SK14102003A3 - Použitie zlúčenín s kombinovanou inhibičnou aktivitou k NEP/MP pri príprave liečiv - Google Patents

Description

Tento vynález sa týka nov ého lekárskeho použitia zlúčenín; ktoré môžu pôsobiť ako kombinované či konkurenčné inhibítory neutrálnej endopeptídázy (NEP) a špecifickej metaloproteázy (MP). ktoré boli nedávno naklonované a identifikované ako jemné metaloproteázy so širokou substrátovou špecifitou.

Doterajší stav techniky

Metaloproteázy sú polypeptidy. ktoré tvoria zvláštnu skupinu štruktúrne a funkčne príbuzných enzýmov, napr. peptidáz, ktoré sú farmaceutický a farmakologicky zaujímavé v súvislosti s liečením alebo profylaxiou rôznych chorôb. Identifikovaných Bolo niekoľko chorôb, u ktorých metaloproteázy hrajú kľúčovú úlohu v patológii choroby. Napríklad bol identifikovaný a charakterizovaný celý rad metaloproteáz obsahujúcich zinok alebo podobných skupín štruktúrne a funkčne príbuzných enzýmov a začalo byť zrejmé, že účasť týchto enzýmov, napr. metaloproteáz obsahujúcich zinok, má úlohu v rôznych biologických funkciách zahrnujúcich situácie jednak normálne, tak aj chorobné. Metaloproteázy obsahujúce zinok tvoria podskupinu enzýmov, ktorých katalytické funkcie sú závislé na prítomnosti iónu zinku v aktívnom centre. O tejto skupine enzýmov, ktorá zahrnuje rôzne skupiny klasifikované na základe jednak sekvenčnej tak aj štruktúrnej informácie, je známe, že sa priamo podieľa v procesoch ako sú napr. vývoj embryí, tvorba chrupaviek a kostí, aktivácia peptidických hormónov, rozmnožovanie, kardiovaskulárnych chorôb, artritídy a rakoviny. Preto existuje zvláštny záujem vo farmaceutickom odbore skúmať kľúčové úlohy metaloproteáz a ich potenciálnych v zájomných vzťahov počas zdravia a chorôb, ale tiež pri navrhovaní vylepšených terapeutických konceptov liečenia chorôb pri využití predmetných metaloproteáz.

Na základe sekvenčnej a štruktúrnej informácie tykajúcej sa väzobného miesta pre zinok v metaloproteázach obsahujúcich zinok, môžu byť tieto enzýmy radené do niekoľkých skupín, ktoré sa môžu ďalej rozdeliť do podskupín ako sú „metzincíny (astacín. seratia. reprolyzín. matrixín), „gluzincíny (tennolyzín. neprilyzín. enzým premieňajúci angíotenzín. aminopeptidáza) alebo „zincíny zahrnujúce podskupiny metzincínov a gluzincínov. Takéto členenie nielen pomáha pri určovaní všeobecných mechanizmov katalytického a biosyntetického pôsobenia, ale je tiež neoceniteľné pri určovaní funkcie (funkcií) novo identifikovaných proteínov. ktoré majú podobné spôsoby viazania zinku. Niektoré príklady metaloproteáz. napr. enzýmov obsahujúcich zinok, ktoré už boli identifikované skôr, zahrnujú neprilyzín. enzým premieňajúci endotelín. enzým premieňajúci angíotenzín, termolyzín.

aminopeptidázu. astacín, seratiu, reprolyzín. matrixín, inzulinázu, karboxypeptidázu a DDkarboxypeptidázu.

Niektoré ďalšie špecifické vlastnosti a podobné známe aktivity poddruhov najmä zaujímavé metaloproteázy. ako je neutrálna endopeptidáza (NEP), enzým premieňajúci endotelín (ECE) a enzým premieňajúci angíotenzín (ACE), môžu byť zhrnuté v nasledujúcej časti.

Enzým premieňajúci angíotenzín I (ACE; peptidyl dipeptidáza A; EC 3.4.15.1) je členom skupiny enzýmov premieňajúcich angíotenzín, ktoré patria medzi metaloproteázy obsahujúce zinok. ACE sa primáme exprimuje na povrchu endotelových, epitelových a neuroepitelových buniek (somatická ACE) ako ektoenzým, čo znamená, že je zachytená k plazmovej membráne väčšinou svojej hmotnosti vrátane katalytického centra a je nasmerovaná na extracelulárnemu prostrediu. ACE bola nájdená v plazmovej membráne cievnych endotelových buniek, s vysokou koncentráciou bola nájdená na cievnom endotelovom povrchu pľúc tak, že aktívne centrá ACE sú nasmerované, aby metabolizovali kolujúce substráty. Okrem endotelovej polohy ACE je enzým tiež exprimovaný na kontaktnú hranicu absorbovaného epitelu malého črevného a ľadvinového proximálneho kanáliku. ACE sa tiež nachádza v monojadrových bunkách, ako sú monocyty po makrofágovej diferenciácii a T-lymfocyty a vo fibroblastoch. In vitro autorádiografía, využívajúca rádioznačených špecifických inhibítorov ACE a imunohistochemických štúdií, zmapovala základný výskyt ACE v mozgu. ACE bola primárne nájdená v plexu choroideu, ktorý je pravdepodobne zdrojom ACE v cerebrospinálnej tekutine, ependýme. subfornikálnom orgáne, bazálnej uzline (caudate putamen a glóbus pallidus), v čiernej substancii a v hypofýze. Rozpustná forma

ACE bola detekovaná v mnohých biologických tekutinách ako je sérum, spermová tekutina, amniotická tekutina a cerebrospinálna tekutina. Rozpustná forma ACE je zrejme odvodená od formy enzýmu viazaného na membráne v endotelových bunkách. Hlavná fyziologická aktivita

ACE spočíva v čistení C-terminálneho dipeptidu z angiotenzínu I pri produkcii účinného vazopresného peptidu angiotenzínu II a v inaktivácii vazodilatačného peptidu bradykinínu sekvenčným odštiepením dvoch C-terminálnych dipeptidov. Ako dôsledok zahrnutia ACE v metabolizme týchto dvoch vazoaktívnych peptidov, angiotenzínu II a bradykinínu, stala sa

ACE rozhodujúcim molekulárnym cieľom pri liečení vysokého tlaku a zlyhaní srdca v dôsledku zahltenia. To viedlo k vývoju vysoko účinných a špecifických inhibítorov ACE, ktoré sa stali klinicky významnými a široko rozšírenými liekmi pre perorálnu aplikáciu pri liečbe vysokého tlaku a zlyhaní srdca v dôsledku zahltenia. Zatiaľ čo metabolizmus vazoaktívnych peptidov zostáva najlepšie poznanou fyziologickou funkciou ACE, enzým bol tiež zapojený do radu ďalších fyziologických procesov nesúvisiacich s reguláciou krvného tlaku, ako je imunita, reprodukcia a metabolizmus neuropeptidov vďaka umiestneniu ACE a/alebo štepeniu radu biologicky aktívnych peptidov in vitro.

Neutrálna endopeptidáza (NEP, neprilyzín, EC 3.4.24.11) je metaloproteáza obsahujúca zinok a je klasifikovaná ako člen skupiny nepri lyzínu. NEP bola prvý raz izolovaná z hraničných membrán králičích ľadvín. Neskoršie bol jeden z enzýmov podobných NEP identifikovaný v krysom mozgu ako enzým zúčastňujúci sa degradácie opioidných peptidov. enkeíalincx. Klonovanie ektoenzvmu NEP a následné pokusy s mutagenézou zameranou na aktívne centrum enzýmu ukázali, že keď tento enzým má špecifitu podobnú ako termolyzín a má tiež podobný tvar aktívneho centra. NEP sa vyznačuje tiež špecifitou podobnou termolyzínu z hľadiska štepenia peptidov na N-terminálnom konci hydrofóbneho zvyšku. S ohľadom na v šeobecnú distribúciu NEP bol tento enzým nájdený v mozgu a chrbticovej mieche a jej porucha a štúdie pomocou elektrónového mikroskopu všeobecne podporujú prevažne nervové umiestnenie NEP. aj keď enzým môže byť prítomný v oligodendrocy toch obklopujúcich vlákna striato-palidálne a striato-nigrálne cesty a vo

Schwannových bunkách v perí ternom nervovom systéme. NEP nie je koncentrovaný na špecifických rozhraniach membrán ako je synapsia, aleje dosť jednoznačne distribuovaný na povrchu nervových bunkových schránok a dendritov. Na periférii je NEP zvlášť hojný v hraničných membránach ľadvín a čriev, lymfatických uzlín a placenty a bol nájdený pri nižších koncentráciách v mnohých ďalších tkanivách vrátane cievnej steny aorty. Bolo zistené, že všeobecným akútny m antigénom lymfoblastickej leukémie je NEP a výskumom tiež dokázané, žc enzým je prechodne prítomný na povrchu lymfohematopoéznych buniek a jeho zvýšené hladiny boli nájdené v dospelých lymfocytoch v určitých štádiách choroby.

Klinický záujem o NEP. najmä záujem o inhibítory NEP ako o potenciálne klinické prostriedky, sa odvíjajú z účinkov NEP. v súvislosti s ďalšou metaloproteázou obsahujúcou zinok, aminopeptidázou N (APN. membránová alanyl aminopeptidáza, EC 3.4.1 1.2) v degradácii enkefalínov a tiež od jej úlohy pri degradácii atriálneho natriuretického peptidu (ANP). Napríklad je známe, že duálne inhibítory NEP a enzýmov premieňajúcich angiotenzín (ACE) sú účinnými antihypertenzívami. v dôsledku súčasne rastúcej cirkulujúcej hladiny atriálneho natriuretického peptidu, kvôli inhibícii NEP a znižujúcej sa cirkulujúcej hladiny angiotenzínu II. v dôsledku inhibície ACE. Ďalší záujem o klinický potenciál inhibítorov NEP nastal, keď sa ukázalo, že periférny enzým degraduje cirkulujúci natriuretický a diuretický peptid. atriálny natriuretický peptid. Inhibítory NEP boli preto skúmané kvôli ich antihypertenzívnym vlastnostiam. Z ďalšieho príkladu vyplýva, že inhibícia metabolizmu enkefalínu syntetickým inhibítorom NEP, liorfanom, dáva pri myšiach antinocicepčné odpovede opačné, než naloxone. To naznačilo možnosť, že zvýšenie hladiny endogénnych opioidov v oblasti ich receptorov, môže spôsobiť analgéziu v podstate bez vedľajších účinkov morfinu a ďalších klasických opiátových liečiv. Bolo zistené, že aby sa dosiahol znateľný účinok, ďalšie enzýmy metabolizujúce enkefalín musia byť tak isto inhibované, predovšetkým aminopeptidáza N (APN). Takéto duálne inhibítory NEP/APN celkom blokujú metabolizmus enkefalínu a majú silné účinky proti bolestiam.

Enzým premieňajúci endotelín (ECE) katalyzuje posledný krok biosyntézy silného vazokonstriktórneho peptidu endotelínu (ET). To zahrnuje štiepenie väzby Trp-Val v neaktívnom medziprodukte, veľkom endotelíne. ĽCE-I je metaloproteázou obsahujúcou zinok, ktorá je homologickou s neutrálnou endopeptidázou (NEP; neprilyzín; EC 3.4.24.11, viď. vyššie). Rovnako ako NEP, aj ECE-1 je inhibovaná látkou fosforamidonom a integrálnym membránovým proteínom typu H. Na rozdiel od NEP, však ECE-1 existuje ako dimér viazaný distilfidovou väzbou a nie je inhibovaný ďalšími inhibítormi NEP, ako je tiorfan.

Imunocytochemické štúdie indikujú prevažné umiestnenie ECE-1 na povrchu bunky, kde existuje ako ektoenzým. ECE-1 je lokalizovaný do endotelových buniek a niektorých sekrétnych buniek, napr. β-buniek v pankrease a v bunkách hladkých svalov. Silné a selektívne inhibítory ECE. alebo duálne inhibítory ECE a NEP, môžu mať terapeutické aplikácie v kardiovaskulárnej a renálnej medicíne. Endotelín (ET), ktorý je bicyklickým peptidom s 21 aminokyselinami, obsahujúci dve intramolekuláme disulfidové väzby, je jedným z najsilnejších vazokonstriktných peptidu doposiaľ identifikovaných ajeho aplikácia na živočíchy má za následok stály rast krvného tlaku, čo zdôrazňuje jeho potenciálnu úlohu v kardiovaskulárnej regulácii. Endogénna produkcia ET-I u ľudí prispieva na udržanie základného stavu ciev. Systém endotelínu a podobných enzýmov ako ECE teda reprezentuje možného kandidáta na vý\oj nových farmaceutických prostriedkov.

Preto je klinický záu jem o ECE. najmä záujem o inhibítory ECE ako potenciálne klinické prostriedky, odvodený od účinkov ECE. najmä v súvislosti s biosyntézou ET. Následne zlúčenin>. vykazujúce významnú inhibičnú aktivitu k enzýmu premieňajúcemu endotelín. sú použiteľné pri liečbe a prev encii rôznych ochorení je. ktoré sú vyvolané ET alebo sa predpokladá, že by mohla bvť vyvolaná ET.

Najmä substrát}' metaloproteáz alebo metaloendopeptidáz, známe v tomto odbore, sú napr. v eľký endotelín 1 (big-ET-l), atriálne natriuretické peptidy (ANP) abradykimn. Napríklad, o big-ET-l sa vie. že je biologicky neaktívnym prekurzorom endotelínu 1 (ET-1), ktorý je vy soko účinným vazokonstriktórnym peptidom. ktorý je produkovaný zo svojho prekurzoru. v eľkého endotelínu 1, špecifickým proteolytickým postupom. ET-1 má fyziologickú úlohu pri udržovaní základného stavu ciev u ľudí. ale tiež sa zdá. že je kauzatívnym faktorom v patogenéze rôznych kardiovaskulárnych ochorení ako hypertenzia, zlyhanie srdca a ateroskleróza. Jeden spôsob, ako stlmiť nepriaznivé účinky prebytkuET-1, je inhibovať enzymatickú konverziu big-ET-l na ET-1. Pretože enzým premieňajúci endotelín 1 (ECE-1) bol naklonovaný v roku 1994 (Xu D. a spol.. Celí, 1994. 78: 473-485). sa začal tento enzým všeobecne akceptovať ako endopeptidáza zodpovedná za fyziologickú premenu big-ET-l na ET-1. Od toho času tiež inhibítor NEP, fosforamidon, začal byť akceptovaný ako látka, ktorá tiež účinne inhibuje ECF.-l; navyše jej aktivita mohla byť overená na pacientoch so zlyhaním srdca, ktorým bola podaná infúzia big-ET-l (Love MP a spol., Circ, 1996. 94:

2131-2137).

Avšak navzdory skutočnosti, že ĽCE-l má schopnosť štiepiť big-ET-l. novšie publikácie vniesli pochybnosti, či ECE-1 je fyziologicky dôležitý enzým premieňajúci endotelín. alebo aspoň argumentovali tým, že ďalšie enzýmy sú potrebné na produkciu ET-1 (Barker S. a spol.. Mol. Pharrnacol. 2001,59: 163-169). Navyše podľa Barkera a spol., endotelín I (Eľ-1) bol zahrnutý ako kauzatívny faktor v patogenéze hypertenzie. pľúcnej hvpertenzíi. celkové zlyhanie srdca, aterosklerózy a astme (viď. tiež Douglas, 1997. Trends

PhaiTnacol. Sci. 18: 408-412; Haynes a Web, 1998, J. Hypertension 16: 1081-1098; Goldie a Henry, 1999. Life Sci. 65: 1-15). O mnohých vysoko účinných antagonistov receptora ET bolo referované kvôli ich terapeutickému použitiu, avšak tieto látky sú všeobecne selektívne k receptorom ĽT_A a neselektívnv antagonisti ETa/ETb (Douglas. 1997, viď. vyššie). Aj keď receptory ET_n prevažujú v niektorých tkanivách, sú odolné voči blokovaniu selektívnymi antagonistami ETr a neselektívnymi antagonistami ETa/ETr (Hay a spol., 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther. 284: 669-677). Preto môže byť špecifická inhibícia syntézy ET-1 pomocou inhibítorov ECE za určitých podmienok lepším spôsobom stlmenia nepriaznivých účinkov prebytku ET-1.

Predmetom tohto vynálezu je predložiť nové terapeutické koncepty liečenia a/alebo profylaxie ochorení súvisiacich s metaloproteázami, napr. v prvom rade predložením terapeuticky vhodných látok, ktoré buď inhibujú vybranú kombináciu najmenej dvoch typov metaloproteáz kombinovaným profilom spôsobu účinku; a v druhom rade predložením terapeuticky vhodných kombinácií látok inhibujúcich vyššie spomenuté metaloproteázy.

Podstata vynálezu

Vzhľadom na pochybnosti v danej oblasti (Barker S. a spol., Mol. Pharmacol., 2001, 59: 163-169). pokiaľ ide o to. že ECE-1 by mal byť jediným fyziologicky vhodným enzýmom premieňajúcim endotelín a teda že ďalšie enzýmy musia byť zahrnuté do produkcie ET-1, bol podľa tohoto vynálezu uskutočnený projekt homologického klonovania s cieľom zistenia, či doposiaľ neznáme metaloproteázy môžu hrať úlohu v konverzii big-ET-1 na ET-1 a či špecifické inhibítory' novo identifikovaných metaloproteáz môžu inhibovať túto konverziu. Tieto snahy vyústili do objavu nového ľudského génu s vysokou homológiou k NEP (zhoda 54 %) a s trocha nižšou homológiou k ECE-1 (zhoda 37 %), ktoré sú dvomi najlepšie charakterizovanými členmi skupiny metaloproteázy neprilyzínu. Polypeptidický produkt ľudského génu bol nájdený evidentne exprimovaným v rade ľudských tkanív a pracovne bol označený názvom JGS5 (viď. súčasne predložená patentová prihláška

PC T/EP 00Ί 1532).

Preto sa tento vynález všeobecne zaoberá použitím látok, vykazujúcich kombinovanú, s výhodou súbežnú, inhibičnú aktiv itu

a) k neutrálnej endopeptidáze a

b) k metaloproteáze IGS5. ktorá je polypeptidom so sekvenciou aminokyselín, ktoráje v zhode aspoň na 70% s určitou sekvenciou aminokyselín vybranou zo skupiny SEQ ID NO:2.

SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6;

alebo inhibičnú aktivitu ich farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru s cieľom výroby liečiva (farmaceutickej zmesi) na liečenie cicavcov, najmä ľudí, ktorí trpia alebo sú ovplyvnení ochoreniami alebo podmienkami, ktoré sa môžu zmierniť alebo urobiť prevenciu kombinovanou, s výhodou súbežnou, inhibiciou NEP a 1GS5.

S výhodou sa tento vynález týka použitia látky s kombinovanou inhibičnou aktivitou k

NEP/IGS5. alebo jej farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru s cieľom výroby liečiva (farmaceutickej zmesi) na liečenie cicavcov, najmä ľudí, ktorí trpia alebo sú ovplyvnení ochorením alebo podmienkami, pri ktorých hladina big-ET-1 je zvýšená a takéto ochorenie (podmienka) môže byť zmiernené alebo preventované kombinovanou, s výhodou súbežnou, inhibiciou NEP a [GS5.

S ďalšou výhodou sa tento vynález dotýka použitia látky s kombinovanou inhibičnou aktivitou k NEP/IGS5, alebo jej farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru s cieľom výroby liečiva (farmaceutické zmesi) na liečenie cicavcov, najmä ľudí, ktorí trpia alebo sú ovplyvnení ochorením alebo podmienkami, pri ktorých je hladina E'ľ1 vyššia a takéto ochorenie (podmienka) môže byť zmiernené alebo preventované kombinovanou, s v ýhodou súbežnou, inhibiciou NEP a IGS5.

S ďalšou výhodou sa tento vynález dotýka použitia týchto látok s kombinovanou alebo súbežnou inhibičnou aktivitou k NEP/1GS5, alebo ich farmaceutický použiteľných solí alebo solvátu alebo biolabilného esteru. s cieľom výroby liečiva (farmaceutickej zmesi), s výhodou použiteľného na liečenie a^zalebo profylaxiu hypertenzie, vrátane sekundárnych foriem hypertenzie. ako je ľadvinová alebo pľúcna hypertenzia, zlyhanie srdca, angíny pectoris. arytmie. infarktu myokardu, srdečnej hypertrofie, mozgovej ischémie, periferálneho cievneho ochorenia, aterosklerózy a bolesti v súvislosti s kolorektálnou rakovinou alebo rakovinou prostaty u vyšších cicavcov, najmä ľudí.

Ďalej môže byť výhodné dodatočne kombinovať tieto látky vykazujúce kombinovanú aiebo súbežnú inhibíčnú aktivitu k NĽP/ÍGS5 s ďalšími individuálnymi a/alebo kombinovanými inhibítormi metaloproteáz než s inhibítormi NEP/IGS5, napr. s oddelenými inhibítormi ACE a/alebo ECE a/alebo NEP a/alebo zmesami inhibítorov týchto metaloproteáz.

Definície

Pojmy použité v tejto prihláške, pokiaľ tu nie sú výslovne definované, znamenajú to, čo sa nimi rozumie v odbore tohto vynálezu. V ďalšom je uvedených niekoľko definícií na uľahčenie pochopenia niektorých termínov, ktoré sa tu často používajú.

„IGS5 sa okrem iného vzťahuje na polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín už určenú v sekvenciách SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6 alebo v ich variantoch. Tým je určené, že „1GS5 zahrnuje najmä IGS5PROT, IGS5PROT1 a IGS5PROT2.

..Enzýmová aktivita alebo „biologická aktivita sa vzťahuje na metabolickú alebo fyziologickú funkciu 1GS5 vrátane podobných aktivít alebo zlepšených aktivít alebo aktivít so znížením nežiadúcich vedľajších účinkov.

„Gén IGS5 sa vzťahuje na polynukleotid. obsahujúcemu sekvenciu nukleotidov už určenou v sekvenciách SEQ ID NO: 1. SEQ ID N0:3 a SEQ ID NO:5 alebo v ich variantoch.

napr. ich alelických variantoch a/alebo ich doplnkoch.

„Zhoda ako miera zhody používaná v tomto odbore, je vzťah medzi dvomi alebo viacerými sekvenciami polypeptidov alebo dvomi alebo viacerými sekvenciami polynukleotidov, ako sa určuje porovnaním sekvencií. V tomto odbore „zhoda tiež znamená stupeň zhodnosti sekvencie medzi sekvenciami polypeptidov alebo polynukleotidov podľa okolností, na základe zhody medzi sériami takýchto sekvencií, napr. všeobecne na základe polohy sekvencií tak. aby sa dosiahla najlepšia možná zhoda. Preto „zhoda a podobné slovo „podobnosť“ má v tomto odbore svoj význam, ktorý sa môže priamo vypočítať známymi metódami, vrátane, ale bez akéhokoľvek obmedzenia, metódami opísanými v „Computational

Molecular Biology. Lesk. A.M.. Ed„ Oxford .University Press, New York, 1988;

„Biocomputing: Informatics and Genome Projects. Smith, D.W.. Ed., Academic Press, New York, 1993; „Computer Analysis of Sequence Data, Part I. Griffin, A.M., and Griffin, H.G.,

Eds„ Humana Press. New Jersey, 1994; „Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje. G„ Academic Press. 1987; „Sequence Analysis Primer, Gribskov. M. a Devereux. J.. Eds., M Stockton Press. New York. 1991; a Carillo, H., a Lipman, D„ SIAM J. Applied Math.. 48: 1073 (1988). Predné metódy na určenie zhody sú opísané tak, aby dávali najvyššiu možnú zhodu medzi testovanými sekvenciami. Metódy na určenie zhody a podobnosti sú kódované v počítačových programoch, verejne dostupných. Preferované počítačové programové metódy na určenie zhody a podobnosti medzi dvomi zahrnutými sekvenciami, avšak bez akéhokoľvek obmedzenia, sú programový balíček GCG (Devereux, J. a spol., Nucleic Acid Research 12(1): 387 (1984)), BI.ASTP. BI.ASTIN a PASTA (Atschul, S.F. a spol., J. Molec. Biol. 215: 403410 (1990). Program BI.AST X je verejne prístupný z NCBI a z ďalších zdrojov (BLAST

Manual. Altschuk S. a spol.. NCBI NMI. NIH Bethesda. MD 20894; Altschul. S. a spol.. J.

