CZ20033183A3 - Použití sloučenin s kombinovanou inhibiční aktivitou NEP/ MP v přípravě léčiv - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká nového lékařského použití sloučenin, které mohou působit jako kombinované či konkurenční inhibitory neutrální endopeptidasy (NEP) a specifické metaloproteasy (MP), které byly nedávno nakloňovány a identifikovány jako jemné metaloproteasy se širokou substrátovou specifitou.

Dosavadní stav techniky

Metaloproteasy jsou polypeptidy, které tvoří zvláštní skupinu strukturně a funkčně příbuzných enzymů, např. peptidas, které jsou farmaceuticky a farmakologicky zajímavé v souvislosti s léčením nebo profylaxí různých chorob. Bylo identifikováno několik chorob, u nichž metaloproteasy hrají klíčovou úlohu v patologii choroby. Například byla identifikována a charakterizována řada metaloproteas obsahujících zinek nebo podobných skupin strukturně a funkčně příbuzných enzymů a začalo být zřejmé, že účast těchto enzymů, např. metaloproteas obsahujících zinek, má úlohu v různých biologických funkcích zahrnujících situace jak normální, tak chorobné. Metaloproteasy obsahující zinek tvoří podskupinu enzymů, jejichž katalytické funkce jsou závislé na přítomnosti iontu zinku v aktivním centru.

O této skupině enzymů, která zahrnuje různé skupiny klasifikované na základě jak sekvenční tak strukturní informace, je známo, že se přímo podílí v procesech jako jsou např. vývoj embryí, tvorba chrupavek a kostí, aktivace peptidických hormonů, rozmnožování, kardiovaskulárních chorob, arthritidy a rakoviny. Proto existuje zvláštní zájem ve farmaceutickém oboru zkoumat klíčové úlohy metaloproteas ajejich potenciálních vzájemných vztahů během zdraví a chorob, ale také při navrhování vylepšených terapeutických konceptů léčení chorob při využití předmětných metaloproteas.

• 9 • ·

Na základě sekvenční a strukturní informace týkající se vazebného místa pro zinek v metaloproteasách obsahujících zinek, mohou být tyto enzymy řazeny do několika skupin, které mohou být dále rozděleny do podskupin jako jsou „metzinciny“ (astacin, serratia, reprolysin, matrixin), „gluzinciny“ (thermolysin, neprilysin, enzym přeměňující angiotensin, aminopeptidasa) nebo „zinciny“ zahrnující podskupiny metzincinů a gluzincinů. Takovéto členění nejen pomáhá při určování obecných mechanismů katalytického a biosynthetického působení, aleje také neocenitelné při určování funkce (funkcí) nově identifikovaných proteinů, které mají podobné způsoby vázání zinku. Některé příklady metaloproteas, např. enzymů obsahujících zinek, které již byly identifikovány dříve, zahrnují neprilysin, enzym přeměňující endothelin, enzym přeměňující angiotensin, thermolysin, aminopeptidasu, astacin, serratiu, reprolysin, matrixin, insulinasu, karboxypeptidasu a DD-karboxypeptidasu.

Některé další, specifické vlastnosti a podobné známé aktivity poddruhů zvláště zajímavé metaloproteasy, jako je neutrální endopeptidasa (NEP), enzym přeměňující endothelin (ECE) a enzym přeměňující angiotensin (ACE), mohou být shrnuty v následující části.

Enzym přeměňující angiotensin I (ACE; peptidyl dipeptidasa A; EC 3.4.15.1) je členem skupiny enzymů přeměňujících angiotensin, které patří mezi metaloproteasy obsahující zinek. ACE se primárně exprimuje na povrchu endothelových, epitelových a neuroepitelových buněk (somatická ACE) jako ektoenzym, což znamená, zeje zachycena k plasmové membráně většinou své hmotnosti včetně katalytického centra a je nasměrována k extracelulárnímu prostředí. ACE byla nalezena v plasmové membráně cévních endothelových buněk, ve vysoké koncentraci byla nalezena na cévním endothelovém povrchu plíce tak, že aktivní centra ACE jsou nasměrována, aby metabolizovala kolující substráty. Kromě endothelové polohy ACE je enzym také exprimován na kontaktní hranici absorbovaného epitelu malého střevního a ledvinového proximálního kanálku. ACE se také • · • ·

• · · · • · · · · · · • · · ·· · nalézá v monojaderných buňkách, jako jsou monocyty po makrofágové diferenciaci a Tlymfocyty a ve fibroblastech. In vitro autoradiografíe, využívající rádi označených specifických inhibitorů ACE a imunohistochemických studií, zmapovala základní výskyt ACE v mozku. ACE byla primárně nalezena v plexu choroideu, který je pravděpodovně zdrojem ACE v cerebrospinální tekutině, ependymě, subfornikálním orgánu, bazální uzlině (caudate putamen a globus pallidus), v černé substanci a v hypofýze. Rozpustná forma ACE byla detekována v mnoha biologických tekutinách jako je sérum, spermová tekutina, amniotická tekutina a cerebrospinální tekutina. Rozpustná forma ACE je zřejmě odvozená od formy enzymu vázaného na membráně v endothelových buňkách. Hlavní fyziologická aktivita

ACE spočívá v čištění C-terminálního dipeptidu z angiotensinu I při produkci účinného vasopresního peptidu angiotensinu II a v inaktivaci vasodilatačního peptidu bradykininu sekvenčním odštěpením dvou C-terminálních dipeptidů. Jako důsledek zahrnutí,ACE v metabolismu těchto dvou vasoaktivních peptidů, angiotensinu II a bradykininu, stala se ACE klíčovým molekulárním cílem při léčení vysokého tlaku a selhání srdce v důsledku zahlcení. To vedlo k vývoji vysoce účinných a specifických inhibitorů ACE, které se staly klinicky významnými a široce rozšířenými léky pro perorální aplikaci při léčbě vysokého tlaku a selhání srdce v důsledku zahlcení. Zatímco metabolismus vasoaktivních peptidů zůstává nejlépe poznanou fyziologickou funkcí ACE, enzym byl též zapojen do řady dalších fyziologických procesů nesouvisejících s regulací krevního tlaku, jako je imunita, reprodukce a metabolismus neuropeptidů díky umístění ACE a/nebo štěpení řady biologicky aktivních peptidů in vitro.

Neutrální endopeptidasa (NEP, neprilysin, EC 3.4.24.11) je metaloproteasa obsahující zinek a je klasifikována jako člen skupiny neprilysinu. NEP byla poprvé isolována z hraničních membrán králičích ledvin. Později byl jeden z enzymů podobných NEP identifikován v krysím mozku jako enzym účastnící se degradace opioidních peptidů, • ·· · · · · · « · · • · · · · · · ···· • « «·· · · · · · · · ···· ·· ··«· · · · ·· ·· · · · · · · · · enkefalinů. Klonování ektoenzymu NEP a následné pokusy s mutagenezí zaměřenou na aktivní centrum enzymu ukázaly, že když tento enzym má specifítu podobnou jako thermolysin a má též podobný tvar aktivního centra. NEP se vyznačuje také specifitou podobnou thermolysinu z hlediska štěpení peptidů na N-terminálním konci hydrofobního zbytku. S ohledem na obecnou distribuci NEP byl tento enzym nalezen v mozku a páteřní míše a její porucha a studie pomocí elektronového mikroskopu obecně podporují převážně nervové umístění NEP, ačkoli enzym může být přítomen v oligodendrocytech obklopujících vlákna striato-pallidální a striato-nigrální cesty a ve Schwannových buňkách v periferním nervovém systému. NEP není koncentrován na specifických rozhraních membrán jako je synapse, aleje dost jednoznačně distribuován na povrchu nervových buněčných schránek a dendritů. Na periferii je NEP zvláště hojný v hraničních membránách ledvin a střev, lymfatických uzlin a placenty a byl nalezen v nižších koncentracích v mnoha dalších tkáních včetně cévní stěny aorty. Bylo zjištěno, že obecným akutním antigenem lymfoblastické leukémie je NEP a výzkumem též prokázáno, že enzym je přechodně přítomen na povrchu lymfohematopoézních buněk a jeho zvýšené hladiny byly nalezeny v dospělých lymfocytech v určitých stádiích nemoci. Klinický zájem o NEP, zvláště zájem o inhibitory NEP jako o potenciální klinické prostředky, se odvíjí z účinků NEP, v souvislosti s další metaloproteasou obsahující zinek, aminopeptidasou Ν (APN, membránová alanyl aminopeptidasa, EC 3.4.11.2) v degradaci enkefalinů a také od její úlohy v degradaci atriálního natriuretického peptidů (ANP). Například je známo, že duální inhibitory NEP a enzymů přeměňujících angiotensin (ACE) jsou účinnými antihypertensivy, v důsledku současně rostoucí cirkulující hladiny atriálního natriuretického peptidů, kvůli inhibici NEP a snižující se cirkulující hladiny angiotensinu II, v důsledku inhibice ACE. Další zájem o klinický potenciál inhibitorů NEP přišel, když se ukázalo, že periferní enzym degraduje cirkulující natriuretický a diuretický peptid, atriální natriuretický peptid. Inhibitory NEP byly proto studovány kvůli jejich • · • ·· · · · · · · ·· ···· · · · ···· · · ··· · · · 9 · · · ····

S ······ · 9 ·

9999 99999 99 · antihypertensním vlastnostem. Z dalšího příkladu vyplývá, že inhibice metabolismu enkefalinu synthetickým inhibitorem NEP, thiorfanem, dává u myší antinocicepční odpovědi opačné, než naloxone. To naznačilo možnost, že zvýšení hladiny endogenních opioidů v oblasti jejich receptorů, může způsobit analgezii v podstatě bez vedlejších účinků morfinu a dalších klasických opiátových léčiv. Bylo zjištěno, že aby bylo dosaženo znatelného účinku, další enzymy metabolizující enkefalin musejí být rovněž inhibovány, zvláště aminopeptidasa N (APN). Takové duální inhibitory NEP/APN zcela blokují metabolismus enkefalinu a mají silné účinky proti bolestem.

Enzym přeměňující endothelin (ECE) katalyzuje poslední krok biosynthesy silného vazokonstriktorního peptidu endothelinu (ET). To zahrnuje štěpení vazby Trp-Val v neaktivním meziproduktu, velkém endothelinu. ECE-1 je metaloproteasou obsahující zinek, která ie homologickou s neutrální endopeptidasou (NEP; neprilysin; EC 3.4.24.! J, viz výše). Stejně jako NEP, i ECE-1 je inhibována látkou fosforamidonem a integrálním membránovým proteinem typu II. Na rozdíl od NEP, však ECE-1 existuje jako dimer vázaný disulfídovou vazbou a není inhibován dalšími inhibitory NEP, jako je thiorfan. Imunocytochemické studie indikují převážné umístěni ECE-1 na povrchu buňky, kde existuje jako ektoenzym. ECE-1 je lokalizován do endothelových buněk a některých sekrečních buněk, např. β-buněk v pankreatu a v buňkách hladkých svalů. Silné a selektivní inhibitory ECE, nebo duální inhibitory ECE a NEP, mohou mít terapeutické aplikace v kardiovaskulární a renální medicíně. Endothelin (ET), který je bicyklickým peptidem o 21 aminokyselinách, obsahující dvě intramolekulární disulfidové vazby, je jedním z nejsilnějších vazokonstriktních peptidů dosud identifikovaných a jeho aplikace na živočichy má za následek stálý růst krevního tlaku, což zdůrazňuje jeho potenciální úlohu v kardiovaskulární regulaci. Endogenní produkce ET-1 u lidí přispívá k udržení základního stavu cév. Systém endothelinu a podobných enzymů jako ECE tudíž reprezentuje možného kandidáta na vývoj nových farmaceutických prostředků.

• · ·· ·· · ··· • ·· · · ··· · · · • · · · ·· · ···· · · ··· · · · · · · · ··· β ······ ··· ·· ·· · · · · · ·· ·

Proto je klinický zájem o ECE, zvláště zájem o inhibitory ECEjako potenciální klinické prostředky, odvozen od účinků ECE, zvláště v souvislosti s biosynthesou ET. Následně sloučeniny, vykazující významnou inhibiční aktivitu k enzymu přeměňujícímu endothelin, jsou použitelné při léčení a prevenci různých onemocnění, která jsou vyvolána ET nebo se předpokládá, že by mohla být vyvolána ET.

Zvláště substráty metaloproteas nebo metaloendopeptidas, známé v tomto oboru, jsou např. velký endothelin 1 (big-ET-1), atriální natriuretické peptidy (ANP) a bradykinin. Například, o big-ET-1 se ví, že je biologicky neaktivním prekursorem endothelinu 1 (ET-1), který je vysoce účinným vazokonstriktorním peptidem, který je produkován ze svého prekursoru, velkého endothelinu 1, specifickým proteolytickým postupem. ET-1 má fyziologickou úlohu při udržování základního stavu cév u lidí, ale též se zdá, že je kauzativním faktorem v patogenezi různých kardiovaskulárních onemocnění jako hypertenze, srdeční selhání a atheroskleróza. Jeden způsob, jak ztlumit nepříznivé účinky nadbytku ET-1, je inhibovat enzymatickou konverzi big-ET-1 na ET-1. Protože enzym přeměňující endothelin 1 (ECE-1) byl nakloňován v roce 1994 (Xu D. a spol., Cell, 1994, 78: 473-485), začal tento enzym být obecně akceptován jako endopeptidasa odpovědná za fyziologickou přeměnu bigET-1 na ET-1. Od té doby také inhibitor NEP, fosforamidon, začal být akceptován jako látka, která též účinně inhibuje ECE-1; navíc mohla její aktivita být ověřena u pacientů se srdečním selháním, kterým byla podána infuze big-ET-1 (Love MP a spol., Circ, 1996, 94: 2131-2137).

Avšak navzdory skutečnosti, že ECE-1 má schopnost štěpit big-ET-1, novější publikace vnesly pochybnosti, zda ECE-1 je fyziologicky důležitý enzym přeměňující endothelin, nebo alespoň argumentovaly tím, že další enzymy jsou potřebné pro produkci ET1 (Barker S. a spol., Mol. Pharmacol. 2001, 59: 163-169). Navíc podle Barkera a spol., endothelin 1 (ET-1) byl zahrnut jako kauzativní faktor v patogenezi hypertenze, plicní hypertenze, městnavé selhání srdce, atherosklerózy a astmatu (viz též Douglas, 1997, Trends • · · · · · · · · · · • · · · · · · ···« • ······ · · · 9 « ··· · ·· · · · · ··· • · · · · · ··· · · ·

Pharmacol. Sci. 18: 408-412; Haynes a Web, 1998, J. Hypertension 16: 1081-1098; Goldie a Henry, 1999, Life Sci. 65: 1-15). O řadě vysoce účinných antagonistů receptoru ET bylo referováno kvůli jejich terapeutickému použití, avšak tyto látky jsou obecně selektivní k receptorům ET_A a neselektivní antagonisti ET_a/ETb (Douglas, 1997, viz výše). Ačkoli receptory ETb převažují v některých tkáních, jsou odolné vůči blokování selektivními antagonisty ETb a neselektivními antagonisty ET_a/ETb (Hay a spol., 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther. 284. 669-677). Proto může být specifická inhibice synthesy ET-1 pomocí inhibitorů ECE za určitých podmínek lepším způsobem ztlumení nepříznivých účinků nadbytku ET-1.

Je předmětem tohoto vynálezu předložit nové terapeutické koncepty léčení a/nebo profylaxe onemocnění souvisejících s metaloproteasami, např. v první řadě předložením terapeuticky vhodných látek, které buď inhibují vybranou kombinaci nejméně dvou typů metaloproteas kombinovaným profilem způsobu účinku; a v druhé řadě předložením terapeuticky vhodných kombinací látek inhibujících výše zmíněné metaloproteasy.

Podstata vynálezu

Vzhledem k pochybnostem v dané oblasti (Barker S. a spol., Mol. Pharmacol., 2001, 59: 163-169), pokud jde o to, že ECE-1 by měl být jediným fyziologicky vhodným enzymem přeměňujícím endothelin a tedy že tedy další enzymy musejí být zahrnuty do produkce ET-1, byl podle tohoto vynálezu proveden projekt homologického klonování za účelem zjištění, zda dosud neznámé metaloproteasy mohou hrát roli v konverzi big-ET-1 na ET-1 a zda specifické inhibitory nově identifikovaných metaloproteas mohou inhibovat tuto konverzi. Tyto snahy vyústily v objev nového lidského genu s vysokou homologií k NEP (shoda 54 %) a s poněkud nižší homologií k ECE-1 (shoda 37 %), které jsou dvěma nejlépe charakterizovanými členy skupiny metaloproteasy neprilysinu. Polypeptidický produkt lidského genu byl shledán • · 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 · · · • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 999 9 9 9 9 · 9 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 999 99 9 evidentně exprimovaným v řadě lidských tkání a pracovně byl označen názvem „IGS5“ (viz současně předložená patentová přihláška PCT/EP 00/11532).

Proto se tento vynález obecně zabývá použitím látek, vykazujících kombinovanou, s výhodou souběžnou, inhibiční aktivitu

a) k neutrální endopeptidase a

b) k metaloprotease IGS5, která je polypeptidem nesoucím sekvenci aminokyselin, která je ve shodě alespoň v 70% s určitou sekvencí aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO:2,

SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6;

nebo inhibiční aktivitu jejich farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru za účelem výroby léčiva (farmaceutické směsi) pro léčení savců, zejména lidí, kteří trpí nebojsou ovlivněni onemocněním či podmínkami, které mohou být zmírněny nebo preventovány kombinovanou, s výhodou souběžnou, inhibici NEP a IGS 5.

S výhodou se tento vynález týká použití látky s kombinovanou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5, nebo její farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru za účelem výroby léčiva (farmaceutické směsi) pro léčení savců, zejména lidí, kteří trpí nebo jsou ovlivněni onemocněním či podmínkami, při nichž hladina big-ET-1 je zvýšena a kteréžto onemocnění (podmínka) může být zmírněno nebo preventováno kombinovanou, s výhodou souběžnou, inhibici NEP a IGS5.

S další výhodou se tento vynález týká použití látky s kombinovanou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5, nebo její farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru za účelem výroby léčiva (farmaceutické směsi) pro léčení savců, zejména lidí, kteří trpí nebojsou ovlivněni onemocněním či podmínkami, při nichž hladina je hladina ET-1 vyšší a kteréžto onemocnění (podmínka) může být zmírněno nebo preventováno kombinovanou, s výhodou souběžnou, inhibici NEP a IGS5.

• · · · · · 0 0 0 0 « • 0 000 * 0 0 0 0 ·« ·«··

0· 0000 00* •0 00 ·0 000 00 0

S další výhodou se tento vynález týká použití těchto látek s kombinovanou či souběžnou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5, nebo jejich farmaceuticky použitelných solí nebo solvátu nebo biolabilního esteru, za účelem výroby léčiva (farmaceutické směsi), s výhodou použitelného pro léčení a/nebo profylaxi hypertenze, včetně sekundárních forem hypertenze, jako je ledvinová nebo plicní hypertanze, srdečního selhání, angíny pectoris, arytmie, infarktu myokardu, srdeční hypertrofíe, mozkové ischemie, periferálního cévního onemocnění, atherosklerózy a bolesti v souvislosti s kolorektální rakovinou nebo rakovinou prostaty u vyšších savců, zejména lidí.

Dále může být výhodné dodatečně kombinovat tyto látky vykazující kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitu k NEP/IGS5 s dalšími individuálními a/nebo kombinovanými inhibitory metaloproteas než s inhibitory NEP/IGS5, např. s oddělenými inhibitory ACE a/nebo ECE a/nebo NEP a/nebo směsmi inhibitorů těchto .metaloproteas.

Definice

Pojmy použité v této přihlášce, pokud zde nejsou výslovně definovány, znamenají to, co se jimi rozumí v oboru tohoto vynálezu. V dalším je uvedeno několik definic k usnadnění porozumění některým termínům, které jsou zde často použity.

„IGS5“ se mezi jiným vztahuje k pólypeptidů obsahujícímu sekvenci aminokyselin již určenou v sekvencích SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6 nebo v jejich variantách. Tím je dáno, že „IGS5“ zahrnuje zejména IGS5PROT, IGS5PR0T1 a IGS5PROT2.

„Enzymová aktivita“ nebo „biologická aktivita“ se vztahuje k metabolické nebo fyziologické funkci IGS5 včetně podobných aktivit nebo zlepšených aktivit nebo aktivit se snížením nežádoucích vedlejších účinků.

« · „Gen IGS5“ se vztahuje k polynukleotidu, obsahujícímu sekvenci nukleotidů již určenou v sekvencích SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:5 nebo v jejich variantách, např. jejich alelických variantách a/nebo jejich doplňcích.

„Shoda“ jako míra shody používaná v tomto oboru, je vztah mezi dvěma nebo více sekvencemi polypeptidů nebo dvěma nebo více sekvencemi polynukleotidů, jak se určuje porovnáním sekvencí. V tomto oboru „shoda“ také znamená stupeň shodnosti sekvence mezi sekvencemi polypeptidů nebo polynukleotidů podle okolností, na základě shody mezi sériemi takových sekvencí, např. obecně na základě polohy sekvencí tak, aby se dosáhlo nejlepší možné shody. Proto „shoda“ a obdobné slovo „podobnost“ má v tomto oboru svůj význam, který může být přímo vypočten známými metodami, včetně, ale bez jakéhokoli omezení, metodami popsanými v „Computational Molecular Biology“, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1988; „Biocomputing: Informatics and Genome Projects“,

Smith, D.W., Ed., Academie Press, New York, 1993; „Computer Analysis of Sequence Data“, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., Eds., Humana Press, New Jersey, 1994; „Sequence Analysis in Molecular Biology“, von Heinje, G., Academie Press, 1987; „Sequence Analysis Primer“, Gribskov, M. a Devereux, J., Eds., M Stockton Press, New York, 1991; a Carillo, H. a Lipman, D„ SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Přední metody pro určení shody jsou popsány tak, aby dávaly nejvyšší možnou shodu mezi testovanými sekvencemi. Metody pro určení shody a podobnosti jsou kódovány v počítačových programech, dostupných veřejně. Preferované počítačové programové metody pro určení shody a podobnosti mezi dvěma zahrnutými sekvencemi, avšak bez jakéhokoli omezení, jsou programový balíček GCG (Devereux, J. a spol., Nucleic Acid Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTIN a FASTA (Atschul, S.F. a spol., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990). Program BLAST Xje veřejně přístupný z NCBI a z dalších zdrojů (BLAST Manual, Altschul, S. a spol., NCBI NML NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. a spol., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990).

