SK15422003A3 - Použitie fragmentov HMG ako protizápalových činidiel - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka použitia fragmentov HMG ako protizápalových činidiel.

Príbuzné prihlášky

Táto prihláška si nárokuje prospech z US predbežnej

prihlášky číslo 60/291 034 podanej 15.mája 2001,	ktorej úplné
zverejnenie je tu	zahrnuté	formou odkazu.
Vládna podpora
Vynález bol	podporený,	vcelku alebo z	časti,	grantom RO1
GM 57226-02 od	National	Instit.utes of	Health	Vláda má
k vynálezu určité	práva.

Doterajší stav techniky

Zápal je často vyvolaný cyuokínmi podporujúcimi zápal, ako sú faktor nekrózy tumorov (TNF), interleukín (IL;-la, IL-Ιβ, IL-b, faktor aktivujúci doštičky (PAF), faktor inhibujúci migráciu makrofágov (MIF) a iné látky. Tieto cytokíny podporujúce zápal sú produkované niekoľkými rôznymi typmi buniek, z ktorých sú najdôležitejšie bunky imunitného systému (napríklad monocyty, makrofágy a neutrofily), ale tiež neimunitnými bunkami, ako sú fibroblasty, osteoblasty, bunky hladkého svalu epltelovej bunky a neuróny. Tieto cytokíny podporujúce zápal prispievajú k rôznym poruchám v ranných štádiách cytokínovej kaskády zapalu.

Cytokínové kaskády zápalov prispievajú ku škodlivým charakteristikám, vrátane zapalov a apoptózy pri mnohých poruchách. Zahrnuté su poruchy charakterizované ako lokalizovanými, tak systémovými reakciami vrátane, ale bez obmedzenia, chorôb zasahujúcich qastrointestinálny trakt a priľahlé tkanivá (ako sú acendicitída, peptické, žalúdočné a dvanástnikové vredy, peritonitida, pankreatitída, ulceratívne, pseudomembranózne, akútne a ischemické kolitidy, divertikulitída, epigiotr t ída, achalázia, cholangitída, coeliacká choroba, hepatitída, Crohnova choroba, enteritída a Whipplova choroba); systémové alebo lokálne zápalové choroby alebo stavy (ako je astma, alergia, anafylaktický šok, choroby imunitného systému, orgánová ischémia, reperfúzne poranenie, orgánová nekróza, senná nádcha, sepsa, septikémia, endotoxicky šok, kachexia, hyperpyrexia, eozinofilný granulóm, granulomatóza a sarkoidoza); choroby zasahujúce urogenitálny systém a priľahlé tkanivá (ako je septický abortus, epididymitída, vaginitída, prostatitída a zápal močovodu); choroby zasahujúce dýchací systém a priľahlé tkanivá (ako je bronchitída, rozedma, rinitída, cystická fibróza, pneumon.it ída, syndróm zástavy dýchania dospelých, ultramikroskopická pneumosi 11kovolkanokonióza, alveolitíoa, bronchiolotída, farynaitída, pleurízia a sínusitída); ochorenie vznikajúce z infekcie rôznymi vírusmi (ako sú vírus

chrípky,	respirátor n y sy.ncyciéiny vírus, HIV, vírus hepatitídy
B, C a	herpes),	baktériami	(ako je rozšírená	bakteriémia,
ho rúčka	Dengue),	hubami (ako	je kandidóza) a protozomálnymi
a mnohobunkovými	parazitmi	(ako je malária,	filarióza,
amebióza	a hydatická cysta)	, dermatologickými	ochoreniami
a poruchami kože	; (ako	sú popáleniny,	dermatitída,
dermatomyoz i t ída,	„spáienie”	slnkom, koprivka	a bradavice);
choroby	zasahuj úce	k a rdi o v u s k;	d ár t:y systém a pri	ľahlé tkanivá

(ako sú vaskulitída, angitíoa, endokarditída, arteritida, ateroskleróza, irorn.bof 1ebit ída, perikarditída, stagnujúce zlyhanie srdca, moykarditída, ischémia myokardu, nooosa a reumatická horúčka); choroby zasahujúce centrálny alebo periférny nervový systém a priľahlé tkanivá (ako je Alzheimerova choroba, men ingi tída, er.cefalitítía, roztrúsená skleróza, mozgový infarkt, mozgová embólia,, syndróm GuiliamaBarrea, neuntída, neuralgia, poranenie miechy, obrna a uveitída); choroby kostí, kĺbov, svalov a väzivového tkaniva (ako sú rôzne artritídy a artralgie, osteomyelitída, zápaly svalov, Pagetova choroba, dna, periodontálne ochorenie, reumatoidná artritída a synovitída); iné autoimúnne a zápalové poruchy (ako sú myastenia gravis, tyeroitída, systémový lupus erytematodes, Goodpasterov syndróm, Bechetov syndróm, odmietnutie aloštepu, ochorenie transplantát-versus-hostitel, diabetes typu I, spondy111ída, Bergerova choroba a Retierov syndróm); ako i rôzne rakoviny, nádory a proliferatívne poruchy (ako je Hodgkinova choroba) a akékoľvek prípady hostiteľskej imunitnej odozvy na akúkoľvek primárnu chorobu.

Skoré zápal podporujúce cytokíny (napríklad TNF, IL-1, atď.) sprostredkovávajú zápal a vyvolávajú neskoré uvoľňovanie skupiny 1 s vysokou mobilitou (HMG1)(známe taktiež ako HMG-1 a HMGB1), bielkoviny, ktoré sa akumulujú v sére a sprostredkovávajú oddialenú letalitu a ďalšiu indukciu skorých zápal podporujúcich cytokínov.

HMG1 boli prvýkrát identifikované ako základné členy rodiny DNA-viažúcich proteínov nazývaných skupinou s vysokou mobilitou (HMG), na ktorom kriticky závisí štruktúra stability DNA. Identifikovaný bol takmer pred 40 rokmi ako všadeprítomný exprimovaný jadrový proteín, ktorý sa viaže na dvojvláknovú DNA bez sekvenčnej špecificity.

Väzba HMG1 ohýba DNA, čo podporuje tvorbu a stabilitu nukleoproteínových komplexov, ktoré umožňujú génovú transkripciu glukokortikoidových receptorov a RAG rekombinázy. Molekula HMG1 má tri domény: dva DNA viažúce motívy nazývané HMG A a HMG B boxy a kyslý karboxylový koniec. Dvomi HMG boxami sú doména tvaru L s konzervovanými 60 aminokyselinami. HMG boxy sú exprimované taktiež v iných transkripčných faktoroch vrátane t rans knpčného faktora RNA polymerázy I, ľudského faktora viažúcenc sa zhora „proti prúdu” a lymfoidne špecifického faatcra.

Nedávne dôkazy implikovali HMG1 ako cytokínový mediátor oddialenej ietality v endotoxémii. Táto práca dokázala, že bakteriálny endotoxin (iipopolysacharid, LPS) aktivuje monocyty/makrofágy na uvoľňovanie HMG1 ako neskorú odozvu k aktivácii, čo vedie ku zvýšeným sérovým hladinám HMG1, ktoré sú toxické. Protilátky proti HMG1 poskytujú prevenciu proti letalite endotoxínu i keď je podávanie protilátky oddialené až do doby po včasnej cytokínc-vej odozve. Podobne ako iné cytokíny podporujúce zápal je HMG1 mocným aktivátorom monocytov. Ir.tratracheálne podanie HMG1 spôsobuje akútne poškodenie pľúc a protilátky proti HMG1 chránia proti endotoxínom indukovanému pľúcnemu edému. V prípade kriticky chorých pacientov sc sepsou alebo hemoragickým šokom sú sérové hladiny HMG1 zvýšené a hladiny sú významne vyššie v prípade neprežívajúcich v porovnaní s prežívajúcimi.

HMG1 bol imlikovaný taktiež ako ligand RAGE, multiliaandového receptora z imunoqlobulínovej super-rodiny. Rage je exprimovaný na endotelových bunkách, bunkách hladkého svalu, monocvtoch a nervoch, a interakcia ligandu transdukuje signály cez MAP kinázu, p21 ras a NF-kB. Oddialená kinetika výskytu HMG1 pri endotoxémii ho robí dobrým terapeutickým cielcm, ale málo sa vie o molekulárnych základoch signalizácie HMG1 a toxicity.

Podstata vynálezu

Tento vynález je založený na objavoch, že 1) A box HMG slúži ako kompetitívny inhibítor pôsobenia HMG v podpore zápalu; a 2; B box HMG má prevážnu aktivitu HMG podporujúcu zápal.

V súlade s tým. je vynález zameraný na polvpeptrd obsahujúci A ioox stavcového HMG alebo jeho biologicky aktívny fragment alebo A box prirodzenie sa nevyskytujúceho HMG alebo jeho biologicky aktívny fragment. A box HMBG alebo tieto uskutočnenia môžu inhibovať uvoľňovanie cytokmov podporujúcich zápal zc stavcových buniek, na ktoré je pôsobené HMG. A box HMG je s výhodou cicavčí A box HMG, výhodnejšie A box cicavčieho HMG1 a najvýhodnejšie A box HMG1 pozostávajúci z alebo obsahujúci SEKV.ľD.Č 4 alebo SEKV.ID.Č. 22. Vo výhodných vyhotoveniach je stavccvou bunkou cicavčí makrofág. Vynález zahŕňa taktiež vektory kódujúce tieto polypeptidy.

V iných vyhotoveniach sa vynález zameriava na prostriedok obsahujúci polypeptid A boxu HMG alebo jeho biologicky aktívny fragment popísaný hore vo farmaceutický prijateľnom excipiente. V týchto vyhotoveniach môže prostriedok inhibovať stav charakterizovaný aktiváciou kaskády zápalových cytokínov. Prostriedok môže ďalej obsahovať antagonistu skorého mediatóra sepsy. Antagonista skorého mediátora sepsy je s výhodou antaqonista cytokínu vybraného z skupiny pozostávajúcej z TNF, IL-Ioí, IL-1, MIF a IL-6, výhodnejšie je protilátkou k TNF alebo MIF alebo antagonistom IL-1 receptoru.

V týchto vyhotoveniach je stav s výhodou vybraný zo skupiny, v ktorej sú obsiahnuté apendicitída, peptické, žalúdočné a dvanástnikové vredy, peritonitída, pankreatítída, ulceratívne, pseudomembranózne, akútne a ischemické kolitídy, divertikulitída, epiglotitída, achalázia, chlangitída, hepatitída, Crohr.ova choroba, enteritída a Whipplova choroba, astma, alergia, anafylaktický šok, orgánová ischémia, reperfúzne poranenie, orgánová nekróza, senná nádcha, sepsa, septikémía, endotoxický šok, kachexia, hyperpyrexia, eozinofilný granulóm, granulomatóza, sarkoidóza, septický abortus, epididymitída, vaginitída, prostatitída, zápal močovodu, bronchitída, rozedma, rinitída, cystická fibróza, pneumonitída, ultramikroskopická pneumosi 1 i kovclkar.okonióza, alveolitída, bronchiolitída, faryngitída, pleurízia, sínusitíoa, infekcia respi ratórnyrr syr.ciciálnym vírusom, infekcia KIV, infekcia vírusom hepatitídy 3, infekcia vírusom hepatitícy C, infekcia herpetickým vírusom, rozšírená bakteriémia, horúčka Dengue, kandidóza, malária, frlarióza, amebióza, hydatická cysta, popáleniny, dermatitída, dermatomyozitída, „spálenie slnkom, koprivka, bradavica, vaskulitida, angitida, endokarditída, arteritida, ateroskleróza, tromboflebitida, perikarditída, myokarditíaa, ischémia myokardu, periart.erit is nodosa, reumatická horúčka, Alzheimerova choroba, coel.iacká choroba, stagnujúce zlyhanie srdca, syndróm zástavy dýchania dospelých, meningitída, encefalitída, roztrúsená skleróza, mozgový infarkt, mozgové embólia, syndróm Guillama-Barrea, neuritída, neuralgia, poranenie miechy, obrna, uveitída, artritídy, artraigie, osteomyelitída, zápaly svalov, Pagetova choroba, dna, períodontálne ochorenia, reumatoidná artitída a synovitída, myasténia gravis, tyreoitida, systémový lupus erytematosus, Goodpast.erov syndróm, Bechetov syndróm, odmietnutie aloštepu, ochorenie trensplant.át-versus-hostitei, diabetes typu 1/ spondylitída, Bergerova choroba, Retierov syndróm a Hodgkinova choroba. Výhodnejšie je stav vybraný zo skupiny, v ktorej sú obsiahnuté apendicitída, peptické, žalúdočné a dvanástnikové vredy, peritonitída, pankreatitída, ulceratívne, pseudomembranózne, akútne a ischemické kolitídy, hepatitída, Crohnova choroba, astma, alergia, anafylaktický šok, orgánová ischémia, reperfúzne poranenie, orgánová nekróza, senná nádcha, sepsa, sept ikémia, endotoxický šok, kachexia, septický abortus, rozšírená bakteriémia, popáleniny, Alzheimerova choroba, coeliacká choroba, stagnujúce zlyhanie srdca, syndróm zástavy dýchania dospelých, meningitída, encefalitída, roztrúsená skleróza, mozgový infarkt, m.ozgo poranenie miechy, obrna, odmietnutie aloštepu transplancát-versus-hostiteľ; najvýhodnejší endocoxický šok a odmietnutie aloštepu. Keď : embólia, a ochorenie sta v j e je stavom odmietnutie aloštepu, prostriedok môže- ďalej obsahovať imunosupresant používaný na inhibíciu odmietnutia aloštepu, s výhodu cyklosporín.

V ďalších vyhotoveniach je vynález zameraný na vyčistený preparát protilátok, ktoré sa špecificky viažu na B box stavovcového proteínu s vysokou mobilitou (HMG), ktoré sa ale špecificky neviažu na epitopy mimo B box HMG. V týchto vyhotoveniach môžu protilátky inhibovať biologickú aktivitu B boxu HMG polypeptidu, napríklad uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal zo stavovcových buniek, na ktoré je pôsobené HMG. V týchto vyhotoveniach môžu protilátky inhibovať biologickú aktivitu B boxu HMG polypeptidu, napríklad uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal zo stavovcových buniek, na ktoré je pôsobené HMG. Vo výhodných vyhotoveniach je B box HMG cicavčí b box HMG, napríklad ľudský B box HMG, výhodnejšie B box HMG1, najvýhodnejšie B box HMG1 s aminokyselinovou sekvenciou SEKV.ID.Č. 5 alebo SEKV.ID.Č. 20. V inom vyhotovení sa protilátky viažu polypeptidovej sekvencii B boxu HMGi, aminokyseliny 1-20 SEKV.ID.Č. 20 (SEKV.ID.Č.

obsahujúce aminokyseliny 1-20 SEKV.ID.Č. 5 (SEKV.ID.Č. 23) . Stavovocou bunkou je s výhodou taktiež cicavčí makrofág. V niektorých vyhotoveniach sú protilátky s výhodou humanizované.

V ďalších vyhotoveniach je vynález zameraný na prostriedok obsahujúci akýkoľvek preparát protilátky písaný zhora v farmaceutický prijateľnom excipiente. V týchto vyhotoveniach môže prostriedok inhibovať stav charakterizovaný aktívácrou kaskády zápalových cytokínov. Tieto prostriedky môžu tartiež užitočne obsahovať antagonistu včasného mediátora sepsy, ako k špecifickej obsahujúcej 16) alebo to bolo popísané skôr. Výhodným stavmi užitočnými na liečbu týmito prostriedkami su stavy sprostredkované aleoo charakterizované kaskádou zápalových cytokíncv, napríklad stavy z výpočtu pre prostriedok A boxu popísané skôr.

Naviac je vynález zameraný na polypeptid obsahujúci S box stavovcového HMG alebo jeno biologicky aktívny fragment alebo B box prirodzene sa nevyskytujúceho HMG alebo jeho biologicky aktívny fragment, ale neobsahujúci HMG proteín plnej dĺžky. V týchto vyhotoveniach môže polypeptid spôsobovať uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal zo stavovcových buniek. Polypeptidom týchto vyhotovení je s výhodou B box HMG, výhodnejšie B box HMG1 a najvýhodnejšie B box HMG1 s aminokyselinovou sekvenciou udávanou ako SEKV.ID.Č. 5 alebo SEKV.1D.Č. 20. V iných vyhotoveniach obsahuje B box HMG sekvenciu SEKV.ID.Č.16 alebo SEKV.ID.Č.23 alebo pozostáva zo sekvencie SEKV.ID.Č. 16 alebo SEKV.ID.Č.23. Vo výhodných vyhotoveniach je starovccvou bunkou cicavčí makrofág. Vynález zahŕňa taktiež vektory kódujúce tieto polypeptidy.

Vynález je taktiež zameraný na spôsob inhibícíe uvoľňovania cytokinu podporujúceho zápal z cicavčej bunky. Spôsob zahŕňa pôsobenie na bunku buď zhora popísaným prostriedkom polypeptidu A boxu alebo biologicky aktívneho fragmentu A boxu alebo hore popísaným prostriedkom protilátky k B boxu alebo k biologicky aktívnemu fragmentu B boxu, v množstve postačujúcom na inhibíciu uvoľňovania cytokinu podporujúceho zápal z bunky. V týchto vyhotoveniach je bunkou s výhodou makrofág. Naviac, cytokín podporujúci zápal je s výhodou vyberaný zo skupiny pozostávajúcej z TNF, IL-Ια, IL1β, MIF a IL-6. Výhodnejšie je bunkou makrofág a cytokín podporujúci zápal s výhodou vybraný zo skupiny pozostávajúcej z TNF, IL-lla, IL-Ιβ, MIF a TL-6. Spôsob s výhodou pôsobí na bunku na pacienta trpiaceho alebo ohrozeného stavom charakterizovaným aktiváciou kaskády zápalových cytokínov. Výhodné stavy boli uvedené v skoršom výpočte.

Ďalšie vyhotovenia sú zamerané na spôsob stimulácie uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z bunky. Spôsob zahŕňa pôsobenie na bunku buď zhora popísaným, prostriedkom polypeptidu B boxu alebo biologicky aktívneho fragmentu ooxu alebo vektorom B boxu alebo biologicky aktívneho fragmentu B boxu v množstve postačujúcom na inhibíciu uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z bunky. V príbuzných vyhotoveniach je vynález zameraný na ovplyvnenie znižovania telesnej hmotnosti alebo liečbu obezity pacienta. Spôsob zahŕňa podávanie účinného množstva polypeptidu B boxu HMG alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu pacientovi. V jednom vyhotovení je polypeptid B boxu HMG alebo jeho biologicky aktívny fragment vo farmaceutický prijateľnom excipiente.

Vynález je zameraný taktiež na spôsob stanovenia, či zlúčenina inhibuje zápal. Spôsob zahŕňa kombináciu zlúčeniny s a) bunkou, ktorá uvoľňuje cytokin podporujúci zápal pri vystavení B boxu stavovcového HMG alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu a b) B boxom stavovcového HMG alebo jehc biologicky aktívneho fragmentu, s následným stanovením, či zlúčenina inhibuje uvoľňovanie cytokínu podporujúceho zápal z bunky. S výhodou je B box HMG cicavcového HMG, napríklad B box HMG1. Výhodné cytokíny podporujúce zápal sú ako boli už predtým popísané.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr.l je schematická reprezentácia mutantov HMG1 a .ich aktivity v uvolňovaní TNF Jpg/ml).