Mol. Biol. 215: 403-410 ( 1090).

Dobre známy algoritmus Smitha a Watermana sa tak isto môže použiť na určení zhody. Verejne prístupný program, použiteľný na určenie zhody alebo podobnosti sekvencií polypeptidov alebo sekvencií polynukleotidov, je známy ako program „gap od Genetic Computer Group, Madison WI. ktorý sa obvykle spúšťa s danými-parametrami na porovnanie (spolu s nulovým postihnutím pri ukončení gapov). Preferované (t.j. dané) parametre na porovnanie sekvencií polypeptidov zahrnujú nasledujúce: Algoritmus opísaný Needlemanom a W’unschom. J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); Comparison Matrix BLOSSUM62 od Hentikoffa a Hentikoffa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992); Gap Penalty 12; Gap Length Penalty: 14. Preferované (t.j. dané) parametre na porovnanie sekvencií polynukleotidov zahrnujú nasledujúce: Algoritmus opísaný Needlemanom a Wunschom, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); Comparison Matrix: zhoda = +10, nezhoda = 0; pokuta za prerušenie: 50; pokuta za dĺžku prerušenia: 3. Slovo „homológia môže nahradzovať slovo, „zhoda.

Pre znázornenie, o polynukleotide, ktorý má sekvenciu nukleotidov aspoň napríklad v „zhode 95% k referenčnej sekvencií nukleotidov, napríklad k referenčnej sekvencií ' nukleotidov vybraných zo skupín SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:5. sa predpokladá, že sekvencia nukleotidov v takom polynukleotide je zhodná so sekvenciou referenčnou s tou výnimkou, že sekvencia polynukleotidu môže obsahovať až päť mutácií na každých 100 nukleotidov takej referenčnej sekvencie nukleotidov. Inými slovami, na získanie polynukleotidu, ktorý má sekvenciu nukleotidov v zhode najmenej 95% s referenčnou sekvenciou nukleotidov, sa môže do 5% nukleotidov z referenční sekvencie odstrániť alebo nahradiť iným nukleotidom alebo rad nukleotidov až do 5% celkových nukleotidov v referenčnej sekvencií môže byť vložená do referenčnej sekvencie alebo rad nukleotidov až do

5% celkových nukleotidov v referenčnej sekvencií môže byť kombinovane odstránená, vložená a nahradená. Takéto mutácie referenčnej sekvencie sa môžu objaviť v terminálnej polohe 5' alebo 3' referenčnej sekvencie nukleotidov alebo kdekoľvek medzi týmito terminálnymi polohami, premiešané buď individuálne medzi nukleotidmi v referenčnej sekvencii alebo v jednej alebo viacerých skupinách susediacich vo vnútri referenčnej sekvencie.

Podobne, o polypeptide, ktorý má sekvenciu aminokyselín najmenej napríklad v ..zhode 95% s referenčnou sekvenciou aminokyselín, napríklad s referenčnou sekvenciou aminokyselín vybranou zo skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6, sa predpokladá, že má sekvenciu aminokyselín v polypeptide zhodnú s referenčnou sekvenciou s výnimkou, že sekvencia polypeptidu môže obsahovať až do päť zmien aminokyselín na každých 100 aminokyselín referenčných aminokyselín. Inými slovami, aby sme získali polypeptid, ktorý má sekvenciu aminokyselín najmenej 95% zhodnú s referenčnou sekvenciou aminokyselín, až 5% aminokyselinových zvyškov v referenčnej sekvencii sa musí odstrániť alebo nahradiť inou aminokyselinou alebo rad aminokyselín až do 5% celkového počtu aminokyselinových zvyškov v referenčnej sekvencii musí byť vložená do referenčnej sekvencie. Tieto zmeny referenčnej sekvencie sa môžu objaviť na amino- alebo karboxyterminálnych pozíciách, premiešané buď jednotlivo medzi zvyškami v referenčnej sekvencii alebo v jednej alebo viacerých susediacich skupinách vo vnútri referenčnej sekvencie.

„Homológ je generický termín používaný v tomto odbore na popis sekvencie polynukleotidu alebo polypeptidu, ktorá má vysoký stupeň príbuznosti sekvencie. Takáto príbuznosť môže bvť kvanti Ukovaná určením stupňa zhody a/alebo podobnosti medzi sekvenciami na porovnanie, ako je tu uvedené. Pod tento generický termín patria aj termíny ako „ortológ”. ktorý znamená polynukleotid alebo polypeptid v inom druhu a „paralóg, ktorý znamená funkčne podobnú sekvenciu vyskytujúcu sa v tom istom druhu. Preto, napríklad u ľudí, vo vnútri skupiny enzýmov ECE-l. premieňajúcich endotelín, je paralóg z inej skupiny, napr. skupiny ECE-2.

Farmakologické vyhodnotenie špecifických inhibítorov novo identifikovaných metaloproteáz 1GS5 voči tejto metaloproteáze.

Vzhľadom na pochybnosti v danej oblasti (Barker S. a spol.. Mol. Pharmacol.. 2001, 59: 163-169). pokiaľ ide o to, že ECE-1 by mal byť jediným fyziologicky vhodným enzýmom premieňajúcim endotelín a teda že teda ďalšie enzýmy musia byť zahrnuté do produkcie ET-1, bol podľa tohoto vynálezu uskutočnený projekt homologického klonovania s cieľom zistenia, či doposiaľ neznáme metaloproteázy môžu hrať úlohu pri konverzii big-ET-1 na ET-1 a či špecifické inhibítory novo identifikovaných metaloproteáz môžu inhibovať túto konverziu. Za predpokladu, že enzýmy s podobnou aktivitou by mali vykazovať podobnosť v sekvencií aminokyselín, bol ľudský génom skúmaný z hľadiska tých sekvencií DNA, kde je kódovanie proteínov s homológiou k NEP a ECE, dvom najlepšie charakterizovaným členom skupiny metaloproteázy neprilyzínu. Tieto snahy vyústili do objavu nového ľudského génu s vysokou homológiou k NEP (zhoda 54 %) a s trocha nižšou homológiou k ECE-1 (zhoda 37 %). Polypeptidický produkt tohto génu bol nájdený evidentne exprimovaný v rade ľudských tkanív a pracovne bol označený názvom „IGS5. Klonovanie, expresia a základná biologická charakterizácia IGS5 je podrobne opísaná v súčasnosti predloženej medzinárodnej patentovej prihláške PCT/EP 00/11532, ktorej celý obsah je čiastočne vložený ako odkaz s cieľom ďalšej ilustrácie podrobností o IGS5 uvedených nižšie.

S cieľom charakterizácie a vyhodnotenia farmakologických enzymatických vlastností 1GS5 pre tento vynález, bol ľudský proteín IGS5 generovaný použitím bunkovej kultúry hmyzu ako expresného systému a bol testovaný celý rad potenciálnych substrátov proteínov IGS5. Bolo potvrdené, že IGS5 účinne štiepi big-ET-1, bradykinín a látku P, čím sa ďalej potvrdilo, že tento nový proteín je skutočnou metaloproteázou so širokou substrátovou špecifitou, ktorá je všeobecnou vlastnosťou metaloproteáz a táto vlastnosť bola potvrdená u NEP, ECE-1 a tiež u ACE. Malo by tiež byť medené, že podľa zistenia v tomto vynáleze, vyúsťuje prekvapujúco proteolýza big-ET-1 pomocou 1GS5 na správne získanie EŤ-1. t.j. big-ET-1 je správne štiepený medzi aminokyselinami Trp21 a Val22.

Ďalej sa podľa tohoto vynálezu prvý raz skúmala účinnosť látok inhibujúeich metaloproteázu z hľadiska potlačenia konverzie big-ET-1 na ET-1, použitím fluorescenčné označeného analógu big-ET-1. Výsledky sú zhrnuté v Tabuľke 9 v časti príkladov. Je zaujímavé, že fosforamidon. o ktorom je známe, že inhibuje konverziu big-ET-1 na ET-1 in vivo. inhibuje tiež 1GS5 s veľkou intenzitou v biochemickom teste, použitom v tomto vynáleze a prekvapujúco je táto inhibícia IGS5 fosforamidonom skutočne výrazné vyššia než inhibícia ECE-1. Na rozdiel od toho, selektívny inhibitor NEP, tiorfan, rovnako ako selektívny inhibitor ĽCE-1. SM-19712 (sodná soľ 4-chlór-N-[[(4-kyan-3-metyl-l-fenyl-lH-pyrazol-5yl)amino]-karbonyl]benzénsulfonamidu; Umekawa K, Haswgawa H, Tsutsumi Y, Sato K,

Matsumura Y, Ohashi N. J Pharmacol 2000 Sep;84(l):7-15; Discovery Research Laboratories

AJ, Research Center. Sumitomo Pharmaceuticals Co, Ltd, Osaka, Japonsko), neovplyvňujú účinnost 1GS5 (Tabuľka 9. kapitola príkladov).

Zvláštnou výhodou sa tento vynález týka najdôležitejšieho a unikátneho zistenia, že mnohé zlúčeniny, ktoré sa prejavujú ako inhibítory metaloproteáz. sú schopné inhibovať enzým IGS5 aj pri nízkych nanomolámych koncentráciách, napr. pri koncentráciách zodpovedajúcich hodnotám IC_?o v rozsahu od 1 do 10 nM, čím bolo dokázané, že môžu špecificky inhibovať novo identifikovanú metaloproteázu IGS5, a takéto zistenie má zvláštny farmaceutický xýznam.

Preto sa všeobecne tento vynález týka použitia látok s kombinovanou, s výhodou súbežnou, inhibičnou aktivitou

a) k neutrálnej endopeptidáze (NEP) a

b) k metaloproteáze IGS5. ktorá je polypeptidom nesúcim sekvenciu aminokyselín, ktorá je v zhode aspoň 70% s určitou sekvenciou aminokyselín vybranou zo skupiny SEQ ID NO:2,

SEQID NO:4a SEQ ID NO.6;

alebo inhibičnou aktivitou ich farmaceutický použiteľné soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru s cieľom výroby liečiva (farmaceutickej zmesi) na liečenie cicavcov, najmä ľudí, ktorí trpia alebo sú ovplyvnení ochorením alebo podmienkami, ktoré môžu byť zmiernené alebo preventované kombinovanou, s výhodou súbežnou, inhibíciou NEP a 1GS5.

Zvláštnou výhodou sa tento vynález týka použitia látky s kombinovanou inhibičnou aktivitou k NEP/IGS5, alebo jej farmaceutický použiteľné soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru s cieľom výroby liečiva (farmaceutickej zmesi) na liečenie cicavcov, najmä ľudí, ktorí trpia alebo sú ovplyvnení ochorením alebo podmienkou, pri ktorom hladina big-ET-1 je zvýšená a toto ochorenie alebo podmienka môže byť zmiernená alebo preventovaná kombinovanou, s v ýhodou súbežnou, inhibíciou NEP a IGS5.

Ďalšou zvláštnou výhodou sa tento vynález týka použitia látky s kombinovanou inhibičnou aktivitou k NEP/IGS5, alebo jej farmaceutický použiteľné soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru s cieľom výroby liečiva (farmaceutickej zmesi) na liečenia cicavcov, najmä ľudí, ktorí trpia alebo sú o\ plyvnení ochorením alebo podmienkou, pri ktorom je hladina ET-1 vyššia a toto ochorenie alebo podmienka môže byť zmiernené alebo preventované kombinovanou, s v ýhodou súbežnou, inhibíciou NEP a IGS5.

„Kombinovaná alebo s výhodou súbežná inhibičná aktivita v zmysle tohto vynálezu znamená aspoň duálnu inhibíciu NEP a IGS5 súbežným pochodom oboch enzymatických systémov, NEP a IGS5 a potenciálne ďalšou súbežnou inhibíciou tretieho systému, napr. trojnásobnou inhibíciou enzymatických systémov NEP, IGS5 a napr. ECE-1. Podľa výsledkov tohto vynálezu sa môže očakávať, že kombinovaná alebo súbežná inhibícia obidvoch enzymatických systémov, NEP a IGS5, je oveľa účinnejšia, než oddelené blokovanie ktorejkoľvek skupiny rôznymi látkami alebo len blokovanie každého z uvedených enzýmov. Preto tento vynález predkladá nový terapeutický koncept tým, že navrhuje použitie kombinovaných, s výhodou súbežných, inhibítorov NEP a IGS5 pri liečenia a/alebo profylaxii radu určitých ochorení alebo ťažkostí, ktoré môžu byť zmiernené alebo preventované kombinovanou, s výhodou súbežnou, inhibíciou NEP a IGS5. Z tohto hľadiska tento vynález tiež poskytuje látky, ktoré vykazujú kombinovanú alebo súbežnú inhibíciu ako NEP. tak aj

IGS5 a poskytuje nové a perspektívne použitie týchto látok pri ich zvýšenej terapeutickej hodnote pri liečbe a/alebo profylaxii chorôb a ťažkostí, ktorých sa týkajú.

O kombinované, s výhodou súbežné mechanizmy účinkuje výnimočný medicinálny záujem, pretože sú očakávané ich terapeutické výhody, ktoré sú vyššie, než len pri zmene každého jednotliv ého systému oddelene.

Napríklad s ohľadom na inhibítory enzýmu premieňajúceho endotelín, bol zverejnený prehľadný článok B.-M. Lôflera (J. Cardiovasc. Pharmacol. (2000), 35(Suppl. 2), S79-S82) s cieľom ďalšieho objasnenia súčasného stavu a perspektív tohto princípu a sprievodných výhod.

Podľa Lôflera smeroval nedávny výskum k objavu účinne selektívnych alebo zmcsových inhibítorov enzýmov premieňajúcich endotelín (ECE), ECE/neutrálnych endopeptidáz (NEP) a

ĽCE/NEP/enzýmov premieňajúcich angiotenzín. Tak isto bol zverejnený podstatnejší dôkaz, že funkcia endotelínových (F.'l j. renin-angiotenzínových a NEP systémov na reguláciu kardiovaskulárnej homeostázy, sú spojené s komplexným regulačným mechanizmom. Preto

Lôľler vyvodzuje, že obtiažnou úlohou budúceho výskumu bude preukázať, v spojitosti s novo dostupnými selektívnymi a zmesovými inhibítormi ECE-I. či kombinovaná inhibícia viac než jedného kardiovaskulárneho systému je lepšia, než selektívna inhibícia. Z tohto hľadiska tento vynález predkladá vhodnejší postup v tom. že prvý raz v tomto odbore spomína kombinovanú a súbežne pôsobiacu inhibíciu aspoň enzymatických systémov NEP a IGS5.

Tento vynález s výhodou predkladá použitie látok alebo ich farmaceutický vhodných solí alebo solvátov alebo biolabilných esterov na výrobu liečiva (farmaceutickej zmesi) na liečenie a/alebo profylaxiu hypertenzíe, vrátane sekundárnych foriem hypertenzie. ako je renálna alebo pľúcna hypertenzia, zlyhanie srdca, angína pectoris, arytmia. infarkt myokardu, hypertrofia srdca, mozgová ischémia, periferálne cievne ochorenie, subarachnoidálne krvácanie, chronická obštrukčná pľúcna choroba (COPD), astma, ľadvinové ochorenie, ateroskleróza a bolesť súvisiaca s kolorektálnou rakovinou a rakovinou prostaty, u cicavcov, najmä u ľudí. S výhodou sú v tomto vynáleze použité látky s kombinovanou alebo súbežnou inhibičnou aktivitou k NEP/IGS5 na liečenie a/alebo profylaxiu vyššie uvedených chorôb a ťažkostí v tej časti populácie pacientov, ktorí trpia alebo sú náchylní na bolesti v dôsledku choroby alebo ťažkostí, ktoré môžu byť zmiernené alebo preventované kombinovanou a s výhodou súbežnou inhibíciou NEP alGSS,

Ďalej môže byť výhodou dodatočne kombinovať látky vykazujúce kombinovanú alebo súbežnú inhibičnú aktivitu k NEP/IGS5, podľa tohtô*vynálezu, s ďalšími individuálnymi a/alebo kombinovanými inhibítormi metaloproteáz, než s kombinovanými inhibítormi NEP/IGS5. Takéto ďalšie inhibítory metaloproteáz, ktoré môžu byť použité v kombinácii s látkami s kombinovanou inhibičnou aktivitou k NEP/IGS5, sú napríklad inhibítory ACE, ako kaptopril, enalapril, lisinopril, fosinopril, perindopril, quinapril, ramipril; ďalej s inhibítormi NEP, ako sú tiorfan; s duálnymi inhibítormi NEP/ECE, ako sú látky CGS-35066 (De Lombart a spol, J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3);488-504); alebo sa zmesovými inhibítormi týchto metaloproteáz, ako sú omapatrilat alebo sampatrilat. Týmto spôsobom kombinácie liečenia a/alebo profylaxie môže byť terapeutická hodnota látok s kombinovanou alebo súbežnou inhibičnou aktivitou k

NEP/IGS5 aj naďalej zvyšovaná, najmä s ohľadom na choroby a/alebo ťažkosti uvedené vyššie. Tento vynález preto tiež predkladá kombinovanú terapiu a/alebo kombinovanú profylaxiu, ktoré sú opísané nižšie.

Podľa tohto vynálezu bolo s výhodou zistené, že látky, ktoré sú primáme inhibítormi neutrálnej endopeptidázy (inhibítory NEP), sú tiež vhodné na inhibíciu novo identifikovaného enzýmu, metaloproteázy IGS5 a sú farmaceutický významné aj pri vyššie uvedených nanomolámych koncentráciách a tým tieto látky dokazujú, že sú inhibítory metaloproteáz s kombinovaným spôsobom účinku, t.j. napr. s kombinovanou alebo súbežnou selektívnou inhibičnou aktivitou k NEP/IGS5. Takéto látky môžu byť predstavované vzorcom I:

v ktorom

A je skupina vzorca II alebo III

O rA III

pričom vo vzorci II

R^la je fenyl-nižšou-alkyl-skupinou, ktorá môže byť voliteľne substituovaná na fenylovom jadre nižším alkylom, nižším alkoxylom alebo halogénom alebo je naftyl-nižšou-alkylskupinou,

R^2a je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester; a pričom vo vzorci III

R^lb je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester kyseliny fosforečnej,

R^2b je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester kyseliny fosforečnej;

a v ktorom

R³ je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester karboxylovej kyseliny; a fyziologicky použiteľné soli kyselín alebo solváty látky vzorca Iľ

Tam, kde substituenty látok vzorca 1 sú alebo obsahujú nižšie alkyly alebo alkoxyskupiny. môžu takéto substituenty byť rovnými alebo rozvetvenými reťazcami, s výhodou dĺžky 1 až 4, výhodnejšie 1 až 2 uhlíkových atómov a sú s výhodou metyl alebo métoxy. Tam, kde substituenty obsahujú halogén, s výhodou vhodné sú fluór, chlór alebo bróm. s väčšou výhodou fluór alebo chlór.

V radikály R^la môže nižší alkýlénový reťazec obsahovať 1 až 4, s výhodou 1 až 2. uhlíkové atómy. S výhodou môže R^ld byť voliteľne substituovanou skupinou fenetylovou, a táto môže byť voliteľne substituovaná jedným alebo viacerými halogénmi, nižším alkoxylom alebo nižším alkylom, alebo je skupinou naftyletylovou.

Látky vzorca la môžu byť voliteľne esterifikovanými derivátmi dikarboxylových kyselín.

Vhodnými skupinami R³, ktoré tvoria biolabilné estery karboxylových kyselín, sú také. ktoré môžu byť štiepené pri fyziologických podmienkach in vivo pri uvoľnení karboxylovej kyseliny. Napríklad na tieto účely sú vhodnými nižšie alkylové skupiny, fenyl alebo fenyl-nižší-alkyl-skupiny, voliteľne mono- alebo polysubstituované na fenylovom jadre nižším alkylom alebo nižším alkoxylom alebo nižším alkylénovým reťazcom, viazaným ku dvom susedným uhlíkovým atómom, dioxolanylmetylskupiny voliteľne substituované na dioxolanovom kruhu nižším alkylom alebo C₂- až Cô-alkanoyloxymetylskupinami, voliteľne substituovanými na oxometylskupine nižším alkylom. Ak skupina R³, tvoriaca biolabilný ester, je alebo obsahuje nižší alkyl, môže tento alkyl byť vetvený alebo nevetvený a môže obsahovať 1 až 4 uhlíkové atómy. Ak skupina, tvoriaca biolabilný ester, je voliteľne substituovanou fenyl-nižšou-alkyl-skupinou, môže táto skupina obsahovať alkylénový reťazec, s 1 až 3. s výhodou 1. uhlíkových atómov a je to výhodne benzyl. Ak fenylový kruh je substituovaný nižším alkylénovým reťazcom, môže tento reťazec obsahovať 3 až

4. s výhodou 3. uhlíkové atómy Ak R’ je voliteľne substituovanou alkanoyloxymetylskupinou. môže táto skupina byť s výhodou vetvenou alkanoyloxyskupinou s 2 až 6, s výhodou s 3 až 5. uhlíkovými atómami a môže byť napríklad pivaloyloxymetylovým radikálom (= terc-butylkarbonyloxymetylovým radikálom).

Vhodnými skupinami R^2a. tvoriacimi biolabilné estery karboxylových kyselín, sú také, ktoré môžu byť štiepené pri fyziologických podmienkach in vivo pri uvoľnení kaiboxylových kyselín a zodpovedajú skupinám doloženým ako skupiny R³ vyššie.

Skupiny R^lb a R^2b, vhodné ako skupiny tvoriace biolabilné estery kyseliny fosforečnej, sú také. ktoré môžu byť odstránené pri fyziologických podmienkach in vivo pri uvoľnení príslušného derivátu kyseliny fosforečnej. Napríklad, skupiny, ktoré sú vhodné na tento účel. sú nižšie alkylskupiny, C2- až C₆-alkanoyloxymetylskupiny voliteľne substituované na oxymetylskupine nižším alkylom, alebo fenyl alebo fenyl-nižší-alkylskupinv. ktorých fenylový kruh je voliteľne mono- alebo polysubstituovaný nižším alkylom. nižším alkoxylom alebo nižším alkylénovým reťazcom, viazaným ku dvom susedným uhlíkovým atómom.

Ak skupina R^lb a/alebo R^2b. tvoriaca biolabilný ester, je alebo obsahuje nižší alkyl, môže tento alkyl byť vetvený alebo nevetvený a môže obsahovať 1 až 4 uhlíkové atómy. Ak R^lb a/alebo R^2b sú voliteľne substituovanou alkanoyloxymetylskupinou, môže táto skupina obsahovať s výhodou vetvenú alkanoyloxyskupinu, ktorá má 2 až 6, s výhodou 3 až 5, uhlíkových atómov a môže. napríklad, byť pivaloyloxymetylovým radikálom (= tercbutylkarbonyloxymetylovým radikálom). Ak R^lb a/alebo R^2b sú voliteľne substituovanou fenyl-nižšou-alkyl-skupinou. môže táto skupina obsahovať alkylénový reťazec, ktorý má 1 až 3. s výhodou 1. uhlíkové atómy. Ak je fenylový kruh substituovaný nižším alkylénovým reťazcom, môže tento reťazec obsahovať 3 až'4, s výhodou 3, uhlíkové atómy a substituovaný fenylový kruh je s výhodou indanyl.