0

0

0«

Dobře známý algoritmus Smithe a Watermana se rovněž může použít k určení shody. Veřejně přístupný program, použitelný pro určení shody nebo podobnosti sekvencí polypeptidů nebo sekvencí polynukleotidů, je znám jako program „gap“ od Genetic Computer Group, Madison WI, který je obvykle spuštěn s danými parametry pro srovnání (spolu s nulovým postižením při ukončení gapů). Preferované (tj. dané) parametry pro srovnání sekvencí polypeptidů zahrnují následující: Algoritmus popsaný Needlemanem a Wunschem, J. Mol. Biol. 48: 443453 (1970); Comparison Matrix BLOSSUM62 od Hentikoffa a Hentikoffa, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992); Gap Penalty 12; Gap Length Penalty: 14. Preferované (tj. dané) parametry pro srovnání sekvencí polynukleotidů zahrnují následující: Algoritmus popsaný Needlemanem a Wunschem, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); Comparison Matrix: shoda = +10, neshoda = 0; pokuta za přerušení: 50; pokuta za délku přerušení: 3. Slovo .homologie“ může nahrazovat slovo „shoda“.

Pro znázornění, o polynukleotidů, který má sekvenci nukleotidů alespoň například ve „shodě“ 95% k referenční sekvenci nukleotidů, například k referenční sekvenci nukleotidů vybraných ze skupin SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:5, se předpokládá, že sekvence nukleotidů v takovém polynukleotidů je shodná se sekvencí referenční s tou výjimkou, že sekvence polynukleotidů může obsahovat až pět mutací na každých 100 nukleotidů takové referenční sekvence nukleotidů. Jinými slovy, k získání polynukleotidů, který má sekvenci nukleotidů ve shodě nejméně 95% s referenční sekvencí nukleotidu, může být do 5% nukleotidů z referenční sekvence odstraněno nebo nahrazeno jiným nukleotidem nebo řada nukleotidů až do 5% celkových nukleotidů v referenční sekvenci může být vložena do referenční sekvence nebo řada nukleotidů až do 5% celkových nukleotidů v referenční sekvenci může být kombinovaně odstraněna, vložena a nahrazena. Takové mutace referenční sekvence se mohou objevit v terminálním poloze 5’ nebo 3’ referenční sekvence nukleotidů nebo kdekoli mezi těmito terminálními polohami, promíchané buď individuálně mezi φ · * · · · · · ·· ··· • · · · · · · ···· • · ··· · · · · · · · ···· ίο · · ···· ··· ·· 99 99 999 99 · nukleotidy v referenční sekvenci nebo v jedné či více skupinách sousedících uvnitř referenční sekvence.

Podobně, o polypeptidu, který má sekvenci aminokyselin nejméně například ve „shodě“ 95% s referenční sekvencí aminokyselin, například s referenční sekvencí aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6, se předpokládá, že má sekvenci aminokyselin v polypeptidu shodnou s referenční sekvencí s tou výjimkou, že sekvence polypeptidu může obsahovat až do pěti změn aminokyselin na každých 100 aminokyselin referenčních aminokyselin. Jinými slovy, abychom získali polypeptid, který má sekvenci aminokyselin nejméně z 95% shodnou s referenční sekvencí aminokyselin, až 5% aminokyselinových zbytků v referenční sekvenci musí být odstraněno nebo nahrazeno jinou aminokyselinou nebo řada aminokyselin až do 5% celkového počtu aminokyselinových zbytků v referenční sekvenci musí být vložena do referenční sekvence. Tyto změny referenční sekvence se mohou objevit na amino- nebo karboxy-terminálních pozicích, promíchané buď jednotlivě mezi zbytky v referenční sekvenci nebo v jedné či více sousedících skupinách uvnitř referenční sekvence.

„Homolog“ je generický termín používaný v tomto oboru k popisu sekvence polynukleotidu nebo polypeptidu, která má vysoký stupeň příbuznosti sekvence. Taková příbuznost může být kvantifikována určením stupně shody a/nebo podobnosti mezi sekvencemi k porovnání, jak je zde popsáno. Pod tento generický termín spadají i termíny jako „ortholog“, který znamená polynukleotid nebo polypeptid v jiném druhu a „paralog“, který znamená funkčně podobnou sekvenci vyskytující se v tom samém druhu. Proto, například u lidí, uvnitř skupiny enzymů ECE-1, přeměňujících endothelin, je paralog z jiné skupiny, např. skupiny ECE-2.

99 99 9 99 9 • 999 9 9 ·9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 999 9 · 9 9999 9999

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 99 9 9 9

Farmakologické vyhodnocení specifických inhibitorů nově identifikovaných metaloproteas IGS5 vůči této metaloprotease.

Vzhledem k pochybnostem v dané oblasti (Barker S. a spol., Mol. Pharmacol., 2001, 59: 163-169), pokud jde o to, že ECE-1 by měl být jediným fyziologicky vhodným enzymem přeměňujícím endothelin a tedy že tedy další enzymy musejí být zahrnuty do produkce ET-1, byl podle tohoto vynálezu proveden projekt homologického klonování za účelem zjištění, zda dosud neznámé metaloproteasy mohou hrát roli v konverzi big-ET-1 na ET-1 a zda specifické inhibitory nově identifikovaných metaloproteas mohou inhibovat tuto konverzi. Za předpokladu, že enzymy s podobnou aktivitou by měly vykazovat podobnost v sekvenci aminokyselin, byl lidský genom zkoumán z hlediska těch sekvencí DNA, kde je kódování proteinů s homologií k NEP a ECE, dvěma nejlépe charaktrizovaným členům skupiny metaloproteasy neprilysinu. Tyto snahy vyústily v objev nového lidského genu s vysokou homologií k NEP (shoda 54 %) a s poněkud nižší homologií k ECE-1 (shoda 37 %). Polypeptidický produkt tohoto genu byl shledán evidentně exprimovaným v řadě lidských tkání a pracovně byl označen názvem „IGS5“. Klonování, exprese a základní biologická charaktrizace IGS5 je popsána v podrobnostech v současně předložené mezinárodní patentové přihlášce PCT/EP 00/11532, jejíž celý obsah je částečně vložen odkazem za účelem další ilustrace podrobností o IGS5 uvedených níže.

Za účelem charakterizace a vyhodnocení farmakologických enzymatických vlastností IGS5 pro tento vynález, byl lidský protein IGS5 generován za použití hmyzí buněčné kultury jako expresního systému a byla testována řada potenciálních substrátů proteinu IGS5. Bylo potvrzeno, že IGS5 účinně štěpí big-ET-1, bradykinin a látku P, čímž se dálo potvrdilo, že tento nový protein je skutečnou metaloproteasou se širokou substrátovou specifitou, kterážto je obecnou vlastností metaloproteas a kterážto vlastnost byla potvrzena u NEP, ECE-1 a také u ACE. Mělo by též být uvedeno, že podle zjištění v tomto vynálezu, vyúsťuje překvapivě • 9

9999 <··· 000

0 9 9 00 0 9990

9 999 099 9900 9900 •9 0900 999

99 09 009 90 9 proteolýza big-ET-1 pomocí IGS5 ve správné získání ET-1, tj. big-ET-1 je správně štěpen mezi aminokyselinami Trp21 a Val22.

Dále byla podle tohoto vynálezu poprvé zkoumána síla látek inhibujících metaloproteasu z hlediska potlačení konverze big-ET-1 na ET-1, za použití fluorescenčně označeného analogu big-ET-1. Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 9 v oddílu příkladů. Je zajímavé, že fosforamidon, o němž je známo, že inhibuje konverzi big-ET-1 na ET-1 in vivo, inhibuje také IGS5 s velkou silou v biochemickém testu, použitém v tomto vynálezu a překvapivě je tato inhibice IGS5 fosforamidonem skutečně výrazně vyšší než inhibice ECE-1. Na rozdíl od toho, selektivní inhibitor NEP, thiorfan, stejně jako selektivní inhibitor ECE-1,

SM-19712 (sodná sůl 4-chlor-N-[[(4-kyan-3-methyl-l-fenyl-lH-pyrazol-5-yl)amino]karbonyljbenzensulfonamidu; Umekawa K, Haswgawa H, Tsutsumi Y, Sáto K, Matsumura

Y, Ohashi N, J Pharmacol 2000 Sep;84(l):7-15; Discovery Research Laboratories 1, Research Center, Sumitomo Pharmaceuticals Co, Ltd, Osaka, Japonsko), neovlivňují účinnost IGS5 (Tabulka 9, oddíl příkladů).

Se zvláštní výhodou se tento vynález týká nejdůležitějšího a unikátního zjištění, že mnohé sloučeniny, které se projevují jako inhibitory metaloproteas, jsou schopné inhibovat enzym IGS5 i v nízkých nanomolárních koncentracích, např. v koncentracích odpovídajícím hodnotám IC50 v rozmezí od 1 do 10 nM, čímž bylo dokázáno, že mohou specificky inhibovat nově identifikovanou metaloproteasu IGS5, kteréžto zjištění má zvláštní farmaceutický význam.

Proto se obecně tento vynález týká použití látek s kombinovanou, s výhodou souběžnou, inhibiční aktivitou a) k neutrální endopeptidase (NEP) a

9

9 9

9999

9

9 9 • · ·· ·· • · · · • · · · • · ··· · • · · • · · ·

b) k metaloprotease IGS5, která je polypeptidem nesoucím sekvenci aminokyselin, která je ve shodě alespoň 70% s určitou sekvencí aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO:2, SEQ

ID NO:4 a SEQ ID NO:6;

nebo inhibiční aktivitou jejich farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru za účelem výroby léčiva (farmaceutické směsi) pro léčení savců, zejména lidí, kteří trpí nebojsou ovlivněni onemocněním či podmínkami, které mohou být zmírněny nebo preventovány kombinovanou, s výhodou souběžnou, inhibici NEP a IGS5.

Se zvláštní výhodou se tento vynález týká použití látky s kombinovanou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5, nebo její farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru za účelem výroby léčiva (farmaceutické směsi) pro léčení savců, zejména lidí, kteří trpí nebojsou ovlivněni onemocněním či podmínkou, při němž hladina big-ET-1 je zvýšena a kteréžto onemocnění nebo podmínka může být zmírněno nebo preventováno kombinovanou, s výhodou souběžnou, inhibici NEP a IGS5.

S další zvláštní výhodou se tento vynález týká použití látky s kombinovanou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5, nebo její farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru za účelem výroby léčiva (farmaceutické směsi) pro léčení savců, zejména lidí, kteří trpí nebojsou ovlivněni onemocněním či podmínkou, při němž je hladina ET-1 vyšší a kteréžto onemocnění nebo podmínka může být zmírněno nebo preventováno kombinovanou, s výhodou souběžnou, inhibici NEP a IGS5.

„Kombinovaná nebo s výhodou souběžná inhibiční aktivita“ ve smyslu tohoto vynálezu znamená alespoň duální inhibici NEP a IGS5 souběžným pochodem obou enzymatických systémů, NEP a IGS5 a potenciálně další souběžnou inhibici třetího systému, např. trojnásobnou inhibici enzymatických systémů NEP, IGS5 a např. ECE-1. Podle výsledků tohoto vynálezu se může očekávat, že kombinovaná nebo souběžná inhibice obou enzymatických systémů, NEP a IGS5, je mnohem účinnější, než oddělená blokování

99 99 9 9* 9

99 9 · 9 9 9 9 99 ••99 99 9 9999 · · ··· 999 9999 9999

ΊΑ 99 9··· 999

99 99 999 99 9 kteréhokoli skupiny různými látkami nebo pouze blokování každého z uvedených enzymů. Proto tento vynález předkládá nový terapeutický koncept tím, že navrhuje použití kombinovaných, s výhodou souběžných, inhibitorů NEP a IGS5 při léčení a/nebo profylaxi řady určitých onemocnění nebo potíží, které mohou být zmírněny nebo preventovány kombinovanou, s výhodou souběžnou, inhibici NEP a IGS5. V tomto ohledu poskytuje také tento vynález látky, které vykazují kombinovanou nebo souběžnou inhibici jak NEP, tak IGS5 a poskytuje nové a perspektivní použití těchto látek při jejich zvýšené terapeutické hodnotě při léčení a/nebo profylaxi nemocí a potíží, jichž se týkají.

O kombinované, s výhodou souběžné mechanismy účinku, je výjimečný medicinální zájem, protože jsou očekávány jejich terapeutické výhody, které jsou vyšší, než jen při změně každého jednotlivého systému odděleně.

Například s ohledem na inhibitory enzymu přeměňujícího endothelin, byl zveřejněn přehledný článek B.-M. Lóflera (J. Cardiovasc. Pharmacol. (2000), 35(Suppl. 2), S79-S82) za účelem dalšího objasnění stávajícího stavu a perspektiv tohoto principu a doprovodných výhod. Podle Lóflera vedl nedávný výzkum k objevu účinně selektivních nebo směsných inhibitorů enzymů přeměňujících endothelin (ECE), ECE/neutrálních endopeptidas (NEP) a ECE/NEP/enzymů přeměňujících angiotensin. Byl rovněž zveřejněn podstatnější důkaz, že funkce endothelinových (ET), renin-angiotensinových a NEP systémů pro regulaci kardiovaskulární homeostázy, jsou spojeny s komplexním regulačním mechanismem. Proto Lófler vyvozuje, že bude obtížným úkolem budoucího výzkumu prokázat, ve spojitosti s nově dostupnými selektivními a směsnými inhibitory ECE-1, zda kombinovaná inhibice více než jednoho kardiovaskulárního systému je lepší, než selektivní inhibice. V tomto ohledu předkládá tento vynález lepší postup v tom, že poprvé zmiňuje v tomto oboru kombinovanou a souběžně působící inhibici alespoň enzymatických systémů NEP a IGS5.

• · ·· ·· ·· · · · · • · · 9 9 • 999 99 9 · · · • 9 99 ·

• φ • · 9 • 9999

9 9

99 9

S výhodou předkládá tento vynález použití látek nebo jejich farmaceuticky vhodných solí či solvátů nebo biolabilních esterů pro výrobu léčiva (farmaceutické směsi) pro léčení a/nebo profylaxi hypertenze, včetně sekundárních forem hypertenze, jako je renální nebo plicní hypertenze, srdeční selhání, angína pectoris, arytmie, infarkt myokardu, srdeční hypertrofie, mozková ischemie, periferální cévní onemocnění, subarachnoidální krvácení, chronická obstrukční plicní nemoc (COPD), astma, ledvinové onemocnění, atheroskleróza a bolest související s kolorektální rakovinou a rakovinou prostaty, u savců, zejména u lidí. S výhodou jsou v tomto vynálezu použity látky s kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5 pro léčení a/nebo profylaxi výše uvedených chorob a potíží u té části populace pacientů, kteří trpí či jsou náchylní k bolesti v důsledku nemoci či potíží, které mohou být zmírněny nebo preventovány kombinovanou a s výhodou souběžnou inhibici NEP a 1GS5.

Dále může být výhodou dodatečně kombinovat látky vykazující kombinovanou či souběžnou inhibiční aktivitu k NEP/IGS5, podle tohoto vynálezu, s dalšími individuálními a/nebo kombinovanými inhibitory metaloproteas, než s kombinovanými inhibitory NEP/IGS5. Takové další inhibitory metaloproteas, které mohou být použity v kombinaci s látkami s kombinovanou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5, jsou například inhibitory ACE, jako kaptopril, enalapril, lisinopril, fosinopril, perindopril, quinapril, ramipril; dále s inhibitory NEP, jako jsou thiorfan; s duálními inhibitory NEP/ECE, jako jsou látky CGS35066 (De Lombart a spol., J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3):488-504); nebo se směsnými inhibitory těchto metaloproteas, jako jsou omapatrilat nebo sampatrilat. Tímto způsobem kombinace léčení a/nebo profylaxe může být terapeutická hodnota látek s kombinovanou či souběžnou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5 i nadále zvyšována, zvláště s ohledem na nemoci a/nebo potíže výše uvedené. Proto tento vynález také předkládá kombinovanou terapii a/nebo kombinovanou profylaxi, které jsou níže popsány.

• fc ·· fcfc • fcfcfc fcfcfc • · · · fcfc fc · fcfcfc fcfc · • · fcfcfc • fc fc fc · • fcfc • fcfcfcfc • fcfc • · ·

S výhodou bylo podle tohoto vynálezu zjištěno, že látky, které jsou primárně inhibitory neutrální endopeptidasy (inhibitory NEP), jsou též vhodné k inhibici nově identifikovaného enzymu, metaloproteasy IGS5 a jsou farmaceuticky významné i ve výše uvedených nanomolárních koncentracích a tím tyto látky dokazují, že jsou inhibitory metaloproteas s kombinovaným způsobem účinku, tj. např. s kombinovanou či souběžnou selektivní inhibiční aktivitou k NEP/IGS5. Takové látky mohou být vyznačeny vzorcem I.

ve kterém

A je skupina vzorce II nebo III _R1a

R^2aOOC

O /

R^2bO lil přičemž ve vzorci II

R^la je fenyl-nižší-alkyl-skupinou, která může být volitelně substituována na fenylovém jádru nižším alkylem, nižším alkoxylem nebo halogenem nebo je naftyl-nižší-alkyl-skupinou,

R^2a je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester; a přičemž ve vzorci III

R^Ib je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester kyseliny fosforečné,

R^2b je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester kyseliny fosforečné;

0 ·· 0 0 · 0 0 0 • ·· · · 0 0 0 0 0 ·

0 0 0 ·· 0 0 0 0 0

0 000 000 0000 0000

0000 000

00 00 000 00 0 a ve kterém

R³ je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester karboxylové kyseliny; a fyziologicky použitelné soli kyselin nebo solváty látky vzorce I.

Tam, kde substituenty látek vzorce I jsou nebo obsahují nižší alkyly nebo alkoxyskupiny, mohou takové substituenty být rovnými nebo rozvětvenými řetězci, s výhodou o délce 1 až 4, s větší výhodou 1 až 2 uhlíkových atomů a jsou s výhodou methyl nebo methoxy. Tam, kde substituenty obsahují halogen, s výhodou vhodné jsou fluor, chlor nebo brom, s větší výhodou fluor nebo chlor.

V radikálu R^la může nižší alkylenový řetězec obsahovat 1 až 4, s výhodou 1 až 2, uhlíkové atomy. S výhodou může R^la být volitelně substituovanou skupinou fenethylovou, kterážto může být volitelně substituována jedním či více halogeny, nižším alkoxylem nebo nižším alkylem, neboje skupinou naffylethylovou.

Látky vzorce Ia mohou být volitelně esterifíkovanými deriváty dikarboxylových kyselin.

Vhodnými skupinami R , které tvoří biolabilní estery karboxylových kyselin, jsou takové, které mohou být štěpeny za fyziologických podmínek in vivo za uvolnění karboxylové kyseliny. Například vhodnými pro tyto účely jsou nižší alkylové skupiny, fenyl nebo fenyl-nižší-alkyl-skupiny, volitelně mono- či polysubstituované na fenylovém jádru nižším alkylem nebo nižším alkoxylem nebo nižším alkylenovým řetězcem, vázaným ke dvěma sousedním uhlíkovým atomům, dioxolanylmethylskupiny volitelně substituované na dioxolanovém kruhu nižším alkylem nebo C₂- až Cé-alkanoyloxymethylskupinami, volitelně substituovanými na oxomethylskupině nižším alkylem. Jestliže skupina R³, tvořící biolabilní ester, je nebo obsahuje nižší alkyl, může tento alkyl být větvený nebo nevětvený a může obsahovat 1 až 4 uhlíkové atomy. Jestliže skupina, tvořící biolabilní ester, je volitelně

9 9

9 9 • · · · • · · ···· • · · · • 9 9 9

9 99 9 substituovanou fenyl-nižší-alkyl-skupinou, může tato skupina obsahovat alkylenový řetězec, mající 1 až 3, s výhodou 1, uhlíkových atomů a je to s výhodou benzyl. Jestliže fenylový kruh je substituován nižším alkylenovým řetězcem, může tento řetězec obsahovat 3 až 4, s výhodou 3, uhlíkové atomy. Jestliže R³ je volitelně substituovanou alkanoyloxymethylskupinou, může tato skupina být s výhodou větvenou alkanoyloxyskupinou s 2 až 6, s výhodou se 3 až 5, uhlíkovými atomy a může být například pivaloyloxymethylovým radikálem (= terc-butylkarbonyloxymethylovým radikálem).

Vhodnými skupinami R^2a, tvořícími biolabilní estery karboxylových kyselin, jsou takové, které mohou být štěpeny za fyziologických podmínek in vivo za uvolnění karboxylových kyselin a odpovídají skupinám doloženým jako skupiny R³ výše.

Skupiny R^lb a R^2b, vhodné jako skupiny tvořící biolabilní estery kyseliny fosforečné, jsou takové, které mohou být odstraněny za fyziologických podmínek in vivo za uvolnění příslušného derivátu kyseliny fosforečné. Například, skupiny, které jsou vhodné pro tento účel, jsou nižší alkylskupiny, C₂- až Cé-alkanoyloxymethylskupiny volitelně substituované na oxymethylskupině nižším alkylem, nebo fenyl nebo fenyl-nižší-alkyl-skupiny, jejichž fenylový kruh je volitelně mono- nebo polysubstituovaný nižším alkylem, nižším alkoxylem nebo nižším alkylenovým řetězcem, vázaným ke dvěma sousedním uhlíkovým atomům.

Jestliže skupina R^lb a/nebo R^2b, tvořící biolabilní ester, je nebo obsahuje nižší alkyl, může tento alkyl být větvený nebo nevětvený a může obsahovat 1 až 4 uhlíkové atomy. Jestliže R^lb a/nebo R^2b jsou volitelně substituovanou alkanoyloxymethylskupinou, může tato skupina obsahovat s výhodou větvenou alkanoyloxyskupinu, která má 2 až 6, s výhodou 3 až 5, uhlíkových atomů a může, například, být pivaloyloxymethylovým radikálem (= tercbutylkarbonyloxymethylovým radikálem). Jestliže R^lb a/nebo R^2b jsou volitelně substituovanou fenyl-nižší-alkyl-skupinou, může tato skupina obsahovat alkylenový řetězec, mající 1 až 3, s výhodou 1, uhlíkové atomy. Jestliže je fenylový kruh substituován nižším · ·· ·· 9 999 • 99 9 9 999 9 · 9

9999 99 9 9999

999999 9 9 99 9999 ·· · · · · 9·· • 9 99 99 999 99 9 alkylenovým řetězcem, může tento řetězec obsahovat 3 až 4, s výhodou 3, uhlíkové atomy a substituovaný fenylový kruh je s výhodou indanyl.

Vhodné fyziologicky použitelné soli kyselin vzorce I zahrnují jejich soli alkalických kovů, soli kovů alkalických zemin nebo amonné soli, například soli sodíku, draslíku nebo vápníku nebo soli s fyziologicky použitelnými, farmakoíogicky neutrálními organickými aminy, jako například diethylaminem nebo terc-butylaminem, nebo s fenyl-nižšímialkylaminy, jako a-methylbenzylaminem.

