa 100 μl/sastojka 2% goveđeg serum albumina u TBS/Tween, i isprana tri puta sa TBS/Tween.
Razrjeđenom supernatantu mišjeg hibridoma C11 je dodano 100 ml/sastojka jednog dijela 96 sastojka posude a razrjeđena kimerna anti-CD23 antitijela su prolazno izražena u supernatantu COS stanica te su dodana u drugi dio od 96 sastojaka posudica. C11 mišja antitijela su otkrivena sa anti-mišjim IgG (cijela molekula) peroksidazom koja je razvijena i konjugirana na kozi u Sigma A4416, razrjeđena 1:1000 u PBS/BSA (goveđi serum albumin) (1%). Kimerna anti-CD23 antitijela su otkrivena sa anti-ljudskim kappa laganim lancem (spojenim i slobodnim) i spojenom peroksidazom, (Sigma A-7164), razrjeđenom u 1:5000 u PBS/BSA (1%). Kimerna anti-CD23 su sigurna na spajanje sa sCD23 u ELISA pokusu.
Kimerna anti-CD23 su također sigurna u spajanje sa membranom CD23 kako je određeno sa FACS. Ti podaci dokazuju da su ispravni mišji C11 teški i lagani lanac promjenjive regije bili klonirani i sekvencionirani. Te mišje sekvence su zatim upotrijebljene za razvoj humaniziranih anti-CD23 antitijela.
Sastavljanje teškog i lakog lanca humaniziranih gena
Humanizirani teški i lagani lanci su sastavljeni uz slijeđenje postupaka koje su opisali Lewis i Crowe (Gene 101 297-302, 1991).
(i) Lagani lanac
Mišji poredak promjenjive regije sekvenci je uspoređen sa ljudskim poretkom sekvenci u GenBank bazi podataka.
Ljudski predak laganog lanca je uspoređen na homolognost sa mišjim anti-ljudskim anti-CD23 promjenjivim poretkom sekvence laganog lanca. Poredak koji je najviše homologan je izabran za PCR preklopno proširivanje; on je:
Lokus: HSIGKVII 490 bp mRNK
Definicija: Ljudska promijenjena DNK za kappa-imunoglobulinske vodeće peptide i promjenjivu regiju
Izvor: homo sapiens
Autori: Klobeck, H.G. i sur. Contribution of human V kappa II germ-line genes to light chain diversitiy, Nature, 309, 73-76, 1984.
Pregledana je svaka amino kiselina koja je različita u istoj poziciji u mišjem i ljudskom poretku. Ljudska amino kiselina je držana ukoliko antigeno spajanje nije djelotvorno iz razloga što ljudske rezidue moraju biti manje imunogenske nego mišje rezidue. Prepoznavanje specifičnih rezidua za djelotvorno spajanje je hipotetsko i bazira se na podacima dobivenim u drugim antigen-antitijelo interakcijama. Iz objavljenih podataka, rezidue 71, 91, i 94 u poretku teškog lanca su bile prikazane u međudjelovanju sa antigenim spajanjem (Tramontano, A., Chotia, C., i A. M. Lesk, J. Mol. Biol 215, 175-182, 1990.; Kettebourgh, C. A., Saldanha, J., Heath, V. J., Morrison, C. J. i M. M. Bending, Protein Eng, 4, 773-783, 1991). Te rezidue su stoga bile slične u humaniziranom poretku kao i u mišjem poretku. Svaka amino kiselinska promjena je uzeta u obzir zbog veličine, hidrofobnosti, hidrofilnosti i punjenja. Ukoliko je ljudska amino kiselina slična sa mišjom amino kiselinom u tim karakteristikama, stoga se ljudska amino kiselina koristi na tom mjestu.
Postoji 13 razlika između amino kiselinske sekvence mišjeg promjenjivog poretka sekvenci laganog lanca i homolognog ljudske promjenjive sekvence laganog lanca. Nijedna od mišjih rezidua nije podupirana. Ljudska promjenjiva sekvenca laganog lanca je stvorena i GCG program je iskorišten za dokazivanje tihih mjesta za slijedeće enzime:
Accl; Heal; Nhel; Pvull; Xbal; Xhol; Xmal
Promjene u nukleotidnim sekvencama su napravljene da uključe ta restrikcijska enzimska mjesta bez promjene amino kiselinske sekvence. Nazočnost tih mjesta je uključena da se lakše napravi rez i bojenje fragmenta PCR klona.
Humanizirani promjenjivi lagani lanac je stvoren pomoću cijepljenja mišjeg laganog lanca CDRa na postojeće predloške (na primjer HSIGKVII Klobek, H. G. i sur. Nature (1984) 309, 73-76) sadržavajući izabrani ljudski poredak sekvenci laganog lanca koristeći spajanje preklapanja PCR. (Crowe, i sur. iznad.). Plazmidi kodiraju humanizirane promjenjive sekvence laganog lanca koje su razvijene kako slijedi:
Kozak sekvenca za transkripciju i signalna sekvenca (MGWSCIILFLVATATGVHS – SEKV. ident. broj 15) su uključeni u predloženu sekvencu laganog lanca. Hind II mjesto je dodano na 5` kraj i Bswi I mjesto je dodano na 3` kraj Pcr produkta za kloniranje. Oligo za PCR preklopno proširenje su:
AL: SEKV. ident. broj: 23. 5` gAT CAA gCT TCT CTA CAg TTA CTg AgC ACA 3`
BL: SEKV. ident. broj: 24. 5` AAT CAA gTA TgT CTT CCC ATC CTT ATA CAg gAg ACT CTT ACT CgA gCg ACA ggA ggC 3`
CL: SEKV. ident. broj: 25. 5` CgC TCg AgT AAg AgT CTC CTg TAT AAg gAT ggg AAg ACA TAC TTg AAT Tgg TAC CTg CAg AAg 3`
DL: SEKV. ident. broj: 26. 5` TgA TgC CCg ggT ggA CAT CAA ATA gAT CAg gAg CTg 3`
EL: SEKV. ident. broj: 27. 5` TTg ATg TCC ACC Cgg gCA TCA ggg gTC CCT gAC Agg 3`
FL: SEKV. ident. broj: 28. 5` AgC CAC CTg ACg TTT gAT CTC CAC CTT ggT CCC TTg
gCC gAA Cgt gAA Tgg ATA CTC TAC CAg CTg TTg ACA gTA ATA AAC CCC 3`
PCR reakcije (Saiki i sur. Science 239, 487-491, 1988) su izvedene na programibilnom zagrijanom bloku (Perkin Elmer, GeneAmp 9600) koristeći okruglo 25 temperaturnih ciklusa (94°C kroz 1 min, 50°C kroz 2 min, i 72°C kroz 3 min) i nakon toga krajnji 5 min. korak na 72°C. Primeri (na 40 uM koncentracije svaki), specificirani iznos predloška, i 2,5 jedinica Taq polimeraze (Perkin Elmer Cetus) je upotrijebljeno u završnom volumenu od 50 ul sa reakcijskim puferom koji je preporučio proizvođač.