Vhodné fyziologicky použiteľné soli kyselín vzorca I zahrnujú ich soli alkalických kovov, soli kovov alkalických zemín alebo amónne soli, napríklad soli sodíka, draslíka alebo vápnika alebo soli s fyziologicky použiteľnými, farmakologicky neutrálnymi organickými amínami, ako napríklad dietylamínom alebo terc-butylamínom, alebo s fenyl-nižšímialkylamínami, ako a-metylbenzylamínom.

Látky vzorca I obsahujú aspoň jeden chirálny uhlíkový atóm, najmä ten uhlíkový atóm, ktorý nesie postranný reťazec amidu v polohe 3 benzazepínovej štruktúry. Látky tak môžu byť prítomné v dvoch opticky stereoizomérnych formách alebo ako racemát. Tento vynález zahrnuj e jednak racemické zmesi, tak aj izomérne čisté látky vzorca I. Ak v latkách vzorca I je skupina A znázornená vzorcom II, potom látky vzorca I obsahujú dva chirálne uhlíkové atómy, najmä uhlíkový atóm v polohe 3 benzazepínu a nesie postranný reťazec amidu, a uhlíkový atóm postranného reťazca amidu, ktorý nesie radikál R^la. Tie látky vzorca I, v ktorých je skupina A znázornená vzorcom II. môžu preto existovať v niekoľkých opticky aktívnych stereoizomérnych formách alebo ako racemáty. Podľa tohto vynálezu sa môžu použiť jednak racemické zmesi, tak aj izomérne čisté látky. Ak v latkách vzorca I je skupina A znázornená vzorcom III a R^lb a R^2b nie sú vodík a majú v každom prípade rozdielnu štruktúru, potom atóm fosforu skupiny fosforečnej kyseliny môže tiež byť chirálny. Vynález sa tiež týka izomérnych zmesí a izomérne čistých látok vzorca I, v ktorých skupina A je znázornená vzorcom III, ktoré vznikajú ako dôsledok chirálnych atómov fosforu.

Podľa tohto vynálezu, látky vzorca I, ich soli a biolabilné estery môžu byť získané spôsobom známym per se v tomto odbore (viď. nižšie).

V rámci tohto vynálezu boli s výhodou objavené látky primáme inhibičné k NEP, ako sú deriváty benzazepinon-N-octovej kyseliny so štruktúrou podľa vzorca Ia alebo ako sú fosfono-substituované deriváty benzazepinonu so štruktúrou podľa vzorca Ib.

Látky so štruktúrou podľa vzorca la sú už známe ako látky inhibujúce NEP podľa patentu US 5,677,297, podľa ktorého vyššie uvedené látky sú používané na liečenie chorôb alebo ťažkostí, na ktoré je odkazované vyššie. Látky podľa vzorca la majú nasledovnú štruktúru

v ktorej

R^la je fenyl-nižší-alkyl-skupinou, ktorá môže byť voliteľne substituovaná na fenylovom jadre nižším alkylom, nižším alkoxylom alebo halogénom alebo je naftyl-nižší-alkyl-skupinou, R^2a je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester a R³ je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester, a fyziologicky použiteľné soli kyselín podľa vzorca I.

Tam, kde substituenty v látke vzorca la sú alebo obsahujú nižšie alkylskupiny alebo alkoxyskupiny, môžu tieto skupiny byť rovnými alebo vetvenými reťazcami a môžu obsahovať s výhodou 1 až 4, výhodnejšie 1 až 2, uhlíkové atómy a sú s výhodou metyl alebo metoxy. Tam, kde substituenty obsahujú halogén, výhodne sú vhodné fluór, chlór alebo bróm, výhodnejšie sú vhodné fluór alebo chlór.

V radikály R^la môže nižší alkylénový reťazec obsahovať 1 až 4, s výhodou 1 až 2 uhlíkové atómy. S výhodou môže R^la byť voliteľne substituovanou skupinou fenetylovou, a ktorá môže byť voliteľne substituovaná jedným alebo viacerými halogénmi, nižším alkoxylom alebo nižším alkylom. alebo je skupinou naftyletylovou.

Látky vzorca la sú voliteľne esterifikované deriváty di karboxylových kyselín. V závislosti na spôsobe aplikácie, biolabilné monoestery. s výhodou látky, u ktorých R^2a je skupinou tvoriacou biolabilný ester a R³ je vodík, alebo dikarboxylové kyseliny, sú výhodné, pričom dikarboxylové kyseliny sú s výhodou vhodné na vnútrožilovú aplikáciu.

Vhodnými skupinami R^2a a R³, v latkách vzorca la, tvoriacich biolabilné estery', sú nižšie alkylskupiny. fenyl alebo fenvl-nižšej-alkyl-skupiny, ktoré môžu byť voliteľne substituované na fenylovom kruhu nižším alkylom alebo nižším alkylénovým reťazcom, viazaným ku dvom susedným uhlíkovým atómom, dioxolanylmetylskupiny, ktoré sú voliteľne substituované na dioxolanovom kruhu nižším alkylom, alebo C2- až Cýalkanoyloxymetylskupiny voliteľne substituované na oxymetylskupine nižším alkylom. Tam, kde skupiny R^2a alebo R³, tvoriace biolabilný ester, sú nižším alkylom, môže tento alkyl byť s výhodou nevetvenou alkylskupinou s 1 až 4, výhodnejšie s 2, uhlíkovými atómami. Tam. kde je skupina, tvoriaca biolabilný ester, voliteľne substituovanou fenyl-nižší-alkyl-skupinou, jej alkylénový reťazec môže obsahovať 1 až 3, s výhodou 1, uhlíkové atómy. Tam, kde je fenylový kruh substituovaný nižším alkylénovým reťazcom, môže tento reťazec obsahovať 3 až 4, s výhodou 3, uhlíkové atómy. Fenyl, benzyl alebo indanyl sú s výhodou vhodné ako substituenty R^2a a/alebo R³, obsahujúce fenyl. Tam, kde R^2a a/alebo R³ sú voliteľne substituovanou alkanoyloxymetylskupinou, ich alkanoyloxyskupina môže obsahovať 2 až 6, s výhodou 3 až 5, uhlíkových atómov a je s výhodou vetvená a môže byť, napríklad, pivaloyloxymetylovým radikálom (= terc-butylkarbonyl-oxymetvlovým radikálom).

Vhodné fyziologický akceptovateľné soli dikarboxylových kyselín alebo monoesterov vzorca L zahrnujú ich soli s alkalickými kovmi, soli s kovy alkalických zemín alebo amónne soli. napríklad soli sodíka alebo vápnika alebo soli s fyziologicky vhodnými, farmaceutický neutrálnymi organickými amínami. ako napríklad dietylamínom alebo terc-butylamínom.

Látky vzorca la obsahujú dva chirálne uhlíkové atómy, najmä uhlíkový atóm, ktorý je v polohe 3 benzazepínu a nesie amidový postranný reťazec a uhlíkový atóm amidového postranného reťazca, ktorý nesie radikál R^ld. Tieto látky môžu preto existovať v niekoľkých opticky aktívnych stereoizomémych formách alebo ako racemát. Podľa tohto vynálezu môžu byť použite jednak ako racemické zmesi, tak aj izomérne čisté látky vzorca la.

Podľa tohto vynálezu, látky vzorca la a ich soli a biolabilné estery môžu byť pripravené spôsobom známym per se v tomto odbore, napr. tak, ako je uvedené v patente US

5,677.297.

Preferované látky vzorca la, sú napr. tie, v ktorých R a/alebo R³ sú skupiny tvoriace biolabi 1 ný ester a ich fyziologicky vhodné soli. Skupiny, tvoriace biolabilný ester, môžu byť nižšie alkylskupiny, alebo fenyl alebo fenyl-nižšia-alkyl-skupina. s výhodou fenyl, benzyl alebo indanyl. ktoré sú voliteľne substituované na fenylovom kruhu nižším alkylom alebo nižším alkylénovým reťazcom v iazaným ku dvom susedným uhlíkovým atómom, alebo dioxolanylntetylskupina. s výhodou (2,2-dimetyl-l,3-dioxolan-4-yl)metyl, ktorý je voliteľne substituovaný na dioxolanovom kruhu nižším alkylom, alebo C2- až C_ftalkanoyloxyntetylskupina voliteľne substituovaná na oxymetylskupine nižším alkylom. S v ýhodou sú preferované látky vzorca la, ktoré sú vyznačené tým, že R² je skupina tvoriaca biolabilný ester a R’je vodík.

Preferovanými príkladmi látok vzorca la sú s výhodou, napr.:

(3S,2'R)-3-11 -[2'-karboxy-4'-fenylbutyl]cyklopentán-l-karbonylamino}-2,3,4,5-tetrahydro2-oxo-IH-l-benzazepin-1-octová kyselina, (látka la-1);

(3 S.2'R )-3- j 1 -[2'-(etoxykarbonyl)-4'-fenylbutyl]cyklopentán-l-karbonylamino}-2,3.4.5tetrahydro-2-oxo-1 H- 1-benz.azepín-l -octová kyselina, (látka Ia-2);

(3S.2'R)-3- í 1 -[2'-(etoxykarbonyl)-4'-naftylbutyl]cyklopentán-l-karbonylamino}-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-l H-l-benzazepín-1-octová kyselina, (látka Ia-3); a ich fyziologicky vhodné soli kyselín alebo solváty.

Ďalšie výhodné príklady látok vzorca la sú napr.:

3- {1 -[2'-(etoxykarbonyl)-4'fcnylbutyl]cyklopentán-l-karbonylamino }-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-1 H-1-benzazepín-1 -acetát-terc-butylester, (látka Ia-4);

3- {1 -[2'-(eloxykarbonyl)-4'fenylbutyl]cyklopentán-l-karbonylamino}-2,3,4,5-tetrahydro-2 oxo-1 H-l-benzazepín-1-octová kyselina, (látka Ia-5);

(3S,2'R)-3-{ l-[2'-(etoxykarbonyl)-4'-fenylbutyl]cyklopentán-l-karbonylamino}-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-l H-l-benzazepín-1-acetát-terc-butylester, (látka Ia-6); (3S,2'R)-3-[l-(2'-karboxy-4'-fenylbutyl)cyklopentán-l-karbonylamino]-2,3,4,5-tetrahydro-2 oxo-1 H-l-benzazepín-1-octová kyselina, (látka Ia-7);

-{1 -[2'-(terc-butoxykarbonyl)-4'fenylbutyl]cyklopentán-l-karbonylamino} -2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-l H-l -benzazepín-1-acetát-terc-butylester, (látka Ia-8);

3-[ 1 -(2'-karboxy-4'fenylbutyl)cyklopentán-l-karbonylamino]-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo- 1H-1 benzazepín-1-octová kyselina, (látka Ia-9);

3-{ l-[2'-(terc-butoxykarbonyl)-4'fenylbutyl]cyklopentán-l-karbonylamino}2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo- ΙΗ-1-benzazepín-l-acetát-benzylester, (látka la-10);

3-[ 1 -(2'-karboxy-4'fenylbutyl)cyklopentán-l-karbonylamino]-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-lH-l benzazepín-1-acetát-benzylester, (látka Ia-11);

3-{ l-[2'-(terc-butylkarbonyloxymetoxykarbonyl)-4'fenylbutyl]cyklopentán-lkarbonylamino} -2.3.4.5-tetrahydro-2-oxo-l H-l -benzazepín- 1-acetát-benzylester, (látka Ia12);

-J 1 -[2 '-(pivaloyloxymetoxykarbonyl)-4'fenylbutyl]cyklopentán-l-karbonylamino}-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-1 H-l -benzazepín-1 -octová kyselina, (látka Ia-13);

a ich fyziologicky vhodné soli kyselín alebo solváty.

Látky so štruktúrou podľa vzorca Ib sú už známe ako látky inhibujúce NEP a ďalej ako slabé inhibítory enzýmu premieňajúceho endotelín (inhibítory ECE) na základe patentu US 5,952,327 a sú použiteľné na liečenie ochorení alebo ťažkostí spomínaných vyššie. Preto sa tento vynález tiež týka látok vzorca Ib,

v ktorom

R^lb je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester kyseliny fosforečnej,

R^2b je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester kyseliny fosforečnej a

R³ je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester karboxylovej kyseliny a fyziologicky použiteľné soli kyselín odvodených od vzorca Ib.

Látky vzorca Ib sú deriváty kyselín vrátane karboxylových kyselín a skupín odvodených od kyseliny fosforečnej, ktoré sú voliteľne esterifikované skupinami tvoriacimi biolabilné estery. Biolabilné estery vzorca Ib sú prekurzory liečiv odvodených od voľných kyselín. V závislosti na forme aplikácie, sú preferované biolabilné estery alebo kyseliny, pričom kyseliny sú s výhodou vhodné pre vnútrožilovú aplikáciu.

Skupiny R^!b a R^2b vhodné ako skupiny, tvoriace biolabilné estery kyseliny fosforečnej, sú tie, ktoré môžu byť odstránené pri fyziologických podmienkach in vivo pri uvoľnení príslušných funkčných skupín kyseliny fosforečnej. Napríklad, skupiny, ktoré sú vhodné na tento účel, sú nižšie alkylskupiny, C2- až Cé-alkanoyloxymetylskupiny voliteľne substituované na oxymetylskupine nižším alkylom, alebo fenyl alebo fenyl-nižšej-alkylskupiny, ktorých fenylový kruh je voliteľne mono- alebo polysubstituovaný nižším alkylom, nižšou alkoxyskupinou alebo nižším alkylénovým reťazcom, viazaným ku^-dvom susedným uhlíkovým atómom. Ak skupina R^lb a/alebo R^2b, tvoriaca biolabilný ester, je alebo obsahuje nižší alkyl, môže tento alkyl byť v etvený alebo nevetvený a môže obsahovať 1 až 4 uhlíkové atómy. Ak R^lp a/alebo R^2b sú voliteľne substituovanou alkanoyloxymetylskupinou, môže táto skupina obsahovať s výhodou vetvenú alkanoyloxyskupinu s 2 až 6, výhodnejšie 3 až 5, uhlíkovými atómami a môže napríklad byť pivaloyloxymetylovým radikálom (= tercbutylkarbonyloxymetylovým radikálom). Ak R^lb a/alebo R^2b sú voliteľne substituovanou fenvl- nižšou-alkylskupinou, môže táto skupina obsahovať alkylénový reťazec s 1 až 3, s výhodou s 1, uhlíkovými atómami. Ak je fenylový kruh substituovaný nižším alkylénovým reťazcom, môže tento obsahovať 3 až 4, s výhodou 3, uhlíkové atómy a tento substituovaný fenylový kruh je s výhodou indanyl.

Vhodné skupiny R’ pre látky vzorca Ib. tvoriace biolabilné estery karboxylových kyselín, sú také, ktoré sa môžu štiepiť pri fyziologických podmienkach in vivo pri uvoľnení karboxylovej kyseliny. Napríklad, skupiny, ktoré sú vhodné na tento účel, sú nižšie alkylskupiny. fenyl alebo fenyl-nižšie-alkylskupiny, ktorých fenylový kruh je voliteľne monoalebo polysubstituovaný nižším alkylom alebo nižšou alkoxyskupinou alebo nižším alkylénovým reťazcom, viazaným ku dvom susedným uhlíkovým atómom, dioxolanylmetylskupiny, voliteľne substituované na dioxolanovom kruhu nižším alkylom alebo C₂- až Cô-alkanoyloxymetylskupiny, voliteľne substituovanej na oxymetylskupine nižším alkylom. Ak skupina R³, tvoriaca biolabilný ester, je alebo obsahuje nižší alkyl, môže tento alkyl byť vetvený alebo nevetvený a môže obsahovať 1 až 4 uhlíkové atómy. Ak skupina, tvoriaca biolabilný ester, je voliteľne substituovanou fenyl-nižšou-alkyl-skupinou, môže táto skupina obsahovať alkylénový reťazec s I až 3, výhodne s I, uhlíkovými atómami a je s výhodou benzylom. Ak je fenylový kruh substituovaný nižším alkylénovým reťazcom, môže tento reťazec obsahovať 3 až 4. s výhodou 3. uhlíkové atómy. Ak R/ je voliteľne substituovanou alkanoyloxymetylskupinou. môže táto skupina obsahovať s výhodou vetvenú alkanoyloxyskupinu s 2 až 6, s výhodou s 3 až 5. uhlíkovými atómami a môže byť napríklad pivaloyloxymetylovým radikálom.

Podľa tohto vynálezu sa môžu látky vzorca Ib a ich soli a biolabilné estery získať spôsobom známym per se v tomto odboíe.

Vhodné fyziologicky použiteľné soli kyselín vzorca Ib sú v každom prípade ich soli s alkalickými kovmi, s kovmi alkalických zemín alebo amónne soli, napríklad ich soli sodné, draselné alebo vápenaté, alebo soli vhodné fyziologicky, farmaceutický neutrálne organické amíny, ako napríklad dietylamín, terc-butylamín alebo fenyl-nižšie-alkylamíny, ako a-metylbenzylamín.

Látky vzorca Ib obsahujú chirálny uhlíkový atóm, najmä uhlíkový atóm nesúci amidový postranný reťazec v polohe 3 benzazepinové štruktúry. Látky tak môžu byť prítomné v dvoch opticky aktívnych stereoizomérnych formách a alebo ako racemát. Tento vynález zahrnuje jednak racemické zmesi, tak aj izomérne čisté látky vzorca L Ak R^lb a R^2h v látke vzorca Ib nie sú vodík a majú v každom prípade odlišný význam, môže atóm fosforu zo skupiny kyseliny fosforečnej byť tiež chirálny. Vynález sa tiež týka izomérnych zmesí a izomérne čistých látok vzorca 1, ktoré sa tvoria ako dôsledok chirálnych atómov fosforu.

Preferovanou látkou vzorca Ib je taká, v ktorej R³ je vodík alebo nižší alkyl, napr. C|-až Cj-alkyl. s výhodou C| až C₂-alkyl a fyziologicky vhodné soli kyselín odvodených zo vzorca Ib.

Zvláštne príklady látok vzorca Ib sú. napr.:

Benzyl-(3.S')-3-( I -dibenzylfosfonometylcyklopentán-1 -karbons lamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-111-1 -benzazepín-l -acetát, (= látka Ib-1);

(35)-3-( 1 -dibenzylfosfonometylcyklopentán-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-l H

1- benzazepín-l-octová kyselina, ( = látka lb-2):

Benzyl-t3S')-3 -(l-benzyletylfosfonometylcyklopentán-l-karbonylamino)-2,3.4,5tetrahydro-2-oxo-l H-1-benzazepín-l-acetát. (= látka Ib-3);

Ety 1-(35)-3-( 1 -benzyletylfosfonometylcyklopentán-1 -karbonylamino)-2,3,4.5-tetrahvdro2- oxo-l H-1-benzazepín-1-acetát, (= látka Ib-4);

Etyl-(35)-3 -(1 -etylfosfonometylcyklopentán-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo1 H-1-benzazepín-l-acetát. (= látka Ib-5);

Etyl-(35)-3 -[l-(pivaloyloxymetyletylfosfonometyl)cyklopentán-l-karbonylamino]2,3,4.5-tetrahydro-2-oxo-l H-1-benzazepín-l-acetát, (- látka Ib-6); Etyl-(35)-3-[l-(5-indayletylfosfonometyl)cyklopentán-l-karbonylamino]-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-lH-l-benzazepín-l-acetát-(= látka Ib-7); terc-Butyl-(35)-3-( l-benzyletylfosfonometylcyklopentán-l-karbonylamino)-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-l H-1-benzazepín-l-acetát, (= látka Ib-8);

Benzyl-(35)-3-(l-etylfosfbnometyIcyklopentán-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-1 H-1-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-9);

Benzyl-(35)-3-(l-dietylfosfonometylcyklopentán-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-1 H-1-benzazepín-l-acetát, (= látka Ib-10);

(35)-3-( 1 -Dietylfosfonometylcyklopentán-l -karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo- 1H1-benzazepín-l-octová kyselina, (= látka Ib-11);

Etyl-(35)-3-(l-dietylfosfonometylcyklopentán-l-karbonyIamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-1 H-1-benzazepín-l-acetát, (= látka Ib-12);

Etyl-(353-3 -(l-fosfonometylcyklopentán-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-l H-lbenzazepín-1-acetát, (= látka Ib-13);

Benzyl-(3N)-3-( 1 -fosfonometylcyklopentán-1 -karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-l H 1-benzazepín-l-acetát. (= látka Ib-14);

Benzyl-(3.7)-3-(1 -diizopropylfosfonometylcyklopentán-l-karbonýlamino)-2,3.4,5tetrahydro-2-oxo-l H-1-benzazepín-l-acetát. (= látka Ib-15):

Benzyl-(37)-3-(l -benzylizopropylfosfonometylcyklopentán-l-karbonylamino)-2,3,4.5tetrahydro-2-oxo-1 H- 1-benzazepín-l -acetát, (= látka Ib-16);

terc-Butyl-(3.S)-3 -(1 -etylfosťonometylcyklopentán-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-1 H-1-benzazepín-l-acetát. (= látka Ib-17);

terc-Butyl-(3.S)-3 -[ 1 -(pivaloyloxymetyletylfosfonometyl)cyklopentán-l-karbonylamino]2.3.4.5-tetrahydro-2-oxo-1 H-1-benzazepín-l-acetát, (- látka Ib-18):

terc-Buty 1 -(37)-3-(1 -fosfonometylcyklopentán-1 -karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo1 H-1-benzazepín-l-acetát. (= látka lb-19);

a ich fyziologicky vhodné soli kyselín.

Preferované príklad) látok vzorca lb sú s výhodou napr. látka Ib-2, látka Ib-8, látka lb alebo látka Ib-19. výhodnejšie látka lb-8 a ich fyziologicky vhodné soli kyselín.

Tento vynález prvý raz predkladá dôkaz, že spolu s metaloproteázou ECE-1. skôr známou v tomto odbore, je tiež enzým, premieňajúci endotelín typu IGS5, metaloproteázou, ktorá sa zúčastňuje štiepenia big-ET-1 na ET-1. Preto zistenie podľa tohto vynálezu predkladajú novú a perspektívnu možnosť pokiaľ ide o zlepšenie terapeutických konceptu na liečenie a/alebo profylaxiu rôznych chorôb ovplyvnených a/alebo implikovaných štiepením big-ET-1 na ET-1 za účasli 1GS5, pretože tento vynález navrhuje identifikáciu a použitie terapeuticky aktívnych látok, ktoré, okrem iného, špecificky inhibujú metaloproteázu typu 1GS5, skôr než skúmať a používať látky, ktoré sa prednostne viažu ku známej ECE-1.

Je potrebné zdôrazniť, že látky vzorca la alebo vzorca lb, spomenuté vyššie, boli pôvodné vybrané v tomto odbore na základe ich inhibičnej aktivity k NEP. Prekvapujúco nájdená veľmi vysoká aktivita týchto látok k IGS5 in vitro podľa tohto vynálezu, je doplnená schopnosťou týchto látok podstatne znížiť vazokonstrikčný .účinok big-ET-1 u skúmaných krýs.

Na záver, výskumy podľa tohto vynálezu dospeli k nájdeniu novej metaloproteázy podobnej ECE/NEP. ktorá účinné štiepi big-ET a je citlivá nielen na známy inhibítor enzýmu premieňajúceho endotelín. fosforamidonu, ale prekvapujúco aj k radu definovaných inhibítorov metaloproteáz so štruktúrou podľa vzorca I, výhodne so štruktúrou podľa vzorca la alebo vzorca lb. Preto je možné, že IGS5 môže zohrávať úlohu pri produkcii ET-1 a že látky so štruktúrou podľa vzorca I, s výhodou látky podľa vzorca la alebo vzorca Ib, môžu uplatniť svoj účinok in vivo inhibíciou novo identifikovaného metaloproteázového enzýmu

IGS5.