0br.2A je histogram ukazujúci účinok 0 pg/ml,0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, í pg/ml a 10 pg/ml B boxu na uvoľňovanie TNF (pg(ml) v bunkách RAW 264.7.

Cbr.2B je histogram ukazujúci účinok 0 pg/ml,0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml a 10 pg/ml B boxu na uvoľňovanie 1L-1& (pg/ml; v bunkách RAW 2 64. /.

Obr.2C je histogram ukazujúci účinok 0 ug/ml,0,01 pg/ml, 0,1 pg/mi, 1 ug/ml a 10 pg/ml 3 boxu na uvolňovanie IL-6 (pg/mi) v bunkách RAW 261.7.

Obr.2D. Skenovanč ob raz preneseného teszu ochrany pred Rnázou ukazujúci účinok B boxu (po 0 hodinách, 4 hodinách, 8 hodinách a 24 hodinách? alebo samotného' vektora (v 4 hodinách po podaní) na expresiu TNF mRNA v bunkách RAW 264.7.

Obr.2E je histogram účinku 3 boxu HMG1 na uvoľňovanie TNE

proteínu (pg/ml)	z buniek	RAW 264.7 v 0 hodinách, 4 hodinách,
8 hodinách, 24	hodinách,	32 hodinách alebo 48 hodinách po
podaní.
Obr.2 F je	histogram	účinku vektora na uvolňovanie TNF
proteínu (pg/ml)	z buniek	RAW 264.7 v 0 hodinách, 4 hodinách,
8 hodinách, 24	hodinách,	32 hodinách alebo 48 hodinách po
podaní.
Obr.3 je schematická	reprezentácia mutant B boxu HMG1
a ich aktivity v	uvoľňovaní	TNF (pg/ml).

Obr.4A je graf účinku 0 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml alebo 25 pg/ml bielkoviny A boxu HMG1 na uvoľňovanie TNF (ako percento uvoľňovania TNF sprostredkovaného samotným HMG1) v bunkách RAW 264.7.

Obr..4B je histogram účinku HMG1 (0 alebo 1,5 pg/ml), Ä boxu HMG1 (0 alebo 10 pg/mi) alebo vektora (0 alebo 10 pg/ml) samotných alebo v kombinácii na uvolňovanie TNF (ako percento uvoľňovania TNF sprostredkovaného samotným HMG1) v bunkách RAW 264.7.

Obr. 5 je graf väzby ¹²⁵I-HNGB1 na bunky RAW 264.7 (CPM/jamku) v čase (minúty).

Obr.5B je histogram väzby ¹²⁵I-HNGB1 v neprítomnosti neznačeného HMG1B alebo A boxu HMG1 po 2 hodinách pri 4°C (celková) alebo počas prítomnosti 5000 násobného molárneho prebytku neznačeného HMG1B1 (HMG1B1) alebo A ooxu (A dox), merané ako percento celkových CPM/jamku.

Obr.6 je histogram účinku HI7G-1 (0 alebo 1 μα/ml) alebo B boxu HMG1 (0 alebc 10 ug/ml) samotných alebo v kombinácii s protilátkou k 3 boxu na (25 pg/'ml alebo 100 pg/ml) alebo IgG (25 pg/ml alebo 100 pg/ml) na uvoľňovanie TNF z buniek RAW 264.7 (vyjadrené ako percento .uvoľňovania TNF sprostredkovaného samotným HMG1).

Obr.TA je skenovaný obraz farbených rezov obličky získanej pôsobenia.

Obr.7B je hematoxylínom a eozínom z myši bez akéhokoľvek hematoxylínom a eozínom skenovaný obraz farbených rezov obličky získanej z myši s podaným B boxom HMG1.

Obr.7C je skenovaný obraz farbených rezov myokardu získaného pôsobenia.

Obr.VD je skenovaný obraz farbených rezov myokardu získaného z myši s podaným B boxom HMG1.

Obr.7E je skenovaný obraz plúc získaného hematoxylínom a eozínom z myší bez akéhokoľvek hematoxylínom a eozínom farbených rezov pôsobenia.

Obr.'⁷ F je hematoxylínom a eozínom z myši bez akéhokoľvek skenovaný obraz hematoxylínom a eozínom farbených rezov plúc získaného z myši s podaným B boxom HMG1.

Obr.7G je farbených rezov pôsobenia.

Obr.7H je skenovaný obraz pečene získaného hematoxylínom a eozínom z myši bez akéhokoľvek hematoxylínom a eozínom skenovaný obraz farbených rezov pečene získaného z myši s podaným B boxom HMG1.

skenovaný obraz l^e hematoxylínom a eozínom farbených rezov pečene (veľké zväčšenie) získaného z myši bez akéhokoľvek pôsobenia.

Obr.7J je skenovaný obraz hematoxylinom a eozínom farbených rezov pečene (veľké zväčšenie) s podaným B boxom HMG1 .

Obr. 6 je graf hladiny HMGB1 (ng/ml) v čase (hodiny) myši podrobenej podviazaniu a punkcii (CLP).

Cbr.9 je graf účinku A boxu (60 pg/myš alebo 600 pg/myš) alebo žiadneho pôsobenia na prežitie myší v čase (dni) po podviazaní a punkcii (CLP).

Obr.lOA je graf účinku protilátky proti HMG1 (tmavé krúžky) alebo žiadneho pôsobenia (svetlé krúžky) na prežitie myší v čase (dni) po podviazaní a punkcii (CLP).

Obr.lOB je graf účinku antiséra proti B boxu HMG1 () alebo žiadneho pôsobenia D na prežitie myší v čase (dni) u myší s podaným lipopolysacharidom (LPS).

Obr.liA je histogram účinku protilátky proti RAGE alebo neímúnnych IgG na uvoľňovanie TNF z buniek RAW 264.7, na kuoré sa pôsobilo HMG1 (HMG1), lipopolysacharidom (LPS) alebo B boxom HMG1 (B box).

Obr.11b je histogram účinku stimulácie HMG1 alebo polypeptidom B boxu HLG1 na aktiváciu NFkB-závislého ELAM promótora (merané lucíferázovou aktivitou) buniek RAW 264.7 kotransfekovaných murínnym MyD 38-dominantným negatívnym (+MyD 88 DN)mutantom (odpovedajúcim aminokyselinám 156-296) alebo prázdnym vektorom (-MyD 88 DN) . Údaje sú vyjadrené ako pomer (násobok aktivácie) priemerných luciferázových hodnôt z nestimulovaných a stimulovaných buniek (s odpočítaním pozadia) + SD.

Obr.llC je histogram účinku stimulácie CHO reportérových bunkových línií, ktoré konštitutívne exprimujú ľudský TLR (prázdne stĺpce) alebo TLR4 (plné stĺpce), s IL-1, HMG1 alebo B boxom HMG1 na expresiu CD25. Údaje sú vyjadrené ako pomer (násobok aktivácie) percenta CD 25⁺ buniek v nestimulovanej a stimulovanej populácii, ktorá bola vždy obmedzená na vylúčenie najnižších 5% buniek podľa strednej FL1 flourescencie.

Obr.llD je histogram účinku podania protilátky proti RAGE, protilátky proti TLR2, spoločne protilátky proti RAGE a protilátky proti TKňLR2, aleoo ľgG na uvoľňovanie TNF sprostredkovanej HMGI (merané ako percento uvoľňovania TNF bez prítomnosti protilátky ) buniek RAW 261.7.

0br.l2A je aminokyselinová sekvencia polypeptidu (ľudského HMG1 (SERV.ID.Č.1).

Obr.l2B je aminokyselinová sekvencia potkanieho a myšieho HMGI (SERV.ID.Č.2).

0br.l2C je aminokyselinová sekvencia ľudského HMG2 (SERV.ID.Č.3) .

0br.l2D je aminokyselinová sekvencia polypeptidu ľudského, potkanieho a myšieho A boxu HMGI (SERV.ID.Č.4).

0br,12E je aminokyselinová sekvencia polypeptidu ľudského, potkanieho a myšieho B boxu HMGI (SERV.ID.Č.5).

	Obr.12F je	sekvencia	nukleovej	kyseliny	priameho	primeru
pre	ľudský HMGI	(SERV.ID.Č	. 6) .
	0br.l2G je	sekvencia	nukleovej	kyseliny	spätného	primeru
pre	ľudský HMGI	(SERV.ID.Č	.7) .
	Obr.12H je	sekvencia	nukleovej	kyseliny	priameho	primeru
pre	karboxylový	koniec ľudského HMGI	(SERV.ID.	Č. 8) .
	Obr.121 je	sekvencia	nukleovej	kyseliny	spätného	primeru
pre	karboxylový	koniec ľudského HMGI	(SERV.ID.	Č. 9) .
	Obr.12J je	sekvencia	nukleovej	kyseliny	priameho	primeru
pre	amino-koniec	luds kého	HMGI (SERV	.ID.Č.10).
	Obr.12K je	sekvencia	nukleovej	kyseliny	spätného	primeru
pre	amino-koniec	ľudského	HMGI (SERV	.ID.Č.11).
	Obr.12L je	sekvencia	nukleovej	kyseliny	priameho	primeru
pre	B box mutantného ľudského HMGÍ (	SERV.ID.Č.	12) .
	Obr. 12M je	sekvencia	nukleovej	kyseliny	spätného	primeru
pre	B box mutantného ľudského HMG2 (:	SERV.ID.Č.	13) .

Obr.l2N je sekvencia nukleovej kyseliny priameho primeru pre amino-koniec A boxu rnutantného ľudského HMG1 (SEKV.ID.Č. 14 ) .

Obr.120 je sekvencia nukleovej kyseliny pre amino-koniec A boxu rnutantného ( SEKV. ID.Č.15) .

Obr. 13 je prirovnanie sekvencii HMG1 sekvencie z potkana (SEKV.ID.Č. 2) , myši a človeka (SEKV.ID.Č.18) .

spacneno primeru ľudského HMG1 polypeptidovej (SEKV.ID.Č.2)

Príklady uksutočnenia vyná1ezu

V praxi budú tento vynález používať, pokial nie je bunkových kultúr, bunková biológia

Takéto techniky sú vyznačené inak, konvenčné techniky molekulárna biológia, mikrobiológia, a imunológia, ktoré sú zbehlé v odbore plne vysvetlené v literatúre. Viď napr. Sambrook et al., 1989, „Molecular Clcning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al. (1995), „Short Prctocols in Moleculer Biology, John Wiley and Sons; Methods in Enzvmology (niekoľko zväzkov); Methods in Celí Biology (niekoľko zväzkov); Methods in Molecular Biology (niekolko zväzkov).

Vynález je založený na sérii objavov, ktoré ďalej objasňujú rôzne charakteristiky schopnosti HMG1 indukovať produkciu cytckínov podporujúcich zápal a kaskády zápalových cytokínov. Konkrétne bolo objavené, že zápal podporujúci aktívna doména HMG1 je B box (a konkrétnejšie prvých 20 aminokyselín B boxu) a že protilátky proti B boxu budú inhibovať uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal a kaskády zápalových cytokínov s dôsledkom, ktorý môže zmierňovať škodlivé symptómy spôsobované kaskádami zápalových cytokínov. Taktiež bolo objavené, že A box je slabým agonistom uvoľňovania cytokínov podporujúcich zápal a že kompetitívne inhibu.je zápal podporujúci aktivitu B boxu HMG1.

Ako sa tu používa, „HNG polypeptid” či „HNG proteín” je v podstate polypeptid, prirodzene čistý alebo v podstate ktorý bol separovaný od čistý a izolovaný zložiek, ktoré ho sprevádzajú, alebo rekombinantne produkovaný polypeptio majúci rovnakú aminokyselinovú .sekvenciu, a ktorá zvyšuje záoal alebo s použitím programu BLAST Príklady HMG polypeptidu z zvyšuje uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal z bunky alebo zvyšuje aktivitu kaskády zápalových cytokínov. V jednom vyhotovení má HMG polypeptid jednu z hore uvedených biologických aktivít. V inom vyhotovení má HMG polypeptid dve z hore uvedených biologických aktivít. V treťom vyhotovení má HMG polypeptid tri z hore uvedených biologických aktivít.

HMG polypeptidom je s výhodou cicavčí HMG polypeptid, napríklad .ľudský HMG1 polypeptid. S výhodou má HMG oolypeptid aspoň 60%, výhodnejšie 70%, 75%, 80%, 85% alebo 90% a najvýhodnejšie aspoň 95% sekvenčnej identity sekvencií vybranej z SEKV.ID.Č.l, SEKV.ID.Č.2, SEKV.ID.Č.3 alebo SEKV.ID.Č.18, ak sa stanoví a parametrov v ňom popísaných, zahŕňajú polypeptid obsahujúci alebo pozostávajúci zo SEKV.ID.Č.l, SEKV.ID.Č.2, SEKV.ID.Č.3 alebo SEKV.ID.Č.18. S výhodou HMG polypeptid obsahuje DNA väzbovú doménu B boxu alebo DNA väzobnú doménu A boxu alebo kyslý karboxylový koniec tu popísaný. Iné príklady HMG polypeptidov sú popísané v GenBank prístupových čísiel AAA64970, AAB08987, P07155,

AAA20598. S29857, P09429, NP-002I19, CAA3110, ktorých všetky poznatky sú tu zahrnuté odkazom. Ďalšie príklady HMG polypeptidov zahŕňajú, ale bez obmedzenia, cicavčí HMG1, HMG2, HMG-2A, HG14, HMG17, HMG I a HMG Y, nie-cicavčí HMG TI a HMG T2 (dúhový pstruh), HMG-X (Xenopus), HMG D/Z (Drosophila), kvasinkové polypetidy NHP10 proteín (homológ HMG proteínu NHP 1) a nehistónový chromozomálny proteín; proteín podobný HMG1/2 (pšenica, kukurica, sója); „proti prúdu” viažúci sa (UBF-1), proteín rozoznávajúci jednovláknové úseky faktor (SSRP) alebo štruktúrny špecifický rekogníčný proteín, HMG homológ TDP-1, cicavčí proteín oblasti Y určujúci pohlavie (Sry, faktor určujúci testes); proteíny húb mat-1, ste 11 a Mc 1; SOX 14 (ako i SOX 1—3, 6, 8, 10, 12 a 21; lymfoidný špecifický faktor (LEF-1); špecifický transkripčný faktor T buniek (TVľ1) a jadrový autoantigér. SP100-HMG.

Ako sa tu používa, „HMG A box, na ktorý sa tu odkazuje taktiež ako na „A box” je v podstate čistý alebo v poastate čistý a izolovaný polypeptid, ktorý bol separovaný od zložiek, ktoré ho prirodzene sprevádzajú, ktorý pozostáva z aminokyselinovej sekvencie kratšej ako HMG polypetid plnej dĺžky a ktorý má jednu alebo viacero z nasledujúcich biologických aktivít: inhibuje zápal alebo inhibuje uvoľňovanie cytokíncv podporujúcich zápal z bunky alebo znižuje aktivitu kaskády zápalových cytokínov. V jednom vyhotovení má polypeptid HMG A boxu jednu z hore uvedených biologických aktivít. V inom vyhotovení má polypeptid HMG A boxu dve z hore uvedených biologických aktivít. V treťom vyhotovení má polypeptid HMG A boxu tri z hore uvedených biologických aktivít. S výhodou HMG A box nemá viac ako 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% alebo 90% biologickej aktivity HMG plnej dĺžky. V jednom vyhotovení pozostáva HMG A box zo sekvencie SEKV.ID.Č.4 alebo SEKV.ID.Č.22 alebo z aminokyselinovej sekvencie v odpovedajúcej oblasti HMG proteinu cicavca. HMG A box je taktiež rekombinantné produkovaný polypeptid majúci rovnakú aminokyselinovú sekvenciu ako sekvencia A boxu popísaná hore. S výhodou je HMG A box cicavčí HMG A box, napríklad A box ľudského HMG1. Polypeptid HMG A boxu podlá vynálezu s výhodou obsahuje alebo pozostáva zo sexvencie SEKV.ID.Č.4 alebo SEKV.ID.Č.22 alebo z aminokyseliovej sekvencie v odpovedajúcej oblasti HMG proteinu cicavca. HMG A box má časti nie viac ako asi 85 aminokyselín a nie menej ako asi 4 aminokyseliny. Príklady polypeptidov, ktoré majú v sebe sekvencie A boxu zahŕňajú, ale bez obmedzenia, HMG1, HMG2, HMG4 ; štruktúrne špecifický rekogničný protein (SRP); PMS1 proteínový homoióg 1;, proteíny SOX-1, SOX-2 a SOX-14; a MTT1. Sekvencie A co.xov v takýchto metódami tu k A boxom tu polypeptidoch môžu byť stanovené a izolov popísanými napríklad porovnaním sekvencii popísaným a testovaným na biologickú aktivitu.

Prvkom vynálezu sú taktiež HMG A boxy prirodzene sa nevyskytujúce. S výhodou má prirodzene sa nevyskytujúci HMG A box aspoň 60%, výhodnejšie aspoň 70%, 75%, 30%, 85% alebo 90%, a najvýhodnejšie 95% sekvenčnej identity k sekvencii SEKV.ID.Č 4 alebo SEKV.ID.Č.22, ako sa stanoví s použitím programu BLAST a parametrov v ňom popísaných a jednu alebo viac aktivít HMG A boxu.

Prvkom vynálezu sú taktiež biologicky aktívne fragmenty A box. Výrazom, „fragment A boxu, ktorý má biologickú aktivitu alebo „biologicky aktívny fragment A boxu sa myslí fragment HMG A boxu, ktorý má aktivitu HMG A boxu tu popisovanú. Napríklad: Fragment A boxu môže znižovať uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal zo stavovcovej bunky, zmenšovať zápal alebo znižovať aktivitu kaskády zápalových cytokínov. Fragmenty A boxu môže byť generované s použitím štandartných techník molekulárnej biológie a testovaním funkcie fragmentu stanovením, či fragment podaný bunke inhibuje uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal z bunky, napríklad s použitím metód tu popísaných. Biologicky aktívne fragmenty A boxu môžu byť používané v spôsoboch tu popísaných, používajú polypeptidy A boxu plnej dĺžky, v ktorých sa napríklad na inhibíciu uvoľňovania cytokínov podporujúcich zápal z bunky alebo na liečbu pacienta, majúceho stav charakterizovaný aktiváciou kaskády zápalových cytokínov.