Tri primarne PCR reakcije su inicijalno izvedene sa 10 ng predloška po reakciji, koristeći primerske parove AL sa BL, CL sa DL, EL sa FL pojedinačno. Produkti tih PCR reakcija, fragmenti ABL, CDL i EFL pojedinačno su pročišćeni uporabom Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen Ltd, Surrey, UK, produkt #28104) slijedeći protokol koji je preporučio proizvođač. Fragmenti ABL i CDL su spojeni upotrebom jedne desetine svakog pročišćenog produkta, i smještene u rekombinantnu PCR reakciju sa primerima AL i DL. Produkt te reakcije, fragment ADL je pročišćen kao i iznad, i jedna desetina produkta je spojena u rekombinantnu PCR reakciju sa jednom desetinom pročišćenog EFL uz upotrebu primera AL i FL. Finalni humanizirani rekombinant laganog lanca PCR produkta, AFL, je vezan u pCTTM II sa «TA Cloning Kit» (Invitrogen BV, Leek, Nizozemska, produkt #K2000-01) slijedeći protokol koji je preporučio proizvođač.
Plazmidini izolati su sekvencionirani upotrebom ABI fluorescentnog sekvencionera.
(ii) Teški lanac
Ljudski poredak sekvenci koji je homologan sa mišjim poretkom sekvenci je dokazan za teški lanac. Najviše homologna sekvenca u bazi podataka za teški lanac je:
Locus: HUMSIGVS 423 BP mRNK
Definicija: Ljudski Ig mišji-lanac mRNK V3b-D-J4 regija 5` kraj
Izvor: Homo sapiens cDNK do mRNK
Autori: Sanz, I. i sur. VH sekquebce of human autoantibody. Evidence that autoantibodies can be unmutated copis of germline genes. J. Immuno. 142, 883-887, 1989.
Postoji sedamnaest razlika između amino kiselinske sekvence mišjeg promjenjivog poretka sekvenci teškog lanca i homologne ljudske promjenjive sekvence poretka teškog lanca. U pet pozicija 49, 66, 76, 77 i 94 mišje amino kiseline su se podudarale. Na ostalim pozicijama ljudske amino kiseline su korištene za humaniziranje poretka teškog lanca.
Niz ljudskih promjenjivih sekvenci teškog lanca je proizveden u GCG programu te je iskorišten za dokazivanje tihih mjesta za slijedeće enzime:
Eagl, Nhel, Xbal; Xhol; Xmal
Promjene u nukleotidnoj sekvenci su napravljene da uključe ta restrikcijska mjesta enzima bez promjene amino kiselinske sekvence. Nazočnost tih mjesta je uključena da se lakše napravi rez i bojenje fragmenta PCR klona.
Hind III restrikcijsko mjesto za kloniranje, Kozak sekvenca za početak transkripcije, i mišja signalna sekvenca (MAWVWTLLFLMAAAQSAQA – SEKV. ident. broj 16) za proteinsku sekreciju su dodani 5` kraju humanizirane promjenjive regijske sekvence teškog lanca. Spel restrikcijsko mjesto je dodan na 3` kraj za kloniranje.
Humanizirani promjenjivi poredak teškog lanca sa mišjim CDRima je izgrađen u PCRu uz upotrebu dugih preklapajućih oligonukleotida: Osam oliga je sintetiziralo približno 60 parova baza sa 15 parova baza koji se preklapaju. Oligo su kako slijede:
AH: SEKV. ident. broj: 29. 5` ACA CgA AGC TTC ACC ATg gCT Tgg gTg Tgg ACC TTg CTA TTC CTg ATg gCg gCC gCC CAA 3`
BH: SEKV. ident. broj: 30. 5` CTT TAC CAA gCC TCC CCC AgA CTC CAC CAg CTg CAC CTC TgC TTg ggC ACT TTg ggC ggC CgC CAT 3`
CH: SEKV. ident. broj: 31. TTg gTA Aag CCC ggg ggg TCC CTT AgA CTC TCC TgT gCA gCT AgC ggA TTC ACT TTC AgT 3`
DH: SEKV. ident. broj: 32. 5` CCC CTT CCC Tgg AgC CTg gCg gAC CCA ggA CAT CCA gTA gCC ACT gAA AgT gAA TCC gCT 3`
EH: SEKV. ident. broj: 33. 5` ggg AAg ggg CTC gAg Tgg gTT gCT gAA ATT AgA TTg AAA TCT gAT AAT TAT gCA ACA CAT 3`
FH: SEKV. ident. broj: 34. 5` ATC ATC TCT TgA gAT ggT gAA TTT CCC CTT CAC AgA CTC CgC ATA ATg TgT TgC ATA ATT 3`
GH: SEKV. ident. broj: 35. 5` ATC TCA AgA gAT gAT TCA AAA TCT AgA CTg TAT CTg CAA Atg AAC AgC CTg AAA ACC gAg gAC ACA 3`
HH: SEKV. ident. broj: 36. 5` ggT gAC TAg TgT TCC CTg gCC CCA gTC TAT gAA ATC TgT ACA gTA ATA CAC ggC TgT gTC CTC ggT TTT 3`
Mišji CDRi su cijepljeni na predlošku uz korištenje rekombinantnog PCR. PCR je izveden upotrebom programibilnog termičkog ciklusa (Trio; Biometra). 50 μl reakcije sadržava 2,5 jedinica AmpliTa polimeraze (Perkin-Elmer-Cetus, Beaconsfield, UK) u puferu koji je opskrbio proizvođač, pufer koji osigurava poželjni pH i ionsku snagu za pojačavanje (10mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl i 1,5 mM MgCl2), 200 μM od svakog dATP, dCTP, dGTP, i dTTP, i primere za pojačavane na 1 μg/μl. Uzorci su grijani na 94°C kroz 2 minute u grijanom bloku, zatim se centrifugirani kroz 30 sec. Na 16,000xG. Uzorci su zatim smješteni na led kroz 1 min, zatim je dodana Taq polimeraza i kap mineralnog ulja na svaki uzorak. Uzorci su miješani, zatim su centrifugirani kroz 30 sec na 16,000xG. Uzorci su smješteni u termalno kolo koje je programirano kako slijedi:
Korak 1: 94°C kroz 1 minutu
Korak 2: 50°C kroz 2 minute, podižući do koraka 3 za 0,4°C/sekundi
Korak 3: 72°C kroz 3 minute, idi na korak 1 i okreni sve 25 puta
Sedam primarnih PCR reakcija je inicijalno izvedeno sa 1 μg/μl od svakog primera po reakciji, uz korištenje primerske kombinacije AH i BH, CH i DH, EH i FH, GH i HH; AH BH CH i DH EH FH GH i HH; AH BH CH i DH, EH i FH GH i HH. 1 ul dio u primarnoj PCR reakciji produkta je kombiniran sa primerima (1 ug/ul) i smješten je u iste PCR reakcijske uvjeta koji su opisani za primarnu PCR reakciju da se stvori puna dužina promjenjive regije teškog lanca. Primarni reakcijski PCR fragmenti AFH i EHH fragment, AHH, fragmenti ABH, GHH i AHH, fragmenti ABH, CDH, EFH i GHH, fragmenti ABH, CDH, EFH, GHH i AHH su kombinirani sa primerima AH i HH. Sve PCR reakcije su dale punu dužinu fragmenata. Promjenjiva regija humaniziranog teškog lanca PCR produkta od ABH, GHH, i AHH reakcije je pročišćena uz pomoć Wizard PCR Preps DNK Purification Sistem (Promega) slijedeći protokol koji je preporučio proizvođač. Pročišćeni produkt je izrezan sa Hind III i Spe I i zatim je kloniran u pUC vektor koji sadrži konstantnu regiju mutiranog IgG1 (vidi ispod).