Preto sa začalo s ďalšími štúdiami, objasňujúcimi distribúciu tkanív, fyziologickú funkciu a patologickú úlohu IGS5 počas rôznych chorôb, s výhodou počas hypertenzie. ľadvinového ochorenia a zlyhanie srdca, v kontexte s týmto vynálezom týkajúcim sa látok, ktoré vykazujú kombinovanú alebo súbežnú inhibičnú aktivitu k NEP/IGS5.

V dvojnásobne slepej klinickej štúdii, týkajúcej sa skúmania placeba, ktorá zahrnula trinásť zdravých dobrovoľníkov, inhibovala látka Ia-2 v závislosti na dávke látky odozvu tlaku indukovaného big-ET a zreteľne preukázala nárast hladiny ANP, závislý na dávke, čím indikovala svoje inhibičné vlastnosti k NEP. Hladina ET-1 sa nezvyšuje, ako by sa očakávalo od selektívneho inhibítora NEP, pokým hladina big-ET sa zvyšovala v závislosti na dávke látok skupiny Ia-2 pri porovnám so skupinou placeba, čím sa indikovalo, že rozpad big-ET sa tak isto inhiboval. Dokázať koncept klinickej účinnosti a bezpečnosti látky Ia-2 na človeka, bolo uskutočnených 6 klinických pokusov na zdravých dobrovoľníkoch a 2 dôkazy konceptu liečenia boli uskutočnené na pacientoch: Jeden náhodný, placebom kontrolovaný dvojnásobne slepý pokus na pacientoch s hypertenziou (N=l 91) a jeden otvorený, pilotný pokus s kontrolou základnej línie na pacientoch s celkovým zlyhaním srdca (N=29). Na základe výsledkov bol podaný dôkaz inhibície neutrálnej endopeptidázy (NEP) významné zvýšenú a podporovanú koncentráciou ANP v plazme a jej druhého messengerovské cGMP u dvoch dobtovoľníkov a pacientov- po orálnom dávkov aní látky Ia-2. Ďalej výsledky u pacientov s celkovým ziyhaním srdca ukázali významnú pozitívnu koreláciu medzi logaritmom koncentrácie látky la-1 (aktívneho metabolitu látky Ia-2) v plazme a hladinou big-ET v plazme po aplikácii látky Ia-2 (p<0.001). Skutočne hladina big-ET v plazme mala tendenciu narastať od základnej línie po aplikácii látky Ia-2 (200 mg: 4.9 až 6.5 fmol/ml (+32.6%); 400 mg: 2.3 až 3.5 fmol/ml (+5b%)). čo podporuje koncept účinnosti orálne aplikovanej látky Ia-2 na prevenciu štiepenia big-ET. Najdôležitejšie je. že látka Ia-2 prvý raz poskytla dôkaz významnej a klinicky relevantnej anti-hypertenzívnej aktivity počas nedávno ukončenej 4-týždennej štúdie (N=l 91) u pacientov s hypertenziou stupňa 1-11 podľa WIIO. U populácie pacientov uvažovaných na liečbu (ITT), sa meraný diastolický krvný tlak verzus placebo znížil o -6.9 mm Hg (posledná hodnota pri liečení; p<0.001) a meraný systolický krvný tlak verzus placebo sa znížil o -9.2 mm Hg (posledná hodnota pri liečení; p=0.003) pri najvyššej skúmanej dávke (200 mg). Toto zistenie má zvláštny význam, pretože pri čistých inhibítoroch

NEP bol demonštrovaný nárast koncentrácie ET-1 a následne skôr nárast než pokles krvného tlaku.

Ďalšie štúdie sú plánované na výskum závislostí srdcových hemodynamických parametrov na dávke pri látke Ia-2 u pacientov s celkovým zlyhaním srdca a na výskum časového priebehu anti-hypertenzívneho účinku po jedinej každodennej dávke u pacientov s hypertenziou.

Metaloproteáza IGS5 v kontexte tohto vynálezu

V kontexte tohto v ynálezu bolo odkázané na polypeptidy IGS5 (alebo enzýmy 1GS5 alebo metaloproteázy IGS5. t.j. na IGS5PROT. IGS5PROT1 alebo IGS5PROT2), s výhodou na ľudské polypeptidy IGS5 (alebo ľudské enzýmy IGS5). Polypeptidy IGS5 môžu prináležať k polypeptidom. najmä k polypeptidom ľudskýn?. obsahujúcim sekvenciu aminokyselín, ktorá je najmenej zo 70% zhodná, výhodnejšie najmenej 80% zhodná a ešte výhodnejšie najmenej 85% zhodná, a ešte výhodnejšie najmenej 90% zhodná, a ešte výhodnejšie najmenej 95% zhodná a s najväčšou výhodou 97% až 99% zhodná s tou. ktorá bola vybraná zo skupiny SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:4 SEQ a SEQ E) NO:6. Takéto polypeptidy zahrnujú polypeptidy obsahujúce polypeptid IGS5. ktorý je zhodný s polypeptidom so sekvenciou aminokyselín zo skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 SEQ a ID NO:6.

Takéto polypeptidy tiež zahrnujú polypeptidy IGS5, s výhodou ľudské polypeptidy IGS5. ktoré majú sekvenciu aminokyselín najmenej 70% zhodnú, s výhodou najmenej 80% zhodnú a s väčšou výhodou najmenej 85% zhodnú, s ďalšou väčšou výhodou najmenej 90% zhodnú, s ďalšou väčšou výhodou najmenej 95% zhodnú a s najväčšou výhodou 97% až 99% zhodnú s tou, ktorá bola vybraná zo skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6. Takéto polypeptidy zahrnujú polypeptidy ÍGS5, ktorý sú zhodné s polypeptidom so sekvenciou aminokyselín zo skupiny SEQ ID NO;2, SEQ ID NO;4 a SEQ ID NO;6.

Ďalšie polypeptid} podľa tohto vynálezu zahrnujú izolované polypeptidy IGS5, ktoré obsahujú sekvenciu obsiahnutú v SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.

Polypeptid}' IGS5 v kontexte tohto vynálezu sú členmi skupiny metaloproteázy neprilyzínu a s výhodou sú ľudskými polypeptidami. Sú zaujímavé, pretože bolo vyššie identifikovaných niekoľko dysfúnkeií, chorôb alebo ťažkostí, v ktorých nové identifikované metaloproteázy hrajú dôležitú rolu v patológii choroby.

Tak bolo podľa tohto vynálezu zistené, že polypeptidy IGS5 môžu byť zahrnuté v metabolizme biologicky aktívnych peptidov a že s výhodou sú tieto polypeptidy IGS5 enzýmy typu metaloproteáz. ktoré môžu mať vplyv na rad vazoaktívnych peptidov. Vazoaktívne peptidy, známe v tomto odbore, sú napr. také, ktoré sú podobné atriálnemu natriuretickému peptidu (ANP), bradykinínu. veľkému endotelínu (big ET-1), endotelínu (ET-1), substancii P a angiotenzínu 1. Ďalej bolo zistené, že ektodom^na 1GS5, ktorá je novou ľudskou metaloproteázou. účinne hydrolyzuje napr. in vitro celý rad spomínaných vazoaktívnych peptidov. s výhodou big-KT-1. bradykinín a substanciu P.

Enzýmy typu metaloproteáz)' IGS5 môžu byť inhibované spomínanými zlúčeninami, ktoré sa používajú na určenie ínhibičných vlastností, s ohľadom na enzýmy ktoré majú

ĽCE/NEP charakteristiky, napr. inhibícia látkami ako je fosforamidon. Ale žiadna inhibícia

1GS5 nebola pozorovaná pri použití spomínaných zlúčenín, ktoré selektívne inhibujú NEP. napr. žiadna inliibícia IGS5 látkami ako jc tiorfan alebo použitím spomínaných látok, ktoré selektívne inhibujú ECE. napr. žiadna inhibícia 1GS5 nebola pozorovaná u látok ako je SM19712 (Sumitomo, viď. vyššie).

Inhibícia 1GS5 by mohla byť pozorovaná pri vyšších koncentráciách len u spomínaných látok, ktoré inhibujú NEP^ZECE, napr. jedným z príkladov je inhibítor NEP/ECE, CGS-35066 (De Lombart a spol.. vyššie). Inhibičné údaje o týchto spomínaných latkách so zreteľom na inhibíciu enzýmov typu metaloproteázy ICrS5 podľa tohto vynálezu sú ďalej opísané nižšie v príkladoch.

Polypeptid) 1GS5 podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť akýmkoľvek vhodným spôsobom. Takéto polypeptidy zahrnujú izolované polypeptidy vyskytujúce sa v prírode, rekombinantne produkované polypeptidy, synteticky produkované polypeptidy alebo polypeptid) produkované kombináciou týchto spôsobov. Spôsoby prípravy takýchto polypeptidov sú v tomto odbore dobre známe. Tak v jednom príklade môže byť metaloproteáza IGS5 generovaná metódou čiastočne uvedenou v spoločne podávanej medzinárodnej patentovej prihláške PCT/EP 00/11532, ktorá je tu v odkaze spomenutá so zreteľom na jej celý obsah, najmä so zreteľom na homológiu klonovania génu ľudskej 1GS5 a na expresiu zodpovedajúceho ľudského proteínu 1GS5.

Zakódovanie polynukleotidov IGS5 zvaných metaloproteáz IGS5 sa môže tiež získať použitím štandardného klonovania a testovacích postupov, z knižnice cDNA získanej z mRNA v bunkách z tkanív ľudských semenníkov použitím derivatizačnej analýzy (EST) exprimovanej sekvencie (Adams. M.D. a spol. Science (1991) 252: 1651-1656; Adams, M.D. a spol.. Náture (1992) 355: 632-634; Adams. M.D. a spol.. Náture (1995) 377 Šupp:3-174). Polynukleotidy 1GS5 sa môžu získať z prírodných zdrojov ako sú genómové knižnice DNA alebo sa môžu syntetizovať použitím dobre známych a komerčne dostupných postupov (napr. F.M. Ausubel a spol., 2000. Current Protocols in Molecular Biology).

Keď sa použijú polynukleotidy IGS5 na rekombinantnú produkciu polypeptidov IGS5, môže polynukleotid sám zahrňovať kódovaciu sekvenciu pre dospelý polypeptid; alebo kódovacia sekvencia pre dospelý polypeptid je čítacím rámcom s ďalšími kódovacími sekvenciami, ako sú tie, ktoré kódujú riadiacu alebo sekrečnú sekvenciu, sekvenciu pre-, alebo pro- alebo prepro-proteínu alebo ďalších zmesových častí peptidu. Napríklad označovacia sekvencia môže s výhodou byť hexa-histidínový peptid. ako sa objavuje vo vektore pQE (Qiagen. Inc.) a ako popisuje Gentz a spol.. Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86: 821-824, alebo je substituentom HA. Polynukleotidy môžu tiež obsahovať nekódovacie sekvencie, ako transkribované, netranslatované sekvencie, čiastočné a polyadenylované signály, viazacie miesta ribozome a sekvencie, ktoré stabilizujú mRNA. Polynukleotidy IGS5, ktoré sú zhodné alebo dostatočne zhodné so sekvenciou nukleotidov obsiahnutú v SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 alebo SEQ ID NO:5 môžu byť použité ako hybridizačné sondy pre cDNA a genómovú DNA alebo ako priméry pre amplifikačnú reakciu nukleových kyselín (PCR), s cieľom izolácie celých cDNA a genómových klonov kódujúcich polypeptidy IGS5 a s cieľom izolácie cDNA a genómových klonov ďalších génov (vrátane génov kódujúcich paralogy z ľudských zdrojov a ortologov a paralogov z iných, než ľudských druhov), ktoré majú vysokú podobnosť sekvencie k SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 alebo SEQ ID NO:5. S výhodou sú tieto sekvencie nukleotidov najmenej v 70% zhodné, s väčšou výhodou najmenej v 80% zhodné, s ďalšou výhodou najmenej v 85% zhodné, s ďalšou väčšou výhodou najmenej v 90% zhodné, s najväčšou výhodou najmenej v 95% zhodné so sékvenciou referenčnej vzorky. Sondy alebo priméry v šeobecne obsahujú najmenej 15 nukleotidov, s výhodou najmenej 30 nukleotidov a môžu mať najmenej 50 nukleotidov. S veľkou výhodou preferov ané sondy búdou mať medzi 30 až 50 nukleotidov. S výhodou preferované priméry búdou mať-medzi 20 až 25 nukleotidov.

Polynukleotid 1GS5 kódujúci polypeptid IGS5, s výhodou polypeptid ľudskej IGS5. sa môže získať postupom, ktorý zahrnuje testovanie príslušnej knižnice za prísnych hybridizačných podmienkach so značenými vzorkami, ktoré majú sekvenciu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 alebo SEQ ID NO:5 alebo ich fragmenty; a pri izolácii celej cDNA a genómových klonov obsahujúcich spomenuté sekvencie polynukleotidov. Tiež hybridizačné techniky sú dobre známe odborníkovi z tohto odboru. Preferované prísne hybridizačné podmienky zahrnujú inkubáciu pri 42 °C cez noc, v roztoku obsahujúcom : 50% formamidu, 5xSSC (150 mM NaCl. 15 mM citrátu trisodného), 50 mM fosforečnanu sodného (pH 7.6),

5x Denhardtov roztok, 10% dextransulfátu (hm./obj.) a 20 pg/ml DNA z denaturovaných spermií lososa; nasleduje premytie filtrov v 0.1 x SSC pri približne 65 °C. Tak sa môžu získať polynukleotidy IGS5 testovaním príslušnej knižnice pri prísnych hybridizačných podmienok so značenými vzorkami, ktoré majú sekvenciu SEQ ID NO: 1, SEQ ID N0:3 alebo SEQ ID NO:5 alebo ich fragment.

Odborník v odbore zhodnotí, že v mnohých prípadoch bude izolovaná sekvencia cDNA nekompletná kvôli tomu, že kódovacia oblasť polypeptidu je prerušená na konci 5' cDNA. To je dôsledok reverznej transkriptázy, enzýmu s podstatne nižšou „spôsobilosťou (mierou schopnosti enzýmu zostať naviazaný na templát počas polymerizačnej reakcie), ktorý nie je schopný dokončiť kópiu DNA z templátu mRNA počas syntézy prvého vlákna cDNA. Existuje niekoľko dostupných metód dobre známych odborníkom v odbore, ktorými je možné získať celé cDNA. alebo predĺžiť krátke cDNA, napríklad metódy založené na spôsobe

Rýchlej Amplifikácie koncov cDNA (RAČE) (viď. napríklad Frohman a spol., PNAS USA

85. 8988-9002, 1988). Nedávne modifikácie tohto postupu, uskutočnené technológiou

MarathonTM (Clontech Laboratories Inc.) majú napríklad významne zjednodušené hľadanie dlhších cDNA. V technológii MarathonTM bola cDNA pripravená z mRNA extrahovanej z vybraných tkanív sekvencie „adaptora viazaného na každom konc'i. Amplifikácia nukleovej kyseliny (PCR) sa potom uskutočňuje amplifikáciou chýbajúceho konca 5’ cDNA použitím kombinácie oligonukleotidového priméru, ktorý’je génovo a adaptorovo špecifický. Reakcia

PCR sa potom opakuje použitím „viazaných primérov. t.j. primérov vytvorených v dvojitom reťazci v ampliftkovanom produkte (s výhodou primér špecifický k adaptoru, ktorý sa viaže ďalej na 3' v sekvencii adaptoru, primér špecifický ku génu, ktorý' sa viaže ďalej na 5' v známej sekvencii génu). Produkty reakcie sa potom môžu analyzovať sekvenovaním DNA a konštrukciou celej cDNA buď priamym naviazaním produktu na existujúcu cDNA na získanie kompletnej sekvencie alebo uskutočnením oddelenej PCR pre celú dĺžku použitím informácie o novej sekvencii pre vytvorenie priméru 5'.

Polypeptidy rekombinantnej IGS5 sa môžu pripraviť postupom dobre známym v tomto odbore z geneticky modifikovaných hostiteľských buniek obsahujúcich expresný systém, ktorý obsahuje polynukleotidy IGS5 alebo polynukleotidy. Hostiteľské bunky, ktoré sú geneticky modifikované takýmito expresnými systémami, sa môžu použiť na produkciu polypeptidov 1GS5 rekoinbinantnými postupmi. Bezbunkové translačné systémy sa tiež môžu použiť na produkciu takýchto proteínov IGS5 použitím RNA odvodených od predlôh DNA z ICS5.

Zavedenie polynukleotidov 1GS5 do hostiteľských buniek môže byť ovplyvnené metódami opísanými v mnohých štandardných laboratórnych manuáloch, ako Davisom a spol., Basic Methods in Molecular Biology (1986) a Salmbrookom a spol., Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989). Takéto metódy zahrnujú, napríklad, transfekciu fosforečnanom vápenatým, trasfekciu pomocou DEAE-dextránu, transvekciu, mikroinjektáž, transfekciu pomocou kationických lipidov, elektroporáciu, transdukciu, vyplnenie odierky, balistickú introdukciu alebo infekciu. Významné príklady príslušných hostiteľov zahrnujú bakteriálne bunky, ako bunky organizmov Streptococci. Staphylococci. E. coli. Streptomyces a Bacillus subtilis;

bunky húb. ako bunky kv asiniek a bunky Aspergillus: bunky hmyzu, ako bunky S2 z rodu Drosophila a S19 z rodu Spodoptera; živočíšne bunky, ako CHO. ČOS. HeLa. C127. 3T3. BHK. HEK 293 a bunky Bovvesovho melanómu: a rastlinné bunkv.

Môže sa použiť velká variabilita expresních systémov. napríklad, chromozomálne. epizomálne a systémy odvodené od vírusov, napr. vektory odvodené od bakteriálnych plaznndov. od bakteriofágov. od transpozónov, od epizómov kvasiniek, od vložených prvkov od chromozomálnych prvkov kvasiniek, od vírusov, ako bakulovírusov. papovavírusov. ako je

SV40. vakcinovírusov. adenovírusov. vírusov hydinových kiahní, vírusov’ pseudobesnoty a retrovírusov, a vektorov odvodených od kombinácie týchto v írusov. ako sú tie, ktoré sú odvodené od plazmidových a bakteriofágových genetických prvkov, ako kozmidov a fágomidov. Expresné systémy môžu obsahovať kontrolné regióny, ktoré regulujú, ako aj plodia, expresiu. Všeobecne sa môže použiť akýkoľvek systém alebo vektor, ktorý· je schopný udržať, propagovať alebo exprimovať polynukleotid na produkciu polypeptidu v hostiteľovi. Daná sekvencia nukleotidu môže byť vložená do expresného systému akýkoľvek z mnohých dobre známych postupov, ako sú napríklad tie, ktoré boli opísané Sambrookom a spol., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (viď. vyššie). Dané sekrečné signály môžu byť vložené do požadovaného polypeptidu. aby umožnili sekréciu proteínu po translácii do dutiny endoplazmatického retikula. periplazmatického priestoru alebo extracelulámeho prostredia. Tieto signály môžu byť endogénne k polypeptidu alebo to môžu byť heterológne signály, t.j. odvodené od rôznych druhov.

Ak sa má polypeptid exprimovať na použitie v teste, je všeobecne možné, že polypeptid ÍGS5 je produkovaný na povrchu bunky alebo alternatívne vo forme rozpustného proteínu. Ak je polv peptid ICiS5 vylučovaný do média, môže bvť médium obnovené s cieľom obnovenia a čistenia polypeptidu IGS5. Ak sa produkuje intracelulárne. musia byť bunky najprv rozštiepené pred tým, kým sa obnoví polypeptid IGS5. Ak je polypeptid IGS5 viazaný na povrch bunky (polypeptid viazaný na membránu), obvykle sa pripravia časti membrány s cieľom akumulácie polypeptidu IGS5 viazaného na membránu. Polypeptid IGS5 môže byť získaný a čistený z rekombinantných bunkových kultúr dobre známymi metódami vrátane vyzrážania síranom amónnym alebo etanolom, kyslej extrakcii, aniónovej alebo katiónovej výmennej chromatografii, chromatografii a fosfocelulóze. chromatografii založenej na hydrofóbnych interakciách, afinitnej chromatografii, hydroxylapatitovej chromatografii a lektínovej chromatografii. S výhodou sa na čistenie používa kvapalinová chromatografia s vysokou účinnosťou. Môžu sa použiť dobre známe postupy na obnovenie skladania proteínov na regeneráciu aktívnych konformácií, keď je polypeptid denaturovaný počas intracelulámej syntézy, izolácie a alebo čistení.

Izolované polynukleotidy-IGS5, s výhodou izolované ľudské polynukleotidy IGS5, ktoré sa môžu použiť na generovanie polypeptidu IGS5. obvykle obsahujú sekvenciu nukleotidu, ktorá je najmenej v 70% zhodná, s výhodou najmenej v 80% a s väčšou výhodou najmenej v 85% zhodná, ešte s ďalšou väčšou výhodou najmenej v 90% zhodná, s ďalšou väčšou výhodou najmenej v 95% zhodná so sekvenciou nukleotidu kódujúceho jeden z polypeptidov vybraných zo skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 alebo SEQ ID NO:6. cez celú kódovaciu oblasť. S týmto aspektom, polynukleotidy, ktoré majú najmenej 97% zhodu, sú vysoko preferované, zatiaľ čo tie, ktoré majú zhodu najmenej 98-99%, sú preferované ešte viac a tie, ktoré majú zhodu 99%, s výhodou 99.9%, sú najviac preferované. Napríklad také izolované, s výhodou ľudské, polynukleotidy IGS5, ktoré sa môžu použiť na generovanie polypeptidov 1GS5, zahrnujú sekvencie nukleotidov, ktoré majú zhodu najmenej 70%, s výhodou najmenej 80%, s väčšou výhodou najmenej 85%, s ešte väčšou výhodou najmenej 90%. s najväčšou výhodou najmenej 95%, cez celú dĺžku jednej sekvencie nukleotidu vybraného zo skupiny SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:5. Z tohto hľadiska.

polynukleotidv IGS5. ktoré obsahujú polynukleotidv 1GS5. ktoré obsahujú alebo majú sekvenciu nukleotidov v zhode najmenej 97% s jednou zo sekvencií nukleotidov vybraných zo skupiny SEQ II) NO: 1. SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:5, sú s výhodou preferované, zatiaľ čo tie, ktoré majú zhodu najmenej 98-99%. sú preferované s väčšou výhodou ä tie. ktoré majú zhodu najmenej 99%. s výhodou 99.9%, sú preferované s najväčšou výhodou. Sekvencia polynukleotidu IGS5. SEQ ID NO.l. (označovaná „IGS5DNA”) je uvedená v Tabuľke 1. ktorá uvádza sekvenciu cDNA ľudského pôvodu (Homo sapiens) s dĺžkou 2076 nukleotidov a obsahuje kódovaciu sekvenciu polypeptidu (z nukleotidu číslo 1 až. číslo 2073), ktorá kóduje polypeptid o 691 aminokyseline, polypeptid SEQ ID NO:2 (označovanú ako

..1GS5PROT). ktorá je uvedená v Tabuľke 2. Sekvencie nukleotidov SEQ ID NO:3 (označovaná ako „IGS5DNA1) je uvedená v Tabuľke 3, ktorá uvádza sekvenciu cDNA ľudského pôvodu (Homo sapiens) s dĺžkou 2340 nukleotidov (vrátane stopovacieho kodónu) a obsahuje sekvenciu kódujúcu polypeptid (od nukleotidu číslo 1 až číslo 2337), kódujúci polypeptid so 779 aminokyselinami, polypeptid SEQ ID NO:4 (označovanou ako

..IGS5PROT1). ktorá je uvedená v Tabuľke 4. Sekvencia nukleotidu SEQ ID ΝΟ.5 (označovaná ako „IGS5DNA2) je uvedená v Tabuľke 5 a uvádza sekvenciu cDNA ľudského pôvodu (Homo sapiens) s dĺžkou 2262 nukleotidov (vrátane stopovacieho kodónu) a obsahuje kódovaciu sekvenciu polypeptidu (od nukleotidu číslo 1 až číslo 2259), ktorá kóduje polypeptid so 75.3 aminokyselinami, polypeptid SEQ ID NO:6 (označovanú ako „IGS5PROT2), ktorá je uvedená v Tabuľke 6.

