CN102076350A - 将骨髓来源的多能干细胞动员到末梢循环的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明在世界上首次发现:1)通过向静脉内给予从游离皮片提取的组织提取液,能够将骨髓来源的多能组织干细胞诱导到末梢血中,2)并且,游离皮片中的将骨髓来源的多能组织干细胞动员到末梢血中的物质是HMGB1,3)具有将骨髓来源的多能干细胞动员到末梢血中的活性的HMGB1能够从培养细胞中简便地纯化出来。
Description
技术领域
本发明涉及将骨髓来源的多能干细胞动员到末梢循环的药物。
背景技术
近年来,已明了损伤组织的修复过程中有各种干细胞参与,通过将大量的干细胞动员到损伤部位来诱导功能性组织再生的新的再生医疗技术的开发也在不断地进行。为了使该新的再生医疗技术成为现实,需要1)体内存在丰富的可动员到损伤部位的干细胞、2)将干细胞动员到损伤部位的因子得以分离、鉴定。
可动员到损伤部位的干细胞有存在于损伤部位或其附近组织的组织干细胞和存在于末梢血中的骨髓来源的干细胞。近年来,不断报告了骨髓来源的细胞参与多种损伤组织的再生,但对于将骨髓来源的细胞动员到损伤组织的机制并不清楚。这里所说的骨髓来源的细胞与具有分化为血液细胞(白细胞、红细胞)的能力的造血系干细胞不同,其包括目前以被称为骨髓间充质干细胞的细胞为代表的干细胞或者存在于骨髓中的组织祖细胞团。骨髓间充质干细胞是具有分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的能力的未分化干细胞,还能够分化为成纤维细胞、肌肉细胞、基质细胞、肌腱细胞等其他的间充质的细胞。近年来已证明骨髓间充质干细胞能够分化为神经细胞、以及能够分化为上皮细胞(皮肤角质形成细胞等)或血管内皮细胞(非专利文献9)。组织祖细胞被定义为具有单方向性地分化为除血液***以外的特定组织细胞的能力的未分化细胞,包括具有分化为上述间充质组织、上皮组织、神经组织、实质器官、血管内皮的能力的未分化细胞。
HMGB1(High mobility group box 1,高迁移率族蛋白B1)为存在于生物体内几乎所有的细胞中的分子量为约25000的蛋白质,根据过去的报道,已知其具有下述功能:1)HMGB1在细胞内与DNA结合,通过控制染色质的结构来调节基因的表达(非专利文献1);2)HMGB1由在炎症性细胞因子TNF-α和IL-1、LPS的作用下的存在于炎症组织中的单核细胞和巨噬细胞分泌,在细胞外与RAGE(糖基化终产物受体)结合(非专利文献2)并诱导强烈的炎症反应(非专利文献3);3)HMGB1从因灌注不足而陷入坏死的细胞向周围的组织释放(非专利文献4);4)HMGB1与重症感染症的败血症患者的炎症的进展相关(非专利文献5);5)HMGB1在心肌梗塞模型中,通过向梗塞部位给予,促进心肌内存在的干细胞的***和增殖,促进心肌的再生和功能恢复(专利文献1);6)HMGB1在灌注不足肝脏动物模型中,通过在制造灌注不足状态前提前给予,可以减轻肝损害的程度(非专利文献6);7)在肌肉损伤模型中,给予到损伤部位的HMGB1将同时给予的血管祖细胞诱导到损伤部位,促进肌肉组织再生(非专利文献7);8)HMGB1在神经细胞中,诱导轴突的形成(非专利文献8)等。但是,过去还没有将骨髓来源的干细胞、特别是能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等所谓的间充质干细胞动员到损伤组织的报道。
以往认为脑和脊髓的中枢神经细胞一旦受到损伤就不能再生。但是,近年来神经干细胞的存在及其诱导已经成为可能。另外,正常神经***中的神经干细胞生态位也已被鉴定。因此,原本认为不可能的损伤的中枢神经系细胞的恢复也变得可行。现在,有关对于脑脊髓损伤、退行性疾病等的神经再生的研究正在展开。
作为脑组织(细胞)损伤的原因,以外伤导致的脑挫伤、脑缺血性疾病为主。作为其他的原因,可列举出以脑肿瘤摘除手术为主的脑外科手术作为起因的原因。特别是由脑实质细胞产生的神经胶质瘤的全部摘除很困难,为了避免运动和语言功能障碍,只能部分摘除。另外,恶性神经胶质瘤的生存预后也不好,以化学疗法和放射疗法为主,近年研究盛行的免疫和基因治疗也未能显示出充分的效果。因此,理想的治疗是尽可能多地摘除肿瘤细胞、且可使由其结果造成的脑功能损伤得到恢复的治疗。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2005-537253
非专利文献
非专利文献1:Bustin等,Mol Cell Biol,19:5237-5246,1999年
非专利文献2:Hori等,J.Biol.Chem.,270,25752-25761,1995年
非专利文献3:Wang等,Science,285:248-251,1999年
非专利文献4:Muller等,EMBO J,20:4337-4340,2001年
非专利文献5:Wang等,Science,285:248-251,1999年
非专利文献6:Germani等,J Leukoc Biol.Jan;81(1):41-5、2007年
非专利文献7:Palumbo等,J.Cell Biol.,164:441-449,2004年
非专利文献8:Merenmies等,J.Biol.Chem.,266:16722-16729,1991年
非专利文献9:Wu Y等、Stem cells.,25:2648-2659,2007年
发明内容
发明所要孵决的课题
已知骨髓中的干细胞中存在能分化为骨组织、软骨组织、脂肪组织的间充质干细胞。近年来,也已清楚存在分化为上皮细胞和神经细胞的多能干细胞。
另外,作为难治性皮肤溃疡的治疗方法,有植皮治疗。根据发明人们的研究,清楚了溃疡治疗后的植皮片是依赖骨髓来源的细胞重建表皮、真皮或毛囊(构成毛的组织)等,从而使皮肤再生。因此,期待能够简单并且有效率地将骨髓中的如上述那样的具有组织修复能力的细胞群回收的方法,但现状是现在还没有开发出那样的方法。
所以,本发明的课题在于提供将骨髓来源的多能干细胞大量地动员到末梢血中的方法。
用于解决课题的手段
在移植皮片生存在生物体组织上的过程中,存在骨髓来源的细胞从皮肤外组织被动员到移植皮片并参与皮肤组织再生的可能性,考虑到这一点,本发明设想存在将具有这样的多能性的骨髓来源的细胞动员到末梢血中的机制,通过从静脉内给予皮肤组织提取液或骨髓来源的多能干细胞诱导剂,能够将骨髓来源的多能干细胞大量地动员到末梢血中。具体而言,在世界上首次发现:1)通过向静脉内给予从游离皮片提取的组织提取液,将骨髓来源的多能组织干细胞诱导到末梢血中,2)并且,将游离皮片中的骨髓来源的多能组织干细胞动员到末梢血中的物质为HMGB1,3)具有将骨髓来源的多能干细胞动员到末梢血中的活性的HMGB1可以从培养细胞简便地纯化出来。
本申请基于上述见解,提供以下的发明。
〔1〕一种被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂,其含有以下的(a)~(i)中任一项记载的成分;
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)***有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)***有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)***有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体。
〔2〕一种被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂,其含有通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的细胞或组织的提取液。
〔3〕一种被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂,其含有通过包含以下工序的方法制造的肝素结合级分;
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序
(b)使通过工序(a)获得的提取液与固定化肝素接触的工序,和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的工序。
〔4〕一种评价细胞或组织的提取液中是否含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的方法,其包含以下工序,其中,当在工序(b)中的将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的活性比对照的活性高时,则判定细胞或组织的提取液中含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子;
(a)制备细胞或组织提取液的工序,和
(b)测定通过工艺(a)制备的提取液的将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的活性的工序。
〔5〕一种对含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的细胞或组织的提取液进行筛选的方法,其包含以下工序;
(a)对于多个提取液,通过〔4〕所述的方法评价所述提取液中是否含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的工序,和
(b)选择在工序(a)中被评价为含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的提取液的工序。
〔6〕一种将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的鉴定方法,其包含下述工序:从通过〔4〕或〔5〕所述的方法被判定为含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的提取液中,以将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的活性为指标,对将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子进行纯化。
〔7〕一种用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的试剂盒,其包含被给予到血管或肌肉中的、含有以下的(a)~(i)中任一项所记载的物质的组合物;
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)***有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)***有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)***有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体。