Ako sa tu používa, „HMG B box, na ktorý sa tu odkazuje, taktiež ako na „B box je v podstate čistý alebo v podstate čistý a izolovaný polypeptid, ktorý bol separovaný od zložiek, ktoré ho prirodzene sprevádzajú, ktorý pozostáva z ammokyselinove j sekvencie kratšej ako HMG polypeptid plnej dĺžky, a ktorá má jednu alebo viacero z nasledujúcich biologických aktivít: zvyšuje zápal alebo zvyšuje uvoľňovanie cytokinov podporujúcich zápal z bunky alebo zvyšuje aktivitu kaskády zápalových cytokinov. V jednom vyhotovení má polypetid HMG B boxu jednu z hore uvedených biologických aktivít. V inom vyhotovení má polypeptid HMG 3 boxu dve z hore uvedených biologických aktivít. V treťom vyhotovení má polypeptid HMG B boxu tri z hore uvedených biologických aktivít. S výhodou má HMG B box prinajmenšom 25%, 30%, 401, 50%, 60%, 70%, 80% alebo 90% biologickej aktivity HMG plnej dĺžky. V inom vyhotovení HMG B box neobsahuje HMG A box. V inom vyhotovení je HMG B box polypeptid, ktorý je asi v dĺžke asi 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 35%, 30%, 25% alebo 20% dĺžky HMG1 polypeptidu plnej dĺžky. V inom vyhotovení HMG box pozostáva z alebo obsahuje sekvenciu SEKV.ID.Č.5 alebo SEKV.ID.Č.20 alebo aminokyselinovú sekvenciu v odpovedajúcej oblasti HMG proteínu cicavca, ale stále menej ako HMG polypeptid plnej dĺžky. Polypeptid HMG B boxu je taktiež rekombinantne produkovaný polypeptid majúci rovnakú aminokyselinovú sekvenciu ako sekvencia B boxu popísaná hore. S výhodou je HMG B box cicavčí HMG B box, napríklad B box ľudského HMG1. HMG B box má často nie viac ako asi 85 aminokyselín

Príklad polypeptidov, zahŕňajú, ale bez a nie menej ako asi 4 aminokyseliny, ktoré majú v sebe sekvenciu B boxu obmedzenia, proteín rozoznávajúci jednovláknové úseky (SSRP) a štruktúrne špecifický rekogničný proteín; HMG homológ TDP-1; proteín oblasti Y určujúci pohlavie (faktor určujúci testes) ; SOX 14 (ako i SOX 1-3, 6,

8, 10, 12 a 21); lymfoidný špecifický faktor (LEF-1);

špecifický transkripčný faktor T buniek (TCF-1). Sekvencie B boxov v takýchto polypeptidoch môžu byť stanovené a izolované metódami tu popísanými napríklad porovnaním sekvencii k B boxom tu popísaným a testovaním na biologickú aktivitu.

Vynález zahŕňa taktiež polypeptidy HMG B boxov prirodzene sa nevyskytujúcich. S výhodou má prirodzene sa nevyskytujúci HMG B box aspoň 60%, výhodnejšie aspoň 7C%, 75*, 80%, 85% alebo 90%, a najvýhodnejšie aspoň 95% sekvenčnej identity k sekvencii SEKV.ID.Č.5 alebo SE

ID.

20, a ,<o s použitím programu BLAST a parametrov v ňom a stanoví popísaných a jednu alebo viacero aktivít HMG A boxu. S výhodou HMG B box pozostáva z alebo SEKV.ID.Č.20 alebo obsahuje sekvenciu SEKV.ID.G.5 alebo aminokyselinovú sekvenciu odpovedajúcu oblasti HMG proteínu cicavca.

V inom vyhotovení je vynález zameraný na polypeptid obsahujúci stavovcový HMG B box alebo jeho fragment, ktorý má biologickú aktivitu B boxu alebo prirodzene sa nevyskytujúci HMG B box, ktorý ale neobsahuje HMG plnej dĺžky. Výrazom „fragment B boxu, ktorý má biologickú aktivitu alebo biologicky aktívny fragment B boxu sa myslí fragment HMG B boxu, ktorý má aktivitu HMG B boxu. Napríklad: Fragment B boxu môže indukovať uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal zo stavovcovej bunky, alebo indukovať aktivitu kaskády zápalových cytokínov. Príkladom takéhoto fragmentu B boxu je fragment obsanujúci prvých 20 aminokyselín HMG1 B boxu fSEKV.ID.Č.16 alebo SEKV. ID. Č. 2 3) ako je to tu popísané. Fragmenty B boxu s použitím štandartných techník a testovaním funkcie fragmentu či fragment podaný bunke zvyšuje uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal z bunky, v porovnaní s vhodnou kontrolou, napríklad s použitím metód tu popísaných.

Ako sa tu používa, „cytokin” je rozpustný proteín alebo peptid, ktorý je prirodzene produkovaný cicavčou bunkou a ktorý in vivo pôsobí ako humorálny regulátor v mikro- až pikomolárnyci. koncentráciách. Cytokíny môžu buď za normálnycn alebo patologických podmienok, modulovať funkčné aktivity jednotlivých buniek alebo tkanív. Cytokin podporujúci zápal je cytokin, ktorý má schopnosť spôsobovať ktorúkoľvek môžu byť molekulárnej stanovením, generovane biológie z nasledujúcich fyziologických reakcií spojených so zápalom

vazodilatáciu	, hyperémiu, zvýšenú permeabiiitu ciev spojenú
s edémami, ?.	emuláciou granulocytov a molekulárnych fagocytov,
alebo ukladar.	ie fibrínu. V niektorých prípadoch môže cytokin
podporujúci z	úpal spôsobovať taktiež apoptčzu, ako je to pri

chronickom zlyhávaní srdca, kde bolo pre TNF dokázané, že

stimuluje ap	optózu (Pukki, Ann. Med.29: 339-343, 1997 ;
a Tsutsui er. ;	cl. Immunol.rev.174: 192-209, 2000).
Neobmedz;	cjúcimi príkladmi cytokínov podporujúcimi zápal sú
faktor nekróz	y tumorov (TNF), interleukín (IL)-la, IL-Ιβ, IL-

6, IL-8, IL-16, interferón γ, HMG-1, faktor aktivujúci doštičky (PAF a faktor inhibujúci migráciu makrofágov (MIF).

Cytokíny podporujúce zápal je potrebné rozlišovať od protizápalových cvtokínov, ak sú IL-4, IL-10 a IL-13, ktoré nie sú mediátormi zápalu.

V mnohých prípadoch sú cytokíny podporujúce zápal produkované v kaskáde zápalových cytokínov, ktoré je tu definované ako in vivo uvoľňovanie prinajmenšom jedného cytokínu podporujúceho zápal u cicavcov, pričom daný cytokin ovplyvňuje fyziologický stav cicavca. Kaskáda zápalových cytokínov je teda inhibovaná vo vyhotovení vynálezu, kde uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal spôsobuje škodlivý fyziologický .-tav.

HMG A bcxy a HMG B boxy, či už sa vyskytujú prirodzene alebo nie, zahŕňajú polypeptidy, ktoré majú sekvenčnú identitu

alebo homolóc.	Lu s HMG A boxami a HMG B boxami popísanými hore.
Ako sa to.	používa, dva polypeptidy (alebo oblasti
polypeptidov)	sú v podstate homológne alebo identické, keď
dané aminokyu	elinové sekvencie sú prinajmenšom z 60%, 70%,
75%, 80%, í '	c, 90% alebo 95% alebo viac homológne alebo
identické. P· :	=ccnto identity dvoch aminokyselinových sekvencií
(alebo dvcc	nuc.leotidových sekvencií) možno stanoviť
prikladaním	ickvencií k. sebe za optimálnych porovnávacích
podmienok (r.	r. môžu byť vkladané medzery do sekvencie prvej

aminokyseliny alebo a percento identity

Potom sa zdieľaných oočet identrcv .0!

.x

Acids Res., 29: BLAST a Gapped príslušných sekvencie). Potom sa porovnávajú nukleotidy v odpovedajúcich pozíciách, medzi dvomi sekvenciami je funkciou počtu identických pozícií danými sekvenciami (t. j. í identických poz í ci i/'cel kový počet pozícií vyhotoveniach dĺžok polypeptidu HMG A boxu aleb HMG B boxu priloženého na porovnávací účel predscavuje prinajmenšom 30%, s výhodou prinajmenšom 49%, výhodnejšie prinajmenšom 60%, a ešte výhodnejšie prinajmenšom 70%, 80%, 90% alebo 100% dĺžky referenčnej sekvencie, napríklad sekvencie poskytnutej v obr,12A-12E a SEKV.ID.Č.18, 20 a 22.

Faktické porovnanie dvoch sekvencii možno uskutočniť dobre známymi metódami, napríklad použitím matematického algoritmu. Výhodný neobmedzujúci príklad takéhoto matematického algoritmu je popísaný Kariínom et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90: 58735877 (1993). Takýto algoritmus je zahrnutý do programov BLASTN a BLASTX (verzia 2.2) a je popísaný v Schaffer et al., Nucleic 2994-3005 (2001). Pri používaná programov

BLAST možno používať programov (napr.

http://www.nebi.nim.nih.gov, ako boli dostupné 10 apríla 2002. V jednom vyhotovení je prehladávaná databáza neredundantnej databázy (NR) a parametre pre porovnávacie sekvencie môžu byť nastavené na: žiadne filtre; hodnota očakávania 10; veľkosť slova 3; matica je BLOSUM62; a cena medzery má existenciu 11 a rozšírenie 1.

Iným výhodným neobmedzujúcim príkladom matematického algoritmu na porovnanie sekvencii je algoritmus Meyersa a Millera, CAB1OS (1989). Takýto algoritmus je zaradený do programu ALIGN (verzia 2.0), ktorý je súčasťou balíka Software porovnávania sekvencii GCG (Accelrys). Pri používaní programu ALIGN na porovnávanie aminokyselinových sekvencii možno použiť cibuľky váhy zvyškov PAM 120, pokutu dĺžky medzery 12 a pokutu medzery 4. Ďalšie algoritmy na analýzy

V určitých polypeptidu parametre

Viď default

BLASTN!

~>Ί sekvencii sú v súbore známe a zahŕňajú ADVANCE a ADAM, ako sú popísané v Toreiiis a Robotti, Comput. Appi. Biosci.10: 1-3 (1994) ; a FA3TA popísaný v Pearson a Lipman, Pros. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 24 -ú ú-8 '1998).

V inom vyhozovení možno percento identity medzi dvomi aminokyselinovýrz sekvenciami určiť s použitím GAP programu v GCG balíku sofzware (dostupnom na //www.acceirys.com, ako je dostupná 31.augusua 2001) buď s použitím matice Blossorr. 63 alebo PAM250, váhou medzery 12, 10, 8, 6 alebo 4 a váhou dĺžky 2, 3 alebo 4. ľ ešte inom vyhotovení možno percento identity medzi dvomi amir.; kyselinovými sekvenciami určiť s použitím GAP programu v GC2 balíku Software (dostupnom na http://www.gcg.ccm), s použitím váhy medzery 50 a váhy dĺžky 3 .

Polypeptid boxu a jeho biologicky aktívne fragmenty

Ako je už opísané, tento vynález je zameraný na poiypeptidové prostriedky obsahujúce cicavčí HMG A box, alebo jeho biologicky aktívne fragmenty, ktoré môžu inhibovať uvolňovanie cytczínov podporujúcich zápal z cicavčích buniek, na ktoré sa pôsobí HMG, alebo ktoré možno použiť na liečbu stavov charakterizovaných aktiváciou kaskády zápalových cytokínov.

Pri odkaze spôsobu podľa vy: zápal, zahŕňa pc aspoň malú ale podporujúcich zá· cytokínov podpor., bez pôsobenia, aspoň 50%, vc v 50%, v ešte výno a v naj výhodne j ú na účinok akéhokoľvek prostriedku alebo .álezu na uvoľňovanie cytokínov podporujúcich užitie výrazov „inhibovať alebo „znižovať merateľnú redukciou uvoľňovania cytokínov al·. Vo výhodných vyhotoveniach je uvoľňovanie ’úcich zápal inhibované aspoň o 20% kontroly o výhodnejších vyhotoveniach je inhibícia úaodnejších vyhotoveniach je inhibícia aspoň .uejších vyhotoveniach je inhibícia aspoň 70% h vyhotoveniach je aspoň 80%.Takéto redukcie uvoľňovania cytokínov podporujúcich zápal majú schopnosť redukcie škodlivých účinkov kaskády zápalových cytokínov v 10 vivo vyhotovení.

Pretože všetky scavovcové HMG A boxy vykazujú vysoký stupeň sekvenčej konzervácie (viď napríklad obr.13 ra porovnanie aminokyselinovéj sekvencie potkaních, myších a ľudských HMG polypeptídov), zdá sa, že akýkoľvek stavovcový HMG A box môže ir.hibcvať uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal zo otavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí HMG. Akýkoľvek stavovcový HMG A box preto spadá do rozsahu vynálezu. S výhodou je HMG A box cicavčí HMG A box, napríklad cicavčí HMG1 A box, ako je cicavčí HMG1 A box poskytnutý tu akc SEKV.ID.Č. 4 aleboSEKV. ID. Č . 22 . Do vynálezu sú taxtiež zanrr.uté fragmenty HMG1 A boxu majúce biologickú aktivitu, ako sú tú popísané.

Osoba zbehlá v odbore taktiež rozpozná, že prirodzene sa HMG A boxy (alebo ich biologicky aktívne toré by inhibovali uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal· zo stavovcovej bunky, na ktoré sa pôsobí HMG, môžu byť vytvorené bez zbytočného experimentovania. Tieto prirodzene sa nevyskytujúce funkčné A boxy môžu byť vytvorené porovnaním aminokyselinových sekvencií HMG A boxov z rôznych zdrojov a vyhotovením jednej alebo viacerých substitúcií v jednej zo sekvencií v aminokyselinových pozíciách, kde sa A boxy líšia. Substitúcie sa s výhodou uskutočnia s použitím rovnakých aminokyselinových zvyškov, aké sa nachádzajú v porovnávanom A boxe. Alternatívne sa uskutoční konzervatívna susbstitúcia ktoréhokoľvek zo zvyškov.

Konzervatívne substitúcie odkazujú na vzájomnú zameniteľnosť zvyškov majúcich podobné bočné reťazce. Konzervatívne substituované aminokyseliny môžu byť zoskupené podľa chemických vlastností bočných reťazcov. Napríklad: jedno zoskupenie aminokyselín zahŕňa tie aminokyseliny, ktoré majú nevyskytujúce fragmenty), neutrálne a hydrofóbne bočné reťazce (a,

1, i, p, w, f a m.'; iné zoskupenie je z aminokyselín majúcich neutrálne a polárne bočné reťazce (g, s, t, y, c, n a q); iné zoskupenie je z aminokyselín majúce bázické bočné reťazce (k, r a n); iné zoskupenie je z aminokyselín majúcich kyslé bočné reťazce (c. a e:; iné zoskupenie je z aminokyselín majúcich alifatické bočné reťazce (g, a, v, 1 a i); iné zoskupenie je z aminokyselín majúcich alifatické-hydroxylové bočné reťazce (s a t) ; iné zoskupenie je z aminokyselín majúcich bočné reťazce obsahujúce amín (n, q, k, r a h); a iné zoskupenie jc z aminokyselín majúcich bočné reťazce obsahujúce síru (c a m). Výhodné skupiny konzervatívnych substitúcií aminokyselín sú : r-k; e-d, y-f, 1-m; v-i a q-h).

Keď v konzervatívnych aminokyselinových substitúciách možno predpokladať zachovanie biologickej aktivity polypeptidu HMG A boxu, nasledujúce je príkladom, ako možno vytvoriť prirodzene sa nevyskytujúce polypeptidy A boxu porovnaním luoského HMG1 A boxu (SEKV.ID.Č.4) so zvyškami 32 až 85 SEKV.ID.Č. ľudského HMG2 A boxu (SEKV.ID.Č.17).

HMGÍ pdasvnfsef skkcserwkt msakekgkfe dmakadkary eremktyipp kget HMG2 pdassnfaef skkcserwkt msakekskfe dmaksdkary dremknyvpp kgdk

Prirodzene sa nevyskytujúci HMG A box môže byť vytvorený napríklad substitúciou zvyšku alanínu (a) v tretej pozícii HMG1 A boxu zvyškom serínu (s), ktorý sa nachádza v tretej pozícií HMG2 A boxu. Osoba zbehlá v odbore oude vedieť, že táto substitúcia poskytne funkčný, prirodzene sa nevyskytujúci A box, pretože zvyšok funguje v tejto pozícii v HMG 2 A boxe. Alternatívne môže byť tretia pozícia HMG1 A boxu substituovaná ktcroukclvek aminokyselinou, ktorá je konzervatívna k alanínu alebo serínu, ako je glycín (g), treonín (T), valín alebo leucín (L). Osoba zbehlá v odbore uzná, že v týchto konzervatívnych substitúciách možno očakávať, že povedú k funkčnému A boxu, pretože A boxy nie sú invariantné v tretej pozícii, takže konzervatívna substitúcia môže poskytovať adekvátnu štruktúrnu náhradu aminokyseliny, ktorá sa v tejto pozícii vyskytuje prirodzene.

Touto metódou možno vytvoriť bez zbytočného experimentovania veľmi mnoho prirodzene sa nevyskytujúcich HMG A boxov s očakávanou funkčnosťou a funkčnosť každého eonkrétn-ho prirodzene sa nevyskytujúceho HMG A boxu možno predpovedať s adekvátnou presnosťou. V každom prípade možno funkčnosť prirodzene sa nevyskytujúceho HMG A boxu stanoviť bez zbytočného experimentovania jednoduchým pridá spoíu HMG a stanovením, či cytckíncv podporujúcich zápal spôsobov tu popísaných.

Bunkou, v ktorej bude A box alebo biologicky aktívny fragment A boxu inhibovať uvoľňovanie HMG-indukovaných cytckíncv podporujúcich zápal, môže byť akákoľvek bunka, ktorá môže byť indukovaná k produkcii cytokínov podporujúcich zápal. Vo výhodných vyhotoveniach je toutu bunkou imunitná bunka, napríklad makrofág, monocyt alebo neutrofil. V najvýhodnejších vyhotoveniach je touto bunkou makrofág.

V rozsahu vynálezu sú polypeptidy obsahujúce A box alebo biologicky aktívny 'fragment A box, ktoré môžu inhibovať produkciu každého jednotlivého cytokínu podporujúceho zápal, známeho teraz alebo objaveného neskôr. S výhodou budú protilátky inhibovať produkciu TNF, IL-Ιβ alebo IL-6. Najvýhodnejšie budú protilátky inhibovať produkciu každého cytokínu podporujúceho zápal produkovaného stavovcovou bunkou.

Vynález je zameraný taktiež na prostriedky obsahujúce ktorýkoľvek z hore popísaných polypeptidov vo farmaceutický prijateľnom excipiente. V týchto vyhotoveniach môže prostriedok inhibovať stav charakterizovaný akzivácicu kaskády . k bunkám A box inhibuje uvoľňovanie bunkou, s použitím napr.

zápalových cytokínov. Stavom môže byť stav, «de kaskáda zápalových cytokínov spôsobuje systémovú reakciu, ako je to or i endotoxickom šoku.

