SK122002A3 - Novel antifungal agents and fungicides, method for the production thereof and their use - Google Patents

Description

ANTIMYKOTIKÁ A FUNGICÍDY, SPÔSOB ICH PRÍPRAVY A ICH POUŽITIE

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka antimykotík a fungicídov, ktoré možno získať z kvasiniek, spôsobu ich prípravy a ich použitia.

Doterajší stav techniky

Selektívne antimykotiká majú veľký význam, pretože infekcie spôsobené hubami alebo kvasinkami u človeka sa v posledných rokoch veľmi rozšírili a v stále väčšej miere dochádza i k nežiaducej kontaminácii potravín a krmív. Obzvlášť vážne následky majú mykózy u imunosuprimovaných pacientov, ktorých bunkový a humorálny obranný systém sa musí udržiavať na nie celkom funkčnej úrovni (Anaissie, 1992; Meunier a kol., 1992; Wingard, 1995). Obzvlášť sú mykózami ohrozené HIV-1-infikované osoby (AIDS), ktoré v pokročilom štádiu choroby zomierajú veľmi často na oportunistické infekcie vyvolané humánno-patogénnymi plesňami a/alebo kvasinkami (Levy, 1993). Antimykotiká, ktoré sa používajú na terapiu týchto infekcií v súčasnej dobe (ako sú Amphotericin B, Fluconazol, Itraconazol, Ketoconazol), majú značné vedľajšie účinky, pretože rozrušujú štruktúrnu integritu eukaryotickej membrány cytoplazmy, a tým poškodzujú i infikovaný hostiteľský organizmus (Hector, 1993). Aplikácia bežných antimykotík vedie okrem toho už za krátky čas k rýchlemu nárastu fluconazolovej rezistencie, ktorá sa v humánnopatogénnych mikroorganizmoch rýchlo rozširuje a predstavuje tak stále väčší problém (Cameron a kol., 1993; Chavenet a kol., 1994; Maenza a kol., 1996; Pfaller a kol., 1994; Rex a kol., 1995; Troillet a kol., 1993). Je preto dôležité vyvinúť také antimykotiká, ktoré sa budú vyznačovať - podobne ako bakteriálne antibiotiká - vysokou selektivitou a tým, že budú napadať pokiaľ možno len huby a kvasinky patogénne pre človeka. Pretože však väčšina bunkových procesov je u vyšších organizmov riadená génovými produktmi, ktoré u eukaryotov vykazujú vysokú mieru funkčnej homológie, nepodarilo sa doteraz

31854/H vyvinúť „špecifické antifungálne antibiotiká,, (Kurz, 1998; Komiyama a kol., 1998).

Cieľovou oblasťou selektívnych antimykotík sú p-1,3-glukány bunkovej steny kvasiniek, ktoré sú nevyhnutné pre mechanickú a osmotickú stabilitu bunky, ktoré sa však u vyšších eukaryotov nevyskytujú, takže by bolo možné ich použiť ako „Achillovu pätu,, (pozn. prekl.: v origináli je Achillesverse, má byť asi Achillesferse) pri likvidácii patogénnych kvasiniek (Roemer a kol., 1994). Napriek tomu, že látky, ktoré selektívne napadajú štruktúru bunkových stien kvasiniek a húb, sú predmetom veľkého záujmu, neboli doteraz žiadne látky podobné antibiotikám na liečenie mykóz použité. Zatiaľ čo producenti bakteriálnych antibiotík sa objavili už začiatkom tohto storočia, podobné efekty u kvasiniek sa pozorovali až začiatkom šesťdesiatych rokov, kedy sa identifikovali a pozorovali tzv. „killer„-kvasinky (Bevan a Makower, 1963). Toxíny produkujúce „killer„-kmene pekárskych kvasníc Saccharomyces cerevisiae produkujú a vylučujú proteíny označené ako „killertoxíny,,, ktoré usmrcujú senzitívne kvasinky pri procese závislom od receptora (Rezeptor-abhängigen Prozess) (Bussey, 1991; Tipper a Schmitt, 1991). Schopnosť produkovať toxín spočíva u S. cerevisiae od infekcie vírusmi s dvojvláknovou RNA, ktoré sa podobajú reovírusu (Reovirus-ähnliche Dopplestrang-RNA-Viren), ktoré sú v cytoplazme kvasiniek stabilné a vo veľkom počte kópií tu pretrvávajú bez toho, aby eukaryotickú hostiteľskú bunku badateľným spôsobom poškodili (Tipper a Schmitt, 1991). U troch doteraz známych killer-toxínov (K1, K2, K28) z kvasiniek S. cerevisiae ide o neglykozylované α/β heterodiméry, ktoré sa prenášajú z infikovanej bunky ako vysokomolekulárne preprotoxíny a premenené na intracelulárnej sekrečnej ceste komplexnými modifikáciami na biologicky aktívne killer-proteíny (Hanes a kol., 1986; Dignard a kol., 1991; Schmitt a Tipper, 1995). Toxické pôsobenie toxínu zo S. cerevisiae spočíva buď v rozrušení celistvosti membrány (toxíny Κ1, K2) alebo (ako je to u killertoxínu K28) v pozastavení bunkového cyklu (Zellcyklus-Arrest) s cielenou inhibíciou syntézy DNA (Bussey, 1991; Schmitt a Compain, 1995; Schmitt a kol., 1996). Killer-toxíny tried K1, K2 a K28 sa síce vo svojom spôsobe účinku a

31854/H vo svojich fyzikálno-chemických vlastnostiach navzájom značne odlišujú, majú však spoločné úzke spektrum účinnosti a ďalej to, že usmrcujú prevažne senzitívne kvasinky úzko príbuzných druhov. Toto obmedzené spektrum účinnosti je dané tým, že doteraz charakterizované killer-toxíny z pekárskych kvasníc s rôznymi populáciami receptorov na úrovniach bunkovej steny kvasiniek a cytoplazmovej membrány musia reagovať navzájom, aby mohli usmrtiť senzitívne cieľové bunky. U primárnych toxínreceptorov bunkovej steny kvasiniek ide buď o veľmi rozvetvené β-Ι,θ-D-glukány alebo o vonkajšie manotriózové bočné reťazce manoproteínu bunkovej steny (Bussey, 1991; Schmitt a Radler, 1987, 1988).

Okrem vírusových proteíntoxínov kvasiniek S. cerevisiae, Hanseniaspora uvarum, Zygosaccharomyces bailii a Ustilago maydis boli opísané killer-kmene i v rodoch Debaromyces, Hansenula, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon, Pichia, Kluyveromyces, Torulopsis a Williopsis (McCracken a kol., 1994, Park a kol., 1996, Schmitt a Neuhausen, 1994; Walker a kol., 1995). Genetické základy tohto killer-javu však u týchto kvasiniek nespočívajú vo vírusových genómoch, ale buď v lineárnych DNA-plazmidoch alebo v chromozomálnych kvasinkových génoch (Schrunder a kol., 1994).

Intenzívne molekulárno-biologické výskumy rôznych killer-kvasiniek produkujúcich toxín preukázali, že sekrécia toxických proteínov (killer-toxíny) je u kvasiniek veľmi rozšírená a že pri vývoji selektívnych antimykotík predstavuje potenciál, ktorý nemožno prehliadnuť (Walker a kol., 1995, Hodgson a kol., 1995; Polonelli a kol., 1986; Schmitt a Neuhausen, 1994; Neuhausen a Schmitt, 1996; Schmitt a kol., 1997), doteraz však tieto proteíntoxíny neboli pripravené.

Úlohou tohto vynálezu je preto príprava vhodných vysoko účinných proteíntoxínov s antimykotickými alebo fungicídnymi účinkami na ničenie kvasiniek a/alebo húb s patogénnym pôsobením na človeka alebo rastliny.

31854/H

Podstata vynálezu

Na ničenie kvasiniek a/alebo húb s patogénnym pôsobením na človeka alebo rastliny sa ako obzvlášť vhodné prekvapujúco ukázali toxíny produkované a secernované s vysokou účinnosťou, a to killer-toxín WICALTIN (rovnako proteíntoxín) z divokého kmeňa kvasiniek Williopsis californica kmeň 3/57 (DSM 12865) a víruskódovaný ZYGOCIN (rovnako proteíntoxín) z kvasiniek Zygosaccharomyces bailii (DSM 12864). Okrem toho týmito prostriedkami možno usmrtiť i obávané škodlivé kvasinky v potravinách a v krmivách. Oba tieto proteíntoxíny preto možno potenciálne použiť ako antimykotikum a/alebo fungicíd na likvidáciu infekcií vyvolaných kvasinkami a/alebo hubami, hlavne na likvidáciu mykóz. Tieto indikácie sa v tomto vynáleze overujú skúmaním spôsobu pôsobenia týchto látok. V rámci tohto vynálezu boli toxíngény vhodným spôsobom klonované a sekvencované a vypracoval sa tak postup génovo-technickej prípravy a expresie (Clberexpression) v kultúre preparátov WICALTIN a ZYGOCIN.

Predmetom tohto vynálezu sú teda proteíntoxíny, ktoré možno získať z Williopsis californica, hlavne z kmeňa DSM 12865 a Zygosaccharomyces bailii, hlavne z kmeňa DSM 12864. Oba tieto kmene boli podľa Budapeštianskej zmluvy dňa 9. júna 1999 uložené do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen GmbH, 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b (www.dsmz.de).

V rámci tohto vynálezu secernovali hlavne kmene DSM 12864 a DSM 12865 biologicky vysoko účinné proteíntoxíny, ktoré vďaka širokému spektru ich účinnosti (pozri príklady 4 a 7) usmrcovali i mnohé humánno- a rastlinnopatogénne kvasinky a huby. Preto sa tento vynález týka i selektívnych antimykotík alebo fungicídov vtom zmysle, že u proteíntoxínov - a ďalej uvedených polypeptidov podľa tohto vynálezu a nimi kódovaných nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, hlavne vo funkčnej jednotke toxíngénu - ide o potenciálne biofarmaká, ktoré na základe ich špecifického pôsobenia sprostredkovaného receptormi usmrcujú výhradne kvasinky a/alebo huby a pre

31854/H vyššie eukaryoty -a samozrejme pre ľudské a cicavčie bunky - a rovnako pre rastliny, hlavne pre kultúrne rastliny, sú celkom neškodné (pozri Pfeiffer a kol.,

1988).

Bolo možné selektívne usmrcovať nasledujúce humánno- a rastlinnopatogénne a rovnako apatogénne kvasinky a/alebo huby:

ZYGOCIN-senzitívne druhy kvasiniek: Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida vinii, Hanseniaspora uvarum, Kluyveromyces marxianus, Metschnikowia pulcherrima, Ustilago maydis, Debaromyces hansenii, Pichia anomala, Pichia jadinii, Pichia membranefaciens, Yarowia lipolytica a Zygosaccharomyces rouxii.

WICALTIN-senzitívne druhy kvasiniek: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Debaromyces hansenii, Kluyveromyces lactis, Metschnikowia pulcherrima, Pichia anomala, Pichia jadinii, Saccharomyces cerevisiae, Sporthhx spec., Torulaspora delbrueckii, Torulaspora pretoriensis, Yarowia lipolytica a Zygosaccharomyces bailii.

Obzvlášť vysoká aktivita wicaltin-produkujúceho kmeňa DSM 12865 spočíva pravdepodobne vo výraznej sekrečnej účinnosti tohto kmeňa, ktorá je v porovnaní s inými kmeňmi rovnakého druhu kvasiniek podstatne vyššia. „Killer„-vlastnosť zigocin-produkujúceho kmeňa kvasiniek DSM 12864 spočíva v infekcii toxínkódujúcimi vírusmi s dvojvláknovou RNA (Mzb-dsRNA), ktoré sú stabilné, v cytoplazme pretrvávajú vo vysokom počte kópií a v príslušných kvasinkách (kmeň DSM 12864) vyvolávajú produkciu a sekréciu zygocinu (pozri Schmitt a Neuhausen, 1994). Ostatné kmene rovnakého druhu nevykazovali žiadnu produkciu toxínu, pretože v cytoplazme neobsahujú žiadne toxínkódujúce dsRNA-vírusy, takže sú fenotypovo klasifikované ako „Ne-killer„typy.

Ďalším predmetom tohto vynálezu sú nukleové kyseliny kódujúce proteíntoxín - s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID No 1 a No 2 a s glukanázovou aktivitou - alebo funkčné varianty týchto nukleových kyselín a

31854/H ich časti minimálne s 8 nukleotidmi, hlavne minimálne s 15 alebo 20 nukleotidmi, obzvlášť minimálne so 100 nukleotidmi, predovšetkým minimálne s 300 nukleotidmi (ďalej sú uvádzané ako „nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu,,).