〔8〕一种用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的试剂盒,其含有被给予到血管或肌肉中的、通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的细胞或组织的提取液。
〔9〕一种用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的试剂盒,其含有被给予到血管或肌肉中的、通过包含以下工序的方法制造的肝素结合级分;
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序,
(b)使通过工序(a)获得的提取液与固定化肝素接触的工序,和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的工序。
〔10〕一种将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的方法,其包含将以下的(a)~(i)中任一项记载的物质给予到血管或肌肉中的工序;
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)***有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)***有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)***有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体。
〔11〕一种将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的方法,其包含下述工序:将通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的细胞或组织提取液给予到血管或肌肉中。
〔12〕一种将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的方法,其包含下述工序:将通过包含以下工序的方法制造的肝素结合级分给予到血管或肌肉中;
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序,
(b)使通过工序(a)获得的提取液与固定化肝素接触的工序,和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的工序。
〔13〕以下(a)~(i)中任一项记载的物质在制造被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂中的用途;
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)***有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)***有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)***有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
〔14〕通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的细胞或组织的提取液在制造被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂中的用途。
〔15〕通过包含以下工序的方法制造的肝素结合级分在制造被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂中的用途;
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序,
(b)使通过工序(a)获得的提取液与固定化肝素接触的工序,和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的工序。
〔16〕在被给予到血管或肌肉中的将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的方法中使用的以下的(a)~(i)中任一项记载的物质;
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)***有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)***有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)***有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
〔17〕通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的细胞或组织的提取液,其被给予到血管或肌肉中,在将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的方法中使用。
〔18〕通过包含以下工序的方法制造的肝素结合级分,其被给予到血管或肌肉中,在将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的方法中使用;
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序,
(b)使通过工序(a)获得的提取液与固定化肝素接触的工序,和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的工序。
附图说明
图1为HMGB1表达载体的图。
图2为从小鼠尾静脉给予皮肤提取液(SE)并采集末梢血的图。
图3为用抗小鼠PDGFRα抗体、抗小鼠CD44抗体对给予皮肤提取液(SE)后12小时后的小鼠末梢血单核细胞级分进行荧光标记,并利用流式细胞仪进行分级而得到的图。上面3个图为阴性对照的PBS给予组(n=3),下面3个图为皮肤提取液(SE)给予组(n=3)。纵轴表示CD44的表达量,横轴表示PDGFRα的表达量。蓝线围住的部分表示CD44阳性且PDGFRα阳性细胞群,其在皮肤提取液给予组(SE)中与PBS组相比增加。
图4为从小鼠尾静脉给予HMBG1并采集末梢血的图。
图5为用抗小鼠PDGFRα抗体、抗小鼠CD44抗体对给予HMGB1后12小时的小鼠末梢血单核细胞级分进行荧光标记,并用流式细胞仪进行分级的图。左图为阴性对照的PBS给予小鼠,右图为HMGB1给予小鼠的图。纵轴表示CD44的表达量,横轴表示PDGFRα表达量。蓝线围住的部分表示CD44阳性且PDGFRα阳性细胞群,其在HMGB1给予小鼠中与PBS给予小鼠相比增加。
图6为用Western blot法检测新生小鼠皮肤提取液中的HMGB家族的照片。
图7为表示在HEK293细胞中表达的纯化重组体Flag tag-HMGB家族融合蛋白质的Western blot的结果的照片。
图8为表示使用了Boyden小室的重组体HMGB1、HMGB2、HMGB3的骨髓间充质干细胞迁移活性的图。任一重组蛋白与对照组相比都显示出迁移活性。
图9为表示在小鼠的皮肤溃疡治疗模型中HMGB家族的治疗结果的图。HMGB1、HMGB2、HMGB3与对照组相比均显示出显著地缩小溃疡面积的效果。
图10为用Boyden小室确认人HMGB1和人皮肤提取液具有使人骨髓来源的间充质干细胞迁移的活性的照片。
图11为用肝素柱将小鼠心脏、小鼠脑和小鼠皮肤提取液中的骨髓间充质干细胞诱导活性物质纯化并使用Boyden小室确认活性的照片。
图12为表示用Boyden小室法确认培养细胞株HEK293和Hela提取液的人骨髓间充质干细胞迁移活性的照片。任一培养细胞都显示出人骨髓间充质干细胞迁移活性。
图13中A为将小鼠固定于脑定位固定装置,用手术刀将头部正中切开,使用钻头进行头部穿孔的照片。B为使用注射器对脑施加负压,以抽吸出一部分脑组织的照片。C为注入5μl溶解于纤维蛋白胶制剂(纤维蛋白原)的皮肤提取液肝素柱纯化级分,然后再注入5μl纤维蛋白胶制剂(凝血酶)后的照片。D和E为脑损伤模型治疗后2周后的照片。与对照的D相比,利用皮肤提取液肝素柱纯化级分的治疗组E中,可见GFP阳性细胞的聚集。F和G为脑损伤模型治疗后6周后的照片。与对照的F相比,利用皮肤提取液肝素柱纯化级分的治疗组G中,可见GFP阳性细胞的聚集。
图14A为表示显示了具有CD44和PDGFRα的细胞的存在频度的流式细胞仪的结果的图。末梢血中的PDGFRα阳性且CD44阳性细胞以及PDGFRα阳性且CD44阴性细胞的所有的细胞群均通过HMGB1的给予而增加。B为显示比较PDGFRα阳性且CD44阳性细胞,C为显示比较PDGFRα阳性且CD44阴性细胞分别在PBS给予组和HMGB1给予组的末梢血中的出现频度的结果的图。在所有的细胞群中,HMGB1给予组中均在统计学上显著地增加。
具体实施方式
本发明提供一种被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂,其含有以下(a)~(i)中任一项所记载的成分。
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)***有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)***有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)***有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
通过将上述药剂给予到血管或肌肉中,能够骨髓组织干细胞动员到末梢循环中,从而促进损伤组织的再生。另外,上述药剂中,不仅有作为功能性组织再生诱导剂和促进剂的用途,还可期待预防因组织干细胞的减少导致的组织和器官功能的降低,即所谓的作为预防药物的用途,或延缓年龄增长性变化的进行,即作为抗衰老药物的用途。
另外,也可以给予上述药剂,将动员到末梢血中的多能干细胞在体外回收后,进行浓缩并给予到损伤部位来进行治疗。以往的骨髓间充质干细胞治疗中,由于从位于体内深部的骨髓回收细胞,因此对生物体有侵害性,但是通过使用本发明的药剂,则可低侵害地从末梢血回收骨髓间充质干细胞,并可利用于骨髓间充质干细胞移植等。
本发明涉及被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂,其含有通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的细胞或组织的提取液。
作为浸渍到溶剂中的细胞或组织,并无特殊限制,可例示出组织来源的细胞、由组织来源的细胞建立的细胞株(例如,可例示出Hela、HEK293,但并非限定于这些)、分离出来的细胞、未分离出来的细胞(例如分离出的组织中存在的细胞)、导入有编码HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的DNA的细胞等。作为上述组织,什么样的组织都可以,例如,可例示出活体皮肤组织、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸和血液等),但并非限定于这些。
