JPWO2007102410A1 - Rageポリペプチドの新規用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、グラム陰性菌関連疾患治療薬または予防薬のスクリーニング方法、グラム陰性菌検出方法、グラム陰性菌収集方法、および、LPSショックの治療剤または予防剤を提供することを目的とする。本発明は、RAGEポリペプチドとリポポリサッカライドとの結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質のグラム陰性菌関連疾患治療薬または予防薬としての効果を評価する方法;RAGEポリペプチドと被検試料とを接触させ、RAGEポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法;RAGEポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をRAGEポリペプチドと結合させることにより試料中のグラム陰性菌を収集する方法;ならびにRAGEポリペプチドを含有するLPSショックの治療剤または予防剤に関する。
Description
本発明は、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法、グラム陰性菌の検出方法、グラム陰性菌の収集方法、および、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤に関する。
膜結合型RAGE(Receptor for advanced gylcation endproducts)は、Sternらのグループにより、AGE(advanced gylcation endproducts,後期糖化反応生成物)の細胞表面特異受容体として分離されその一次構造が決定された(非特許文献1)。膜結合型RAGEは、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する1回膜貫通型の受容体で、V,C1,C2の3つのイムノグロブリンドメインからなる細胞外領域と短い細胞内領域とを有する。膜結合型RAGEにAGEが結合すると、活性酸素種の産生を経て転写因子NFκBの活性化を引き起こし、血管障害性の遺伝子群の活性化をおこすと考えられている。
本発明者らのグループは、ヒトの生体内に、膜結合型RAGEのスプライシングバリアントで膜貫通領域を有しない可溶性RAGEが天然に存在することを見出し、特許出願している(特許文献1)。当該可溶性RAGEは内在性分泌型RAGE(esRAGE)と称される。
一方、リポポリサッカライドはグラム陰性菌の外表面における主要な成分として知られている(非特許文献2)。
これまでにRAGEポリペプチドの機能に関しては種々の報告がある(非特許文献3および4)。しかしながら、RAGEポリペプチドとリポポリサッカライドとの結合に関する報告はなされていない。
特開2003−12586号公報
J.Biol.Chem.267:14998−15004(1992)
Carbohydrate Research 338:2431−2447(2003)
J.Clin.Invest.113:1641−1650(2004)
J.Clin.Invest.115:1267−1274(2005)
本発明者らのグループは、ヒトの生体内に、膜結合型RAGEのスプライシングバリアントで膜貫通領域を有しない可溶性RAGEが天然に存在することを見出し、特許出願している(特許文献1)。当該可溶性RAGEは内在性分泌型RAGE(esRAGE)と称される。
一方、リポポリサッカライドはグラム陰性菌の外表面における主要な成分として知られている(非特許文献2)。
これまでにRAGEポリペプチドの機能に関しては種々の報告がある(非特許文献3および4)。しかしながら、RAGEポリペプチドとリポポリサッカライドとの結合に関する報告はなされていない。
本発明は、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法、グラム陰性菌の検出方法、グラム陰性菌の収集方法、および、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤を提供することを目的とする。
本発明者らは膜結合型または可溶型のRAGEポリペプチドが、リポポリサッカライドと結合することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の発明を包含する。
(1)Receptor for advanced gylcation endproducts(RAGE)ポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する方法。
(2)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する増強的効果に基づいて該被検物質を評価することを特徴とする、(1)記載の方法。
(3)下記の工程を含む(1)または(2)記載の方法:
1)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と、被検物質とを混合し、該混合物中における、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量(A)を測定する、
2)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌とを混合し、該混合物中における、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量(B)を測定する、
3)結合量(A)と結合量(B)との相違に基づき、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する。
(4)被検試料中のグラム陰性菌を検出する方法であって、
RAGEポリペプチドと被検試料とを接触させ、RAGEポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法。
(5)RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用試薬。
(6)RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用キット。
(7)試料中のグラム陰性菌を収集する方法であって、
RAGEポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をRAGEポリペプチドと結合させる工程を含む方法。
(8)RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用試薬。
(9)RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用キット。
(10)RAGEポリペプチドを含有する、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006−49312号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明者らは膜結合型または可溶型のRAGEポリペプチドが、リポポリサッカライドと結合することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の発明を包含する。
(1)Receptor for advanced gylcation endproducts(RAGE)ポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する方法。
(2)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する増強的効果に基づいて該被検物質を評価することを特徴とする、(1)記載の方法。
(3)下記の工程を含む(1)または(2)記載の方法:
1)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と、被検物質とを混合し、該混合物中における、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量(A)を測定する、
2)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌とを混合し、該混合物中における、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量(B)を測定する、
3)結合量(A)と結合量(B)との相違に基づき、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する。
(4)被検試料中のグラム陰性菌を検出する方法であって、
RAGEポリペプチドと被検試料とを接触させ、RAGEポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法。