Kompletné nukleové kyseliny kódujú proteíntoxíny, ktoré vykazujú po intracelulárnom spracovaní a sekrécii veľkosť 309 aminokyselín a molekulovú hmotnosť 34 kDA (SEQ ID No 1), resp. 99 aminokyselín a molekulovú hmotnosť 10 kDA (SEQ ID No 2). Expresia tejto nukleovej kyseliny podľa SEQ ID No 1 v kvasinkách S. cerevisiae vedie k rekombinantnému WICALTINU, ktorý sa v supernatante kultúry kvasiniek secernuje ako glykozylovaný protein so signifikantnou p-1,3-D-glukanázovou aktivitou (pozri príklad 10). Ďalšie experimenty vykonané podľa tohto vynálezu potvrdili, že u nukleových kyselín podľa tohto vynálezu ide o nukleové kyseliny, ktoré v prípade SEQ ID No 1 kódujú proteíntoxín s glukanázovou aktivitou a v prípade SEQ ID No 2 kódujú in vivo pravdepodobne O-glykozylovaný proteíntoxín označovaný ako ZYGOCIN. Nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu možno získať z DSM 12865 (SEQ ID No 1) a z DSM 12864 (SEQ ID No 2).

V jednej preferovanej forme vyhotovenia sú nukleovými kyselinami podľa tohto vynálezu DNA alebo RNA, predovšetkým dvojvláknová DNA, a hlavne DNA so sekvenciou nukleových kyselín podľa SEQ ID No 1 od pozície 1 do pozície 947 a podľa SEQ ID No 2 od pozície 1 do pozície 713. Obe tieto pozície určujú podľa tohto vynálezu začiatok a koniec kódujúcej oblasti, t.j. vždy prvú a poslednú aminokyselinu v príslušnom čítacom rámci (Leseraster).

Pojmom „funkčný variant,, sa chápe podľa tohto vynálezu nukleová kyselina, ktorá je funkčne príbuzná s nukleovými kyselinami podľa tohto vynálezu. Tak napríklad sú príbuznými nukleovými kyselinami nukleové kyseliny z rôznych kvasinkových buniek, resp. kmeňov a kultúr alebo alelické varianty. Tento vynález zahrňuje i varianty nukleových kyselín, ktoré môžu pochádzať z rôznych kvasiniek/kmeňov kvasiniek alebo iných pôvodcov infekcií ako sú dermatofyty a plesne (podľa DHS systému).

V ďalšom zmysle sa pod pojmom „varianty,, podľa tohto vynálezu chápu

31854/H nukleové kyseliny, ktoré vykazujú homológiu, hlavne identitu sekvencií z cca 60 %, radšej z cca 75 %, obzvlášť z cca 90 % a predovšetkým z cca 95 %.

Časti nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa môžu používať napríklad na prípravu jednotlivých epitopov, ako sondy pre identifikáciu ďalších funkčných variantov alebo ako antisense-nukleové kyseliny. Tak napríklad nukleová kyselina skladajúca sa minimálne z cca 8 nukleotidov je vhodná ako antisense-nukleová kyselina, nukleová kyselina skladajúca sa minimálne z cca 15 nukleotidov je vhodná ako primér pri PCR-postupe, nukleová kyselina skladajúca sa minimálne z cca 20 nukleotidov je vhodná na identifikáciu ďalších variantov a nukleová kyselina skladajúca sa minimálne z cca 100 nukleotidov je vhodná ako sonda.

V ďalšej výhodnej forme vyhotovenia tohto vynálezu obsahuje nukleová kyselina podľa tohto vynálezu jednu alebo viacero nekódujúcich sekvencií a/alebo poly(A)-sekvenciu, jednu alebo viacero (pre intracelulárne pro-proteínspracovanie nevyhnutných) Kex2p-endopeptidázových rozlišujúcich sekvencií (Endopeptidase Erkennungssequenzen) a rovnako jedno alebo viacero potenciálnych N-glykozylačných miest. Nekódujúcimi sekvenciami sú riadiace sekvencie, ako sú promótor- alebo enhancer-sekvencie pre riadenú expresiu kódujúceho toxíngénu obsahujúceho nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu.

V ďalšej forme vyhotovenia je preto nukleová kyselina obsiahnutá vo vektore, prednostne v expresnom vektore alebo v génovo-terapeuticky účinnom vektore.

Expresnými vektormi môžu byť napríklad v prípade nukleových kyselín podľa SEQ ID No 2 prokaryotické a/alebo eukaryotické expresné vektory, resp. v prípade nukleových kyselín podľa SEQ ID No 1 výhradne eukaryotické expresné vektory. Expresia toxínkódujúcich nukleových kyselín podľa SEQ ID No 1 v Escheríchia coli nie je možná, pretože príslušný heterologicky exprimovaný proteíntoxín je pre bakteriálne bunky toxický. Klonovanie WICALTIN-kódujúcich nukleových kyselín podľa SEQ ID No 1 v E. coli je možné len s plazmidmi, ktoré nenesú žiaden promótor (napr. pomocou derivátov plazmidu pBR322). Príkladom prokaryotického vektoru, ktorý

31854/H umožňuje heterologickú expresiu ZYGOCIN-kódujúcej nukleovej kyseliny podľa SEQ ID No 2, je komerčne dostupný vektor pGEX-4T-1, ktorý umožňuje vykonávať v E. coli expresiu glutatión-S-transferáza-ZYGOCIN-fúzneho proteínu. Ďalším vektorom pre expresiu ZYGOCINU v E. coli je napríklad T7 expresný vektor pGM10 (Martin, 1996), ktorý kóduje N-terminálnu Met-AlaHis6-časť (tag), čo umožňuje výhodné čistenie exprimovaného proteínu na stĺpci Ni²⁺-NTA. Ako eukaryotické expresné vektory pre expresiu v Saccharomyces cerevisiae sú vhodné napríklad vektory p426Met25 alebo p426GAL1 (Mumberg a kol., 1994, Nucl. Acids Res., 22, 5767), pre expresiu v bunkách hmyzu sú použiteľné napríklad Baculovirus-vektory ako sú EP-B10127839 alebo EP-B1-0549721 a pre expresiu v bunkách cicavcov možno použiť napríklad SV40-vektory, ktoré sú bežne dostupné.

Expresné vektory obsahujú všeobecné regulačné sekvencie vhodné i pre hostiteľskú bunku, ako sú napr. trp-promótor pre expresiu v E. coli (pozri napr. EP-B1-0154133), ADH-2-promótor pre expresiu v kvasinkách (Russel a kol., 1983, J. Biol. Chem., 2588, 2674), baculovirus-polyhedrín-promótor pre expresiu v bunkách hmyzu (pozri napríklad EP-B1-0127839) alebo starší SV40promótor alebo LTR-promótory napr. z MMTV (Mouse Mammary Tumour Virus, Lee a kol., 1981, Náture, 214, 228).

Príkladom génovo-terapeuticky účinných vektorov sú vírusvektory, hlavne adenovírusvektory, najmä replikačno-deficientné adenovírusvektory alebo adenoasociované vírusvektory, napr. adenoasociovaný vírusvektor, ktorý sa skladá výhradne z dvoch vložených terminálnych opakujúcich sa sekvencii (Wiederholungssequenz) (ITR).

Vhodné adenovírusvektory sú opísané napr. v prácach McGroy, W. J. a kol., 1988, Virol., 163, 614; Gluzman, Y. a kol., 1982, v publikácii „Eukaryotic Viral Vectors,, (Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Chroboczek, J. a kol., 1992, Virol., 186, 280; Karlsson, S. a kol., 1986, EMBO J., 5, 2377 alebo vo WO 95/00655.

Vhodné adenoasociované vírusvektory sú opísané napr. v prácach Muzyczka, N., 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97; WO 95/23867;

31854/K

Samulski, R.J., 1989, J. Virol., 63, 3822; WO 95/23867; Chiorini, J. A. a kol.,

1995, Human Gene Therapy, 6, 1531 alebo Kotin, R. M., 1994, Human Gene

Therapy, 5, 793.

Génovo-terapeuticky účinné vektory možno získať i tak, že sa nukleová kyselina podľa tohto vynálezu viaže do komplexu s lipozómami. Na to sú vhodné zmesi lipidov, ktoré sú opísané napr. v prácach Felgner, P. L. a kol., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413; Behr, J. P. a kol., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982; Felgner, J. H. a kol., 1994, J. Biol. Chem., 269, 2550 alebo Gao, X. a Huang, L., 1991, Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195. Pri príprave týchto lipozómov sa DNA naviaže iónovo na povrch lipozómov, a to vtákom pomere, aby na povrchu zostal zachovaný kladný náboj a aby DNA bola s lipozómami úplne viazaná v komplexe.

V ďalšej forme vyhotovenia sú nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu obsiahnuté vo vektore, prednostne v expresnom vektore na prípravu transgénnych rastlín. Vzhľadom k tomu, že opisované killer-toxíny WICALTIN a ZYGOCIN majú široké spektrum účinnosti a usmrcujú i fytopatogénne kvasinky a huby, možno získať také transgénne rastliny, ktoré sú odolné napr. proti infekcii vyvolávanej u kukurice patogénom Ustilago maydis. Podobné pokusy sa už vykonávali na rastlinách tabaku, ktoré po heterologickej expresii prirodzeného virálne kódovaného killertoxínu KP4 z U. maydis mali schopnosť secernovať príslušný proteíntoxín a získať tak špecifickú ochranu proti infekciám určitými fytopatogénnymi kmeňmi U. maydis (Park a kol., 1996; Kinal a kol., 1995; Bevan, 1984). Na základe komerčne dostupných transformačných systémov, založených na modifikovaných derivátoch prirodzených Ti-plazmidov z Agrobacterium tumefaciens, možno nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu, zastúpené i v toxíngénoch WCT a ZBT, naklonovať do tzv. dvojsmerných pBIvektorov (fa. CLONTECH) a použiť na získanie transgénnych rastlín. Príslušné toxíngény WCT a ZBT sa pritom vkladajú pod transkripčnou kontrolou silného promótora vírusu karfiolovej mozaiky (CaMV-P). Bližšie podrobnosti o výstavbe tohto konštruovaného vektoru sú schematicky uvedené v príklade 9.

Nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu možno napr. syntetizovať

31854/H chemicky s použitím sekvencii zo SEQ ID No 1 a No 2 alebo s použitím peptidových sekvencii zo SEQ ID No 1 a No 2 s využitím genetického kódu napr. fosfotriesterovou metódou (pozri napr. Uhlman, E. a Peyman, A., 1990, Chemical Reviews, 90, 543, č. 4). Ďalšou možnosťou získania nukleových kyselín podľa tohto vynálezu je izolácia z vhodnej génovej banky s použitím vhodnej sondy (pozri napr. Sambrook, J. a kol., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor, New York). Ako sondy sú vhodné napr. jednovláknové fragmenty DNA s dĺžkou cca 100 až 1000 nukleotidov, hlavne s dĺžkou 200 až 500 nukleotidov, obzvlášť s dĺžkou cca 300 až 400 nukleotidov, ktorých sekvenciu možno odvodiť zo sekvencie nukleových kyselín podľa SEQ ID No 1 a No 2.

Ďalším predmetom tohto vynálezu sú polypeptidy ako také s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID No 1 a No 2 alebo ich funkčné varianty a ich časti minimálne so šiestimi aminokyselinami, hlavne minimálne s 12 aminokyselinami, obzvlášť minimálne so 65 aminokyselinami a predovšetkým s 309 aminokyselinami (SEQ ID No 1) a s 99 aminokyselinami (SEQ ID No 2) (ďalej sú uvádzané ako „polypeptidy podľa tohto vynálezu,,). Tak napr. môže polypeptid s dĺžkou cca 6-12, hlavne s dĺžkou cca 8 aminokyselín obsahovať epitop, ktorý slúži po naviazaní na nosič na prípravu špecifických poly- alebo monoklonálnych protilátok (pozri napr. US 5,656,435). Polypeptidy s dĺžkou minimálne cca 65 aminokyselín sa môžu použiť priamo i bez nosiča na prípravu poly- alebo monoklonálnych protilátok.

Pojmom „funkčný variant,, v zmysle tohto vynálezu sa chápu polypeptidy, ktoré sú príbuzné s peptídom podľa tohto vynálezu, t.j., že vykazujú glukanázovú aktivitu. Variantmi sa chápu i alelické varianty alebo polypeptidy, ktoré môžu pochádzať i z rôznych kvasiniek/kmeňov kvasiniek alebo iných pôvodcov infekcií, ako sú dermatofyty alebo plesne (podľa DHS-systému).