Látky vzorce I obsahují alespoň jeden chirální uhlíkový atom, zejména ten uhlíkový atom, který nese postranní řetězec amidu v poloze 3 benzazepinové struktury. Látky mohou tak být přítomné ve dvou opticky stereoisomerních formách nebo jako racemát. Tento vynález zahrnuje jak racemické směsi, tak isomerně čisté látky vzorce I. Jestliže v látkách vzorce I je skupina A znázorněna vzorcem II, pak látky vzorce I obsahují dva chirální uhlíkové atomy, zejména uhlíkový atom v poloze 3 benzazepinu a nese postranní řetězec amidu, a uhlíkový atom postranního řetězce amidu, který nese radikál R^la. Ty látky vzorce I, ve kterých je skupina A znázorněna vzorcem II, mohou proto existovat v několika opticky aktivních stereoisomerních formách nebo jako racemáty. Podle tohoto vynálezu se mohou použít jak racemické směsi, tak isomerně čisté látky. Jestliže v látkách vzorce I je skupina A znázorněna vzorcem III a R a R nejsou vodík a mají v každém případě rozdílnou strukturu, pak atom fosforu skupiny fosforečné kyseliny může též být chirální. Vynález se také týká isomerních směsí a isomerně čistých látek vzorce I, ve kterých skupina A je znázorněna vzorcem III, kteréžto vznikají jako důsledek chirálních atomů fosforu.

Podle tohoto vynálezu, látky vzorce I, jejich soli a biolabilní estery mohou být získány způsobem známým per se v tomto oboru (viz níže).

0 0 0 ·· · ··· • 0 · 0 · · 0 · · 0 ·

0 0 0 0 0 · 0 0 0 0

0 000 0 0 0 0 0 0 0 0000

0000 000

00 0 0 000 00 0

V rámci tohoto vynálezu byly s výhodou objeveny látky primárně inhibiční k NEP, jako jsou deriváty benzazepinon-N-octové kyseliny se strukturou podle vzorce Ia nebo jako jsou fosfono-substituované deriváty benzazepinonu se strukturou podle vzorce Ib.

Látky se strukturou podle vzorce Ia jsou již známé jako látky inhibující NEP na základě patentu US 5,677,297, podle nějž výše uvedené látky jsou používány pro léčení chorob nebo potíží, na které je odkazováno výše. Látky podle vzorce Ia mají následující strukturu

ve které

R^la je fenyl-nižší-alkyl-skupinou, která může být volitelně substituována na fenylovém jádru nižším alkylem, nižším alkoxylem nebo halogenem nebo je naftyl-nižší-alkyl-skupinou,

R^2a je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester a

R³ je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester, a fyziologicky použitelné soli kyselin podle vzorce I.

Tam, kde substituenty v látce vzorce Ia jsou nebo obsahují nižší alkylskupiny nebo alkoxyskupiny, mohou tyto skupiny být rovnými nebo větvenými řetězci a mohou obsahovat s výhodou 1 až 4, s větší výhodou 1 až 2, uhlíkové atomy ajsou s výhodou methyl nebo methoxy. Tam, kde substituenty obsahují halogen, s výhodou vhodné jsou fluor, chlor nebo brom, s větší výhodou fluor nebo chlor.

V radikálu R^la může nižší alkylenový řetězec obsahovat 1 až 4, s výhodou 1 až 2 uhlíkové atomy. S výhodou může R^la být volitelně substituovanou skupinou fenethylovou, • · • 0 0 0 · 0 · 0 · · · ···· · · · 0000

0 000 0 0 0 0 0 0 0 0000 πα 00 e a# e 000

X-J ·« ·· ·· 000 00 0 kterážto může být volitelně substituována jedním či více halogeny, nižším alkoxylem nebo nižším alkylem, nebo je skupinou naftylethylovou.

Látky vzorce la jsou volitelně esterifikované deriváty dikarboxylových kyselin.

V závislosti na způsobu aplikace, biolabilní monoestery, s výhodou látky, u nichž R^2a je skupinou tvořící biolabilní ester a R³ je vodík, nebo dikarboxylové kyseliny, jsou výhodné, přičemž dikarboxylové kyseliny jsou s výhodou vhodné pro aplikaci nitrožilní.

Vhodnými skupinami R^2a a R³, v látkách vzorce la, tvořících biolabilní estery, jsou nižší alkylskupiny, fenyl nebo fenyl-nižší-alkyl-skupiny, které mohou být volitelně substituované na fenylovém kruhu nižším alkylem nebo nižším alkylenovým řetězcem, vázaným ke dvěma sousedním uhlíkovým atomům, dioxolanylmethylskupiny, které jsou volitelně substituované na dioxolanovém kruhu nižším alkylem, nebo C2- až C(,alkanoyloxymethylskupiny volitelně substituované na oxymethylskupině nižším alkylem.

Tam, kde skupiny R^2a nebo R³, tvořící biolabilní ester, jsou nižším alkylem, může tento alkyl být s výhodou nevětvenou alkylskupinou s 1 až 4, s větší výhodou se 2, uhlíkovými atomy.

Tam, kde je skupina, tvořící biolabilní ester, volitelně substituovanou fenyl-nižší-alkylskupinou, její alkylenový řetězec může obsahovat 1 až 3, s výhodou 1, uhlíkové atomy. Tam, kde je fenylový kruh substituován nižším alkylenovým řetězcem, může tento řetězec obsahovat 3 až 4, s výhodou 3, uhlíkové atomy. Fenyl, benzyl nebo indanyl jsou s výhodou vhodné jako substituenty R^2a a/nebo R³, obsahující fenyl. Tam, kde R^2a a/nebo R³ jsou volitelně substituovanou alkanoyloxymethylskupinou, jejich alkanoyloxyskupina může obsahovat 2 až 6, s výhodou 3 až 5, uhlíkových atomů a je s výhodou větvena a může být, například, pivaloyloxymethylovým radikálem (= terc-butylkarbonyl-oxymethylovým radikálem).

Vhodné fyziologicky akceptovatelné soli dikarboxylových kyselin nebo monoesterů vzorce I, zahrnují jejich soli s alkalickými kovy, soli s kovy alkalických zemin nebo amonné • · · • ·· · · soli, například solí sodíku nebo vápníku nebo soli s fyziologicky vhodnými, farmaceuticky neutrálními organickými aminy, jako například diethylaminem nebo terc-butylaminem.

Látky vzorce Ia obsahují dva chirální uhlíkové atomy, zejména uhlíkový atom, který je v poloze 3 benzazepinu a nese amidový postranní řetězec a uhlíkový atom amidového postranního řetězce, který nese radikál R^la Tyto látky mohou proto existovat v několika opticky aktivních stereoisomerních formách nebo jako racemát. Podle tohoto vynálezu mohou být použity jak racemické směsi, tak isomerně čisté látky vzorce Ia.

Podle tohoto vynálezu, látky vzorce Ia a jejich soli a biolabilní estery mohou být připraveny způsobem známým per se v tomto oboru, např. tak, jak je popsáno v patentu US

5,677,297.

Preferované látky vzorce Ia, jsou např. ty, v nichž R² a/nebo R³ jsou skupiny tvořící biolabilní ester a jejich fyziologicky vhodné soli. Skupiny, tvořící biolabilní ester, mohou být nižší alkylskupiny, nebo fenyl nebo fenyl-nižší-alkyl-skupina, s výhodou fenyl, benzyl nebo indanyl, které jsou volitelně substituované na fenylovém kruhu nižším alkylem nebo nižším alkylenovým řetězcem vázaným ke dvěma sousedním uhlíkovým atomům, nebo dioxolanylmethylskupina, s výhodou (2,2-dimethyl-l,3-dioxolan-4-yl)methyl, který je volitelně substituován na dioxolanovém kruhu nižším alkylem, nebo C2- až C6alkanoyloxymethylskupina volitelně substituovaná na oxymethylskupině nižším alkylem.

S výhodou jsou preferovány látky vzorce Ia, které jsou vyznačené tím, že R² je skupina tvořící biolabilní ester a R³ je vodík.

S výhodou preferovanými příklady látek vzorce Ia jsou, např.: (3S,2’R)-3-{l-[2’-karboxy-4’-fenylbutyl]cyklopentan-l-karbonylamino}-2,3,4,5-tetrahydro2-oxo- lH-l-benzazepin-1 -octová kyselina, (látka Ia-1);

(3S,2’R)-3-{ l-[2’-(ethoxykarbonyl)-4’-fenylbutyl]cyklopentan-l-karbonylamino}-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-lH-l-benzazepin-l-octová kyselina, (látka Ia-2);

Φ Φ · φ φ φ φ φ φ · φφ · ··· (3 S,2’R)-3-{l-[2’-(ethoxykarbonyl)-4’-naftylbutyl]cyklopentan-1-karbonylamino )-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-lΗ-1-benzazepin-l-octová kyselina, (látka Ia-3); a jejich fyziologicky vhodné soli kyselin nebo solváty.

Další výhodné příklady látek vzorce la jsou např. :

3-{ l-[2’-(ethoxykarbonyl)-4’fenylbutyl]cyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2οχο-ΙΗ-1-benzazepin-l-acetát-terc-butylester, (látka Ia-4);

3-{ l-[2’-(ethoxykarbonyl)-4’fenylbutyl]cyklopentan-1-karbonylamino )-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-1H-1-benzazepin-l-octová kyselina, (látka Ia-5);

(3 S,2’R)-3-{ l-[2’-(ethoxykarbonyl)-4’-fenylbutyl]cyklopentan- 1-karbonylamino )-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-1 Η-1 -benzazepin-1 -acetát-terc-butylester, (látka Ia-6);

(3 S,2’R)-3 -[ 1 -(2’-karboxy-4 ’-feny lbutyljcyklopentan-1 -karbonylamino]-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-1H-1-benzazepin-1-octová kyselina, (látka Ia-7);

- {1 -[2 ’ -(terc-butoxykarbonyl)-4 ’ fenylbutyl] cyklopentan-1 -karbonylamino )-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-1 Η-1 -benzazepin-1 -acetát-terc-butylester, (látka la-8);

-[ 1 -(2 ’ -karboxy-4 ’ fenylbutyl)cyklopentan-1 -karbonylamino]-2,3,4,5 -tetrahydro-2-oxo-1 Η-1 benzazepin-1-octová kyselina, (látka Ia-9);

- {1 -[2 ’ -(terc-butoxykarbonyl)-4 ’ fenylbutyl] cyklopentan-1 -karbonylamino )-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-1 Η-1 -benzazepin-1 -acetát-benzylester, (látka la-10);

3-[ 1-(2 ’-karboxy-4 ’ fenylbutyl)cyklopentan-1-karbonylamino]-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-1 Η-1 benzazepin-1-acetát-benzylester, (látka Ia-11);

- {1 - [2 ’ -(terc-butylkarbonyloxymethoxykarbonyl)-4 ’ fenylbutyl] cyklopentan-1 karbonylamino} -2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-1 Η-1 -benzazepin-1 -acetát-benzylester, (látka Ia12);

3-{ l-[2’-(pivaloyloxymethoxykarbonyl)-4’fenylbutyl]cyklopentan-1-karbonylamino )-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-lH-1-benzazepin-l-octová kyselina, (látka Ia-13);

·· · • · φ · · φ φ · φ · · • φ φφφ φφφ φφφφ φφφ

Οζζ φφ φ φ φ · φφφ

Z.Q · · φφ φφ φφφ φφ φ a jejích fyziologicky vhodné soli kyselin nebo solváty.

Látky se strukturou podle vzorce Ib jsou již známé jako látky inhibující NEP a dále jako slabé inhibitory enzymu přeměňujícího endothelin (inhibitory ECE) na základě patentu US 5,952,327 a jsou použitelné pro léčení onemocnění nebo potíží zmíněných výše. Proto se tento vynález také týká látek vzorce Ib,

ve kterém

R^lb je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester kyseliny fosforečné,

R²¹’je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester kyseliny fosforečné a

R³ je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester karboxylové kyseliny a fyziologicky použitelné soli kyselin odvozených od vzorce Ib.

Látky vzorce Ib jsou deriváty kyselin včetně karboxylových kyselin a skupin odvozených od kyseliny fosforečné, které jsou volitelně esterifikovány skupinami tvořícími biolabilní estery. Biolabilní estery vzorce Ib jsou prekursory léčiv odvozených od volných kyselin. V závislosti na formě aplikace, jsou preferovány biolabilní estery nebo kyseliny, přičemž kyseliny jsou s výhodou vhodné pro nitrožilní aplikaci.

Skupiny R^lb a R^2b vhodné jako skupiny, tvořící biolabilní estery kyseliny fosforečné, jsou ty, které mohou být odstraněny za fyziologických podmínek in vivo za uvolnění příslušných funkčních skupin kyseliny fosforečné. Například, skupiny, které jsou vhodné pro tento účel, jsou nižší alkylskupiny, C2- až Cg-alkanoyloxymethylskupiny volitelně • ·

9 9 9 999 9 9 9 • 9 · · · 9 9999

999 999 9999 9999

9999 999

99 999 99 9 substituované na oxymethylskupině nižším alkylem, nebo fenyl nebo fenyl-nižšíalkylskupiny, jejichž fenylový kruh je volitelně mono- nebo polysubstituován nižším alkylem, nižší alkoxyskupinou nebo nižším alkylenovým řetězcem, vázaným ke dvěma sousedním uhlíkovým atomům. Jestliže skupina R^lb a/nebo R^2b, tvořící biolabilní ester, je nebo obsahuje nižší alkyl, může tento alkyl být větvený nebo nevětvený a může obsahovat 1 až 4 uhlíkové atomy. Jestliže R^lb a/nebo R^2b jsou volitelně substituovanou alkanoyloxymethylskupinou, může tato skupina obsahovat s výhodou větvenou alkanoyloxyskupinu s 2 až 6, s větší výhodou 3 až 5, uhlíkovými atomy a může například být pivaloyloxymethylovým radikálem (= terc-butylkarbonyloxymethylovým radikálem). Jestliže R^lb a/nebo R^2b jsou volitelně substituovanou fenyl-nižší-alkylskupinou, může tato skupina obsahovat alkylenový řetězec s 1 až 3, s výhodou s 1, uhlíkovými atomy. Jestliže je fenylový kruh substituován nižším alkylenovým řetězcem, může tento obsahovat 3 až 4, s výhodou 3, uhlíkové atomy a tento substituovaný fenylový kruh je s výhodou indanyl.

Vhodné skupiny R³ pro látky vzorce lb, tvořící biolabilní estery karboxylových kyselin, jsou takové, které mohou být štěpeny za fyziologických podmínek in vivo za uvolnění karboxylové kyseliny. Například, skupiny, které jsou vhodné pro tento účel, jsou nižší alkylskupiny, fenyl nebo fenyl-nižší-alkylskupiny, jejichž fenylový kruh je volitelně mono- nebo polysubstituován nižším alkylem nebo nižší alkoxyskupinou nebo nižším alkylenovým řetězcem, vázaným ke dvěma sousedním uhlíkovým atomům, dioxolanylmethylskupiny, volitelně substituované na dioxolanovém kruhu nižším alkylem nebo C₂- až C6-alkanoyloxymethylskupiny, volitelně substituované na oxymethylskupině nižším alkylem. Jestliže skupina R³, tvořící biolabilní ester, je nebo obsahuje nižší alkyl, může tento alkyl být větvený nebo nevětvený a může obsahovat 1 až 4 uhlíkové atomy. Jestliže skupina, tvořící biolabilní ester, je volitelně substituovanou fenyl-nižší-alkyl-skupinou, může tato skupina obsahovat alkylenový řetězec s 1 až 3, s výhodou s 1, uhlíkovými atomy a je • · ·· ·

I ♦ ··· s výhodou benzylem. Jestliže je fenylový kruh substituován nižším alkylenovým řetězcem, může tento řetězec obsahovat 3 až 4, s výhodou 3, uhlíkové atomy. Jestliže R³ je volitelně substituovanou alkanoyloxymethylskupinou, může tato skupina obsahovat s výhodou větvenou alkanoyloxyskupinu s 2 až 6, s výhodou s 3 až 5, uhlíkovými atomy a může být například pivaloyloxymethylovým radikálem.

Podle tohoto vynálezu mohou látky vzorce Ib a jejich soli a biolabilní estery být získány způsobem známým per se v tomto oboru.

Vhodné fyziologicky použitelné soli kyselin vzorce Ib jsou v každém případě jejich soli s alkalickými kovy, s kovy alkalických zemin nebo amonné soli, například jejich soli sodné, draselné nebo vápenaté, nebo soli vhodné fyziologicky, farmaceuticky neutrální organické aminy, jako například diethylamin, terc-butylamin nebo fenyl-nižší-alkylaminy, jako a-methylbenzy!amin.

Látky vzorce Ib obsahují chirální uhlíkový atom, zejména uhlíkový atom nesoucí amidový postranní řetězec v poloze 3 benzazepinové struktury. Látky tak mohou být přítomné ve dvou opticky aktivních stereoisomerních formách a nebo jako racemát. Tento vynález zahrnuje jak racemické směsi, tak isomerně čisté látky vzorce I. Jestliže R^lb a R^2b v látce vzorce Ib nejsou vodík a mají v každém případě odlišný význam, může atom fosforu ze skupiny kyseliny fosforečné být také chirální. Vynález se také týká isomerních směsí a isomerně čistých látek vzorce I, které se tvoří jako důsledek chirálních atomů fosforu.

Preferovanou látkou vzorce Ib je taková, v níž R³ je vodík nebo nižší alkyl, např. Ciaž C4-alkyl, s výhodou Ci- až C2-alkyl a fyziologicky vhodné soli kyselin odvozených ze vzorce Ib.

Zvláštní příklady látek vzorce Ib jsou, např.:

Benzyl-(35)-3-(l-dibenzylfosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo- lH-l-benzazepin-1 -acetát, (= látka Ib-1);

0 0

000 ·· ·· • 0 0 0 • · 000

0 0

0*0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 (3 5)-3 -(1 -dibenzylfosfonomethylcyklopentan-1 -karbonylamino)-2,3,4,5 -tetrahydro-2-oxo-1H1- benzazepin-l-octová kyselina, (= látka Ib-2);

Benzyl-(35)-3-(l-benzylethylfosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-lH-l-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-3);

Ethyl-(35)-3-(l-benzylethylfosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro2- oxo-lH-l-benzazepin-1-acetát, (= látka Ib-4);

Ethyl-(35)-3-(l-ethylfosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxoΙΗ-1-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-5);

Ethyl-(35)-3-[l-(pivaloyloxymethylethylfosfonomethyl)cyklopentan-l-karbonylamino]2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-lH-l-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-6); Ethyl-(35)-3-[l-(5-indaylethylfosfonomethyl)cyklopentan-l-karbonylamino]-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-ΙΗ-1-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-7);

terc-Butyl-(35’)-3 -(1 -benzyl ethylfosfonomethylcyklopentan-1 -karbonylamino)-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-lH-l-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-8);

Benzyl-(3 5)-3 -(1 -ethylfosfonomethylcyklopentan-1 -karbonylamino)-2,3,4,5 -tetrahydro-2oxo-ΙΗ-1-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-9);

Benzyl-(35)-3-(l-diethylfosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-ΙΗ-1-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-10);

(3 5)-3 -(1 -Diethylfosfonomethylcyklopentan-1 -karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-1H1-benzazepin-l-octová kyselina, (= látka Ib-11);

Ethyl-(35)-3-(l-diethylfosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-lH-l-benzazepin-1 -acetát, (= látka Ib-12);

Ethyl-(35^r)-3-(l-fosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-lH-lbenzazepin-1-acetát, (= látka Ib-13);

9* 9

9 9

9999

9

9 9 9 9

9 9 9 9

9 999 9 9

Benzyl-(3 5)-3 -(1 -fosfonomethylcyklopentan-1 -karbonylamino)-2,3,4,5 -tetrahydro-2 -oxo-1H1-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-14);

Benzyl-(3ó)-3-(l-diisopropylfosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-lH-l-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-15);

Benzyl-(3ó)-3-(l-benzylisopropylfosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5tetrahydro-2-oxo-lH-l-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-16);

terc-Butyl-(35)-3-(l-ethylfosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2oxo-lH-l-benzazepin-1-acetát, (= látka Ib-17);

terc-Butyl-(3ó’)-3-[l-(pivaIoyloxymethylethylfosfonomethyl)cyklopentan-l -karbonylamino] 2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-lH-l-benzazepin-l-acetát, (= látka Ib-18); terc-Butyl-(3ó’)-3-(l-fosfonomethylcyklopentan-l-karbonylamino)-2,3,4,5-tetrahydro-2-oxoΙΗ-1-benzazepin 1-acetát, (= látka Ib-19);

a jejich fyziologicky vhodné soli kyselin.

S výhodou preferované příklady látek vzorce Ib jsou např. látka Ib-2, látka Ib-8, látka Ib-18 nebo látka Ib-19, s větší výhodou látka Ib-8 a jejich fyziologicky vhodné soli kyselin.

Tento vynález poprvé předkládá důkaz, že spolu s metaloproteasou ECE-1, známou dříve v tomto oboru, je též enzym, přeměňující endothelin typu IGS5, metaloproteasou, která se zúčastňuje štěpení big-ET-1 na ET-1. Proto zjištění podle tohoto vynálezu předkládají novou a perspektivní možnost pokud jde o zlepšení terapeutických konceptů pro léčení a/nebo profylaxi různých chorob ovlivněných a/nebo implikovaných štěpením big-ET-1 na ET-1 s účastí IGS5, protože tento vynález navrhuje identifikaci a použití terapeuticky aktivních látek, které, mimo jiné, specificky inhibují metaloproteasu typu IGS5, spíše než zkoumat a používat látky, které se přednostně váží ke známé ECE-1.

Je potřeba zdůraznit, že látky vzorce la nebo vzorce Ib, zmíněné výše, byly původně vybrány v tomto oboru na základě jejich inhibiční aktivity k NEP. Tak překvapivě nalezená • fc • * • · velmi vysoká aktivita těchto látek k IGS5 in vitro podle tohoto vynálezu, je provázena

• fc fc • fcfc • fcfcfc • · · fc··· • fcfc schopností těchto látek snížit podstatně vazokonstrikční účinek big-ET-1 u zkoumaných krys.

Na závěr, výzkumy podle tohoto vynálezu vedly k nalezení nové metaloproteasy podobné ECE/NEP, která účinně štěpí big-ET a je citlivá nejen k známému inhibitoru enzymu přeměňujícímu endothelin, fosforamidonu, ale překvapivě i k řadě definovaných inhibitorů metaloproteas se strukturou podle vzorce I, s výhodou se strukturou podle vzorce Ia nebo vzorce Ib. Je proto možné, že IGS5 může hrát roli v produkci ET-1 a že látky se strukturou podle vzorce I, s výhodou látky podle vzorce Ia nebo vzorce Ib, mohou uplatnit svůj účinek in vivo inhibici nově identifikovaného metaloproteasového enzymu IGS5.

Proto byly započaty další studie, objasňující distribuci tkání, fyziologickou funkci a patologickou úlohu IGS5 během různých nemocí, s výhodou během hypertenze, ledvinového onemocnění a srdečního selhání, v kontextu s tímto vynálezem týkajícím se látek, které vykazují kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitu k NEP/IGS5.