作为上述溶剂可例示出生理盐水、PBS(phosphate buffered saline)、TBS(Tris-buffered saline),但并非限定于这些。另外,作为将细胞或组织浸渍到溶剂中的时间,为诱导细胞坏死所需的足够的时间,即1小时到48小时(例如6小时到48小时)、优选12到24小时,但并非限定于该时间。因此,“将细胞浸渍到溶剂中的工序”可表达为“在用于诱导坏死所需的足够的时间内将细胞浸渍到溶剂中的工序”或“使细胞坏死的工序”。另外,作为将细胞或组织浸渍到溶剂中的温度,可例示出4℃到25℃(例如4℃到8℃),优选为4℃,但并非限定于这些。另外,作为将细胞或组织浸渍到溶剂中的pH值,可例示出pH为7到8,优选为pH7.5,但并非限定于此。另外,作为缓冲液的成分,可列举出10mM~50mM、优选为10~20mM的浓度的磷酸缓冲液,但并非限定于此。
另外,本发明中将细胞或组织浸渍到溶剂中后,也可从含有细胞或组织的溶剂中将该细胞或该组织除去。从溶剂中除去细胞或组织的方法只要是本领域技术人员众所周知的方法,则无特殊限制。例如,在4℃~25℃(例如4℃)、重力加速度10G~10万G(例如440G)下离心,通过分离上清液,可从溶剂中除去细胞或组织,但对此并无限制。该上清液可用作细胞或组织的提取液。
作为在本发明中使用的通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的细胞或组织提取液,可列举出例如皮肤提取液或末梢血单核细胞提取液(末梢血提取液),但并非限定于这些。
末梢血提取液的制备方法为,在使用注射器等采血后,利用冰箱或液氮、干冰等将细胞冷冻,其后在0℃以上的温度下再融解。进而,为了去除细胞的不溶成分,例如,在4℃~25℃(例如4℃)下,在重力加速度10G~100000G(例如440G)下离心,通过分离上清液,可从溶剂中去除细胞的不溶成分,但并非限定于此。该上清液可用作细胞或组织的提取液。为了去除细胞的不溶成分,代替离心操作,可使其通过具有0.45μm微孔的硝化纤维素滤膜等,去除不溶成分。另外,通过将采血后的末梢血在4℃的状态下放置3小时到48小时,诱发细胞的坏死,可使末梢血中的细胞分泌细胞内成分。之后在重力加速度10G~100000G(例如440G)下离心,通过分离上清液,可从溶剂中去除细胞的不溶成分,但并非限定于此。该上清液可用作细胞或组织的提取液。为了去除细胞的不溶成分,代替离心操作,可使其通过具有0.45μm微孔的硝化纤维素滤膜,去除不溶成分。
另外,从末梢血单核细胞制备细胞提取液的方法为,用注射器等采集末梢全血后,用PBS将总量稀释到4mL,在离心管中加入3mL的Ficoll-Paque Plus(GE)液后,在其上层置稀释血液。在400G(18℃)下离心40分钟,将含有单核细胞的中间层回收到新的离心管中,加入45mL的PBS,在800G(18℃)下离心5分钟,除去上清液。进而再次加入45mL的PBS,在800G(18℃)下离心5分钟除去上清液。向沉淀的细胞中加入200μL的PBS进行悬浮。细胞悬浮液在-80℃的冰箱内冷冻30分钟,从冰箱中取出在冰上融解。重复该冷冻融解的操作3次。然后在800G(4℃)下离心15分钟并回收上清液。替代冷冻细胞,可通过在4℃的冰箱中放置3小时到48小时,诱发细胞的坏死,使细胞内成分分泌。另外,可通过一边在冰上冷却,一边进行超声处理来破坏细胞,使细胞内成分释放到细胞外。不论在何种情况下使细胞内成分释放到细胞外后,在重力加速度440G到1000000G、优选100000G到20000G的条件下进行离心操作,回收上清液,制成细胞提取液。另外,替代离心操作,可使其通过具有0.45μm微孔的硝化纤维素滤膜或醋酸纤维素等,去除不溶成分,制成细胞提取液。
此外,本发明涉及一种被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂,其含有通过包含以下工序的方法制造的肝素结合级分。
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序,
(b)使通过工序(a)获得的提取液与固定化肝素接触的工序,和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的(也表述为肝素纯化级分、肝素柱纯化级分)工序。
固定化肝素是将肝素与不溶性载体共价键合而成的物质。作为上述不溶性载体,可例示出Sepharose beads(Sepharose 4B,Sepharose 6B等:GEHealthcare),但并非限定于此。在本发明中,也可以使用市售的固定化肝素(Hitrap Hepalin HP colum:GE Healthcare)。
作为细胞或组织的提取液与固定化肝素的接触条件,可例示出pH7~8左右(优选pH 7.5),盐浓度可例示出0~200mM,优选100~200mM左右,但并非限定于这些。提取液与固定化肝素接触的时间没有特殊限定,从使肝素结合级分与固定化肝素充分吸附的观点出发,优选保持5分钟以上。另外,作为温度,可列举出4~8℃,优选4℃,但并非限定于这些。此外,作为在固定化肝素上吸附的肝素结合级分的洗脱条件,可列举出pH 7~8左右、盐浓度200~1000mM(优选1000mM左右),但并非限定于这些。
通过将含有上述提取液或上述级分的药剂给予到血管或肌肉中,能够使骨髓组织干细胞被动员到末梢循环中,从而促进损伤组织的再生。另外,上述药剂不仅有作为功能性组织再生诱导剂和促进剂的用途,还可期待预防因组织干细胞的减少导致的组织和器官功能的降低,即所谓的作为预防药物的用途,或延缓年龄增长性变化的进行,即作为抗衰老药物的用途。
另外,也可以给予上述药剂,将动员到末梢血中的多能干细胞在体外回收后,进行浓缩并给予到损伤部位进行治疗。以往的骨髓间充质干细胞治疗中,由于从位于体内深部的骨髓回收细胞,因此对生物体有侵害性,但是通过使用本发明的药剂,则可低侵害地从末梢血回收骨髓间充质干细胞,并可利用于骨髓间充质干细胞移植等。
本发明另外还提供一种用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的试剂盒,其包含被给予到血管或肌肉中的、含有以下的(a)~(i)中任一项所记载的物质的组合物。
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)***有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)***有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)***有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体。
本发明另外还提供一种用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的试剂盒,其含有被给予到血管或肌肉中的、通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的细胞或组织的提取液。
本发明另外还提供一种用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的试剂盒,其含有被给予到血管或肌肉中的、通过包含以下工序的方法制造的肝素结合级分。
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序,
(b)使通过工序(a)获得的提取液与固定化肝素接触的工序,和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的工序。
上述的向末梢血动员骨髓细胞用的试剂盒的特征在于,通过向血管或肌肉中给药,从而将骨髓组织干细胞动员到末梢循环中。
作为上述试剂盒,可例示出含有(1)溶解于纤维蛋白原中的上述提取液或上述级分等、以及(2)凝血酶的促进组织再生用的试剂盒,或者含有(1)上述提取液或上述级分等、(2)纤维蛋白原、以及(3)凝血酶的促进组织再生用的试剂盒。本发明中,可使用市售的纤维蛋白原和凝血酶。例如,可列举出纤维蛋白原HT-Wf(Benesis-Mitsubishi Pharma)、Beriplast(ZLB Behring)、Tisseel(Baxter)、Bolheal(化血研)、TachoComb(ZLBBehring),但并非限定于这些。
被动员到损伤组织中的骨髓来源的细胞可向各种细胞分化,有助于损伤组织的功能性再生以及功能维持、功能强化。本发明中,作为损伤组织,可列举出由于引起缺血、灌注不足和缺氧状态的各种病态、外伤、烧伤、炎症、自身免疫、基因异常等而发生损伤的组织,但并非限定于这些原因。另外,损伤组织中还包括坏死组织。
作为本发明中的组织,只要是骨髓来源的细胞能分化的组织,则无特殊限定,例如,可例示出皮肤组织、骨组织、软骨组织、肌肉组织、脂肪组织、心肌组织、神经组织、肺组织、消化道组织、肝-胆-胰组织、泌尿-生殖器等生物体内的所有组织。另外,通过使用上述组织再生促进剂,不仅难治性皮肤溃疡、皮肤创伤、水疱症(bullosis)、脱发症等皮肤疾病,就是在脑梗塞、心肌梗塞、骨折、肺梗塞、胃溃疡、肠炎等组织损伤中也能进行诱导功能性组织再生的治疗。作为给予上述组织再生促进剂的动物种,可列举出人或非人的动物,例如可以例示出人、小鼠、大鼠、猴子、猪、狗、兔、仓鼠、豚鼠等,但并非限定于这些。
本发明的骨髓细胞为除造血系干细胞及来源于此的白细胞、红细胞、血小板以外的细胞,目前包括以被称为骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞的细胞为代表的干细胞或存在于骨髓中的组织祖细胞团。作为本发明的骨髓细胞,为可以通过骨髓采集(骨髓细胞采集),或末梢血采血进行分离的细胞。造血系干细胞为非粘附细胞,本发明的骨髓细胞为通过对利用骨髓采集(骨髓细胞采集)、末梢血采血而获得的血液中的单核细胞级分进行培养而以粘附细胞的形式获得。另外,本发明的骨髓细胞含有间充质干细胞,优选具有分化为成骨细胞(在诱导分化时可通过观察钙的沉淀来识别)、软骨细胞(可以通过阿辛蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来识别)、脂肪细胞(可以通过苏丹III染色阳性来识别)、以及成纤维细胞、平滑肌细胞、基质细胞、肌腱细胞等间充质细胞、以及神经细胞、上皮细胞(例如表皮角化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族)、血管内皮细胞的能力,但分化后的细胞并非局限于上述细胞,还包括向肝脏、肾脏、胰脏等实质器官细胞分化的能力。
本发明中,骨髓来源间充质干细胞或骨髓间质多能细胞或骨髓多能干细胞是指存在于骨髓内的细胞,直接从骨髓或间接从其它组织(血液或皮肤、脂肪、其他组织)采集,能够作为对(塑料或玻璃制)培养皿的粘附细胞来培养和增殖,该细胞的特征是具有分化为骨、软骨、脂肪等间充质系组织(间充质干细胞)、或骨骼肌、心肌、以及神经组织、上皮组织(多能干细胞)的能力,其可以通过骨髓血采血、末梢血采血、以及从脂肪等间充质组织、皮肤等上皮组织、脑等神经组织采取而获得。另外,骨髓来源间充质干细胞或骨髓来源的多能干细胞或骨髓多能干细胞还具有如下特征:通过将暂时粘附在培养皿上的细胞给予至生物体的损伤部位,从而具有分化成为例如构成皮肤的角化细胞等上皮组织、构成脑的神经组织的能力。