(5)RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用試薬。
(6)RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用キット。
(7)試料中のグラム陰性菌を収集する方法であって、
RAGEポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をRAGEポリペプチドと結合させる工程を含む方法。
(8)RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用試薬。
(9)RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用キット。
(10)RAGEポリペプチドを含有する、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006−49312号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図1は、LPSとRAGEの結合曲線(ビアコア法)を示す。LPSの濃度は、図1の上から順に20、10、5、2.5、1.25ng/mlである。LPSの平均分子量を50,000と想定した。
図2は、AGE−RAGE結合阻害曲線(プレート法)を示す。
図3は、LPS−RAGE相互作用を示す。
図4は、RAGE+/+野生型マウス、RAGE−/−ノックアウトマウスにおけるLPS投与時の生存率の、マウスsRAGE処置の有無による相違を示す図である。
図2は、AGE−RAGE結合阻害曲線(プレート法)を示す。
図3は、LPS−RAGE相互作用を示す。
図4は、RAGE+/+野生型マウス、RAGE−/−ノックアウトマウスにおけるLPS投与時の生存率の、マウスsRAGE処置の有無による相違を示す図である。
(RAGEポリペプチド)
本発明において「Receptor for advanced gylcation endproducts(RAGE)ポリペプチド」とは、advanced gylcation endproducts(AGE,後期糖化反応生成物)の受容体として機能しうるすべてのポリペプチドを意味し、天然物であっても、天然物の変異体であっても、人為的に合成されたものであってもよい。
天然に存在するRAGEポリペプチドとしては、ヒト、マウス、ラット、ウシなどの哺乳動物に由来するものが挙げられる。天然に存在するRAGEポリペプチドには膜結合型のものと可溶型のものが存在するが、本発明には両者とも好適に使用できる。天然に存在する可溶型RAGEポリペプチドには、内在性分泌型RAGE(esRAGE)と呼ばれるポリペプチドが包含される。また、天然に存在する膜結合型RAGEポリペプチドを人為的に可溶性に改変したものもまた同様に使用できる。本発明には、AGEを受容しうるポリペプチドである限り、天然に存在するRAGEポリペプチドの変異体や、天然に存在するRAGEポリペプチドの部分ポリペプチドや、当該部分ポリペプチドの変異体などもまた好適に使用できる。
本発明においてRAGEポリペプチドとして好適に使用可能な、天然に存在するRAGEポリペプチドとしては、配列番号1のアミノ酸配列で表されるヒト由来膜結合型RAGEポリペプチド、配列番号2のアミノ酸配列で表されるヒト由来esRAGEポリペプチド、配列番号3のアミノ酸配列で表されるマウス由来膜結合型RAGEポリペプチド、配列番号4のアミノ酸配列で表されるマウス由来esRAGEポリペプチド、配列番号5のアミノ酸配列で表されるラット由来膜結合型RAGEポリペプチド、および、配列番号6のアミノ酸配列で表されるウシ由来膜結合型RAGEポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1種が挙げられる。本発明には、配列番号1,2,3,4,5,および6からなる群から選択される1つにより表されるアミノ酸配列において1〜数個(例えば、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、最も好ましくは1〜3個)のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつAGEを受容しうるポリペプチドもまたRAGEポリペプチドとして好適に使用可能である。
本発明においてRAGEポリペプチドとして好適に使用可能な、天然に存在するRAGEポリペプチドの部分配列としては、配列番号1のCys38〜Cys99のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号1のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは62であるポリペプチド)、配列番号2のCys38〜Cys99のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号2のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは62であるポリペプチド)、配列番号3のCys38〜Cys98のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号3のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは61であるポリペプチド)、配列番号4のCys38〜Cys98のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号4のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは61であるポリペプチド)、配列番号5のCys38〜Cys98のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号5のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは61であるポリペプチド)、および、配列番号6のCys38〜Cys98のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号6のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは61であるポリペプチド)からなる群から選択される少なくとも1種が挙げられる。
本発明には、前段落で言及した部分ポリペプチドのアミノ酸配列において1〜数個(例えば、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、最も好ましくは1〜3個)のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつAGEを受容しうるポリペプチドもまたRAGEポリペプチドとして好適に使用可能である。
本発明に用いるRAGEポリペプチドの調製方法は特に限定されず、例えば、通常のクローニング法を用いた発現法により調製してもよいし、天然物から単離することにより調製してもよいし、市販品を購入して使用してもよい。
本明細書において、「RAGEポリペプチド」を「RAGE」と、「esRAGEポリペプチド」を「esRAGE」とそれぞれ称する場合があるが、同義である。
(グラム陰性菌)
本発明における「グラム陰性菌」としては、具体的には、腸内細菌科(Citrobacter属(Citrobacter freundii等)、Enterobacter属(Enterobacter cloacae complex等)、Escherichia属(Escherichia coli等),Klebsiella属(Klebsiella pneumoniae等)、Proteus属(Proteus mirabilis等)、Salmonella属(Salmonella cholerasuis等)、Serratia属(Serratia marcescens等)、Shigella属(Shigella dysenteriae等)、Yersina属(Yersinia pestis等)等)、クラミジア科(Chlamydia属(Chlamydia trachomatis等)等)、コクシエラ科(Coxiella属(Coxiella burnetii等)等)、レジオネラ科(Legionella属(Legionella pneumophila等)等)、パスツレラ科(Haemophilus属(Haemophilus influenzae等)、Pasteurella属(Pasteurella multocida等)等)、Fusobacterium科(Fusobacterium属(Fusobacterium nucleatum等)等)、Bartonella科、Brucella科、Rickettsia科(Rickettsia属(Rickettsia rickettsii等)、Orientia属(Orientia tsutsugamushi等)等)、Moraxella科(Acinetobacter属(Acinetobacter baumannii等)、Branhamella属、Moraxella属等)、Pseudomonas科(Pseudomonas属(Pseudomonas aeruginosa等)等),Vibrio科(Vibrio属(Vibrio cholerae等)等)、Neiserria科(Neisseria属(Neisseria meningitidis等)、Kingella属(Kingella denitrificans等)等)、スピロヘータ科(Borrelia属(Borrelia burgdorferi等)、Treponema属(Treponema pallidum等)等)が挙げられるが、これらには限定されない。
(グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法)
実施例に記載の通り、RAGEポリペプチドとリポポリサッカライドとは結合することができる。したがって、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価することが可能である。ここで「グラム陰性菌関連疾患」とは、グラム陰性菌の感染により引き起こされる疾患を意味する。
細胞膜上に存在する膜結合型RAGEポリペプチドと異なり、可溶型RAGEポリペプチドは細胞外に存在する。可溶型RAGEポリペプチドは細胞外でリガンドを捕捉することにより、リガンドと膜結合型RAGEポリペプチドとの結合を阻害するデコイ型レセプターとしての役割を持つと考えられる。つまり、可溶型RAGEポリペプチドは、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と膜結合型RAGEとの結合により生じる強い炎症反応を軽減させる働きがあると考えられる。さらに、それに加えて可溶型RAGEポリペプチドは、理論的には、膜結合型RAGE以外のレセプターを介する炎症反応をも軽減させうる可能性がある。RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合を増強する作用を有する物質が、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌が存在する体内に投与されると、可溶型RAGEポリペプチドがリポポリサッカライドまたはグラム陰性菌に結合し、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌による炎症反応は生じにくくなるものと考えられる。従って、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合を増強する作用を有する物質は、グラム陰性菌が細胞膜上に存在する膜結合型RAGEポリペプチドに結合することにより生じる疾患のみならずリポポリサッカライドまたはグラム陰性菌によって引き起こされるあらゆる疾患の治療薬または予防薬として有用であると考えられる。
本発明のこの実施形態においてリポポリサッカライドを使用する場合は、当該リポポリサッカライドは、スクリーニングされるべき治療薬または予防薬が対象とする疾患の原因となるグラム陰性菌から単離されたものであることが好ましいが、それには限定されない。リポポリサッカライドとしては市販品を使用することもでき、市販品としては例えば大腸菌O111:B4、大腸菌O55:B5、大腸菌O127:B8,大腸菌O128:B12,大腸菌O26:B6,大腸菌K−235,Klebsiella pneumoniae,Pseudomonas aeruginosa 10,Salmonella enterica serotype abortus equi,Salmonella enterica serotype enteritidis,Salmonella enterica serotype minnesota,Salmonella enterica serotype typhimurium,Salmonella typhosa,またはSerratia marcescensに由来するリポポリサッカライド(以上すべてシグマ社)が挙げられる。
本発明のこの実施形態においてグラム陰性菌を使用する場合は、当該グラム陰性菌は、スクリーニングされるべき治療薬または予防薬が対象とする疾患の原因となるグラム陰性菌であることが好ましいが、それには限定されない。グラム陰性菌の具体例は上述の通りである。
本発明に係る、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法は、典型的には次の3つの工程を含む。
1)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と、被検物質とを混合し、該混合物中における、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量(A)を測定する、
2)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌とを混合し、該混合物中における、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量(B)を測定する、
3)結合量(A)と結合量(B)との相違に基づき、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する。
結合量(A)または(B)の測定方法は、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に伴う物理量の変化を検出することができる方法であればいずれの方法であってもよい。例えば、表面プラズモン共鳴センサーを用いる方法、イムノアッセイ、細胞膜上のRAGEポリペプチドへのリガンド結合により生じるシグナル伝達を検出する方法(例えば実施例に示すNFκB−ルシフェラーゼアッセイ)など種々の方法が利用できる。
この方法において、RAGEポリペプチド、またはリポポリサッカライドもしくはグラム陰性菌は、必要に応じて、固相担体に固定化された形態で用いることができる。このとき、使用できる固相担体とは、結合させる反応系で溶媒に不溶な担体であれば、その材質及び形状は特に制限されず、公知の固相担体が使用できる。固相担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すれば良く、例えば、テストプレート状、ビーズ状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が挙げられる。また、その材質としては、通常のイムノアッセイ用担体として用いられるもの、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等の合成樹脂、または、これらに公知の方法によりスルホン酸基、アミノ基などの反応性官能基を導入したもの、ガラス、多糖類、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等が例示できる。
固相担体へのRAGEポリペプチド等の固定化方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用できる。
イムノアッセイに用いる標識物質としては、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、補酵素、あるいはラジオアイソトープ等が挙げられる。なかでも、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼのような酵素標識は、安全性や経済性に優れ、しかも必要な感度を比較的容易に達成できる上で好ましい。標識物質は、RAGEポリペプチドや、抗RAGEポリペプチド抗体や、該抗体に対する二次抗体に直接結合して標識することができる。あるいは標識物質を認識する抗体やアビジン−ビオチン系などを利用して間接標識することもできる。
本発明のこの形態において「被検物質」は特に限定されず、天然化合物であっても、合成化合物であっても、それらの混合物であってもよい。
(グラム陰性菌の検出方法)
本発明の第二の形態は、被検試料中のグラム陰性菌を検出する方法であって、RAGEポリペプチドと被検試料とを接触させ、RAGEポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法に関する。この方法は、例えば、食品試料中に、食中毒の原因となる大腸菌などのグラム陰性菌が含まれるか否かを定性的に判別したり、食品試料中のグラム陰性菌の存在量を定量的に測定したりする目的で使用できる。
RAGEポリペプチドとグラム陰性菌との結合は、上記と同様にして測定できる。
本発明はまた、RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用試薬に関する。
当該試薬は、必要な他の試薬とともにキット化することもできる。例えばイムノアッセイ用の試薬キットの場合は、構成試薬として、例えばRAGEポリペプチド、蛍光標識した抗RAGEポリペプチド抗体などを含有する。RAGEポリペプチドは予め固相担体に固定化されていてもよく、あるいは使用時に固相担体に固定化する形態であってもよい。この場合、試薬キットに、RAGEポリペプチドを固定化するための固相担体が含まれていてもよい。また、凝集反応用の試薬キットの場合は、RAGEポリペプチドを固定化した担体粒子を含有することができる。