Tátkv s kombinovanou alebo súbežnou selektívnou inhibičnou aktivitou k NEP/IGS5 ako nový terapeutický koncept.

Zistením podľa tohto vynálezu je, že ukazuje, že metaloproteázy IGS5, napr. tiež v kombinácii s najmenej jednou ďalšou metaloproteázou. ako s výhodou s NEP a voliteľne v spojení s EC’E aúilebo ACT. sú zodpovedné za jednu alebo viacero biologických funkcií súvisiacich s chorobami spomínanými vyššie. Tak v najširšom aspekte, vynález predkladá nové terapeutické koncepty na liečenie spomínaných chorôb tak, ako už bolo uvedené vyššie, tým, že prvý raz navrhuje použitie látok s kombinovanou alebo súbežnou inhibičnou aktivitou k neutrálnej endopeptidáze (NEP) a k metaloproteáze 1GS5. alebo použiť ich farmaceutický použiteľných solí alebo solvátov alebo biolabilných esterov, na výrobu liečiv (farmaceutických zmesí) na liečenie cicavcov, s výhodou ľudí, ktorí trpia alebo sú citliví na podmienky, ktoré môžu byť zmiernené alebo preventované kombinovanou alebo súbežnou inhibíciou NEP a IGS5.

Takéto látky, použiteľné podľa vynálezu, ktoré môžu súbežne inhibovať funkciu metaloproteázy 1GS5 a NEP, môžu byť identifikované testovacími metódami použitím metaloproteázy IGS5 a voliteľne NEP, v teste na inhibíciu príslušného enzýmu. Takéto testy inhibície enzýmu sú podrobnejšie opísané v príkladoch nižšie. Na identifikáciu látok s kombinovanou alebo súbežnou selektívnou inhibičnou aktivitou kNEP/lGS5 sa môžu kandidátske látky testovať oddelene jednak počas inhibičného testu na NEP, tak aj počas inhibičného testu na IGS5. Látky inhibujúce NEP/IGS5 môžu byť identifikovaný mnohých zdrojov, napríklad buniek, bczbunkových preparátov, chemických knižníc a zmesí prírodných produktov.

Testovacia metóda môže jednoducho merať vplyv kandidátskej látky na aktivitu polypeptidu vylučovaného do média kultúry alebo buniek alebo membrán nesúcich polypeptid. Alternatívne môže testovacia metóda zahrnúť súťaž s kompetitívnou látkou. Ďalej môže testovacia metóda ukázať, či má kandidátska látka za následok signál generovaný aktiváciou alebo inhibíciou polypeptidu, využitím detekčných systémov súvisiacich s aktivitou polypeptidu vylučovaného do média kultúry alebo do buniek alebo membrán nesúcich polypeptid. Inhibícia aktivity polypeptidu sa všeobecne skúša v prítomnosti známeho substrátu a účinok kandidátskej látky sa pozoruje na základe zmenenej aktivity, napr. testovaním, či kandidátska látka má za následok inhibíciu polypeptidu. Napríklad testovacie metódy môžu jednoducho obsahovať zmiešanie kandidátskej látky s roztokom obsahujúcim skúmaný polypeptid, v kontexte tohto vynálezu, a porovnávať aktivitu polypeptidu so zmesou a so štandardom bez kandidátskej látky.

Tento vynález tiež umožňuje odborníkovi v odbore identifikovať látky. napr. kandidátske látky, pomocou testovacej metódy, zahrnujúcu zistenie tohto vynálezu tak. že sa spomenuté látky môžu ukázať ako perspektívny kandidáti liečiv, s výhodou s ohľadom na dysfunkcie. ťažkosti alebo choroby, na ktoré sa už vyššie odvolávalo Odborník v odbore ohodnotí, že metaloproteáza IGS5 môže byť použitá pri metóde vývoja inhibičných látok pre 1GS5 na základe ich štruktúry, a to pomocou:

(a) prvotné určenie alebo použitím trojrozmernej štruktúry metaloproteázy IGS5;

(b) dedukcie trojrozmernej štruktúry pre pravdepodobne reaktívne alebo miesto(a) väzby inhibítora 1GS5:

(c) syntézy kandidátsky ch látok, u ktorých sa predpokladá, že sa budú viazať alebo reagovať s predpokladanými väzobnými alebo reaktívnymi miestami; a (d) testovanie, či kandidátske látky sú skutočne inhibitormi IGS5.

Ďalej bude ukázané, že toto bude normálny iteratívny proces.

Dnes majú chemici v medicíne vedomosti o moderných stratégiách plánovania a uskutočňovania organickej syntézy s cieľom generovania nových zlúčenín a látok, ktoré sa oplatí skúmať kvôli ich potenciálnym fyziologickým alebo farmakologickým vlastnostiam a tieto látky sú preto sľubné osvedčiť sa ako perspektívny noví kandidáti na liečivá na liečenie a'alebo profylaxiu špecifických dysfunkcií, ťažkostí alebo chorôb. Ďalej je dnes bežné pripravovať knižnice látok pomocou kombinatómej chémie, napr. s výhodou všeobecných a

..riadených chemických knižníc alebo knižníc zlúčenín, v ktorých štruktúra a obmeny farmakoťomých skupín a rezíduí alebo substituentov sú skúsenému odborníkovi známe. Ak sú chemické knižnice alebo knižnice zlúčenín so stále neznámou štruktúrou látok skúmané v testoch, potenciálne perspektívne látky, napr. kandidátske látky, môžu byť, napokon, jednoducho analyzované z hľadiska ich štruktúry a chemických vlastností dnes dobre podloženými analytickými spôsobmi, ako napr. hmotovou spektroskopiou, nukleárnou magnetickou rezonanciou, infračervenými spektrami, body topenia, optickou rotáciou u zúčastnených chirálnych látok a elementárnou analýzou.

Vynález sa tiež týka procesu prípravy kandidátskej látky s definovanou chemickou štruktúrou schopnou inhibovať polypeptid IGS5, pričom tento proces zahrnuje výrobu látky alebo jej farmaceutický vhodné soli alebo biolabilného esteru pomocou chemickej syntézy, za predpokladu, že inhibičná aktivita látky k polypeptidu IGS5 je zistiteľná testovacou metódou, napr. ako je to uvedené v príkladoch tohto vynálezu.

Viac podrobností o napr. chemickej organickej syntéze a napr. chemických, analytických a fyzikálnych metódach možno nájsť v príručke Handbook „Houben-Weyl (Houben-Weyl, „Methoden der organischen Chemie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York) v jej najnovšej verzii.

Tento vynález sa tiež týka použitia látky podľa vzorca I, ako bolo spomenuté vyššie alebo jej farmaceutický vhodné soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru, na výrobu liečiva (farmaceutickej zmesi) na liečenie väčších cicavcov, s výhodou ľudí, ktorí trpia alebo sú citliví na podmienky, ktoré môžu byt' zlepšené alebo preventované kombinovanou alebo súbežnou inhibíciou (a) neutrálnej endopeptidázy (NEP) a (b) metaloproteázy IGS5. ktorá je polypeptidom obsahujúcim sekvenciu aminokyselín, ktorá má najmenej v 70° o zhodu ó po celej dĺžke k jednej zo sekvencií aminokyselín vybraných zo skupiny SEQ ID NO.2, SEQ ID N0:4 a SEQ ID N0:6.

S výhodou sa tento vynález týka použitia látok podľa vynálezu, s výhodou látok vzorca I. ktoré majú kombinovanú alebo súbežnú inhibičnú aktivitu k (a) neutrálnej endopeptidáze (NEP) a (b) metaloproteáze IGS5. ktorá je polypeptidom obsahujúcim sekvenciu aminokyselín, ktorá má najmenej v 70% zhodu 6 po celej dĺžke k jednej zo sekvencii aminokyselín vybraných zo skupiny SEQ ID NO:2. SEQ ID NO.4 a SEQ ID NO:6;

alebo jej farmaceutickv v hodným soliam alebo solvátom alebo biolabilným esterom, s cieľom výroby liečiva (farmaceutickej zmesi) na liečenie a/alebo profylaxiu hypertenzie, vrátane sekundárnych foriem hypertenzie. ako je ľadvinová alebo pľúcna hypertenzia. zlyhanie srdca, angína pectoris. arytmia. infarkt myokardu, srdečná hypertrofia, mozgová ischémia, periférne cievne ochorenie, subarachnoidálne krvácanie, chronická obštrukčná pľúcna choroba (COPD), astma, ľadvinové ochorenie, ateroskleróza a bolesť v dôsledku kolorektálnej rakoviny alebo rakoviny prostaty, u vyšších cicavcov, s výhodou u ľudí.

Látky vzorca 1 môžu byť pripravené podľa predpisu v patente US 5,677,297, ktorý je v hodný pre látky vzorca la a podľa patentu US 5,952.327. ktorý je vhodný pre látky vzorca lb

Komplexy proteínu s ligandom vo vývoji liečiv a optimalizácia vedúcej štruktúry.

Iný aspekt tohto vynálezu sa týka komplexu proteínu s ligandom, ktorý obsahuje polypeptid 1GS5 so zhodou najmenej 70% s jedným z polypeptidov SEQ ID NO:2. SEQ ID

NO:4 a SEQ ID NO:5 a látku, ktorá sa viaže na 1GS5, s výhodou látku s inhibičnou aktivitou k IGS5, ktorá je najmenej taká alebo porovnateľná s látkou vzorca 1. Takéto komplexy proteínu s ligandom sú s výhodou použiteľné v metódach vývoja liečiv, hľadaní vedúcich štruktúr, optimalizáciu vedúcich štruktúr a v modulačných metódach. Metódy sú dobre známe v tomto odbore. Na odkazy ako príklad viď. literatúru týkajúcu sa napr. kombinatómej syntézy a multidimenzionálnej NMR spektroskopie a jej prínosu na porozumenie v zťahov medzi proteínom a ligandom (Kessler, Angew. Chem. 1997, 109. 857-859; James K. Chen a spol., Angevv. Chem. 107 (045). S. 1041-1058). Ďalej viď. Lesík (Journal ot'Medicinal Chemistry.

34(199!). S. 2937-2945). ktorý popisuje štúdia molekulárnych komplexov pomocou NMR ako nástroj pri vývoji liečiv: a Fesik a spol. (Biochemical Pharmacology 40 (1990), S. 161167). ktorí popisujú metódy NMR pri určovaní štruktúr komplexov enzýmov s inhibítormi ako pomoc pri vývoji liečiv. Najnovšia publikácia Rossa a spol. (Journal of Biomolecular NMR,

16: 139-146 (2000)) popisuje automatizáciu merania NMR a vyhodnotenie dát na systematické testovaní interakcií malých molekúl s cieľovými proteínmi, napr. receptormi. Potom sa tiež vynález týka použitia komplexu proteínu s ligandom, ktorý obsahuje polypeptid 1GS5 v zhode najmenej 70% s jedným z polypeptidov SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6 a látku, ktorá sa viaže na IGS5 pri vývoji a modulácii alebo optimalizácii vedúcich štruktúr, ktoré majú väzobnú alebo inhibičnú aktivitu k IGS5.

Kombinovaná terapia (látky inhibujúce NEP/IGS5 a látky inhibujúce ECE/ACE).

Ako už bolo vyššie krátko spomenuté, môže byť užitočné dodatočne kombinovať látky t · vykazujúce kombinovanú alebo súbežnú inhibičnú aktivitu k NEP/IGS5, podľa tohto vynálezu, napr. látky vzorca I. s výhodou látky vzorca la alebo Ib, s ďalšími látkami a/alebo kombinovanými inhibítormi metaloproteáz, než s kombinovanými inhibítormi NEP/IGS5.

T akéto ďalšie inhibítory metaloproteáz, ktoré môžu byť použité v kombinácii s látkami s kombinovanou inhibičnou aktivitou k NEP/IGS5, sú napríklad inhibítory ACE, ako kaptopril, enalapril, lizínopril. fosinopril. perindopril, quinapril, ramipril; selektívne inhibítory ECE, ako sú látka SM-19712 (Sumitomo, vyššie); selektívne inhibítory NEP, ako tiorfan; duálne inhibítory NEP/ECE. ako látka CGS-35066 (De Lombart a spol., J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3):488-504): alebo zmesové inhibítory' týchto metaloproteáz, ako omapatrilat alebo sampatrilat. S týmto typom kombinovaného liečenia a/alebo profylaxie môže byť terapeutická hodnota látok s kombinovanou alebo súbežnou inhibičnou aktivitou k NEP/IGS5 stále ďalej zvýšená, najmä so zreteľom na choroby a/alebo podmienky spomenuté vyššie. Preto sa tento vynález tiež týka kombinovanej terapie a/alebo kombinovanej profylaxie. S týmto typom kombinovaného liečenia a/alebo profylaxie môže byť terapeutická hodnota spomínaných látok s kombinovanou alebo súbežnou inhibičnou aktivitou k NEP/1GS5. s výhodou látok vzorca I. s väčšou výhodou látok vzorca la alebo lb. stále ešte zvýšená, najmä so zreteľom na choroby a/alebo podmienky spomenuté vyššie.

Tak sa v tomto ohľade vynález týka použitia prvej látky, ktorá vykazuje kombinovanú alebo súbežnú inhibičnú aktiv itu k NEP/1GS5. aiebo jej farmaceutický v hodné soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru, ako sú tieto látky opísané vyššie s ohľadom na tento vynález, v kombinácii s najmenej jednou ďalšou látkou vybranou zo skupiny ďalších látok a/alebo kombinovaných inhibítorov metaloproteáz, než s kombinovanými inhibítormi NEP/IGS5, pričom spomenutá prídavná látka je s výhodou vybraná zo skupiny inhibítorov ACE, selektívnych inhibítorov ECE. selektívnych inhibítorov NEP. duálnych inhibítorov NEP/ECE a zmesových inhibítorov týchto metaloproteáz, na výrobu liečiva (farmaceutickej zmesi) na kombinované liečenie a/alebo kombinovanú profylaxiu ktorejkoľvek z chorôb alebo podmienok podľa odkazu vyššie v kontexte s týmto vynálezom. S výhodou toto použitie podľa vynálezu spomenuté prvé látky v kombinácii s najmenej jednou spomenutou prídavnou látkou je charakterizované tým. že prvá látka má štruktúru podľa vzorca 1, s výhodou štruktúru podľa vzorca la alebo vzorca lb tak. ako sú tieto vzorce vyššie uvedené v kontexte tohto vynálezu. S výhodou je použitie spomenutej prvej látky v kombinácii s najmenej jednou uv edenou prídavnou látkou ďalej charakterizované tým, že kombinácia násobí účinok, s výhodou synergistickým spôsobom.

Ďalej sa vynález tiež týka farmaceutickej zmesi (liečiva), obsahujúceho spoluúčinkujúce, s výhodou synergistiekv účinkujúce, množstvo:

prvej látky s kombinovanou alebo súbežnou inhibičnou aktivitou k NEP/IGS5. alebo jej farmaceutický vhodné soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru tak. ako je táto látka opísaná vyššie s ohľadom na v ynález: a najmenej jednej prídavnej látky vybranej zo skupiny ďalších látok a/alebo kombinovaných inhibítorov metaloproteáz, než· kombinovaných inhibítorov NEP/IGS5. pričom prídavná látka je s výhodou vybraná zo skupiny inhibítorov ACE. selektívnych inhibítorov ECE. selektívnych inhibítorov NEP. duáfnych inhibítorov NEP/ECE a zmesových inhibítorov týchto metaloproteáz. na kombinované liečenie a/alebo kombinovanú profylaxiu ktorejkoľvek z chorôb alebo podmienok tak, ako bolo vyššie spomenuté v kontexte tohto vynálezu. Najmä farmaceutická zmes podľa tohto vynálezu môže obsahovať spoluúčinkujúce, s výhodou synergisticky účinné, množstvo prvej látky a najmenej jednej prídavnej látky, pričom prvá látka je ďalej charakterizovaná tým, že má štruktúru vzorca I. s výhodou štruktúru vzorca la alebo vzorca Ib tak, ako sú tieto vzorce uvedené vyššie v kontexte tohto vynálezu.

Odborníkovi je jasné, že kombinovaná terapia a/alebo kombinovaná profylaxia podľa tohto vynálezu sa môže dosiahnuť aplikáciou pacientovi, ktorý takúto terapiu a/alebo profylaxiu potrebuje, prvé látky s kombinovanou alebo súbežnou inhibičnou aktivitou k NĽP/IGS5, alebo jej farmaceutický vhodné soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru a prídavné látky vybrané zo skupiny ďalších látok a/alebo kombinovaných inhibítorov metaloproteáz, než kombinovaných inhibítorov NEP/IGS5, simultánnym spôsobom, buď aplikáciou preparátu, ktorý je jednotnou farmaceutickou zmesou alebo oddelenými farmaceutickými preparátmi pre prvú a druhú látku, oddeleným spôsobom, napr. danou dávkou v životospráve alebo podľa schémy, ktoré môže byť buď kontinuálne alebo postupné, alebo stupňovaným spôsobom, čokoľvek sa zdá vhodné na zlepšenie alebo prevenciu pacientovej choroby alebo podmienok.

Úprava do foriem a aplikácia.

Zistenia urobené podľa vy nálezu dokazujú, že látky s kombinovanou alebo súbežnou selektívnou inhibíciou k NEP/IGS5, voliteľne v kombinácii s oddelenými inhibičnými látkami k ACE a/alebo k ECE, alebo ich farmaceutický vhodné soli alebo solváty alebo biolabilné estery. majú výhodnú terapeutickú aktivitu. Preto tieto látky, voliteľne v kombinácii s oddelenými inhibítormi ACE a/alebo ECE. sú vhodné ako liečivá na liečenie a/alebo profylaxiu hypertenzie. vrátane sekundárnych foriem hypertenzie, ako je ľad\ inová alebo pľúcna hypertenzia, zlyhanie srdca, angína pectoris, arytmia. infarkt myokardu, hypertrofia srdca, mozgová ischémia, periferálne cievne ochorenie.

subarachnoidálne krvácanie, chronická obštrukčná pľúcna choroba (COPD). astma.

ľadvinové ochorenie, ateroskleróza. bolesť v dôsledku kolorektálnej rakoviny alebo rakoviny prostaty, u vyšších cicavcov, s výhodou u ľudí. Látky inhibujúce NEP/1GS5, voliteľne v kombinácii s oddelenými inhibičnými látkami k ACE a^zalebo ECE, sa môžu podávať všetkými známymi aplikačnými cestami.

Zmes bude upravená podľa spôsobu aplikácie, napríklad miestnym alebo orálnym spôsobom. Preferované formy na miestnu aplikáciu zahrnujú injekciu, s výhodou vnútrožilovú injekciu. Môžu sa použiť ďalšie injekčné spôsoby, ako podkožný, vnútrosvalový alebo vnútropodbrušnicový. Alternatívne spôsoby miestnej aplikácie zahrnujú aplikáciu cez sliznicu a cez kožu použitím penetrantov ako sú soli kyseliny žlčovej alebo fusidové kyseliny alebo iné detergenty. Ďalej môžu byť látky upravené do foriem ako tobolky alebo kapsule, pričom orálna aplikácia je tiež možná. Aplikácia týchto látok môže byť aj topikálna a/alebo lokalizovaná formou mastí, pást, gélov a pod.

Pre aplikáciu podľa vynálezu, môžu terapeuticky aktívne množstvá látok inhibujúcich NEP/IGS5, ktoré zlepšujú a/alebo preventujú choroby alebo podmienky spomenuté vyššie v kontexte tohto vynálezu, obsahovať bežné farmaceutické prísady a/alebo aditíva v pevných alebo kvapalných farmaceutických formách.

Príklady pevných dávkových foriem ako sú pevné látky, polopevné látky, lyofilizovaný prášok, tablety, poťahované tablety, pilulky, kapsle, prášky, granule alebo čapíky a formulácie s postupným uvoľňovaním. Tieto pevné dávkovacie formy môžu obsahovať štandardné farmaceutické anorganické a/alebo organické prísady. Takéto prísady zahrnujú pri farmaceutickej čistote manitol. laktózu, škrob, stearan horečnatý. sodnú soľ sacharínu, mastenec, celulózu, glukózu, želatínu, sacharózu, uhličitan horečnatý a tak ďalej v spojitosti s bežnými farmaceutickými aditívami, ako sú plnivá, mazadlá alebo dezintegrátory tabliet. Kvapalné prípravky, ako roztoky, suspenzie alebo emulzie aktívnych zložiek, môžu obsahovať obvyklé rozpúšťadlá, ako vodu, olej a/alebo suspendujúce prísady, ako polyetylénglykol a pod. Ďalšie aditíva ako konzervačné prostriedky, prostriedky dodávajúce vôňu atď.. sa môžu tiež pridať.

Aktívne zložky sa môžu zmiešať a upraviť do foriem s farmaceutickými prísadami a/alebo aditívami známym spôsobom. Na výrobu pevných dávkovacích foriem, napríklad, sa môže aktívna zložka zmiešať s prísadami a/alebo aditívami a granulovať za vlhka alebo za sucha. Granule alebo prášok sa môže priamo plniť do kapsulí alebo lisovaný do tabletových foriem: Ak je to potrebné, sa môžu tablety poťahovať známym spôsobom.

Kvapalné prípravky sa môžu pripraviť rozpustením alebo dispergovaním látok a voliteľných farmaceutických prísad, na nosiči ako je napríklad vodný roztok soli, vodný roztok dextrózy, glycerol alebo etanol, a vytvoriť roztok alebo suspenziu.

Dávky na aplikáciu sa môžu líšiť podľa jedincov a prirodzene sa meniť v závislosti na type podmienok, ktoré sa majú liečiť a podľa spôsobu aplikácie. Napríklad lokálne aplikované formulácie, injekcie, všeobecne obsahujú podstatne menšie množstvo aktívnej látky než formulácie pre miestnu aplikáciu. Požadovaný rozsah dávok závisí na úsudku lekára, s výhodou s ohľadom na výber látok, aplikačných spôsobov, povahy formy a na stave subjektu. Vhodné dávkovania sú však v rozsahu od 0.1 do 100 pg/kg hmotnosti subjektu. Široký rozsah potrebného dávkovania sa predpokladá vzhľadom na paletu dostupných látok a odlišnej účinnosti rôznych spôsobov aplikácie. Napríklad o orálnej aplikácii sa predpokladá, že bude vyžadovať vyššie dávkovanie, než vnútrožilová aplikácia empirických spôsobov optimalizácie, ak aj podľa skúseností v odbore.

Tabuľky sekvencii DNA IGS5 a proteínu IGS5.