本发明的骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞除了具有分化为成骨细胞(在诱导分化时可通过观察钙的沉淀来识别)、软骨细胞(可以通过阿辛蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来识别)、脂肪细胞(可以通过苏丹III染色阳性等来识别)的能力以外,还优选具有分化为例如成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、基质细胞、肌腱细胞等间充质系细胞、神经细胞、色素细胞、表皮细胞、毛囊细胞(表达细胞角蛋白家族、毛发角蛋白家族等)、上皮细胞(例如表皮角质化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族等)、内皮细胞、以及肝脏、肾脏、胰脏等实质器官细胞的能力,但分化后的细胞并非局限于上述细胞。
另外,人骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞可以例示出,骨髓采集(骨髓细胞采集)、末梢血采血、脂肪采集后,直接或将单核细胞级分分离后进行培养,作为粘附细胞而获得的细胞,但并非局限于此。作为人骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞的标记,可以例示出Lin阴性、CD45阴性、CD44阳性的全部或一部分,但并非局限于这些。
另外,小鼠骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞可以例示出,例如能够通过实施例中记载的方法获得的细胞,但并非局限于此。作为小鼠骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞的标记,可以例示出、CD44阳性、PDGFRα阳性、PDGFRβ阳性、CD45阴性、Lin阴性、Sca-1阳性、c-kit阴性的全部或一部分,但并非局限于这些。
组织祖细胞被定义为具有单方向性地分化为除血液***以外的特定组织细胞的能力的未分化细胞,包括具有分化为上述间充质组织、上皮组织、神经组织、实质器官、血管内皮的能力的未分化细胞。
本发明的药剂中,作为上述提取液、上述肝素结合级分、或上述(a)~(i)所记载的成分中的至少1个成分以外的成分,只要不阻碍骨髓细胞的动员和组织再生促进,则无特殊限定。例如,本发明的药剂中除了上述提取液、上述肝素结合级分、或上述(a)~(i)所记载的成分中的至少1个成分以外,还可以含有强化HMGB1、HMGB2或HMGB3的功能性组织再生诱导功能的相关分子(群)、抑制除HMGB1、HMGB2、或HMGB3所期待的效果以外的作用的分子(群)、控制骨髓细胞的增殖和分化的因子、强化和维持这些因子或细胞的功能的其它因子。
作为本发明的药剂中的提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的来源的动物种,可以列举出人或非人动物,例如可以例示出人、小鼠、大鼠、猴子、猪、狗、兔子、仓鼠、豚鼠等,但优选为与被给予上述提取液等的动物种相同的动物种。
作为本发明的药剂中的HMGB1蛋白质,可以例示出包含序列号:1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质,但并非局限于这些。本发明的HMGB1蛋白质中也包括与包含序列号:1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质,可以列举出例如:1)由在序列号:1、3或5中记载的氨基酸序列中替换、缺失、***和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与含有序列号:1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质;以及2)为由与包含序列号:2、4或6中记载的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA编码的蛋白质、且与包含序列号:1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。
作为本发明的药剂中的HMGB2蛋白质,可以例示出包含序列号:7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质,但并非局限于这些。本发明的HMGB2蛋白质中还包括与包含序列号:7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质,可以列举出例如:1)由在序列号:7、9或11中记载的氨基酸序列中替换、缺失、***和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号:7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质;和2)为由与包含序列号:8、10或12中记载的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA编码的蛋白质、且与包含序列号:7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。。
作为本发明的药剂中的HMGB3蛋白质,可以例示出包含序列号:13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质,但并非局限于这些。本发明的HMGB3蛋白质中还包括与包含序列号:13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质,可以列举出例如:1)由在序列号:13或15中记载的氨基酸序列中替换、缺失、***和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与含有序列号:13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的经分离的蛋白质;以及2)为由与包含序列号:14或16中记载的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA编码的蛋白质、且与包含序列号:13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的经分离的蛋白质。
与包含序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的经分离的蛋白质可以为包含序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质的同源物或者旁系同源物。与包含序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的蛋白质可通过本领域技术人员众所周知的方法(実験医学別冊·遺伝子工学ハンドブック,pp246-251、羊土社、1991年発行)来分离。
作为与包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的蛋白质,可以列举出具有骨髓来源的细胞的诱导活性的蛋白质。
由在序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列中替换、缺失、***和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列形成、且与含有序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质包括天然存在的蛋白质。一般来说,如通过干扰素基因等所已知的,真核生物的基因具有多态性(polymorphism)。根据该多态性所产生的碱基序列的变化,有时1个或多个氨基酸被替换、缺失、***和/或添加。属于这样自然存在的蛋白质、且具有在序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列中替换、缺失、***和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、并且与由序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等同的蛋白质,包括在本发明的HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质中。
另外,只要是与由序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等同的蛋白质,即便是人为制作的变异蛋白质也包含在本发明中。作为对给定的碱基序列施加随机变异的方法,已知例如通过DNA的亚硝酸处理的碱基对的替换(Hirose,S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,79:7258-7260,1982)。该方法中,通过对欲导入变异的片段进行亚硝酸处理,能够在特定的片段中随机地导入碱基对的替换。或者另外,作为在任意位点导入目标变异的技术,有gapped duplex法等(Kramer W.and Fritz HJ.,Methods in Enzymol.,154:350-367,1987)。将克隆要导入变异的基因而得到的环状双链载体分成单链,使其与在目标部位具有变异的合成寡核苷酸杂交。使利用限制性内切酶切断形成线状的载体来源的互补单链DNA与上述环状单链载体黏着(anneal),用DNA聚合酶填充该载体与上述合成核苷酸之间的间隙,进而通过连接形成完整的双链环状载体。
所改变的氨基酸的数目典型地为50个氨基酸以内、优选为30个氨基酸以内、进一步优选为5个氨基酸以内(例如1个氨基酸)。
在人为地替换氨基酸的情况下,如果替换为性质相似的氨基酸,则容易维持原蛋白质的活性。本发明的蛋白质包括在上述氨基酸替换中进行保守性替换而得到的蛋白质、且与包含序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。在替换对于蛋白质活性来说重要的区域的氨基酸等情况下,保守性替换是重要的。这样的氨基酸的保守性替换对于本领域技术人员来说是熟知的。
作为相当于保守性替换的氨基酸的组,可列举出例如碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、细氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等。
另外,通过非保守性替换也能够使蛋白质的活性等进一步提高(包括例如恒定的活化型蛋白质(constitutively activated proteins)等)。