Alternatívne moze sta v sprostredkovaný lokalizovanou kaskádou zápalových cytokínov, ako pri reumatickej artritíde. Neobmedzujúce príklady stavov, ktoré možno užitočne liečiť s použitím tohto vynálezu, boli uvedené v tejto špecifikácii v sekcii c do:

stave techniky. S výhodou je týmto stavom apendicicída, peptické, žalúdočné a dvanástnikové vredy, peritonitída, pankreatitída, ulceratívna, pseudomembranózna, akútna a ischemická kolitída, divertikulitída, epiglotitída, achalázia, Whipplova choroba, astma, alergia, anafylaktický šok, ochorenie imunitného komplexu, orgánová ischémia, reperfúzne poranenie, orgánová nekróza, senná nádcha, sepsa, septi kémia, endotoxický šok, kachexia, hyperpyrexia, eozinofilný granulóm, granulomstóza, sarkcidóza, septický abortus, epididymitída, vaginitída, prostatitída, zápal močovodu, bronchitída, rozedma, rinitída, ultrami kros kopická bronchioiitída, cystická fibróza, pneumonitída, pneumsilikovolkanokonióza, alveolitída, farangitída, pleurízia, sínusítída, infekcia respiratórnym synciciálnym vírusom, herpetická infekcia, infekcia HIV, infekcia vírusom hepatitídy B, infekcia vírusom hepatitídy C, rozšírená bakteriémia, horúčka Dengue, kandidóza, malária, filarióza, amebióza, hydatická cysta, popáleniny, dermatitída, dermatomyozitída, „spálenie' vaskulitída, angitída, slnkom, koprivka, bradavica, endokarditída, arteritída, ateroskleróza, tromboflebitída, perikarditída, myokarditída, ischémia myokardu, periarteritis nodosa, reumatická horúčka, Alzheimerova choroba, coeliacká choroba, stagnujúce zlyhanie srdca, syndróm zástavy dýchania dospelých, meningitída, encefalitída, roztrúsená skleróza, mozgový infarkt, mozgová embólia, syndróm Guillama-Barrea, neuritída, neuralgia, poranenie miechy, obrna, uveitída, artritídy, artralgie, osteomyelitída, zápaly svalov, Pagetova choroba, dna, per iodontálne ochorenie, reumatoidná <artritída, synovitída, myastenia gravís, thyreoitída, systémový lupus erytematosus, Goodpasterov syndróm, Bechterov syndróm, odmietnutie aloštepu, septixemia, rozšírená ochorenie transplantát-versus-hostitel, diabetes typu I, sponaylitída, Bergerova choroba, Retierov syndróm a Hodgkinova choroba. Vo výhodnejších vyhotoveniach je stavom aper.dicitída, peptické, žalúdočné a dvanástin kové vredy, peritonicida, pankreatitída, ulceratívna, pseudomembranózna, akútna a ischemická kolitída, hepatitída, Crohnova choroba, astma, alergia, anafylaktický šok, orgánová ischémia, reperfúzne poranenie, orgánov nekróza, senná nádcha, sepsa, endctoxický šok, kachexia, septický abortus, bakteriémia, popáleniny, Alzheimerova choroba, coeiiacká choroba, stagnujúce zlyhanie srdca, syndróm zástavy dýchania dospelých, mozgový infarkt, mozgová embólia, poranenie miechy, obrna, odmietnutie aloštepu a ochorenie transplantát-versushostiteľ. V najvýhodnejších vyhotoveniach je stavom endotoxický šok a odmietnutie aloštepu a ochorenie transplantát-versus-hostitel. V najvýhodnejších vyhotoveniach je stavom endotoxický šok a odmietnutie aloštepu. Keď je stavom odmietnutie aloštepu, prostriedok môže ďalej s výhodou obsahovať imunosupresant používaný na inhibíciu odmietnutia aloštepu, ako je cyklosporín.

Excipient zaradený s polypeptidom do týchto prostriedkov je vybraný na základe očakávanej cesty podávania prostriedku pri liečebných aplikáciách. Cesta podávania prostriedku závisí na stave, ktorý má by liečený. Napríklad: Intravenózna injekcia môže byť výhodná na liečbu systémových porúch, ako je endotoxický šok a orálne podávanie môže byť vhodné na liečbu gastrointestinálnych porúch, ako je žalúdočný vred. Cesta podávania prostriedku, ktorý má byť podávaný, môže byť určená bez zbytočného experimentovania osobou zbehlou v odbore v súvislosti so štandartnými štúdiami dávka-odozva. Relevantné okolnosti zvažované pri takýchto určeniach zahŕňajú stav, ktorý má byť liečený, vek, hmotnosť a odozvu jednotlivého pacienta a závažnosť pacientových príznakov. V závislosti na stave teda môže byť protilátkový prostriedok podávaný pacientovi, orálne, parenterálne, ir.tranasálne, vagmálne, rektálne, na jazyk, pod jazyk, do líca, intrabukálne a transdermálne.

V súlade s tým môžu byť prostriedky určené na podávanie orálne, na jazyk, pod jazyk, do líca a intrabukálne pripravené bez zbytočného experimentovania spôsobmi cobre známymi v odbore, napríklad s inertným rozpúšťadlom alebo jedlým nosičom. Prostriedky môžu byť uzatvorené do jedlých kapslí alebo stlačené do tabliet. Na účely orálneho liečebného podávania môžu byť farmaceutické prostriedky podlá vynálezu spojené s excipientami a používané vo forme tabliet, pastiliek, kapslí, elixírov, suspenzií, sirupov, opiatiek, žuvacích gúm a podobne.

Tablety, pilulky, kapsule, pastilky a podobne môžu obsahovať taktiež viažúce látky, recipienty, dezintegračné látky, lubrikanty, sladidlá, príchute. Príklady niektorých väzobných látok zahŕňajú mikrokryštalickú celulózu, gumu, tragakant alebo želatínu. Príklady excipientov zahŕňajú škrob alebo laktózu. Príklady niektorých dezintegračných látok zahŕňajú kyselinu alginovú, kukuričný škrob a podobne. Príklady lubrikantov zahŕňajú stearát horečnatý alebo draselný. Príkladom glidantu je silikóndioxid. Príklady niektorých sladidiel zahŕňajú sacharózu, sacharín, a podobne. Príklady príchutí zahŕňajú mätu, metylsalicylát, pomarančovú chuť a podobne. Materiály používané na preparáciu týchto rôznych prostriedkov musia byť farmaceutický čisté a netoxické v používaných množstvách.

Prostriedky podlá vynálezu možno parenterálne, ako napríklad intravenózne, intratekálne alebo podkožnou injekciou. Parenterálne podávanie môže byť uskutočnené vyhotovením protilátkového prostriedku pódia vynálezu do roztoku alebo suspenzie. Takéto roztoky alebo suspenzie môžu taktiež obsahovať sterilné rozpúšťadlá, ako je voda pre injekcie, soľný roztok, fixované oleje, lahko podávať intramuskulárne, polyetylénglykoly, glycerín, propylénglykol a iné syntetické rozpúšťadlá. Parenterálne formulácie môžu taktiež zahŕňať antibakteriálne činidlá, ako sú napríklad benzylalkohol alebo metylparabény, antioxrdanty, ako sú napríklad kyselina askorbová alebo bisulfit sodný a chelačné činidlá, ako je EDTA. Pridané môžu byť taktiež pufry, ako sú acetáty, citráty a fosfáty, a činidlá na nastavenie tonicity, ako je chlorid Parenterálne prostriedky môžu byť jednorázových striekačkách alebo sodný alebo glukóza, uzatvorené v ampulách, flaštičkách pre viacero dávok vyrobených zo skla alebo plastu.

Rektálne podávanie zahŕňa podávanie farmaceutického prostriedku do rekta alebo hrubého čreva. Toto je uskutočnené použitím čípkov alebo klystýru. Formuláciu čípkov možno uskutočniť ľahko spôsobmi v odbore známymi. Napríklad: Formuláciu čípkov možno uskutočniť zahriatím glycerínu na asi 120°C, rozpustením protilátkového prostriedku v glyceríne, miešaním zahriateho glycerínu, po ktorom možno pridať čistenú vodu a naliať horkú zmes do čipkovej formy.

Podávanie cez kožu zahŕňa perkutánnu absorpciu prostriedku cez kožu. Transdermálne formulácie zahŕňajú náplaste, mazanie, krémy, gély, riedke masti a podobne.

Tento vynález zahŕňa nosné podávanie terapeuticky účinného množstva prostriedku cicavcovi. Ako sa tu používa, nosné podanie alebo podávanie nosom zahŕňa podávanie prostriedku na membránu sliznice nosného traktu alebo nosnej dutiny pacienta. Ako sa tu používa, farmaceutické prostriedky na nosné podávanie prostriedku obsahujú terapeuticky účinné množstvo agonistu pripravené dobre známymi spôsobmi na podávanie, napríklad ako nosný sprej, nosné kvapky, suspenzia, gél, mazanie, krém alebo púder. Podávanie možno uskutočňovať taktiež s použitím nosného tampónu alebo nosnej hubky.

Polypeptidové prostriedky tu popásané môžu zahŕňať taktiež antagonistu mediátora včasnej sepsy. Ako sa tu používa, mediátor včasnej sepsy je cytokin podporujúci zápal, ktorý je uvoľňovaný z bunky skoro (t.j. počas 30-60 minút; pc indukcii vystavení

LPS; .

faktora produkciu týchto interleukínnu-ΐβ.

kaskády zápalových cytokínov (napr.

Neobmedzujúcimi príkladmi týchto cytokínov sú TNF, IĽ-loy IL1β, IL-6, PAF a MIF. Zahrnuté ako mediatorv včasnej sepsy sú taktiež receptory pre tieto cytokíny (napríklad receptor nekrózy tumorov, typu 1) a enzýmy potrebné na cytokínov, napríklad enzým konverzie Antagonisti mediátorov včasnej sepsy, už známe alebo neskôr objavené, môžu byť užitoční pre tieto vyhotovenia ďalšej inhibície kaskády zápalových cytokínov.

Neobmedzujúcimi príkladmi antagonistov mediátorov včasnej sepsy sú „antisense zlúčeniny, ktoré mediátcrom včasnej sepsy, pričom bránia jej napr. Ojwang et al., Biochemistry í et al., Biol. Reprod. 52: 1316-132(

228 642; Yahata et al., Antisense Nuclei Acid Drug Dev.tí: 199205, 1998), ribozómy, ktoré špecificky štiepia mRNA mediátorov včasnej sepsy (viď napr. Leawitt et al., Antisense Nuclei Acid Drug Dev. 10: 409-414, 2000; Kisich et al., 1999; a Hendrix et al., Biochem.J.314 (pt.2): 655-661, 1996) a protilátky, ktoré sa viažu k mediátorom včasnej sepsy a inhibujú ich pôsobenie (viď napr. Kam a Tragan, Expert Opin.Pharmacother. 1: 615-622;

Nagahira et al., J.Immunol. Methods 222, 83-89, 1999; Lavíne et al., J.Cereb. Blood Flow Metab.18: 52-58, 1998 al., Hybridoma 19: 363-367, 2000). Na antagonistu mediátorov včasné sepsy, známeho alebo objaveného v budúcnosti, sa pozerá ako na patriaceho do rozsahu vynálezu. Osoba zbehlá v odbore môže určiť množstvo mediátorov včasnej sepsy na použitie v týchto prostriedkoch na inhibíciu ktoréjkokoľvek konkrétnej kaskády zápalových cytokínov bez zbytočného experimentovania pomocou rutinných štúdií dávka/odozva.

ktoré	sa	viažu
ránia	jej	expresii
6C03-	6045 ,	197; Pa.
1995 ;	U.S.	patent (

Vie ; a Holmes et ktoréhokoľvek

Polypeptidy B boxu, ich biologicky aktívne fragmenty a protilátky k ním

Ako je vpredu opísané, vynález je zameraný na polypeptidové prostriedky obsahujúce stavovcové HMG B boxy, alebo icn biologicky aktívne fragmenty, ktoré môžu zvyšovať uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal zo stavovcovej bunky, na ktoré sa pôsobí HMG.

Pri odkazoch na účinok akéhokoľvek prostriedku alebo spôsobu podlá vynálezu na uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal, zahŕňa použitie výrazov „zvyšovať aspoň malý, ale meratelný nárast uvoľňovania cytokínov podporujúcich zápal. Vo výhodných vyhotoveniach je uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal zvýšené aspoň 1,5-krát, aspoň 2-krát, aspoň 5-krát alebo aspoň 10-krát nad kontroly bez pôsobenia. Takéto zvýšenia uvoľňovania cytokínov podporujúcich zápal majú schopnosť zvyšovať účinok kaskády zápalových cytokínov v in vivo vyhotoveniach. Takéto polypeptidy môžu byť použité taktiež na indukciu straty hmotnosti alebo liečenia obezity.

Pretože všetky stavovcové HMG B boxy vykazujú vysoký stupeň sekvenčnej konzervancie (viď napr. obr.13 na porovnanie aminokyselinovej sekvencie potkaních, myších a ľudských HMG polypeptidov), zdá sa, že funkčné, prirodzene sa nevyskytujúce HMG B boxy môžu byť vytvorené bez zbytočného experimentovania vyhotovením jednej alebo viacerých konzervatívnych aminokyselinových substitúcií alebo porovnaním prirodzene sa vyskytujúcich stavovcových a substitúciou analogických rozobraté hore s ohľadom

B boxov z rôznych zdrojov aminokyselín, ako to bolo na funkčné, prirodzene sa nevyskytujúce HMG A boxy. Vo zvlášť výhodných vyhotoveniach B box obsahuje SEKV.ID.Č.5 alebo SEKV.ID.Č.20, čo sú sekvencie ľudského HMG1 B boxu dvoch rôznych dĺžok, alebo je fragmentom B boxu, ktorý má biologickú aktivitu B boxu. Napríklad: Sekvencia 20-tich aminokyselín obsiahnutá v rámci SEKV.ID.Č.20 prispieva k funkcii B boxu. Tento 20 aminokyselinový fragment B boxu má nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu: fkdpnaokrl psafflfcse (SEKV.ID.Č.16). Iný príklad biologicky aktívneho fragmentu B boxu pozostáva z aminkyselín 1-20 SEKV.I2.G.5 (napkrppsaf flfcseyrpk; SEKV.ID.Č.23).

Vynález je taktiež zameraný na purifikované preparáty protilátok, ktoré sa špecificky viažu k B boxu stavovccvého proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG), ale neviažu sa špecificky k non-B boxovým epitopcm HMG. V týchto vyhotoveniach môžu protilátky inhibovať biologickú aktivitu polypeptidu B boxu, napríklad uvolňovanie cytokinov podporujúcich zápal zo stavovcovej bunky indukovanej HMG.

Na získanie protilátok špecifických k HMG B boxu alebo jeho fragmentom, alebo k bunkám exprimujúcim B box alebo jeho fragmenty nesúce epitop, môžu byť tieto použité ako imunogén na produkciu protilátok imunošpecifických k imunogénu. Výraz „protilátky ako sa tu používa zahŕňa monoklonálne a polyklonálne protilátky, chimerické, jednovláknové, simianizované a humanizované protilátky, ako i Fab fragmenty, vrátane produktov Fab imunoglobulínovej expresnej” knižnice.

Pretože všetky stavovcové HMG B boxy vykazujú vysoký stupeň sekvenčnej konzervancie, zdá sa, že ktorýkoľvek stavovcový HMG B box môže indukovať uvoľňovanie cytokinov podporujúcich zápal z stavovcovej bunky. Protilátky proti akémukoľvek stavovcovému HMG B boxu sú preto v rozsahu vynálezu. S výhodou je HMG B boxom cicavčí HMG B box, výhodnejšie cicavčí HMG1 B box, najvýhodnejšie ludský HMG1 B box, poskytnutý tu ako SEKV.ID.Č.5 alebo SEKV.ID.Č.20. Protilátky môžu byť cielené taktiež proti fragmentu HMG B boxu, ktorý má biologickú aktivitu.

Protilátky generované proti HMG B boxu môžu byť získané podávaním B boxu, fragmentu B boxu alebo buniek obsahujúcich B box alebo fragment B boxu zvieraťu, s výhodou nie ľudskému, s použitím rutinných protokolov. Daný polypeptid, ako je antigénny alebo immunologicky ekvivaletný derivát alebo jeho fúzny proteín, je použitý ako antigén na imunizáciu myší alebo iného zvieraťa, ako je potkan alebo kura. Imunogén 3 boxu alebo fragmentu môže byť poskytnutý ako fúzny proteín na poskytnutie stability alebo alebo fragmentu. Imunogén konjugáciou, s ímunogénnym zvýšenie imunogénici ty 3 boxu môže byť spojený, napríklad nosičovým: proteínom, napríklad zvýšenie nosiča.

bovinným sérumalbumínom (BSA) hemocyanínom šášne lodnej (KLH). Alterantivne môže byť antigény peptid obsahujúci viacero kópií B boxu alebo fragmentu dostatočne antigénny na imunogenicity tak, že možno obísť použitie

Bišpecifické protilátky majúce dve antigén viažuce domény, z ktorých každá je cielená k inému epitopu B boxu, môžu byť taktiež produkované rutinnými metódami.

Na prípravu monoklonálnych protilátok možno použiť ktorúkoľvek techniku známu v odbore, ktorá poskytuje protilátky produkované v kontinuálnych kultúrach bunkovej línie. Viď Kohler a Milstein, Náture 256: 495-497, 1975; Kozbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983; a Cóle et al.,' str.77-96 v Monoclonal Antibodies nad Cancer therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985.

Techniky na produkciu jednovláknových protilátok (U.S.patent 4 946 778) možno adaptovať na produkciu jednovláknových protilátok k B boxu alebo fragmentom. Na expresiu humanizovaných protilátok možno použiť transgénne myši alebo iné organizmy, ako sú iné cicavce.

Keď sa protilátka používa terapeuticky v in vivo aplikáciách, je protilátka s výhodou modifikovaná tak, aby sa stala menej imunogénnou v danom jednotlivcovi je jednotlivcom človek, protilátka určujúce

Napríklad: Keď je s výhodou komplementaritu „humanizovaná, pričom oblasť (i) protilátky je/sú transplantovaná/é do ľudskej protilátky (ako je napríklad popísané v Jones et al., Náture 321: 522-525,

1986; a Tempest et al., Biotechnology 9: 266-273, 1991).

Technológiu vystavenia na fágu možno taktiež využiť na selekciu génov protilátok s väzobnou aktivitou proti polypeptidu, a to buď z repertoáru PC-ampiifikovaných v-génov lymfoctov z človeka zachyteného ako nositeľa protilátok proti B boxu, alebo z naivných knihovien (McCafferty et al., Náture 348: 552-554, 1990; a Marks et al., Biotecknology 10: 779-783, 1992). Afinita týchto protilátok môže byť taktiež zvýšená prehadzovaním reťazcov (Clakson et al., Náture 352: 624-628, 1991).

Keď sú protilátky, ktoré sa špecificky viažu k epitopom HMG B boxu získané, môžu byť bez zbytočného experimentovania hodnotené na schopnosť inhibovať uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal.

Protilátky, ktoré môžu inhibovať produkciu ktoréhokoľvek jednotlivého cytokínu podporujúceho zápal sú v rozsahu vynálezu. S výhodou môžu protilátky inhibovať produkciu TNF, IL-Ιβ alebo IL-6. Najvýhodnejšie môžu protilátky inhibovať produkciu všetkých cytokínov podporujúcich zápal produkovaných stavovcovou bunkou.

Na spôsoby inhibície uvoľňovania cytokínov podporujúcich zápal z bunky alebo na liečbu stavu charakterizovaného aktiváciou kaskády zápalových cytokínov s použitím protilátok k HMG B boxu alebo jeho biologicky aktívnemu fragmentu môže byť bunkou akákoľvek bunka, ktorá môže byť indukovaná na produkciu cytokínov podporujúcich zápal. Vo výhodných vyhotoveniach je toutu bunkou imunitná bunka, napríklad makrofág, monocyt alebo neutrofil. V najvýhodnejších vyhotoveniach je touto bunkou makrofág.

V iných vyhotoveniach je vynález zameraný na prostriedok obsahujúci preparát protilátky popísanej hore vo farmaceutický prijateľnom excipiente. V týchto vyhotoveniach môže prostriedok inhibovať stav charakterizovaný aktiváciou kaskády zápalových cytokínov. Stavy, ktoré môžu byť liečené týmito prostriedkami, boli už dané do výpočtu hore.