上記の構成試薬の他に、標準試料、緩衝液、溶解液、洗浄液、反応停止液、使用説明書などが含まれていてもよい。上記各構成試薬は、懸濁液、溶液、または凍結乾燥品の形態とすることができる。
また、RAGEポリペプチドは、それを高密度に貼り付けたプロテインチップ(プロテインアレイ)としてよく、このようなプロテインチップも本発明のキットに含まれる。この場合、キットには、質量分析計、測定・解析に必要なソフト、該ソフトを導入したコンピューターなどが含まれていてよい。
(グラム陰性菌の収集方法)
本発明の第三の形態は、試料中のグラム陰性菌を収集する方法であって、RAGEポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をRAGEポリペプチドと結合させる工程を含む方法に関する。本方法は試料中のグラム陰性菌を単離または濃縮する目的で使用することができる。
本発明のこの形態では、RAGEポリペプチドは予め固相担体に固定化されていているか、あるいは使用時に固相担体に固定化する形態であることが好ましい。このとき、使用できる固相担体とは、結合させる反応系で溶媒に不溶な担体であれば、その材質及び形状は特に制限されず、公知の固相担体が使用できる。固相担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すれば良く、例えば、テストプレート状、ビーズ状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が挙げられる。また、その材質としては、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等の合成樹脂、または、これらに公知の方法によりスルホン酸基、アミノ基などの反応性官能基を導入したもの、ガラス、多糖類、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等が例示できる。固相担体へのRAGEポリペプチド等の固定化方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用できる。
典型的な実施形態としては、例えばRAGEポリペプチドを表面に固定化したビーズをカラムに充填し、充填後のカラムにグラム陰性菌を含有する試料を流し、試料中のグラム陰性菌をビーズ上のポリペプチドに捕捉する方法が挙げられるがこれには限定されない。
本発明はまた、RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用試薬に関する。
当該試薬は、必要な他の試薬とともにキット化することもできる。当該試薬またはキットにおいて、RAGEポリペプチドは予め固相担体に固定化されているか、あるいは使用時に固相担体に固定化する形態であることが好ましいことは上記の通りである。試薬キットには、RAGEポリペプチドを固定化するための固相担体が含まれていてもよい。
上記の構成試薬の他に、緩衝液、溶解液、洗浄液、反応停止液、使用説明書などが含まれていてもよい。上記各構成試薬は、懸濁液、溶液、または凍結乾燥品の形態とすることができる。
また、RAGEポリペプチドは、それを高密度に貼り付けたプロテインチップ(プロテインアレイ)としてよく、このようなプロテインチップも本発明のキットに含まれる。この場合、キットには、質量分析計、測定・解析に必要なソフト、該ソフトを導入したコンピューターなどが含まれていてよい。
(リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤)
グラム陰性菌が有するリポポリサッカライドは、ヒトなどの哺乳動物の体内で急激な炎症(ショック症状)を惹起することが知られている。本発明者らは、RAGEポリペプチドを投与することにより、この症状が緩和できることを見出した。すなわち、本発明の第四の形態は、RAGEポリペプチドを含有する、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤に関する。本発明はまた、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療または予防方法であって、当該炎症の治療または予防を必要とする対象(典型的にはヒト)に、有効量のRAGEポリペプチドを投与する工程を含む前記方法に関する。本発明はまた、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤の製造におけるRAGEポリペプチドの使用に関する。
本発明のこの実施形態ではRAGEポリペプチドは血中に可溶性のものであることが好ましく、例えばヒト等に由来する内在性分泌型RAGE(esRAGE)ポリペプチドが好ましい。
投与形態は経口投与または非経口投与のいずれであってもよいが、急激なショック症状を迅速に緩和するためには非経口投与が好ましい。
製剤形態への調製は、常法に従って行うことができ、その際に利用できる担体や賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、希釈剤も、慣用されている各種のものから適宜選択することができる。形態には、特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、経鼻剤、経腸剤、貼付剤、軟膏剤等の非経口剤として製剤化される。
RAGEポリペプチドの投与量は有効量であれば特に限定されないが、1日当たり0.1〜10mg/kg体重が好適といえる。
本発明において「Receptor for advanced gylcation endproducts(RAGE)ポリペプチド」とは、advanced gylcation endproducts(AGE,後期糖化反応生成物)の受容体として機能しうるすべてのポリペプチドを意味し、天然物であっても、天然物の変異体であっても、人為的に合成されたものであってもよい。
天然に存在するRAGEポリペプチドとしては、ヒト、マウス、ラット、ウシなどの哺乳動物に由来するものが挙げられる。天然に存在するRAGEポリペプチドには膜結合型のものと可溶型のものが存在するが、本発明には両者とも好適に使用できる。天然に存在する可溶型RAGEポリペプチドには、内在性分泌型RAGE(esRAGE)と呼ばれるポリペプチドが包含される。また、天然に存在する膜結合型RAGEポリペプチドを人為的に可溶性に改変したものもまた同様に使用できる。本発明には、AGEを受容しうるポリペプチドである限り、天然に存在するRAGEポリペプチドの変異体や、天然に存在するRAGEポリペプチドの部分ポリペプチドや、当該部分ポリペプチドの変異体などもまた好適に使用できる。
本発明においてRAGEポリペプチドとして好適に使用可能な、天然に存在するRAGEポリペプチドとしては、配列番号1のアミノ酸配列で表されるヒト由来膜結合型RAGEポリペプチド、配列番号2のアミノ酸配列で表されるヒト由来esRAGEポリペプチド、配列番号3のアミノ酸配列で表されるマウス由来膜結合型RAGEポリペプチド、配列番号4のアミノ酸配列で表されるマウス由来esRAGEポリペプチド、配列番号5のアミノ酸配列で表されるラット由来膜結合型RAGEポリペプチド、および、配列番号6のアミノ酸配列で表されるウシ由来膜結合型RAGEポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1種が挙げられる。本発明には、配列番号1,2,3,4,5,および6からなる群から選択される1つにより表されるアミノ酸配列において1〜数個(例えば、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、最も好ましくは1〜3個)のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつAGEを受容しうるポリペプチドもまたRAGEポリペプチドとして好適に使用可能である。