另外,作为获得与包含序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质的方法,可列举出利用杂交的方法。即,将对序列号:2、4、6、8、10、12、14或16所示的本发明的HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质进行编码的DNA或其片断制成探针,将能够与其杂交的DNA分离。若在严格的条件下实施杂交,则能够选择同源性高的DNA作为碱基序列,其结果是,分离的蛋白质中含有与HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质在功能上等同的蛋白质的可能性较高。同源性高的碱基序列是指,可以表现出例如70%以上、优选90%以上的相同性。
另外,严格的条件是指,具体地说,例如可以表示为在6×SSC、40%甲酰胺、25℃下进行杂交、和在1×SSC、55℃下进行洗涤的条件。严格性由盐浓度、甲酰胺的浓度、或温度的条件所左右,但只要是本领域技术人员,就能够设定这些条件以获得所需的严格性。
通过利用杂交,能够将对例如除包含序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质以外的HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的同源物进行编码的DNA分离。
与包含序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质通常与序列号:1、3、5、7、9、11、13或15中记载的氨基酸序列具有高的同源性。高的同源性是指,至少30%以上、优选50%以上、更优选80%以上(例如95%以上)的序列的相同性。关于碱基序列或氨基酸序列的同源性,可利用使用了网络的同源性检索网站来进行[例如在日本DNA数据库(DDBJ)中,可以利用FASTA、BLAST、PSI-BLAST和SSEARCH等的同源性检索[例如日本DNA数据库(DDBJ)的网站上的同源性检索(Search and Analysis)的网页:http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html]。另外,在National Center forBiotechnology Information(NCBI)中,还可以进行使用了BLAST的检索(例如NCBI的主页网站的BLAST网页:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/;Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.,1990,215(3):403-10;Altschul,S.F.&Gish,W.,Meth.Enzymol.,1996,266:460-480;Altschul,S.F.et al.,Nucleic Acids Res.,1997,25:3389-3402)]。
例如,在使用Advanced BLAST 2.1中的氨基酸序列的相同性的计算中,相同性(identity)的值(%)可以如下进行检索来得到:程序使用blastp,将Expect值设定为10、将Filter全部设定为OFF,Matrix使用BLOSUM62,并将Gap existence cost、Per residue gap cost和Lambda ratio分别设定为11、1、0.85(缺省值)(Karlin,S.and S.F.Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68;Karlin,S.and S.F.Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-7)。
本发明的蛋白质或在功能上与其等同的蛋白质可以是进行了糖链等生理性修饰、荧光或放射性物质等标记或者与其他蛋白质的融合等各种修饰而得到的蛋白质。特别是在后文所述的基因重组体中,糖链的修饰可能因用于表达的宿主的不同而产生差异。但是,即使在糖链的修饰方面存在差异,只要显示与本说明书中公开的HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质相同性状,均为本发明的HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质,或在功能上等同的蛋白质。
HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质不仅可以从生物体材料获得,而且可以作为通过将对其进行编码的基因整合入适当的表达体系而制成基因重组体(recombinant)来获得。为了通过基因工程技术获得HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质,可以将上文所述的编码HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的DNA整合入适当的表达体系并使之表达。作为本发明中可应用的宿主/载体体系,可举出例如表达载体pGEX和大肠杆菌。由于pGEX可以使外来基因以与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白质的形式表达(Gene,67:31-40,1988),因此通过热激将整合了对HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质进行编码的基因的pGEX导入BL21等大肠杆菌株中,在适当培养一段时间后,添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG),从而诱导GST融合HMGB1、GST融合HMGB2、或GST融合HMGB3蛋白质的表达。本发明的GST由于吸附于谷胱甘肽琼脂糖4B,因此表达产物能够容易地通过亲和柱层析法(affinity column chromatography)分离、纯化。
作为用于获得HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的重组体的宿主/载体体系,还可以采用下述的体系。首先,当利用细菌作为宿主时,市售的有利用了组氨酸标签(histidine-tag)、HA标签(HA-tag)、FLAG(FLAG-tag)等的融合蛋白质的表达用载体。关于酵母,已公知Pichia属酵母对于具有糖链的蛋白质的表达是有效的。从糖链的添加的角度出发,还可以采用利用了以昆虫细胞为宿主的杆状病毒载体的表达体系(Bio/Technology,6:47-55,1988)。此外,还利用哺乳动物的细胞进行利用了CMV、RSV或SV40等启动子的载体的转染,这些宿主/载体体系均能够用作HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的表达体系。另外,还可以利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等病毒载体来导入基因。
得到的本发明的蛋白质可以从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离,然后纯化成实质上纯且均一的蛋白质。蛋白质的分离、纯化可以使用在通常的蛋白质纯化中使用的分离、纯化方法,没有任何限定。例如,可以对色谱柱、过滤膜、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透析、重结晶等进行适当选择、组合以对蛋白质进行分离、纯化。
作为色谱法,可列举出例如亲和层析法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤法、逆相色谱法、吸附层析法等(Marshak et al.,Strategies forProtein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual.EdDaniel R.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。这些色谱法可以使用液相色谱法例如HPLC、FPLC等液相色谱法来进行。
另外,本发明的蛋白质优选是实质上经纯化的蛋白质。这里,“实质上经纯化”是指本发明的蛋白质的纯化度(本发明的蛋白质在蛋白质成分总体中的比例)为50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、100%或者接近100%。接近100%的上限依赖于本领域技术人员的纯化技术和分析技术,例如为99.999%、99.99%、99.9%、99%等。
另外,只要是具有上述纯化度的蛋白质,则可以是通过任何纯化方法进行了纯化的蛋白质,包括实质上经纯化的蛋白质。例如,可例示出通过将上述色谱柱、过滤膜、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透析、重结晶等适当选择或组合而实质上纯化得到的蛋白质,但并不限定于这些。
作为释放或分泌本发明的药剂中的HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的细胞,基本上生物体内所有的组织来源的细胞均可以。作为容易采集和培养的细胞,可例示出成纤维细胞(例如正常皮肤成纤维细胞和其来源的细胞株),但并不限定于这些。另外,分泌HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的细胞也可以通过将下述载体导入成纤维细胞(例如正常皮肤成纤维细胞和其来源的细胞株)等哺乳类细胞、昆虫细胞或其他细胞来制作,所述载体是通过将编码HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的DNA、或者通过将编码分泌信号的DNA(ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTATGG GTA CTG CTG CTG TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC;序列号:17)结合到编码HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的DNA上而得到的DNA***公知的表达载体或基因治疗用载体而制作的。作为编码分泌信号的DNA,可例示出具有上述序列的DNA,但并不限定于此。另外,这些细胞所来源的动物种没有特别限制,优选使用进行组织再生的对象动物种的细胞、对象自身的细胞、或者与进行组织再生的对象具有血缘关系的动物来源的细胞。
编码本发明的药剂中的HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的DNA只要编码HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质,则可以是cDNA、也可以是基因组DNA,另外,还可以是天然的DNA或是人工合成的DNA。编码HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的DNA通常以***到载体(例如基因治疗用载体)的状态包含在本发明的药剂中。