Pravljenje humaniziranih antitijela
Promjenjiva regija PCR produkta humaniziranog teškog lanca je izrezana sa Hind III i Spe I i zatim je klonirana u pUC vektor koji sadrži konstantnu regiju mutiranog IgG1 (vidi ispod). Promjenjive regije klona su sekvencionirane, crtež 3 i 4 (SEKV. ident. broj 17 i 18). Klon sadrži ispravnu humaniziranu promjenjivu amino kiselinu teškog lanca koja je odabrana. Taj klon ima tihi nukleotid promijenjen u modelu humanizirane promjenjive sekvence teškog lanca.
IgG1 sa mutacijama eliminira C1q, a Fc spajanje je upotrijebljeno za konstantnu regiju humaniziranog teškog lanca. Te mutacije su bazirane na slijedeća dva rada: Duncan, A.R. i Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988 i Duncan, A. R., Woolf, J. M., Partidge, L. J. Burton, D. R. i Winter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988.
Mutirane rezidue su prikazane u Kabat, E. A., Wu, T. T. , Perry, H. M., Gottesman, K. S. i C. Foeller, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Volumen 1, strana 680.
Promjene napravljene na IgG1 da se stvori IgG1 izotop smanjene citototoksičnosti su kako slijede: 248 Leu (CTg) do Ala (gCg) i 250 Gli (ggA) do Ala (gCA).
Te mutacije su napravljene na mjestu direktne mutageneze ljudskog IgG1 kako slijedi:
Konstantne regije oligo PCR koje su upotrijebljene za dobivanje IgG1 sa mutacijama su:
SEKV. ident. broj 37 Ac gCT gCT CCT TTT AAg CTT Tgg ggT CAA ggC TCA CTA gTC ACA gTC TCC
SEKV. ident. broj 38 Bc TgA Cgg TgC CCC CgC gAg TTC Agg
SEKV. ident. broj 39 Cc CCT gAA CTC gCg ggg gCA CCg TCA
SEKV. ident. broj 40 Dc AAg CTT CCg TCg AAT TCA TTT ACC Cgg AgA CAg
Oligo Ac sadrži Hind/Spel mjesto. Oligo Bc i Cc sadrže mutacije u poziciji 248 i 250. Oligo Dc sadrži Eco R1 mjesto. Oligo Ac i Bc su upotrijebljeni za stvaranje fragmenata AB uz korištenje PCR specificiranih uvjeta opisanih u General Methodology section of this application and cloned human IgG1 constant region as template (Reichmann, L., Clark, M., Waldmann, H., i Winter, G. (1988) Resharping human antibodies for therapy, Nature 322, 323-327). Oligo Cc i Dc su upotrijebljeni za stvaranje fragmenta CD uz korištenje istih PCR uvjeta kao predložak za AB. PCR fragmenti AB i CD su pročišćeni uporabom Wizard PCR Preps DNK Purification Sistem (Promega). PCR fragmenti ABc (5,0 ul) i CDc (5,0 ul) su kombinirani sa oligo Ac i Dc na način da stvore fragment ADc koji sadrži konstantnu regiju IgG1 sa mutacijama. Fragment ADc je pročišćeni uporabom Wizard PCR Preps DNK Purification Sistem (Promega), digestiran sa Hind II i Eco R1, zatim ligiran u Hind III – EcoR1 digestiran PEE6 plazmid koji sadrži promjenjivu regiju humaniziranog anti-CD23 teškog lanca.
Konstantna regija je sekvencionirana da potvrdi mutacije. Fragment koji sadrži te mutacije je premješten na ekspresionirani plazmid pEE6 koji sadrži promjenjivu regiju humaniziranog anti-CD23 teškog lanca.
Promjenjiva regija humaniziranog PCR produkta laganog lanca je izrezana sa Hind III i BsiW1, i zatim je klonirana u ekspresiju plazmida pEE12 koji sadrži konstantnu regiju ljudskog kappa laganog lanca a koja je opisana iznad. Klonovi su sekvencionirani uporabom ABI fluorescentnog sekvencera a taj odabrani klon sadrži ispravnu amino kiselinsku sekvencu za promjenjivu regiju humaniziranog lakog lanca.
Bgl II – Sal I fragment sadrži humanizirani anti-CD23 teški lanac iz pEE6 plazmida koji je ligiran na Bam H1 – Sal I mjesto pEE12 plazmid koji sadrži humanizirani anti-CD23 teški lanac na način da se napravi jedan plazmid koji će sadržavati oba humanizirana anti-CD23 teška lanca. Sekvencionirana je promjenjiva i konstantna regija humaniziranog teškog lanca i promjenjiva i konstantna regija humaniziranog laganog lanca u finalnoj ekspresiji plazmida.