本発明においてRAGEポリペプチドとして好適に使用可能な、天然に存在するRAGEポリペプチドの部分配列としては、配列番号1のCys38〜Cys99のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号1のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは62であるポリペプチド)、配列番号2のCys38〜Cys99のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号2のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは62であるポリペプチド)、配列番号3のCys38〜Cys98のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号3のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは61であるポリペプチド)、配列番号4のCys38〜Cys98のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号4のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは61であるポリペプチド)、配列番号5のCys38〜Cys98のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号5のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは61であるポリペプチド)、および、配列番号6のCys38〜Cys98のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号6のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド(好ましくはアミノ酸残基数100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは70以下、最も好ましくは61であるポリペプチド)からなる群から選択される少なくとも1種が挙げられる。
本発明には、前段落で言及した部分ポリペプチドのアミノ酸配列において1〜数個(例えば、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、最も好ましくは1〜3個)のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつAGEを受容しうるポリペプチドもまたRAGEポリペプチドとして好適に使用可能である。
本発明に用いるRAGEポリペプチドの調製方法は特に限定されず、例えば、通常のクローニング法を用いた発現法により調製してもよいし、天然物から単離することにより調製してもよいし、市販品を購入して使用してもよい。
本明細書において、「RAGEポリペプチド」を「RAGE」と、「esRAGEポリペプチド」を「esRAGE」とそれぞれ称する場合があるが、同義である。
(グラム陰性菌)
本発明における「グラム陰性菌」としては、具体的には、腸内細菌科(Citrobacter属(Citrobacter freundii等)、Enterobacter属(Enterobacter cloacae complex等)、Escherichia属(Escherichia coli等),Klebsiella属(Klebsiella pneumoniae等)、Proteus属(Proteus mirabilis等)、Salmonella属(Salmonella cholerasuis等)、Serratia属(Serratia marcescens等)、Shigella属(Shigella dysenteriae等)、Yersina属(Yersinia pestis等)等)、クラミジア科(Chlamydia属(Chlamydia trachomatis等)等)、コクシエラ科(Coxiella属(Coxiella burnetii等)等)、レジオネラ科(Legionella属(Legionella pneumophila等)等)、パスツレラ科(Haemophilus属(Haemophilus influenzae等)、Pasteurella属(Pasteurella multocida等)等)、Fusobacterium科(Fusobacterium属(Fusobacterium nucleatum等)等)、Bartonella科、Brucella科、Rickettsia科(Rickettsia属(Rickettsia rickettsii等)、Orientia属(Orientia tsutsugamushi等)等)、Moraxella科(Acinetobacter属(Acinetobacter baumannii等)、Branhamella属、Moraxella属等)、Pseudomonas科(Pseudomonas属(Pseudomonas aeruginosa等)等),Vibrio科(Vibrio属(Vibrio cholerae等)等)、Neiserria科(Neisseria属(Neisseria meningitidis等)、Kingella属(Kingella denitrificans等)等)、スピロヘータ科(Borrelia属(Borrelia burgdorferi等)、Treponema属(Treponema pallidum等)等)が挙げられるが、これらには限定されない。
(グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法)
実施例に記載の通り、RAGEポリペプチドとリポポリサッカライドとは結合することができる。したがって、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価することが可能である。ここで「グラム陰性菌関連疾患」とは、グラム陰性菌の感染により引き起こされる疾患を意味する。
細胞膜上に存在する膜結合型RAGEポリペプチドと異なり、可溶型RAGEポリペプチドは細胞外に存在する。可溶型RAGEポリペプチドは細胞外でリガンドを捕捉することにより、リガンドと膜結合型RAGEポリペプチドとの結合を阻害するデコイ型レセプターとしての役割を持つと考えられる。つまり、可溶型RAGEポリペプチドは、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と膜結合型RAGEとの結合により生じる強い炎症反応を軽減させる働きがあると考えられる。さらに、それに加えて可溶型RAGEポリペプチドは、理論的には、膜結合型RAGE以外のレセプターを介する炎症反応をも軽減させうる可能性がある。RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合を増強する作用を有する物質が、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌が存在する体内に投与されると、可溶型RAGEポリペプチドがリポポリサッカライドまたはグラム陰性菌に結合し、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌による炎症反応は生じにくくなるものと考えられる。従って、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合を増強する作用を有する物質は、グラム陰性菌が細胞膜上に存在する膜結合型RAGEポリペプチドに結合することにより生じる疾患のみならずリポポリサッカライドまたはグラム陰性菌によって引き起こされるあらゆる疾患の治療薬または予防薬として有用であると考えられる。
本発明のこの実施形態においてリポポリサッカライドを使用する場合は、当該リポポリサッカライドは、スクリーニングされるべき治療薬または予防薬が対象とする疾患の原因となるグラム陰性菌から単離されたものであることが好ましいが、それには限定されない。リポポリサッカライドとしては市販品を使用することもでき、市販品としては例えば大腸菌O111:B4、大腸菌O55:B5、大腸菌O127:B8,大腸菌O128:B12,大腸菌O26:B6,大腸菌K−235,Klebsiella pneumoniae,Pseudomonas aeruginosa 10,Salmonella enterica serotype abortus equi,Salmonella enterica serotype enteritidis,Salmonella enterica serotype minnesota,Salmonella enterica serotype typhimurium,Salmonella typhosa,またはSerratia marcescensに由来するリポポリサッカライド(以上すべてシグマ社)が挙げられる。
本発明のこの実施形態においてグラム陰性菌を使用する場合は、当該グラム陰性菌は、スクリーニングされるべき治療薬または予防薬が対象とする疾患の原因となるグラム陰性菌であることが好ましいが、それには限定されない。グラム陰性菌の具体例は上述の通りである。
本発明に係る、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法は、典型的には次の3つの工程を含む。
1)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と、被検物質とを混合し、該混合物中における、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量(A)を測定する、
2)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌とを混合し、該混合物中における、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量(B)を測定する、