ľabuľka 1: DNA IGS5 („IGS5DNA) SEQ ID NO: 1

--— .--—5' TGCACCACCCCTGGCTGCGTGAľAGCAGCTGCCAGGATCCTCCAGAACATGGACCCGACC

ACGGAACCGTGTGACGACTTCTACCAGTTTGCATGCGGAGGCTGGCTGCGGCGCCACGTG

ATCCCTGAGACCAACTCAAGATACAGCATCTTTGACGTCCTCCGCGACGAGCTGGAGGTC

ATCCTCAAAGCGGTGCTGGAGAATTCGACTGCCAAGGACCGGCCGGCTGTGGAGAAGGCC

AGGACGCTGTACCGCTCCTGCATGAACCAGAGTGTGATAGAGAAGCGAGGCTCTCAGCCC

CTGCTGGACATCTTGGAGGTGGTGGGAGGCTGGCCGGTGGCGATGGACAGGTGGAACGAG

ACCGTAGGACTCGAGľGGGAGCTGGAGCGGCAGCTGGCGCTGATGAACTCACAGTTCAAC

AGGCGCGTCCTCATCGACCTCTTCATCTGGAACGACGACCAGAACTCCAGCCGGCACATC

ATCTACATAGACCAGČCCACCTTGGGCATGCCCTCCCGAGAGTÄCTACTTCAACGGCGGC

AGCAACCGGAAGGTGCGGGAAGCCTACCTGCAGTTCATGGTGTCAGTGGCCACGTTGCTG

CGGGAGGATGCAAACCTGCCCAGGGACAGCTGCCTGGTGCAGGAGGACATGATGCAGGTG

GTGGAGCTGGAGACACAGCTGGCCAAGGCCACGGTACCCGAGGAGGAGAGACACGACGTC

ATCGCCTTGTACCACCGGATGGGACTGGAGGAGCTGCAAAGCCAGTTTGGCCTGAAGGGA

TTTAACTGGACTCTGTTCATACAAACTGTGCTATCCTCTGTCAAAATCAAGCTGCTGCCA J GATGAGGAAGTGGTGGTCTATGGCATCCCCTACCTGCAGAACCTTGAAAACATCATCGAC

ACCTACTCAGCCAGGACCATACAGAACTACCTGGTCTGGCGCCTGGTGCTGGACCGCATT

GGTAGCCTAAGCCAGAGATTCAAGGACACACGAGTGAACTACCGCAAGGCGCTGTTTGGC

ACAATGGTGGAGGAGGTGCGCTGGCGTGAATGTGTGGGCTACGTCAACAGCAACATGGAG

AACGCCGTGGGCTCCCTCTACGTCAGGGAGGCGTTCCCTGGAGACAGCAAGAGCATGGTC

AGAGAACTCATTGACAAGGTGCGGACAGTGTTTGTGGAGACGCTGGACGAGCTGGGCTGG

ATGGACGAGGAGTCCAAGAAGAAGGCGCAGGAGAAGGCCATGAGCATCCGGGAGCAGATC

GGGCACCCTGACTACATCCTGGAGGAGATGAACAGGCGCCTGGACGAC-GAGTACTCCAAT

CTGAACTTCTCAGAGGACCTGTACTTTGAGAACAGTCTGCAGAACCTCAAGGTGGGCGCC

CAGCGGAGCCTCAGGAAGCTTCGGGAAAAGGTGGACCCAAA.TCTCTGGATCATCGGGGCG

GCGGTGGTCAATGCGTTCTACTCCCCAAACCGAAACCAGATTGTATTCCCTGCCGGGATC

CTCCAGCCCCCCTTCTTCAGCAAGGAGGAGCCACAGGCCTTGAACTTTGGAGGCATTGGG

ATGGTGATCGGGCACGAGATCACGCACGGCTTTGACGACAATGGCCGGAACTTCGACAAG

AATGGCAACATGATGGA7TGGTGGAGTAACGTCTCCACCCAGCACTTCCGGGAGCAGTCA

GAGTGCATGATCTACCAGTACGGCAACTACTCCTGGGACCTGGCAGACGAACAGAACGTG

AACGGATTCAACACCCTTGGGGAAAACAľľGCTGACAAGGGAGGGGTGCGGCAAGCCTAT

AAGGCCTACCTCAAGTGGATGGCAGAGGGTGGCAAGGAGCAGCAGCTGCCCGGCCTGGAT

CTCACCCATGAGCAGCTCTTCTTCATCAACTACGCCCAGGTGTGGTGCGGGTCCTACCGG

CCCGAGTTCGCCATCCAATCCATCAAGACAGACGTCCAGAGTCCCCTGAAGTACAGGGTA

CTGGGGTCGCTGCAGÄACCTGGCCGCCTTCGCAGACACC-TTCCACTGTGCCCGGGGCACC CCCATGCACCCCAAGGAGCGATGCCGCGTGTGGTAG - 3'

Tabuľka 2: Proteín IGS5 („IGS5PR0T) SEQ ID N0.2

CTTPGCVIAAAR1LQNMDPTTEPCDDFYQFACGG WLRRHVIPETNSRYSIFDVLRDELEV

J ILKAVLENSTAKDRPAVEKARTLYRSCMNQSVIEKRGSQPLLDILEVVGGWPVAMDRWNE j TVGLEWELERQLALMNSQFNRRVLIDLFIWNDDQNSSRHIIYIDQPTLGMPSREYYFNGG

SNRKVREAYLQFMVSVATLLREDANLPRDSCLVQEDMMQVLELETQLAKATVPQEERHDV

1ALYHRMGLEELQSQFGLKGFNWTLFIQTVLSSVKIKLLPDEEVWYGIPYLQNLENIID ľYSARTIQNYLVWRLVLDRIGSLSQRFKDTRVNYRKALFGTMVEEVRWRECVGYVNSNME

NAVGSXYVREAFPGDSKSMVRELIDKVRTVFVETLDELGWMDEESKKKAQEKAMSIREQI

GHPDYILEEMNRRLDEEYSNLNFSEDLYFENSLQNLKVGAQRSLRKLREKVDPNLWIIGA

AVVNAFYSPNRNQIVFPAGILQPPFFSKEQPQALNFGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFDK

NGNMMDWWSNFSTQHFREQSECM1YQYGNYSWDLADEQNVNGFNTLGEN1ADNGGVRQAY

KAYLKWMAEGGKDQQLPGLDLTHEQLFFINYAQVWCGSYRPEFAIQSIKTDVHSPLKYRV

LGSLQNLAAFADTFHCARGTPMHPKERCRVW

Tabuľka 3: DNA-1IGS5 („IGS5DNA1 SEQ ID N0:3

5' atggggaagtccgaaggccccgtggggatggtggagagcgctggccgtgcagggcagaag

CGCCCGGGGTTCCTGGAGGGGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGTGACCGCTGCCCTG

GTGGCCTTGGGTGTCCTCTACGCCGACCGCAGAGGGAÄGCAGCTGCCACGCCTTGCTAGC

GGGCľGTGCTTC'rTACAGGAGG.AGAGGACCTTTGTAAAACGAAAACCCCGAGGGA.TCCCA

GAGGCCCAAGAGGTGAGCGAGGTCGGCACCACCCGTGGCTGCGTGATAGCAGCTGCCAGG

ATGCTGCAGAAGATGGACCCGACCACGGAACCGTGTGACGACTTCTäCCAGTTTGCATGC

GGAGGCTGGCTGCGGCGCCACGTGA.TCCCTGAGACCAACTCAAGATACAGCATCTTTGAC

GTGCTCCGCGAGGAGCTGGAGGTCATCCTCAAAGCGGTC-CTGGAGAATTCGACTGCCAAG

GACCGGCCGGCTGTGGAGAAGGCCAGGACGCTGTACCGCTCCTGCATGAACCAGAGTGTC

ATAGAGAAGCGAGGCTCTCAGCCCCTGCTGC-ACäTCTTGGAGGTGGTGGGAGGCTGGCCG

GTGGCGA'ľGGA.GAGGTGGAAGGAGACCGTAGGACTCGAGTGGGAGCTGGAGCGC-CAC-CTG

GCGCTGATGAACTCACAGTTCAACAGGCGCGTCCTCATCGACCTCTTCATCTGGAACGAC

GACCAGAACTCCAGCCGGCACATCATCTACATAGACCAGCCCACCTTGGGCATGCCCTCC

CGAGAGTAGTA.CTTCAACGGCGGCAGCAACCGGAAGGTGCGGGAAGCCTACCTGCAGTTC

ATGGTGTCAGTGGCCACGTTGCTGCGGGAGGATGCAAACCTGCCCAGGGACAGCTGCCTG

GTGCAGGAGGACATGATGCAGG'ľGCTGGAGCTGC-AGACACAGCTGGCCAAGGCCACGGTA

CCCCAGGAGGAGAGACACGACGTCATCGCCTTGTACCACCGGATGGGACTGGAGGAGCTG

CAAAGCCAGTTTGGCCIGAAGGGATTTAACTGGACTCTGTTCATACAAACTGTGCTATCC

TCTGTCAAAATCAAGCTGCTGCCAGATGAGGAAGTGGTGGTCTATGGCATCCCCTACCTG

CAGAACCTTGAAAACATCATCGACACCTACTCAGCCAGGACCATACAGäACTACCTGGTC

TGGCGCCTGGTGCTGGACCGCäTTGGTAGCCTAAGCCAGAGATTCAAGGACACACGAGTG

AACTäCCGCAAGGCGCTGTTTGGCACAATGGTGGAGGAGGTGCGCTGGCGTGAATGTGTG ggctacgtcaacagcaacatggagaacgccgtgggctccctctacgtcagggaggcgttc cctggagacagcaagagcatggtcagagaactcattgacaaggtgcggacagtgtttgtg gagacgctggacgagctgggctggatggacgaggagtccaagaagaaggcgcaggagaag gccatgagcatccgggagcagatcgggcaccctgactacatcctggaggagatgaacagg cgcctggacgaggagtactccaatctgaacttctcagaggacctgtactttgagaacagt ctgcagaacctcaaggtgggcgcccagcggagcctcaggaagcttcgggaaaaggtggac ccaaatctctggatcatcggggcggcggtggtcaatgcgttctactccccaaaccgaaac cagattgtattccctgccgggatcctccagccccccttcttcagcaaggagcagccacag gccttgaactttggaggcattgggatggtgatcgggcacgagatcacgcacggctttgac gacaatggccc-gaacttcgacaagaatggcaacatgatggattggtggagtaacttctcc acccagcacttccgggagcagtcagagtgcatgatctaccagtacggcaactactcctgg gacctggcagacgaacagaacgtgaacggattcaacacccttggggaaaacattgctgac aacggaggggtgcggcaagcctataaggcctacctcaagtggatggcagagggtggcaag gaccagcagctgcccggcctggatctcacccatgagcagctcttcttcatcaactacgcc

CAGGTGTGGTGCGGGTCCTACCGGCCCGAGTTCGCCATCCAATCCATCAAGACAGACC-TC CACAGTCGCCTGAAGTACAGGGTACTGGGGTCGCTGCAGAACCTGGCCGCCTTCGCAGAC ACGTTCCACTGTGCCCGGGGCACCCCCATGCACCCCAAGGAGCGATGCCGCGTGTGGTAG - 3'

Tabuľka 4: Proteín-1 IGS5 T.IGS5PROT1) SEQ IDN0:4

MGKSEGPVGMVESAGRAGQKRPGFLEGGLLLLLLLVTAALVALGVLYADRRGKQLPRLAS

RLCFLQEERTFVKRKPRGIPEAQEVSEVCTTPGCVIAAARILQNMDPTTEPCDDFYQFAC

GGWLRRHVIPETNSRYSľFDVLRDELEVILKAVLENSTAKDRPAVEKARTLYRSCMNQSV

IEKRGSQPLLDILEVVGGWPVAMDRWNETVGLEWELERQLALMNSQFNRRVLIDLFIWND

DQNSSPHIIYIDQPTLGMPSREYYFNGGSNP.KVREAYLQFMVSVATLLREDANLPRDSCL

VQEDMMQVLELETQLAKATVPQEERHDVIALYHRMGLEELQSQFGLKGFNWTLFIQTVLS

SVKIKLLPDEEVVVYGIPYLQNLENIIDTYSARTIQNYLVMRLVLDRIGSLSQRFKDTRV

NYRKALFGTMVBEVRWRECVGYVNSNMENAVGSLYVREAFPGDSKSMVRELIDKVRTVFV

ETLDELGWMDEESKKKAQEKAMSIREQIGHPDYILEEMNRRLDEEYSNLNFSEDLYFENS

LQNLKVGAORSLRKLREKVDPNLWIIGAAWNAFYSPNRNQIVFPAGILQPPFFSKEQPQ

ALNFGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFDKNGNMMDWWSNFSTQHFREQSECMIYQYG1SJYSW

DLADEQNVNGFNTLGENIADNGGVRQAYKAYLKWMAEGGKDQQLPGLDLTHEQLFFINYA

QVWCGSYRPEFAIQSIKTDVHSPLKYRVLGSLQNLAAFADTFHCARGTPMHPKERCRVW

Tabuľka 5: DNA-2 IGS5 („ÍGS5DNA2) SEQ ID NO:5

ATGGGGAAGTCCGAAGGCCCAGTGGGGATGGTGGAGAGCGCCGGCCGTGCAGGGCAGAAG

GGCCCGGGGTTCCTGGAGGGGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGTGACCGCTGCCCTG

GTGGCCTTGGGTGTCCTCTACGCCGACCGCAGAGGGATCCCAGAGGCCCAAGAGGTGAGC

GAGGTCTGCACCACCCCTGGCTGCGTGATAGCAGCTGCCAGGATCCTCCAGAACATGGAC

CCGACCACGGAACCGTGTGACGACTTCTACCAGTTTGCATGCGGAGGCTGGCTGCGGCGC

CACGTGATCGCTGAGACCAACTCAAGATACAGCATCTTTGACGTCCTCCGCGACGAGCTG

GAGGTCATCGTCAAAGCGGTGCTGGAGA.ATTCGACTGCCAAGGACCGGCCGGCTGTGGAG aa.ggc gaggaggctgtaccgctcctgcatgaaccagagtgtgatagagaagcgaggctct

GAGCGCCTGCTGGACATCTTGGAGGTGGTGGGAGGCTGGCCGGTGGCGATGGACAGGTGG

AACC-A.C-ACCGCAGGACTCGAGTGGGAGCTGGAGCGGCäGCTGGCGCTGATGAACTCACAG

TTCAA 3AGGCGCGTCCTCATCGACCTCTTCATCTGGAACGAGGACCAGAACTCCAGCCGG

CACACCATCTACATAGACCAGCCCACCTTGGGCATGCCCTCCCGAGAGTACTACTTCAAC

GG3C-3CAGCAACCGGAAGGTGCGGGAÄGCCTACCTGCAGTTCATGGTGTCAGTGGCCACG

TTGCTGCGGGAGGATGCAAACCTGCCCAGGGACAGCTGCCTGGGGGAGGAGGACATGATG

CAGGľGC'ľGGAGC'ľGGAGACACAGCTGGCCAAGGCCACGGTACCGCAGGAGGAGAGACAC

GACGGCATCGCCTTGTACCACCGGATGGGACTGGAGGAGCTGCAAA.GCCÄGTTTGGCCTG

AAGGGATT'ľAA.CTGGACTCTGTTCATACAAACTGTGCTATCCTCTGTCAAAATCAAGCTG

CTGCGAGäTGAGGAAGTGGTGGTCTATGGCATCOCCTACCTGCAGAACCTTGAAAACATC

ATCGACACCTACTCAGCCAGGACCATACAGAACTACCTGGTCTGGCGCCTGGTGCTGGAC

GGCATTGGTAGCCTAAGCCAGAGATTCAAGGAGACACGAGTGAACTACCGCAAGGCGCTG

TTTGGCACAATGGTGGAGGAGGTGCGCTGGCGTGAATGTGTGGGCTACGTCAACAGCAAC

ATGGAGAACGCCGTGGGCTCCCTCTACGTCAGGGAGGCGTTCCCTGGAGACAGCAAGAGC

ATGGTCAGAGAACTCATTGACAAGGTGCGGACAGTGTTTGTGGAGACGCTGGACGAGCTG

GGCTGGATGGACGAGGAGTCCAAGAAGAAGGCGCAGGAGAAGGCCATGAGCATCCGGGAG

CAGATCGGGCACCCTGACTACATCCTGGAGGAGATGAACAGGCGCCTGGACGAGGAGTAC

TCCAATCTGAACTTCTCAGAGGACCTGTACTTTGAGAACAGTCTGCAGAACCTCAAGGTG

GGCGCCCAGCGGAGCCTCAGGAAGCTTCGGGAAAAGGTGGACCCAAATCTCTGGATCATC

GGGGCGGCGGTGGTCAATGCGTTCTACTCCCCAAACCGAAACCAGATTGTATTCCCTGCC

GGGATCCTCCAGCCCCCCTTCTTCAGCAAGGAGCAGCCACAGGCCTTGAACTTTGGAGGC

ATTGGGATGGTGATCGGGCACGAGATCACGCACGGCTTTGACGACAATGGCCGGAACTTC

GACAAGAATGGCAACATGATGGATTGGTGGAGTAACTTCTCCACCCAGCACTTCCGGGAG

CAGTCAGAGTGCATGATCTACCAGTACGGCAACTACTCCTGGGACCTGGCAGACGAACAG

AACGTGAACGGATTCAACACCCTTGGGGAAAACATTGCTGACAACGGAGGGGTGCGGCAA

GCCTAT.AAGGCCTACCTCAAGTGGATGGCAGAGGGTGGCAAGGACCAGCAGCTGCCCGGC

CTC-GATCTCACCCATGAGCAGCTCTTCTTCATCAACTACGCCCAGGTGTGGTGCGGGTCC

TACCGGCCCGAGTTCGCCATCCAATCCATCAAGACAGACGTCCACAGTCCCCTGAAGTAC

AGGGTACTGGGGTCGCTGCAGAACCTGGCCGCCTTCGCAGACACGTTCCACTGTGCCCGG GGGACCCCCATGCACCCCAAGGAGCGATGCCGCGTGTGGTAG - 3’

Tabuľka 6: Proteín-2 IGS5 („IGS5PROT2) SEQ ID N0.6

MGKSEGPVGM'.'ESAGRAGQKRPGFLEGGLLLLLLLVTAALVALGVLYADRRGI PEAQEVS EVCTTPGCVIAAARILQNMDPTTEPCDDFYQFACGGWLRRHVIPETNSRYSIFDVLRDEL EVILKAVLENSTAKDRPAVEKARTLYRSCMNQSVIEKRGSQPLLDILEWGGWPVAMDRW NETVGLEWELERQLALMNSQFNRRVLIDLFIWNDDQNSSRHIIY1DQPTLGMPSREYYFN GGSNRKVREAYLQFMVSVATLLREDANLPRDSCLVQEDMMQVLELETQLAKATVPQEERH DVIALYHRMGLEELQSQFGLKGFNWTLFIQTVLSSVKIKLLPDEEVWYGIPYLQNLENI IDTYSARTIQNYLVWRLVLDRIGSLSQRFKDTRVNYRKALFGTMVEEVRWRECVGYVNSN MENAVGSLYVREAFPGDSKSMVRELIDKVRTVFVETLDELGWMDEESKKKAQEKAMSIRE QIGHPDYILEEMNRRLDEEYSNLNFSEDLYFENSLQNLKVGAQRSLRKLREKVDPNLWII GAAVVNAFYSPNRNQIVFPAGILQPPFFSKEQPQALNFGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNF DKNGNMMDWWSNFSTQHFREQSECMIYQYGNYSWDLADEQNVNGFNTLGENIADNGGVRQ AYKAYLKWMAEGGKDQQLPGLDLTHEQLFFINYAQVWCGSYRPEFAIQSIKTDVHSPLKY RVL$S LQN LAAFADT FHCAJRGT PMHPKERCRVW

Všetky publikácie, vrátane, ale bez akéhokoľvek obmedzenia na patenty a patentové prihlášky, citované v tejto špecifikácii, sú tu vložené ako odkazy, pričom každá jednotlivá publikácia špecificky alebo jednotlivo spomenutá, ktorá tu bola uvedená v citáciách, je tu plne objasnená.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1. Klonovanie cDNA kódujúcej nového člena skupiny metaloproteázy NEP/ECE, neprilyzínu.

Príklad la. Náčrt homológie klonovania kódovacej sekvencie cDNA z IGS5.

Metaloproteázy podskupiny M13 sú zahrnuté v metabolizme rôznych neurónových a hormonálnych peptidov. Doteraz obsahuje táto podskupina neprilyzín (NEP), enzým 1 premieňajúci endotelín (ECE-1), ECE-2, Kell, Pex a XCE. Inhibítory NEP a ECE boli vyvinuté pre terapeutické použitie napríklad v kardiológii a gastroenterólogii. Pretože ďalší členovia tejto skupiny môžu byť zaujímavými cieľmi pri štúdiu liečiv, hontologické klonovanie bolo použité na identifikáciu nových génov v ľudskom genóme.

Hontologické klonovanie IGS5 bolo uskutočnené podľa všeobecného opisu vyššie a podľa experimentálnych podrobností ďalej ilustrovaných v príkladoch medzinárodnej patentovej prihlášky PCľ/ĽP 00/11532. na ktorú sa tu odvoláva. Proces môže byť opísaný nasledovne:

V databanke exprimovanej sekvencie derivátov (EST) boli detekované sekvencie.

ktoré obsahov ali malý otvorenú čítaciu oblasť, ktorá vykazovala podobnosť na C-terminálnu časť metaloproteázy podobnej NEP/ECE. Na základe týchto sekvencií EST a opakujúcich sa úsekoch metaloproteáz podobných NEP/ECE, sme použili degeneratívne PCR na klonovanie celej sekvencie cDNA z cDNA ľudských pľúc, srdca a semenníkov.

Sekvencia cDNA kódujúca glykosylovaný proteín, pomenovaný 1GS5 alebo alternatív ne ľudskú rozpustnú endopeptidázu (hSEP) vykazuje charakteristiky člena skupiny

Ml3. IGS5 vykazovala vysokú zhodu sekvencie aminokyselín k myšej SEP (78%). myšej, krysej a ľudskej NEP (54%) a k ľudskej ECE-1 (39%). V analógii so zviazaným variantom SEP a SEP^a u myši sme detekovali tiež dve zviazané verzie IGS5, ktoré sa líšili v alternatívnom exónu 78bp. Tieto zv iazané formy kódovali proteíny so 753 a 779 rezíduami. Dlhšia forma obsahovala predpokladané miesto na proteolytické štiepenie susediace s medzimembránovou väzbou. Tieto dve zviazané formy môžu preto predstavovať formu viazanú na membráne a rozpustnú formu proteínu 1GS5.

Expresná analýza použitím mnohonásobnej analýzy tkanív typu dot blot a kv antitatívna

PCR odhalila expresiu na mnohých ľudských tkanivách, s najväčšou odozvou pozorovanou v semenníkoch. Expresia mRNA IGS5 bola tiež pozorovaná napr. v prostate, v tenkom čreve, žalúdku, ľadvine a mozgu. T ieto dva zviazané varianty vykázali odlišné expresné vlastnosti.

Funkčná charakteristika potvrdila, že tento enzým je pravým členom skupiny neprilyzinu a má aktivitu ECE.

Príklad 1 b. Priradenie IGS5 so sekvenciou proteínov členov skupiny metaloproteáz

NEP/ECE.

Na sekvenciu IGS5 originálne klonovanú (viď. príklad 1), hľadania homológie až po súčasnosť v databankách proteínov a translatovaných databankách DNA bolo uskutočnené použitím algoritmu BLAST (Altschul S.F. a spol. [1997], Nucleic Acids Res. 25: 33893402). Tieto výskumy dokázali, že originálne získaný proteín IGS5 bol najviac podobný (zhoda 54 až 55% cez ± 700 rezíduí) myšej, krysej a ľudskej neutrálnej endopeptidáz.e (SW:NEP_MOUSE, prístupové číslo Q61391; SW:NEP RAT, prístupové číslo P07861 a

SW:NEP HUMAN. prístupové číslo P08473). Toto priradenie takmer úplnej sekvencie proteínu IGS5 k ďalším členom skupiny NEP/ECE preukázalo všeobecne vzťah 1GS5 k metaloproteázam a s výhodou k metaloproteázam skupín NEP a/alebo ECE. Podľa tohto štruktúrneho priradenia bolo odvodené, že IGS5 má funkčnosť metaloproteáz, ktoré sú zase zaujímavé v kontexte niektorých dysfunkcií, ťažkostí alebo chorôb u živočíchov a ľudí.