Prolazna ekspresija humaniziranog antitijela
Plazmid sa humaniziranim anti-CD23 je tranfekcioniran u COS stanice i prolazno je ekspresioniran uz upotrebu istog protokola koji je opisan za kimerna antitijela iznad. Ekspresionirani plazmid sa ljudskim anti-CD23 je tranfekcioniran u COS stanice i prolazno ekspresioniran kako je opisano i za kimernu anti-CD23 prolaznu ekspresiju.
Koncentracija kimernih i humaniziranih anti-CD23 antitijela zahtijevanih za polovicu-maksimuma spajanja s sCD23 je pokusno upotrijebljena s sCD23 a ELISA pokus je već opisan. Optička gustoća na 405 nm je unesena u dijagram nasuprot stupnju koncentracije antitijela koja stvaraju sigmoidalnu krivulju sa «dobrim položajem» u korelaciji koeficijenta 1. Optička gustoća je očitana uz pomoć molekularne naprave za čitanje s posudica (Menlo Park, Calif., SAD) i Softmax (Molecular Devices Corp) softvera za izračunavanje najbolje prilagodbe sa log-logit algoritmom i zatim prikazuje krvulju danu jednadžbom parametra i koeficijentom korelacije. Rasprave prilagodbi krivulja dane su u «Data Analysis and Quality Control of assays: A Practical Primer», od R. P. Channing Rogers u Practical Immuno Assay, pisca Wilfrid Butt; objavljuje Marcel Dekker, Inc., New York 1984. Algoritam prilagodbi krivulja za log-logit sustav jednadžbi je baziran na Levenberg-Maquardt postupku. Rasprava o tom postupku može se naći u Numerical Principles in C: The Art of Science computing by William H Press, Brian P Flannery, Saul A Teukolski i William T Vetterling, a objavio ga je Cambridge University Press, New york, 1988. Iznos za x u ng/ml je uračunat u slijedećim jednadžbama:
x = c x [a - y] 1/b
[y - d]
kada y + d – c
2
i kada
je d y-vrijednost koja odgovara ravnoj crti za visoke vrijednosti x-osovine a i ako y-vrijednost odgovara ravnoj crti za male vrijednosti x-osovine
c je x-vrijednost za među točku između a i b
b opisuje kako rapidno zavoj radi svoju transformaciju iz ravne crte u centar zavoja, tipično 1.
Polovica-maksimalnog spajanja sCD23 sa kimernim anti-CD23 je 16,28 ng/ml (vidi crtež 5). Polovica-maksimalnog spajanja je konstantna za humanizirani anti-CD23 i ona iznosi 15,03 (vidi crtež 6). Ovi podaci pokazuju da humanizirani anti-CD23 ima ekvivalentno spajanje sa kimernim anti-C23 koji je kompletna promjenjiva regija mišjeg C11.
Stabilna ekspresija
Stabilna linija stanica ekspresioniranih humaniziranih anti-CD23 je izabrana upotrebom glutaminin sintetaze sistema za pojačavanje gena dobivenog u Celtech. Osnovni sistem je kako slijedi opisao Bebbington i sur., 1992, Biotechnology 10, 169-175. Sistem opisuje pravljenje prikladne linije stanica uvođenjem linearizirane ekspresije vektora koji sadrži cDNK koja kodira hrčkovu glutamin sintetazu pod kontrolom SV40 ranog promotora i isprepletenog SV40 i poliadenilacijskog signala te cDNK za teški i lagani lanac antitijela u stanice sisavca pomoću elektroporacije. Transfektirane stanice su zatim odabrane po sposobnosti za rast u sredstvu slobodnom od glutamina. NSO stanice (ne-imunoglobulinske sekrecijske mišje mieloma B stanice) su upotrijebljene za pravljenje humanizirane anti-CD23 stabilne linije stanica koja raste u Iscove`s Modified Dulbecco`s Medium (Sigma) sa 2 mM glutamina (GIBCO/BRL) i 10% fetalnom serumu teleta (Hyclone) (ne-selektivno sredstvo). Anti-CD23 linija stanica je napravljena kako slijedi. Ekspresija plazmida koja sadrži humanizirane anti-CD23 (40 ug) je linearizirana sa FsP1 (New England Biolabs), etanolnim precipitatom te je resuspendirana u 50 μl sterilne vode. Brojan je eksponencijalni rast NSO stanica. Stanice (107) su centrifugirane i jednom isprane u fosfatnom slanom puferu (PBS). Stanice su resuspendirane u 950 μl sterilnog PBS. DNK a zatim i stanice su dodane u elektroporacijsku kivetu (0,4 mm, Bio-Rad) na ledu. Kiveta je smještena u Bio-Rad elektroporator i isporučena su dva uzastopna pulsa od 1500 volti sa 3 μF. Kiveta je uklonjena iz elektroporatora i smještena na led. Stanice su razrjeđene od 104, 103, 102 stanica/ml u ne-selektivnom sredstvu i smještene su u 96 posudica (Costar), 50 μl/sastojku. Slijedeći dan 150 μl Iscove`s Modified Dulbecco`s Medium (Sigma) sa 60 μg/ml glutaminske kiseline (Sigma), 60 μg/ml asparagina (Sigma), 7 μg/ml od svakog adenozina (Sigma), gvanozin (Sigma), citidin (Sigma), uridin (Sigma) i timidin (Sigma), i 10% fetalnog seruma teleta (Hyclone) (selektivno sredstvo) je dodano svakom sastojku. Posudice su vraćene na 37°C u inkubator i ostavljene sve dok se nije pojavila supstancijalna stanična smrt te su se pojavile diskretne kolonije koje su preživjele.
Kolonije su premještene iz mase od 96 sastojaka u jedan sastojak sa 24 posudice, zatim poslije nekoliko dana, masa sastojaka iz 24 posudice je upotrijebljena za inokuliranje u bočicu od 25 ml. Potrošeno sredstvo je isključeno sa svježim selekcijskim sredstvom da se izvede bolja ekspanzija. Jednom u bočici, kulture su održavane između 105 i 106 stanica/ml. specifično dobiveni odnos (SPR) 144 klonova je izveden da se usporedi dobivanje antitijela svakog klona tako da najveća produkcija klona bude izabrana kao produkcijska linija. SPR je izveden uzimanjem 106 stanica iz smjese iz bočice, a zatim su stanice isprane sa PBS, te je stanicama dodano 10 ml svježeg sredstva kro 24 sata na 37°C. Dobivanje antitijela je mjereno pomoću ELISA pokusa.