V dvojnásobně slepé klinické studii, týkající se zkoumání placeba, která zahrnula třináct zdravých dobrovolníků, inhibovala látka Ia-2 v závislosti na dávce látky odezvu tlaku indukovaného big-ET a prokázala jasně nárůst hladiny ANP, závislý na dávce, čímž indikovala své inhibiční vlastnosti k NEP. Hladina ET-1 se nezvyšuje, jak by se očekávalo od selektivního inhibitoru NEP, zatímco hladina big-ET se zvyšovala v závislosti na dávce látek skupiny Ia-2 při porovnání se skupinou placeba, čímž se indikovalo, že rozpad big-ET byl rovněž inhibován. Dokázat koncept klinické účinnosti a bezpečnosti látky Ia-2 na člověka, bylo provedeno 6 klinických pokusů na zdravých dobrovolnících a 2 důkazy konceptu léčení byly provedeny na pacientech: Jeden nahodilý, placebem kontrolovaný dvojnásobně slepý pokus na pacientech s hypertenzí (N= 191) ajeden otevřený, pilotní pokus s kontrolou základní linie na pacientech s městnavým srdečním selháním (N=29). Na základě výsledků byl podán důkaz inhibice neutrální endopeptidasy (NEP) významně zvýšenou a ·

• · · · 0 · 0 0 · ··

0 0 0 ·· · ···· • · 0 0 0 0 0 · 0 00 00000

9 9 9 9 9 9 999 jZ 00 00 00 000 00 0 podporovanou koncentrací ANP v plasmě a jejího druhého messengerovské cGMP u dvou dobrovolníků a pacientů po orálním dávkování látky Ia-2. Dále výsledky u pacientů s městnavým srdečním selháním ukázaly významnou pozitivní korelaci mezi logaritmem koncentrace látky Ia-1 (aktivního metabolitu látky Ia-2) v plasmě a hladinou big-ET v plasmě po aplikaci látky Ia-2 (p<0.001). Fakticky hladina big-ET v plasmě měla tendenci vzrůstat od základní linie po aplikaci látky Ia-2 (200 mg: 4.9 až 6.5 fmol/ml (+32.6%); 400 mg: 2.3 až 3.5 fmol/ml (+56%)), což podporuje koncept účinnosti orálně aplikované látky Ia-2 pro prevenci štěpení big-ET. Nej důležitější je, že látka Ia-2 poprvé poskytla důkaz významné a klinicky relevantní anti-hypertensní aktivity během nedávno dokončené 4-týdenní studie (N= 191) u pacientů s hypertenzí stupně I-II podle WHO. U populace pacientů uvažovaných pro léčbu (ITT), se měřený diastolický krevní tlak versus placebo snížil o -6.9 mm Hg (poslední hodnota při léčení; p<0.001) a měřený systolický krevní tlak versus placebo se snížil o -9 2 + mm Hg (poslední hodnota při léčení; p=0.003) při nejvyšší zkoumané dávce (200 mg). Toto zjištění má zvláštní význam, protože u čistých inhibitorů NEP byl demonstrován vzrůst koncentrace ET-1 a následně spíše vzrůst než pokles krevního tlaku.

Další studie jsou plánovány k výzkumu závislostí srdečních hemodynamických parametrů na dávce u látky Ia-2 u pacientů s městnavým srdečním selháním a k výzkumu časového průběhu anti-hypertensního účinku po jediné každodenní dávce u pacientů s hypertenzí.

Metaloproteasa IGS 5 v kontextu tohoto vynálezu

V kontextu tohoto vynálezu bylo odkázáno na polypeptidy IGS 5 (nebo enzymy IGS 5 nebo metaloproteasy IGS5, tj. na IGS5PROT, IGS5PROT1 nebo IGS5PROT2), s výhodou na lidské polypeptidy IGS5 (nebo lidské enzymy IGS5). Polypeptidy IGS5 mohou náležet k polypeptidúm, zejména k polypeptidúm lidským, obsahujícím sekvenci aminokyselin, která ···· ·· · · · · · • · ··· · · · · · · · ··· ·· · · · · ··· «· · · ·· · · · ·· · je z nejméně 70% shodná, s výhodou nejméně z 80% shodná a s větší výhodou nejméně z 85% shodná, s další větší výhodou nejméně z 90% shodná, s další větší výhodou nejméně z 95% shodná a s největší výhodou z 97% až 99% shodná s tou, která byla vybrána ze skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO.4 SEQ a SEQ ID NO:6. Takové polypeptidy zahrnují polypeptidy obsahující polypeptid IGS5, který je shodný s polypeptidem o sekvenci aminokyselin ze skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 SEQ a ID NO:6.

Takové polypeptidy také zahrnují polypeptidy IGS5, s výhodou lidské polypeptidy IGS5, které mají sekvenci aminokyselin z nejméně 70% shodnou, s výhodou nejméně z 80% shodnou a s větší výhodou nejméně z 85% shodnou, s další větší výhodou nejméně z 90% shodnou, s další větší výhodou nejméně z 95% shodnou a s největší výhodou z 97% až 99% shodnou s tou, která byla vybrána ze skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO.6.

Takové polypeptidy zahrnují polypeptidy IGS 5 který jsou shodné s polypeptidem o sekvenci aminokyselin ze skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.

Další polypeptidy podle tohoto vynálezu zahrnují isolované polypeptidy IGS5, které obsahují sekvenci obsaženou v SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.

Polypeptidy IGS5 v kontextu tohoto vynálezu jsou členy skupiny metaloproteasy neprilysinu a s výhodou jsou lidskými polypeptidy. Jsou zajímavé, protože bylo výše identifikováno několik dysfunkcí, nemocí nebo potíží, v nichž nově identifikované metaloproteasy hrají důležitou roli v patologii nemoci.

Tak bylo podle tohoto vynálezu zjištěno, že polypeptidy IGS5 mohou být zahrnuty v metabolismu biologicky aktivních peptidů a že s výhodou jsou tyto polypeptidy IGS5 enzymy typu metaloproteas, které mohou mít vliv na řadu vazoaktivních peptidů. Vazoaktivní peptidy, známé v tomto oboru, jsou např. takové, které jsou podobné atriálnímu natriuretickému peptidu (ANP), bradykininu, velkému endothelinu (big ET-1), endothelinu (ET-1), substanci P a angiotensinu 1. Dále bylo zjištěno, že ektodoména IGS5, kteráje novou • φ φφ φφ · φφφ • φφ φ φ φφφ φ φφ φφφφ φφ φ φφφφ φ φ φφφ φφφ φφφφ φφφ

0/1 ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦΦ •J « φφ φφ φφ φφφ φφ φ lidskou metaloproteasou, účinně hydrolyzuje např. in vitro řadu zmíněných vazoaktivních peptidů, s výhodou big-ET-1, bradykinin a substanci P.

Enzymy typu metaloproteasy IGS5 mohou být inhibovány zmíněnými sloučeninami, které se používají k určení inhibičních vlastností, s ohledem na enzymy mající ECE/NEP charakteristiky, např. inhibice látkami jako je fosforamidon. Ale žádná inhibice IGS5 nebyla pozorována při použití zmíněných sloučenin, které selektivně inhibují NEP, např. žádná inhibice IGS5 látkami jako je thiorfan nebo při použití zmíněných látek, které selektivně inhibují ECE, např. žádná inhibice IGS5 nebyla pozorována u látek jako je SM-19712 (Sumitomo, viz výše).

Inhibice IGS5 by mohla být pozorována při vyšších koncentracích pouze u zmíněných látek, které inhibují NEP/ECE, např. jedním příkladem je inhibitor NEP/ECE, CGS-35066 (De Lombart a spol., výše). Inhibiční údaje o těchto zmíněných látkách se zřetelem na inhibici enzymů typu metaloproteasy IGS5 podle tohoto vynálezu jsou dále popsány v příkladech níže.

Polypeptidy IGS5 podle tohoto vynálezu mohou být připraveny jakýmkoli vhodným způsobem. Takové polypeptidy zahrnují isolované polypeptidy vyskytující se v přírodě, rekombinantně produkované polypeptidy, syntheticky produkované polypeptidy nebo polypeptidy produkované kombinací těchto způsobů. Způsoby přípravy takových polypeptidů jsou v tomto oboru dobře známé. Tak v jednom příkladu může být metaloproteasa IGS5 generována methodou částečně popsanou ve společně podávané mezinárodní patentové přihlášce PCT/EP 00/11532, která je zde zmíněna odkazem se zřetelem k jejímu celému obsahu, zvláště se zřetelem na homologii klonování genu lidské IGS5 a na expresi odpovídajícího lidského proteinu IGS5.

Zakódování polynukleotidů IGS5 řečených metaloproteas IGS5 může též být získáno při použití standardního klonování a testovacích postupů, z knihovny cDNA získané z mRNA • · · • · · ·

·. · • · v buňkách z tkání lidských varlat za použití derivatizační analýzy (EST) exprimované sekvence (Adams, M.D. a spol. Science (1991) 252: 1651-1656; Adams, M.D. a spol., Nátuře (1992) 355: 632-634; Adams, M.D. a spol., Nátuře (1995) 377 Supp:3-174). Polynukleotidy IGS5 mohou být získány z přírodních zdrojů jako jsou knihovny genomové DNA nebo mohou být synthetisovány za použití dobře známých a komerčně dostupných postupů (např.

F.M. Ausubel a spol., 2000, Current Protocols in Molecular Biology).

Když jsou použity polynukleotidy IGS5 pro rekombinantní produkci polypeptidů IGS5, může polynukleotid sám zahrnovat kódovací sekvenci pro dospělý polypeptid; nebo kódovací sekvence pro dospělý polypeptid je čtecím rámcem s dalšími kódovacími sekvencemi, jako jsou ty, které kódují řídící nebo sekreční sekvenci, sekvenci pre-, nebo pronebo prepro-proteinu nebo dalších směsných částí peptidu. Například označovací sekvence může s výhodou být hexa-histidinový peptid, jak se objevuje ve vektoru pQE (Qiagen, lne.) a jak popisuje Gentz a spol., Proč Nati Acad Sci USA (1989) 86: 821-824, neboje substituentem HA. Polynukleotidy mohou také obsahovat nekódovací sekvence, jako transkribované, netranslatované sekvence, částečné a polyadenylované signály, vázací místa ribosomů a sekvence, které stabilizují mRNA. Polynukleotidy IGS5, které jsou shodné nebo dostatečně shodné se sekvencí nukleotidů obsaženou v SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 nebo SEQ ID NO:5 mohou být použity jako hybridizační sondy pro cDNA a genomovou DNA nebo jako primery pro amplifikační reakci nukleových kyselin (PCR), za účelem isolace celých cDNA a genomových klonů kódujících polypeptidy IGS5 a za účelem isolace cDNA a genomových klonů dalších genů (včetně genů kódujících paralogy z lidských zdrojů a orthologů a paralogů z jiných, než lidských druhů), které mají vysokou podobnost sekvence k SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 nebo SEQ ID NO:5. S výhodou jsou tyto sekvence nukleotidů v nejméně 70% shodné, s větší výhodou v nejméně 80% shodné, s další výhodou v nejméně 85% shodné, s další větší výhodou v nejméně 90% shodné, s největší výhodou v nejméně

95% shodné se sekvencí referenčního vzorku. Sondy nebo primery obecně obsahují nejméně nukleotidů, s výhodou nejméně 30 nukleotidů a mohou mít nejméně 50 nukleotidů.

S velkou výhodou preferované sondy budou mít mezi 30 až 50 nukleotidy. S výhodou preferované primery budou mít mezi 20 až 25 nukleotidy.

Polynukleotid IGS5 kódující polypeptid IGS5, s výhodou polypeptid lidské IGS5, může být získán postupem, který zahrnuje testování příslušné knihovny za přísných hybridizačních podmínek se značenými vzorky, které mají sekvenci SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 nebo SEQ ID NO:5 nebo jejich fragmenty; a při isolaci celé cDNA a genomových klonů obsahujících řečené sekvence polynukleotidů. Takové hybridizační techniky jsou dobře známé odborníkovi z tohoto oboru. Preferované přísné hybridizační podmínky zahrnují inkubaci při 42 °C přes noc, v roztoku obsahujícím : 50% formamidu, 5xSSC (150 mMNaCl, 15 mM citrátu trisodného), 50 mM fosforečnanu sodného (pH 7.6), 5x Denhardtůvroztok, = 10% dextransulfátu (hm./obj.) a 20 μg/ml DNA z denaturovaného spermatu lososa; následuje promytí filtrů v 0.1 x SSC při přibližně 65 °C. Tak mohou být získány polynukleotidy IGS5 testováním příslušné knihovny za přísných hybridizačních podmínek se značenými vzorky, které mají sekvenci SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 nebo SEQ ID NO:5 nebo jejich fragment.

Odborník v oboru ocení, že v mnoha případech bude isolovaná sekvence cDNA nekompletní kvůli tomu, že kódovací oblast polypeptidů je přerušena na konci 5’ cDNA. To je důsledek reversní transkriptasy, enzymu s podstatně nižší „způsobilostí“ (mírou schopnosti enzymu zůstat navázaný k templátu během polymerizační reakce), který není schopen dokončit kopii DNA z templátu mRNA během synthesy prvního vlákna cDNA. Existuje několik dostupných metod dobře známých odborníkům v oboru, kterými je možno získat celé cDNA, nebo prodloužit krátké cDNA, například metody založené na způsobu Rychlé Amplifikace konců cDNA (RACE) (viz například Frohman a spol., PNAS USA 85, 89889002, 1988). Nedávné modifikace tohoto postupu, provedené technologií MarathonTM • · · · · · · · · · · • · · · ·· · ···· • · ··· · · · · « · · ··· • · · · · · · « · • · ·· ·» ··· · · · (Clontech Laboratories lne.) mají například významně zjednodušené hledání delších cDNA.

V technologii MarathonTM byla cDNA připravena z mRNA extrahované z vybraných tkání sekvence „adaptoru“ vázaného na každém konci. Amplifikace nukleové kyseliny (PCR) se pak provádí amplifikací chybějícího konce 5’ cDNA za použití kombinace oligonukleotidového primeru, který je genově a adaptorově specifický. Reakce PCR se pak opakuje za použití „vázaných“ primerů, tj. primerů vytvořených v dvojitém řetězci v amplifikovaném produktu (s výhodou primer specifický k adaptoru, který se váže dále na 3 ’ v sekvenci adaptoru, primer specifický ke genu, který se váže dále na 5’ ve známé sekvenci genu). Produkty reakce mohou pak být analyzovány sekvenováním DNA a konstrukcí celé cDNA buď přímým navázáním produktu na existující cDNA k získání kompletní sekvence nebo provedením oddělené PCR pro celou délku při použití informace o nové sekvenci pro vytvoření primeru 5 ’.

Polypeptidy rekombinantní IGS5 se mohou připravit postupem dobře známým v tomto oboru z geneticky modifikovaných hostitelských buněk obsahujících expresní systém, který obsahuje polynukleotidy IGS5 nebo polynukleotidy. Hostitelské buňky, které jsou geneticky modifikované takovými expresními systémy, se mohou použít pro produkci polypeptidu IGS5 rekombinantními postupy. Bezbuněčné translační systémy se také mohou použít k produkci takových proteinů IGS5 při použití RNA odvozených od předloh DNA z IGS5. Zavedení polynukleotidů IGS5 do hostitelských buněk může být ovlivněno metodami popsanými v mnoha standardních laboratorních manuálech, jako Davisem a spol., Basic Methods in Molecular Biology (1986) a Salmbrookem a spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Takové metody zahrnují, například, transfekci fosforečnanem vápenatým, trasfekci za pomoci DEAEdextranu, transvekci, mikroinjektáž, transfekci za pomoci kationických lipidů, elektroporaci, transdukci, vyplnění oděrky, balistickou introdukci nebo infekci. Významné příklady • ·

příslušných hostitelů zahrnují bakteriální buňky, jako buňky organismů Streptococci, Staphylococci, E. coli, Streptomyces a Bacillus subtilis; buňky hub, jako buňky kvasinek a buňky Aspergillus; buňky hmyzu, jako buňky S2 z rodu Drosophila a S19 z rodu Spodoptera; živočišné buňky, jako CHO, COS, HeLa, 027, 3T3, BHK, HEK 293 a buňky Bowesova melanomu; a rostlinné buňky.

Může se použít velká variabilita expresních systémů, například, chromozomální, epizomální a systémy odvozené od virů, např. vektory odvozené od bakteriálních plasmidů, od bakteriofágů, od transpozonů, od epizomů kvasinek, od vložených prvků, od chromozomálních prvků kvasinek, od virů, jako bakulovirů, papovavirů, jako je SV40, vakcinovirů, adenovirů, virů drůbežích neštovic, virů pseudovztekliny a retrovirů, a vektorů odvozených od kombinace těchto virů, jako jsou ty, které jsou odvozené od plasmidových a bakteriofágových genetických prvků, jako kosmidů a fagemidů. Expresní systémy mohou obsahovat kontrolní regiony, které regulují, jakož i plodí, expresi. Obecně může být použit jakýkoli systém nebo vektor, který je schopný udržet, propagovat nebo exprimovat polynukleotid k produkci polypeptidu v hostiteli. Daná sekvence nukleotidu může být vložena do expresního systému jakoukoli z mnohých dobře známých postupů, jako jsou například ty, které byly popsány Sambrookem a spol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (viz výše). Dané sekreční signály mohou být vloženy do požadovaného polypeptidu, aby umožnily sekreci proteinu po translaci do dutiny endoplasmatického retikula, periplasmatického prostoru nebo extracelulárního prostředí. Tyto signály mohou být endogenní k polypeptidu nebo to mohou být heterologní signály, tj. odvozené od různých druhů.

Jestliže má být polypeptid exprimován pro použití v testu, je obecně možné, že polypeptid IGS5 je produkován na povrchu buňky nebo alternativně ve formě rozpustného proteinu. Jestliže polypeptid IGS5 je vylučován do media, může být medium obnoveno za účelem obnovení a čištění polypeptidu IGS5. Jestliže se produkuje intracelulárně, musejí být ·· · • · 0 * 0 0 0 0 · 00 • 000 00 0 0 0 0 0

0 000 0 0 0 0 0 0 0 000

7Q 00 0000 000 jy 00 00 00 000 00 0 buňky nejprve rozštěpeny před tím, než se obnoví polypeptid IGS5. Jestliže je polypeptid IGS5 vázán na povrch buňky (polypeptid vázaný na membránu), obvykle se připraví části membrány za účelem akumulace polypeptidu IGS5 vázaného na membránu. Polypeptid IGS5 může být získán a čištěn z rekombinantních buněčných kultur dobře známými metodami včetně srážení síranem amonným nebo ethanolem, kyselé extrakce, aniontové nebo kationtové výměnné chromatografie, chromatografie a fosfocelulóze, chromatografie založené na hydrofóbních interakcích, afinitní chromatografie, hydroxylapatitové chromatografie a lektinové chromatografie. S výhodou se pro čištění používá kapalinová chromatografie a vysokou účinností. Mohou se použít dobře známé postupy pro obnovení skládání proteinů k regeneraci aktivních konformací, když je polypeptid denaturován během intracelulární synthesy, isolace a nebo čištění.

Isolované polynukleotidy IGS5,-s výhodou isolované lidské polynukleotidy IGS5, které mohou být použity ke generování polypeptidu IGS5, obvykle obsahují sekvenci nukleotidu, která je z nejméně 70% shodná, s výhodou z nejméně 80% a s větší výhodou z nejméně 85% shodná, s další větší výhodou z nejméně 90% shodná, s další větší výhodou z nejméně 95% shodná se sekvencí nukleotidu kódujícímu jeden z polypeptidů vybraných ze skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 nebo SEQ ID NO:6, přes celou kódovací oblast.

S tímto zřetelem, polynukleotidy, které mají nejméně 97% shodu, jsou vysoce preferovány, zatímco ty, které mají shodu nejméně 98-99%, jsou ještě více preferovány a ty, které mají shodu 99%, s výhodou 99.9%, jsou nejvíce preferovány. Například takové isolované, s výhodou lidské, polynukleotidy IGS5, které mohou být použity ke generování polypeptidů IGS5, zahrnují sekvence nukleotidů, které mají shodu nejméně 70%, s výhodou nejméně 80%, s větší výhodou nejméně 85%, s ještě větší výhodou nejméně 90%, s největší výhodou nejméně 95%, přes celou délku jedné sekvence nukleotidu vybraného ze skupiny SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:5. V tomto ohledu, polynukleotidy IGS5, které obsahují • · · · ·· « ··· • · · · · · · · · · · • · · · ·· · ···· • · ··· · · · · · · · ··· • · ···· ·«· • · · · ·· ··· ·· · nebo mají sekvenci nukleotidů ve shodě nejméně 97% s jednou ze sekvencí nukleotidů vybraných ze skupiny SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:5, jsou s výhodou preferovány, zatímco ty, které mají shodu nejméně 98-99%, jsou preferovány s větší výhodou a ty, které mají shodu nejméně 99%, s výhodou 99.9%, jsou preferovány s největší výhodou. Sekvence polynukleotidu IGS5, SEQ ID NO:1, (označovaná „IGS5DNA“) je uvedena v Tabulce 1, která uvádí sekvenci cDNA lidského původu (Homo sapiens) s délkou 2076 nukleotidů a obsahuje kódovací sekvenci polypeptidu (z nukleotidu číslo 1 až číslo 2073), která kóduje polypeptid o 691 aminokyselině, polypeptid SEQ ID NO:2 (označovanou jako „IGS5PROT“), která je uvedena v Tabulce 2. Sekvence nukleotidů SEQ ID NO:3 (označovaná jako „IGS5DNA1“) je uvedena v Tabulce 3, která uvádí sekvenci cDNA lidského původu (Homo sapiens) s délkou 2340 nukleotidů (včetně stopovacího kodónu) a obsahuje sekvenci kódující polypeptid (od nukleotidu číslo 1 až číslo 2337), kódující polypeptid o 779 aminokyselinách, polypeptid SEQ ID NO:4 (označovanou jako „IGS5PROT1“), která je uvedena v Tabulce 4. Sekvence nukleotidu SEQ ID NO:5 (označovaná jako „IGS5DNA2“) je uvedena v Tabulce 5 a uvádí sekvenci cDNA lidského původu (Homo sapiens) s délkou 2262 nukleotidů (včetně stopovacího kodónu) a obsahuje kódovací sekvenci polypeptidu (od nukleotidu číslo 1 až číslo 2259), která kóduje polypeptid o 753 aminokyselinách, polypeptid SEQ ID NO:6 (označovanou jako „IGS5PROT2“), která je uvedena v Tabulce 6.

Látky s kombinovanou nebo souběžnou selektivní inhibiční aktivitou k NEP/IGS5 jako nový terapeutický koncept.

Zjištěním podle tohoto vynálezu je, že ukazuje, že metaloproteasy IGS5, např. také v kombinaci s nejméně jednou další metaloproteasou, jako s výhodou s NEP a volitelně ve spojení s ECE a/nebo ACE, jsou zodpovědné za jednu nebo více biologických funkcí • · · • · * φ φ · · · · · · • · φ · · · φ φφφφ • · φφφφφ φ φ φφ φφφφ φφ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φφφ φφ φ souvisejících s nemocemi zmíněnými zde výše. Tak v nejširším aspektu, vynález předkládá nové terapeutické koncepty pro léčení řečených nemocí tak, jak již bylo výše řečeno, tím, že navrhuje poprvé použít látek s kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitou k neutrální endopeptidase (NEP) a k metaloprotease IGS5, nebo použít jejich farmaceuticky použitelných solí nebo solvátů nebo biolabilních esterů, k výrobě léčiv (farmaceutických směsí) pro léčení savců, s výhodou lidí, kteří trpí nebojsou citliví k podmínkám, které mohou být zmírněny nebo preventovány kombinovanou nebo souběžnou inhibici NEP a IGS5.