Príklad 1 c. Klonovanie fragmentov cDNA obsahujúcich kódovanie plnej dĺžky sekvencie IGS5.

Aby sa získala ďalšia sekvencia cDNA IGS5, bolo uskutočnené ďalšie kolo reakcií

RT-PCR na RNA z ľudských pľúc za podmienok opísaných vyššie, použitím špecifického reverzného primeru IGS5. Forma ktorá vznikla obsahovala otvorený čítací rámec, ktorý začínal iniciačným kodónom „ATG a kódoval proteín, ktorý vykazoval vysokú zhodu s Nterminálnou sekvenciou myšieho proteínu SEP.

Kompletizácia sekvencií DNA všetkých izolovaných klonov preukázala prítomnosť dvoch typov sekvencií cDNA. ktoré sa odlišovali prítomnosťou alebo absenciou segmentu 78 bp. ktorý bol pôvodne identifikovaný v genómovom klone 1GS5/SI. Tieto dve sekvencie boli pravdepodobne vytvorené dvomi zviazanými molekulami RNA. Najdlhší prepis obsahuje otvorený čítací rámec s 2337 nukleotidami (kódujúce protein so 779 rezíduami), pokým kratší prepis obsahuje otvorený čítací rámec s 2259 nukleotidami (kódujúce protein so 753 rezíduami). Na kódovaciu sekvenciu a sekvencii proteínu dlhej formy sa odkazuje ako na

1GS5DNA1 (znázornená v SEQ ID NO:3, 2340 bp vrátane stopovacieho kodónu) a

IGS5PROT1 (SEQ ID NO:4). pokým na kódovaciu sekvenciu a sekvenciu proteínu kratšej formy sa odkazuje ako na IGS5DNA2 (znázornená v SEQ ID NO:5. 2262 bp vrátane stopovacieho kodónu) a IGS5PROT2 (SEQ ID NO:6). V smere stanoveného metionínového iniciačného kodónu v IGS5DNA1 a IGS5DNA2 je prítomný ďalší vnútorný metionínový kodón v kodónovej polohe 10. Aj keď prvý metionínový kodón bol vybraný, aby sa stal iniciačným kodónom (alebo priamo výnimočným), iniciácia prepisu v polohe 10 kodónu nemohla byť vylúčená, pretože obidva metioníny se objavujú v ekvivalentnej vhodnej iniciácii „Kozák prepisového kontextu (Kozák M., Gene [1999]: 234: 187-208). Hydropatínna analýza (Kyte J. a spol., J. Mol. Biol. [1982] 157: 105-132; Klein P. a spol.. Biochim. Biophys. Acta [1985] 815: 468-476) sekvencii IGS5PROT1 a IGS5PROT2 ukázala prítomnosť jednoduchej medzimembránovej oblasti medzi článkami 22 až 50. To indikuje, že IGS5PROT1 a 1GS5PROT2 sú proteíny integrálnej membrány typu II a majú tak membránovú topológiu podobnú ďalším členom skupiny proteínov NEP/ECE.

Príklad 1 d. Priradenie sekvencie proteínu 1GS5 z príkladu 1 c k sekvencii proteínov členov skupiny metaloproteáz NEP/ECE.

Pre sekvenciu 1GS5, klonovanú v príklade 1 c. bolo uskutočnené hľadanie databanky proteínov a databanky prepisovej DNA až po súčasnosť použitím algoritmu BLAST (Altschul S.E. a spol.. Nucleic Acid Res. [1997] 25: 3389-3402). Toto hľadanie preukázalo, že IGS5PROT1 bol najviac zhodný (zhoda 75% vyše 778 zviazaných rezíduí) sa SEP u myši (\stup GenBank číslo AF157105) a tiež ukázalo 54 až 55 % zhodu vyše 696 zviazaných rezíduí k myším, krysím a ľudským neutrálnym endopeptidázam (SW:NEP_MOUSE. prístupov é číslo Q61391; SWtNEP RAT. prístupové číslo P07861 a SWtNEP HUMAN. prístupové číslo P084731. Homologické hľadanie IGS5PROT2 ukázalo, že táto sekvencia bola naj\ iac zhodná (zhoda 78% vyše 752 zviazaných rezíduí k myšej SEP^A (vstup GenBank číslo AF 157106). V analógii s myšími proteínmi SEP a SEP^ sa očakávalo, že IGS5PROT1 a IGS5PROT2 predstavujú rozpustnú a na membránu viazanú formu proteínu IGS5. To bolo potvrdené prítomnosťou dvojbázických rezíduí (KRK) zakódovaných na konci 3' alternatívne zviazaného exónu 78bp.

Toto porovnanie kompletnej sekvencie proteínov IGS5 s ďalšími členmi skupiny NEP/ECE ukazuje vzťah 1GS5 k metaloproteázam NEP/ECE všeobecne a s výhodou potom ku členom skupiny SEP a NEP. Z tohto štruktúrneho priradenia sa vyvodzuje, že proteín IGS5 má funkčnosť metaloproteáz. ktorá je zasa zaujímavá v kontexte niektorých dysfunkcií, ťažkostí alebo chorôb u živočíchov a ľudí.

Príklad 2. Expresia a čistenie rozpustnej ektodomény ukončenej pomocou HIS u ľudskej

IGS5.

Cieľom tohto pokusu bolo produkovať rozpustný proteín IGS5 použitím expresného systému bakulovírusu. Rekombinantný bakulovírus bol konštruovaný tak, že bola exprimovaná ektodoména IGS5, ukončená koncom Hísô, po infekcii bunkovej línie Sf9. Rozpustný proteín 1GS5 sa potom čistený z média kultúry' dvojkrokovým postupom, zahrnujúcom afinitnú chromatografiu na lektíne zo šošovice a Zn-IMAC tak, ako to bolo uskutočnené v odbore pre His„ ECE-1.

Príklad 2a. Experimentálny postup.

Kinetická expresná analýza.

519 buniek (IGCE 83.0). exponenciálne rastúcich v suspenzii v Spinerovej banke pri 27°C' v médiu TC100 (JRH Biosciences. katalógové číslo 56941), pridaním 10% inaktivovaného plodového teľacieho séra (Gibco BRL. katalógové číslo 10 084 168). bolo nízkorýchlostnou centrifugáciou zhromaždené a pridané k 5.10⁵ buniek/Fk (25 cm² ) v médiu TC100 bez séra. Pridané boli kandidátske rekombinantné klony vírusu pri vynásobení infekcie (MO1) 3 pfu/bunku a kultúry bunky/vírus boli následne inkubované pri 27°C. Bunky a kondíciované médium (CM) boli zobrané pri 24.48 a 72 hod. po infekcii pomocou 2 postupnými centrifugáciami pri nízkej rýchlosti. Vzorky boli analyzované gélovou elektroforézou SDS PAGE a pomocou analýzy elektroforézou typu Western blotting.

Deglykosylačná štúdia.

Ku vzorkám sa pridalo SDS po výslednú koncentráciu 1% a inkubovalí sa pri 95°C 5 minút.

Po prídavku 1 objemu 2x inkubačného pufra (250 mM fosfátového pufra, 50 mM EDTA. 5%

N-oktylglykozidu. 1% 2-merkaptoetanolu) a po ďalšej 5 min. inkubačnej perióde pri 95°C, sa vzorka ochladila na 37°C. Bola pridaná 1 U N-glykozidázy F (Boehringer Mannheim.

katalógové číslo 1 365 177) a po celonočnej inkubácii pri 37°C bola vzorka redukovaná 100 mM DTT (konečná koncentrácia).

Preparatívna produkcia.

519 buniek (IGCL 83-2). exponenciálne rastúcich v suspenzii v Spinerovej banke pri

27°C v médiu TC100 (JRH Biosciences, katalógové číslo 56941), pridaním 10% inaktivovaného plodového teľacieho séra (Gibco BRL, katalógové číslo 10 084 168), bolo nízkorýchlostnou centrifugáciou zhromaždené a znovu suspendované pri hustote 2. 10^ô bunieKml v médiu TC100. do ktorého sa pridalo 0.013 TIU aprotinínu/ml (Pentex).

Rekombinantný vírus IGBV73 bol pridaný k bunkám pri znásobení infekcie (MOI) 2.25 pfu/bunku (namiesto MOI 3 kvôli nízkemu titru primárnej banky vírusu). Suspenzia bunky/vírus bola následné inkubovaná pri 27°C v sklenených bankách na rolcr (3 x 500 ml /

1260 cm²) počas 72 h. CM (1.5 1) bol potom oddelený od buniek a bunkových trosiek dvomi následnými centrifugáciami pri nízkej rýchlosti. Pomerné diely boli zobraté na kontrolu kvality analýzou Western blot a na určenie hladín endotelínu.

Príklad 2b. Výsledky

Kinetika expresie.

Kinetika expresie troch kandidátskych rekombinantných klonov vírusu bola študovaná pomocou analýzy Western blot. Elektrol'oréza Western blot ukázala jasný pás u približne 81 kDa v CM všetkých kandidátskych klonov, čo zodpovedá teoretickej molekulovej hmotnosti celého proteínu (81.2 kDa). Pre bunkový štep bol SDS gél preťažený, a preto nemohol poskytnúť žiadny záver. Hladiny expresie všetkých 3 klonov mali maximum pri 48 až 72 h po infekcii. Kloň 2 bol vybraný na ďalšiu amplifikáciu a bol uložený ako IGBV73. Optimálna doba zberu bola stanovená na 72 h po infekcii.

Deglykosylačná štúdia.

Sekvencia rozpustného proteínu IGS5 obsahuje 8 potenciálnych N-glykosy lačných miest. Pretože protokol o čistení zahrnuje väzbu cukrových rezíduí na vzorky CM a bunkových lyzátov na lektínovej afinitnej kolóne, boli zobraté po 72 h po infekcii použité na deglykosylačné štúdie s N-glykozidázou F, aby sa skontrolovalo, či rekombinantný rozpustný proteín HíSďIGSS je skutočne experimovaný ako glykosylovaný proteín.

Analýza elektroforézou Western blot vzorku CM ošetrených N-glykozidázou F a neošetrených štandardov ukazuje posun v molekulárnej hmotnosti, keď vzorky sú deglykosylované, čím sa preukazuje, že rozpustný ľudský IGS5, ukončený pomocou His, je exprimovaný ako glykosylovaný proteín. V neošetrenom bunkovom lyzáte môžu byť objavené 3 proteínové pásv veľkosti približne 80 až 82 kDa, Po ošetrení N-glykozidázou F ostáva jeden z pásov veľkosti približne 80 kDa viditeľný čo zodpovedá najnižšiemu pásu molekulovej hmotnosti neošetrených vzoriek.

Preparatívna produkcia.

Množstvo 1.5 litra CM bolo zozbieraných z buniek hmyzu Sf9. infikovaných pomocou 1GBV73. 72 h po infekcii. Obsah endotoxínu bol stanovený hodnotou 0.0847

Ílmi CM. Analýza Western blot označila jasný pás u približne 81 kDa v CM, čo zodpovedá molekulovej hmotnosti celého rozpustného IGS5 s ukončením His. Keď sa to porovná so vzorkami bunkových lyzátov, ktoré vykazujú 3 proteínové pásy. proteínový pás

CM zodpovedá slabšiemu strednému pásu molekulových hmotností, prítomnom v bunkách.

Príklad.3. Čistenie IC3S5.

Príklad 3a. Experimentálne postupy.

Ošetrenie vzorky vopred.

tableta kompletu bez EDTA (EFC: Roche Biochemicals, katalógové číslo 1873580) sa pridala k 300 ml čistených Bakulo CM. HEPES, glycerol a Tvveen 20 sa pridali ku konečnej koncentrácii 20 mM. 5% (obj./obj.) a 0.005% (hm./obj.). Hodnota pH CM bola upravená na 7.4 a vzorka sa filtrovala membránovými filtrami Durapore, 0.2 μ GV). Všetky kroky čistenia boli uskutočňované pri 4 °C.

Afinitná chromatografia na lektíne zo šošovice.

Vzorka bakula sa počas noci nanášala rýchlosťou 0.3 ml/min. na 5 ml lentil lectín sepharosovú živicu v kolóne 00/10 (Pharmacia), ktorá bola ekvilibrovaná v pufre A (20 mM Hepesu. I 50 mM NaCl. 5% glycerolu, 0.005% Tweenu 20) pridaním 1 tabletv EFC / 500 ml.

Kolóna sa premývala ekv ilibračným pufrom. pokým absorpcia pri 280 nm nedosiahla základné línie a naviazaný proteín bol eluovaný aplikáciou pufra A obsahujúceho 0.5 M u63 metylpyranozidu. Kolóna bola regenerovaná aplikáciou I0Ô mM acetátu, 500 mM NaCl, pH 5.0, Elučné a regeneračné kvapaliny sa ručne zhromaždili a frakcie boli analyzované pomocou

SDS-PAGE na 12.5% Phastovom géle (Pharmacia) a farbením striebrom. Vopred zafarbené značkovače (Gibco) sa použili ako štandardy s relatívnou molekulovou hmotnosťou (Mr).

Afinitná chromatografia so zakotveným kovom (IMAC) a dialýza.

ml činidla Chelating HiTrap (Pharmacia) bol nasýtený iónmi zinku tak, ako to bolo opísané výrobcom a ekvilibrovaný s pufrom B (20 mM Hepesu, 100 mM NaCl, 5% glycerolu,

0.005% (hm./obj.) Tweenu 20, pH 7.2). Elučné frakcie 1 a 2 sa oddelene naniesli rýchlosťou

0.5 ml/min. na kolónu HiTrap (IMAC vstup A a IMAC vstup B). Slepý pokus sa tiež uskutočnil kvôli porovnaniu chromatografických absorpčných profilov. Kolóna sa premyla pufrom B až po dosiahnutí základnej línie a naviazaný protein sa eluoval aplikáciou gradientu imidazolu (20, 50. 100 a 200 mM) v pufre B. Frakcie sa zhromaždili ručne. Kolóna IMAC bola regenerovaná aplikáciou 20 mM Hepesu, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, pH 7.2. Elučné a regeneračné frakcie sa analyzovali pomocou SDS-PAGE (12.5% Phastových gélov,

Pharmacia) a farbení striebrom. Imidazolový pool, 200mM, bol prenesený do plochej kazety (MWCO 10.000, Pierce) a dialyzovaný cez noc oproti pufru B (130 násobný prebytok, bez regenerácie pufra).

Určenie množstva proteínu.

Množstvo rozpustného IGSS v dialyzačnej frakcii bolo stanovene metódou mikroBCA (Pierce). BSA bola zahrnutá ako štandard.

Charakterizácia proteínu.

Dialyzovaný bakulo IGSS bol biochemický charakterizovaný (1) pomocou SDS-PAGE za redukčných a neredukčných podmienok a (2) pomocou analýzy Western blot s anti Hissubstituovaným mAb (21EIB4, IG) s následnou inkubáciou s králičou anti-myšej lg, značenou alkalickou fosfatázou (Dáko) a detekciou pomocou farbenia NBT/BC1P. Status glvkosy lácie rozpustného IGS5 bol overený ošetrením PGNasou F (Biorad).

Príklad 3b. Výsledkv.

Lektínový elučný profil s 0.5 M α-metylpyranozidom mal za následok výrazný signál. Pretekajúci, premývací a elučný roztok boli analyzované pomocou SDS-PAGE a farbenia striebrom. Najväčšie množstvo proteínu sa získalo z pretekajúcich roztokov a pás kandidátskej IGS5 molekulovej hmotnosti asi 85000 bol nájdený v elučných roztokoch I a 3.

Analýza elektroforézou Western blot lektínovej chromatografie mAb s anti-His substitúciou ukázala, že rozpustný proteín MGS5 (Mr - 85000) je úplne viazaný na živicu v aíinitnej chromatografii a že proteín so substitúciou His sa získava počas celého elučného signálu, ale najmä vo frakcii 1 a 2. Elučné frakcie 1 a 2 afinitnej chromatografie boli ďalej procesované na kolóne zinok-IMAC (nástreky A a B). Viazané proteíny boli eluované imidazolovým gradientom. Analýza SDS-PAGE a farbenie striebrom ukázali, že hlavné množstvo kontaminujúcich proteínov bolo eluovaných aplikáciou 20 mM a 50 mM elučnej imidazolovej fázy. Proteín hlGS5 bol získaný pomocou 100 mM a 200 mM imidazolových elučných fáz.

100 tnM iinidazolová elúcia. ktorá obsahuje maximálne 10% hIGS5 v eluáte, je stále kontaminovaná proteínom s Mr > 115000. Pás IGS5 v 100 mM je tiež zdvojeným pásom.

Ostáva na overenie, či slabý horný pás, ktorý predstavuje menej než 10% dubletu, je zvyškový bakulový kontaminant alebo izoforma IGS5, alebo či nižší (intenzívny) pás je degradačný produkt s karboxylovým koncom. Pás 85 kDa v 200 mM imidazolovej frakcii je jednotným pásom v SDS-PAGE, ktorý reaguje s mAb s anti his substituentom.

Farbenie striebrom nevykazuje žiadny rozdiel v čistote medzi materiálom hIGS5, získaným z pokusu A a pokusu B 1MAC. To naznačuje, že frakcia 1 a frakcia 2 lektínového eluátu môže v budúcnosti byť frakcionovaná a procesovaná súčasne v jedinom pokuse na kolóne zinok-IMAC.

Zhodné vlastnosti pásu boli pozorované v pokuse na géle SDS-PAGE farbenom pomocou Coomassie za redukujúcich a neredukujúcich podmienok, čo indikovalo, že čistený MGS5 neobsahuje oligoméry tvorené na základe disulfidov. Ošetrenie pomocou PGNasy F redukovalo Mr na SDS-PAGE s asi 5 kDa. Tento malý posun u MGS5, exprimovanej bakulom, po ošetrení endoglykozidázou sa dosť odlišoval od migračného posunu, ktorý bol pozorovaný u myšieho SEP exprímovaného CHO (Ikeda a spol., JBC, 274, 32469, 1999).

Keď sa začalo zo 300 ml bakula CM, získalo sa 340 pg ektodomény hlGSS, viac ako

95% čistej, so substituentom His pomocou dvojkrokového čistiaceho procesu (t.j. výťažok asi 1 mg /1). Čistený produkt sa potom použil v teste enzýmovej inhibície tak, ako ukazuje nasledujúci príklad.

Príklad 4. Test enzýmovej inhibície IGS5.

Enzýmová aktivita polypeptidov 1GS5 podľa vynálezu bola testovaná s ohľadom na metabolizmus biologicky aktívnych peptidov. S výhodou bolo testované, či tieto polypeptidy IGS5 môžu pôsobiť na rôzne vazoaktívne peptidy známe v odbore, ako napr. na atriálny natriuretický peptid (ANP), bradykinín, veľký endotelín (big-ET-l), endotelín (ET-1). substanciu P a angiotenzín-1. V kontexte tohto vynálezu bolo s výhodou testované, či ektodoména IGS5, ktorá je novou ľudskou metaloproteázou, hydrolyzuje spomenuté vazoaktívne peptidy. Na porovnanie sa skúška tiež uskutočnila pre známeho člena skupiny metaloproteáz. ktorý bol opísaný skôr ako rozpustná vylučovaná endopeptidáza (SEP) Emotem a spol. (J. Biol. Chem., diel 274 (1999): str. 32469-32477). Ďalej sa testovalo, či aktivita IGS5. konvertovať analóg big-ET-l (takzvaný 17 aa big-ET-l), môže byť inhibovaná predmetnými zlúčeninami, ktoré holi použité na určenie inhibičných vlastností so zreteľom na enzým, ktorý má charakteristiky ECE a/alebo NEP. Látky. ktoré boli použité na testovanie inhibície aktivity IGS5 na analóg} big-ET-1. bola látka fosforamidon. ktorá inhibuje cndopeptidázy s charakteristikou NEP. látka tiorfan. ktorá inhibuje selektívne NEP a látka

CGS-35066. ktorá je duálnvm inhibítorom NEP/ECE.

Príklad 4a. Materiály.

Enzým: IGS5 (sol hu)(his)6; alebo ekotodoména IGS5 derivovaná His6;

Skladovací roztok: 53 pg/ml v 20 mM HEPESU pH 7.2. 5% glycerol, 0.005°^z

Tweenu 20. 100 ml NaCl. čistota >99%; skladovanie pri 4 °C.

Pracovný roztok: skladovací roztok riedený testovacím pufrom na 10 pg/ml.

Substrát: Mca-Asp-lle-Ala-Trp-Phe-Dpa-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-LeuGly-COOH:

Fluorescenčné značený analóg bi-ET-1;

Mca = 7-Mctoxykumarín-4-yl;

Dpa = 3-[2.4/Dinitrofenyl]-l-2,3-diarninopropanoyl;

Skladovací roztok: 100 pM v testovacom pufre; skladovanie pri -20 °C.

(komerčne dostupný od dodávateľa: Polypeptide Laboratories, Wolfénbiittel,

Nemecko)

Testovací pufer: 100 mM Tris pH 7.0. 250 mM NaCl.

Všetky testované látky boli rozpustené v DMSO koncentrácie 10 mM a ďalej sa riedili testovacím pufrom.

Príklad 4b. Testovací postup.

Množstvo 70 μΐ testovacieho pufru. 10 μΐ pracovného roztoku enzýmu a 10 μΐ roztoku testovanej látky boli zmiešané v Eppendorfovej nádobke a preinkubované pri 37 °C počas 15 minút. Potom sa pridalo 10 μΐ skladovacieho roztoku substrátu a reakčná zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas 60 minút, aby prebehla enzymatická hydrolýza. Následne sa enzymatická reakcia ukončila ohriatím na 95 °C po dobu 5 minút. Po centrifugácii (Heraeus Biofuge B. 3 min.) bol supernatant podrobený HPLC analýze.

Príklad 4c. HPLC metóda.

S cieľom oddelenia zvyškového substrátu od produktov štiepenia bola použitá metóda

HPLC na reverznú fázu použitím Cis RP kolóny Nucleosil 300/5, CC 125/4, a C18 predkolóny s náplňou Nucleosil 100/5, CC 8/4 (komerčne dostupných od Macherey-Nagel,

Duren. Nemecko). Tak bolo nastriekaných 60 μΐ reakčného vzorku, získaného v príkladu 7b, do HPLC a kolóna bola eluovaná pri prietoku 1 ml/min. pomocou nasledujúceho gradientu a roztokov:

Roztok A: 100 % vody + 0.5 M H3PO4, pH = 2.0

Roztok B: 100 % acetonitrilu + 0.5 M H3PO4 až 2 min. 20 % B až 6 min. 20 až 60 % B až 8 min. 60 % až 10 min. 60 až 90 % B až 13 min. 90% B až 15 min. 90 až 100% B

Peptidy boli detekované pri absorpcii 214 nm a fluorescenčné s excitačnou vlnovou dĺžkou 328 nm a emisnou vlnovou dĺžkou 393 nm.

Príklad 4d. Výpočty.

Narastajúci fluorescenčný signál piku peptidu s neznačeným fluorofórom Mca v HDPLC po hydrolýze bol zobratý ako základ všetkých výpočtov.

Tento signál bol porov naný pre vzorky s inhibítorom a bez neho a % inhibícia bola vyrátaná na základe príslušných plôch pikov.

/Ó inhibície 1 00*( 1 ^_Ainhibícia/A.|<_ontrola)

Všetky v zorky boli analyzované dvakrát a použitá bola priemerná hodnota. Štandardný inhibítor (10 nM a 100 nM fosforamidónu) a kontrola rozpúšťadlom boli použité pre každej analýze.

Príklad 4e. Výsledky.

S ohľadom na polypeptidy IGS5 podľa tohto vynálezu, výsledky príkladu 4 ukazujú, že tieto polypeptidické metaloproteázy IGS5 hydrolyzujú in vitro celý ratj vazoaktívnych peptidov známych v tomto odbore. Výsledky hydrolýzy pri porovnaní s aktivitou SEP sú znázornené v Tabuľke 7. Z týchto výsledkov vyplýva, že IGS5 môže byť čiastočne zahrnutá v metabolizme spomenutých biologicky vazoaktívnych peptidov.