V ďalšom zmysle sa do tohto vynálezu zahrňujú i polypeptidy, ktoré vykazujú homológiu sekvencii, hlavne identitu sekvencii z cca 70 %, najme z cca 80 %, obzvlášť z cca 90 % a predovšetkým z cca 95 % s polypeptidom s aminokyselinovou sekvenciou podľa obr. 2. Ďalej sa sem radí i vyštiepenie

31854/H polypeptidu v rozsahu cca 1 - 60, hlavne 1 - 30, obzvlášť cca 1 - 15 a predovšetkým cca 1 - 5 aminokyselín. Tak napríklad môže chýbať prvá aminokyselina metionín bez toho, aby sa funkcia tohto polypeptidu podstatne zmenila. Okrem toho sem patria i fúzne proteíny, ktoré obsahujú vyššie uvedené polypeptidy podľa tohto vynálezu, pričom tieto fúzne proteíny už samotné majú funkciu glukanázy alebo túto špecifickú funkciu môžu získať až po odštiepení fúzneho podielu. Patria sem predovšetkým fúzne proteíny s podielom hlavne ne-humánnych sekvencii obsahujúcich cca 1 - 200, hlavne cca 1-150, obzvlášť cca 1 -100 a predovšetkým cca 1 - 50 aminokyselín. Ako príklady ne-humánnych peptidových sekvencii možno uviesť prokaryotické peptidové sekvencie, napr. z galaktozidázy z E. coli alebo tzv. histidínový reťazec (Histidin-Tag), napr. Met-Ala-His₆-reťazec (Tag). Fúzny protein s tzv. histidínovým reťazcom je obzvlášť vhodný na čistenie exprimovaného proteínu na kolóne s kovovými iónmi, napr. s použitím stĺpca Ni²⁺-NTA. „NTA„ predstavuje chelátor, ktorým je n itri lotri octová kyselina (Qiagen GmbH, Hilden). Tento vynález zahrňuje i polypeptidy podľa tohto vynálezu, ktoré sú skryté ako pro-proteín alebo v najširšom zmysle ako Pre-drug.

Časti polypeptidov podľa tohto vynálezu predstavujú napr. epitopy, ktoré možno špecificky rozpoznať pomocou protilátok.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu možno pripraviť napr. expresiou nukleových kyselín podľa tohto vynálezu vo vhodnom expresnom systéme s použitím prv opísaných metód, ktoré sú odborníkom známe. Ako hostiteľské bunky na prípravu správne spracovaných, a tým i biologicky aktívnych proteíntoxínov sú vhodné výhradne eukaryotické organizmy, hlavne klíčiace kvasinky (Sprosshefe) Saccharomyces cerevisiae a štiepne kvasinky (Spalthefe) Schizosaccharomyces pombe.

Uvedené časti polypeptidu možno rovnako syntetizovať i pomocou klasickej syntézy peptidov (technika Merrifield). Tieto časti sú vhodné hlavne na získanie antisér, s ktorých pomocou možno preskúmať vhodné génexpresné banky tak, aby bolo možné získať ďalšie funkčné varianty polypeptidu podľa tohto vynálezu.

31854/H

Ďalší predmet tohto vynálezu sa preto vzťahuje k postupu prípravy polypeptidu podľa tohto vynálezu, pričom nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa vo vhodnej hostiteľskej bunke exprimuje a prípadne izoluje.

Obzvlášť sa preferujú deliace sa kvasinky Schizosaccharomyces pombe, pretože tieto kvasinky vykazujú prirodzenú rezistenciu proti WICALTINU a ZYGOCINU a už sa niekoľkokrát úspešne použili na heterologickú expresiu cudzích proteínov (Giga-Hama a Kimagai, 1997, v publikácii „Foreign Gene Expresion in Fission Yeast (Expresia cudzích génov v deliacich sa kvasinkách): Schizosaccharomyces pombe,,, nakl. Springer). Ako je uvedené v príklade 11, môžu sa toxín-kódujúce nukleové kyseliny podľa SEQ ID No 1 a No 2 naklonovať napr. do S. pomôe-vektora pREP1 (Maundrell, 1990, J. Biol. Chem., 265, 10857-10864), v ktorom sú pod transkripčnou kontrolou tiamínregulovaného nmt1 promótora deliacich sa kvasiniek (nmt = no message with thiamine). Kvasinky transformované týmto vektorom exprimujú príslušný cudzorodý gén v závislosti od koncentrácie tiamínu v kultivačnom médiu kvasiniek. Týmto spôsobom je prípadne možno časovo oddeliť fázu rastu kvasiniek od fázy produkcie cudzorodého proteínu, takže principiálne možno vykonať i expresiu proteínov, ktoré sú pre kvasinky toxické. Aby bolo možné vykonávať súčasnú sekréciu, a tým podstatne uľahčiť čistenie heterologicky exprimovaných toxínov WICALTIN a ZYGOCIN v S. pombe, vykonali sme konštrukciu expresného/sekrečného vektora (vektor ρΤΖατ; pozri príklad 11), ktorý obsahuje sekrečný a procesný signál virálneho K28-pre-protoxíngénu (Schmitt a Tipper, 1995), a tým umožňuje účinnú sekréciu príslušného „inframe,, zaradeného cudzorodého proteínu.

Ďalší predmet tohto vynálezu sa vzťahuje i na protilátky, ktoré špecificky reagujú s polypeptidom podľa tohto vynálezu, pričom vyššie uvedené časti tohto polypeptidu sú buď samotné imunogénne alebo môže byť ich imunogenita vyvolaná alebo zvýšená naviazaním na vhodný nosič, ako je napr. bovínny sérový albumín.

Tieto protilátky sú buď polyklonálne alebo monoklonálne. Ich príprava, ktorá je rovnako predmetom tohto vynálezu, sa vykonáva napr. podľa

31854/H všeobecne známych metód imunizáciou nejakého cicavca, ako je napríklad králik, polypeptidom alebo jeho vyššie uvedenou časťou podľa tohto vynálezu, prípadne za prítomnosti napr. Freundovho adjuvans a/alebo alumíniumhydroxidových gélov (pozri napr. Diamond, B. A. a kol., 1981, The New England Journal of Medicíne, 1344). Polyklonálne protilátky vzniknuté vo zvierati imunologickou reakciou možno nakoniec pomocou všeobecne známych metód ľahko izolovať z krvi a čistiť napríklad pomocou stĺpcovej chromatografie. Preferuje sa afinitné čistenie protilátok, pri ktorom sa napríklad príslušný antigén (WICALTIN alebo ZYGOCIN) kovalentne naviaže na všeobecne dostupnú CnBr-aktivovanú Sepharozovú matricu a použije sa na čistenie príslušných toxínšpecifických protilátok.

Monoklonálne protilátky možno pripraviť napríklad podľa známej metódy, ktorú publikovali Winter a Miistein (Winter, G. a Milstein, C., 1991, Náture, 349, 293).

Ďalším predmetom tohto vynálezu je i liek, ktorý obsahuje nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu alebo polypeptidy podľa tohto vynálezu (samotné alebo v kombinácii) a prípadne vhodné prísady alebo pomocné látky a postup na prípravu tohto lieku na liečenie mykóz, ako sú povrchové, kutánne a subkutánne dermatomykózy, mykózy slizníc a systémové mykózy, a to hlavne Cand/'c/a-mykózy, pričom sa nukleová kyselina podľa tohto vynálezu alebo polypeptid podľa tohto vynálezu kombinujú s farmaceutický vhodnými prísadami a/alebo pomocnými látkami.

V príklade 12 je uvedené, že čistený toxín WICALTIN produkovaný kmeňom DSM 12865 má dokonca podstatne vyššiu toxicitu pre kvasinky ako porovnávané antimykotiká Clotrimazol a Miconazol, ktoré sa na liečenie mykóz často používajú.

Preto sa tento vynález týka i liečiva vo vyššie uvedenom zmysle, ktorý obsahuje antimykotikum alebo proteíntoxín izolovaný z DSM 12864 a/alebo DSM 12865 a/alebo polypeptidy s antimykotickým účinkom podľa tohto vynálezu.

31854/H

Pre génovo-terapeutické použitie u človeka je vhodný hlavne taký liek, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu podľa tohto vynálezu v základnej forme (nackte Form) alebo vo forme niektorého z vyššie uvedených génovoterapeuticky účinných vektorov alebo vo forme komplexu s lipozómami.

Ako vhodné prísady a/alebo pomocné látky možno použiť napr. fyziologický roztok kuchynskej soli, stabilizátory, proteínázové inhibítory, nukleázové inhibítory atď.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je diagnostický prostriedok obsahujúci nukleovú kyselinu podľa tohto vynálezu, polypeptid podľa tohto vynálezu alebo protilátky podľa tohto vynálezu a prípadne vhodné prísady a/alebo pomocné látky a postup prípravy tohto diagnostického prostriedku pre diagnózu mykóz, ako sú povrchové, kutánne a subkutánne dermatomykózy, mykózy slizníc a systémové mykózy, a to hlavne Cand/da-mykózy, pri ktorom sa nukleová kyselina podľa tohto vynálezu, polypeptid podľa tohto vynálezu alebo protilátky podľa tohto vynálezu kombinujú s vhodnými prísadami a/alebo pomocnými látkami.

Tak je možné napríklad podľa tohto vynálezu s použitím nukleových kyselín podľa tohto vynálezu získať diagnostikum na základe polymerázovej reťazovej reakcie (PCR-diagnostika, napríklad podľa EP-0 200 362) alebo Northern a/alebo Southern Blot-analýzy, ako je bližšie opísané v príklade 13. Tieto testy sú založené na špecifickej hybridizácii nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu s komplementárnym protivláknom (Gegenstrang) spravidla zodpovedajúcej mRNA. Nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu sa môžu pritom modifikovať i spôsobom opísaným napríklad v EP 0 063 879. Pritom sa hlavne DNA-fragment podľa tohto vynálezu označí podľa známych metód vhodnými činidlami, ako je napríklad rádioaktívny a-P³²-dATP alebo nerádioaktívny biotín a inkubuje sa s izolovanou RNA, spravidla naviazanou na vhodnej membráne napríklad z celulózy alebo nylonu. Pritom je výhodné izolovanú RNA pred hybridizáciou a naviazaním na membránu rozdeliť v závislosti od jej veľkosti napríklad pomocou elektroforézy na agarózovom géli. Pri rovnakom množstve sledovanej RNA z každej vzorky tkaniva je tak možné stanoviť množstvo mRNA

31854/H špecificky značené pomocou sondy.

Ďalšie diagnostikum obsahuje polypeptid podľa tohto vynálezu, resp. jeho vyššie uvedené imunogénne časti. Tento polypeptid, resp. jeho časti, viazané predovšetkým na pevnej fáze, napríklad na nitrocelulóze alebo nylone, je možné napríklad dať in vitro do styku s vyšetrovanou telesnou tekutinou, napríklad krvou, aby mohlo napríklad dôjsť k reakcii s protilátkou. Tento komplex protilátka-peptid sa môže potom dokázať napríklad pomocou značenej antihuman-lgG-protilátky alebo antihuman-IgM-protilátky. Pri tomto značení ide napríklad o enzým, ako je peroxidáza, ktorý katalyzuje farebnú reakciu. Prítomnosť a množstvo prítomných autoimunitných protilátok je tak možné ľahko a rýchlo preukázať pomocou farebnej reakcie.

Ďalšie diagnostikum obsahuje protilátky podľa tohto vynálezu ako také. Pomocou týchto protilátok možno napríklad ľahko a rýchlo vyšetrovať vzorky ľudského tkaniva na prítomnosť príslušného polypeptidu. V tomto prípade sa protilátky podľa tohto vynálezu značia napr. enzýmom, ako bolo opísané prv. Špecifický komplex protilátka-peptid je tak možno ľahko a rýchlo preukázať pomocou enzymatickej farebnej reakcie.

Ďalší predmet tohto vynálezu sa týka fungicídu, ktorý obsahuje nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu a/alebo polypeptidy podľa tohto vynálezu O'ednotlivo alebo v kombinácii) a prípadne vhodné prísady alebo pomocné látky a ďalej postupu prípravy fungicídu na ničenie škodlivých kvasiniek a škodlivých húb, pri ktorom sa kombinuje nukleová kyselina podľa tohto vynálezu alebo polypeptid podľa tohto vynálezu s poľnohospodársky prípustnými prísadami a/alebo pomocnými látkami.

Ako bolo opísané prv, v jednej vyššie uvedenej forme vyhotovenia sa získala transgénna rastlina, ktorá exprimuje proteíntoxín podľa tohto vynálezu. Preto sa tento vynález týka i rastlinných buniek a rovnako transgénnej rastliny ako takej, ktoré obsahujú polypeptidy a/alebo proteíntoxíny podľa tohto vynálezu.

Ďalší predmet tohto vynálezu sa týka testu identifikácie funkčných

31854/H interaktorov, ako sú napr. inhibítory alebo stimulátory obsahujúce nukleovú kyselinu podľa tohto vynálezu, polypeptid podľa tohto vynálezu alebo protilátka podľa tohto vynálezu a prípadne vhodné prísady a/alebo pomocné látky.