3)結合量(A)と結合量(B)との相違に基づき、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する。
結合量(A)または(B)の測定方法は、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に伴う物理量の変化を検出することができる方法であればいずれの方法であってもよい。例えば、表面プラズモン共鳴センサーを用いる方法、イムノアッセイ、細胞膜上のRAGEポリペプチドへのリガンド結合により生じるシグナル伝達を検出する方法(例えば実施例に示すNFκB−ルシフェラーゼアッセイ)など種々の方法が利用できる。
この方法において、RAGEポリペプチド、またはリポポリサッカライドもしくはグラム陰性菌は、必要に応じて、固相担体に固定化された形態で用いることができる。このとき、使用できる固相担体とは、結合させる反応系で溶媒に不溶な担体であれば、その材質及び形状は特に制限されず、公知の固相担体が使用できる。固相担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すれば良く、例えば、テストプレート状、ビーズ状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が挙げられる。また、その材質としては、通常のイムノアッセイ用担体として用いられるもの、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等の合成樹脂、または、これらに公知の方法によりスルホン酸基、アミノ基などの反応性官能基を導入したもの、ガラス、多糖類、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等が例示できる。
固相担体へのRAGEポリペプチド等の固定化方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用できる。
イムノアッセイに用いる標識物質としては、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、補酵素、あるいはラジオアイソトープ等が挙げられる。なかでも、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼのような酵素標識は、安全性や経済性に優れ、しかも必要な感度を比較的容易に達成できる上で好ましい。標識物質は、RAGEポリペプチドや、抗RAGEポリペプチド抗体や、該抗体に対する二次抗体に直接結合して標識することができる。あるいは標識物質を認識する抗体やアビジン−ビオチン系などを利用して間接標識することもできる。
本発明のこの形態において「被検物質」は特に限定されず、天然化合物であっても、合成化合物であっても、それらの混合物であってもよい。
(グラム陰性菌の検出方法)
本発明の第二の形態は、被検試料中のグラム陰性菌を検出する方法であって、RAGEポリペプチドと被検試料とを接触させ、RAGEポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法に関する。この方法は、例えば、食品試料中に、食中毒の原因となる大腸菌などのグラム陰性菌が含まれるか否かを定性的に判別したり、食品試料中のグラム陰性菌の存在量を定量的に測定したりする目的で使用できる。
RAGEポリペプチドとグラム陰性菌との結合は、上記と同様にして測定できる。
本発明はまた、RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用試薬に関する。
当該試薬は、必要な他の試薬とともにキット化することもできる。例えばイムノアッセイ用の試薬キットの場合は、構成試薬として、例えばRAGEポリペプチド、蛍光標識した抗RAGEポリペプチド抗体などを含有する。RAGEポリペプチドは予め固相担体に固定化されていてもよく、あるいは使用時に固相担体に固定化する形態であってもよい。この場合、試薬キットに、RAGEポリペプチドを固定化するための固相担体が含まれていてもよい。また、凝集反応用の試薬キットの場合は、RAGEポリペプチドを固定化した担体粒子を含有することができる。
上記の構成試薬の他に、標準試料、緩衝液、溶解液、洗浄液、反応停止液、使用説明書などが含まれていてもよい。上記各構成試薬は、懸濁液、溶液、または凍結乾燥品の形態とすることができる。
また、RAGEポリペプチドは、それを高密度に貼り付けたプロテインチップ(プロテインアレイ)としてよく、このようなプロテインチップも本発明のキットに含まれる。この場合、キットには、質量分析計、測定・解析に必要なソフト、該ソフトを導入したコンピューターなどが含まれていてよい。
(グラム陰性菌の収集方法)
本発明の第三の形態は、試料中のグラム陰性菌を収集する方法であって、RAGEポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をRAGEポリペプチドと結合させる工程を含む方法に関する。本方法は試料中のグラム陰性菌を単離または濃縮する目的で使用することができる。
本発明のこの形態では、RAGEポリペプチドは予め固相担体に固定化されていているか、あるいは使用時に固相担体に固定化する形態であることが好ましい。このとき、使用できる固相担体とは、結合させる反応系で溶媒に不溶な担体であれば、その材質及び形状は特に制限されず、公知の固相担体が使用できる。固相担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すれば良く、例えば、テストプレート状、ビーズ状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が挙げられる。また、その材質としては、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等の合成樹脂、または、これらに公知の方法によりスルホン酸基、アミノ基などの反応性官能基を導入したもの、ガラス、多糖類、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等が例示できる。固相担体へのRAGEポリペプチド等の固定化方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用できる。
典型的な実施形態としては、例えばRAGEポリペプチドを表面に固定化したビーズをカラムに充填し、充填後のカラムにグラム陰性菌を含有する試料を流し、試料中のグラム陰性菌をビーズ上のポリペプチドに捕捉する方法が挙げられるがこれには限定されない。
本発明はまた、RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用試薬に関する。
当該試薬は、必要な他の試薬とともにキット化することもできる。当該試薬またはキットにおいて、RAGEポリペプチドは予め固相担体に固定化されているか、あるいは使用時に固相担体に固定化する形態であることが好ましいことは上記の通りである。試薬キットには、RAGEポリペプチドを固定化するための固相担体が含まれていてもよい。
上記の構成試薬の他に、緩衝液、溶解液、洗浄液、反応停止液、使用説明書などが含まれていてもよい。上記各構成試薬は、懸濁液、溶液、または凍結乾燥品の形態とすることができる。
また、RAGEポリペプチドは、それを高密度に貼り付けたプロテインチップ(プロテインアレイ)としてよく、このようなプロテインチップも本発明のキットに含まれる。この場合、キットには、質量分析計、測定・解析に必要なソフト、該ソフトを導入したコンピューターなどが含まれていてよい。
(リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤)
グラム陰性菌が有するリポポリサッカライドは、ヒトなどの哺乳動物の体内で急激な炎症(ショック症状)を惹起することが知られている。本発明者らは、RAGEポリペプチドを投与することにより、この症状が緩和できることを見出した。すなわち、本発明の第四の形態は、RAGEポリペプチドを含有する、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤に関する。本発明はまた、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療または予防方法であって、当該炎症の治療または予防を必要とする対象(典型的にはヒト)に、有効量のRAGEポリペプチドを投与する工程を含む前記方法に関する。本発明はまた、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤の製造におけるRAGEポリペプチドの使用に関する。
本発明のこの実施形態ではRAGEポリペプチドは血中に可溶性のものであることが好ましく、例えばヒト等に由来する内在性分泌型RAGE(esRAGE)ポリペプチドが好ましい。
投与形態は経口投与または非経口投与のいずれであってもよいが、急激なショック症状を迅速に緩和するためには非経口投与が好ましい。