Protilátkové prostriedky popísané hore môžu zahŕňať taktiež antagonistu mediátorov včasnej sepsv, ako hol už sxôr popísaný.

Polypeptidy B boxu alebo jeho biologicky aktívne fragmenty popísané v týchto vyhotoveniach môžu byť použité na indukciu zápalových cytokinov vo vhodných izlovaných bunkách in vitro , alebo ex vivo, alebo ako liečba in vivo. V taždom takomto pôsobení môže byť polypeptid alebo fragment podávaný poskytnutím vektoru DNA alebo RNA kódujúci B oox alebo fragment B boxu, s patričnou riadiacou sekvenciou funkčne spojenou s kódovaným B boxom alebo fragmentom B boxu, takže B box alebo fragment B boxu je syntetizovaný v bunke alebo pacientovi, na ktorého sa pôsobí. In vivo aplikácie zahŕňajú použitie polypeptidov, na ktoré sa pôsobí. In vivo aplikácie zahŕňajú použitie polypeptidov B boxu alebo polypeptidov fragmentu B boxu alebo vektorov ako činidla pôsobenia na strate hmotnosti. Viď WO 00/47104 (ktorého všetky poznatky sú tu zahrnuté odkazom), ktorý demonštruje, že liečba HMG1 indukuje stratu hmotnosti. Pretože HMG B box má aktivitu HMG proteínu, možno v B boxe očakávať indukciu straty hmotnosti. Vo fragmentoch B boxu, ktoré majú funkciu B boxu, možno taktiež očakávať indukciu straty hmotnosti.

V ďalších vyhotoveniach je vynález zameraný taktiež na spôsob inhibície uvoľňovania cytokinov podporujúcich zápal z cicavčej bunky. Spôsob zahŕňa pôsobenie na bunku ktorýmkoľvek prostriedkom HMG A boxu alebo ktorýmkoľvek protilátkovým prostriedkom HMG B boxu alebo biologicky aktívneho fragmentu B boxu, rozobraných hore.

Zdá sa, že tento spôsob by mal· byť užitočný na inhibíciu uvoľňovania cytokinov z akejkoľvek cicavčej bunky, ktorá produkuje cytokíny podporujúce zápal. Vo výhodných vyhotoveniach je však touto bunkou makrofág, pretože makrofágová produkcia cytokinov podporujúcich zápal je spojená s niekoľkými závažnými ochoreniami.

Zdá sa, že tento spôsob je užitočný na inhibiciu akéhokoľvek cytokínu podporujúceho zápal produkovaného cicavčou bunkou. Vo výhodných vyhotoveniach je cytokínom podporujúcim zápal TNF, IL-Ία, IL-Ιβ, MIF alebo IL-6, pretože tieto cytokiny podporujúce zápal sú obzvlášť dôležitými mediárormi ochorenia.

Spôsob týchto vyhotovení je užitočný pre m vitro aplikácie, ako je to pri štúdiách na stanovenie biologických charakteristík produkcie cytokínov podporujúcich zápal v bunke. Výhodnými vyhotoveniami sú však in vivo terapeutické aplikácie, kde sú bunky v pacientovi, ktorý trpí, alebo je v ohrození, stavom charakterizovaným aktiváciou kaskády zápalových cytokínov.

V týchto in vivo vyhotoveniach sa zdá, že sú užitočné v ktoromkoľvek stave, ktorý je sprostredkovaný kaskádou zápalových cytokínov, vrátane tých, ktoré boli už dané do výpočtu. Medzi výhodné stavy sú zahrnuté apendicitída, peptické, žalúdočné a dvanástnikové vredy, peritonitida, pankreatitída, ulceratívna, pseudomembranózna, akútna a ischemická kolitída, hepatitída, Crohnova choroba, astma, alergia, anafylaktický šok, orgánová ischémia, reperfúzne poranenie, orgánová nekróza, senná nádcha, sepsa, septikémia, endotoxicky šok, kachexia, septický abortus, bakteriémia, popáleniny, Alžheimerova choroba infarkt, mozgová embólia, poranenie miechy, obrna, odmietnutie aloštepu a ochorenie transplantát-versus-hostitel.

V najvýhodnejších vyhotoveniach je stavom endotoxicky· šok a odmietnutie aloštepu. Keď je stavom odmietnutie aloštepu, prostriedok môže čulej s výhodou obsahovať imunosupresant používaný na inhibiciu odmietnutia aloštepu, ako je cyklosporín.

Tieto spôsoby môžu taktiež s úžitkom zahrnúť podávanie antagonistu médiá*.ora včasnej sepsy. Povaha týchto rozšírená mozgový antagonistov bola ui rozobraná.

V ešte iných vyhotoveniach je vynález zameraný na spôsob liečby stavu charakterizovaného aktiváciou kaskády zápalových cytokínov u pacienta. Spôsob zahŕňa podávanie ktoréhokoľvek prostriedku HMG Ά boxu (vrátane prirodzene sa nevyskytujúcich polypeptidov A boxu alebo biologicky aktívnych fragmentov A boxu) alebo ktoréhokolvek protilátkového prostriedku HMG B boxu alebo biologicky aktívneho fragmentu B boxu (vrátane prirodzene sa nevyskytujúcich polypeptidov B boxu alebo ich biologicky aktívnych fragmentov) rozobraných hore, pacientovi.

V tomto spôsobe sa zdá, že by mal byť užitočný v ktoromkoľvek stave, ktorý je sprostredkovaný kaskádou zápalových cytokínov, vrátane tých, ktoré už boli vypočítané. Ako v skôr popísaných in vivo spôsoboch, medzi výhodné stavy sú zahrnuté apendicitída, peptické, žalúdočné a dvanástnikové vredy, peritonitída, pankreatitída, ulceratívne, pseudomembranózne, akútne a ischemické kolitídy, hepatitída, Crohnova choroba, astma, alergia, anafylaktický šok, orgánová ischémia, reperfúzne proanenie, orgánová nekróza, senná nádcha, sepsa, septikémia, endotoxický šok, kachexia, septický abortus, rozšírená bakteriémia, popáleniny, Alzheimerova choroba, mozgový infarkt, mozgová embólia, poranenie miechy, obrna, odmietnutie aloštepu a ochorenie transplantát-versus-hostiteľ.

V najvýhodnejších vyhotoveniach je stavom endotoxický šok a odmietnutie aloštepu. Keď je stavom odmietnutie aloštepu, prostriedok môže ďalej s výhodou obsahovať imunosupresant používaný na inhibíciu odmietnutia aloštepu, ako je cyklosporín.

Tieto spôsoby môžu taktiež s úžitkom zahrnúť podávanie antagonistu mediátora včasnej sepsv. Povaha týchto antagonistov bola už rozobraná.

V iných vyhotoveniach je vynález zameraný na spôsoby stimulácie uvoľňovania cytokínov podporujúcich zápal z bunky. Spôsob zahŕňa pôsobenie na bunku ktorýmkoľvek z polypeptidov B boxu alebo ktorýmkoľvek z polypeptidov fragmentu B boxu, napríklad so sekvenciou SEKV.ID.Č.5, SEKV.ID.C.2 C, SEKV.ID.Č.16 alebo SEKV.ID.Č.23, ako sú tu popísané (vrátane prirodzene sa nevyskytujúcich polypeptidov . B boxu a fragmentov) . Spôsoio ]e užitočný pre in vitro aplikácie, napr. na štúdium účinkov produkcie cytokinov podporujúcich zápal a biológiu produkčné] bunky. Spôsob je taktrež užitočný pre in vivo aplikácie, napríklad v ovplyvnení straty hmotnosti alebo liečoa obezity pacienta, ako to už bolo popísané.

V ďalších vyhotoveniach je teda vynález zameraný na spôsob ovplyvnenia straty hmotnosti alebo liečby obezity u pacienta. Spôsob zahŕňa podávanie účinného množstva ktoréhokoľvek z polypeptidov B boxu alebo polypeptidov fragmentov B boxu (vrátane prirodzene sa nevyskytujúcich polypeptidov B boxu a fragmentov) vo farmaceutický prijateľnom excipiente pacientovi.

Vyhľadávanie modulátorov podporujúcich zápal z bunky.

uvoľňovania cytokinov

Vynález je taktiež zameraný na spôsob stanovenia, či zlúčenina (testovaná zlúčenia) inhibuje zápal alebo zápalovú odozvu. Spôsob zahŕňa zostavenie systému zo zlúčeniny a s a) bunky, ktorá uvoľňuje cvtokíny podporujúce zápal pri vystavení stavovcovému HMG B boxu alebo jeho biologicky aktívnemu fragmentu a b) HMG B boxu alebo jeho biologicky aktívnemu fragmentu, a potom stanovenie, či zlúčenia inhibuje uvolňovanie cytokinov podporujúcich zápal z bunky, v porovnaní s vhodnou kontrolou. Zlúčenina, ktorá inhibuje uvolňovanie cytokinov podporujúcich zápal v tomto teste môže byť použitá na liečbu zápalu alebo zápalovej odozvy. HMG B box alebo jeho biologicky aktívny fragment môžu byť k bunke endogénne alebo môžu byť do bunky zavedené s použitím štandartných techník molekulárnej biológie.

Očakáva sa, že užitočnou pre vynález by mala byť každá bunka, ktorá uvoľňuje cytokiny podporujúce zápal pri vystavení stavovcovému HMG E boxu alebo jeho biologicky aktívnemu fragmentu bez prítomnosti testovanej zlúčeniny. Predpokladá sa, že bunka, ktorá bude vybraná, by mala byť dôležitá v etiológii stavu, ktorý má byť liečený inhibičnou zlúčeninou, ktorá je testovaná. V mnohých stavoch sa očakáva, že výhodnou bunkou bude ludský makrofág.

Akýkoľvek spôsob stanovenia, či zlúčenina inhibuje uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal z bunky, by mal byť užitočný pre tieto vyhotovenia. Predpokladá sa, že výhodnými spôsobmi sú priame merania cytokínov podporujúcich zápal, napríklad ktorýmkoľvek z množstva komerčne dostupných ELISA testov. V niektorých vyhotoveniach však môže byť výhodné meranie zápalového účinku uvoľňovania cytokínov, obzvlášť, keď je testovanou bunkou produkované niekoľko cytokínov podporujúcich zápal. Ako už bolo rozobrané hore, pre mnoho závažných porúch sú prevažujúcimi cytokínmi podporujúcimi zápal TNF, IL-la, IL-Ιβ, MIF alebo IL-6, obzvlášť TNF.

Vynález taktiež obsahuje spôsob stanovenia, či zlúčenina zvyšuje zápalovú odozvu alebo zápal. Spôsob zahŕňa zostavenie systému zo zlúčeniny (testované zlúčeniny) a z a) bunky, ktorá uvoľňuje cytokiny podporujúce zápal pri vystavení stavovcovému HMG A boxu alebo jeho biologicky aktívnemu fragmentu a b) HMG A boxu alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu, a potom stanovenie, či zlúčenina zvyšuje uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal· z bunky, v porovnaní s vhodnou kontrolou. Zlúčenina, ktorá znižuje uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal v tomto teste alebo môže byť použitá na zvýšenie zápalovej odozvy alebo zápalu. HMG A boxu alebo biologicky aktívny fragment A boxu môžu byť k bunke endogénne alebo môžu byť do bunky zavedené s použitím štandartných molekulárnej biológie.

techník u vo f r. o vanie / odozve na o i o 1 o g i c k y testovanej

Podobne ako v bunkových typoch na identifikáciu inhibítorov zápalu vpredu opísaných očakáva sa, že užitočné pre vynález by mala byť každá bunka, v ktorej je cytokínov podporujúcich zápal normálne rnhibované vystavenie stavovcovému HMG A boxu alebG jeno aktívnemu fragmentu bez prítomnosti akejkolvek zlúčeniny. Predpokladá sa, že bunka, kvorá bude vybraná, cy mala byť dôležitá v etiológii stavu, Ktorý má byt liečený mhibičnou zlúčeninou, ktorá je testovaná. V mnohých stavoch sa očakáva, že výhodnou bunkou bude ľudský makrofág.

Akýkolvek spôsob stanovenia, či zlúčenina zvyšuje uvoľňovanie cytokínov podporujúcich zápal z bunky, by mal byť užitočný pre tieto vyhotovenia. Predpokladá sa, že výhodnými spôsobmi sú priame merania cytokínov podporujúcich zápal, napríklad ktorýmkoľvek z rady komerčne dostupných ELISA testov. V niektorých vyhotoveniach však môže byť výhodné meranie zápalového účinku uvoľňovaných cytokínov, obzvlášť, keď je testovanou bunkou produkované niekoľko cytokínov podporujúcich zápal. Ako už bolo rozobrané, pre mnoho závažných porúch sú prevažujúcimi cytokínmi podporujúcimi zápal NF, IL-la, IL-Ιβ,. MIF alebo IL-6, obzvlášť TNF.

Výhodné vyhotovenia vynálezu sú popísané v nasledujúcich príkladoch. Osobe zbehlej v odbore budú pri uvážení špecifikácií a praxe vynálezu, ako je tu popísaný zrejmé iné vyhotovenia v rozsahu vynálezu. Zámerom je, aby špecifikácie, spolu s príkladmi a nárokmi, boli považované len za vybrané príklady.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Materiály a metódy

Klonovanie HMG1 a produkcia mutantov HMG1

Na prípravu klonov a mutantov ľudského HMG1 boli použité nasledujúce metódy. Rekombinantý ľudský HMGľ plnej olžky (651 párov báz; prístupové číslo GenBank U51677) bol klor.ovar.ý PCR amplifikáciou z Quick-Clone (Clontech, Palo Alto, CA) preparátu cDNA ľudského mozgu pri použití nasledujúcich primerov; priamy primer: 5'GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG 3' (SEKV.ID.Č.6) a spätného primeru: 5'GCGGCCGCTTATTCATCATCATCTTC 3' (SEKV.ID.Č.47). Mutanty ľudského HMG1 boli klonované a purifikované ako nasledujúce. Skrátená forma ľudského HMG1 bola klonovaná PCR amplifikáciou z Quick-Clone(Clontech, Palo Alto, GA) preparátu cDNA ľudského mozgu. Použité primery, priamy resp. spätný, boli:

Karboxyterminálny mutant (557 bp): 5'GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG 3' (SEKV.ID.Č.8) a 5'GCGGCCGCTCACTTGCTTTTTTCAGCCTGAC 3' (SEKV.ID.Č.9) .

Mutant v N konci + B boxu (48 6 bp) : 5'GAGCATAAGAAGAAGCACCCA 3' íSEKV.ID.Č.10) a 5'GCGGCCGCTCACTTGCTTTTTTCAGCCTTGAC 3' (SEKV.ID.Č.11) .

Mutant B boxu (233 bp) : 5' AAGTTCAAGGATCCCAATGCAAG 3' (SEKV.ID.Č.12) a 5' GCGGCCGCTCAATATGCAGCCTATAATCCTTTTC 3' (SEKV.ID.Č.13).

Mutant N-konca + A boxu (261 bp): 5'GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG 3' (SEKV.ID.Č.13) a 5'TCACTTTTTTGTCTCCCCTTTGGG 3'(SEKV.ID.Č.14).

Ku každému mutantu bol pridaný stop kodón na zaistenie presnej veľkosti bielkovín. PCR produkty boli subklonované do EcoRI miest pCRII-TOPO vektor s použitím TA kloncvacej metódy podlá inštrukcií výrobcu (Invitrogen, Carlsbad, CA). Po amplifikácii bol PCR produkt štiepený EcoRI a subkloncvaný do vektora expresie s pridaným úsekom GST, pGEX (Pharmacia); správna orientácia pozitívnych klonov bola potvrdzovaná sekvenciou DNA obidvoch vlákien. Rekombinantné plazmidy boli transformované do E.coli kmeňov BL21 alebo RG21(DE3)plysS def icientr.ých na proteázu ÍNovagen, Madison, Wi) a expresia fúzneho proteínu bola indukovaná izopropyl-Dtiogalaktopyranozidom (IPTG). Rekombina.n té bielkoviny boli získané s použitím afinitnej purifikácie na kolóne s náplňou glutatión Sepharosy (Pharmacia).

HMG mutanty generované ako je to popísané hore mali nasledujúce aminokyselinové sekvencie:

HMG1 divokého typu:

MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEF

SKKCSERWKTMSAKEKGFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKD

PNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGE.MWNNTAADDKQP

YEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEED

EEDEEEEEDEEDEEDEEEDDDDE (SEKV.ID.Č.18)

Karboxyterminálny mutant:

MGKGDPKKPTGKMSSYÄFFVQTCREEHKKKHPDAS

VNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGFEDMAKÄDKARYEREMKTYIPPKGET

KKKFKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTA ADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKS (SEKV.ID.Č.19)

Mutant B boxu:

FKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEM

WNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAY (SEKV.ID.Č.20)

Mutant N-konca + A boxu:

MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEF

SKKCSERWKTMSAKEKGFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGET (SEKV.ID.Č.21) pričom A box pozostáva zo sekvencie

PTGKMSSYAFF

VQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGFEDMAKADK

ARYEREMKTYIPPKGET (SEKV.I D.Č.22)

Polypeptid generovaný z GST vektora bez HMGÍ proteínu bol zahrnutý ako kontrola (obsahujúca už pridanú GST sekvenciu). Na inaktiváciu batkeriálnej DMA, ktorá viaže HMGÍ divokého typu a niektorých mutantov lyzátu Dnázs I íLife Technologies) pre karboxyterminálny mutant a mutant 3 boxu alebo benzonáza nukleáza (Novagen, Medíson, WI) pre HMGÍ divokéno typu, na asi 20 jedn./ml. Degradácia DNA bola overovaná farbením agarózových gélov obsahujúcich HMGÍ proteín etídium bromidom pred a po pôsobení. Proteínové eluáty boli nechané pretiecť kolónou polymyxínu D (Pierce, Rockford, IL) na odsoránenie všetkého kontaminujúcého LPS a extenzívne dialyzcvané proti fosfátovému pufru so solou na odstránenie prebytočného glutatiónu. Preparáty potom boli lyofilizované a pred použitím znovu rozpustené v sterilnej vode. Hladiny LPS boli nižšie ako 60 pg/pg bielkoviny pri mutantoch a 300 pg/pg pri HMG 1 divokého typu, ako bolo zmerané testom lyzátu amébocytov Limulus (Bio Whittaker Inc., Wlakersville, MD). Integrita proteínov bola overovaná SDS-PAGE. V niektorých pokusoch bol použitý rekombinantý potkaní HMGÍ (Wang et al., Science 285: 248-251, 1999) pretože nemá degradačné fragmenty pozorované v purifikovanom ľudskom HMGÍ.

Syntéza peptidov

Peptidy boli syntetizované v Biotechnologickom centre Utah State University (Logan, Utah) s 90%-nou čistotou. V preparátoch syntetických peptidov nebol detekovaný endotoxín, ako bolo merané Limulus testom.