Vhodným testom identifikácie funkčných interaktorov, hlavne takých, ktoré v senzitívnej bunke kvasiniek reagujú s proteíntoxínom ZYGOCINOM podľa SEQ ID No 2, je napr. tzv. „Two-Hybrid System,, (Fields, S. a Sternglanz, R., 1994, Trends in Genetics, 10, 286). Pri tomto teste sa bunka, napr. bunka kvasiniek transformuje alebo transferuje s jedným alebo niekoľkými expresnými vektormi, exprimujúcimi fúzny proteín, ktorý obsahuje polypeptid podľa tohto vynálezu a DNA-väzbovú doménu známeho proteínu, napr. z Gal4 alebo LexA z E. coli a/alebo s vektormi, ktoré exprimujú fúzny proteín, ktorý obsahuje neznámy polypeptid a jednu transkripčno-aktivačnú doménu, napr. z Gal4, herpesvírusu VP16 alebo B42. Okrem toho obsahuje táto bunka reportérgén, napr. LacZ-gén z E. coli „Green (zelený) Fluorescence Proteín,, alebo kvasinkové gény biosyntézy aminokyselín (AS-Biosynthesegene der Hefe) His3 alebo Leu2, ktoré prostredníctvom regulačných sekvencii, ako sú napr. lexApromótor/operátor alebo tzv. „Upstream (vzostupná) Activation Sequence,, (UAS) kvasinku riadi. Neznámy polypeptid sa napr. kóduje DNA-fragmentom pochádzajúcim z génovej banky, napr. z humánnej génovej banky. V kvasinkách sa spravidla pripravuje pomocou opísaných expresných vektorov cDNA-génová banka, takže hneď potom možno test vykonať.

Tak napríklad sa v kvasinkovom expresnom vektore klonujú nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu vo funkčnej jednotke na nukleovú kyselinu kódujúcu LexA-DNA-väzbovú doménu, takže dochádza k expresii fúzneho proteínu z polypeptidu podľa tohto vynálezu a LexA-DNA-väzbové domény v transformovaných kvasinkách. V inom kvasinkovom expresnom vektore sa cDNA-fragmenty z cDNA-génovej banky vo funkčnej jednotke klonujú na nukleovú kyselinu kódujúcu Gal4-transkripčne-aktivačnú doménu, takže dochádza k expresii fúzneho proteínu z neznámeho polypeptidu a Gal4transkripčno-aktivačnej domény v transformovaných kvasinkách. Kvasinka transformovaná pomocou oboch týchto vektorov, napr. Leu2', obsahuje okrem

31854/H toho nukleovú kyselinu kódujúcu Leu2, ktorá je riadená LexA-promótoroperátorom. V prípade funkčnej interakcie medzi polypeptidom podľa tohto vynálezu a neznámym polypeptidom sa viaže Gal4-transkripčno-aktivačná doména prostredníctvom LexA-DNA-väzbovej domény na LexA-promótoroperátor, ktorý sa aktivuje a exprimuje Leu2-gén. To má za následok, že kvasinky Leu2' môžu rásť na minimálnom médiu, ktoré neobsahuje žiaden leucín.

Pri použití LacZ- resp. „Green Fluorescence Protein„-reportérgénu namiesto génu biosyntézy aminokyselín možno aktiváciu transkripcie dokázať tvorbou modro, resp. zeleno fluoreskujúcich kolónií. Mieru modrej, resp. zelenej fluorescencie možno ľahko kvantifikovať spektrofotometricky, napr. v prípade modrej farby pri 585 nm.

Týmto spôsobom možno ľahko a rýchlo zisťovať v expresných génových bankách prítomnosť polypeptidov, ktoré reagujú s polypeptidom podľa tohto vynálezu. Potom možno nájdený nový polypeptid izolovať a ďalej charakterizovať.

Ďalšou možnosťou použitia systému „Two-Hybrid System,, je ovplyvnenie interakcie medzi polypeptidom podľa tohto vynálezu a známym alebo neznámym polypeptidom pôsobením ďalších látok, ako sú napr. chemické zlúčeniny. Tento spôsob umožňuje i ľahké vyhľadávanie novej chemicky syntetizovateľnej účinnej látky, ktorú je možné použiť ako terapeutikum. Tento vynález preto nie je zameraný len na postup vyhľadávania polypeptidických interaktorov, ale sa vzťahuje i na postup vyhľadávania látok, ktoré môžu reagovať s vyššie uvedeným proteín-proteín-komplexom. Tieto peptidické a rovnako chemické interaktory sa označujú v zmysle tohto vynálezu ako funkčné interaktory, ktoré môžu mať inhibičné alebo stimulačné účinky.

Ďalší predmet tohto vynálezu sa týka postupu prípravy proteíntoxínov zahrňujúceho kultiváciu a sekréciu proteíntoxínu v médiu, ktoré je syntetickým kultivačným médiom (BAVC-médium), chromatografické čistenie secernovaného toxínu, napr. pomocou ultrafiltrácie a katexovej chromatografie a/alebo afinitnej chromatografie na Laminarin-Sepharose a/alebo na :: I: í: > ' '

31854/H

Mannoprotein-Sepharose (pozri príklad 1 a dodatok k príkladom). V prípade WICALTINU produkovaného a secernovaného kmeňom DSM 12865 možno dosiahnuť ďalšie zvýšenie produkcie toxínu tak, že sa do média pridá rastlinný (a všeobecne dostupný) p-1,3-D-glukán laminarín na konečnú koncentráciu 1 %. Ako je uvedené v príklade 14, vedie prídavok laminarínu do kultivačného média k podnieteniu tvorby WICALTINU, ktorá je podľa Northern-anaiýzy vyvolaná indukciou transkripcie.

Na tvorbu toxínu ZYGOCINU secernovaného DSM 12864 možno používať syntetické B-médium (pozri Radler a kol., 1993)

Ďalej uvedené príklady slúžia ako ilustrácia tohto vynálezu a neznamenajú nijaké obmedzenie tohto vynálezu len na tieto príklady.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia, koncentrácia a čistenie anti-Canď/'ďa-toxínu WICALTIN zo supernatantu kultivačného roztoku killer-kvasiniek W. californica kmeň 3/57 (DSM 12865)

Killer-toxín WICALTIN secernovaný killer-kvasinkami l/V. californica 3/57 vykázal pri agarovom difúznom teste na agare s metylénovou modrou (Methylenblau-Agar) optimálne inhibičné pôsobenie na senzitívne kvasinky pri pH 4,7 a 20 °C. V syntetickom kvapalnom médiu vykazujú killer-kvasinky l/V californica 3/57 maximálnu produkciu toxínu pri kultivácii v BAVC-médiu (pH 4,7). Kvôli zvýšeniu tvorby toxínu sa killer-kvasinky najprv inkubovali za pretrepávania počas 24 hodín v 5 ml YEPD-médiu pri teplote 30 °C, potom boli kvantitatívne prevedené do 200 ml BAVC-média a znova sa kultivovali počas 48 hodín pri teplote 20 °C na trepačke (140 ot./min.). Štyri hlavné kultúry (Hauptkultur) sa zaočkovali predpestovanou kultúrou (Vorkultur) (1 %-né inokulum) vždy do 2,5 I BAVC-média (pH 4,7 v 5 I Erlenmeyerovej banke) a inkubovali počas 5 dní za mierneho trepania (60 ot./min.). Kvôli skoncentrovaniu secernovaného killer-toxínu sa bezbunkový supernatant pri

31854/H teplote +4 °C a tlaku 1 bar 200-násobne zahustil ultrafiltráciou na membránach z polysulfónových kyselín („EasyFIow,, (fa. Sartorius); vylučovacia hranica (Ausschlussgrenze/10 kDA) na objem 50 ml. Kvôli odstráneniu nízkomolekulárnych zlúčenín a kvôli odstráneniu solí z takto získaného koncentrátu sa toxín dialyzoval cez noc pri 4 °C v dialyzačnej trubici (vylučovacia hranica 10-20 kDA) proti 5 mM citrát-fosfátovému pufru (pH 4,7). Kvôli uchovaniu koncentrátu toxínu sa dialyzovaný preparát sterilné prefiltroval cez membránu 0,2 pm a v dávkach po 1 ml sa zmrazil na -20 °C.

Dôkaz a kalibrácia aktivity toxínu sa vykonali pri agarovom difúznom teste na agare s metylénovou modrou (MBA, pH 4,7) proti senzitívnym indikačným kvasinkám Saccharomyces cerevisiae 192.2d. Pritom sa z koncentrátu toxínu pripravili logaritmické zried’ovacie stupne v 0,1 M citrátfosfátovom pufre (pH 4,7) a pipetovalo sa vždy 100 μΙ do vopred pripravených otvorov (priemer otvoru 9 mm) v MBA-doske zaočkovanej senzitívnymi indikačnými kvasinkami (2 x 10⁵ buniek/ ml). Po trojdennej inkubácii dosiek pri teplote 20 °C sa zmerali dobre viditeľné inhibičné dvorce (Hemmhof). Pritom sa preukázalo, že medzi priemerom inhibičného dvorca a logaritmom koncentrácie toxínu existuje lineárny vzťah. Priemeru inhibičného dvorca (korigovaného na priemer otvoru ) 20 mm sa priradila aktivita toxínu 1 x 10⁴ jednotiek/ml.

Čistenie koncentrovaného toxínu WICALTIN sa vykonávalo buď katexovou chromatografiou na Bioscale-S (FPLC) alebo afinitnou chromatografiou na epoxy-aktivovanej Sepharose-68-Matrix (Fa. Pharmacia), na ktorú sa vopred naviazal rastlinný β-Ι,β-D-glukán pustulán. Tento toxínový preparát, u ktorého sa týmto spôsobom preukázala špecifická aktivita zodpovedajúca 625-násobnému obohateniu (tabuľka 1), sa pri gélovej elektroforéze javil ako čistý a vykazoval po SDS-PAGE (v 10-22 %-nom gradientovom géli) len samostatné oddelené pásy pri cca 37 kDA, ktoré bolo možné preukázať ako modrou Coomassie-Blau (sfarbenie proteínu), tak i Schiffovým činidlom s kyselinou jodistou (Perjodsäure-Schifffs-Reagent-PAS; sfarbenie sacharidov). Pozitívne PAS-sfarbenie ukazuje na potenciálnu Nglykozyláciu anti-Canď/ďa-toxínu WICALTIN. Reakciou vyčisteného toxínu

31854/H s endoglykázou-H bolo možné preukázať, že WICALTIN obsahuje Nglykozidicky viazanú sacharidickú časť s dĺžkou cca 3 kDA, ktorá vzhľadom k svojej veľkosti v kvasinkách rovnako ukazuje na jediné N-glykozylačné miesto v proteíntoxíne. Vzhľadom k tomu, že deglykozylovaný WICALTIN vykazuje podstatne zníženú toxicitu, je možné usúdiť, že sacharidická časť WICALTINU je zrejme pre naviazanie na senzitívnu cieľovú bunku nevyhnutná, t.j., že nepriamo ovplyvňuje biologickú aktivitu toxínu.

Tabuľka 1

Zahustenie toxínu WICALTIN zo supernatantu kultivačného média killerkvasiniek Williopsis californica (UF, ultrafiltrácia)

Preparát	Objem (ml)	Celk. proteín (mg)	Celková aktivita toxínu (E)	Špecifická aktivita toxínu (E/mg)	Aktívny výťažok (%)	Faktor vyčistenia (Reinigungsf.)
Supernatant kultiv. média	10 000	24 600	7,9 x 10*	3,2x10	100	1
UF-retentát	50	162	6,3x10	3,9x10	80	122
Lyofil. dialyzát	25	45,8	3,1 x 10	6,8 x 10	39	213
Bioscale S (katex)	64	1,28	2,5 x 104	2,0 x 104	3,2	625

Príklad 2

Stanovenie NH₂-terminálnej aminokyselinovej sekvencie preparátu WICALTIN a dôkaz enzymatickej β-1,3-glukonázovej aktivity

Sekvencovaním N-terminálnych aminokyselín vo vyčistenom killer-toxíne sa stanovilo prvých desať aminokyselín. Ako vyplýva z obr. 1, vykazuje Nkoniec preparátu WICALTIN signifikantnú homológiu s amino-koncom endo-β1,3-glukanázy kódovanej BGL2-génom z kvasiniek Saccharomyces cerevisiae.