Takové látky, použitelné podle vynálezu, které mohou souběžně inhibovat funkci metaloproteasy IGS5 a NEP, mohou být identifikovány testovacími metodami za použití metaloproteasy IGS5 a volitelně NEP, v testu na inhibici příslušného enzymu. Takové testy inhibice enzymu jsou popsány ve více podrobnostech v příkladech níže. Pro identifikaci látek s kombinovanou nebo souběžnou selektivní inhibiční aktivitou k NEP/IGS5 mohou kandidátské látky být testovány odděleně jak během inhibičního testu na NEP, tak během inhibičního testu na IGS5. Látky inhibující NEP/IGS5 mohou být identifikovány z řady zdrojů, například buněk, bezbuněčných preparátů, chemických knihoven a směsí přírodních produktů.

Testovací metoda může jednoduše měřit vliv kandidátské látky na aktivitu polypeptidu vylučovaného do media kultury nebo buněk nebo membrán nesoucích polypeptid.

Alternativně může testovací metoda zahrnout soutěž s kompetitivní látkou. Dále může testovací metoda ukázat, zda má kandidátská látka za následek signál generovaný aktivací nebo inhibici polypeptidu, při využití detekčních systémů souvisejících s aktivitou polypeptidu vylučovaného do media kultury nebo do buněk nebo membrán nesoucích polypeptid. Inhibice aktivity polypeptidu se obecně zkouší v přítomnosti známého substrátu a účinek kandidátské látky se pozoruje na základě změněné aktivity, např. testováním, zda kandidátská látka má za následek inhibici polypeptidu. Například testovací metody mohou • · ·· · • · · · · · · · · · ···· ·· · · · • ··«»·· · 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 999 99 9 jednoduše obsahovat směšování kandidátské látky s roztokem obsahujícím zkoumaný polypeptid, v kontextu tohoto vynálezu, a srovnávat aktivitu polypeptidů se směsí a se standardem bez kandidátské látky.

Tento vynález také umožňuje odborníkovi v oboru identifikovat látky, např. kandidátské látky, skrze testovací metody, zahrnující zjištění tohoto vynálezu tak, že se mohou řečené látky ukázat jako perspektivní kandidáti léčiv, s výhodou s ohledem na dysfunkce, potíže nebo nemoci, na které již bylo výše odkázáno. Bude přímo ohodnoceno odborníkem v oboru, že metaloproteasa IGS5 může být použita v metodě vývoje inhibičních látek pro IGS5 na základě jejich struktury, a to pomocí.

(a) prvotní určení nebo použití třírozměrné struktury metaloproteasy IGS5;

(b) dedukce třírozměrné struktury pro pravděpodobně reaktivní nebo vázací místo(a) inhibitoru IGS5; ........

(c) synthesy kandidátských látek, u kterých se předpokládá, že se budou vázat nebo reagovat s předpokládanými vázacími nebo reaktivními místy; a (d) testování, zda kandidátské látky jsou vskutku inhibitory IGS5.

Dále bude ukázáno, že toto bude normálně iterativní proces.

Dnes mají lékařští chemici vědomosti o moderních strategiích plánování a provádění organické synthesy za účelem generování nových sloučenin a látek, které stojí za to zkoumat kvůli jejich potenciálním fyziologickým nebo farmakologickým vlastnostem a kteréžto látky jsou proto slibné osvědčit se jako perspektivní noví kandidáti na léčiva k léčení a/nebo profylaxi specifických dysfunkci, potíží nebo nemocí. Dále je dnes běžné připravovat knihovny látek pomocí kombinatorní chemie, např. s výhodou obecných a „řízených“ chemických knihoven nebo knihoven sloučenin, v nichž struktura a obměny farmakoforních skupin a residuí nebo substituentů jsou známé zkušenému odborníkovi. Jestliže jsou chemické knihovny nebo knihovny sloučenin se stále neznámou strukturou látek zkoumány v testech,

• · potenciálně perspektivní látky, např. kandidátské látky, mohou být, nicméně, snadno analyzovány po stránce jejich struktury a chemických vlastností dnes dobře vybudovanými analytickými způsoby, jako např. hmotovou spektroskopií, nukleární magnetickou resonancí, infračervenými spektry, body tání, optickou rotací u zúčastněných chirálních látek a elementární analýzou.

Vynález se také týká procesu přípravy kandidátské látky s definovanou chemickou strukturou schopnou inhibovat polypeptid IGS5, přičemž tento proces zahrnuje výrobu látky nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo biolabilního esteru pomocí chemické synthesy, za předpokladu, že inhibiční aktivita látky k polypeptidu IGS5 je zjistitelná testovací metodou, např. jako je popsáno v příkladech tohoto vynálezu.

Více podrobností o např. chemické organické synthese a např. chemických, analytických a fyzikálních metodách lze najít v příručce Handbook „Houben-Weyl“ (HoubenWeyl, „Methoden der organischen Chemie“, Georg Thíeme Verlag, Stuttgart, New York) v její nej novější verzi.

Tento vynález se také týká použití látky vzorce I, jak bylo zmíněno výše nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru, pro výrobu léčiva (farmaceutické směsi) pro léčení větších savců, s výhodou lidí, kteří trpí nebojsou citliví k podmínkám, které mohou být zlepšeny nebo preventovány kombinovanou nebo souběžnou inhibici (a) neutrální endopeptidasy (NEP) a (b) metaloproteasy IGS5, která je polypeptidem obsahujícím sekvenci aminokyselin, která má z nejméně 70% shodu 6 po celé délce k jedné ze sekvencí aminokyselin vybraných ze skupiny SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.

S výhodou se tento vynález týká použití látek podle vynálezu, s výhodou látek vzorce

I, které mají kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitu k ·· ·

0 0

0·0

0 0000

0 0 (a) neutrální endopeptidase (NEP) a (b) metaloprotease IGS5, která je polypeptidem obsahujícím sekvenci aminokyselin, která má z nejméně 70% shodu 6 po celé délce k jedné ze sekvencí aminokyselin vybraných ze skupiny SEQ ID NO.2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6;

nebo jejím farmaceuticky vhodným solím nebo solvátům nebo biolabilním esterům, za účelem výroby léčiva (farmaceutické směsi) pro léčení a/nebo profylaxi hypertenze, včetně sekundárních forem hypertenze, jako je ledvinová nebo plicní hypertenze, srdeční selhání, angína pectoris, arytmie, infarkt myokardu, srdeční hypertrofie, mozková ischemie, periferní cévní onemocnění, subarachnoidální krvácení, chronická obstrukční plicní nemoc (COPD), astma, ledvinové onemocnění, atheroskleróza a bolest v důsledku kolorektální rakoviny nebo rakoviny prostaty, u vyšších savců, s výhodou u lidí.

Látky vzorce I mohou být připraveny podle předpisu v patentu US 5,677,297, který je vhodný pro látky vzorce la a podle patentu US 5,952,327, který je vhodný pro látky vzorce lb.

Komplexy proteinu s ligandem ve vývoji léčiv a optimalizace vůdčí struktury.

Jiný aspekt tohoto vynálezu se týká komplexu proteinu s ligandem, který obsahuje polypeptid IGS5 o shodě nejméně 70% s jedním z polypeptidů SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:5 a látku, která se váže na IGS5, s výhodou látku s inhibiční aktivitou k IGS5, která je nejméně taková nebo srovnatelná s látkou vzorce I. Takové komplexy proteinu s ligandem jsou s výhodou použitelné v metodách vývoje léčiv, hledáni vůdčích struktur, optimalizace vůdčích struktur a v modulačních metodách. Metody jsou dobře známé v tomto oboru. Pro odkazy jako příklad viz literaturu týkající se např. kombinatorní synthesy a mutidimensionální NMR spektroskopie a jejího přínosu k porozumění vztahů mezi proteinem a ligandem (Kessler, Angew. Chem. 1997, 109, 857-859; James K. Chen a spol., Angew.

Chem. 107 (1995), S. 1041-1058). Dále viz Fesik (Journal of Medicinal Chemistry, 34 (1991), fc fc • · • · • ·« • fcfcfc · · · • fcfcfc fcfc fc « fcfcfc fcfc · • · · · « fcfc fcfc fcfc ·

S. 2937-2945), který popisuje studie molekulárních komplexů pomocí NMR jako nástroj při vývoji léčiv; a Fesik a spol. (Biochemical Pharmacology 40 (1990), S. 161-167), kteří popisují metody NMR při určování struktur komplexů enzymů s inhibitory jako pomoc při vývoji léčiv. Nejnovější publikace Rosse a spol. (Journal of Biomolecular NMR, 16: 139-146 (2000)) popisuje automatizaci měření NMR a vyhodnocení dat pro systematické testování interakcí malých molekul s cílovými proteiny, např. receptory.

Pak se vynález také týká použití komplexu proteinu s ligandem, který obsahuje polypeptid IGS5 ve shodě nejméně 70% s jedním z polypeptidů SEQ ID NO:2, SEQ ID NO.4 a SEQ ID NO:6 a látku, která se váže na IGS5 při vývoji a modulaci nebo optimalizaci vůdčích struktur, které mají vazebnou nebo inhibiční aktivitu k IGS5.

Kombinovaná terapie (látky inhibující NEP/IGS5 a látky inhibující ECE/AGE).

Jak již bylo výše krátce zmíněno, může být užitečné dodatečně kombinovat látky vykazující kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitu k NEP/IGS5, podle tohoto vynálezu, např. látky vzorce I, s výhodou látky vzorce Ia nebo Ib, s dalšími látkami a/nebo kombinovanými inhibitory metaloproteas, než s kombinovanými inhibitory NEP/IGS5.

Takové další inhibitory metaloproteas, které mohou být použity v kombinaci s řečenými látkami s kombinovanou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5, jsou například inhibitory ACE, jako kaptopril, enalapril, lisinopril, fosinopril, perindopril, quinapril, ramipril; selektivní inhibitory ECE, jako jsou látka SM-19712 (Sumitomo, výše); selektivní inhibitory NEP, jako thiorfan; duální inhibitory NEP/ECE, jako látka CGS-35066 (De Lombart a spol., J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3):488-504); nebo směsné inhibitory těchto metaloproteas, jako omapatrilat nebo sampatrilat. S tímto typem kombinovaného léčení a/nebo profylaxe může být terapeutická hodnota látek s kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5 stále dále zvýšena, zejména se zřetelem na nemoci a/nebo podmínky zmíněné výše. Proto se tento *· • · · · • · · ·· ·

·· vynález také týká kombinované terapie a/nebo kombinované profylaxe. S tímto typem kombinovaného léčení a/nebo profylaxe může být terapeutická hodnota řečených látek s kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5, s výhodou látek vzorce I, s větší výhodou látek vzorce la nebo Ib, stále ještě zvýšena, zejména se zřetelem na nemoci a/nebo podmínky zmíněné výše.

Tak se v tomto ohledu vynález týká použití první látky, která vykazuje kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitu k NEP/IGS5, nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru, jak jsou tyto látky popsány výše s ohledem na tento vynález, v kombinaci s nejméně jednou další látkou vybranou ze skupiny dalších látek a/nebo kombinovaných inhibitorů metaloproteas, než s kombinovanými inhibitory NEP/IGS5, přičemž řečená přídavná látka je s výhodou vybrána ze skupiny inhibitorů ACE, selektivních inhibitorů ECE, selektivních inhibitorů NEP, duálních inhibitorů NEP/ECE a směsných inhibitorů těchto metaloproteas, pro výrobu léčiva (farmaceutické směsi) pro kombinované léčení a/nebo kombinovanou profylaxi kterékoli z nemocí nebo podmínek podle odkazu výše v kontextu s tímto vynálezem. S výhodou toto použití podle vynálezu řečené první látky v kombinaci s nejméně jednou řečenou přídavnou látkou je charakterizováno tím, že první látka má strukturu podle vzorce I, s výhodou strukturu podle vzorce la nebo vzorce Ib tak, jak jsou tyto vzorce výše uvedeny v kontextu tohoto vynálezu. S výhodou je použití řečené první látky v kombinaci s nejméně jednou řečenou přídavnou látkou dále charakterizováno tím, že kombinace násobí účinek, s výhodou synergistickým způsobem.

Dále se vynález také týká farmaceutické směsi (léčiva), obsahujícího spoluúčinkující, s výhodou synergisticky účinkující, množství:

první látky s kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5, nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru tak, jak je tato látka popsána výše s ohledem na vynález; a nejméně jedné přídavné látky vybrané ze skupiny dalších látek

ΦΦ φφ φφ φ φφ φ φ φφ φ φ φφφ φ φφ φφφφ φφ φ φφφφ φ φ φφφ φφ φ φ φφ φφφφ φφ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φφφ φφ φ a/nebo kombinovaných inhibitorů metaloproteas, než kombinovaných inhibitorů NEP/IGS5, přičemž přídavná látka je s výhodou vybrána ze skupiny inhibitorů ACE, selektivních inhibitorů ECE, selektivních inhibitorů NEP, duálních inhibitorů NEP/ECE a směsných inhibitorů těchto metaloproteas, pro kombinované léčení a/nebo kombinovanou profylaxi kterékoli z nemocí nebo podmínek tak, jak bylo výše zmíněno v kontextu tohoto vynálezu. Zejména farmaceutická směs podle tohoto vynálezu může obsahovat spoluúčinkující, s výhodou synergisticky účinná, množství řečené první látky a nejméně jedné řečené přídavné látky, přičemž je první látka dále charakterizována tím, že má strukturu vzorce I, s výhodou strukturu vzorce Ia nebo vzorce Ib tak, jak jsou tyto vzorce zmíněny výše v kontextu tohoto vynálezu.

Odborníkovi je samostatně jasné, že kombinované terapie a/nebo kombinované profylaxe podle tohoto vynálezu může být dosaženo aplikací pacientovi, který takovou terapii a/nebo profylaxi potřebuje, první látky s kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitou k NEP/IGS5, nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru a přídavné látky vybrané ze skupiny dalších látek a/nebo kombinovaných inhibitorů metaloproteas, než kombinovaných inhibitorů NEP/IGS5, simultánním způsobem, buď aplikací preparátu, který je jednotnou farmaceutickou směsí nebo oddělenými farmaceutickými preparáty pro první a druhou látku, odděleným způsobem, např. danou dávkou v životosprávě nebo podle schématu, které může být buď kontinuální nebo postupné, nebo stupňovaným způsobem, cokoli se zdá vhodné s ohledem zlepšení nebo prevenci pacientovy choroby nebo podmínek.

Formulování a aplikace.

Zjištění učiněná podle vynálezu prokazují, že látky s kombinovanou nebo souběžnou selektivní inhibici k NEP/IGS5, volitelně v kombinaci s oddělenými inhibičními látkami • · e

• · ·

k ACE a/nebo k ECE, nebo jejich farmaceuticky vhodné soli nebo solváty nebo biolabilní estery, mají výhodnou terapeutickou aktivitu. Proto tyto látky, volitelně v kombinaci s oddělenými inhibitory ACE a/nebo ECE, jsou vhodné jako léčiva pro léčení a/nebo profylaxi hypertenze, včetně sekundárních forem hypertenze, jako je ledvinová nebo plicní hypertenze, srdeční selhání, angína pectoris, arytmie, infarkt myokardu, srdeční hypertrofie, mozková ischemie, periferální cévní onemocnění, subarachnoidální krvácení, chronická obstrukční plicní nemoc (COPD), astma, ledvinové onemocnění, atheroskleróza, bolest v důsledku kolorektální rakoviny nebo rakoviny prostaty, u vyšších savců, s výhodou u lidí. Látky inhibující NEP/IGS5, volitelně v kombinaci s oddělenými inhibičními látkami k ACE a/nebo ECE, mohou být podávány všemi známými aplikačními cestami.

Směs bude upravena podle způsobu aplikace, například systemickým nebo orálním způsobem. Preferované formy pro systemickou aplikaci zahrnují injekci, s výhodou nitrožilní injekci. Mohou se použít další injekční způsoby, jako podkožní, nitrosvalový nebo nitropobřišnicový. Alternativní způsoby systemické aplikace zahrnují aplikaci skrze sliznici a skrze kůži za použití penetrantů jako jsou soli kyseliny žlučové nebo fusidové kyseliny nebo jiné detergenty. Dále mohou látky být formulovány jako střívková nebo enkapsulovaná formulace, přičemž orální aplikace je též možná. Aplikace těchto látek může být i topikální a/nebo lokalizovaná formou mastí, past, gelů a tak podobně.

Pro aplikaci podle vynálezu, mohou terapeuticky aktivní množství látek inhibujících NEP/IGS5, která zlepšují a/nebo preventují nemoci nebo podmínky zmíněné výše v kontextu tohoto vynálezu, obsahovat běžné farmaceutické přísady a/nebo aditiva v pevných nebo kapalných farmaceutických formulacích.

Příklady pevných dávkových forem jako jsou pevné látky, polopevné látky, lyofilizovaný prášek, tablety, potahované tablety, pilulky, kapsle, prášky, granule nebo čípky a formulace s postupným uvolňováním. Tyto pevné dávkovači formy mohou obsahovat • · • · ··· ·· ·· ·* • · · · · • · · · · · • · ··· « · · • · · · · ·· · · ·· ·· • · • · · • · · »·♦ 99 · standardní farmaceutické anorganické a/nebo organické přísady. Takové přísady zahrnují ve farmaceutické čistotě mannitol, Iaktosu, škrob, stearan hořečnatý, sodnou sůl sacharinu, talek, celulosu, glukosu, želatinu, sacharosu, uhličitan hořečnatý a tak dále ve spojitosti s běžnými farmaceutickými aditivy, jako jsou plniva, mazadla nebo desintegrátory tablet. Kapalné přípravky, jako roztoky, suspenze nebo emulze aktivních složek, mohou obsahovat obvyklá rozpouštědla, jako vodu, olej a/nebo suspendující přísady, jako polyethylenglykol a tak podobně. Další aditiva jako konzervační prostředky, prostředky dodávající vůni a tak dále, mohou též být přidány.

Aktivní složky mohou být smíchány a formulovány s farmaceutickými přísadami a/nebo aditivy známým způsobem. Pro výrobu pevných dávkovačích forem, například, může být aktivní složka smíchána s přísadami a/nebo aditivy a granulována za vlhka nebo za sucha. Granule nebo prášek může být přímo plněn do kapslí nebo stlačen do tabletových forem. Jestliže je to potřebné, mohou tablety být potahované známým způsobem.

Kapalné přípravky mohou být připraveny rozpuštěním nebo dispergováním látek a volitelných farmaceutických přísad, na nosiči jako je například vodný roztok soli, vodný roztok dextrosy, glycerol nebo ethanol, za vytvoření roztoku nebo suspenze.

Dávky k aplikaci se mohou lišit podle jedinců a přirozeně se měnit v závislosti na typu podmínek, které mají být léčeny a podle způsobu aplikace. Například lokálně aplikované formulace, injekce, obecně obsahují podstatně menší množství aktivní látky než formulace pro systemickou aplikaci. Tak požadované rozmezí dávek závisí na úsudku lékaře, s výhodou s ohledem na výběr látek, aplikačních způsobů, povahy formulace a na stavu subjektu.

Vhodná dávkování jsou však v rozsahu od 0.1 do 100 pg/kg hmotnosti subjektu. Široké meze potřebného dávkování se předpokládají vzhledem k paletě dostupných látek a odlišným účinnostem různých způsobů aplikace. Například o orální aplikaci se předpokládá, že bude vyžadovat vyšší dávkování, než nitrožilní aplikace injekcí. Rozdíly v hladinách těchto dávek mohou být stanoveny při použití standardních empirických způsobů optimalizace, jakož i na • · · · · · φ φφφφ • · ·ΦΦ φ φ φ φφφφ φφφ • Φ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φφφ φφ φ základě zkušeností v oboru.