Bunkové kultúry

Murinné makrofágcm-pcdobné bunky RAW 264.7 (American Type Culture Collection, Rockvilee, MD) boli kultivované v RPMI 1640 médiu (Life Technologies, Grand Island, NY j doplnenom 10% fetálneho bovinného séra (Gemini, Catabasas, CA), penicílom a streptomycínom (Life Technologies) a boli používané pri 90* konfluencii v bezsérovom médiu Opti-MEM I (Life Technologies, Grand Island, NY) . Rutinne bol pridávaný poiymixín 3 (Sigma, St.Louis, MO) na 100-1000 jedn./ml na neutralizáciu akejkoľvek kontaminácie LPS, ako je to skôr popísané; polymyxín B samotný neovplyvňuje viabilitu buniek stanovenú s trypánovou modrou (Wang.el.al., hore). Polymyxín B nebol používaný v pokusoch so syntetickými peptidmi.

Meranie uvoľňovania TNF z buniek

Uvoľňovanie TNF bolo merané štandartnými biotestami (Bianchi et al., hore) s murínnymi fibroblastami L929 (ATCC, American Type Culture Collection, Rockville, MD) s najnižšou detekovatelnou koncentráciou 30 pg/ml. Rekombinantný myší TNF bol získaný od R&D systém Inc., (Minneapolis, MN). Bunky murínnych fibroblastov L929 (ATCC) boli kultivované v DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) doplnenom 10% fetálnvm sérom (Gemini, Catabasas, CA) , penicilínom (50 jedn./ml) a streptomycínom (50 jedn./ml) (Life Technologies) v zvlhčovanom inkubátore s 5% CO?.

Produkcia protilátok

Polyklonálne protilátky proti HMG1 B boxu boli vytvorené v králikoch (Cocalico Biologicals, Inc., Reamstown,

PA) a testované a titer „imunoblottingom. IgG boli purifikované

A agarózy podľa Anti-HMGl B box z anti-HMGl antiséra s použitím Proteín výrobcovho návodu (Píerce, Rockford, IL) protilátky boli afinitne purifikované a použitím kyanobromidom aktivovaných zrniek Sepharózy (Cocalico Biologiclas, In.).

Neimúnny králičí IgG bol získaný od spol. Sigma (St.Louis,

MO). Protilátky detekovali v inunotestoch HMG1 plnej dĺžky a B box, ale nereagovali krížovo s TNF, IL-1 a IL-6.

Značenie HMG1 pomocou Na-I¹^' a väzba na bunkový povrch

Puri f i kovaný proteín HMG1 (10 pg) bol rádioaktívne značený s 0,2 mCi beznosíčového ^1<5I (NEN Life Science prooucts Inc., Boston, MA) s použitím Todo-beads (Pierce, Rockford, IL) podlá výrobcovho návodu. ¹²⁵I-HMG1 proteín bol oddelený od nezreagovaného ¹²⁵I na kolóne pre gélovú chromatografiu (P6 Micro Bio-Spin- Chrmatography Columns, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) vopred ekvilibrované 300 mM chloridom sodným, 17,5 mM citrátom sodným, pH 7,0 a 0,1 %-ným bovinným sérum albumínom (BSA). Špecifická aktivita eiuovaného HMG1 bola okolo 2,8 x 10⁶ cpm/pg proteínu. Štúdie väzby k bunkovému povrchu boli uskutočnené ako je to skôr popísané (Yang et al., Am.J. Physiol. 275 c675-C683, 1998). Bunky RAW 264.7 boli nanesené na 24-jamkovej doštičke a rozrastané do kcnfluencie. Bunky boli dvakrát premyté ľadovo chladným PBS obsahujúcim 0,1% BSA a väzba bola uskutočňovaná pri 4°C počas 2 hodín s 0,5 ml väzobného pufru obsahujúceho 120 mM chlorid sodný, 1,2 mM síran horečnatý, 15 mM octan sodný, 5 mM chlorid draselný, lOmM Tris.HCI, pH 7,4, 0,2%BSA, 5mM glukózy a 25 000 cpm ¹²⁵I-HMG1. Na konci inkubácie boli odstránené supernatanty a bunky boli trikrát premyté ľadovo chladným P3S s 0,1% BSA a lýzované s 0,5 ml 0,5 N NaOH a 0,1% SDS počas 20 minút pri izbovej teplote. Rádiokativita v lyzáte bola potom meraná pomocou gama počítača. Špecifická väzba bola potom stanovená ako celková väzba mínus rádioaktivita získaná v prítomnosti prebytku neznačeného proteínu HMG1 alebo A boxu.

Pokusv na zvieratách

TNF ,, knock-out myši boli získané od spol. Amgen (Thcusand oaks, CA) a boli. na základe B6xl29. Vekovo odpovedajúce myši divokého typu B6xl29 boli v týchto štúdiách otužilé ako kontroly. Myši boli chované na University of Florida (Gainsville, FL) v domácom zverinci pre tr.ansgénne myši, bez špecifických pategénov; používané boli vo veku 6-8 týždňov.

Sarn.ci 6-8 týždenných myší Balb/c a C3H/Hej boli nakúpení v Harlan Sprague-Dawly (Indianapolis, IN) a nechané aklimatizované pred použitím v pokusoch 7 týždňov. Všetky zvieratá boli umiestnené v North Shore University Hospital Animal Facility pri štandartnej teplote a cykle svetla a tmy.

Cekálne podviazanie a punkcia

Cekálne podviazanie a punkcia (CLP) boli uskutočňované ako je to skôr popísané (Fink a Heard, u.Surg.Res.49: 186-196, 1990; Wichman et al., Crit.Care Med.26: 2078-2086, 1998; a Remick et al. Shock 4: 89-95, 1995). V stručnosti: Balb/c myši boli anestezované intramuskulárne 75 mg/kg ketamínu (Fort Dodge, Fort Dodge, Iowa) a 20 mg/kg xylazínu (Boehringer Igelheim, St.Josef, MO). Bola uskutočnená stredová íncízia a cékum bolo izolované. Podviazanie 6-0 prolénovým šitím bolo umiestnené v hladine 5, 0 mm od cekálneho vrcholu smerom od ileocekálnej chlopne.

Na podviazanom cekálnom výstupku potom bola uskutočnená jedna punkcia ihlou mierky 22, bez priamej extrúzie stolice. Cékum bolo potom umiestnené späť do svojej normálnej vnútrobrušnej polohy. Brucho bolo uzatvorené bežným 6-0 prolénovým šitím v dvoch vrstvách, peritoneum a fascia zvlášť, aby sa predišlo presakovaniu tekutiny. Všetky zvieratá boli resuscitované normálnym soľným roztokom podaným subkutánne pri 20 ml/kg telesnej hmotnosti. Všetky zvieratá boli resuscitované normálnym soľným roztokom podaným subkutánne pri 20 ml/kg telesnej hmotnosti. Každé zviera dostalo 30 minút po operácii subkutánnu injekciu imipénu (0,5 mg/myš)(?rimaxin, Merck & Co., Inc., West Point, PA) . Zvieratá sa potom, nechali zotaviť sa. Mortalita bola zaznamenávaná až do i tvždňa pr danej procedúre; prežívajúce zvieratá boli sledované počas 2 týždňoch, aby bolo zaručené, že nedošlo k žiadnej neskorej mortalite.

Myši senzitizované D-galaktozamínom

Model senzitizácie D-galaktozamínom bol publikované už skôr (Galanos et al·., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 59395943, 1997 ; Lehmann et al., J. Exp. Med, 165: 657-663, 1997). Myši boli injikova.né intraperitoneálne 20 mg D-galaktozamínHC1 (Sigma)/myš v (200 μΐ PBS) a 0,1 alebo 1 mg alebo HMG1 boxu alebo vektorového proteínu v (200 pl PBS). Mortalita bola zaznamenávaná denne až do 72 hodín po injekcii, prežívajúce zvieratá boli sledované po 2 týždňoch a neboli zaznamenané žiadne neskoré úmrtia z toxicity B boxu.

Kultúra slezinných baktérií

Štrnásť myší dostalo buď anti-HMGl protilátku (n = 7) alebo kontrolu (N=7) v 24 alebo 30 hodinách po CLP, ako je tu popísané, a boli utratené na nekropsiu. Slezinné baktérie boli získané ako je to popísané skôr (Villa et al., Endotoxín Res.4: 197-204, 1997). Sleziny boli vybrané a homogenizované v 2 ml PBS. Po serálnej dilúcii PBS boli homogenáty nanesené ako 0,15 ml alikvóty na sójové tryptické agarované platne (Difco, Detroit, MI) a CFU boli spočítané po inkubácii pri 37°C cez noc.

Štatistická analýza

Údaje sú prezentované ako priemer + SEM, pokiaľ nie je uvedené inak. Rozdiely medzi skupinami sú stanovené pomocou 2reťazcového Študentovho testu, jednosmernej ANO'/A nasledovanej testom nemenšieho významného rozdielu alebo 2-reťazcoveno Eisnerovho exaktného testu.

Príklad 2

Mapovanie HMG1 domén pódia podpory cytokínovej aktivity

HMG1 má dve poskladané DNA-väzobné domény (A a B box) a negatívne nabitú kyslú karboxylovú koncovú časť. Na objasnenie štruktúrneho základu HMG1 cytokínovej aktivity a na mapovanie domény zápalovej bielkoviny sme exprimovaii HMG1 plnej dlžný a skrátených foriem pomocou mutagenézy a prebrali bielkoviny podľa stimulačnej aktivity v kultúrach monocytov (Obr.l). Boli generované HMG1 plnej držky, mutant, ktorého C-koniec bol deletovaný, mutant obsahujúci B box a mutant obsahujúci len A box. Tieto mutanty ľudského HMG1 boli vytvorené polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím špecifických primerov, ako je to tu popísané a mutantné bielkoviny boli exprimované s použitím fúzneho génového systému s glutatión S-tranferázou (GST) (Pharmacia

Biotech, Piscataway,

NJ) v súlade s návodom výrobcu.

V srručnosti: DNA fragmenty pripravené PCR metódou boli spojené s GST fúznym vektorom a amplifikované v E.coli. Exprimované bielkoviny HMG1 a mutantov HMG1 boli potom izolované s použitím GST afinitnej kolóny.

Účinok mutantov na uvoľňovanie TNF z murínnych makrofágompodobných buniek RAW 264.7 (ATCC) bol sledovaný ako nasleduje. Bunky RAW 264.7 boli kultivované v RPMI 1640 médiu (Life Technologies, Grand Island, NY) doplnenom 102 fetálneho Dovinného séra (Gemíni, Catabasas, CA) , penicilínom a streptomycínom (Life Technologies). Pridávaný bol polymyxin 3 (Sigma, St.Louis, MO) na 100 jedn./ml na neutralizáciu akejkoľvek kontaminácie LPS. Bunky boli kultivované s 1 pg/ml proteínu HMG1 plnej dĺžky (divokého typu) a každého HMG1 mutantu v médiu Opti-MEM I počas 8 hodín a boli zobrané končiciované supernatanty (obsahujúce TNF, ktorý bol uvolnený z buniek) a TNF uvoľnený z buniek bol -meraný štandartným biooestom cytotoxicity s murínynmi fibroblastamr .2929 (ATCC) (Bianchi et al., hore)s najnižšou aetekovatelnou koncentráciou 30 pg/ml. Rekombinantý myší TNF bol získaný od R&D systém Inc., (Minneapolis, MN) a používaný v týchto pokusoch ako kontrola. Výsledky tejto štúdie sú ukázané na obr.l. Všetky údaje na obr.l sú prezentované ako priemer + SEM, pokial nie je uvedené inak. (N = 6 - 10).

Ako ukazuje obr.l, HMG1 divokého typu a HMG1 skrátený od karboxylového konca stimulujú významne uvoľňovanie TNF monocytovými kultúrami (murínnymi makrofágom-podobnými bunkami RÄW 264.7). Box B bol mocným aktivátorom uvoľňovania TNF monocytmi. Tento stimulačný účinok bol špecifický, pretože A box aktivoval uvoľňovanie TNF len slabo.

Príklad 3

Proteín HMG1 B boxu podporuje cytokínovú aktivitu spôsobom vykazujúcim závislosť na dávke.

Kvôli ďalšiemu skúmaniu účinku HMG1 B boxu na produkciu cytokínov boli rôzne množstvá HMG1 boxu hodnotené podľa účinkov na produkciu TNF, IL-ΙΒ a IL-6 v murínnych makrofágompodobných bunkách RAW 264.7. Bunky RAW 264.7 boli stimulované proteínom B boxu pri 0-10 pg/ml, ako je vyznačené v obr.2A-2C, po 8 hodinách. Boli zobraté kondiciované médiá a zmerané na hladiny TNF, IL-Ιβ a IL-6. Hladiny TNF boli merané ako je to tu popísané a hladiny IL-Ιβ a IL-6 boli merané s použitím súprav na hladiny TNF, IL-Ιβ a IL-6. Hladiny TNF boli merané ako tu popísané a hladiny IL-Ιβ a IL-6 boli merané s použitím súprav s enzýmom spojených imunosorpčných stanovení (ELISA) monocytov B boxom prebehla pretože TNE mRNA bola (R&D System Inc., Minneapolis, MN) a s N > 5 vo všetkých pokusoch. Výsledky týchto štúdií sú ukázané na obr.2A-2C.

Ako ukazuje obr.2A, uvoľňovanie TNE z RAK 264.7 buniee sa zvyšovalo so zvyšujúcim sa množstvom B boxu podaného k bunkám. Ako ukazuje ob.2B, pridanie ipg/ml alebo 10 ug/ml B ooxu videlo k zvýšeniu uvoľňovaniu ΙΕ-2β z RAW 2 64.7' buniek. Naviac, ako ukazuje obr.2c, uvoľňovanie IL-6 z RAW 264.7 buniek sa zvyšovalo so zvyšujúcim sa množstvom B boxu podaného k bunkám.

Skúmaná bola taktiež kinetika uvoľňovania B boxom indukovaného uvoľňovanie TNF. Uvoľňovanie TNF a expresia TNF mRNA boli merané v RAW 264.7 bunkách indukovaných polypeptidom E boxu alebo GST prídatným polypeptidom používaným len ako kontrola (vektor) (10 pg/mi) pre 0 a 48 hodín. Supernatanty boli analyzované na hladinu proteínu TNF biotestom L929 cytotcxicity (N = 3-5) ako je tu popísaný. Na meranie mRNA. boli bunky nanesené na 100 mm misky a opracované Opti-MEM I médiom obsahujúcim polypeptid B boxu alebo samotného vektora v časoch 0, 4, 8 alebo 24 hodín, ako je to vyznačené na obr.2D. Vzorka s vektorom samotným bola testovaná v časovom bode 4 hodín. Bunky boli zoškrabnuté z misky a pomocou RNAzol B metódy podľa návodu výrobcu (Tel-Test „B, Inc., Eriendswood, TX) ooia izolovaná celková RNA. TNF (287bp) bol meraný testom ochrany pred RNAzou (Ambion, Austin, TX) . Rovnaké nanášky a integrita RNA boli overované vyfarbením RNA vzorky na agarózoformaldehydovom géle etídium bromidom, Výsledky testu ochrany pred RNAzou sú ukázané v obr.2D. Ako ukazuje obr.2D, aktivácia na úrovni génovej transkripcie, významne zvýšená v monocytoch vystavených proteínu B boxu (Fig.2B). Expresia TNF mRNA bola najvyššia o štvrtej hodine a znižovala sa v hodinách 8 a 24. Proteín samotného vektora, kontrola (GST prídatnej sekvencie), nevykazoval žiaany účinok na expresiu TNF mRNA. Podobr.á štúdia bola uskutočnená s meraním TNF proteínu uvoľneného z RAW 264.7 buniek O, 4, 8 , 24, 32 alebo 48 hodín po pridaní B boxu alebo proteínu samotného vektora (GST prídatnej sekvencie) s použitím biotestu L92 9 cytotoxicity, ako je tu popísaný. V porovnaní s kontrolou (len médium) stimulovalo pôsobenie B boxu expresiu proteínu TNF (obr.2F), ale- pôsobenie proteínu samotného vektora nie (obr.2E). Údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé pokusy. Tieto údaje dohromady ukazujú, že doména B boxu HMG1 má cytokínovú aktivitu a je zodpovedná za cytokínstimulujúcu aktivitu HMG1 plnej dĺžky.

V súhrne: B box HMG1 stimuloval závislé na dávke uvoľňovanie TNF, IL-Ιβ a IL-6 z kultúr monocytov (Obr.2A-2C), v súlade so zápalovou aktivitou HMG1 plnej dĺžky (Andersson et al., J . Exp.Med.192:565-57 0, 2000). Naviac tieto štúdie ukazujú, že maximum uvoľňovania TNF nastalo do 8 hodín (obr.2F). Tento typ oneskoreného uvoľňovania TNF je podobný uvolňovaniu TNF indukovanému samotný MG1 a významne neskorší, ako kinetika TNF indukovaného LPS (Andersson et ai., hore).

Príklad 4

Prvých 20 aminokyselín MG1 B boxu stimuluje TNF aktivitu

TNF-stimulujúca aktivita HMG1 B boxu bola mapovaná ďalej. Táto štúdia bola uskutočnená ako nasleduje. Fragmenty B boxu boli generované s použitím techniky syntézy chránených peptidov, ako je ru popísaná. Generovaných bolo päť fragmentov HMG1 B boxu (zo SEKV.ID.Č.20) obsahujúcich aminokyseliny 1-20; 16-25, 30-49; 45-64 alebo 60-74, ako je to vyznačené na obr.3. Na P.AW 264.7 bunky sa pôsobilo B boxom (1 pg/ml) alebo syntetickými peptidovými fragmentárni B boxu (10 pg/ml), ako sú vyznačené na obr.3 a uvoľňovanie TNF do supernatantu bolo merané ako je tu popísané. Ukázané údaje sú priemer ý SEM (n=3 pokusy, každý uskutočnený v duplikátoch a overované s použitím troch rôznych šarží syntetických peptidov). Ako ukazuje obr.3, TNF-stimu1 u júca aktivita bola zachovaná v syntetickom peptide odpovedajúceho aminokyselinám 1-20 HMG1 B boxu so SEKV.I D.Č.2 C (fkdpnapkrlpsaffIŕcse SEKV.ID.Č.16) . TNF-st. i mu 1 ačná aktivita 1-20-méru bola menej silná ako v syntetickom B boxe pii.^y dĺžky (i-^-4-mér), alebo HMG1 plne] dĺžky, ale stimulačné účinky boli špecifické, pretože .syntetické 20-mér aminokyselinových fragmentov obsahujúce 16-25, 30-45; 45-64 alebo 60-74 aminokyseliny HMG1 B boxu neindukovali uvoľňovanie TNF. Tieto výsledky sú priamym dôkazom, že makrofágy stimulujúce aktivitu HMG B boxu prislúchajú špecifickej doméne prvých 20 aminokyselín HMG B boxu so SEKV.ID.Č.20, Tento fragment B boxu môže byť použitý rovnakým spôsobom ako polypeptid kódovaný B boxom plnej dĺžky, napr. na stimuláciu cytokínu podporujúceho zápal, alebo na liečbu stavov pacienta, charakterizovaných aktiváciou kaskády zápalových cytokínov.

Príklad 5

Proteín

HMG1

A boxu antagonizuje HMGl-indukovanú cytokínovú aktivitu spôsobom vykazujúcim koncentračnú zá vislosť

Slabí agonisti sú z definície antagonisti. Pretože MG1 A box ioa slabo indukuje produkciu TNF, akc> je ukázané na obr.l, bola hodnotená schopnosť HMG1 A boxu pôsobiť ako antagonista HMG1 aktivity. Táto štúdia bola uskutočnená ako nasleduje. Na sub-konfluentnej RAW 264.7 bunky v 24-jamových doštičkách sa pôsobilo HMG1 (1 pg/ml) a 0, 5, 10 alebo 25 pg/ml A boxu počas 16 hodín v Opti-MEM I médiu v prítomnosti polymyxínu (100 j edn./ml).