作为本发明中的基因治疗用载体,可例示出质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、仙台病毒载体、仙台病毒包膜载体、***状瘤病毒载体等,但并不限定于这些。该基因治疗用载体中还可以包括有效地诱导基因表达的启动子DNA序列、控制基因表达的因子以及维持DNA的稳定性所需的分子。
另外,本发明的药剂中也可以含有属于HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的部分肽且具有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的活性的肽、分泌该部分肽的细胞、或***有对该部分肽进行编码的DNA的载体。
本发明的药剂的给予方法为向血管或肌肉的非经口给予。作为涉及的给予方法,具体可以列举出注射给予。例如,可通过血管内注射(动脉内注射、静脉内注射)、肌肉内注射等将本发明的药剂给予到血管或肌肉中。
另外,可以根据患者的年龄、症状选择适宜的给予方法。给予HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质时,例如在每次给予时,可在每1kg体重0.0000001mg~1000mg的范围内选择给予量。或者,例如可在每位患者0.00001~100000mg/body的范围内选择给予量。给予分泌HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的细胞或***了对HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质进行编码的DNA的基因治疗用载体时,也可以按照使HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的量达到上述范围内的方式进行给予。但是,本发明的药剂并非局限于这些投予量。
本发明的药剂可以按照常规方法制成制剂(例如Remington′sPharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A),还可以共同地含有医药上可容许的载体或添加物。可列举出例如表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等,但并不限于这些,还可以适当使用其他常用的载体。具体地,可列举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯固化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
另外,上述细胞或组织提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质、分泌HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的细胞、***有对HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体、HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质的部分肽、分泌该部分肽的细胞、或***有对该部分肽进行编码的DNA的载体的用途,也可以按照以下(1)~(3)来表示。
(1)一种将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的方法,其包含下述工序:将细胞或组织提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质、分泌该蛋白质的细胞、***有对该蛋白质进行编码的DNA的载体、该蛋白质的部分肽、分泌该部分肽的细胞、或***有对该部分肽进行编码的DNA的载体给予到血管或肌肉中。
(2)细胞或组织的提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质、分泌该蛋白质的细胞、***有对该蛋白质进行编码的DNA的载体、该蛋白质的部分肽、分泌该部分肽的细胞、或***有对该部分肽进行编码的DNA的载体在制造被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂中的用途。
(3)被给予到血管或肌肉中的在将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的方法中使用的细胞或组织的提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质、分泌该蛋白质的细胞、***有对该蛋白质进行编码的DNA的载体、该蛋白质的部分肽、分泌该部分肽的细胞、或***有对该部分肽进行编码的DNA的载体。
另外,本发明还提供评价细胞或组织的提取液中是否含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的方法,其包含以下工序,其中,当工序(b)中的将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血的活性比对照的活性高时,则判定细胞或组织的提取液中含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的方法。
(a)制备细胞或组织的提取液的工序,和
(b)测定通过工序(a)制备的提取液的将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的活性的工序。
上述方法中,首先要将细胞或组织浸渍到溶剂中。作为上述细胞,并无特殊限制,可例示出组织来源的细胞、由组织来源的细胞建立的细胞株(例如可例示出Hela、HEK293,但并非局限于这些)、分离的细胞、未分离的细胞(例如分离的组织中存在的细胞)、***有对HMGB1、HMGB2、或HMGB3蛋白质进行编码的DNA的细胞等。作为上述组织,可以是任意的组织,例如,活体皮肤组织、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸和血液等)、损伤组织。另外,作为该溶剂,可例示出生理盐水、PBS、TBS,但并非局限于这些。另外,作为将细胞或组织浸渍到溶剂中的时间,优选为诱导细胞坏死所需的足够的时间(通常24小时以上),但并非局限于该时间。另外,本发明中,将细胞或组织浸渍到溶剂中后,也可从含有细胞或组织的溶剂中去除该细胞或该组织。从溶剂中去除细胞或组织的方法只要是本领域技术人员众所周知的方法,并无特殊限制。
其次,测定获得的细胞或组织提取液的将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的骨髓细胞动员活性。作为对照,可例示出浸泡细胞或组织前的溶剂。骨髓细胞的骨髓细胞动员活性例如可通过实施例所记载的方法测定,但并非局限于此。
将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的动员活性可如下测定:通过将获得的细胞或组织提取液经静脉、经皮、肌肉内、腹腔内给予后,经过一分钟到4周后,优选经过1小时到24小时后,更优选经过12小时后,回收末梢血,对其单核细胞群利用流式细胞仪法,计数PDGFRα阳性细胞且CD44阳性细胞,或PDGFRβ阴性细胞且CD44阳性细胞的细胞数,但并非局限于此。
另外,本发明提供对含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的细胞或组织的提取液进行筛选的方法,其包含以下工序。
(a)对于多种的提取液,利用上述方法,评价该提取液中是否含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的工序,和
(b)选择工序(a)中被评价为含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的提取液的工序。
进而,本发明还提供将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的鉴定方法,其包含下述工序:从通过上述的评价方法或筛选方法被判定为含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的提取液中,以骨髓细胞的动员活性为指标,对将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子进行纯化的工序。对将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子进行纯化的过程中,可以使用通常的蛋白质纯化中使用的分离、纯化方法,并无任何限定。例如,可以适当选择、组合色谱柱、滤膜、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等来对蛋白质进行分离、纯化。纯化的因子可利用例如质量分析等本领域技术人员众所周知的方法进行鉴定。通过使用被鉴定的因子,可将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中。另外,该因子也可为将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的候补和有助于骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的候补。
另外,本说明书中引用的全部现有技术文献被引入本说明书中以作为参照。
实施例
以下通过实施例更具体地说明本发明,但本发明并非局限于这些实施例。
[实施例1]
目的:皮肤组织提取液内存在的骨髓来源的组织于细胞诱导因子将骨髓组织干细胞动员到末梢血的研究
方法:针对上述目的,通过以下的方法进行研究。
1)骨髓来源的组织干细胞诱导剂的制备:将从25只新生小鼠(2日龄)获得的游离皮片浸渍到生理性磷酸缓冲液pH 7.4(PBS)25ml中,在4℃下孵育24小时后,为了除去组织,在4℃的条件下以440G离心10分钟,回收上清液,从而制作皮肤提取液(SE)。
另外,使用Trizol(invitrogen)从C57/B16新生小鼠皮肤提取RNA,然后使用SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板,使用PCR(聚合酶链反应)法对HMGB1的cDNA进行扩增,将其***哺乳类细胞的表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中,以使在氨基酸序列的N末端添加了Flag tag(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys;序列号:18)的蛋白质表达。将这些质粒载体基因导入HEK293(人胎肾细胞来源的培养细胞株),培养48小时使蛋白质表达。分别将表达HMGB1蛋白质的细胞和培养上清液在4℃下孵育16小时,然后以4400g离心5分钟,回收上清液。将该上清液每50mL与100μL的Anti Flag抗体Gel(Sigma)混合,在4℃下孵育16小时。离心回收Gel,然后用PBS洗涤5次。然后使用3X Flag peptide(final 100μg/ml)进行洗脱。使用HMGB 1ELISA kit(Shino-Test)确认洗脱的蛋白质的浓度,冷冻干燥后用PBS将其调整到200μg/mL。