製剤形態への調製は、常法に従って行うことができ、その際に利用できる担体や賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、希釈剤も、慣用されている各種のものから適宜選択することができる。形態には、特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、経鼻剤、経腸剤、貼付剤、軟膏剤等の非経口剤として製剤化される。
RAGEポリペプチドの投与量は有効量であれば特に限定されないが、1日当たり0.1〜10mg/kg体重が好適といえる。
表面プラズモン共鳴センサーを用いたアッセイ
方法
リポポリサッカライド(以下「LPS」と称する)とRAGEの結合を表面プラズモン共鳴センサーであるビアコア(BIAcore2000)を用いて直接検出した。リガンド結合ドメインはRAGE細胞外領域に存在するという想定で、LPSとesRAGEとの結合が確認できれば、LPSとRAGEとの結合も可能と考えた。LPSはシグマ社の大腸菌由来O111:B4を使用した。ヒト由来内在性分泌型RAGE(esRAGE)は、CM5センサーチップ表面のカルボキシメチルデキストランにアミンカップリング法によって5,500RU(110fmol/mm2)固定した。ランニング緩衝液は10mM HEPES(pH7.4),0.15M NaCl,3mM Na−EDTA and 0.005% surfactant P−20を使用し、25℃、流速20mL/minでLPSをセンサーチップ表面に流した。センサーチップ表面にLPSが結合し停留すると、チップ上の質量増加により表面プラズモン共鳴が変化しRU値として検出される。結合はリアルタイムに観測され、その反応速度及び親和性が算出できる。
結果
LPSは固定化したesRAGEと結合し、センサーグラム上でRU値の上昇が観測された。1:1 Langmuir binding modelによってセンサーグラム(図1)を解析したところ、3.5x10−8M程度の解離定数が得られた。
方法
リポポリサッカライド(以下「LPS」と称する)とRAGEの結合を表面プラズモン共鳴センサーであるビアコア(BIAcore2000)を用いて直接検出した。リガンド結合ドメインはRAGE細胞外領域に存在するという想定で、LPSとesRAGEとの結合が確認できれば、LPSとRAGEとの結合も可能と考えた。LPSはシグマ社の大腸菌由来O111:B4を使用した。ヒト由来内在性分泌型RAGE(esRAGE)は、CM5センサーチップ表面のカルボキシメチルデキストランにアミンカップリング法によって5,500RU(110fmol/mm2)固定した。ランニング緩衝液は10mM HEPES(pH7.4),0.15M NaCl,3mM Na−EDTA and 0.005% surfactant P−20を使用し、25℃、流速20mL/minでLPSをセンサーチップ表面に流した。センサーチップ表面にLPSが結合し停留すると、チップ上の質量増加により表面プラズモン共鳴が変化しRU値として検出される。結合はリアルタイムに観測され、その反応速度及び親和性が算出できる。
結果
LPSは固定化したesRAGEと結合し、センサーグラム上でRU値の上昇が観測された。1:1 Langmuir binding modelによってセンサーグラム(図1)を解析したところ、3.5x10−8M程度の解離定数が得られた。
プレートアッセイ
方法
BSAとglyceraldehydeを37℃で1週間反応させて生成したAGE−BSAを96穴プレートに吸着させて、AGE固相化プレートを作製した。そこに濃度を変えたLPSとヒト由来内在性分泌型RAGE(esRAGE)を添加した。LPSはシグマ社の大腸菌由来O111:B4を使用した。25℃で1時間静置した後プレートを洗浄し、蛍光標識したesRAGE抗体を添加した。1時間静置した後洗浄し、蛍光測定をおこなった。蛍光強度は固相化されたAGEと結合したesRAGEの量に比例するため、LPSがAGEとesRAGEとの結合を阻害した場合、蛍光強度の減少として検出される。
結果
LPSを加えた場合、蛍光強度は濃度依存的に減少し、AGE−BSAとesRAGEとの結合を阻害していることが示された(図2)。AGEが結合するRAGEの領域と同じ箇所にLPSが結合するものと考えた。
方法
BSAとglyceraldehydeを37℃で1週間反応させて生成したAGE−BSAを96穴プレートに吸着させて、AGE固相化プレートを作製した。そこに濃度を変えたLPSとヒト由来内在性分泌型RAGE(esRAGE)を添加した。LPSはシグマ社の大腸菌由来O111:B4を使用した。25℃で1時間静置した後プレートを洗浄し、蛍光標識したesRAGE抗体を添加した。1時間静置した後洗浄し、蛍光測定をおこなった。蛍光強度は固相化されたAGEと結合したesRAGEの量に比例するため、LPSがAGEとesRAGEとの結合を阻害した場合、蛍光強度の減少として検出される。
結果
LPSを加えた場合、蛍光強度は濃度依存的に減少し、AGE−BSAとesRAGEとの結合を阻害していることが示された(図2)。AGEが結合するRAGEの領域と同じ箇所にLPSが結合するものと考えた。
NFκB−luciferaseアッセイ
方法
アッセイに用いたC6−RAGE−NFκB−luc細胞は、C6 gliomaにレポーターベクターpNF−κB−Luc(NFκB応答配列の下流にluciferase遺伝子を含む)とヒト由来膜結合型RAGE cDNA発現ベクターをTransIT−LT1(TaKaRa,リポソーム型導入試薬)を用いて同時に導入することで樹立した安定発現細胞株である。RAGEへのリガンド結合により、下流のシグナル伝達が起こりNFκBが活性化することは既に知られている。従って本系を用いれば、RAGEとリガンドとの相互作用をluciferase活性の上昇として検出することができる。樹立したクローン株を96穴プレートにてサブコンフルエントにまで培養し、RAGE siRNA(RAGEの発現を抑制)あるいはdominant negative RAGE(dnRAGE,細胞内ドメインを欠失し細胞内シグナルを生じないもの)発現ベクターを導入(GenomeONE−neo)した。2日後コンフルエントの状態で、0.1%ウシ血清培地に置換し、LPS 50ng/ml(シグマ社の大腸菌由来O111:B4)で刺激した。刺激開始4時間後にLuciferase活性をDual−luciferase reporter assay system(Promega)を用いてluminometer(Fluoroscan Ascent FL,Labosystems)にて測定した。
結果
結果を図3に示す。C6−RAGE−NFκB−luc細胞においては、ウエスタンブロッティング法により導入したRAGE遺伝子の過剰発現が認められた。またRAGE siRNAによるRNA干渉によってその発現は抑制された。dominant negative RAGE発現ベクターを導入した細胞においてその発現を確認した。luciferaseアッセイにおいて、無刺激の対照群(Control)と比較してLPS 50ng/mlで刺激した細胞においては顕著なluciferase活性の上昇が認められた(LPS)。またこの活性上昇は、RAGE siRNAあるいはdominant negative RAGEによって部分的にではあるが、しかし有意に抑制した。LPSがRAGEと結合する作用によるものであると結論した(siRNA,dnRAGE)。これは分泌型RAGE200μg/mlの添加によってluciferase活性が有意に抑制されることからも確認できた(sRAGE200μg/ml)。sRAGEはマウスのRAGE cDNAの細胞外領域だけをvaculocirusを用いて昆虫細胞で発現させ、精製したものである。完全抑制されない原因としては、RAGE以外にもtoll−like receptor 4などの他のLPSをリガンドとする受容体が存在し、NFκBシグナルを生じさせていることが考えられる。
方法
アッセイに用いたC6−RAGE−NFκB−luc細胞は、C6 gliomaにレポーターベクターpNF−κB−Luc(NFκB応答配列の下流にluciferase遺伝子を含む)とヒト由来膜結合型RAGE cDNA発現ベクターをTransIT−LT1(TaKaRa,リポソーム型導入試薬)を用いて同時に導入することで樹立した安定発現細胞株である。RAGEへのリガンド結合により、下流のシグナル伝達が起こりNFκBが活性化することは既に知られている。従って本系を用いれば、RAGEとリガンドとの相互作用をluciferase活性の上昇として検出することができる。樹立したクローン株を96穴プレートにてサブコンフルエントにまで培養し、RAGE siRNA(RAGEの発現を抑制)あるいはdominant negative RAGE(dnRAGE,細胞内ドメインを欠失し細胞内シグナルを生じないもの)発現ベクターを導入(GenomeONE−neo)した。2日後コンフルエントの状態で、0.1%ウシ血清培地に置換し、LPS 50ng/ml(シグマ社の大腸菌由来O111:B4)で刺激した。刺激開始4時間後にLuciferase活性をDual−luciferase reporter assay system(Promega)を用いてluminometer(Fluoroscan Ascent FL,Labosystems)にて測定した。