TNF stimulačná aktivita (testovaná s použitím biotestu L929 cytotoxicity, ako je tu popísaný), vo vzorke, ktorá nedostala žiadny A box, bola vyjadrená ako 100% a inhibícia A boxom bola vyjadrená ako percente so samotným HMG1. Výsledky účinku A boxu na uvoľňovanie TNF z buniek RAW 264.7 sú ukázané na obr.4A. Ako ukazuje obr.4A, A box v závislosti na dávke inhiboval HMG1 indukované uvoľňovanie TNF so zdanlivou EC50 približne 7,5 pg/ml. Údaje na obr.4A sú prezentované ako priemer +SD (n = 23 nezávislé pokusy).

Príklade

Proteín HMGI A boxu inhibuje cytokínovú aktivitu HMGI plnej cĺžky a HLG1 B boxu

Antagonizmus aktivity HMG1 plnej dĺžky A boxom HMGI alebo GST prídatným proteínom (kontrola, vektor) bol stanovený taktiež meraním TNF uvoľňovania Z RAW 264.7 makrofágových kultúr pri súčasnom pridaní A boxu s HMGI plnej dĺžky. RAW 264.7 makrofágové bunky (ATCC) boli naočkované dc 24 jamkových doštičiek a používané pri 90% kcnfluencii. Na bunky sa pôsobilo HMGF1 alebo A boxom ako je to vyznačené počas 16 hodín v Optimum T médiu (Life Technologies, Grand Island, NY) v prítomnosti polymyxínu B (100 jedn./ml, Sigma, St.Louis, MO) a supernatanty boli zbierané na meranie TNF (myší ELISA súpravy od R&D Sytem Inc., Minneapolis, MN) . TNF-indukčná aktivita bola vyjadrená ako percento aktivity dosiahnuté S HMG1 samotným. Výsledky týchto štúdií sú ukázané na obr.4B. Obrázok 4B je histogram účinku HMG1 samotného, A boxu samotného, kontroly vektoru samotného, HMG1 v kombinácii s A boxom a HMGi v kombinácii s vektorom. Ako ukazuje obr.4B, HMG1 A box významne zoslaboval TNF-stimuiačnej aktivity HMGI plnej dĺžky.

Príklad 7

HMGI A box proteín inhibuje HMGI cytokínovú aktivitu naviazaním

Kvôli určeniu, či HMGI A box pôsobí ako antagonista vytesnením MG1 z väzby, bol k makrofágovým kultúram pridaný ¹²⁵I-značený HMGI a väzba bola meraná po 2 hodinách pri 4 °C.

Väzobné testy s RAW 264.7 bunkami boli uskutočňované axo je tu popísané. Väzba ¹²⁵I-HMG1 bola meraná s RAW 264.7 bunkami nanesenými na 24-jamkové doštičky v časoch vyznačených na obr.5A. Špecifická väzba sa rovná celkovému s bunkami asociovanému ^Κ5Ι-ΗΜΘ1 (CPM/jamku) mínus s. bunkami asociovanej rádioaktivite CPM/jamku v prízemnosti 5000 násobnéno molárnehe prebytku neznačeného HMG1. Obr.5A je graf väzby ’^I-HMGl v čase. Ako ukazuje obr.5A, HMG1 vykazoval saturačnú väzoonú kinetiku prvého rádu. Špecificita väzby bola zisťovaná ako je to popísané v Príklade 1.

Naviac: Väzba ¹²⁵I-HMG1 bola meraná s RAW 264.7 bunkami nanesenými na 24-jamovej doštičke a inkubovanými s ^;^I-HMG1 samotným alebo v prítomnosti neznačeného HMG1 A boxu. Výsledky tohto väzobného testu sú ukázané v obr.SB. Údaje predstavujú priemer +SEM z troch nezávislých pokusov. Obr.5B je histogram väzby ^UoI-HMGi k bunkovému povrchu v neprítomnosti neznačeného HMGBÍ alebo HMGBÍ (HMG1) A boxu, alebo v prítomnosti 5000 násobného molárneho prebytku neznačeného HMGB1 alebo HMGBÍ A boxu, merané ako percento celkových CPM/jamku. „Celková hodnota sa rovná impulzom za minútu (CPM/jamku) s bunkami asociovaného ¹²³I-HMG1 v neprítomnosti neznačeného HMGBÍ alebo A boxu po 2 hodinách pri 4°C. „HMGBÍ alebo „A box sa rovná impulzom CPM/jamku s bunkami asociovaného ⁱ²⁵I-HMGl v prítomnosti 5000 násobného molárneho prebytku neznačeného MGB1 alebo A boxu. Údaje sú vyjadrené ako percento celkových impulzov získaných v neprítomnosti neznačených HMGBÍ bielkovín (2 382 179 CPM/jamku) . Tieto výsledky ukazujú, že HMG1 A box je kompetitívnym antagonistom HMG1 aktivity in vitro, ktorý inhibuje TNF-stimulačnú aktivitu HMG1.

Príklad 8

Inhibícia cytokínovej aktivity HMG1 plnej dĺžky a HMG J B boxu polyklonáinymi protilátkami proti B boxu

Zistená bola taktiež schopnosť protilátok cielených proti HMG1 B boxu modulovať účinok HMG1 plnej dĺžky alebo HMGl B boxu. Afinitne purifikovaná protilátky cielené proti HMGl B boxu (protilátky K B boxu} boli generované ako je to popísané a s použitím štandartných techník. Na . testovanie účinku protilátok na uvolňovanie TNF z RAW 264.7 buniek indukovaných HMGl alebo HMG1 B boxom sa na subkonfiuentný RAW 264.^-7 bunky v 24-jamkových doštičkách pôsobilo HMGl (1 pg/ml) alebo HMGl B boxom (10 pg/ml) počas 10 hodín s alebo bez protilátok proti. B boxu (25 pg/ml alebo 100 pg/ml afinitne pur i f i kovaných s antigénom, Cocalico Biologícals, Inc., Reamstown, PA) alebo s pridaným neimúnnym ľgG (25pg/ml alebo 100 pg/ml; Sigma). Uvolňovanie TNF v buniek RAW 264.7 bolo merané s použitím biotestu L292 cytotoxicity, ako je tu popísaný. Výsledky tejto štúdie sú ukázané na obr.6, ktorá je histogramom TNF uvoľneného z buniek RAW 264.7 bez ďalšieho podania, s podaním 1 pg/ml HMGl, Ιμσ/ml HMGl plus 25 pg/ml protilátok proti B boxu, 1 pg/ml HMGl plus 25 pg/ml IgG (kontrola), 10 pg/ml B boxu, 10 pg/ml B boxu plus 100 pg/ml protilátok proti B boxu, alebo 10 pg/ml B boxu plus 100 pg/ml IgG (kontrola). Množstvo

TNF uvoľneného z buniek indukovaných HMG1 samotným (bez pridania protilátok k B boxu) bolo brané ako 100%, údaje uvedené na obr.6 sú výsledky z troch nezávislých pokusov. Ako ukazuje obr. 6, afinitne punfikované protilátky cielené proti HMG1 B boxu významne inhibovali uvoľňovanie TNF indukované buď HMG1 plnej dĺžky alebo HMGl B boxom. Tieto výsledky ukazujú, že na moduláciu funkcie HMG1 je možné použiť protilátku.

Príklad 9

Proteín B boxu HMG1 je toxický pre Balb/c myši senzitivované D-ga la ktosamínorn

Na skúmanie, či HMG1 B box má cytokinovú aktivitu m vitro sme podávali proteín HMG1 B boxu neanestetizovaným Balb/c myšiam senzitizovaným D-galaktosamínom (D-gal), v modeli, který je široko používaný na štúdium toxicity cytokínov 'Galanos et al., zhora). V stručnosti: Myši (20 - 25 g, samou, Harlan Sprague-Dawly, Indianopolis, In) dostali intraperi toneálnu injekciu D-gal (20 mg) (Sigma) a B boxu (0,1 mg/ml/myš alebo 1 mg/ml/myš alebo bielkoviny GST (vektor, 0,1 mg/ml/myš alebo 1 mg/ml/myš), ako je vyznačené v tabuľke 1. Prežívanie myší bolo monitorované až do i dní na presvedčenie sa, že nedochádza k neskorým úmrtiam. Výsledky tejto štúdie sú uvedené v tabuľke 1 .

Tabuľka 1: Toxicita B boxu HMG1 pre Balb/c myši senzitizované D-galaktosamínom

	Pôsobenie	živých/celkových
Kontrola	-	10/10
Vektor	0,1 mg/myš	2/2
	1 mg/myš	3/3
B box	0,1 mg/myš	6/6
	1 mg/myš	2/8*

* p <0,01 proti vektoru samotnému, ako je testované Fisherovým exaktným testom

Výsledky tejto štúdie ukázali., že HMG1 B box je letálny pre myši senzitizované D-galaktozamínom spôsobom vykazujúcim závislosť na dávke. Vo všetkých prípadoch kedy nastalo úmrtie, nastalo v priebehu 12 hodín. Letalita nebola pozorovaná s porovnateľnými preparátmi purifikovaného vektorového proteínu GST bez B boxu.

Príklad 10

Histológia Balb/c myší senzitizovaných D-galaktozamínom alebo C3H/Hej myší po podaní proteínu HMG1 3 boxu

Kvôli zisťovaniu letality proteínu HMGl B boxu in vivo bol HMGl· B box znovu podávaný Balb/c myšiam senzitizovaným Dgalaktczamínom. Myši (3 na skupinu) dostali D-gal ('2 0 mq/myš) plus B box alebo vektor (1 mg/myš) intraperitoneálne na 7 hodín a potom boli utratené dekapitáciou. Bola odobraná krv a vybraté a 10%-formeldehydom fixované orgány ŕpečeň, srdce, obličky a pľúca). Tkanivové rezy boli na histologické hodnotenie pripravené hematoxylínovým a eozínovým farbením (Criterion Inc., Vancouver, Canada). Výsledky týchto štúdií sú ukázané na obr.7A-7J, čo sú skenované obrazy hematoxylínom

a eozínoi	r farbených	rezov obličiek	(obr.7A	.) , myokardu
(obr.7C)	, pľúc (obr.7E)	a pečene (obr.7G	a 71)	získaných zo
zvierat	bez pôsobenia	a rezu obličiek	(obr.7	B), myokardu
(obr.7 D)	, pľúc (obr.7F)	a pečene (obr.7H	a 7J)	získaných zo
zvierat	po pôsobení HMGl B boxu. V porovnaní	s kontrolnými
myšami,	pôsobenie B boxu nespôsobovalo	žiadne	abnormality
v pečeni	(obr.7A a 7B)	a plúcach (obr.7E	a 7F)	Tieto myši

mali určité ischemické zmeny a stratu krížovej striace v srdci vo vláknach myokardu (obr.7C a 7D, ak je to vyzančené šípkou na obr.7D). Pečeň vykazovala väčšinu poškodení B boxom, ako ilustruje aktívna hepatitída (obr.7G-7J). Na obr.7j je vidieť odpadnuté heptocyty obklopené nahromadenými polymorfojadrovými leukocytami. Šípka na obr.7J mieri na miesta poylmorfojadrového hromadenia (bodkované) a apoptických hepatocytov (plnou čiarou). Podávanie HMGl B boxu in vivo taktiež významne stimulovalo zvýšené sérové hladiny IL-6 (315 + 93 vs.20 + 7 pg/ml, B box vs kontrola p<0,05).

Podávanie proteínu HMGl B boxu myšiam CÔH/Hej ’ ktoré nemajú odozvu na endotoxín) bolo taktiež letálne, č.o ukazuje, že HMGl B box je letálny v neprítomnosti LPS signálnej transdukcie. Hematoxylínom a eozínom farbené rezy tkanív plúc a obličiek odobraných 8 hodín po podaní B boxu neodhaiujú žiadne abnormálne morfologické zmeny. Prehliadka rezov zo srdca však odhaľuje dôkazy ischémie so stratou krížovej striace spojenej s amorfnou ružovou cytoplazmou vo vláknach myokardu. Rezy z pečene ukázali mierne akútne zápalové odozvy, s trochou odpadnutých hepatocytov a apoptózy a jednotlivými polymorfojadrovými leukocytmi. Tieto špeciofické morfologické zmeny boli porovnateľné so zmenami po podaní HMG1 plnej dĺžky a potvrdili, že B box samotný môže rekapitulovať letálnu patologickú odozvu na HMG1 in vivo.

K zisteniu, či TNF-stimulujúca aktivita HMG1 prispieva ku sprotredkovaniu letality B boxu, sme merali letalitu u myší s TNF „knock-out (TNF-KO, Nowak et al., Am.J.Physiol.Reg.Integr.Comp.Physiol.278: R1202-R1209, 2000) a kontrol divoké typu (kmeň B6xl29) senzitizovaných Dqalaktozamínom (20 mg/myš) a vystavených B boxu (1 mg/myš, intraperitoneálne) . B box bol vysoko letálny pre myši divokého typu (6 úmrtí z 9 vystavených), ale letalita nebola pozorovaná pri TNF-KO myší, na ktoré sa pôsobilo B boxom (0 úmrtí z 9 vystavených, p<0,05 proti divokému typu). Dokopy s údajmi z kultúr makrofágov RAW 254.7, tu popísanými, tieto údaje potom ukazujú, že B boxu HMG1 je priradená TNF-stimulujúca cytkínová aktivita.

Príklad 11

Hladina proteínu HMG1 je zvýšená u septických myší

Kvôli skúmaniu úlohy HMG1 počas sepsy sme spôsobili sepsu myšiam a merali sérový HMG1 s použitím kvantitatívneho imunot.estu popísaného skôr (Wang et al., Hore). Myši boli podrobené cekálnemu podviazaniu charakterizovanému modelu sepsy a punkci (CLP), dobre spôsobenej perforáciou a chirurgicky vytvorenému cekálnemu diveriikulu, ktoré vedie k polymikrobiálnej peritonitíde a sepse (Fink a Heard, hore; Wichman et al·., hore; a Remick et all., hore). Potom boli merar.é hladiny HMG1 v sére (Wang et al., hore). Obrázok 8 ukazuje výsledky tejto štúdie v grafe, ktorý ilustruje hladiny HMG1 u myší 0 hodín, 8, 18, 24, 15 a 72- hodín po podrobení CLP. Ako ukazuje obr. 8, sérové hladiny HMG1 neboli významne zvýšené po prvých 8 hodinách po cekálnej perforácii, potom sa významne zvýšili po 18 hodinách (obr.8). Zvýšený sérový HMG1 zostal na hladine zvýšeného plató po prinajmenšom 72 hodín po CLP, kinetický profil je dosť podobný skôr popísanej oneskorenej kinetike HMG1 u endotoxémie (Wang et al., hore). Tento časový priebeh uvoľňovania HMG1 verne odpovedá vývoju známok sepsy v daných myšiach. V priebehu prvých ôsmych hodín po cekálnej perforácii boli zvieratá mierne choré, so zníženými aktivitami a stratou vyhladávacieho chovania. Počas nasledujúcich 18 hodín sa stali zvieratá ťažko chorými, chúlili sa so zježenou srsťou v skupinách, nevyhľadávali vodu alebo potravu a stávali sa len minimálne reagujúcimi k vonkajším podnetom alebo k prehliadke ošetrovateľom.

Príklad 12

Liečba septických myší proteínom HMG1 A boxu zvyšuje prežitie myší

Kvôli určeniu, či HMG1 A box môže inhibovať letalitu HMG1 v priebehu sepsy, boli myši podrobené cekálnej preforácii a liečené podávaním A boxu začínajúc 24 hodinou po nástupe sepsy. CLP sa usktočnilo na samcoch Balb/v myší ako je tu popísané. Zvieratá boli náhodne dané do skupín s 15-25 myšami. HMG1 A box (zakaždým 60 alebo 600 ug/myš) alebo vektor (prídatný GST, 600 μα/myš) samotný boli podávané Intraperitoneálne dvakrát za deň po tri dni, začínajúc 24 hodín po CLP. Prežívanie bolo monitorované dvakrát za deň) až 2 týždne kvôli presvedčeniu sa, že nedochádza k neskorým úmrtiam. Výskedky tejto štúdie sú ilustrované na obr.9, čo je graf účinku vektora (GST; kontrola) 60 ug/myš alebo 600 ug/myš na prežívanie v priebehu času (*P<0,03 vs. kontrola, ako bolo testovné Fisherovým exaktným testom). Ako ukazuje obr.9, podávanie HMGÍ A boxu významne chránilo myši pred lctálnymi účinkami sepsy a zlepšovalo prežívame z 28% u zvierat, na ktoré sa pôsobilo bielkovinou purifikovanou z vektorovej bielkoviny (GST) bez A boxu, na 68% u zvierat, ktoré dostali A box (P<0,03 podlá Fisherovho exaktného testu). Ocnratné účinky HMGÍ A boxu v tejto modelovej sepse boli závislé na dávke A boxu; u zvierat, na ktoré sa pôsobilo 600 ug/myš A boxu bolo pozorované, že sú významne čulejšie, aktívnejšie a že sa im viac vracia žravé chovanie v porovnaní s kontrolou, na ktorú sa pôsobilo preparátmi odvodenými z vektora, tak so zvieratami, na ktoré sa pôsobilo len 60 pg/myš A boxu. Posledné spomínané zvieratá zostávali ťažko choré, s potlačenou aktivitou a kŕmením sa počas niekoľko dní a väčšina zomrela.

Príklad 13

Pôsobenie anti-HMGl protilátkou na septické zvieratá zvyšuje prežívanie myší

Pasívna imunizácia kriticky chorých septických myší an.tiHMG1 protilátkami bola taktiež hodnotená. V tejto štúdii boli samci Balb/c myší (20-25 gramov) podrobené CLP, ako je tu popísané. Afinitne purifikovaná polyklonálna protilátka proti HMGÍ B boxu alebo králičie IgG (ako kontrola) boli podávané v 600 pg/myš začínajúc 24 hodín po chirurgickom zákroku a dvakrát denne počas 3 dní. Prežívanie bolo monitorované počas 2 týždňov. Výsledky tejto štúdie sú ukázané na obr.lOA, čo je graf prežívania septických myší, na ktoré sa pôsobilo buď kontrolnou protilátkou, alebo anti-HMGl protilátkou. Výsledky ukazujú, že anti-HMGl protilátky podávané myšiam 24 hodín po nástupu cekálnej perforácie významne chráni zvieratá pred úmrtím v porovnaní s podávaním neimúnnych protilátok (p<0,02 podľa Fisherovho exaktného testu). V priebehu 12 hodín po podaní anti-HMGl protilátok vykazovali zvieratá, na ktoré sa pôsobilo, zvýšenú aktivitu a reaktívnosť v porovnaní s kontrolami, ktoré dotali neimúnne protilátky. Zatiaľ čo zvieratá, na ktoré sa pôsobilo neimúnnymi protilátkami sa ďalej chúlili, zle udržiavali a zostávali neaktívne, liečené zvieratá sa významne zlepšili a v priebehu 48 hodín sa vrátili k žravému chovaniu. V tomto modeli anti-HMGl protilátky nepotlačovali bakteriálnu proliferáciu, pretože sme pozorovali porovnateľné počty baktérií (CFU, jednotky tvorby kolónii za aeróbnych podmienok) zo slezín 31 hodín po CLP u liečených zvierat v porovnaní so zvieratami, ktoré dostali irelevantné protilátky (kontrolné počty baktérií = 3,5 + 0,9 x 10⁴ CFU/g; n = 7). Zvieratá boli monitorované počas 2 týždňov potom a neskoré úmrtia neboli pozorované, čo ukazuje, že pôsobením anti-HMGl došlo k úplnej záchrane pre letálnou sepsou, a nie iba oddialenie úmrtí.