Klonovi koji su prvi zaštićeni za dobivane ljudskih IgG koriste ELISA pokus kako slijedi. EIA/RIA posudice (Costar) su prekrivene sa 100 μl/sastojka sa 5 μg/ml kozjeg anti-ljudskog IgG (Jackson Immunoresearch Labs #109-001-003) u 35 mM NaHCO3, 15 mM Na2CO3, pH 9,3 na 4°c preko noći. Posudice su isprane tri puta sa 150 mM NaCl, 50mM Trizma baze, 0,1% (tež/tež) Tween-20, pH 7,4 (TBS/Tween), blokirane kroz 1-2 sata na 2°C sa 100 μl/sastojku 2% kravljeg serum albumina u TBS/Tween, i zatim su isprane tri puta sa TBS/Tween. Jedna stotina mikrolitre kontrolnog Campath-1H IgG [age, M. J. i Sydenham (1991) (iznad)] standard (1000 ng/ml – 1 ngml) dodano je kontrolnom sredstvu ili uzorku supernatanta, u triplikate, u sastojak te je inkubirano preko noći na 4°C. Posudice su isprane pet puta sa TBS/Tween i 100 μl od 1:5000 otopine kozje anti-ljudske alkalne fosfataze je konjugirano (Jackson Immunoresearch Labs #109-055-088) te je dodano i inkubirano kroz 2 sata na 22°C ili preko noći na 4°C. Posudice su isprane pet puta sa TBS/Tween i dodano je100 μl od 3 nM pNPP u puferskom supstratu (Sigma 104-0) i posudice su očitane na 405 nm na mikrotitracijskom čitaču posudica (Molecular Devices) upotrebom 20 minutnog kinetičkog programa. Standardni zavoji i uzorak koncentracije IgG je uračunat i unesen je direktno u program. SPR je izražen kao μg/ 106 stanica/ 24 sata. SPRi od 144 klona opsega od 14 – 0 μg/106 stanica/24 sata. Klonovi koji su izraženi na najmanje 5μg / 106 stanica/ 24 sata su također testirani na spajanje s sCD23 upotrebom ELISA pokusa koji je već opisan. Kimerni CD23 je upotrijebljen kao standard za te pokuse.
Liza komplemenata i ADCC pokusi
FITC koji je označen kao humaniziran anti-CD23 je upotrijebljen da potvrdi ekspresiju površine CD23 na RPMI stanicama sa tekućom citometrijom. Te iste stanice su obojene sa FITC označenim humaniziranim anti-CDw52 antitijelima (hCD52) i nađeno je da su negativne za CD52 ekspresiju. Naprotiv, Wein 133 obojane stanice su pozitivne na hCD52 ali negativne za anti-CD23.
RPMI 8866 stanice su obojane sa europium dietilen triaminopentaacetatom (Eu/DTPA) dok su Wein 133 stanice označene sa samarium dietilen triaminopentaacetatom (Sm/DTPA) u skladu sa postupcima koje je opisao (Blomberg, K, 1993, J. Immunol. Methods 168, 267 Patel i sur, 1995, J. Immunol. Methods 184, 29). A1:1 mješavina označenih Wein 133 stanica i RPMI 8866 stanice su zatim lizirane sa jednim ili drugim hCD52 ili anti-CD23 uz prisutnost NHS kao izvora komplementa. Aktivacija komplementa kroz klasične ulazne putove sa hCD52 uzrokuje otpuštanje Sm/DTPA. Nijedan Sm/DTPA nije otpušten u prisutnosti anti-CD23. podaci potvrđuju da samo hCD52 i ne anti-Cd23 uzrokuju lizu Wein 133 stanica. Podaci nadalje potvrđuju da se ulazni putovi komplementa budu aktivirali da uzrokuju lizu stanica. Nijedan Eu/DTPA iz RPMI 8866 nije otpušten sa hCD52 kako je unaprijed očekivano. Mada RPMI 8866 stanice izražavaju CD23, nijedan Eu/DTPA nije otpušten sa anti-CD23, prikazujući tako da su antitijela nesposobna aktivirati komplement.
Liza 1:1 mješavine označenih Wein 133 stanica i RPMI 8866 sa antitijelima ovisi o staničnoj citotoksičnosti (ADCC) te je pokušana sa oba anti-Cd23 ili hCD52 u prisutnosti monklirnih stanica periferne krvi (PBMC). Otpuštanje Sm/DTPA sa hCD52 i ne anti-Cd23 potvrđuje da je samo kasnije nemoguće djelovati lizi ADCC na Wein 133 stanice. To ne iznenađuje, otkad Wein 133 stanice ne izražavaju CD23. Nijedno od antitijela ne uzrokuje otpuštanje Eu/DTPA. To nas upućuje da iako je ekspresija CD23 potvrđena na RPMI 8866 stanicama pomoću tekuće citometrije, a nije otkriveno da ADCC djeluje na lizu stanica sa anti-CD23.
Kinetička analiza
Odnos udruživanja, odnos razdruživanja i konstantni odnos razdruživanja za spajanje humaniziranih anti-Cd23 na CD23 antigen je ocjenjivano na Biacore Biosensor. Ukratko, pročišćeni rekombinant CD23 je imobiliziran na CMC osjetljivu površinu. Karboksilna skupina na površini dekstrana je aktivirana sa 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbamid (EDCO/N-hidroksisukcimimid) (NHS). Slijedeći aktivaciju, rekombinantni CD23 je prošao preko površine da inicira imobilizaciju. Zatim je dodan etanolamin da se poliju rezidualne aktivne skupine. Humanizirana anti-CD23 otopljena u HBS puferu su pasirana preko osjetljive površine. Spajanje anti-CD23 na imobilizirane CD23 je praćen u pravom vremenu za ocjenu odnosa združivanja (M-1 sec-1). Disocijacija CD23 i anti-CD23 kompleksa u puferu je također praćena za ocjenu odnosa disocijacije (sec-1). Konstanta disocijacije (nM) izračunata iz odnosa disaocijacije i združivanja. Za 6 serija anti-CD23 podaci pokazuju odnos združivanja u opsegu od 1,5-1,8x106 M-1 sec-1 i odnos disocijacije od 1-2x10-5 sec-1. Za konstanta disocijacije za anti-CD23 je nađeno da je unutar 8-12 pM. Određena je konstanta afiniteta na približno 9x1010 Ka mo1-1.