Tabuľka 7: Hydrolýza vazoaktívnych peptidov pomocou polypeptidu IGS5 pri porovnaní k SĽP (rozpustnej vylučovanej endopeptidáze).

Vazoaktívny peptid	% Hydrolýzy polypeptidom IGS5	% Hydrolýzy pomocou SEP (Emoto a spol.)
	Podmienky;	Podmienky:
	100 pg polypeptidu IGS5	lOpgSEP
	0,5 pM substrát; 2 h, 37°C.	0,5 pM substrát; 12 h, 37°C.
ANP	5(80*)	>95
Bradykinín	100(62**)	>95
ET-1	<30	92
Substancia P	100	>95
Angiotenzín I	15 ***	>95
17 aa big-ET-1****	41	n.d.

* 500 pg polypeptidu IGS5 ** 10 pg polypeptidu IGS5 *** Degradácia angiotenzínu I nemá za následok tvorbu angiotenzínu II **** 17 aa big-ET-1 bol použitý ako analóg prírodného big-ET-1; hydrolyzujúca aktivita

IGS5 bola tiež detekovaná použitím prírodného big-ET-1, ale nemohla byť kvantifikovaná v dôsledku ťažkostí s detekciou v HPLC.

Príklad 5. Inhibičný test enzýmu NEP.

Neutrálna endopeptidáza (E.C.3.4.24.11) bola pripravená z ľadvinovej kôry ošípaných podľa metódy, ktorú opísal Gee a spol. (Biochem J 15. mája 1985; 228(1); 119-26) a čistená podľa Reltona a spol. (Biochem J 1 .decembra 1983; 215(3): 519-23). Na test inhibície enzýmu sa použilo 10 ng čisteného enzýmu, 20 μΜ substrátu (metionín-enkefalín) a použili sa rôzne koncentrácie inhibítora. Testovací pufer bol 50 mM Tris-(hydroxymetyl)-aminometán/HCl pH

7.4. celkový objem pri teste bol 100 μΐ. Po preinkubačnej perióde 5 min. enzýmu a inhibítora sa pridal substrát a následne bola začatá druhá inkubačná fáza na hydrolýzu substrátu indukovanou enzýmom pri 37 °C počas 30 min. Enzymatická reakcia bola ukončená zahriatím na 95 ⁼C počas 5 min. Po centrifugácii bol supernatant podrobený HPLC. Produkty enzymatickej hydrolýzy substrátu boli oddelené od prírodného substrátu metódou HPLC a inhibičná energia vyrátaná porovnaním plôch signálov produktov s plochami signálov prírodného substrátu jednak pre vzorky s inhibítorom, ako aj bez nej (kontrola).

Porovnávacie pokusy bez enzýmu, kontroly bez inhibítora, vzorky s inhibičným rozpúšťadlom namiesto inhibítora a vzorky so štandardným inhibítorom boli pridané ku každej analýze.

Dodávateľ materiálov:

NEP: Dr. Philippe Crine. Univ. of Montreal, Kanada

Methionin-enkefalin: Sigma. Deisenhofen, Nemecko

Príklad 6. Inhibičný test enzýmu ECE.

Rekombinantný ľudský enzým-1, ukončený COOH, derivovaný Hisé, premieňajúci endotelín. bol exprimovaný v bunkách Sf9. Čistenie sa uskutočnilo afinitnou chromatografiou. Inhibičný test enzýmu zahrnoval enzým (2.8 pg), 5 pg substrátu (mierne modifikovaného veľkého endotelínu-1. skráteného o 17 aminokyselín), inhibítor pri rôznych konečných koncentráciách a 100 mM Tris-pufm (Tris-hydroxymetylaminometán/HCl, pH 7.0 + 150 ntM NaCl) konečného objemu 100 pl. Preinkubácia enzýmu s inhibítorom po dobu 15 min. pri 37 °C bola uskutočnená pred pridaním substrátu a inkubáciou (60 min. pri 37 °C) na enzýmovú hydrolýzu. Enzymatická reakcia bola ukončená zahriatím na 95 °C po dobu 5 min. Po centrifugácii bol supernatant podrobený HPLC s cieľom oddelenia produktov enzymatickej hydrolýzy od nedegradovaného substrátu. Percentá inhibície boli vyrátané podľa plôch signálov produktov⁷ a neštiepeného substrátu pre inhibovanú reakciu pri porovnaní s kontrolou (bez inhibítora). Porovnávacie pokusy bez enzýmu, kontroly bez inhibítora. vzorky s inhibičným rozpúšťadlom namiesto inhibítora a vzorky so štandardným inhibítorom boli pridané ku každej analýze.

Dodávateľ materiálov:

ECE: Innogenetics. Gent. Belgicko

Substrát pre ECE: Polypeptide, Wolfenbuttel, Nemecko

Príklad 7. Biochemický profil inhibičných látok k NF.P/IGS5 pri porovnaní s referenčnými látkami.

S cieľom charakterizácie a vyhodnotenia farmakologických enzymatických vlastností 1GS5 pre účely tohto vynálezu, bol ľudský protein IGS5 generovaný použitím bunkových línií hmyzu ako expresného systému tak, ako je opísané v príkladoch vyššie a bolo testovaných množstvo potenciálnych substrátov proteínu IGS5. Podľa výsledkov príkladu 4, bolo zistené, že IGS5 účinne štepí big-ET-1. ANP a bradykinín, čím sa potvrdzuje, že tento nový protein je jemnou metaloproteázou so širokou substrátovou špecifitou, ktorá je všeobecnou vlastnosťou metaloproteáz a táto vlastnosť bola nájdená u NEP, ECE-l a tiež ACE. Malo by sa tiež poznamenať, že podľa zistenia podľa tohto vynálezu, má proteolýza big-ET-1 pomocou IGS5 prekvapujúco za následok správnu tvorbu ET-1, napr. big-ET-1 je správne štepený medzi aminokyselinami Trp21 a Val22.

Ďalej bola skúmaná účinnosť inhibičných látok metaloproteáz a referenčných látok pri potlačovaní konverzie big-ET-1 na ET-1 tak, ako je opísané v príklade 7, použitím fluorescenčné značeného analógu big-ET-E Postupy použité v testoch enzýmu sú opísané v príkladoch 4 s ohľadom na 1GS5, v príkladoch 5 s ohľadom na NEP a v príklade 8 s ohľadom na ECE.

Výsledky inhibičných testov enzýmov sú zhrnuté v Tabuľke 8. Je zaujímavé, že fosforamidon. o ktorom je známe, že inhibuje konverziu big-ET-hnaET-] in vivo. inhibuje tiež

1GS5 s vysokou účinnosťou v biochemických testoch použitých v tomto vynáleze a prekvapujúco je táto inhibícia IGS5 fosforamidonom skutočne významne vyššia, než u ECE-1.

Na rozdiel od toho. selektívny inhibítor NEP, tiorfan, ako aj selektívny inhibítor ECE-1, SM19712 (monosodná soľ 4-chlór-N-{[(4-kyano-3-metyl-l-fenyl-lH-pyrazol-5yl)amino]karbonylj-benzénsulfonamidu: IJmekawa K, Ilasegawa H, Tsutsumi Z, Sato K.

Matsumura Z, Ohashi N. J Parmacol 2000 Sep; 84(1): 7-15; Discovery Research Laboratories 1,

Research Center, Sumitomo Pharmaceuticals Co, Ltd, Osaka, Japonsko) neovplyvňujú aktivitu

IGS5 (Tabuľka 8).

Tabuľka 8: Biochemický profil inhibičných látok NEP/IGS5 a referenčných látok

Látka í	IGS5 IC50/nM	NEP IC50/nM	ECE-1 IC50/'nM
Fosforamidon	18	2.0	O o j
CGS-35066	1300	42	5
Tiorfan	> 1000	2.4	> 10000
SM-19712	> 10000	> 1000	11.7
Látka Ia-2 ako aktívne liečivo	1.2	2.9	1000
Látka la-2 ako aktív ne liečivo	2.9	1.7	3279
Látka la-2 ako aktívne liečivo	2.8	4	374

Výsledky tohto vynálezu sú veľmi prekvapujúce, najmä so zreteľom na nasledovné skutočnosti. Pretože enzým-1 (ECE-1), premieňajúci endotelín, bol klonovaný v roku 1984, začal byť tento enzým všeobecne akceptovaný ako endopeptidáza' zodpovedná za fyziologickú konverziu big-ET-1 na ET-1. Avšak navzdory skutočnosti, že ECE-1 má schopnosť štiepiť bigET-1, objavili sa pochybnosti na základe novšej správy, či ECE-1 je jediným fyziologicky významným enzýmom premieňajúcim endotelín, alebo aspoň argumenty o tom, že ďalšie enzýmy musia byť zahrnuté v produkcii ET-1, Proteín IGS5 bol objavený ako metaloproteáza veľmi podobná NEP (zhoda 54 %) a čiastočne menej podobná ECE-1 (zhoda 39 %). Snaha charakterizovať enzymatické vlastnosti tejto novej metaloproteázy pomocou pokusov v príklade

4. vyústila do hľadania potenciálnych substrátov, čím sa zistilo, že substancia P, bradykinin, bigET-1 a menej účinne ANP, angiotenzín I a ET-1, sú štiepené pomocou IGS5. Enzymatická aktivita IGS5 má optimum pri neutrálnom pH (7,0-7.5). Malo by sa poznamenať, že proteolýza big-ET-1 pomocou IGS5 má za následok správny vznik ET-1.

Pomocou pokusov v príklade 7 bola skúmaná účinnosť inhibítorov metaloproteázy potlačovať konverziu big-ET-1 na ET-1 pomocou IGS5, použitím fluorescenčné značeného analógu big-ET-1 ako substrátu. Je zaujímavé, že fosforamidon, o ktorom je známe, že inhibuje konverziu big-ET-1 na ET-1 in vivo, inhibuje tiež IGS5 s vysokou účinnosťou (IC50 = 18 nM) v našom biochemickom teste (značne vyšší, než ECE-1). Na rozdiel od toho, selektívny inhibítor NEP. tiorfan, ako aj selektívny inhibítor ECE-1, SM-19712 od Sumitomo, neovplyvňuje aktivitu IGS5.

Tak látka vzorca I. s výhodou buď vzorca la alebo lb. vykazuje prekvapujúco kombinovanú alebo súbežnú inhibičnú aktivitu k NEP/IGS5. Ako reprezentačný príklad látok vzorca la je látka Ia-2 a látok vzorca lb je látka Ib-8, ktoré boli skúmané v pokusoch príkladu 7. Obe látky sú veľmi účinnými inhibítormi (IC50 = 1.2 a 2.9 nM) novo identifikovanej metaloproteázy IGS5.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie derivátu benzazepínu. vyznačuj úce sa tým. že má s výhodou súbežnú inhibičnú aktivitu k

   a) neutrálnej endopeptidáze (NEP) a

   b) metaloproteáze IGS5, ktorá je polypeptidom obsahujúcim sekvenciu aminokyselín, která je v zhode najmenej 70 % s jednou zo sekvencií aminokyselín vybraných zo skupín SEQ

   ID NO:2. SEQ ID NO.4 alebo SEQ ID NO:6;

   alebo jeho farmaceutický' použiteľné soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru. na výrobu liečiva (farmaceutickej zmesi) na liečenie cicavca, s výhodou človeka, ktorý trpí alebo je citlivý na podmienku, ktorá môže byť zmiernená alebo preventovaná kombinovanou alebo súbežnou inhibíciou NEP a IGS5.
2. 2. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa nároku 1. v y z n a č u j ú c e sa t ý m, že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie cicavca, s výhodou človeka, ktorý trpí alebo je citlivý na podmienku, pri ktorej je hladina big-ET-l zvýšená a táto choroba alebo podmienka môže byť zmiernená alebo preventovaná kombinovanou alebo súbežnou inhibíciou NEP a IGS5.
3. 3. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa nároku 1. vyznačujúce sa t ý m, že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie cicavca, s výhodou človeka, ktorý trpí alebo je citlivý na podmienku, pri ktorej je hladina ET-1 významne zvýšená a táto choroba alebo podmienka môže byť zmiernená alebo preventovaná kombinovanou alebo súbežnou inhibíciou NEP a 1GS5.
4. 4. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa nárokov 1 až 3. v y z n a č u j ú c e sa t ý m, že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie a/alebo profylaxiu hypertenzie, vrátane sekundárnych foriem hypertenzie. ako je pľúcna hypertenzia, zlyhanie srdca, angíny pecforis, arytmie, infarktu myokardu, hypertrofie srdca, mozgovej ischémie, periferálneho cievneho ochorenia, subarachnoidálneho krv ácania, chronické obštrukčné pľúcne choroby (COPD), astmy, renálneho ochorenia, aterosklerózy, bolesti v dôsledku kolorektálnej rakoviny alebo rakoviny prostaty, u vyšších cicavcov, s výhodou u ľudí.
5. 5. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa nárokov 2 alebo 3, v y z n a č u j ú c e sa t ý m, že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie a/alebo profylaxiu aterosklerózy u vyšších cicavcov, s výhodou u ľudí.

   *
6. 6. Použite derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa nárokov 2 alebo 3, v y z n a č uj ú c e sa t ý m, že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie a/alebo profylaxiu hypertenzie, vrátane sekundárnych foriem hypertenzie. ako je pľúcna hypertenzia, zlyhanie srdca, angína pectoris, arytmia, infarktu myokardu, hypertrofia srdca, mozgová ischémia, periferálneho cievneho ochorenia, subarachnoidálneho krvácania, chronické obštrukčné pľúcne choroby (COPD), astmy, renálneho ochorenia, aterosklerózy, bolesti v dôsledku kolorektálnej rakoviny alebo rakoviny prostaty, u vyšších cicavcov, s výhodou u ľudí.
7. 7. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúce sa tým, že metaloproteáza IGS5 je polypeptid, ktorý má sekvenciu aminokyselín zhodnú najmenej v 70% s jednou zo sekvencií aminokyselín vybraných zo skupín SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.
8. 8. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 7, vyznačujúce sa tým, že sekvencia aminokyselín, ktorá je obsiahnutá v metaloproteáze IGS5 alebo je metaloproteázou IGS5, je najmenej v 95% zhodná s jednou zo sekvencií aminokyselín vybraných zo skupín SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.
9. 9. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa nároku 8, v y z n ač u j ú c e sa t ý m, že sekvencia aminokyselín, ktorá je obsiahnutá v metaloproteáze IGS5 alebo je metaloproteázou IGS5, je zhodná s jednou zo sekvencií aminokyselín vybraných zo skupín SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 aSEQIDNO:6.
10. 10. Použitie derivátu benzazepínu vzorca I,

    A

    O v ktorom

    A je skupina vzorca II alebo III

    R²*OOi

    II a vo vzorci II

    R^la je fenyl-nižšou-alkylskupinou. ktorá môže byť voliteľne substituovaná na fenvlovom kruhu nižším alkylom, nižším alkoxylom alebo halogénom, alebo je naftyl-nižšoualkylskupinou.

    R^2a je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester; a a vo vzorci III

    R^lb je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester kyseliny fosforečnej,

    R^?b je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester kyseliny fosforečnej;

    a v ktorom

    R³ je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester karboxylovej kyseliny;

    alebo jeho farmaceutický použiteľné soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa nároku

    I, vyznačujúci sa tým, že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie vyššieho cicavca, s výhodou človeka, ktorý trpí alebo je citlivý na podmienku, ktorá môže byť zmiernená alebo preventovaná kombinovanou alebo súbežnou inhibiciou

    a) neutrálnej endopeptidázy (NEP) a

    b) metaloproteázy IGS5, ktoráje polypeptidom obsahujúcim sekvenciu aminokyselín, ktoráje zhodná najmenej v 70 % s jednou zo sekvencii aminokyselín vybraných zo skupín SEQ ID NO:2. SEQ ÍD NO:4 alebo SEQ ID NO:6.

    II. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa nároku 10, vyznačujúce sa tým, že látka vzorca 1 je vybraná z podskupiny látok, ktoré majú štruktúru podľa vzorca la.

    v ktorom

    R^la je fenyl-nižšou-alkylskupinou, ktorá môže byť voliteľne substituovaná na fenylovom kruhu nižším alkylom, nižším alkoxylom alebo halogénom, alebo je naftyl-nižšou-alkylskupinou,

    R^2a je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester, a

    R³ je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester ajej fyziologicky vhodné soli kyselín alebo solváty.
11. 12. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa nároku 10, vyznačujúce sa tým, že látka vzorca I je vybraná z podskupiny látok, ktoré majú štruktúru podľa vzorca Ib, v ktorom

    R^lb je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester kyseliny fosforečnej, R^2b je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester kyseliny fosforečnej, a R³ je vodík alebo skupina tvoriaca biolabilný ester karboxylovej kyseliny ajej fyziologicky vhodné soli kyselín alebo solváty.
12. 13. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 12. v y z n a č u j ú c e sa t ý m. že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie cicavca,'s výhodou človeka, ktorý trpí alebo je citlivý na chorobu alebo podmienku, pri ktorej sú hladiny big-ET-1 zvýšené a táto choroba alebo podmienka môže byť zmiernená alebo preventovaná kombinovanou alebo súbežnou inhibíciou NEP a IGS5.
13. 14. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa ktoréhokoľvek z nárokov lOažl 2, vyznačujúce sa t ý m, že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie cicavca, s výhodou človeka, ktorý trpí alebo je citlivý na chorobu (podmienku), pri ktorej je hladina ET-1 významné zvýšená a táto choroba (podmienka) môže byť zmiernená alebo preventovaná kombinovanou alebo súbežnou inhibíciou NEP a IGS5.
14. 15. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa ktoréhokoľvek z nárokov lOažl 4, vyznačujúce sa t ý m, že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie a/alebo profylaxiu hypertenzie, vrátane sekundárnych foriem hypertenzie, ako je pľúcna hypertenzia, zlyhanie srdca, angíny pectoris, arytmia, infarktu myokardu, hypertrofie srdca, mozgovej ischémie, periferálneho cievneho ochorenia, subarachnoidálneho krvácania, chronickej obštrukčnej pľúcnej choroby (COPD), astmy, renálneho ochorenia, aterosklerózy, bolesti v dôsledku kolorektálnej rakoviny alebo rakoviny prostaty, u vyšších cicavcov, s výhodou u ľudí.
15. 16. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 alebo 14, v y z n a č u j ú c e sa ty m. že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie a/alebo profylaxiu aterosklerózy u vyšších cicavcov, s výhodou u ľudí.
16. 17. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 alebo 14. vyznačujúce sa t ý m. že sa vyrobí liečivo (farmaceutická zmes) na liečenie a/alebo profylaxiu hypertenzie. v rátane sekundárnych foriem hypertenzie. ako je pľúcna hypertenzia. zlyhanie srdca, angíny pectoris. arytmia. infarktu myokardu, hypertrofia srdca, mozgovej ischémie, periferálneho cievneho ochorenia, subarachnoidálneho krvácania, chronickej obštrukčnej pľúcnej choroby (COPD), astmy, renálneho ochorenia, aterosklerózy , bolesti v dôsledku kolorektálnej rakoviny alebo rakov iny prostaty, u vyšších cicavcov, s výhodou u ľudí.
17. 18. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa ktoréhokoľvek z nárokov lOažl 7, vyznačujúce sa t ý m. že metaloproteáza IGS5 je polypeptid. ktorý má sekvenciu aminokyselín zhodnú najmenej v 70% s jednou zo sekvencií aminokyselín vybraných zo skupín SEQ ID NO:2. SEQ

    IDNO:4aSEQ IDNO:6.
18. 19. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 18. vyznačujúce sa t ý m. že sekvencia aminokyselín, která je obsiahnutá v metaloproteáze 1GS5 alebo je metaloproteázou IGS5. je najmenej v 95% zhodná s jednou zo sekvencií aminokyselín vybraných zo skupín SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.
19. 20. Použitie derivátu benzazepínu alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa nároku 19. v y z n a č u j ú c e sa t ý m, že sekvencia aminokyselín, ktorá je obsiahnutá v metaloproteáze 1GS5 alebo je metaloproteázou IGS5, je zhodná s jednou zo sekvencií aminokyselín vybraných zo skupín SEQ ID .NO:2. SEQ ID NO:4 aSEQ!DNO:6.
20. 21. Použitie derivátu benzazepínu ako prvotnej látky, v y z n a č u j ú c e sa t ý m, že vykazuje kombinov anú alebo súbežnú inhibičnú aktivitu k NEP/1GS5 alebo jeho farmaceutický použiteľnej soli alebo solvátu alebo biolabilného esteru podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20, v kombinácii s najmenej jednou prídavnou látkou, vybranou zo skupiny ďalších látok a^zalebo kombinovaných inhibítorov metalopioteázy. než kombinovaných inhibítorov NEP/IGS5, pričom spomenutá prídavná látka je s výhodou vybraná zo skupiny inhibítorov ACE, selektívnych inhibítorov ECE, selektívnych inhibítorov NEP, duálnych inhibítorov NEP/ECE a zmesových inhibítorov týchto metaloproteáz, na výrobu liečiva (farmaceutickej zmesi) s cieľom kombinovaného liečenia a^zalebo kombinovanej profylaxie ktorejkoľvek z chorôb alebo podmienok opísaných v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 20.
21. 22. Použitie predmetného derivátu benzazepínu ako prvotnej látky podľa nároku 21, vyznačujúce sa t ý m, že je v kombinácii s najmenej jednou zo spomenutých prídavných látok a že táto prvotná látka má štruktúru podľa vzorca I, ako bolo dané v nárokoch 10 až 12, s výhodou má štruktúru podľa vzorca la, ako bolo dané v nároku 11 alebo vzorca Ib, ako bolo dané v nároku 12.
22. 23. Použitie predmetného derivátu benzazepínu ako prvotnej látky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 22. v y z. n a č u j ú c e sa t ý m, že je v kombinácii s najmenej jednou zo spomenutých prídavných látok a že táto kombinácia je spoluúčinná, s výhodou synergisticky účinná.
23. 24. Farmaceutická zmes. v y z n a č u j ú c a sa t ý m, že obsahuje spoluúčinné. s výhodou synergisticky účinné množstvo:

    derivátu benzazepínu ako prvotnej látky, ktorá vykazuje kombinovanú alebo súbežnú inhibičnú aktivitu k NĽP/IGS5, alebo jej farmaceutický vhodné soli alebo solvátu alebo biolabi 1 ného esteru. podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20; a najmenej jednej prídavnej látky vybranej zo skupiny ďalších látok a/alebo kombinovaných inhibítorov metaloproteázy, než kombinovaných inhibítorov NEP/IGS5, pričom predmetná prídavná látka je s výhodou vybraná zo skupiny inhibítorov ACE. selektívnych inhibítorov ECE, selektívnych inhibítorov NEP, duálnych inhibítorov NEP/ECE a zmesových inhibítorov týchto metaloproteáz. na kombinované liečenie a^zalebo kombinovanú profylaxiu ktorejkoľvek z chorôb alebo podmienok, ktoré sú dané ktorýmkoľvek z nárokov 1 až 20.
24. 25. Farmaceutická zmes podľa nároku 24, v y z n a č u j ú c a sa t ý m, že obsahuje spoluúčinné. s výhodou synergisticky účinné, množstvo predmetného derivátu benzazepínu ako prvotnej látky a najmenej jednu zo spomenutých prídavných látok, pričom prvá látka má štruktúru podľa vzorca 1. ako je uvedené v nárokoch 10 až 12. s výhodou štruktúru podľa vzorca la. ako je uvedené v nároku 11 alebo vzorca lb, ako je uvedené v nároku 12.