Tabulky sekvencí DNA IGS5 a proteinů IGS5. Tabulka 1: DNA IGS5 („IGS5DNA“) SEQ ID NO.l

5'TGCACCACCCCTGGCTGCGTGATAGCAGCTGCCAGGATCCTCCAGAACATGGACCCGACC

ACGGAACCGTGTGACGACTTCTACCAGTTTGCATGCGGAGGCTGGCTGCGGCGCCACGTG

ATCCCTGAGACCAACTCAAGATACAGCATCTTTGACGTCCTCCGCGACGAGCTGGAGGTC

ATCCTCAAAGCGGTGCTGGAGAATTCGACTGCCAAGGACCGGCCGGCTGTGGAGAAGGCC

AGGACGCTGTACCGCTCCTGCATGAACCAGAGTGTGATAGAGAAGCGAGGCTCTCAGCCC

CTGCTGGACATCTTGGAGGTGGTGGGAGGCTGGCCGGTGGCGATGGACAGGTGGAACGAG

ACCGTAGGACTCGAGTGGGAGCTGGAGCGGCAGCTGGCGCTGATGAACTCACAGTTCAAC

AGGCGCGTCCTCATCGACCTCTTCÁTCTGGAACGACGACCAGAACTCCAGCCGGCACAŤ(T

ATCTACATAGACCAGCCCACCTTGGGCAŤGCCCTCCCGAGAGTÁCTACTTCAACGGCGGC

AGCAACCGGAAGGTGCGGGAAGCCTACCTGCAGTTCATGGTGTCAGTGGCCACGTTGCTG

CGGGAGGATGCAAACCTGCCCAGGGACAGCTGCCTGGTGCAGGAGGACATGATGCAGGTG

CTGGAGCTGGAGACACAGCTGGCCAAGGCCACGGTACCCCAGGAGGAGAGACACGACGTC

ATCGCCTTGTACCACCGGATGGGACTGGAGGAGCTGCAAAGCCAGTTTGGCCTGAAGGGA

TTTAACTGGACTCTGTTCATACAAACTGTGCTATCCTCTGTCAAAATCAAGCTGCTGCCA

GATGAGGAAGTGGTGGTCTATGGCATCCCCTACCTGCAGAACCTTGAAAACATCATCGAC

ACCTACTCAGCCAGGACCATACAGAACTACCTGGTCTGGCGCCTGGTGCTGGACCGCATT

GGTAGCCTAAGCCAGAGATTCAAGGACACACGAGTGAACTACCGCAAGGCGCTGTTTGGC

ACAATGGTGGAGGAGGTGCGCTGGCGTGAATGTGTGGGCTACGTCAACAGCAACATGGAG

AACGCCGTGGGCTCCCTCTACGTCAGGGAGGCGTTCCCTGGAGACAGCAAGAGCATGGTC

AGAGAACTCATTGACAAGGTGCGGACAGTGTTTGTGGAGACGCTGGACGAGCTGGGCTGG

ATGGACGAGGAGTCCAAGAAGAAGGCGCAGGAGAAGGCCATGAGCATCCGGGAGCAGATC

GGGCACCCTGACTACATCCTGGAGGAGATGAACAGGCGCCTGGACGAGGAGTACTCCAAT

CTGAACTTCTCAGAGGACCTGTACTTTGAGAACAGTCTGCAGAACCTCAAGGTGGGCGCC

CAGCGGAGCCTCAGGAAGCTTCGGGAAAAGGTGGACCCAAATCTCTGGATCATCGGGGCG

GCGGTGGTCAATGCGTTCTACTCCCCAAACCGAAACCAGATTGTATTCCCTGCCGGGATC

CTCCAGCCCCCCTTCTTCAGCAAGGAGCAGCCACAGGCCTTGAACTTTGGAGGCATTGGG

ATGGTGATCGGGCACGAGATCACGCACGGCTTTGACGACAATGGCCGGAACTTCGACAAG

AATGGCAACATGATGGATTGGTGGAGTAACTTCTCCACCCAGCACTTCCGGGAGCAGTCA • 0 00 0 <

• · 0

0 gagtgcatgatctaccagtacggcaactactcctgggacctggcagacgaacagaacgtg AACGGATTCAACACCCTTGGGGAAAACATTGCTGACAACGGAGGGGTGCGGCAAGCCTAT AAGGCCTACCTCAAGTGGATGGCAGAGGGTGGCAAGGACCAGCAGCTGCCCGGCCTGGAT CTCACCCATGAGCAGCTCTTCTTCATCAACTACGCCCAGGTGTGGTGCGGGTCCTACCGG CCCGAGTTCGCCATCCAATCCATCAAGACAGACGTCCACAGTCCCCTGAAGTACAGGGTA CTGGGGTCGCTGCAGAACCTGGCCGCCTTCGCAGACACGTTCCACTGTGCCCGGGGCACC CCCATGCACCCCAAGGAGCGATGCCGCGTGTGGTAG - 3'

Tabulka 2: Protein IGS5 („IGS5PR0T“) SEQ ID N0:2

CTTPGCVIAAARILQNMDPTTEPCDDFYQFACGGWLRRHVIPETNSRYSIFDVLRDELEV

ILKAVLENSTAKDRPAVEKARTIiYRSCMNQSVIEKRGSQPLLDILEWGGWPVAMDRWNE

TVGLEWELERQLALMNSQFNRRVLIDLFIWNDDQNSSRHIIYItXJPTLGMPSREYYFNGG

SNRKVREAYLQFMVSVATLLREDANLPRDSCLVQEDMMQVLEL.ETQLAKATVPQEERHDV

IALYHRMGLEELQSQFGLKGFNWTLFIQTVLSSVKIKLLPDEEVVVYGIPYLQNLENIID

TYSARTIQNYLVWRLVLDRIGSLSQRFKDTRVNYRKALFGTMVEEVRWRECVGYVNSNME

NAVGSLYVREAFPGDSKSMVRELIDKVRTVFVETLDELGWMDEESKKKAQEKAMSIREQI

GHPDYILEEMNRRLDEEYSNLŇFSEDLYFENSLQNIiKVGAQRSLRKLREKVDPNLWIIGA

AWNAFYSPNRNQIVFPAGILQPPFFSKEQPQALNFGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFDK

NGNMMDWWSNFSTQHFREQSECMIYQYGNYSWDLADEQNVNGFNTLGENIADNGGVRQAY

KAYLKWMAEGGKDQQLPGLDLTHEQLFFINYAQVWCGSYRPEFAIQSIKTDVHSPLKYRV

LGSLQNLAAFADTFHCARGTPMHPKERCRVW

Tabulka 3: DNA-1IGS5 („IGS5DNA1“) SEQ ID N0.3

5'ATGGGGAAGTCCGAAGGCCCCGTGGGGATGGTGGAGAGCGCTGGCCGTGCAGGGCAGAAG

CGCCCGGGGTTCCTGGAGGGGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGTGACCGCTGCCCTG

GTGGCCTTGGGTGTCCTCTACGCCGACCGCAGAGGGAAGCAGCTGCCACGCCTTGCTAGC

CGGCTGTGCTTCTTACAGGAGGAGAGGACCTTTGTAAAACGAAAACCCCGAGGGATCCCA

GAGGCCCAAGAGGTGAGCGAGGTCTGCACCACCCCTGGCTGCGTGATAGCAGCTGCCAGG

ATCCTCCAGAACATGGACCCGACCACGGAACCGTGTGACGACTTCTACCAGTTTGCATGC

GGAGGCTGGCTGCGGCGCCACGTGATCCCTGAGACCAACTCAAGATACAGCATCTTTGAC

GTCCTCCGCGACGAGCTGGAGGTCATCCTCAAAGCGGTGCTGGAGAATTCGACTGCCAAG

GACCGGCCGGCTGTGGAGAAGGCCAGGACGCTGTACCGCTCCTGCATGAACCAGAGTGTG

ATAGAGAAGCGAGGCTCTCAGCCCCTGCTGGACATCTTGGAGGTGGTGGGAGGCTGGCCG

GTGGCGATGGACAGGTGGAACGAGACCGTAGGACTCGAGTGGGAGCTGGAGCGGCAGCTG

GCGCTGATGAACTCACAGTTCAACAGGCGCGTCCTCATCGACCTCTTCATCTGGAACGAC

GACCAGAACTCCAGCCGGCACATCATCTACATAGACCAGCCCACCTTGGGCATGCCCTCC

CGAGAGTACTACTTCAACGGCGGCAGCAACCGGAAGGTGCGGGAAGCCTACCTGCAGTTC

ATGGTGTCAGTGGCCACGTTGCTGCGGGAGGATGCAAACCTGCCCAGGGACAGCTGCCTG

GTGCAGGAGGACATGATGCAGGTGCTGGAGCTGGAGACACAGCTGGCCAAGGCCACGGTA

CCCCAGGAGGAGAGACACGACGTCATCGCCTTGTACCACCGGATGGGACTGGAGGAGCTG

CAAAGCCAGTTTGGCCTGAAGGGATTTAACTGGACTCTGTTCATACAAACTGTGCTATCC

TCTGTCAAAATCAAGCTGCTGCCAGATGAGGAAGTGGTGGTCTATGGCATCCCCTACCTG

CAGAACCTTGAAAACATCATCGACACCTACTCAGCCAGGACCATACAGAACTACCTGGTC

TGGCGCCTGGTGCTGGACCGCATTGGTAGCCTAAGCCAGAGATTCAAGGACACACGAGTG

AACTACCGCAAGGCGCTGTTTGGCACAATGGTGGAGGAGGTGCGCTGGCGTGAATGTGTG

GGCTACGTCAACAGCAACATGGAGAACGCCGTGGGCTCCCTCTACGTCAGGGAGGCGTTC

CCTGGAGACAGCAAGAGCATGGTCAGAGAACTCATTGACAAGGTGCGGACAGTGTTTGTG

GAGACGCTGGACGAGCTGGGCTGGATGGACGAGGAGTCCAAGAAGAAGGCGCAGGAGAAG

GCCATGAGCATCCGGGAGCAGATCGGGCACCCTGACTACATCCTGGAGGAGATGAACAGG

CGCCTGGACGAGGAGTACTCCAATCTGAACTTCTCAGAGGACCTGTACTTTGAGAACAGT

CTGCAGAACCTCAAGGTGGGCGCCCAGCGGAGCCTCAGGAAGCTTCGGGAAAAGGTGGAC

CCAAATCTCTGGATCATCGGGGCGGCGGTGGTCAATGCGTTCTACTCCCCAAACCGAAAC

CAGATTGTATTCCCTGCCGGGATCCTCCAGCCCCCCTTCTTCAGCAAGGAGCAGCCACAG

GCCTTGAACTTTGGAGGCATTGGGATGGTGATCGGGCACGAGATCACGCACGGCTTTGAC

GACAATGGCCGGAACTTCGACAAGAATGGCAACATGATGGATTGGTGGAGTAACTTCTCC

ACCCAGCACTTCCGGGAGCAGTCAGAGTGCATGATCTACCAGTACGGCAACTACTCCTGG

GACCTGGCAGACGAACAGAACGTGAACGGATTCAACACCCTTGGGGAAAACATTGCTGAC

AACGGAGGGGTGCGGCAAGCCTATAAGGCCTACCTCAAGTGGATGGCAGAGGGTGGCAAG

GACCAGCAGCTGCCCGGCCTGGATCTCACCCATGAGCAGCTCTTCTTCATCAACTACGCC

0 · · ·· · 0 0 0 • 0 0 · 0 000 0 · 0 000 0 00 0 0000 0 0 000 0 0 0 0 0 0 0 000

00 00 000 00 0

CAGGTGTGGTGCGGGTCCTACCGGCCCGAGTTCGCCATCCAATCCATCAAGACAGACGTC

CACAGTCCCCTGAAGTACAGGGTACTGGGGTCGCTGCAGAACCTGGCCGCCTTCGCAGAC

ACGTTCCACTGTGCCCGGGGCACCCCCATGCACCCCAAGGAGCGATGCCGCGTGTGGTAG

- 3 '

Tabulka 4: Protein-1 IGS5 („IGS5PROT1“) SEQ ID N0:4

MGKSEGPVGMVESAGRAGQKRPGFLEGGLLLLLLLVTAALVALGVLYADRRGKQLPRLAS

RLCFLQEERTFVKRKPRGIPEAQEVSEVCTTPGCVIAAARILQNMDPTTEPCDDFYQFAC

GGWLRRHVIPETNSRYSIFDVLRDELEVILKAVLENSTAKDRPAVEKARTLYRSCMNQSV

IEKRGSQPLLDILEWGGWPVAMDRWNETVGLEWELERQLALMNSQFNRRVLIDLFIWND

DQNSSRHIIYIDQPTLGMPSREYYFNGGSNRKVREAYLQFMVSVATLLREDANLPRDSCL

VQEDMMQVLELETQLAKATVPQEERHDVIALYHRMGLEELQSQFGLKGFNWTLFIQTVLS

SATKIKLLPDEEt/WYGIPYLQNLENIIDTYSARTIQNYLVWRLVLDRIGSLSQRFKDTRV

NYRKALFGTMVEEVRWRECVGYVNSNMENAVGSLYVREAFPGDSKSMVRELIDKVRTVFV

ETLDELGWMDEESKKKAQEKAMSIREQIGHPDYILEEMNRRLDEEYSNLNFSEDLYFENS

LQNLKVGAQRSLRKLREKVDPNLWIIGAAWNAFYSPNRNQIVFPAGILQPPFFSREQPQ

ALNFGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFDKNGNMMDWWSNFSTQHFREQSECMIYQYGNYSW

DLADEQNVNGFNTLGENIADNGGVRQAYKAYLKWMAEGGKDQQLPGLDLTHEQLFFINYA

QVWCGSYRPEFAIQSIKTDVHSPLKYRVLGSLQNLAAFADTFHCARGTPMHPKERCRVW

Tabulka 5: DNA-2 IGS5 („IGS5DNA2“) SEQ ID N0:5

5'ATGGGGAAGTCCGAAGGCCCAGTGGGGATGGTGGAGAGCGCCGGCCGTGCAGGGCAGAAG

CGCCCGGGGTTCCTGGAGGGGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGTGACCGCTGCCCTG

GTGGCCTTGGGTGTCCTCTACGCCGACCGCAGAGGGATCCCAGAGGCCCAAGAGGTGAGC

GAGGTCTGCACCACCCCTGGCTGCGTGATAGCAGCTGCCAGGATCCTCCAGAACATGGAC

CCGACCACGGAACCGTGTGACGACTTCTACCAGTTTGCATGCGGAGGCTGGCTGCGGCGC

CACGTGATCCCTGAGACCAACTCAAGATACAGCATCTTTGACGTCCTCCGCGACGAGCTG

GAGGTCATCCTCAAAGCGGTGCTGGAGAATTCGACTGCCAAGGACCGGCCGGCTGTGGAG • · • · » • ·· ·

AAGGCCAGGACGCTGTACCGCTCCTGCATGAACCAGAGTGTGATAGAGAAGCGAGGCTCT

CAGCCCCTGCTGGACATCTTGGAGGTGGTGGGAGGCTGGCCGGTGGCGATGGACAGGTGG

AACGAGACCGTAGGACTCGAGTGGGAGCTGGAGCGGCAGCTGGCGCTGATGAACTCACAG

TTCAACAGGCGCGTCCTCATCGACCTCTTCATCTGGAACGACGACCAGAACTCCAGCCGG

CACATCATCTACATAGACCAGCCCACCTTGGGCATGCCCTCCCGAGAGTACTACTTCAAC

GGCGGCAGCAACCGGAAGGTGCGGGAAGCCTACCTGCAGTTCATGGTGTCAGTGGCCACG

TTGCTGCGGGAGGATGCAAACCTGCCCAGGGACAGCTGCCTGGTGCAGGAGGACATGATG

CAGGTGCTGGAGCTGGAGACACAGCTGGCCAAGGCCACGGTACCCCAGGAGGAGAGACAC

GACGTCATCGCCTTGTACCACCGGATGGGACTGGAGGAGCTGCAAAGCCAGTTTGGCCTG

AAGGGATTTAACTGGACTCTGTTCATACAAACTGTGCTATCCTCTGTCAAAATCAAGCTG

CTGCCAGATGAGGAAGTGGTGGTCTATGGCATCCCCTACCTGCAGAACCTTGAAAACATC

ATCGACACCTACTCAGCCAGGACCATACAGAACTACCTGGTCTGGCGCCTGGTGCTGGAC

CGCATTGGTAGCCTAAGCCAGAGATTCAAGGACACACGAGTGAACTACCGCAAGGCGCTG

TTTGGCACAATGGTGGAGGAGGTGCGCTGGCGTGAATGTGTGGGCTACGTCAACAGCAAC

ATGGAGAACGCCGTGGGCTCCCTCTACGTCAGGGAGGCGTTCCCTGGAGACAGCAAGAGC

ATGGTCAGAGAACTCATTGACAAGGTGCGGACAGTGTTTGTGGAGACGCTGGACGAGCTG ggctggatggacgaggagtccaagaagaaggcgcaggagaaggccatgagcatccgggag

CAGATCGGGCACCCTGACTACATCCTGGAGGAGATGAACAGGCGCCTGGACGAGGAGTAC

TCCAATCTGAACTTCTCAGAGGACCTGTACTTTGAGAACAGTCTGCAGAACCTCAAGGTG

GGCGCCCAGCGGAGCCTCAGGAAGCTTCGGGAAAAGGTGGACCCAAATCTCTGGATCATC

GGGGCGGCGGTGGTCAATGCGTTCTACTCCCCAAACCGAAACCAGATTGTATTCCCTGCC

GGGATCCTCCAGCCCCCCTTCTTCAGCAAGGAGCAGCCACAGGCCTTGAACTTTGGAGGC

ATTGGGATGGTGATCGGGCACGAGATCACGCACGGCTTTGACGACAATGGCCGGAACTTC

GACAAGAATGGCAACATGATGGATTGGTGGAGTAACTTCTCCACCCAGCACTTCCGGGAG

CAGTCAGAGTGCATGATCTACCAGTACGGCAACTACTCCTGGGACCTGGCAGACGAACAG

AACGTGAACGGATTCAACACCCTTGGGGAAAACATTGCTGACAACGGAGGGGTGCGGCAA

GCCTATAAGGCCTACCTCAAGTGGATGGCAGAGGGTGGCAAGGACCAGCAGCTGCCCGGC

CTGGATCTCACCCATGAGCAGCTCTTCTTCATCAACTACGCCCAGGTGTGGTGCGGGTCC

TACCGGCCCGAGTTCGCCATCCAATCCATCAAGACAGACGTCCACAGTCCCCTGAAGTAC

AGGGTACTGGGGTCGCTGCAGAACCTGGCCGCCTTCGCAGACACGTTCCACTGTGCCCGG

GGCACCCCCATGCACCCCAAGGAGCGATGCCGCGTGTGGTAG - 3 ' • · · · · · • · · · 9 9 9

4 4 4 4 4

9 49449 4

4 4 4 4 9 449

Tabulka 6: Protein-2 IGS5 („IGS5PROT2“) SEQ ID N0:6

MGKSEGPVGMVESAGRAGQKRPGFLEGGLLLLLLLVTAALVALGVLYADRRGIPEAQEVS evcttpgcviaaarilqnmdpttepcddfyqfacggwlrrhvipetnsrysifdvlrdel

EVILKAVLENSTAKDRPAVEKARTLYRSCMNQSVIEKRGSQPLLDILEWGGWPVAMDRW

NETVGLEWELERQLALMNSQFNRRVLIDLFIWNDDQNSSRHIIYIDQPTLGMPSREYYFN

GGSNRKVREAYLQFMVSVATLLREDANLPRDSCLVQEDMMQVLELETQLAKATVPQEERH

DVIALYHRMGLEELQSQFGLKGFNWTLFIQTVLSSVKIKLLPDEEVWYGIPYLQNLENI

IDTYSARTIQNTYLVWRLVLDRIGSLSQRFKDTRVNYRKALFGTMVEEVRWRECVGYVNSN

MENAVGSLYVREAFPGDSKSMVRELIDKVRTVFVETLDELGWMDEESKKKAQEKAMSIRE

QIGHPDYILEEMNRRLDEEYSNLNFSEDLYFENSLQNLKVGAQRSLRKLREKVDPNLWII

GAAWNAFYSPMRNQIVFPAGILQPPFFSKEQPQALNFGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNF

DKNGNMMDWWSNFSTQHFREQSECMIYQYGNYSWDLADEQNVNGFNTLGENIADNGGVRQ

AYKAYLKWMAEGGKDQQLPGLDLTHEQLFFINYAQVWCGSYRPEFAIQSIKTDVHSPLKY

RVLGSLQNLAAFADTFHCARGTPMHPKERCRVW

Všechny publikace, včetně, ale bez jakéhokoli omezení na patenty a patentové přihlášky, citované v této specifikaci, jsou zde vloženy jako odkazy, přičemž každá jednotlivá publikace specificky či jednotlivě zmíněná, která byla uvedena zde v citacích, je zde plně objasněna.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Klonování cDNA kódující nového člena skupiny metaloproteasy NEP/ECE, neprilysinu.

Příklad la. Nástin homologie klonování kódovací sekvence cDNA z IGS5.

Metaloproteasy podskupiny Ml3 jsou zahrnuty v metabolismu různých neuronových a hormonálních peptidů. Do této doby obsahuje tato podskupina neprilysin (NEP), enzym 1 přeměňující endothelin (ECE-1), ECE-2, Kell, Pex a XCE. Inhibitory NEP a ECE byly vyvinuty pro terapeutické použití například v kardiologii a gastroenterologii. Protože další členové této skupiny mohou být zajímavými cíly při studiu léčiv, homologické klonování bylo použito k identifikaci nových genů v lidském genomu.

Homologické klonování IGS5 bylo provedeno podle obecného popisu výše a podle experimentálních podrobností dále ilustrovaných v příkladech mezinárodní patentové přihlášky PCT/EP 00/11532, na kterou je zde odkázáno. Proces může být popsán následovně.

V databance exprimované sekvence derivátů (EST) byly detekovány sekvence, které obsahovaly malý otevřený čtecí rámec, který vykazoval podobnost k C-terminální části metaloproteasy podobné NEP/ECE. Na základě těchto sekvencí EST a opakujících se úsecích metaloproteas podobných NEP/ECE, jsme použili degenerativní PCR ke klonování celé sekvence cDNA z cDNA lidských plic, srdce a varlete.

Sekvence cDNA kódující glykosylovaný protein, pojmenovaný IGS5 nebo alternativně lidskou rozpustnou endopeptidasu (hSEP) vykazuje charakteristiky člena supiny Ml3. IGS5 vykazovala vysokou shodu sekvence aminokyselin k myší SEP (78%), myší, krysí a lidské NEP (54%) a k lidské ECE-1 (39%). V analogii se svázanou variantou SEP a SEP^A u myši jsme detekovali také dvě svázané verze IGS5, které se lišily v alternativním exonu 78bp. Tyto svázané formy kódovaly proteiny o 753 a 779 residuích. Delší forma obsahovala domnělé místo pro proteolytické štěpení sousedící s mezimembránovou vazbou. Tyto dvě svázané formy mohou proto představovat formu vázanou na membráně a rozpustnou formu proteinu IGS5.

Expresní analýza za použití mnohonásobné tkáňové analýzy typu dot blot a kvantitativní PCR odhalila expresi na řadě lidských tkání, s nejsilnější odezvou pozorovanou ve varleti. Exprese mRNA IGS5 byla také pozorována např. v prostatě, v tenkém střevě, žaludku, trakčníku, ledvině a mozku. Tyto dvě svázané varianty vykázaly odlišné expresní vlastnosti.

• · ···· ·· · · · · · • · ··· · · · · · · · ···· ·· ······· ·· ·· ·· ··· ·· ·

Funkční charakteristika potvrdila, že tento enzym je pravým členem skupiny neprilysinu a má aktivitu ECE.

Příklad lb. Přiřazení IGS5 se sekvencí proteinů členů skupiny metaloproteas NEP/ECE.

Pro sekvenci IGS5 originálně klonovanou (viz příklad 1), hledání homologie až do současnosti v databankách proteinů a translatovaných databankách DNA bylo provedeno za použití algoritmu BLAST (Altschul S.F. a spol. [1997], Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).

Tyto výzkumy prokázaly, že originálně získaný protein IGS5 byl nejvíce podobný (shoda 54 až 55% přes ± 700 residuí) myši, kryse a lidské neutrální endopeptidase (SW:NEP_MOUSE, přístupové číslo Q61391; SW:NEP_RAT, přístupové číslo P07861 a SW:NEP_HUMAN, přístupové číslo P08473). Toto přiřazení téměř úplné sekvence proteinu IGS5 k dalším členům skupiny NEP/ECE prokázalo obecně vztah IGS5 k metaloproteasám a s výhodou k metaloproteasám skupin NEP a/nebo ECE. Podle tohoto strukturního přiřazení bylo odvozeno, že IGS5 má funkčnost metaloproteas, které jsou zase zajímavé v kontextu některých dysfunkcí, potíží nebo nemocí u živočichů a lidí.

Příklad lc. Klonování fragmentů cDNA obsahujících kódování plné délky sekvence IGS5.

Aby se získala další sekvence cDNA IGS5, bylo provedeno další kolo reakcí RT-PCR na RNA z lidských plic za podmínek popsaných výše, při použití specifického reversního primeru IGS5. Vzniklá forma obsahovala otevřený čtecí rámec, který začínal iniciačním kodonem „ATG“ a kódoval protein, který vykazoval vysokou shodu s N-terminální sekvencí myšího proteinu SEP.