Claims (19)
1. Antitijelo, naznačeno time, da ima dovoljno amino kiselinskih sekvenci za svaki CDR prikazan ispod kao i da je antitijelo sposobno spajati CD23 (FCεRII) tip II molekule ekspresionirane na hematopoetskim stanicama:
RSSKSLLY KDGKTYLN CDRL1 (SEKV. ident. broj: 3)
LMSTRAS… CDRL2 (SEKV. ident. broj: 5)
QQLVEYPFT CDRL3 (SEKV. ident. broj: 7)
GYWMS… CDRH1 (SEKV. ident. broj: 9)
EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2 (SEKV. ident. broj: 11)
FID… CDRH3 (SEKV. ident. broj: 13).
2. Antitijelo, naznačeno time, da spaja CD23 (FCεRII) tip II molekule ekspresioniran na hematopoetskim stanicama ili topivom CD23 kojeg karakterizira konstantni afinitet jednak ili veći od 1x109 Ka Mo1-1.
3. Antitijelo, naznačeno time, da kompetitivno inhibira spajanje antitijela koje ima CDR sekvence izvedene u zahtjevu 1, sa CD23 (FCεRII) tip II molekule ekspresionirane u hematopoetskim stanicama.
4. Antitijelo u skladu sa bilo kojim od prethodnih zahtjeva, naznačeno time, da je to izmijenjeno antitijelo.
5. Antitijelo u skladu za zahtjevom 4, naznačeno time, da je to humanizirano antitijelo.
6. Antitijelo u skladu sa bilo kojim prethodnim zahtjevom, naznačeno time, da poredak laganog lanca uključuje amino kiselinske rezidue na bilo kojoj od pozicija 49, 66, 76, 77 i 94.
7. Antitijelo u skladu sa bilo kojim prethodnim zahtjevom, naznačeno time, da poredak laganog lanca uključuje amino kiselinske rezidue svojih mišjih antitijela na poziciji 64.
8. Antitijelo, naznačeno time, da sadrži jednu ili obje amino kiselinske sekvence u skladu sa SEKV. ident. broj sekvence: 1 i 2.
9. Antitijelo, naznačeno time, da sadrži jednu ili obje amino kiselinske sekvence u skladu sa SEKV. ident. broj sekvence 17 i 18.
10. Antitijelo u skladu sa bilo kojim prethodnim zahtjevom, naznačeno time, da konstantna regija sadrži Ala na poziciji 235 i Ala na poziciji 237 po Kabatovom sistemu označavanja.
11. Antitijelo u skladu sa bilo kojim prethodnim zahtjevom, naznačeno time, da je za upotrebu u terapiji ljudi.
12. Upotreba antitijela prema zahtjevima od 1-10, naznačena time, da se koristi u proizvodnji medikamenata za liječenje slijedećih poremećaja artritis, lupus erythematosus, Hashimoto tiroiditis, multipla skleroza, diabetes, uveitis, dermatitis, psorijaza, urtikarija, nefrotični sindrom, glomerulonefritis, upale potrbušnice, ulcerativni kolitis, Kronova bolest, Sjorgenov sindrom, alergije, specifične astme, alergijska ili urođena astma, akutna asmatska egzarcebacija, rinitis, ekcem, GVH, COPD, inzulitis, bronhitis (naročito kronični bronhitis) ili dijabetes (naročito Tip 1 dijabetes), i malignosti B-stanica.
13. Upotreba antitijela, naznačena time, da spaja CD23 (FCeRII) tip II molekule ekspresionirane na hematopoetskim stanicama u proizvodnji medikamenta za blokiranje topive CD23 formacije.
14. Upotreba antitijela u skladu sa zahtjevom 13, naznačena time, da je antitijelo prema bilo kojim od zahtjeva 1–10.
15. DNK sekvenca koja kodira lanac antitijela, naznačena time, da sadrži jednu ili više sekvenci u skladu sa:
CDRL1 baza brojevi parova od 70-117 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj sekvence: 4)
CDRL2 baza brojevi parova od 163-183 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj sekvence: 6)
CDRL3 baza brojevi parova od 280-306 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj sekvence: 8)
CDRH1 baza brojevi parova od 91-105 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj sekvence: 10)
CDRH2 baza brojevi parova od 148-204 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj sekvence: 12)
CDRH3 baza brojevi parova od 301-309 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj sekvence: 14).
16. DNK sekvenca koja kodira lanac antitijela, naznačena time, da sadrži jednu ili obje kodirane sekvence od sekvenci u skladu sa SEKV. ident. broj sekvence: 1 i 2.
17. DNK sekvenca koja kodira lanac antitijela, naznačena time, da sadrži jednu ili obje sekvence u skladu sa SEKV. ident. broj sekvence: 17 i 18.
18. Farmaceutska formulacija, naznačena time, da sadrži antitijelo kako je definirano u bilo kojem od zahtjeva od 1 do 10 i farmaceutski prihvatljivi ekscipient.