2)从8周龄雄性小鼠(C57/B16)的尾静脉用安装有30G1/2的注射针的注射器给予上述皮肤提取液(SE)500μL或者作为阴性对照组的PBS500μL(图2)。在给予6/12/24/48小时后,在异氟醚吸入麻醉下,从小鼠的心脏用肝素涂覆的1mL的注射器采集末梢血1mL,在与3mL的PBS混合后,轻轻地层置于3mL的Ficol(GE healthcare)的上面。用离心机在25℃下以400g离心40分钟。回收中间层的白色混浊层的细胞作为单核细胞级分。向回收的细胞中加入1mL的溶血剂HLB溶液(免疫生物研究所),在室温下孵育5分钟。重复该溶血操作2次。加入10mL的PBS,在25℃下以440g离心5分钟,除去上清液,回收细胞。将该细胞1,000,000个与分别用PBS稀释100倍的抗小鼠PE标记PDGFRα抗体(e-Bioscience)、PE标记抗小鼠PDGFRβ抗体(e-Bioscience)、PerCy5标记抗小鼠CD44抗体(BD biosciences)在室温下孵育20分钟。其后,将该细胞在25℃以440g离心5分钟,除去上清液。加入含1%多聚甲醛的PBS 400μL,作为流式细胞分析的样品。
从8周龄雄性小鼠(C57/B16)的尾静脉用安装有30G1/2的注射针的注射器给予小鼠HMGB1250μL(1μg/μL)或者作为阴性对照组的PBS250μL(图4)。在给予12小时后,在异氟醚吸入麻醉下,从小鼠的心脏用肝素涂覆的1mL的注射器采集末梢血1mL,在与3mL的PBS混合后,轻轻地层置于3mL的Ficol(GE healthcare)的上面。用离心机在25℃下以400g离心40分钟。回收中间层的白色混浊层的细胞作为单核细胞级分。向回收的细胞中加入1mL的溶血剂HLB溶液(免疫生物研究所),在室温下孵育5分钟。重复该溶血操作2次。加入10mL的PBS,在25℃下以440g离心5分钟,除去上清液,回收细胞。将该细胞1,000,000个与分别用PBS稀释100倍的抗小鼠PE标记PDGFRα抗体(e-Bioscience)、PerCy5标记抗小鼠CD44抗体(BD biosciences)在室温下孵育20分钟。其后,将该细胞在25℃以440g离心5分钟,除去上清液。加入含1%多聚甲醛的PBS400μL,作为流式细胞分析的样品。
结果:在注射皮肤提取液(SE)12小时后的末梢血中,确认了PDGFRα阳性、CD44阳性细胞被显著地动员(图3)。在注射HMGB112小时后的末梢血中,确认了PDGFRα阳性、CD44阳性细胞被显著地动员(图5)。
[实施例2]
目的:通过静脉内给予重组HMGB1蛋白,确认间充质干细胞是否被动员到末梢血中。
方法:从C57BL6小鼠(8~10周龄、雄性)的尾静脉给予重组HMGB1蛋白/生理盐水(100μg/ml)400μl(40μg HMGB1)或者生理盐水400μl。12小时后采集小鼠末梢血,加入PBS将总量稀释到4mL。向离心管中加入Ficoll-Paque Plus(GE)液3mL,然后在其上层置稀释血液。以400G(18℃)离心40分钟,将含有单核细胞的中间层回收到新的离心管中,加入45mL的PBS以800G(18℃)离心5分钟,除去上清液,然后再一次加入45mL的PBS、以800G(18℃)离心5分钟,除去上清液。使得到的单核细胞与Phycoerythrobilin(PE)标记抗小鼠PDGFRα抗体和Fluorescein isothiocyanate(FITC)标识抗小鼠CD44抗体反应,然后利用流式细胞仪(Facscan;Becton,Dickinson and Company)评价单核细胞级分内的PDGFRα阳性/CD44阳性细胞的存在频度。
结果:可见给予HMGB112小时后,末梢血单核细胞级分内的PDGFRα阳性且CD44阳性细胞和PDGFRα阳性且CD44阴性细胞显著地增加(图14)。即显示,HMGB1具有将作为间充质干细胞的标记已知的PDGFRα阳性细胞从骨髓内动员到末梢血中的活性。
讨论:PDGFRα和CD44已知是以骨髓来源的多能干细胞为代表的骨髓间充质干细胞的表面标记。骨髓间充质干细胞是能够分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞的多能干细胞,并且甚至能够分化为神经细胞或上皮细胞等。另外,本实验中使用的皮片由于为缺血状态,组织慢慢地变为坏死状态,从而将细胞的表面的蛋白质甚至核等的细胞内的蛋白质释放到周围。另外,HMGB1是皮肤提取液中含有的蛋白质。在植皮等中,这些蛋白质成为信号将骨髓来源的组织干细胞动员到植皮片中,在植皮片内重建骨髓细胞来源的表皮、皮下组织、毛囊组织等,使皮肤功能性地再生。本实验中通过将这样的皮肤提取液或HMGB1给予到静脉内,从而首次发现成功地将骨髓来源的组织干细胞动员到末梢循环中。根据该发现,通过将骨髓来源的多能干细胞动员到末梢血中,从而使针对脑梗塞、心肌梗塞、骨折、皮肤溃疡等伴随着组织损伤的难治性疾病的新的治疗方法成为可能。另外,动员到末梢血中的细胞能够与通常的采血方法同样采集,因此与迄今为止为了治疗脑梗塞而从骨髓进行采集的以往的方法相比,是简便且安全的骨髓来源的组织干细胞的采集方法。
[参考例1]
目的:皮肤提取液中HMGB1家族的鉴定和骨髓间充质干细胞诱导活性的研究
方法:使用Western blot法确认新生小鼠皮肤提取液中是否含有HMGB蛋白家族。作为样品,将从400只新生小鼠获得的游离皮片浸渍到生理性磷酸缓冲液pH7.4(PBS)400ml内,在4℃下孵育24小时后,为了除去组织,在4℃的条件下以440G离心10分钟,回收上清液,使用SDS-PAGE法对得到的皮肤提取液10μl进行电泳,使用印迹装置(ATTO)将凝胶中分离的蛋白转移到PVDF膜上。用含有3%脱脂乳的0.1%Tween 20的PBS(S-T-PBS)在室温下孵育1小时,然后使其分别与用S-T-PBS稀释至1000倍的兔抗小鼠HMGB1抗体、兔抗小鼠HMGB2抗体、兔抗小鼠HMGB3抗体在4℃下反应16小时。反应后,将该PVDF膜用S-T-PBS洗涤5分钟,5次,然后将该PVDF膜使用用S-T-PBS稀释2000倍的过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(GE Healthcare)在25℃下孵育1小时。然后用S-T-PBS洗涤5分钟、5次,然后使ECL Western Blotting Detection System(GE Healthcare)与该PVDF膜反应,在使ECL胶片感光后进行显影,检测HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质的存在情况。
使用Trizol(invitrogen)从新生小鼠皮肤提取RNA,然后使用SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板,使用PCR(聚合酶链反应)法对HMGB1、HMGB2、和HMGB3的cDNA进行扩增,将其***哺乳类细胞的表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中,以使在氨基酸序列的N末端添加了Flag tag(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys;序列号:18)的蛋白质表达。将这些质粒载体基因导入HEK293(人胎肾细胞来源的培养细胞株),培养48小时使蛋白质表达。将分别表达HMGB1、HMGB2、和HMGB3蛋白质的细胞和培养上清液在4℃下孵育16小时,然后以4400g离心5分钟,回收上清液。将该上清液每50mL与100μL的Anti Flag抗体Gel(Sigma)混合,在4℃下孵育16小时。离心回收Gel,然后用PBS洗涤5次。然后使用3X Flag peptide(final 100μg/ml)进行洗脱。用使用了用S-T-PBS稀释1000倍的小鼠抗Flag抗体、和用S-T-PBS稀释2000倍的过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体(GE Healthcare)的Western blot法确认重组蛋白的表达。使用boyden小室评价这些纯化重组蛋白对小鼠骨髓间充质干细胞的迁移活性。另外,为了观察HMGB家族在体内的药效,将8周龄C57BL/6小鼠的背部皮肤切出直径为8μm的圆形,从而制作皮肤溃疡模型,然后将纯化的HMGB1、HMGB2、HMGB3各(100ng/μL)与1g/100mL PBS的浓度的透明质酸溶液分别等量混合,然后将100μL给予溃疡面。为了使溃疡面不发生干燥,用粘着性透明创伤覆盖/保护材料Tegaderm(3M Healthcare)覆盖,测量经时的创伤面积,从而测定治愈效果。
此外,为了研究人皮肤提取液和人纯化HMGB1是否具有使人骨髓间充质干细胞迁移的活性,使用boyden小室进行评价。将面积为1cm2的人皮肤浸渍到1ml的PBS中,在4℃的条件下孵育16小时,然后在4℃的条件下以440G离心10分钟。仅回收上清液,将其用作人皮肤提取液。另外,加入boyden小室的上部的细胞使用人骨髓间充质干细胞(Cambrex公司)。(该细胞使用流式细胞仪进行细胞表面抗原的分析的结果为CD105阳性、CD166阳性、CD29阳性、CD44阳性、CD34阴性、CD45阴性。此外,在分化诱导试验中,向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞的分化为阳性。)另外,在小室下部加入100ng/well人HMGB1(R&D公司)和用PBS稀释10倍的人皮肤提取液,使用PBS作为对照。
结果:Western blot的结果为,除了HMGB1的条带以外还检测到HMGB2和HMGB3的条带。因此确认,新生小鼠皮肤提取液中在除HMGB1之外还含有家族蛋白质的HMGB2和HMGB3(图6)。制作分别在蛋白质的N末端添加了Flag tag的HMGB1、HMGB2、HMGB3的表达载体(图1)。将表达载体基因导入HEK293细胞,在使用Flag tag将表达的蛋白质纯化后,使用Western blot法对蛋白质进行确认(图7)。对使用了这些纯化蛋白质的小鼠骨髓间充质干细胞的迁移活性进行测定,结果确认了任一蛋白质均具有活性(图8)。每7天测量在小鼠背部制作的溃疡面积,结果与非治疗组相比,HMGB1、2和3的治疗组具有显著的溃疡面积缩小的效果(图9)。从而可知与小鼠的情况同样地,人HMGB1和人皮肤提取液也具有使人骨髓间充质干细胞迁移的活性(图10)。
讨论:作为与HMGB1同源性高的蛋白质,已知有HMGB2和HMGB3。期待这些蛋白质也具有与HMGB1同样的性质。这里,确认了从游离皮片提取液中获得了HMGB1的家族即HMGB2和HMGB3。此外,制作了HMGB1、HMGB2、HMGB3的重组蛋白,确认了在体外的骨髓间充质干细胞迁移活性,并确认了在体内的皮肤溃疡的治疗效果。可知新生小鼠游离皮片中的HMGB家族(HMGB1、HMGB2、HMGB3)和重组HMGB家族具有骨髓间充质干细胞诱导活性和将骨髓来源的能够分化为上皮系的干细胞诱导到局部的活性,并且,这些被诱导的骨髓来源的细胞群在损伤组织中能够分化为表皮角质形成细胞、毛囊和成纤维细胞等各种各样的细胞,从而具有促进损伤组织愈合的效果。另外,骨髓间充质干细胞由于是多能干细胞,因此相信对于其他组织损伤状态例如脑损伤、心肌梗塞、骨折等组织损伤的治疗也可期待具有与全身给予或局部给予HMGB家族同样的治疗效果。