31854/H

Na základe tejto zistenej homológie preparátu WICALTIN a Bgl2 sa zisťovalo, či je v nečistenom koncentráte toxínu a rovnako v čistenom toxínovom preparáte preukázateľná glukanázová aktivita. Ako pri enzymatickom teste, pri ktorom sa použil ako substrát p-í,3-D-glukán laminarín, tak i pri fluorescenčnom teste, pri ktorom sa použil ako substrát 4metyl-umbelliferyl-p-D-glukozid (MUC), bolo možné u preparátov WICALTINU preukázať výraznú p-¥l,3-D-glukanázovú aktivitu; súbežne testovaný |>1,6-Dglukán pustulan sa pôsobením preparátu WICALTIN nehydrolyzoval.

Príklad 3

Miera prežitia kvasinkových buniek po pôsobení WICALTINU za prítomnosti a neprítomnosti glukánov bunkovej steny: kompetičné analýzy

Senzitívne bunky kvasiniek kmeňa S. cerevisiae 192.2d, ktoré boli kultivované v kvapalnom médiu YEPD (pH 4,7) pri 20 °C za prítomnosti čisteného WICALTINU s aktivitou 1 x 10⁵ E/ml, vykázali kinetiku usmrcovania uvedenú na obr. 2. Prídavkom rastlinného β-Ι,β-D-glukánu pustulanu bolo možné mieru prežitia kvasinkových buniek po pôsobení toxínu výrazne zvýšiť. Tento prídavok pri koncentráciách 10 mg/ml spôsobil úplné potlačenie toxicity preparátu WICALTIN. Na rozdiel od pustulanu nevykázal β-1,3-D-glukán laminarín schopnosť zvýšiť mieru prežitia toxínom upravovaných kvasinkových buniek (obr. 2).

Z uvedených poznatkov možno vyvodiť záver, že pôsobenie preparátu WICALTIN vyžaduje väzbu na β-1,6-D-glukány, ktoré fungujú ako primárne miesto väzby (Andockstelle) (receptory toxínu) na bunkovej stene kvasiniek. V súlade s tým sa dokázalo, že kvasinky s vyštiepením v chromozomálnom KRE1-génovom centre (Genlocus) majú toxínrezistentné správanie a po retransformácii s KRE1-nesúcim epizomálnym vektorom sú opäť toxínsenzitívne (obr. 3). V kre1-mutantoch spočíva rezistencia voči toxínu na podstatne zníženom obsahu p-1,6-D-glukánu, a tým podmieneným znížením väzby toxínu na povrch buniek kvasiniek, potrebnej pre letálny účinok.

31854/H

Príklad 4

Spektrum účinnosti a usmrcovania pôsobením WICALTINU

Pri agarovom difúznom teste preukázal čistený toxín WICALTIN z l/K califomica výraznú toxicitu voči kvasinkám uvedeným v tabuľke 2. S výnimkou troch kmeňov kvasiniek Candida crusei sa u J všetkých 22 sledovaných klinických izolátov od pacientov a rovnako u všetkých ostatných kontrolných kmeňov humánno-patogénnych druhov Candida preukázalo veľmi účinné ničenie pôsobením WICALTINU. U 14 toxínsenzitívnych druhov kvasiniek z celkom 10 rôznych rodov dokázal WICALTIN ako killer-toxín neobyčajné široké spektrum účinnosti.

Tabuľka 2

Spektrum účinnosti preparátu WICALTIN na patogénne a apatogénne kvasinky rôznych rodov. Všetky kmene sa skúšali pri agarovom difúznom teste (MBA; pH 4,7) proti čistenému preparátu WICALTIN. Aktivita aplikovaného toxínu bola vo všetkých prípadoch 1 x 10⁶ E/ml. Kmeň C. tropicalis (pacient č. 541965) pochádzal z ústavu Inštitút fur Medizinisché Mikrobiológie und Hygiene z univerzitnej kliniky v Mainze).

Kmeň kvasiniek	Fenotyp	Priemer inhibičného dvorca (mm)
Candida albicans ATCC 10231	S	11
C. glabrata NCYC 388	S	12
C. krusei 185	R	0
C. tropicalis pacient č. 541965	S	11
Debaromyces hansenii 233	S	16
Hanseniaspora uvarum ATCC 64295	R	0
Hasegawaea japonica var. Versatilis 191	R	0
Kluyveromyces lactis CBS 2359/152	S	22

31854/H

Kmeň kvasiniek	Fenotyp	Priemer inhibičného dvorca (mm)
K. marxianus C 8,1	R	0
Metchnikowia pulcherrima K/31 B6	S	8
Pichia anomala 245	S	17
P. farinosa 258	R	0
P. jardinii 258 ?	R	0
P. kluyveri ATCC 64301	R	0
P. membranaefaciens NCYC 333	R	0
Saccharomyces cerevisiae 192.2d	S	30
381	S	23
ATCC 42017 (K1-superkiller)	S	19
NCYC 738 (K2-killer)	S	14
452(= NCYC 1006)	S	16
Saccharomyces ludwigii 240	R	0
Schizosaccharomyces pombe CBS 1042	R	0
Sporothrix spec. 1129	S	11
Toruiospora delbrueckii 208	S	18
T. pretoriensis 186	S	1θ
Yarrowia lipolytica 271	S	8
Zygosaccharomyces bailii	S	23

Príklad 5

Klonovanie, sekvencovanie a molekulárna charakterizácia WICALTINkódujúceho WCT-génu kvasiniek W. califomica kmeň 3/57 (DSM 12865)

Na základe N-terminálnej aminokyselinovej sekvencie preparátu WICALTIN sa pripravili špecifické DNA-oligonukleotidy, ktoré viedli k identifikácii a klonovaniu a rovnako k molekulárno-biologickej charakterizácii chromozomálne lokalizovaného toxíngénu WCT. DNA-sekvencia WCT (SEG ID

31854/H

No 1) vykazuje jediný otvorený čítací rámec, ktorý kóduje potenciálne Nglykozylovaný proteín z 309 aminokyselín a s vypočítanou molekulovou hmotnosťou 34 017 Da.

Sledovanie účinnosti WCT-kódovaného killer-toxínu dokázalo, že v prípade preparátu WICALTIN ide o glykoproteín, ktorý jé pre kvasinky mimoriadne toxický, ktorého primárnym „cieľom (target)„_; sú β-1,3-D-glukány, ktoré sá vyskytujú v bunkovej stene kvasiniek. Jeho selektívna toxicita voči kvasinkám a hubám spočíva vtom, že WICALTIN rozrušuje v senzitívnej cieľovej bunke štruktúru a/alebo integritu bunkovej steny, takže napadá kvasinky v ich najcitlivejšom mieste, a tým ich ničí.

Príklad 6

Úprava a čistenie vírus-toxínu ZYGOCIN získaného zo supernatantu po kultivácii killer-kvasiniek Z. ba////kmeň 412 (DSM 12864)

Z kvasiniek Z. bailii kmeň 412 sa zo supernatantu kultivačného média killer-kvasiniek metódou, ktorú opísali Radler a kol. (1993) izoloval víruskódovaný killer-toxín ZYGOCIN, ktorý sa ďalej zahustil ultrafiltráciou a potom sa čistil pomocou afinitnej chromatografie. Jednostupňové čistenie ZYGOCINU opísané v citovanej štúdii využíva prirodzenú afinitu toxínu k manoproteínom bunkovej steny senzitívnych kvasiniek. Podľa metódy, ktorú opísali Schmitt a Radler (1997) sa izolovaný a čiastočne vyčistený manoproteín zo S. cerevisiae kmeň 192.2d kovalentne naviazal na epoxyaktivovanú Sepharose-6B-matricu (Fa. Pharmacia) a použil pre FPLC čistenie toxínu pomocou stĺpcovej chromatografie. Podľa SDS-PAGE vykázal týmto spôsobom čistený biologicky vysoko aktívny ZYGOCIN oddelené proteínové pásy so zjavnou molekulovou hmotnosťou cca 10 kDa (obr. 4).

Príklad 7

Spektrum účinnosti a usmrcovania pôsobením ZYGOCINU

31854/H

Spektrum účinnosti virálného ZYGOCINU z kvasiniek Z. bailii 412 (DSM 12864), stanovené pri agarovom difúznom teste, zahrňuje patogénne a apatogénne rody kvasiniek, z ktorých Candida albicans a Sporothrix schenkii sa predpokladajú, že sú pôvodcami chorôb u človeka a zvierat a Ustilago maydis a Debaromyces hansenii za škodlivé kvasinky v poľnohospodárstve a potravinárstve (tab. 3).

Tabuľka 3

Spektrum účinnosti ZYGOCINU voči patogénnym a apatogénnym kvasinkám rôznych rodov. Všetky kmene sa testovali pri agarovom difúznom teste (MBA, pH 4,5) na preparát ZYGOCIN s aktivitou 1 x 10⁴ E/ml.

ZYGOCIN-senzitívne kvasinky	Relatívny stupeň senzitivity
Saccharomyces cerevisiae	++
Candida albicans	+
Candida krusei	++
Candida glabrata	++
Candida vinii	+
Hanseniaspora uvarum	++
Kluyveromyces marxianus	+
Metchnikowia pulcherrima	+
Ustilago maydis	++
Debaromyces hansenii	++
Pichia anomala	++
Pichia jadinii	+
Pichia membranefaciens	+
Yarrowia lipolytica	+
Zygosaccharomyces rouxii	++

31854/H

Príklad 8

Klonovanie a sekvencovanie ZYGOCIN-kódujúceho ZBT-génu (ZBT) kvasiniek Z. bailii kmeň 412 (DSM 12864) cDNA-syntéza toxínkódujúceho dvojvláknového RNA-genómu killerkvasiniek Z: bailii 412 sa vykonala podľa metódy, ktorú qpísal Schmitt s čistenou a metylortuťhydroxidom denaturovanou M-dsRNA ako matricou a s rôznymi hexanukleotidmi ako „primérmi,,. Po ligácii do EcoRI-restringovaného vektoru pUC18, transformácii v E. colia izolácii rekombinantného plazmidu bolo možné identifikovať a sekvencovať niekoľko cDNA-klonov. cDNA-sekvencia ZYGOCINOM kódovaného čítacieho rámca (SEQ ID No 2) obsahuje genetickú informáciu pre prvotný proteín (Vorläuferprotein) (Pro-Toxin) z 238 aminokyselín,. ktorý má v aminokyselinovej pozícii RR¹³⁹ potenciálne Kex2endopeptidázové štiepne miesto. Pri in vivo vykonávanej - premene ProZYGOCINU v neskorom Golgiho štádiu (im späten Golgi-Stadium) sprostredkovanej Kex2 vzniká biologicky aktívny ZYGOCIN, ktorého molekulová hmotnosť (10 kDA; 99 aminokyselín) a N-terminálna aminokyselinová sekvencia súhlasia presne s hodnotami zodpovedajúcimi čistenému ZYGOCINU.

Heterologická expresia ZBT-cDNA v kvasinkách S. cerevisiae viedla vzhľadom k toxicite ZYGOCINU k tomu, že transformované kvasinky boli usmrtené svojim vlastným toxínom. V budúcnosti bude heterologická expresia ZYGOCINU zameraná na toxínrezistentné deliace sa kvasinky Schizosaccharomyces pombe, pretože - ako už bolo uvedené v príklade vírusového K28-toxínu - sú tieto deliace sa kvasinky pre expresiu a sekréciu cudzorodých proteínov obzvlášť vhodné.

Príklad 9

Expresia toxíngénu WCT a ZBT v transgénnych rastlinách

31854/H

Vzhľadom k tomu, že opísané killer-toxíny WICALTIN a ZYGOCIN majú široké spektrum účinnosti a usmrcujú i fytopatogénne kvasinky a huby, malo by byť možné pripraviť také transgénne rastliny, ktoré by boli odolné napr. proti infekcii kukurice zapríčinenej patogénom Ustilago maydis. Podobné pokusy sa už vykonali s rastlinami tabaku, ktoré pri heterologickej expresii prirodzeného vírusovo kódovaného killer-toxínu KP4 z U. maydis mali schopnosť secernovať príslušný killer-toxín, a tak získať špecifickú Ochranu proti infekciám vyvolaným určitými fytopatogénnymi kmeňmi U. maydis (Park a kol., 1996; Kinal a kol., 1995; Bevan, 1984). Na základe komerčne dostupných transformačných systémov založených na modifikovaných derivátoch prírodného Ti-plazmidu z Agrobacterium tumefaciens bolo možné klonované toxíngény WCT a ZBT naklonovať do tzv. dvojsmerných pBI-vektorov (Fa. Clontech) a použiť k získaniu transgénnych rastlín. Príslušné toxíngény WCT a ZBT boli pod transkripčnou kontrolou silného promótora vírusu karfiolovej mozaiky (CaMVP). Výstavba konštruovaných vektorov je schematicky znázornená na obr. 5.