19. Farmaceutska formulacija, naznačena time, da sadrži antitijela kako je definirano u bilo kojem od zahtjeva od 1 do 10 u kombinaciji sa imunomodulatorima ili anti-upalnim sredstvima i farmakološki prihvatljivim ekscipientom.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9809839.5A GB9809839D0 (en) | 1998-05-09 | 1998-05-09 | Antibody |
PCT/GB1999/001434 WO1999058679A1 (en) | 1998-05-09 | 1999-05-07 | Antibodies to cd23, derivatives thereof, and their therapeutic uses |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HRP20000762A2 true HRP20000762A2 (en) | 2001-06-30 |
Family
ID=10831668
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HR20000762A HRP20000762A2 (en) | 1998-05-09 | 2000-11-09 | Antibodies to cd23, derivatives thereof, and their therapeutic uses |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7008623B1 (hr) |
EP (1) | EP1076701A1 (hr) |
JP (1) | JP2002514421A (hr) |
KR (1) | KR20010043470A (hr) |
CN (1) | CN1308676A (hr) |
AP (1) | AP1547A (hr) |
AU (1) | AU763491B2 (hr) |
BR (1) | BR9910327A (hr) |
CA (1) | CA2328606A1 (hr) |
EA (1) | EA200001041A1 (hr) |
EE (1) | EE200000658A (hr) |
GB (1) | GB9809839D0 (hr) |
HR (1) | HRP20000762A2 (hr) |
HU (1) | HUP0102005A3 (hr) |
ID (1) | ID28088A (hr) |
IL (1) | IL139384A0 (hr) |
IS (1) | IS5696A (hr) |
NO (1) | NO20005632L (hr) |
NZ (1) | NZ507879A (hr) |
PL (1) | PL344019A1 (hr) |
SK (1) | SK16762000A3 (hr) |
TR (1) | TR200003281T2 (hr) |
WO (1) | WO1999058679A1 (hr) |
YU (1) | YU69000A (hr) |
ZA (1) | ZA200006312B (hr) |
Families Citing this family (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6696550B2 (en) | 1998-07-23 | 2004-02-24 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor |
GEP20063752B (en) | 2000-10-13 | 2006-02-27 | Biogen Inc | Humanized Anti-LT-Beta-R Antibodies |
US20040151721A1 (en) | 2001-10-19 | 2004-08-05 | O'keefe Theresa | Humanized anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor |
WO2004002431A2 (en) * | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Biogen, Inc. | Humanized anti-lymphotoyin beta receptor antibodies |
AR040778A1 (es) | 2002-08-06 | 2005-04-20 | Glaxo Group Ltd | Anticuerpos alterados o fragmentos funcionales que se unen a mag (glicoproteina asociada a mielina). |
GB0306309D0 (en) | 2003-03-19 | 2003-04-23 | Glaxo Group Ltd | Method of treatment |
WO2005000898A2 (en) | 2003-06-27 | 2005-01-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions |
CA2434668A1 (en) | 2003-07-04 | 2005-01-04 | Laurence Mulard | Novel approach to design glycopeptides based on o-specific polysaccharide of shigella flexneri serotype 2a |
EP1631311A4 (en) * | 2003-12-10 | 2007-04-11 | Millennium Pharm Inc | HUMANIZED ANTI-CCR2 ANTIBODIES AND METHOD OF USE |
US7435799B2 (en) * | 2004-01-08 | 2008-10-14 | Applied Molecular Evolution | TNF-α binding molecules |
CA2560742A1 (en) | 2004-03-23 | 2005-10-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof |
US20060246075A1 (en) * | 2004-09-29 | 2006-11-02 | Marc Mercken | Anti-amyloid antibodies, compositions, methods and uses |
WO2006074399A2 (en) | 2005-01-05 | 2006-07-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Multispecific binding molecules comprising connecting peptides |
CN101309704B (zh) | 2005-11-14 | 2012-10-10 | 礼纳特神经***科学公司 | 针对降钙素基因相关肽的拮抗剂抗体及其使用方法 |
GB0525662D0 (en) | 2005-12-16 | 2006-01-25 | Glaxo Group Ltd | Immunoglobulins |
US7680868B2 (en) * | 2005-12-20 | 2010-03-16 | Roche Molecular Systems, Inc. | PCR elbow determination by use of a double sigmoid function curve fit with the Levenburg-Marquardt algorithm and normalization |
EP1804172B1 (en) * | 2005-12-20 | 2021-08-11 | Roche Diagnostics GmbH | PCR elbow determination using curvature analysis of a double sigmoid |
WO2009043051A2 (en) * | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Biogen Idec Ma Inc. | Cd23 binding molecules and methods of use thereof |
US20090148905A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-11 | Claire Ashman | Antigen-binding constructs |
CA2716424C (en) | 2008-03-04 | 2015-04-28 | Pfizer Limited | Methods of treating chronic pain |
EP2271323A2 (en) | 2008-05-06 | 2011-01-12 | Glaxo Group Limited | Encapsulation of biologically active agents |
CA2753332A1 (en) | 2009-02-24 | 2010-09-02 | Glaxo Group Limited | Antigen-binding constructs |
EP2401298A1 (en) | 2009-02-24 | 2012-01-04 | Glaxo Group Limited | Antigen-binding constructs |
WO2010097394A1 (en) | 2009-02-24 | 2010-09-02 | Glaxo Group Limited | Multivalent and/or multispecific rankl-binding constructs |
JP2012522749A (ja) | 2009-04-01 | 2012-09-27 | グラクソ グループ リミテッド | 抗il−23免疫グロブリン |
WO2010122090A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Glaxo Group Limited | Fgfr1c antibody combinations |
AU2010288194B2 (en) | 2009-08-28 | 2013-08-29 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide |
FR2957598B1 (fr) * | 2010-03-17 | 2015-12-04 | Lfb Biotechnologies | Nouveau peptide signal, et son utilisation pour la production de proteines recombinantes |
KR101947356B1 (ko) | 2010-11-23 | 2019-02-12 | 글락소 그룹 리미티드 | 온코스타틴 m (osm)에 대한 항원 결합 단백질 |
MX2013005847A (es) | 2010-11-24 | 2013-12-12 | Glaxo Group Ltd | Proteinas de union a antigeno multiespecificas que eligen como blanco a hgf. |
US8974782B2 (en) | 2011-02-07 | 2015-03-10 | Glaxo Group Limited | Treatment of stroke comprising anti-MAG antibodies |
LT3415531T (lt) | 2011-05-27 | 2023-09-25 | Glaxo Group Limited | Bcma (cd269/tnfrsf17) – surišantys baltymai |
WO2014029752A1 (en) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Glaxo Group Limited | Anti lrp6 antibodies |
US10176293B2 (en) | 2012-10-02 | 2019-01-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | Universal method to determine real-time PCR cycle threshold values |
SI2970464T1 (sl) | 2013-03-15 | 2020-08-31 | Glaxosmithkline Intellectual Propety Development Limited | Anti-LAG-3 vezavni proteini |
CA2917661C (en) * | 2013-07-10 | 2023-09-12 | Onconox Aps | Antibodies to .beta.2-glycoprotein i and therapeutic uses thereof |
US10556945B2 (en) | 2014-03-21 | 2020-02-11 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