結果
結果を図3に示す。C6−RAGE−NFκB−luc細胞においては、ウエスタンブロッティング法により導入したRAGE遺伝子の過剰発現が認められた。またRAGE siRNAによるRNA干渉によってその発現は抑制された。dominant negative RAGE発現ベクターを導入した細胞においてその発現を確認した。luciferaseアッセイにおいて、無刺激の対照群(Control)と比較してLPS 50ng/mlで刺激した細胞においては顕著なluciferase活性の上昇が認められた(LPS)。またこの活性上昇は、RAGE siRNAあるいはdominant negative RAGEによって部分的にではあるが、しかし有意に抑制した。LPSがRAGEと結合する作用によるものであると結論した(siRNA,dnRAGE)。これは分泌型RAGE200μg/mlの添加によってluciferase活性が有意に抑制されることからも確認できた(sRAGE200μg/ml)。sRAGEはマウスのRAGE cDNAの細胞外領域だけをvaculocirusを用いて昆虫細胞で発現させ、精製したものである。完全抑制されない原因としては、RAGE以外にもtoll−like receptor 4などの他のLPSをリガンドとする受容体が存在し、NFκBシグナルを生じさせていることが考えられる。
マウスLPSショックにおけるRAGEの役割
方法
RAGE欠損マウスとその対照の野生型マウスを用いて、LPSを腹腔に投与した後の生存率を検討した。LPSはシグマ社の大腸菌由来O55:B5を使用し、2mg/40gで投与した。マウスsRAGE(実施例3参照)はLPS投与30分前に、35μg/mouseで処置した。
結果
結果を図4に示す。RAGE+/+野生型マウスとRAGE−/−ノックアウトマウスとの比較では、RAGE+/+野生型マウスの方が有意にLPSショックでの生存が悪かった(p<0.0001)。sRAGEを処置しておくことで、両者の生存率はともに有意に改善した。LPSが直接RAGEを介して激しい炎症反応を引き起こしているものと考えた。sRAGEはLPSと結合し、RAGEとの結合を阻害し炎症を和らげている可能性がある。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
方法
RAGE欠損マウスとその対照の野生型マウスを用いて、LPSを腹腔に投与した後の生存率を検討した。LPSはシグマ社の大腸菌由来O55:B5を使用し、2mg/40gで投与した。マウスsRAGE(実施例3参照)はLPS投与30分前に、35μg/mouseで処置した。
結果
結果を図4に示す。RAGE+/+野生型マウスとRAGE−/−ノックアウトマウスとの比較では、RAGE+/+野生型マウスの方が有意にLPSショックでの生存が悪かった(p<0.0001)。sRAGEを処置しておくことで、両者の生存率はともに有意に改善した。LPSが直接RAGEを介して激しい炎症反応を引き起こしているものと考えた。sRAGEはLPSと結合し、RAGEとの結合を阻害し炎症を和らげている可能性がある。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
本発明によれば、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法が提供される。
本発明によればまた、グラム陰性菌の検出方法が提供される。
本発明によればまた、グラム陰性菌の収集方法が提供される。
本発明によればまた、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤が提供される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
本発明によればまた、グラム陰性菌の検出方法が提供される。
本発明によればまた、グラム陰性菌の収集方法が提供される。
本発明によればまた、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤が提供される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
Claims (10)
- Receptor for advanced gylcation endproducts(RAGE)ポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する方法。
- RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する増強的効果に基づいて該被検物質を評価することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 下記の工程を含む請求項1または2記載の方法:
1)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と、被検物質とを混合し、該混合物中における、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量(A)を測定する、
2)RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌とを混合し、該混合物中における、RAGEポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量(B)を測定する、
3)結合量(A)と結合量(B)との相違に基づき、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する。 - 被検試料中のグラム陰性菌を検出する方法であって、
RAGEポリペプチドと被検試料とを接触させ、RAGEポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法。 - RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用試薬。
- RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用キット。
- 試料中のグラム陰性菌を収集する方法であって、
RAGEポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をRAGEポリペプチドと結合させる工程を含む方法。 - RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用試薬。
- RAGEポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用キット。
- RAGEポリペプチドを含有する、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006049312 | 2006-02-24 | ||
JP2006049312 | 2006-02-24 | ||
PCT/JP2007/053979 WO2007102410A1 (ja) | 2006-02-24 | 2007-02-23 | Rageポリペプチドの新規用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2007102410A1 true JPWO2007102410A1 (ja) | 2009-07-23 |
Family
ID=38474841
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008503817A Pending JPWO2007102410A1 (ja) | 2006-02-24 | 2007-02-23 | Rageポリペプチドの新規用途 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2007102410A1 (ja) |
WO (1) | WO2007102410A1 (ja) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100447154C (zh) * | 2001-05-15 | 2008-12-31 | 费因斯坦医学研究学院 | 利用hmg片段作为抗炎症试剂 |
-
2007
- 2007-02-23 JP JP2008503817A patent/JPWO2007102410A1/ja active Pending
- 2007-02-23 WO PCT/JP2007/053979 patent/WO2007102410A1/ja active Search and Examination
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2007102410A1 (ja) | 2007-09-13 |
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