Pokiaľ vieme, žiadne špecifické, k cytokínom smerované terapeutikum nie je tak účinné pri podávní tak neskoro po nástupe sepsy. Pre porovnanie: Podávanie anti-TNF protilátok v skutočnosti zvyšovalo v tomto modeli mortalitu a anti-MIF protilátky boli neúčinné, keď sa podávalo viac ako 8 hodín po cekálnej perforácii (Remick et al., hore a Calandra et al, Náture Med, 6: 164-170, 2000) . Tieto údaje dokazujú, že na záchranu letálnych prípadov rozvinutej sepsy je možné zacieliť HMG1 tak neskoro, ako je 24 hodín po cekálnej perforácii.

V inom príklade záchrany endotoxemických myší s použitím anti-B protilátok, boli protilátky proti HMG1 B boxu hodnotené na schopnosť zachraňovať LPS-indukované septické myši. Na samcov Balb/c myší (20-25 gramov, 26 na skupinu) sa pôsobilo LD75 dávkou LPS (15 mg/kg) injikovanou intraperitoneálne (IP). Anti-HMGl B box alebo neimúnne králičie sérum (0,3 ml na myš zakaždým, IP) boli podávané v čase 0, +12 hodín a +24 hodín po podaní LPS. Bolo hodnotené prežívanie myší v čase. Výsieoky tejto štúdie sú ukázané na obr.lOB, čo je graf prežívar.ia septických myší, ktorým sa podávali anti-HMGl B- box protiláky alebo neimúnne sérum. Ako je ukázané na obr.lOB, anti-HMGi B box protilátky zlepšovali prežitie septických myší.

Príklad 14

Inhibícia HMG1 signálnej dráhy s použitím anti-RAGE protilátok

Predchádzajúce údaje implikovala RAGE ako HMGI receptor, ktorý môže sprostredkovať odrastanie neuritcv v priebehu vývoja mozgu a migrácie buniek hladkého svalu počas hojenia rán (Horí et al., J.Biol.Chem.270: 25752 - 25761, 1995; Merenmie.s et al. , J. Biol.Chem.266: 16722 - 16729, 1991; a Degryse et al., J. Celí Biol. 152: 1197 - 1206, 2001). Merali sme uvoľňovanie TNF v kultúrach RAW 264.7 stimulovaných HMGi (1 pg/ml), LPS (0,1 pg/ml), alebo HMG1 B boxom (1 pg/'ml) v prítomnosti anti-RAGE protilátky (25 pg/ml) alebo neimúnnych IgG (25 pg/ml). V stručnosti: Bunky boli naočkované do 24jamkových doštičiek a používané pri 90% konfluencii. LPS (E.colli 0111:B4, Sigma S.Louis, MO) bol sonikovaný 20 min pred použitím. Na bunky sa pôsobilo HMGI (1 pg/ml), LPS (0,1 gg/ml), alebo HG1 B boxom (1 pg/ml) v prítomnosti anti-RAGE protilátky (25 pg/ml) alebo neimúnnych IgG (25 gg/ml). V stručnosti: Bunky boli naočkované do 24-jamkových doštičiek a používané pri 90% konfluencii. LPA {E.colli 0111:BA, Sigma St.Luois, MO) bol sonikovaný 20 minút pre použitím. Na bunky sa pôsobilo HMGI (1 pg/ml), LPS (0,1 pg/mli, alebo HMGI B boxom (1 pg/ml) v prítomnosti anti-RAGE protilátky (25 pg/ml) alebo neimúnnych ígG (25 pg/ml) ako je to vyznačené na obr.llA počas 16 hodín v bezsérovom médiu Opti.MEM I (Life Technologies) a supernatanty boli odobrané na meranie TNF s použitím biotestu L929 cytotoxicity, ako je :u popísaný. IgG čistená polykionálnou anti-RAGE protilátkou ( kat.čí s.sc-8230, N-16, Santa Cruz Biotech, Inc., Santa Cruz, CA) bola pred použitím extenzívne dialyzovaná proti PBS. Výsledky tejto štúdie sú ukázané na obr.llA, čo je histogram účinku HMG1, LPS alebo HMG1 B boxu v prítomnosti anti-RAGE protilátok alebo neimúnnych IgG (kontrola) na uvoľňovanie TNF z buniek RAW 264.⁷. Ako ukazuje obr.llA, v porovnaní s neimúnnym IgG inhibovala anti-RAGE protilátka významne uvoľňovanie TNF indukovanej HMG1 B boxom. Toto potlačenie bolo špecifické, pretože anti-RAGE neinhibovala významne uvoľňovanie TNF stimulovanej LPS: Za poznamenanie stojí, že najvyšší inhibičný účinok anti-RAGE znižoval HMG1 signalizáciu o 401, č napovedá, že v HMG1 signalizácii môžu participovať iné dráhy transdukcie signálu.

Na skúmanie účinkov HMG1 alebo HMG1 B boxu NF-kBdependentnom ELAM promótore boli usktutočňované nasledujúce pokusy: Makrofägy RAW 264.7 boli transietne kontransekované plazmidom expresie kódujúcim myší MyD 88 dominantne negatívny (DN) mutant (ktorý odpovedá aminokyselinám 146-296) alebo prázdnym vektorom, plus luciferázovým reportérovým plazmidom pod kontrolou NF-kB-dependentého ELAM promótora, ako je to popísané Meanem et al. , (J.Immunol. 166: 4074-4082, 2001). Časť buniek bola stimulovaná po 5 hodinách HMG1 plnej dĺžky (100 ng/ml), alebo purifikovaným HMG1 B boxom (1C pg/ml). Bunky boli potom zozbierané a meraná luciferázová aktivita s použitím štandartných metód. Všetky transfekcie boli uskutočňované v triplikátoch opakovane aspoň trikrát a jednotlivý reprezentatívny pokus je ukázaný na obr.líB. Ako ukazuje obr.113, HMG1 stimuloval luciferázová aktivitu vo vzorcoch, ktoré neboli kotransfekované MyD 88 dominantne negatívnym a hladina stimulácie bola znížená vo vzorcoch, ktoré boli kotransfekované MyD 88 dominantne negatívnym. Tento účinok bol pozorovaný taktiež vo vzorcoch, ktorým bol podaný HMG B box.

Taktiež bol· skúmaný účinok HMG1 alebo HMG1 B boxu na NF-kB aktivácii. Reportérové bunkové línie CHO, ktoré konštitutívne exprimovali ludský Toll-podobný receptor 2 (TLR2) alebo Tollpodobný receptor 4 (TLR, boli skôr popísané (Means et al., J.Immunology 163: 3920-3927, 1999). Tieto reportérové línie obsahujú taktiež stabilne transekovaný ELAM-CD25 reportérový gén a exprimujú na svoj povrch CD25 ako dôsledok NF-kB aktivácie. Bunky CHO/TLR2 a CHO/TLR4 boli stimulované počas 18 hodín IL-l (10 ng/mi), purifikovaným HMGi plnej dĺžky (100 ng/ml) alebo purifikovaným B boxom (10 pg/ml). Následne po stimulácii boli bunky farbené PE-značenou anti-CD25 monoklonálnou protilátkou a expresia CD25 na povrch bola meraná prietokovou cytometriou. Výsledky tejto štúdie sú ukázané na obr.llC. Údaje sú vyjadrené ako pomer (násobok aktivácie) percent CD25⁺ buniek a stimulovaných bunkových populáciách, vylúčení najnižších 5% buniek na základe strednej FL1 flourescencie. V bunkách CHO/TLR4 stimulácia ako HMGI, tak HMGI B boxom viedla ku zníženej expresii CD25 v porovnaní so vzorkami CHO/TLR2.

Stanovený bol taktiež účinok anti-RAGE protilátok a kombinácie anti-RAGE protilátok a ant.i-TLR2 protilátok alebo IgG na HMG-l-sprostredkované uvolňovanie TNF z RAW 264.7 buniek. Bunky RAW 264.7 boli naočkované do 24-jamkových doštičiek a používané pri 90% konfluencii. Bunky boli počas 16 hodín inkubované s HMG-1 a s alebo bez anti-RAGE protilátky (kat.čís.sc-8230, Santa Cruz Biotech, Inc., Santa Cruz, CA) , anti-TLR2 protilátky (afinitne purifikované polyklonálne protilátky, (kat.čís. sc-12504, D17, Santa Cruz) alebo IgG (neimún.ne IgG, Sigma St.Louis, MO) v médiu Optimum I (Life Technologies, Grand Island, NY) v prítomnosti plymyxínu B (100 jedn./ml, Sigma, St.Louis, MO). Boli zobraté kondiciovné médiá v nestimulovaných ktoré prešli pri a uskutočnená TNF ELISA s použitím štandartných ELISA metód. Údaje (n = 3) sú vyjadrené ako percento aktivity dosiahnuté so samotným HMG-1. Výsledky tejto štúdie sú ukázané r.a obr.llD. Ako anti-RAGE, tak anti-TLR-2 protilátky inhibovali významne (p < 0,05) HMG-I sprostredkované uvoľňovanie TNF. Kombinácia dvoch prouilátok mala aditívny účinok v inhibícii uvoľňovania TNF, zatiaľ čo IgG boli irelevantné.

I keď tento vynález bol konkrétne predvedený a popísaný s odkazmi na svoje vyhotovenia, osoby zbehlé v odbore pochopia, že možno uskutočňovať rôzne zmeny vo forme a detailoch bez vzdialenia sa rozsahu vynálezu zahrnutého v pripojených nárokoch.

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypetid obsahujúci A box stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo prirodzene sa nevyskytujúci HMG A box, ktorý môže i-nhibovať uvoľňovanie cytokínu podporujúceho zápal zo stavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí proteínom skupiny s vysokou mobilitou (HMG). '
2. 2. Polypeptid, pričom polypeptidom je biologicky aktívny fragment A boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo biologicky aktívny fragment prirodzene sa nevyskytujúceho HMG A boxu, ktorý môže inhibovat uvoľňovanie cytokínu podporujúceho zápal zo stavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí proteínom skupiny s vysokou mobilitou (HMG).
3. 3. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polypeptid obsahujúci A box stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo prirodzene sa nevyskytujúci HMG A box, ktorý môže inhibovat uvoľňovanie cytokínu podporujúcho zápal zo stavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí proteínom skupiny s vysokou mobilitou (HMG) vo farmaceutický prijateľnom excipiente.
4. 4. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polypeptid, pričom polypetidom je biologicky aktívny fragment A boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo biologicky aktívny fragment prirodzene sa nevyskytujúceho HMG A boxu, ktorý môže inhibovat' uvoľňovanie cytokínu podporujúceho zápal zo stavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí proteínom skupiny s vysokou mobilitou (HMG) vo farmceuticky prijateľnom excipiente.
5. 5. Purifikovaný preparát protilátok, vyznačujúci sa tým, že sa špecificky viažu k B boxu stavovcového proteínu skupiny s vyscxou mobilitou (HMG), ale neviažu sa špecificky k r.on-B box epitopom HMG, pričom tieto inbibovať uvoľňovanie cytokínu protilátky môžu podporujúceho zápal zo stavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí proteínom skupiny s vysokou mobilitou (HMG)
6. 6. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, ze obsahuje purifikovaný preparát protilátok, ktoré sa špecificky viažu k B boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG), ale neviažu sa k non-B box epitopom HMG, vo farmaceutický excipiente, pričom tieto špecificky prijateľnom inhibovať protilátky môžu uvoľňovanie cytokínu podporujúcho zápal zo stavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí proteínom skupiny s vysokou mobilitou (HMG).
7. 7. Polypeptid obsahujúci B box stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo prirodzene sa nevyskytujúci HMG B box, ale neobsahujúci dĺžky, pričom tento polypeptid môže uvoľňovanie cytokínu podporujúceho zápal zo bunky.

   HMG plnej spôsobovať stavovcovej
8. 8. Polypeptid, pričom polypeptidom je biologicky aktívny fragment B boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG; alebo biologicky aktívny fragmenr prirodzene sa nevyskytujúcho HMG B boxu.
9. 9. Vektor, vyznačujúci sa tým, že kóduje polypeptid obsahujúci B box stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo prirodzene sa nevyskytujúci HMG B box, ale neobsahujúci HMG plnej dĺžky, pričom tento polypeptid môže spôsobovať uvoľňovanie cytokinu podporujúceho zápal zo stavovcovej bunky.
10. 10. Vektor, vyznačujúci sa tým, že kóduje polypeptid, pričom polypeptidom je biologicky aktívny fragment B boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo biologicky aktívny fragment prirodzene sa

    nevyskytujúcho HMG B boxu a tento polypeptid môže spôsobovať uvoľňovanie cytokinu podporujúceho zápal zo stavovcovej bunky. 11. Spôsob inhibície uvoľňovania cytokinu podporujúceho

    zápal z cicavčej bunky, vyzančujúci sa tým, že zahŕňa pôsobenie na bunku určitým množstvom purifikovaného preparátu protilátok, ktoré sa špecificky viažu k B boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG), ale neviažu sa špecificky k non-B box epitopom HMG.
11. 12. Spôsob inhibície uvoľňovania cytokinu podporujúceho zápal z cicavčej bunky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa pôsobenie na bunku polypeptidom obsahujúcim A box stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo prirodzene sa nevyskytujúci HMG A box, ktorý môže inhibovať uvoľňovanie cytokinu podporujúceho zápal zo stavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí proteínom skupiny s vysokou mobilitou (HMG), v množstve dostatočnom na inhibíciu uvoľňovania cytokinu podporujúceho zápal z bunky.
12. 13. Spôsob inhibície uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z cicavčej bunky, vyzančujúci sa tým, že zahŕňa pôsobenie na bunku polypeptidom, pričom týmro polypeptidom je biologicky aktívny fragment A boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou íHMG >

    alebo biologicky aktívny nevyskytujúceho HMG A boxu, uvoľňovanie cytokínu podporujúceho zápal zo stavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí proteínom skupiny s vysokou mobilitou (HMG), v množstve dostatočnom na inhibíciu uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z bunky.

    fragment prirodzene sa ktorý môže inhibovať
13. 14. Spôsob liečby stavu pacienta charakterizovaného aktiváciou kaskády zápalových cytokínov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie purifikovaného preparátu protilátok, ktoré sa špecificky viažu k B boxu stavcvcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG), ale neviažu sa špecificky k non-B box epitopom HMG, pacientovi v množstve dostatočnom na inhibíciu kaskády zápalových cytokínov.
14. 15. Spôsob liečby stavu pacienta charakterizovaného aktiváciou kaskády zápalových cytokínov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie polypeptidu obsahujúceho A box stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo prirodzene sa nevyskytujúceho HMG A boxu, ktorý môže inhibovať uvoľňovanie cytokínu podporujúceho zápal zo stavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí proteínom skupiny s vysokou mobilitou (HMG), pacientovi v množstve dostatočnom na inhibíciu uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z bunky.
15. 16. Spôsob liečby stavu pacienta charakterizovaného aktiváciou kaskády zápalových cytokínov, vyznačujúci sa tým, ze zahŕňa podávanie polypeptidu, pričom týmto polypeptidom je biologicky aktívny fragment A boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou :hmg;

    fragment prirodzene sa ktorý môže inhibovať alebo biologicky aktívny nevyskytujúcho HMG A boxu, uvoľňovanie cytokínu podporujúceho zápal zo stavovcovej bunky, na ktorú sa pôsobí proteínom skupiny s vysokou mobilitou (HMG), pacientovi v množstve dostatočnom na inhibiciu uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z bunky.
16. 17. Spôsob stimulácie uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z bunky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa pôsobenie na bunku polypeptidom obsahujúcim E box proteínu stavovcového HMG) alebo skupiny s vysokou mobilitou prirodzene sa nevyskytujúci HMG 3 box, ale neobsahujúcim HMG plnej dĺžky, v množstve dostatočnom na stimuláciu uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z bunky.
17. 18. Spôsob stimulácie uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z bunky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa pôsobenie na bunku polypeptidom, pričom týmto polypeptidom je biologicky aktívny fragment B boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo biologicky aktívny fragment prirodzene sa nevyskytujúceho HMG B boxu, v množstve dostatočnom na stimuláciu uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z bunky.
18. 19. Spôsob stimulácie uvoľňovania cytokínu podporujúceho zápal z bunky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa pôsobenie na bunku vektorom kódujúcim polypeptid obsahujúci B box stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo prirodzene sa nevyskytujúci HMG B box, ale neobsahujúci HMG plnej dĺžky, v množstve dostatočnom na stimuláciu uvoľňovania cytokinu podporujúceho zápal z bunky.
19. 20. Spôsob stimulácie uvoľňovania cytokinu podporujúceho zápal z bunky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa pôsobenie na bunku vektorom kódujúcim polypeptid, pričom týmto polypeptidom je biologicky aktívny fragment B ooxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo biologicky aktívny frament prirodzene sa nevyskytujúcho HMG boxu, v množstve dostatočnom na stimuláciu uvoľňovania cytokinu podporujúcho zápal z bunky.
20. 21. Spôsob ovplyvnenia straty telesnej hmotnosti alebo liečby obezity pacienta, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie účinného množstva polypeptidu obsahujúceho B box stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo prirodzene sa nevyskytujúceho HMG B boxu, ale neobsahujúceho HMG plnej dĺžky, pacientovi v množstve dostatočnom na stimuláciu uvoľňovania cytokinu podporujúceho zápal z bunky.
21. 22. Spôsob ovplyvnenia straty telesnej hmotnosti alebo .liečby obezity pacienta, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie účinného množstva polypeptidu, pričom týmto polypeptidom je biologicky aktívny fragment B boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo biologicky aktívny fragment prirodzene sa nevyskytujúceho HMG B boxu, pacientovi v množstve dostatočnom na stimuláciu uvoľňovania cytokinu podporujúceho zápal z bunky.
22. 23. Spôsob stanovenia, či zlúčenina inhibuje zápal, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa zostavenie systému zo zlúčeniny a z

    a) bunky, ktorá uvolňuje cytokin podporujúci zápal pri vystavení 3 boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG); a

    b) HMG B boxu, a potom stanovenie, či zlúčenina inhibuje uvolňovanie cytokínu podporujúceho zápal z bunky.
23. 24. Spôsob stanovenia či zlúčenina inhibuje zápal, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa zostavenie systému zo zlúčeniny a z

    a) bunky, ktorá uvolňuje cytokin podporujúci zápal pri vystavení B boxu stavovcového proteínu skupiny s vysokou mobilitou (HMG) alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu; a

    b) HMG B boxu alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu, a potom stanovenie, či zlúčenina inhibuje uvolňovanie cytokínu podporujúceho zápal z bunky.