US9896502B2 (en) | 2014-03-21 | 2018-02-20 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
KR20180042412A (ko) | 2015-09-02 | 2018-04-25 | 이뮤텝 에스.에이.에스. | 항-lag-3 항체 |
JP6935184B2 (ja) * | 2016-05-31 | 2021-09-15 | シスメックス株式会社 | 糖ペプチドと反応するモノクローナル抗体およびその用途 |
US10479827B2 (en) * | 2016-05-31 | 2019-11-19 | Sysmex Corporation | Monoclonal antibody reacting with glycopeptide, and use thereof |
AU2017281830B2 (en) | 2016-06-20 | 2023-04-06 | Kymab Limited | Anti-PD-L1 antibodies |
KR20190066607A (ko) | 2016-09-23 | 2019-06-13 | 테바 파마슈티컬스 인터내셔널 게엠베하 | 불응성 편두통의 치료 |
AU2020308053A1 (en) | 2019-06-26 | 2022-01-20 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | IL1RAP binding proteins |
CN112552403A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-26 | 南京英瀚斯生物科技有限公司 | 一种人源抗人CD23抗体的Fab片段、药物组合物及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0605442T3 (da) * | 1991-07-25 | 2003-08-04 | Idec Pharma Corp | Rekombinante antistoffer til human terapi |
MX9204374A (es) * | 1991-07-25 | 1993-03-01 | Idec Pharma Corp | Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion. |
CA2203363A1 (en) * | 1994-10-25 | 1996-05-02 | Jean-Yves Marcel Paul Bonnefoy | Binding agents to cd23 |
US6011138A (en) | 1997-02-20 | 2000-01-04 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Gamma-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies |
-
1998
- 1998-05-09 GB GBGB9809839.5A patent/GB9809839D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-05-07 AP APAP/P/2000/001983A patent/AP1547A/en active
- 1999-05-07 PL PL99344019A patent/PL344019A1/xx unknown
- 1999-05-07 EE EEP200000658A patent/EE200000658A/xx unknown
- 1999-05-07 SK SK1676-2000A patent/SK16762000A3/sk unknown
- 1999-05-07 AU AU38367/99A patent/AU763491B2/en not_active Ceased
- 1999-05-07 US US09/674,716 patent/US7008623B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-07 WO PCT/GB1999/001434 patent/WO1999058679A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-05-07 IL IL13938499A patent/IL139384A0/xx unknown
- 1999-05-07 NZ NZ507879A patent/NZ507879A/xx unknown
- 1999-05-07 BR BR9910327-3A patent/BR9910327A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-05-07 CN CN99808452A patent/CN1308676A/zh active Pending
- 1999-05-07 CA CA002328606A patent/CA2328606A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-07 JP JP2000548470A patent/JP2002514421A/ja not_active Ceased
- 1999-05-07 ID IDW20002573A patent/ID28088A/id unknown
- 1999-05-07 EA EA200001041A patent/EA200001041A1/ru unknown
- 1999-05-07 TR TR2000/03281T patent/TR200003281T2/xx unknown
- 1999-05-07 HU HU0102005A patent/HUP0102005A3/hu unknown
- 1999-05-07 YU YU69000A patent/YU69000A/sh unknown
- 1999-05-07 KR KR1020007012530A patent/KR20010043470A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-05-07 EP EP99920991A patent/EP1076701A1/en not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-10-31 IS IS5696A patent/IS5696A/is unknown
- 2000-11-03 ZA ZA200006312A patent/ZA200006312B/xx unknown
- 2000-11-08 NO NO20005632A patent/NO20005632L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-11-09 HR HR20000762A patent/HRP20000762A2/hr not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1999058679A1 (en) | 1999-11-18 |
AU3836799A (en) | 1999-11-29 |
YU69000A (sh) | 2003-08-29 |
CN1308676A (zh) | 2001-08-15 |
EA200001041A1 (ru) | 2001-06-25 |
EP1076701A1 (en) | 2001-02-21 |
CA2328606A1 (en) | 1999-11-18 |
KR20010043470A (ko) | 2001-05-25 |
AP1547A (en) | 2006-01-13 |
IS5696A (is) | 2000-10-31 |
NZ507879A (en) | 2004-02-27 |
EE200000658A (et) | 2002-04-15 |
HUP0102005A2 (hu) | 2001-10-28 |
TR200003281T2 (tr) | 2001-03-21 |
GB9809839D0 (en) | 1998-07-08 |
ID28088A (id) | 2001-05-03 |
BR9910327A (pt) | 2001-01-30 |
PL344019A1 (en) | 2001-09-24 |
AP2000001983A0 (en) | 2000-12-31 |
JP2002514421A (ja) | 2002-05-21 |
US7008623B1 (en) | 2006-03-07 |
IL139384A0 (en) | 2001-11-25 |
NO20005632D0 (no) | 2000-11-08 |
ZA200006312B (en) | 2003-02-26 |
NO20005632L (no) | 2001-01-08 |
HUP0102005A3 (en) | 2003-10-28 |
AU763491B2 (en) | 2003-07-24 |
SK16762000A3 (sk) | 2001-07-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7008623B1 (en) | Antibodies to CD23, derivatives thereof, and their therapeutic uses | |
WO2021136308A1 (en) | Antibodies binding bcma and uses thereof | |
US7060808B1 (en) | Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody | |
ES2526194T3 (es) | Anticuerpos del receptor 1 de interferón alfa, y sus usos | |
ES2625798T3 (es) | Anticuerpos humanos que se unen a CXCR4 y usos de los mismos | |
EP2692737B1 (en) | Fully human anti-VAP-1 monoclonal antibodies | |
CN108602885B (zh) | 抗人ip-10抗体及其用途 | |
SK332792A3 (en) | Humanized and chimeric monoclonal antibodies | |
WO1996040210A1 (en) | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors | |
CN103154029B (zh) | 抗人tweak的抗体及其用途 | |
JP2003199594A (ja) | Cd18に対するヒト化抗体 | |
CA3067597C (en) | Chimeric antibodies for treatment of amyloid deposition diseases | |
JP2012517806A (ja) | ヒト化抗cd20抗体および使用方法 | |
KR20230034960A (ko) | Lag3에 결합하는 항체 및 그 용도 | |
US20070207145A1 (en) | Mouse/human chimeric anti-phencyclidine antibody and uses thereof | |
FI114550B (fi) | Menetelmä immunoglobuliini-isotyyppiä vastaan suunnattujen uudelleenmuotoiltujen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi | |
US20030224001A1 (en) | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors | |
US11807683B2 (en) | Antibody binding TIM-3 and use thereof | |
WO2023232023A1 (en) | Molecules binding pd-l1 and uses thereof | |
CZ20004164A3 (cs) | Protilátky proti CD23, jejich dertiváty a jejich terapeutické použití | |
MXPA00011013A (en) | Antibodies to cd23, derivatives thereof, and their therapeutic uses | |
JP2023504974A (ja) | 抗tirc7抗原結合タンパク質 | |
KR20220012314A (ko) | Bcma에 결합하는 항체 및 그의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A1OB | Publication of a patent application | ||
ARAI | Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application | ||
ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20050421 Year of fee payment: 7 |
|
OBST | Application withdrawn |