Kompletace sekvencí DNA všech isolovaných klonů ukázala přítomnost dvou typů sekvencí cDNA, které se odlišovaly přítomností nebo absencí segmentu 78 bp, který byl původně identifikován v genomovém klonu IGS5/S1. Tyto dvě sekvence byly pravděpodobně • · · · ·· • · · · · · · vytvořeny dvěma svázanými molekulami RNA. Nejdelší přepis obsahuje otevřený čtecí rámec o 2337 nukleotidech (kódující protein o 779 residuích), zatímco kratší přepis obsahuje otevřený čtecí rámec o 2259 nukleotidech (kódující protein o 753 residuích). Na kódovací sekvenci a sekvenci proteinu dlouhé formy se odkazuje jako na IGS5DNA1 (znázorněna v SEQ ID NO:3, 2340 bp včetně stopovacího kodonu) a IGS5PROT1 (SEQ ID NO:4), zatímco na kódovací sekvenci a sekvenci proteinu kratší formy je odkazováno jako na IGS5DNA2 (znázorněna v SEQ ID NO:5, 2262 bp včetně stopovacího kodonu) a IGS5PROT2 (SEQ ID NO.6). Ve směru stanoveného methioninového iniciačního kodonu v IGS5DNA1 a IGS5DNA2 je přítomen další vnitřní methioninový kodon v kodonové poloze 10. Ačkoli první methioninový kodon byl vybrán, aby se stal iniciačním kodonem (nebo přímo výjimečným), iniciace přepisu v poloze 10 kodonu nemohla být vyloučena, protože oba methioniny se objevují v ekvivalentní vhodné iniciaci „Kozák“ přepisového kontextu (Kozák M., Gene [1999]: 234: 187-208). Hydropathinní analýza (Kyte J. a spol, J. Mol. Biol. [1982] 157: 105-132; Klein P. a spol., Biochim. Biophys. Acta [1985] 815: 468-476) sekvencí

IGS5PROT1 a IGS5PROT2 ukázala přítomnost jednoduché mezimembránové oblasti mezi články 22 až 50. To indikuje, že IGS5PROT1 a IGS5PROT2 jsou proteiny integrální membrány typu II a mají tak membránovou topologii podobnou dalším členům skupiny proteinů NEP/ECE.

Příklad ld. Přiřazení sekvence proteinů IGS5 z příkladu lc k sekvenci proteinů členů skupiny metaloproteas NEP/ECE.

Pro sekvenci IGS5, klonovanou v příkladu lc, bylo provedeno hledání databanky proteinů a databanky přepisové DNA až do současnosti za použití algoritmu BLAST (Altschul S.F. a spol., Nucleic Acid Res. [1997] 25: 3389-3402). Toto hledání ukázalo, že IGS5PROT1 byl nejvíce shodný (shoda 75% přes 778 svázaných residuí) se SEP u myši • 0 «· 0 0 · 00 0 • 0 0 · 0 0 0 0 · ·· ·*·· 00 0 0000 0 0 000 0 0 0 0 0 0 0 000 (vstup GenBank číslo AF157105) a také ukázalo 54 až 55 % shodu přes 696 svázaných residuí k myším, krysím a lidským neutrálním endopeptidasám (SW:NEP_MOUSE, přístupové číslo Q61391; SW:NEP_RAT, přístupové číslo P07861 a SW:NEP_HUMAN, přístupové číslo P08473). Homologické hledání IGS5PROT2 ukázalo, že tato sekvence byla nejvíce shodná (shoda 78% přes 752 svázaných residuí k myší SEP^A (vstup GenBank číslo AE157106). V analogii s myšími proteiny SEP a SEP^A se očekávalo, že IGS5PROT1 a IGS5PROT2 představují rozpustnou a na membráně vázanou formu proteinu IGS5. To bylo potvrzeno přítomností dvojbazických residuí (KRK) zakódovaných na konci 3’ alternativně svázaného exonu 78bp.

Tak toto srovnání kompletní sekvence proteinů IGS5 s dalšími členy skupiny NEP/ECE ukazuje vztah IGS5 k metaloproteasám NEP/ECE obecně a s výhodou pak ke členům skupiny SEP a NEP. Z tohoto strukturního přiřazení se vyvozuje, že protein IGS5 má funkčnost metaloproteas, která je zase zajímavá v kontextu některých dysfunkcí, potíží nebo nemocí u živočichů a lidí.

Příklad 2. Exprese a čištění rozpustné ektodomény ukončené pomocí HIS u lidské IGS5.

Cílem tohoto pokusu bylo produkovat rozpustný protein IGS5 za použití expresního systému bakuloviru. Rekombinantní bakulovirus byl konstruován tak, že byla exprimována ektodoména IGS5, ukončená koncem Hise, po infekci buněčné linie Sf9. Rozpustný protein IGS5 pak byl čištěn z media kultury dvoukrokovým postupem, zahrnujícím afinitní chromatografii na lektinu z čočky a Zn-IMAC tak, jak to bylo provedeno v oboru pro HiséECE-1.

♦ · · • · · ·· · · · · · • ··· · · · · · · · ··· • · · · · ··· • · · · · · ··· *· ·

Příklad 2a. Experimentální postup.

Kinetická expresní analýza.

519 buněk (IGCL 83.0), exponenciálně rostoucích v suspenzi ve Spinerově baňce při 27°C v mediu TC100 (JRH Biosciences, katalogové číslo 56941), za přídavku 10% inaktivovaného plodového telecího séra (Gibco BRL, katalogové číslo 10 084 168), bylo shromážděno nízkorychlostní centrifugací a přidáno k 5.10⁵ buněk/Fk (25 cm²) v mediu TC100 bez séra. Byly přidány kandidátské rekombinantní klony viru při znásobení infekce (MOI) 3 pfu/buňku a kultury buňky/virus byly následně inkubovány při 27°C. Buňky a kondiciované medium (CM) byly sklizeny při 24, 48 a 72 h po infekci pomocí 2 postupnými centrifugacemi při nízké rychlosti. Vzorky byly analyzovány gelovou elektroforézou SDS PAGE a pomocí analýzy elektroforézou typu Western blotting.

..... Deglykosylační studie,

Ke vzorkům bylo přidáno SDS do konečné koncentrace 1% a byly inkubovány při 95°C 5 minut. Po přídavku 1 objemu 2x inkubačního pufru (250 mM fosfátového pufru, 50 mM EDTA, 5% N-oktylglykosidu, 1% 2-merkaptoethanolu) a po dalším 5 min inkubační periodě při 95°C, byl vzorek ochlazen na 37°C. Byla přidána 1 U N-glykosidasy F (Boehringer Mannheim, katalogové číslo 1 365 177) a po celonoční inkubaci při 37°C byl vzorek redukován 100 mM DTT (konečná koncentrace).

Preparativní produkce.

519 buněk (IGCL 83-2), exponenciálně rostoucích v suspenzi ve Spinerově baňce při 27°C v mediu TC100 (JRH Biosciences, katalogové číslo 56941), za přídavku 10% inaktivovaného plodového telecího séra (Gibco BRL, katalogové číslo 10 084 168), bylo shromážděno nízkorychlostní centrifugací a znovu suspendováno při hustotě 2.10⁶ buněk/ml v mediu TC100, do kterého bylo přidáno 0.013 TIU aprotininu/ml (Pentex). Rekombinantní virus IGBV73 byl přidán k buňkám při znásobení infekce (MOI) 2.25 pfu/buňku (místo MOI

9· · • · · · • Φ ΦΦΦΦ*

ΦΦΦ

ΦΦ Φ kvůli nízkému titru primární banky viru). Suspenze buňky/virus byla následně inkubována při 27°C ve skleněných baňkách na roler (3 x 500 ml / 1260 cm²) po dobu 72 h. CM (1.5 1) byl poté oddělen od buněk a buněčných trosek dvěma následnými centrifugacemi při nízké rychlosti. Poměrné díly byly vzaty pro kontrolu kvality analýzou Western blot a pro určení hladin endothelinu.

Příklad 2b. Výsledky Kinetika exprese.

Kinetika exprese tri kandidátských rekombinantních klonů viru byla studována pomocí analýzy Western blot. Elektroforéza Western blot ukázala jasný pás u přibližně 81 kDa v CM všech kandidátských klonů, což odpovídá teoretické molekulové hmotnosti celého proteinu (81.2 kDa). Pro buněčný štěp byl SDS gel přetížený, a proto nemohl poskytnout žádný závěr. Hladiny exprese všech 3 klonů měly maximum při 48 až 72 h po infekci. Klon 2 byl vybrán pro další amplifikaci a byl uložen jako IGBV73. Optimální doba sklizně byla stanovena na 72 h po infekci.

Deglykosylační studie.

Sekvence rozpustného proteinu IGS5 obsahuje 8 potenciálních N-glykosylačních míst. Protože protokol o čištění zahrnuje vazbu cukerných residuí na vzorky CM a buněčných lysátů na lektinové afinitní koloně, byly sklizně po 72 h po infekci použity pro deglykosylační studie s N-glykosidasou F, aby se zkontrolovalo, zda rekombinantní rozpustný protein HÍS6IGS5 je vskutku experimován jako glykosylovaný protein.

Analýza elektroforézou Western blot vzorků CM ošetřených N-glykosidasou F a neošetřených standardů ukazuje posun v molekulární hmotnosti, když vzorky jsou deglykosylované, čímž se prokazuje, že rozpustný lidský IGS5, ukončený pomocí His, je exprimován jako glykosylovaný protein. V neošetřeném buněčném lysátu mohou být • · 0 · 0 0 · · 0 0 0

0 0 0 · · · 0000

0 000 0 0 0 0 0 0 0 000

0000 000 οζ ·♦ ·· ·· ··· ♦· · objeveny 3 proteinové pásy o velikosti přibližně 80 až 82 kDa. Po ošetření N-glykosidasou F zůstává jeden z pásů o velikosti přibližně 80 kDa viditelný, což odpovídá nejnižšímu pásu molekulové hmotnosti neošetřených vzorků.

Preparativní produkce.

Množství 1.5 litru CM bylo sklizeno z hmyzích buněk Sf9, infikovaných pomocí IGBV73, 72 h po infekci. Obsah endotoxinu byl stanoven hodnotou 0.0847 EU/ml CM. Analýza Western blot ukázala jasný pás u přibližně 81 kDa v CM, což odpovídá molekulové hmotnosti celého rozpustného IGS5 s ukončením His. Když se to porovná se vzorky buněčných lysátů, které vykazují 3 proteinové pásy, proteinový pás CM odpovídá slabšímu střednímu pásu molekulových hmotností, přítomnému v buňkách.

Příklad 3 Čištění IGS5 .

Příklad 3a. Experimentální postupy.

Ošetření vzorku předem.

tableta kompletu bez EDTA (EFC; Roche Biochemicals, katalogové číslo 1873580) byla přidána k 300 ml čištěných Bakulo CM. 1TEPES, glycerol a Tween 20 byly přidány ke konečné koncentraci 20 mM, 5% (obj./obj.) a 0.005% (hm./obj.). Hodnota pH CM byla upravena na 7.4 a vzorek byl filtrován membránovými filtry Durapore, 0.2 μ GV). Všechny kroky čištění byly prováděny při 4 °C.

Afinitní chromatografie na lektinu z čočky.

Vzorek bakulo byl během noci nanášen rychlostí 0.3 ml/min na 5 ml lentil lectin sepharosovou pryskyřici v koloně Cl0/10 (Pharmacia), která byla ekvilibrována v pufru A (20 mM Hepesu, 150 mM NaCl, 5% glycerolu, 0.005% Tweenu 20) za přídavku 1 tablety EFC / 500 ml. Kolona byla promývána ekvilibračním pufrem, dokud absorpce u 280 nm nedosáhla základní linie a navázaný protein byl eluován aplikací pufru A obsahujícího 0.5 Μ afc · methylpyranoside. Kolona byla regenerována aplikací 100 mM acetátu, 500 mM NaCl, pH 5.0. Eluční a regenerační kapaliny byly ručně shromážděny a frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE na 12.5% Phastově gelu (Pharmacia) a barvení stříbrem. Předem obarvené značkovače (Gibco) byly použity jako standardy s relativní molekulovou hmotností (Mr).

Afinitní chromatografie se zakotveným kovem (IMAC) a dialýza.

ml činidla Chelating HiTrap (Pharmacia) byl nasycen ionty zinku tak, jak bylo popsáno výrobcem a ekvilibrován s pufrem B (20 mM Hepesu, 100 mM NaCl, 5% glycerolu, 0.005% (hm./obj.) Tweenu 20, pH 7.2). Eluční frakce 1 a 2 byly odděleně naneseny rychlostí 0.5 ml/min na kolonu HiTrap (IMAC vstup A a IMAC vstup B). Slepý pokus byl též proveden kvůli srovnání chromatografických absorpčních profilů. Kolona byla promyta pufrem B až po dosažení základní linie a navázaný protein byl eluován aplikací gradientu imidazolu (20, 50, 100 a 200 mM) v pufru B. Frakce byly shromážděny ručně. KolonaíMAC byla regenerována aplikací 20 mM Hepesu, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, pH 7.2. Eluční a regenerační frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE (12.5% Phastových gelů,

Pharmacia) a barvení stříbrem. Imidazolový pool, 200mM, byl přenesen do ploché kazety (MWCO 10.000, Pierce) a dialyzován přes noc proti pufru B (130násobný přebytek, bez regenerace pufru).

Určení množství proteinu.

Množství rozpustného IGSS v dialyzační frakci bylo stanoveno metodou mikro-BCA (Pierce). BSA byla zahrnuta jako standard.

Charakterizace proteinu.

Dialyzovaný bakulo IGSS byl biochemicky charakterizován (1) pomoci SDS-PAGE za redukčních a neredukčních podmínek a (2) pomocí analýzy Western blot s anti Hissubstituovaným mAb (21E1B4, IG) s následnou inkubací s králičí anti-myší Ig, značenou • · · · · · · · « · · ···· · · · · · · · • · ··· · · · · · · · ··» f . ·· · ······ θ4 ·· ·· ·· ♦ ·· ·· ♦ alkalickou fosfatasou (Dako) a detekcí pomocí barvení NBT/BCIP. Status glykosylace rozpustného IGS5 byl ověřen ošetřením PGNasou F (Biorad).

Příklad 3b. Výsledky.

Lektinový eluění profil s 0.5 M α-methylpyranosidem měl za následek výrazný signál.

Protékající, promývací a eluční roztok byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem. Největší množství proteinů bylo získáno z protékajících roztoků a pás kandidátské IGS5 s molekulovou hmotností asi 85000 byl nalezen v elučních roztocích 1 a 3. Analýza elektroforézouWestern blot lektinové chromatografie mAb s anti-His substitucí ukázala, že rozpustný protein hIGS5 (Mr ~ 85000) je zcela vázán na pryskyřici v afinitní chromatografii a že protein se substitucí His se získává během celého elečního signálu, ale zejména ve frakci 1 a 2. Eluění frakce 1 a 2 afinitní chromatografie byly dále procesovány na koloně zinek-IMAC (nástřiky A a B). Vázané proteiny byly eluovány imidazolovým gradientem. Analýza SDSPAGE a barvení stříbrem ukázaly, že hlavní množství kontaminujících proteinů bylo eluováno aplikací 20 mM a 50 mM eluční imidazolové fáze. Protein hIGS5 byl získán pomocí 100 mM a 200 mM imidazolových elučních fází. 100 mM imidazolová eluce, která obsahuje maximálně 10% hIGS5 v eluátu, je stále kontaminovaná proteinem s Mr > 115000. Pás IGS5 ve 100 mM je také zdvojeným pásem. Zůstává k ověření, zda slabý horní pás, který představuje méně než 10% dubletu, je zbytkový bakulový kontaminant nebo isoforma IGS5, nebo zda nižší (intensivní) pás je degradaění produkt s karboxylovým koncem. Pás 85 kDa ve 200 mM imidazolové frakce je jednotným pásem v SDS-PAGE, který reaguje s mAb s anti his substituentem.

Barvení stříbrem nevykazuje žádný rozdíl v čistotě mezi materiálem hIGS5, získaným z pokusu A a pokusu B IMAC. To naznačuje, že frakce 1 a frakce 2 lektinového eluátu může ·· ·· ··

9 9 9 4 • · · · · • 999 99 « v budoucnu být frakcionována a procesována současně v jediném pokusu na koloně zinekIMAC.

Shodné vlastnosti pásu byly pozorovány v pokusu na gelu SDS-PAGE obarveném pomocí Coomassie za redukujících a neredukujících podmínek, což indikovalo, že čištěný hIGS5 neobsahuje oligomery tvořené na základě disulfidů. Ošetření pomocí PGNasy F redukovalo Mr na SDS-PAGE o asi 5 kDa. Tento malý posun u hIGS5, exprimované bakulem, po ošetření endoglykosidasou se silně odlišoval od mgračního posunu, který byl pozorován u myšího SEP exprimovaného CHO (Ikeda a spol., JBC, 274, 32469, 1999).

Když se začalo ze 300 ml bakula CM, bylo získáno 340 pg ektodomény hIGS5, více než 95% čisté, se substituentem His pomocí dvoukrokového čistícího procesu (tj. výtěžek asi 1 mg /1). Čištěný produkt byl pak použit v testu enzymové inhibice tak, jak ukazuje následující příklad.

Příklad 4. Test enzymové inhibice IGS5.

Enzymová aktivita polypeptidů IGS5 podle vynálezu byla testována s ohledem na metabolismus biologicky aktivních peptidů. S výhodou bylo testováno, zda tyto polypeptidy IGS5 mohou působit na různé vazoaktivní peptidy známé v oboru, jako např. na atriálni natriuretický peptid (ANP), bradykinin, velký endothelin (big-ET-1), endothelin (ET-1), substanci P a angiotensin-1. V kontextu tohoto vynálezu bylo s výhodou testováno, zda ektodoména IGS5, která je novou lidskou metaloproteasou, hydrolyzuje řečené vazoaktivní peptidy. Pro srovnání byla zkouška také prováděna pro známého člena skupiny metaloproteas, který byl popsán dříve jako rozpustná vylučovaná endopeptidasa (SEP) Emotem a spol. (J. Biol. Chem., díl 274 (1999): str. 32469-32477). Dále bylo testováno, zda aktivita IGS5, konvertovat analog big-ET-1 (tak zvaný 17 aa big-ET-1), může být inhibována předmětnými sloučeninami, které byly použity k určení inhibičních vlastností se zřetelem k enzymu, který

4« •

• · • 449 «9 99 9« 9

4 9 9 9 9 94

4 4 4 4 4 4 • 9 944 9 4 9 9

4 9 9 4 9

44 94 444 má charakteristiky ECE a/nebo NEP. Látky, které byly použity k testování inhibice aktivity IGS5 na analogy big-ET-1, byly látka fosforamidon, která inhibuje endopeptidasy s charakteristikou NEP, látka thiorfan, která inhibuje selektivně NEP a látka CGS-35066, která je duálním inhibitorem NEP/ECE.

Příklad 4a. Materiály.

Enzym: IGS5 (sol hu)(his)6; nebo ekotodoména IGS5 derivovaná His6;

Skladovací roztok: 53 pg/ml ve 20 mM HEPESU pH 7.2, 5% glycerol, 0.005% Tweenu 20, 100 ml NaCl, čistota >99%; skladování při 4 °C.

Pracovní roztok: skladovací roztok ředěný testovacím pufrem na 10 pg/ml.

Substrát: Mca-Asp-Ile-Ala-Trp-Phe-Dpa-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-LeuGlv-COOH;

Fluorescenčně značený analog bi-ET-1;

Mca = 7-Methoxykumarin-4-yI;

Dpa = 3-[2,4/Dinitrofenyl]-L-2,3-diaminopropanoyl;

Skladovací roztok: 100 μΜ v testovacím pufru; skladování při -20 °C. (komerčně dostupný od dodavatele: Polypeptide Laboratories, Wolfenbiittel, Německo)

Testovací pufr: 100 mM Tris pH 7.0, 250 mM NaCl.

Všechny testované látky byly rozpuštěny v DMSO v koncentraci 10 mM a byly dále ředěny testovacím pufrem.

β ·· ·

Příklad 4b. Testovací postup.

Množství 70 μΐ testovacího pufru, 10 μΐ pracovního roztoku enzymu a 10 μΐ roztoku testované látky byly smíchány v Eppendorfově nádobce a preinkubovány při 37 °C během 15 minut. Pak bylo přidáno 10 μΐ skladovacího roztoku substrátu a reakční směs byla inkubována při 37 °C během 60 minut, aby proběhla enzymatická hydrolýza. Následně byla enzymatická reakce ukončena zahřátím na 95 °C po dobu 5 minut. Po centrifugaci (Heraeus Bioíuge B, 3 min) byl supernatant podroben HPLC analýze.

Příklad 4c. HPLC metoda.

Za účelem oddělení zbytkového substrátu od produktů štěpeni byla použita metoda HPLC na reversní fázi s použitím Cis RP kolony Nucleosil 300/5, CC 125/4, a 08 předkolony s náplní Nucleosil 100/5, CC 8/4 (komerčně dostupných od Macherey-Nagel, Duřen, Německo). Tak bylo nastříknuto 60 μΐ reakčního vzorku, získaného v příkladu 7b, do HPLC a kolona byla eluována při průtoku 1 ml/min pomocí následujícího gradientu a roztoků: Roztok A: 100 % vody + 0.5 M H₃PO₄, pH = 2.0

Roztok B: 100 % acetonitrilu + 0.5 Μ H3PO4 až 2 min 20 % B až 6 min 20 až 60 % B až 8 min 60 % až 10 min 60 až 90 % B až 13 min 90% až 15 min 90 až 100 % B

Peptidy byly detekovány při absorbci 214 nm a flourescenčně s excitační vlnovou délkou 328 nm a emisní vlnovou délkou 393 nm.

Příklad 4d. Výpočty.

Vzrůstající fluorescenční signál píku peptidu s neznačeným fluoroforem Mca v HPLC po hydrolýze byl vzat za základ všech výpočtů.

Tento signál byl srovnán pro vzorky s inhibitorem a bez něj a % inhibice byla vypočtena na základě příslušných ploch píků.

/0 inhlblCe 100*(l-Ajnhjbice/Akontrola)

Všechny vzorky byly analyzovány dvakrát a použita byla průměrná hodnota.

Standardní inhibitor (10 nM a 100 nM fosforamidonu) a kontrola rozpouštědlem byly použity u každé analýzy.

Příklad 4e. Výsledky.

S ohledem na polypeptidy IGS5 podle tohoto vynálezu, výsledky příkladu 4 ukazují, že tyto polypeptidické metaloproteasy IGS5 hydrolyzují in vitro řadu vazoaktivnich peptidů známých v tomto oboru. Výsledky hydrolýzy při srovnání s aktivitou SEP jsou znázorněny v Tabulce 7. Z těchto výsledků vyplývá, že IGS5 může být částečně zahrnuta v metabolismu řečených biologicky vazoaktivnich peptidů.

• · · • · · · • · · · · · · • · · · · · · · · • · · · ··· · • · 999 9 · · · · · • · 9 9 9 9 9 9 9

99 99 999 99 9

Tabulka 7: Hydrolýza vazoaktivních peptidů pomocí polypeptidů IGS5 v porovnání k SEP (rozpustné vylučované endopeptidase).