Príklad 10

Heterologická expresia WICALTIN-kódujúceho WCT-génu kvasiniek IV. califomica 3/57 (DSM 12865) v S. cerevisiae

Kvôli heterologickej expresii WCT-génu v kvasinkách S. cerevisiae sa WICALTIN-kódujúci WCT-gén ako 930 bp EcoR/Smal-fragment naklonoval do všeobecne dostupného 2 μ vektoru pYX242. Výsledný vektor pSTH2 (obr. 6) obsahuje toxíngén pod transkripčnou kontrolou vlastného kvasinkového triózafosfát-izomeráza-promótoru (TPI) a umožňuje tak po transformácii v kvasinkách (S. cerevisiae) vykonať konštitutívnu expresiu WICALTINU. Gélová elektroforéza supernatantu kultivačného média dokázala u takto získaných kvasinkových transformantov, že rekombinantný WICALTIN sa secernuje do kultivačného média a vykazuje p-1,3-D-glukanázovú aktivitu (obr. 6) zodpovedajúcu homologickému WICALTINU (z „divokého,, kmeňa DSM 12865).

31854/H

Príkladu

Pokusy s heterologickou expresiou WICALTINU a ZYGOCINU v deliacich sa kvasinkách Schizosaccharomyces pombe

Vzhľadom k tomu, že deliace sa kvasinky ako vo forme intaktnej bunky, tak i ako sférôplast bez bunkovej steny sú voči WICALTINU a ZYGOCINU rezistentné, sú vhodné^;ako hostiteľské bunky pre heterologickú expresiu týchto toxínov. Aby sa zaručilo, že tieto rekombinantné toxíny sa v deliacich sa kvasinkách nielen exprimujú, ale že sa dostanú i do intracelulárnej sekrečnej cesty, a tým sa secernujú do vonkajšieho kultivačného média, skonštruoval sa vektor (ρΤΖ/ατ, obr. 7), ktorý je nositeľom funkčného signálu pre sekréciu a spracovanie v S. pombe (S/P) a ktorý pochádza z cDNA virálneho K28preprotoxíngénu kvasiniek S. cerevisiae (pozri Schmitt, 1995; Schmitt a Tipper, 1995). Tento sekrečný a procesný signál zaisťuje, že sa vždy „in-frame„ zaradený cudzorodý proteín v deliacich sa kvasinkách importuje do dutiny (Lumen) endoplazmatického retikula, a tým sa dostane do sekrečnej cesty kvasiniek. Prostredníctvom Kex2p-štiepneho miesta na C-konci S/P oblasti sa odštiepi požadovaný cudzorodý proteín v neskorom Golgiho priestore v bunkách (in spätem Golgi-Kompartiment) pôsobením vlastnej kvasinkovej Kex2p-endopeptidázy od svojho intracelulárneho „transportného prostriedku (Transport-Vehikel,,) a môže sa nakoniec secernovať ako biologicky aktívny proteín (ZYGOCIN a/alebo WICALTIN) do vonkajšieho kultivačného média.

Príklad 12

Porovnanie biologickej aktivity čisteného WICALTINU a topických antimykotík Clotrimazol a Miconazol

Vzhľadom k tomu, že čistený WICALTIN vykazuje široké spektrum účinnosti a účinne ničí i ľudské patogénne kvasinky a/alebo huby, má značný význam i ako potenciálne antimykotikum. Preto sa vykonali štúdie, pri ktorých sa WICALTIN porovnával s veľmi často používanými topickými antimykotikami Clotrimazol a Miconazol. Najprv sa testovalo toxické pôsobenie Clotrimazolu a

31854/H

Miconazolu pri MBA-agarovom difúznom teste, pri ktorom sa ako indikátorové kvasinky použili Sporothríx spec. Pritom sa Clotrimazol rozpustil na koncentráciu 10 mg/ml v etanole (96 %); tento základný roztok sa zriedil redestilovanou vodou a použil vždy po 100 μΙ pri MBA-teste v koncentráciách od 0,1 do 10 mg/ml. Priemer inhibičného dvorca (Hemmhof) bol pri použitom množstve 10 - 50 μ9 Clotrimazolu medzi 12 a 32 mm. Z Miconazolu sa pripravil základný roztok 100 μρ/ηιΙ v DMSO (100 %), ktorý; sa pri MBA-teste sledoval rovnakým spôsobom ako u Clotrimazolu na biologickú aktivitu voči Sporothríx spec. Použitie 0,08-0,3 μ9 Miconazolu viedlo pri „Bioassay,, k inhibičným dvorcom s priemerom medzi 22 a 36 mm. Biologická aktivita 10 μς Clotrimazolu, resp. 0,08 g Miconazolu zodpovedala toxicite 2 g čisteného WICALTINU. Z porovnania týchto troch skúšaných zlúčenín vzťahujúceho sa na ich molekulové hmotnosti vyplýva, že WICALTIN už v koncentrácii 0,07 pmol vykazuje rovnakú aktivitu ako 0,2 pmol Miconazolu a 29 pmol Clotrimazolu; to znamená, že WICALTIN je ako antimykotikum vysoko účinný (obr. 8).

Príklad 13

Dôkaz WICALTIN-kódujúceho WCT-génu kvasiniek W. califomica 3/57 (DSM 12865) pomocou Southern-hybridizácie s génovo-špecifickou DNA-sondou

Ako dôkaz pre to, že nukleovú kyselinu podľa SEQ ID No 1 možno použiť na prípravu WICALTIN-špecifickej DNA-sondy pre nasledujúcu Southern-hybridizáciu, sa DIG-značená, 930 bp dlhá DNA-sonda použila ako dôkaz WCT-génu naklonovaného do vektoru pSTH1. Konštruovaný vektor pSTH1 predstavuje derivát všeobecne dostupného prokaryotického klonovacieho vektoru pBR322.

Výsledky elektroforézy na agarózovom géli uvedené na obr. 9 a príslušné Southern-Blot-analýzy nepochybne preukázali, že WICALTINkódujúci WCT-gén možno pomocou sondy pripravenej z nukleových kyselín dokázať.

31854/H

Príklad 14

Northern-Blot-analýza pre dôkaz transkripčnej indukcie WICALTIN-kódujúceho WCT-génu kvasiniek Williopsis califomica 3/57 (DSM 12865) pomocou β-1,3-Dglukánu

Kvôli dokázaniu WCT-transkripcie indukovanej β-1,3-D-glukánom sa kultivoval kmeň kvasiniek DSM 12865 v 300 ml BAVC-médiu, resp. v BAVC- ? médiu s prídavkom 0,03 % prírodného β-1,3-D-glukánu laminarínu počas 48 hodín pri teplote 20 °C za mierneho trepania (60 ot./min.) a postupne sa v rôznych intervaloch použil na prípravu celkovej RNA. Všetky vzorky (10 ml) sa pred izoláciou RNA upravili na rovnaký počet buniek 1,8 x 10⁸ buniek/ml a potom sa tieto vzorky elektroforeticky delili v denaturujúcich agarózaformaldehydových géloch. Ako vyplýva z obr. 10, bolo možné preukázať ako za neindukčných podmienok (BAVC-médium bez prídavku), tak i v laminarínom obohatenom BAVC-médiu, že WCT-transkript má veľkosť 1 100 báz. Bez prídavku glukánu sa dosiahla maximálna expresia WCT ku koncu fázy exponenciálneho rastu (po 19 hodinách); podstatne slabšie hybridizačné signály v stacionárnej fáze rastu ukazujú na zoslabenú transkripciu. Pri indukujúcich podmienkach kultivácie (za prítomnosti laminarínu) vykázal WCTtranskript po 10 hodinách podstatne vyššiu intenzitu ako v neindukujúcom kultivačnom médiu, z čoho vyplýva, že táto transkripcia WICALTINOM kódovaného WCT-génu sa môže vyvolať prídavkom β-1,3-D-glukánu.

Dodatok k príkladom uskutočnenia vynálezu

Médiá a roztoky použité v príkladoch:

a) BAVC-médium glukóza 50 g/l

D,L-jablčnan 20 g/l trinátriumcitrát 0,5 g/l (NH₄)₂SO₄

MgSO₄

1,5 g/l 1,0 mg/l

31854/H myoinozit 0,04 g/l základný roztok aminokyselín (10 x) 200 ml/l základný roztok stopových prvkov (100 x) 10 ml/l základný roztok vitamínov (100 x) 20 ml/l

b) základný roztok aminokyselín (10 x) alanín 0,75 g/l arginínmonohydrochlorid ‘ 3,5 g/l asparágová kyselina 0,5 g/l glutámová kyselina 3 g/l histidínmonohydrochlorid 0,2 g/l metionín 0,4 g/l serín 0,5 g/l treonín 2 g/l tryptofán 0,4 g/l

c) základný roztok stopových prvkov (100 x) boritá kyselina 200 mg/l

FeCI3.6 H2O 200 mg/l

ZnSO4.7 H2O 200 mg/l

AICI3 200 mg/l

CuSO4.5 H2O 100 mg/l

Na2MoO4.2 H2O 100 mg/l

LÍ2SO4 . H2O 100 mg/l

KJ 100 mg/l hydrogénvínan draselný 2 g/l

d) základný roztok vitamínov (100 x)

4-aminobenzoová kyselina 20 mg/l biotín 2 mg/l listová kyselina 2 mg/l nikotínová kyselina 100 mg/l pyridoxolhydrochlorid 100 mg/l

31854/H riboflavín tiamíniumdichlorid

Ca-D-pantotenát mg/l 50 mg/l 100 mg/l

Biotín: bol rozpustený v roztoku 5 g KH2PO4 v 50 ml destilovanej vody.

Listová kyselina: bola rozpustená v 50 ml destilovanej vody s prídavkom niekoľkých kvapiek zriedeného NaOH.>

Riboflavín: bol rozpustený za zahrievania v 500 ml destilovanej vody s niekoľkými kvapkami HCI.

Ostatné vitamíny sú rozpustné v malom množstve destilovanej vody.

Hodnota pH BAVC-média bola upravená prídavkom KOH na pH 4,7. Glukóza a základné roztoky boli sterilizované oddelene. Základné roztoky aminokyselín, vitamínov a stopových prvkov sa sterilizovali počas 20 minút prúdom pary pri 100 °C a potom sa pridalo BAVC-médium upravené v autokláve.

Vysvetlenie obrázkov na výkresoch a najdôležitejších sekvencii

SEQ ID No 1: DNA- a odvodená aminokyselinová sekvencia WCT-kódovaného proteíntoxínu WICALTINU z kvasiniek Williopsis califomica kmeň 3/57.

SEQ ID No 2: cDNA- a odvodená aminokyselinová sekvencia ZBT-kódovaného proteíntoxínu ZYGOCINU z kvasiniek Z. bailii.

Obr. 1: N-terminálne aminokyselinové sekvencie W. califomica-iox\nu WICALTINU a endo-p-1,3-glukanázy Bgl2 z kvasiniek S. cerevisiae. Hrubo sú vytlačené jednotlivé odchýlky inak rovnakých čiastkových sekvencii (Bgl2psekvencie ako uvádzajú Klebl a Tanner, 1989).

Obr. 2: Kinetika usmrcovania buniek senzitívnych kvasiniek S. cerevisiae 192.2 WICALTINOM za prítomnosti (2a) a neprítomnosti (2b) β-D-glukánu laminarínu (L) a pustulanu (P). Použitý toxín mal celkovú aktivitu 4,0 x 10⁵ E/ml pri špecifickej aktivite 4,2 x 10⁵ E/mg proteínu.

Obr. 3 (a, b, c, d): Agarový difúzny test ako dôkaz senzitivity/rezistencie voči

31854/H

WICALTINU u Kre1⁺ a Kreľ kmeňov kvasiniek S. cerevisiae. Po transformácii

WICALTIN-rezistentného kre1-nulmutantu S. cerevisiae SEY6210 [kre1] s KRE1- nesúcim vektorom pPGK [KRE1] sa opäť obnovila plná citlivosť voči

WICALTINU.

Obr. 4: (A) Gélová elektroforéza (SDS-PAGE) ZYGOCINU produkovaného a secernovaného kvasinkami Z. bailii kmeň 412 (DSM 12864)_; po afinitne] chromatografii nä mahoproteín-Sepharose. (B) Agarový difúzny test ako dôkaz biologickej aktivity čisteného killer-toxínu ZYGOCINU.

Obr. 5: Schéma štruktúry ZBT-, resp. WCT-nesúceho expresného vektoru na prípravu transgénnych rastlín.

(Vysvetlivky: RB, LB: pravé a ľavé okrajové (right and left border) sekvencie prírodného Tl-plazmidu z Agrobacteríum tumefaciens', CaMV-P: 35S promótor vírusu karfiolovej mozaiky; NOS-P, NOS-T: transkripčný promótor a terminátor nopalínsyntázy; kan^R: kanamycín-rezistentný gén zo Streptococcus pre selekciu vE coli; NPT-II: neomycín-fosfotransferázový gén ztranspozónu Tn5 pre selekciu v rastline).