另外可知,人与小鼠的各自构成HMGB1的氨基酸序列具有98%(213/215)的同源性,各自构成HMGB2的氨基酸序列具有96%(202/210)的同源性,各自构成HMGB3的氨基酸序列具有97%(195/200)的同源性。因此认为,人的HMGB具有与小鼠的HMGB同样的活性,根据该结果,可知人的皮肤提取液、HMGB1与小鼠的皮肤提取液、HMGB1同样地具有诱导骨髓间充质干细胞的活性。
[参考例2]
目的:建立骨髓间充质干细胞诱导因子组织提取液的制作方法
方法:将一只6周龄C57BL6的脑、心脏、肠、肾脏、肝脏和一只新生小鼠的皮肤浸渍到生理性磷酸缓冲液pH7.4(PBS)1ml内,在4℃下孵育24小时后,为了除去组织,在4℃的条件下以440G离心10分钟,回收上清液,从而获得组织提取液。为了确认得到的提取液中存在骨髓间充质干细胞诱导活性,使用boyden小室研究骨髓来源的间充质干细胞的迁移活性。另外,使用HMGB1 ELISA kit(Shino-Test)测量相同的样品中所含的HMGB1的浓度。然后,使脑、心脏和皮肤的组织提取液结合于肝素亲和层析柱,使用boyden小室确认结合级分的蛋白质的骨髓间充质干细胞诱导活性。
结果:小鼠脑提取液中含有与新生小鼠皮肤提取液等同的HMGB1。此外,小鼠脑的骨髓间充质干细胞的诱导活性也与皮肤同样地得到确认。小鼠肠提取液和小鼠心脏提取液中几乎不含有HMGB1,但也可见有骨髓间充质干细胞的诱导活性。另外,小鼠脑、小鼠心脏的肝素柱结合级分与小鼠皮肤的肝素柱结合级分同样地具有诱导骨髓间充质干细胞的活性(图11)。表1示出了测定小鼠各组织提取液的HMGB1浓度与骨髓间充质干细胞的诱导活性的结果。
表1
HMGB1浓度(ng/mL) | 骨髓间充质干细胞诱导活性 | |
皮肤 | 110 | 有 |
脑 | 140 | 有 |
心脏 | 4 | 有 |
肠 | 0 | 有 |
肾脏 | 115 | ND |
肝脏 | 61 | ND |
ND:未实施
讨论:本发明开发出了仅通过将不仅仅是皮肤而且包括脑的器官浸渍到生理性缓冲液中这样简便的方法来简便地提取HMGB1的方法。该方法对于其他器官例如肝脏或肾脏也是同样的。另外,尽管从心脏或肠获得的提取液虽然几乎不含有HMGB1,但也可见骨髓间充质干细胞诱导活性。这认为是由于提取液中含有与HMGB1不同的其他骨髓间充质干细胞诱导物质。这些提取液中所含的物质本来即存在于各组织中,在生理上当组织损伤时将骨髓间充质干细胞诱导到损伤组织。本发明开发出了从各种器官功能性地且简便地提取含有HMGB1的多种骨髓间充质干细胞诱导物质的新的方法。此外,为了纯化从组织提取液获得的骨髓间充质干细胞诱导物质,开发出了使其与肝素柱结合的方法。另外,这些具有骨髓间充质干细胞诱导活性的成分能够通过与皮肤同样的方法采用肝素柱进行纯化,从脑或心脏获得的成分也同样。
〔参考例3〕
目的:建立从培养细胞提取间充质干细胞迁移活性物质的方法。
方法:将人胎肾来源的培养细胞株HEK293和人子***细胞株HeLa分别在含有10%胎牛血清的D-MEM(Nacalai公司制)中培养。将各细胞用PBS洗涤后,将细胞107个浸渍到4℃的5ml的PBS(Nacalai公司制)中16小时。以重力加速度为440G在4℃下离心5分钟,回收上清液。在boyden小室的上层加入人骨髓间充质干细胞,在下层加入用DMEM稀释了5倍的细胞提取液,确认人骨髓间充质干细胞迁移活性。
结果:HEK293提取液、HeLa提取液同样地均显示使骨髓间充质干细胞迁移的活性(图12)。
讨论:本发明通过将培养细胞浸渍到PBS中这样的简便方法成功地提取了使骨髓间充质干细胞迁移的活性物质。
〔参考例4〕
目的:制作小鼠脑缺损模型,通过将皮肤提取液肝素柱纯化级分缓释地给予局部损伤部位,使自身骨髓系中所含的干细胞迁移到局部损伤部位,从而来研究是否能够诱导神经***细胞的再生。
方法:
(1)皮肤提取液肝素柱纯化级分的制作
将切除的新生小鼠皮肤在PBS(一只/ml)中在4℃下孵育16小时,将从中提取的皮肤提取液用4℃的9倍容积的20mM磷酸缓冲液pH 7.5稀释到10倍。预先使20mM磷酸缓冲液pH 7.5(30ml)流入HiTrap HepalinHP column(柱容量:5ml、GE Healthcare)中,使柱平衡。然后,使稀释液与柱结合。具后,用20mM磷酸缓冲液pH 7.5、100mM NaCl(30ml)对柱进行洗涤。向柱内加入20mM磷酸缓冲液pH 7.5、1000mM NaCl以将吸附的蛋白质洗脱,将洗脱液分级到管中。使用boyden小室法分别评价吸附级分的小鼠骨髓来源的细胞株的迁移活性,收集具有迁移能力的级分。将该具有活性的溶液作为皮肤提取液肝素纯化级分用于以下的参考例中。
(2)骨髓抑制小鼠的制作
对小鼠进行10Gy的X射线单次照射,制成骨髓抑制小鼠。
(3)向骨髓抑制小鼠的GFP小鼠骨髓移植
从GFP小鼠的两侧大腿骨和下腿骨采集骨髓细胞。将其从照射后24小时的骨髓抑制小鼠的尾静脉给予。其中,给予是在异氟醚吸入麻醉下进行的。
(4)小鼠脑损伤(脑组织缺损)模型的制作
对移植了GFP小鼠的骨髓细胞的骨髓抑制小鼠用异氟醚进行吸入麻醉,向腹腔内注入戊巴比妥(45mg/kg)。将小鼠固定到脑定位固定装置,用手术刀从头部正中切开。在距前囟的右外侧2.5mm、前方1mm处用钻头进行头部穿孔(图13A)。在该部位以深度为3mm的位置为前端,***并固定20G Surflow针的外筒。这里,使用注射器并施加负压,以吸引部分脑组织(图13B)。
(5)皮肤提取液肝素柱纯化级分向脑组织缺损部的给予
在上述位置,使用Hamilton注射器和26G注射器,注入溶解于纤维蛋白胶制剂(纤维蛋白原)(Bolheal(化血研))的皮肤提取液肝素柱纯化级分5μl,接着注入纤维蛋白胶制剂(凝血酶)(Bolheal(化血研))5μl(图13C)。通过该操作,获得皮肤提取液肝素柱纯化级分作为缓释剂的效果。
(6)脑组织缺损部的神经***细胞再生效果的评价
使用对照组和治疗组的小鼠进行评价。确定适当的经过设定(经时地),将小鼠用4%多聚甲醛灌流固定后,将脑切出。然后,用4%多聚甲醛外固定。在用15%和30%梯度的蔗糖脱水后,制成冷冻切片。
用DAPI(4′,6-Diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride)溶液进行核染色,使用光漂白防止剂进行封固。用激光共聚焦显微镜评价损伤部位(脑组织缺损部)的GFP阳性细胞的聚集。
结果:定性地显示给予后的2周和6周后的GFP阳性细胞聚集情况。在2周后(对照:图13D,皮肤提取液肝素柱纯化级分:图13E)和6周后(对照:图13F,皮肤提取液肝素柱纯化级分:图13G),与对照组相比,治疗组的损伤部位具有GFP阳性细胞的聚集更多的倾向。
讨论:通过给予皮肤提取液肝素柱纯化级分,骨髓来源的细胞聚集于脑组织缺损部位并显示神经细胞的形态。已知骨髓来源的间充质干细胞能够分化为神经细胞,从本结果证明皮肤提取液肝素柱纯化级分能够诱导脑损伤部位的神经***细胞再生。另外,其也能够用于脑缺血性疾病或脑挫伤中的脑组织障碍部位的神经再生。
产业上的可利用性
本发明提供了针对脑梗塞、心肌梗塞、骨折、皮肤溃疡等伴随着组织损伤的难治性疾病的新的治疗方法。另外,由于动员到末梢血中的细胞能够与通常的采血方法同样采集,因此与迄今为止为了治疗脑梗塞而从骨髓进行采集的以往的方法相比,本发明使简便且安全的骨髓来源的组织干细胞的采集方法成为可能。
Claims (6)
1.一种被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂,其含有以下的(a)~(i)中任一项记载的成分;
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)***有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)***有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)***有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体。
2.一种被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂,其含有通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的细胞或组织的提取液。
3.一种被给予到血管或肌肉中的用于将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂,其含有通过包含以下工序的方法制造的肝素结合级分;
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序
(b)使通过工序(a)获得的提取液与固定化肝素接触的工序,和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的工序。
4.一种评价细胞或组织的提取液中是否含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的方法,其包含以下工序,其中,当在工序(b)中的将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的活性比对照的活性高时,则判定细胞或组织的提取液中含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子;
(a)制备细胞或组织提取液的工序,和
(b)测定通过工艺(a)制备的提取液的将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的活性的工序。
5.一种对含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的细胞或组织提取液进行筛选的方法,其包含以下工序;
(a)对于多个提取液,通过权利要求5所述的方法评价该提取液中是否含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的工序,和
(b)选择在工序(a)中被评价为含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的提取液的工序。
6.一种将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的鉴定方法,其包含下述工序:从通过权利要求4或5所述的方法被判定为含有将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子的提取液中,以将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的活性为指标,对将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的因子进行纯化。
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