Vazoaktivní peptid	% Hydrolýzy polypeptidem IGS5	% Hydrolýzy pomoci SEP (Emoto a spol.)
	Podmínky.	Podmínky.
	100 pg polypeptidu IGS5	lOpgSEP
	0.5 μΜ substrát; 2 h, 37°C.	0.5 μΜ substrát; 12 h, 37°C.
ANP	5 (80*)	>95
Bradykinin	100 (62**)	>95
ET-1	<30	92
Substance P	100	>95
Angiotensin I	15***	>95
17 aa big-ET-1****	41	n.d.

* 500 pg polypeptidu IGS5 ** 10 pg polypeptidu IGS5 *** Degradace angiotensinu I namá za následek tvorbu angiotensinu II **** 17 aa big-ET-1 byl použit jako analog přírodního big-ET-1; hydrolyzující aktivita

IGS5 byla též detekována při použití přírodního big-ET-1, ale nemohla být kvantifikována v důsledku potíží s detekci v HPLC.

Příklad 5. Inhibiční test enzymu NEP.

Neutrální endopeptidasa (E.C.3.4.24.11) byla připravena z ledvinové kůry prasat podle metody, kterou popsal Gee a spol. (Biochem J 1985 květen 15; 228(1): 119-26) a čištěna podle Reltona a spol. (Biochem J 1983 prosinec 1; 215(3): 519-23). Pro test inhibice enzymu • · · · · • 0 · · · • · · · · · 0 0 0 0 0

0 0 0

• · · 0 000 bylo použito 10 ng čištěného enzymu, 20 μΜ substrátu (methionin-enkefalin) a bylo použito různých koncentrací inhibitoru. Testovací pufr byl 50 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan/HCl pH 7.4, celkový objem při testu byl 100 μΐ. Po preinkubační periodě 5 min enzymu a inhibitoru byl přidán substrát a následně byla započata druhá inkubační fáze pro hydrolýzu substrátu indukovanou enzymem při 37 °C po dobu 30 min. Enzymatická reakce byla ukončena zahřátím na 95 °C po dobu 5 min. Po centrifugaci byl supernatant podroben HPLC. Produkty enzymatické hydrolýzy substrátu byly odděleny od přírodního substrátu metodou HPLC a inhibiční síla vypočtena srovnáním ploch signálů produktů s plochami signálů přírodního substrátu jak pro vzorky s inhibitorem, tak bez něj (kontrola). Srovnávací pokusy bez enzymu, kontroly bez inhibitoru, vzorky s inhibičním rozpouštědlem místo inhibitoru a vzorky se standardním inhibitorem byly přidány ke každé analýze.

Dodavatel materiálů:

NEP: Dr. Philippe Crine, Univ. of Montreal, Kanada

Methionin-enkefalin: Sigma, Deisenhofen, Německo

Příklad 6. Inhibiční test enzymu ECE.

Rekombinantní lidský enzym-1, ukončený COOH, derivovaný His6, přeměňující endothelin, byl exprimován v buňkách Sf9. Čištění bylo prováděno afinitní chromatografií. Inhibiční test enzymu zahrnoval enzym (2.8 pg), 5 pg substrátu (mírně modifikovaného velkého endothelinu-1, zkráceného o 17 aminokyselin), inhibitor při různých konečných koncentracích a 100 mM Tris-pufru (Tris-hydroxymethylaminomethan/HCl, pH 7.0 + 150 mM NaCI) v konečném objemu 100 pl. Preinkubace enzymu s inhibitorem po dobu 15 min při 37 °C byla prováděna před přídavkem substrátu a inkubací (60 min při 37 °C) pro enzymovou hydrolýzu. Enzymatická reakce byla ukončena zahřátím na 95 °C po dobu 5 min. Po centrifugaci byl supernatant podroben HPLC za účelem oddělení produktů enzymatické « · hydrolýzy od nedegradovaného substrátu. Procenta inhibice byla vypočtena na základě ploch signálů produktů a neštěpeného substrátu pro inhibovanou reakci ve srovnání s kontrolou (bez inhibitoru). Srovnávací pokusy bez enzymu, kontroly bez inhibitoru, vzorky s inhibičním rozpouštědlem místo inhibitoru a vzorky se standardním inhibitorem byly přidány ke každé analýze.

Dodavatel materiálů:

ECE: Innogenetics, Gent, Belgie

Substrát pro ECE: Polypeptide, Wolfenbuttel, Německo

Příklad 7. Biochemický profil inhibičních látek k NEP/IGS5 ve srovnání k referenčním látkám.

Za účelem charakterizace a vyhodnocení farmakologických enzymatických vlastností IGS5 pro účely tohoto vynálezu, byl lidský protein IGS5 generován za použití hmyzích buněčných linií jako expresního systému tak, jak je popsáno v příkladech výše a byla testována řada potenciálních substrátů proteinu IGS5. Podle výsledků přikladu 4, bylo shledáno, že IGS5 účinně štěpí big-ET-1, ANP a bradykinin, čímž se potvrzuje, že tento nový protein je jemnou metaloproteasou se širokou substrátovou specifitou, která je obecnou vlastností metaloproteas a kterážto vlastnost byla nalezena u NEP, ECE-1 a také ACE. Mělo by se také poznamenat, že podle zjištění podle tohoto vynálezu, má proteolýza big-ET-1 pomocí IGS5 překvapivě za následek správnou tvorbu ET-1, např. big-ET-1 je správně štěpen mezi aminokyselinami Trp21 a Val22.

Dále byla zkoumána účinnost inhibičních látek metaloproteas a referenčních látek při potlačování konverze big-ET-1 na ET-1 tak, jak je popsáno v příkladu 7, za použití fluorescenčně značeného analogu big-ET-1. Postupy použité v testech enzymu jsou popsány • · · · · • · · « · · · · • · · · · · · 944994 4 4 94 v příkladech 4 s ohledem na IGS5, v příkladech 5 s ohledem na NEP a v příkladu 8 s ohledem na ECE.

Výsledky inhibičních testů enzymů jsou shrnuty v Tabulce 8. Je zajímavé, že fosforamidon, o němž je známo, že inhibuje konverzi big-ET-1 na ET-1 in vivo, inhibuje také IGS5 s vysokou účinností v biochemických testech použitých v tomto vynálezu a překvapivě je tato inhibice IGS5 fosforamidonem skutečně významně vyšší, než u ECE-1. Na rozdíl od toho, selektivní inhibitor NEP, thiorfan, jakož i selektivní inhibitor ECE-1, SM-19712 (monosodná sůl 4-chlor-N-{[(4-kyano-3-methyl-1 -fenyl- lH-pyrazol-5-yl)amino]karbonyl}benzensulfonamidu; Umekawa K, Hasegawa H, Tsutsumi Z, Sáto K, MatsumuraZ, Ohashi N, J Parmacol 2000 Sep; 84(1): 7-15; Discovery Research Laboratories I, Research Center, Sumitomo Pharmaceuticals Co, Ltd, Osaka, Japonsko) neovlivňují aktivitu IGS5 (Tabulka 8).

Tabulka 8: Biochemický profil inhibičních látek NEP/IGS5 a referenčních látek

Látka	IGS5	NEP	ECE-1
	IC50/nM	IC50/nM	IC50/nM
Fosforamidon	18	2.0	300
CGS-35066	1300	42	5
Thiorfan	> 1000	2.4	> 10000
SM-19712	>10000	> 1000	11.7
Látka Ia-2 jako	1.2	2.9	1000
aktivní léčivo
Látka Ia-2 jako	2.9	1.7	3279
aktivní léčivo
Látka Ia-2 jako	2.8	4	374
aktivní léčivo

• ·

• · · · α »» • · · ·0·0 • · · 0 00 00000 • · 0 0 0 0

000 00 0

Výsledky tohoto vynálezu jsou velmi překvapující, zvláště se zřetelem na následující fakta. Protože enzym-1 (ECE-1), přeměňující endothelin, byl klonován v roce 1984, začal být tento enzym obecně akceptován jako endopeptidasa odpovědná za fyziologickou konverzi big-ET-1 na ET-1. Avšak navzdory skutečnosti, že ECE-1 má schopnost štěpit big-ET-1, objevily se pochybnosti na základě novější zprávy, zda ECE-1 je jediným fyziologicky významným enzymem přeměňujícím endothelin, nebo aspoň argumenty o tom, že další enzymy musejí být zahrnuty v produkci ET-1. Protein IGS5 byl objeven jako metaloproteasa vysoce podobná NEP (shoda 54 %) a částečně méně podobná ECE-1 (shoda 39 %). Snaha charakterizovat enzymatické vlastnosti této nové metaloproteasy pomocí pokusů v příkladu 4, vyústila v hledání potenciálních substrátů, čímž se zjistilo, že substance P, bradykinin, bigET-1 a méně účinně ANP, angiotensin I a ET-1, jsou štěpeny pomocí IGS5. Enzymatická aktivita IGS5 má optimum při neutrálním pH (7.0^7.5). Mělo by se poznamenat, že proteolýza big-ET-1 pomocí IGS5 má za následek správný vznik ET-1,

Pomocí pokusů v příkladu 7 byla studována účinnost inhibitorů metaloproteasy potlačovat konverzi big-ET-1 na ET-1 pomocí IGS5, při použití fluorescenčně značeného analogu big-ET-1 jako substrátu. Je zajímavé, že fosforamidon, o němž je známo, že inhibuje konverzi big-ET-1 na ET-1 in vivo, inhibuje také IGS5 s vysokou účinností (IC50 = 18 nM) v našem biochemickém testu (značně vyšší, než ECE-1). Na rozdíl od toho, selektivní inhibitor NEP, thiorfan, jakož i selektivní inhibitor ECE-1, SM-19712 od Sumitomo, neovlivňuje aktivitu IGS5.

Tak látka vzorce I, s výhodou buď vzorce la nebo lb, vykazuje překvapivě kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitu kNEP/IGS5. Jako representační příklad látek vzorce laje látka Ia-2 a látek vzorce lb je látka Ib-8, které byly zkoumány v pokusech příkladu 7. Obě látky jsou velmi účinnými inhibitory (IC50 = 1.2 a 2.9 nM) nově identifikované metaloproteasy IGS5.

9

9 · • ···

* · · · ··· ··

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití derivátu benzazepinu, vyznačující se tím, že má s výhodou souběžnou inhibiční aktivitu k

   a) neutrální endopeptidase (NEP) a

   b) metaloprotease IGS5, která je polypeptidem obsahujícím sekvenci aminokyselin, která je ve shodě nejméně 70 % s jednou ze sekvencí aminokyselin vybraných ze skupin SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 nebo SEQ ID NO:6;

   nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru, pro výrobu léčiva (farmaceutické směsi) pro léčení savce, s výhodou člověka, který trpí neboje citlivý k podmínce, která může být zmírněna nebo preventována kombinovanou nebo souběžnou inhibici NEP a IGS5.
2. 2. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru podle nároku 1,vyznačující se tím, že se vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení savce, s výhodou člověka, který trpí neboje citlivý k podmínce, při níž je hladina big-ET-1 zvýšena a kterážto nemoc nebo podmínka může být zmírněna nebo preventována kombinovanou nebo souběžnou inhibici NEP a IGS5.
3. 3. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že se vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení savce, s výhodou člověka, který trpí neboje citlivý k podmínce, při níž je hladina ET-1 je významně zvýšena a kterážto nemoc nebo podmínka může být zmírněna nebo preventována kombinovanou nebo souběžnou inhibici NEP a IGS5.

   • · ·· · • * · • · · · • · · · · • · · • · ·
4. 4. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo sol vátu nebo biolabilního esteru podle nároků 1 až 3, v y z n a č u j í c í se t í m, že se vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení a/nebo profylaxi hypertenze, včetně sekundárních forem hypertenze, jako je plicní hypertenze, srdečního selhání, angíny pectoris, arytmie, infarktu myokardu, srdeční hypertrofíe, mozkové ischemie, periferálního cévního onemocnění, subarachnoidálního krvácení, chronické obstrukční plicní nemoci (COPD), astmatu, renálního onemocnění, atherosklerózy, bolesti v důsledku kolorektální rakoviny nebo rakoviny prostaty, u vyšších savců, s výhodou u lidí.
5. 5. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru podle nároků 2 nebo 3, vyznačující se tím, že se vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení a/nebo profylaxi atherosklerózy u vyšších savců, s výhodou u ^ž lidi.
6. 6. Použiti derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru podle nároků 2 nebo 3,vyznačující se tím, že se vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení a/nebo profylaxi hypertenze, včetně sekundárních forem hypertenze, jako je plicní hypertenze, srdečního selhání, anginy pectoris, arytmie, infarktu myokardu, srdeční hypertrofíe, mozkové ischemie, periferálního cévního onemocnění, subarachnoidálního krvácení, chronické obstrukční plicní nemoci (COPD), astmatu, renálního onemocnění, atherosklerózy, bolesti v důsledku kolorektální rakoviny nebo rakoviny prostaty, u vyšších savců, s výhodou u lidí.
7. 7. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vy z n ačuj i ci se t í m, že

   9 ·

   99 9 metaloproteasa IGS5 je polypeptid, který má sekvenci aminokyselin shodnou z nejméně 70% s jednou ze sekvencí aminokyselin vybraných ze skupin SEQ ID NO:2, SEQ ID NO.4 a SEQ

   ID NO:6.
8. 8. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, v y z n a č u j i c i se t i m, že sekvence aminokyselin, kteráje obsažena v metaloprotease IGS5 neboje metaloproteasou IGS5, je z nejméně 95% shodná s jednou ze sekvencí aminokyselin vybraných ze skupin SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.
9. 9. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru podle nároku 8, vyznačující se í i m, že sekvence aminokyselin, kteráje obsažena v metaloprotease IGS5 neboje metaloproteasou IGS5, je shodná s jednou ze sekvencí aminokyselin vybraných ze skupin SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.
10. 10. Použití derivátu benzazepinu vzorce I, ve kterém

    A je skupina vzorce II nebo III

    R13

    R^2flOOC (I /

    R^2bO lit

    9 9 • 99 9 · 999 « ·· ···· ·· 9 999· • * ··· · 9 · 9999 9999 <7*7 · 9 ···· 999 // ·9 99 99 999 99 9 v kterémžto vzorci II

    R^la je fenyl-nižší-alkylskupinou, která může být volitelně substituována na fenylovém kruhu nižším alkylem, nižším alkoxylem nebo halogenem, nebo je naftyl-nižší-alkylskupinou,

    R^2a je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester; a v kterémžto vzorci III

    R^lb je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester kyseliny fosforečné,

    R je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester kyseliny fosforečné;

    a ve kterém

    R³ je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester karboxylové kyseliny;

    nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru podle nároku 1, vyznačující se tím, že se vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení vyššího savce, s výhodou člověka, který trpí nebo je citlivý k podmínce, která může být zmírněna nebo preventována kombinovanou nebo souběžnou inhibici

    a) neutrální endopeptidasy (NEP) a

    b) metaloproteasy IGS5, která je polypeptidem obsahujícím sekvenci aminokyselin, která je ve shodě nejméně 70 % s jednou ze sekvencí aminokyselin vybraných ze skupin SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4 nebo SEQ ID NO:6.
11. 11. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru podle nároku 10, v y z n a č u j i c i se t i m, že látka vzorce I je vybrána z podskupiny látek, které mají strukturu podle vzorce Ia,

    ΦΦ ·· ·· • · φ · · · · • Φ Φ · Φ φ

    Φ Φ ΦΦΦ Φ Φ Φ

    Φ Φ ΦΦΦ

    ΦΦΦΦ ΦΦΦ ve kterém

    R^la je fenyl-nižší-alkylskupinou, která může být volitelně substituována na fenylovém kruhu nižším alkylem, nižším alkoxylem nebo halogenem, neboje naftyl-nižší-alkylskupinou,

    R^2a je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester, a

    R³ je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester a její fyziologicky vhodné soli kyselin nebo solváty.
12. 12. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru podle nároku 10, vyznačující se tím, že látka vzorce I je vybrána z podskupiny látek, které mají strukturu podle vzorce Ib, ve kterém

    R^lb je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester kyseliny fosforečné, R^2b je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester kyseliny fosforečné, a R³ je vodík nebo skupina tvořící biolabilní ester karboxylové kyseliny a její fyziologicky vhodné soli kyselin nebo solváty.

    • · · • ·· ·
13. 13. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru podle kteréhokoli z nároků 10 až 12, v y z n a č u j í c í se t í m, že se vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení savce, s výhodou člověka, který trpí neboje citlivý k nemoci nebo podmínce, při níž jsou hladiny big-ET-1 zvýšeny a kterážto nemoc nebo podmínka může být zmírněna nebo preventována kombinovanou nebo souběžnou inhibici NEP a IGS5.
14. 14. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru podle kteréhokoli z nároků lOaž 12, vyznačující se tím, že se vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení savce, s výhodou člověka, který trpí nebo je citlivý k nemoci (podmínce), při níž je hladina ET-1 významně zvýšena a kterážto nemoc (podmínka) může být zmírněna nebo preventována kombinovanou nebo souběžnou inhibici

    NEPaIGS5.
15. 15. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru podle kteréhokoli z nároků 10 až 14, v y z n a č u j í c í se t í m, že se vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení a/nebo profylaxi hypertenze, včetně sekundárních forem hypertenze, jako je plicní hypertenze, srdečního selhání, angíny pectoris, arytmie, infarktu myokardu, srdeční hypertrofie, mozkové ischemie, periferálního cévního onemocnění, subarachnoidálního krvácení, chronické obstrukční plicní nemoci (COPD), astmatu, renálního onemocnění, atherosklerózy, bolesti v důsledku kolorektální rakoviny nebo rakoviny prostaty, u vyšších savců, s výhodou u lidí.
16. 16. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru podle kteréhokoli z nároků 13 nebo 14, vyznačující se tím, že se ·· • · 44 · · · • 4 4 · · · « • · · · · · 4 ···· • · · · · · ·· ··· ·· · vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení a/nebo profylaxi atherosklerózy u vyšších savců, s výhodou u lidí.
17. 17. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru podle kteréhokoli z nároků 13 nebo 14, v y z n a č u j i c i se t í m, že se vyrobí léčivo (farmaceutická směs) pro léčení a/nebo profylaxi hypertenze, včetně sekundárních forem hypertenze, jako je plicní hypertenze, srdečního selhání, angíny pectoris, arytmie, infarktu myokardu, srdeční hypertrofie, mozkové ischemie, periferálního cévního onemocnění, subarachnoidálního krvácení, chronické obstrukční plicní nemoci (COPD), astmatu, renálního onemocnění, atherosklerózy, bolesti v důsledku kolorektální rakoviny nebo rakoviny prostaty, u vyšších savců, s výhodou u lidí.
18. 18. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru podle kteréhokoli z nároků lOaž 17, vyznačující se tím, že metaloproteasa IGS5 je polypeptid, který má sekvenci aminokyselin shodnou z nejméně 70% s jednou ze sekvencí aminokyselin vybraných ze skupin SEQ ID NO:2, SEQ ID NO.4 a SEQ

    IDN0:6.
19. 19. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru podle kteréhokoli z nároků lOaž 18, vyznačující se tím, že sekvence aminokyselin, která je obsažena v metaloprotease IGS5 neboje metaloproteasou IGS5, je z nejméně 95% shodná s jednou ze sekvencí aminokyselin vybraných ze skupin SEQ

    ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.

    ·· 0 * · · • · · · ·· ·
20. 20. Použití derivátu benzazepinu nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru podle nároku 19, vyznačující se tím, že sekvence aminokyselin, která je obsažena v metaloprotease IGS5 neboje metaloproteasou IGS5, je shodná s jednou ze sekvencí aminokyselin vybraných ze skupin SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6.
21. 21. Použití derivátu benzazepinu jako prvotní látky, vyznačující se tím, že vykazuje kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitu k NEP/IGS5 nebo jeho farmaceuticky použitelné soli nebo solvátu nebo biolabilního esteru podle kteréhokoli z nároků 1 až 20, v kombinaci s nejméně jednou přídavnou látkou, vybranou ze skupiny dalších látek a/nebo kombinovaných inhibitorů metaloproteasy, než kombinovaných inhibitorů NEP/IGS5, přičemž řečená přídavná látka je s výhodou vybrána ze skupiny inhibitorů ACE, selektivních inhibitorů ECE, selektivních inhibitorů NEP, duálních inhibitorů NEP/ECE a směsných inhibitorů těchto metaloproteas, pro výrobu léčiva (farmaceutické směsi) za účelem kombinovaného léčení a/nebo kombinované profylaxe kterékoli z nemocí nebo podmínek popsaných v kterémkoli z nároků 1 až 20.
22. 22. Použití řečeného derivátu benzazepinu jako prvotní látky podle nároku 21, vyznačující se tím, že je v kombinaci s nejméně jednou z řečených přídavných látek a že tato prvotní látka má strukturu podle vzorce I, jak bylo dáno v nárocích 10 až 12, s výhodou má strukturu podle vzorce la, jak bylo dáno v nároku 11 nebo vzorce Ib, jak bylo dáno v nároku 12.
23. 23. Použití řečeného derivátu benzazepinu jako prvotní látky podle kteréhokoli z nároků 21 až 22, v y z n a č u j í c i se 11 m, že je v kombinaci s nejméně jednou z řečených přídavných látek a že tato kombinace je spoluúčinná, s výhodou synergisticky účinná.

    ·· ·* • · ««· · · «

    • ·· • · • · • · · ·· ·
24. 24. Farmaceutická směs, vyznačující se tím, že obsahuje spoluúčinné, s výhodou synergisticky účinné množství:

    derivátu benzazepinu jako prvotní látky, která vykazuje kombinovanou nebo souběžnou inhibiční aktivitu k NEP/IGS5, nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo solvátů nebo biolabilního esteru, podle kteréhokoli z nároků 1 až 20; a nejméně jedné přídavné látky vybrané ze skupiny dalších látek a/nebo kombinovaných inhibitorů metaloproteasy, než kombinovaných inhibitorů NEP/IGS5, přičemž řečená přídavná látka je s výhodou vybrána ze skupiny inhibitorů ACE, selektivních inhibitorů ECE, selektivních inhibitorů NEP, duálních inhibitorů NEP/ECE a směsných inhibitorů těchto metaloproteas, pro kombinované léčení a/nebo kombinovanou profylaxi kterékoli z nemocí nebo podmínek, které jsou dány kterýmkoli z nároků 1 až 20.
25. 25. Farmaceutická směs podle nároku 24, vyznačující se tím, že obsahuje spoluúčinná, s výhodou synergisticky účinná, množství řečeného derivátu benzazepinu jako prvotní látky a nejméně jednu z řečených přídavných látek, přičemž první látka má strukturu podle vzorce I, jak je dáno v nárocích 10 až 12, s výhodou strukturu podle vzorce la, jak je dáno v nároku 11 nebo vzorce Ib, jak je dáno v nároku 12.

    Výčet sekvence

    Solvay Phramaceuticals GmbH

    Použití sloučenin s kombinovanou inhibiční aktivitou NEP/MP v přípravě léčiv <130> HA 00.17-WO