Obr. 6:

(A) Parciálna reštrikčná karta epizomálneho vektoru pSTH2 pre heterologickú expresiu WICALTIN-kódujúceho toxíngénu WCT v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae. Vektor pSTH2 je konštruovaný plazmid vychádzajúci z komerčne dostupného 2μ Multi-Copy-vektoru pYX242, v ktorom je WCT-gén klonovaný z kmeňa DSM 12865 ako 930 bp EcoRI/Smal-fragment. Príslušný toxíngén podlieha transkripčnej kontrole vlastného kvasinkového TPI-promótoru a umožňuje tak po transformácii v S. cerevisiae intenzívnu a konštitutívnu expresiu WICALTINU.

(B) Gélová elektroforéza (SDS-PAGE; 10 - 22,5 %-ný gradientový gél) koncentrovaného supernatantu kultivačného média S. cerevisiae po transformácii s konštruovaným WICALTIN-expresným vektorom pSTH2 (záznam/Spur/1). WICALTIN heterologicky exprimovaný v S. cerevisiae je označený šípkou.

31854/H (C) Dôkaz extracelulárnej β-1,3-glukanázovej aktivity kvasiniek S. cerevisiae po transformácii s WICALTIN-exprimujúcim kvasinkovým vektorom pSTH2. Kvôli stanoveniu exo-β-1,3-glukanázovej aktivity boli kvasinkové kolónie kultivované na bezleucínovom SC-agare postriekané 0,04 %-ným 4-metylumbelliferyl^-Dglukozidom (MUG) v 50 mM nátriumacetátovom pufre (pH 5,2). Po inkubácii pri 37 °C počas 30 minút sa agarové dosky ožiarili UV-svetlom (vlnová dĺžka 254 nm). Glukanázová aktivita sa preukázala fluorescenciou na základe MUGhydrolýzy.

(Vysvetlivky: 1 a 4, S. cerevisiae transformované vektorom (pEP-WCT), ktorý exprimuje WICALTIN-kódujúci WCT-gén za pôsobenia vlastného promótora; 2. kvasinky „divokého,, typu W. californica 3/57 (DSM 12865); 3. „divoké,, kvasinky W. californica 3/111; 5. S. cerevisiae po transformácii s WICALTINexprimujúcim vektorom pYX-WCT; 6. S. cerevisiae transformované so základným vektorom pYX242 (bez toxíngénu)).

Obr. 7: Schéma štruktúry vektoru pTZ cdx pre heterologickú expresiu a sekréciu cudzorodých proteínov (hlavne WICALTINU a ZYGOCINU) v deliacich sa kvasinkách Schizosaccharomyces pombe.

(Vysvetlivky: P_nmt1, T_nmn, transkripčný promótor a terminátor nmt1 génu deliacich sa kvasiniek S. pombe regulovaný tiamínom; S/P sekrečná a procesná sekvencia virálneho K28-preprotoxínu pučiacich kvasiniek S. cerevisiae, ars1, autonómne sa replikujúce sekvencie z chromozómu 1 deliacich sa kvasiniek; Ieu2, leucín-2-markérový gén pre selekciu leucínprototrofných transformantov S. pombe).

Obr. 8: Porovnanie biologickej aktivity čisteného WICALTINU, Clotrimazolu a Miconazolu; uvedené molárne množstvá vyvolali pri „Bioassay„ (agarový difúzny test) voči senzitívnym indikačným kvasinkám Sporothrix spec. priemer inhibičného dvorca 12 mm.

Obr. 9: Dôkaz WICALTIN-kódujúceho WCT-génu kvasiniek W. californica 3/57 (DSM 12865) klonovaného vpSTHI (derivát pBR322) vykonaný pomocou elektroforézy na agarózovom géli (A) a pomocou Southern-hybridizácie s DIG31854/H značenou WCT-sondou (B).

(Vysvetlivky: DIG-značený DNA-dĺžkový štandard II; záznam 1, pSTH1 restringovaný s EcoRI a Sa/I; záznam 2, DNA-markér „Smart-ladder,,).

Obr. 10: Northern-analýza transkripčnej indukcie WICALTIN-kódujúceho WCTgénu kvasiniek W. califomica 3/57 (DSM 12865) za neindukujúcich podmienok kultivácie v BAVC-médiu (A) a za indukujúcich podmienok v BAVC-médiu s prídavkom 0,03 % láminarínu (B). Elektroforetické delenie dĺžkovej RNA izolovanej z kmeňa DSM 12865 sa vykonávalo v denaturujúcom agaróza/formaldehydovom géli pri konštantnom napätí (7 V/cm). RNA sa na nylonovej membráne hybridizovala proti WICALTIN-špecifickej DIG-značenej sonde (630 bp) a detekovala pomocou chemiluminiscencie.

(Vysvetlivky: M, DIG-značený DNA-dĺžkový štandard I; záznamy 1-8 zodpovedajú dobám odberu vzoriek pre izoláciu celkovej RNA; záznam 1, 10 hod. záznam 2, 15 hod., záznam 3, 19 hod., záznam 4, 24 hod., záznam 5, 33 hod., záznam 6, 38 hod., záznam 7, 43 hod., záznam 8, 48 hod.).

Skratky použité v texte

WCT Williopsis Califomica Toxin

ZBT Zygosaccharomyces Bailii Toxin

ZYGOCIN názov: toxín secernovanýz DSM 12864

WICALTIN názov: toxín secernovaný z DSM 12865

Ďalej uvedené mikroorganizmy použité podľa tohto vynálezu boli uložené do medzinárodne uznávanej Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Maschenroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, SRN, podľa požiadaviek Budapeštianskej zmluvy o medzinárodnom uznaní deponovania mikroorganizmov pre patentové účely (číslo uloženia, dátum uloženia).

Williopsis califomica kmeň 3/57 (DSM 12865)(09.06.1999)

31854/H

Zygosaccharomyces bailii kmeň 412 (DSM 12864)(09.06.1999).

31854/H

Sekvenčný protokol· <110> Aventis Research & Technologies GmbH & Co KG <120> Antimykotiká a fungicídy, spôsob ich prípravy a ich použitie <130> 99F028 <140> 19930959.0 <14l> 1999-07-05 <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 930 <212> DNA <213> Williopsis californica <220>

<221> CDS <222> (1). . (930) <400> 1

atg cgt Met Arg 1

ttc Phe

act Thr

aca Thr 5

ctc Leu

gtt Val

gcc Ala

ctc Leu

gca Ala 10

ggt Gly

gcc Ala

att íle

tcc tca gtc

48

Ser

Ser 15

Val

cag

gcc

atc

ggc

caa

cta

get

ttt

aac

ttg

ggt

gtc

aag

gat

aac

tca

96

Gin

Ala

íle

Gly

Gin

Leu

Ala

Phe

Asn

Leu

Gly

Val

Lys

Asp

Asn

Ser

20

25

30

ggt

cag

tgc

aag

act

gcc

tca

gag

tac

aag

gat

gac

ttg

tct

acc

ctt

144

Gly

Gin

Cys

Lys

Thr

Ala

Ser

Glu

Tyr

Lys

Asp

Asp

Leu

Ser

Thr

Leu

35

40

45

tca

ggc

tac

aca

tct

aag

gtt

aga

gtc

tac

get

gcc

tca

gac

tgt

aac

192

Ser

Gly

Tyr

Thr

Ser

Lys

Val

Arg

Val

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asp

Cys

Asn

50

55

60

act

ttg

cag

act

ttg

ggt

cca

gtt

gtc

gaa

gag

get

ggc

ttc

tca

ttt

240

Thr

Leu

Gin

Thr

Leu

Gly

Pro

Val

Val

Glu

Glu

Ala

Gly

Phe

Ser

Phe

65

70

75

80

ttc

gtt

ggt

att

tgg

cca

aac

gat

gat

get

cac

ttc

cag

gaa

gag

caa

288

Phe

Val

Gly

íle

Trp

Pro

Asn

Asp

Asp

Ala

His

Phe

Gin

Glu

Glu

Gin

90 95

31854/H

3/

gac get

ttg Leu

aaa Lys 100

act Thr

tat Tyr

ttg cca aag att

aag Lys

aga Arg

tcc Ser

aca Thr 110

gtg Val

gag Glu

336

Asp

Ala

Leu

Pro Lys 105

íle

gcc

ttc

act

gtt

ggt

tet

gag

gcc

ttg

tat

aga

gat

gat

atg

act

get

384

Ala

Phe

Thr

Val

Gly

Ser

Glu

Ala

Leu

Tyr

Arg

Asp

Asp

Met

Thr

Ala

115

120

125

caa

gag

ttg

get

gac

aga

atc

aaa

act

att

aga

gag

ttg

gtt

gcc

act

432

Gin

Glu

Leu

Ala

Asp

Arg

íle

Lys

Thr

íle

Arg

Glu

Leu

Val

Ala

Thr

130

135

140

att

gac

gac

tcc

gaa

ggt

aac

tca

tat

get

ggt

att

cca

gtt

ggt

ttc

480

íle

Asp

Asp

Ser

Glu

Gly

Asn

Ser

Tyr

Ala

Gly

íle

Pro

Val

Gly

Phe

145

150

155

160

gtt

gac

tcc

tgg

aac

gtt

ttg

gtt

gat

ggt

get

tet

cac

cca

get

att

528

Val

Asp

Ser

Trp

Asn

Val

Leu

Val

Asp

Gly

Ala

Ser

His

Pro

Ala

íle

165

170

175

gtt

gag

get

gat

gtt

gtg

ttc

gcc

aat

get

ttc

tet

tac

tgg

caa

ggt

576

Val

Glu

Ala

Asp

Val

Val

Phe

Ala

Asn

Ala

Phe

Ser

Tyr

Trp

Gin

Gly

180

185

190

cag

act

cag

cag

aac

tcg

tca

tac

tet

ttc

ttt

gac

gac

. att

atg

caa

624

Gin

Thr

Gin

Gin

Asn

Ser

Ser

Tyr

Ser

Phe

Phe

Asp

Asp

íle

Met

Gin

195

200

205

get

ttg

caa

acc

att

caa

act

get

aag

ggt

gag

aca

gat

atc

act

ttc

672

Ala

Leu

Gin

Thr

íle

Gin

Thr

Ala

Lys

Gly

Glu

Thr

Asp

íle

Thr

Phe

210

215

220

tgg

gtt

ggt

gag

acc

ggc

tgg

cca

acc

gat

ggt

act

cac

ttt

gaa

gac

720

Trp

Val

Gly

Glu

Thr

Gly

Trp

Pro

Thr

Asp

Gly

Thr

His

Phe

Glu

Asp

225

230

235

240

tet

gtc

cca

tet

gtt

gag

aat

get

cag

acc

ttc

tgg

aaa

gat

gcc

gtc

768

Ser

Val

Pro

Ser

Val

Glu

Asn

Ala

Gin

Thr

Phe

Trp

Lys

Asp

Ala

Val

245

250

255

tgt

gcc

att

aga

ggt

tgg

ggt

atc

aat

gtt

att

gcc

ttt

gag

gcc

ttt

816

Cys

Ala

íle

Arg

Gly

Trp

Gly

íle

Asn

Val

íle

Ala

Phe

Glu

Ala

Phe

260

265

270

gac

gaa

get

tgg

aag

cca

gat

acc

tet

ggt

acc

tet

gat

gtg

gaa

aag

864

Asp

Glu

Ala

Trp

Lys

Pro

Asp

Thr

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Val

Glu

Lys

275

280

285

tac

tgg

ggt

gtt

tgg

gac

tet

aac

age

aag

ttg

aag

tat

gat

ttg

tcc

912

Tyr

Trp

Gly

Val

Trp

Asp

Ser

Asn

Ser

Lys

Leu

Lys

Tyr

Asp

Leu

Ser

31854/H si

	290				295	300
tgt	gac	ttt	acc	tct	tag		930
Cys	Asp	Phe	Thr	Ser
305					310

<210> 2 <211> 309 <212> PRT <213> Williopsis californica <400> 2

Met 1

Arg

Phe

Thr Thr 5

Leu Val Ala

Leu

Ala 10

Gly Ala

íle

Ser

Ser 15

Val

Gin

Ala

íle

Gly

Gin

Leu

Ala

Phe

Asn

Leu

Gly

Val

Lys

Asp

Asn

Ser

20

25

30

Gly

Gin

Cys

Lys

Thr

Ala

Ser

Glu

Tyr

Lys

Asp

Asp

Leu

Ser

Thr

Leu

35

40

45

Ser

Gly

Tyr

Thr

Ser

Lys

Val

Arg

Val

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asp

Cys

Asn

50

55

60

Thr

Leu

Gin

Thr

Leu

Gly

Pro

Val

Val

Glu

Glu

Ala

Gly

Phe

Ser

Phe

65

70

75

80

Phe

Val

Gly

íle

Trp

Pro

Asn

Asp

Asp

Ala

His

Phe

Gin

Glu

Glu

Gin

85

90

95

Asp

Ala

Leu

Lys

Thr

Tyr

Leu

Pro

Lys

íle

Lys

Arg

Ser

Thr

Val

Glu

100

105

110

Ala

Phe

Thr

Val

Gly

Ser

Glu

Ala

Leu

Tyr

Arg

Asp

Asp

Met

Thr

Ala

115

120

125

Gin

Glu

Leu

Ala

Asp

Arg

íle

Lys

Thr

íle

Arg

Glu

Leu

Val

Ala

Thr

130

135

140

íle

Asp

Asp

Ser

Glu

Gly

Asn

Ser

Tyr

Ala

Gly

íle

Pro

Val

Gly

Phe

145

150

155

160

Val

Asp

Ser

Trp

Asn

Val

Leu

Val

Asp

Gly

Ala

Ser

His

Pro

Ala

íle

165

170

175

Val

Glu

Ala

Asp

Val

Val

Phe

Ala

Asn

Ala

Phe

Ser

Tyr

Trp

Gin

Gly

31854/H

180

185

190

Gin

Thr

Gin

Gin

Asn

Ser

Ser

Tyr

Ser

Phe

Phe

Asp

Asp

íle

Met

Gin

195

200

205

Ala

Leu

Gin

Thr

íle

Gin

Thr

Ala

Lys

Gly

Glu

Thr

Asp

íle

Thr

Phe

210

215

220

Trp

Val

Gly

Glu

Thr

Gly

Trp

Pro

Thr

Asp

Gly

Thr

His

Phe

Glu

Asp

225

230

235

240

Ser

Val

Pro

Ser

Val

Glu

Asn

Ala

Gin

Thr

Phe

Trp

Lys

Asp

Ala

Val

245

250

255

Cys

Ala

íle

Arg

Gly

Trp

Gly

íle

Asn

Val

íle

Ala

Phe

Glu

Ala

Phe

260

265

270

Asp

Glu

Ala

Trp

Lys

Pro

Asp

Thr

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Val

Glu

Lys

275

280

285

Tyr

Trp

Gly

Val

Trp

Asp

Ser

Asn

Ser

Lys

Leu

Lys

Tyr

Asp

Leu

Ser

290

295

300

Cys

Asp

Phe

Thr

Ser

305

<210> 3 <211> 717 <212> DNA <213> Zygosaccharomyces bailii <220>

<221> CDS <222> 1)..(717) <400> 3 atg aaa gca gcc caa ata tta aca gca agt ata gta agc tta ttg cca Met Lys Ala Ala Gin íle Leu Thr Ala Ser íle Val Ser Leu Leu Pro

10 15 ata tat act agt get aga aac ata tta gac aga gaa tac aca gca aac íle Tyr Thr Ser Ala Arg Asn íle Leu Asp Arg Glu Tyr Thr Ala Asn

25 30 gaa tta aaa act get ttt gga gat gaa gaa att ttt aca gat ttg acg

Glu Leu Lys Thr Ala Phe Gly Asp Glu Glu íle Phe Thr Asp Leu Thr

144

31854/H

35

40

45

tat

cac

att

cac

gtt

aac

gtc

agt

ggc

gaa

att

gac

tet

tac

tat

cat

192

Tyr

His

íle

His

Val

Asn

Val

Ser

Gly

Glu

íle

Asp

Ser

Tyr

Tyr

His

50

55

60

aat

tta

gtc

aat

ttt

gtc

gat

aac

get

cta

gca

aac

aaa

gat

att

aat

240

Asn

Leu

Val

Asn

Phe

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Ala

Asn

Lys

Asp

íle

Asn

65

70

75

80

aga

tat

ata

tac

get

ata

ttt

aca

cag

cag

aca

aac

tat

aca

gag

gat

288

Arg

Tyr

íle

Tyr

Ala

íle

Phe

Thr

Gin

Gin

Thr

Asn

Tyr

Thr

Glu

Asp

85

90

95

ggg

ctc

att

gag

tac

tta

aat

cat

tac

gat

tca

gag

act

tgc

aaa

gat

336

Gly

Leu

íle

Glu

Tyr

Leu

Asn

His

Tyr

Asp

Ser

Glu

Thr

Cys

Lys

Asp

100

105

110

atc

att

act

cag

tat

aat

gtt

aac

gta

gac

act

agt

aac

tgt

ata

age

384

íle

íle

Thr

Gin

Tyr

Asn

Val

Asn

Val

Asp

Thr

Ser

Asn

Cys

íle

Ser

115

120

125

aat

act

aca

gat

caa

get

aga

ctc

caa

cgt

ege

gga

ggg

tgg

gtg

aac

432

Asn

Thr

Thr

Asp

Gin

Ala

Arg

Leu

Gin

Arg

Arg

Gly

Gly

Trp

Val

Asn

130

135

140

cca

cat

tgt

agt

ggt

gat

aac

tta

gcc

gat

act

age

gat

tgt

tgt

aac

480

Pro

His

Cys

Ser

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

Asp

Thr

Ser

Asp

Cys

Cys

Asn

145

150

155

160

ttg

get

tat

aac

aag

att

aac

ccc

tet

tca

aac

tta

cag

tca

tgg

aat

528

Leu

Ala

Tyr

Asn

Lys

íle

Asn

Pro

Ser

Ser

Asn

Leu

Gin

Ser

Trp

Asn

165

170

175

tat

gtt

gtc

ggg

cag

tgt

cac

tat

att

tet

cac

get

aat

gga

aag

gta

576

Tyr

Val

Val

Gly

Gin

Cys

His

Tyr

íle

Ser

His

Ala

Asn

Gly

Lys

Val

180

185

190

tgt

agt

ggt

get

gac

agg

caa

cag

tta

get

gaa

aat

gta

tgt

aac

tgg

624

Cys

Ser

Gly

Ala

Asp

Arg

Gin

Gin

Leu

Ala

Glu

Asn

Val

Cys

Asn

Trp

195

200

205

tgt

cag

gtt

aac

ggt

ggt

gtt

age

get

ttt

get

age

agt

agt

tet

gca

672

Cys

Gin

Val

Asn

Gly

Gly

Val

Ser

Ala

Phe

Ala

Ser

Ser

Ser

Ser

Ala

210

215

220

cat

cca

ggt

get

tgc

atg

agt

gat

gta

ggg

ttc

tgc

tat

qct

tag

717

His

Pro

Gly

Ala

Cys

Met

Ser

Asp

Val

Gly

Phe

Cys

Tyr

Ala

225

230

235

31854/H

<210>	4
<211>	238
<212>	PRT
<213>	Zygosaccharomyces	bai
<400>	4
Met Lys Ala Ala Gin íle	Leu
1	5

Iii íle Tyr Thr Ser Ala Arg Asn 20

Glu Leu Lys Thr Ala Phe Gly 35

Tyr His íle His Val Asn Val 50 55

Asn Leu Val Asn Phe Val Asp 65 70

Arg Tyr íle Tyr Ala íle Phe 85

Gly Leu íle Glu Tyr Leu Asn 100 íle íle Thr Gin Tyr Asn Val 115

Asn Thr Thr Asp Gin Ala Arg 130 135

Pro His Cys Ser Gly Asp Asn 145 150

Leu Ala Tyr Asn Lys íle Asn 165

Tyr Val Val Gly Gin Cys His 180

Cys Ser Gly Ala Asp Arg Gin 195

Cys Gin Val Asn Gly Gly Val 210 215

Thr Ala Ser íle Val Ser Leu Leu 10 15 íle Leu Asp Arg Glu Tyr Thr Ala 25 30

Asp Glu Glu íle Phe Thr Asp Leu 40 45

Ser Gly Glu íle Asp Ser Tyr Tyr 60

Asn Ala Leu Ala Asn Lys Asp íle 75

Thr Gin Gin Thr Asn Tyr Thr Glu 90 95

His Tyr Asp Ser Glu Thr Cys Lys 105 110

Asn Val Asp Thr Ser Asn Cys íle 120 125

Leu Gin Arg Arg Gly Gly Trp Val 140

Leu Ala Asp Thr Ser Asp Cys Cys 155

Pro Ser Ser Asn Leu Gin Ser Trp 170 175

Tyr íle Ser His Ala Asn Gly Lys 185 190

Gin Leu Ala Glu Asn Val Cys Asn 200 205

Ser Ala Phe Ala Ser Ser Ser Ser 220

Pro

Asn

Thr

His

Asn

Asp

Asp

Ser

Asn

Asn

160

Asn

Val

Trp

Ala

31854/H

Ý3

His Pro Gly Ala Cys Met Ser Asp Val Gly Phe Cys Tyr Ala 225 230 235

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Proteíntoxíny získateľné z Williopsis califomica a/alebo Zygosaccharomyces bailii.
2. 2. Proteíntoxíny podľa nároku 1, získateľné z DSM 12864 a/alebo DSM

   12865. ;
3. 3. Proteíntoxíny podľa nároku 1 a 2, vyznačujúce sa tým, že majú antimykotické a/alebo fungicídne účinky.
4. 4. Proteíntoxín podľa niektorého z nárokov 1 až 3 s glukanázovou aktivitou.
5. 5. Proteíntoxín podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa viaže na β1,6-D-glukán a vykazuje β-1,3-D-glukanázovú aktivitu a/alebo β-1,3-ϋglukanozyltransferázovú aktivitu.
6. 6. Nukleová kyselina kódujúca glukanázu a/alebo proteíntoxín podľa niektorého z nárokov 1 až 5 s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID No 1 alebo SEQ ID No 2 alebo jej funkčný variant a jej časti minimálne s 8 nukleotidmi, pričom SEQ ID No 1 alebo SEQ ID No 2 je súčasťou tohto nároku.
7. 7. Nukleová kyselina podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že táto nukleová kyselina je DNA alebo RNA, prednostne dvojvláknová DNA.
8. 8. Nukleová kyselina podľa nároku 6 alebo 7, vyznačujúca sa tým, že táto nukleová kyselina je DNA s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID No 1 s pozíciou báz 1 až 951 alebo SEQ ID No 2 s pozíciou báz 1 až 717, pričom SEQ ID No 1 alebo SEQ ID No 2 je súčasťou tohto nároku.
9. 9. Nukleová kyselina podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že táto nukleová kyselina obsahuje jednu alebo viacero regulačných oblastí, ako je promótor, enhancer, terminátor a/alebo 3'-terminálnu PolyA-sekvenciu a/alebo Kex2p-endopeptidázové štiepne miesto nevyhnutné pre intracelulárne spracovanie pro-toxínu a/alebo jedno alebo niekoľko potenciálnych N31854/H glykozylačných miest.
10. 10. Nukleová kyselina podľa niektorého z nárokov 8 až 9, získateľná z DSM 12864 a/alebo DSM 12865.
11. 11. Nukleová kyselina podľa niektorého z nárokov 6 až 10, vyznačujúca sa tým, že táto nukleová kyselina je obsiahnutá vo vektore, prednostne v expresnom vektore alebo v génovo-terapeuticky účinnom vektore.
12. 12. Spôsob prípravy nukleovej kyseliny podľa niektorého z nárokov 6 až 10, vyznačujúci sa tým, že táto nukleová kyselina je syntetizovaná chemicky alebo je izolovaná pomocou sondy z génovej banky.
13. 13. Polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID No 1 alebo SEQ ID No 2 alebo jeho funkčný variant a jeho časti minimálne so šiestimi aminokyselinami.
14. 14. Spôsob prípravy polypeptidu podľa nárokov 1 až 5 a 13, vyznačujúci sa tým, že sa nukleová kyselina podľa niektorého z nárokov 6 až 11 exprimuje vo vhodnej hostiteľskej bunke.
15. 15. Protilátka proti peptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a 13.
16. 16. Spôsob prípravy protilátky podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že sa cicavec imunizuje polypeptidom podľa nároku 7 a prípadne vzniknutá protilátka sa izoluje.
17. 17. Liečivo obsahujúce nukleovú kyselinu podľa niektorého z nárokov 6 až 10 alebo polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a 13 alebo protilátku podľa nároku 15 a prípadne farmaceutický prípustné prísady alebo pomocné látky.
18. 18. Spôsob prípravy liečiva na liečenie mykóz ako sú povrchové, kutánne a subkutánne dermatomykózy, mykózy slizníc a systémové mykózy, hlavne Cand/c/a-mykózy, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina podľa niektorého z nárokov 6 až 10 alebo polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a 13 alebo protilátka podľa nároku 15 sa kombinuje s farmaceutický prípustnou prísadou alebo pomocnou látkou.

    31854/H

    Η
19. 19. Diagnostikum obsahujúce nukleovú kyselinu podľa niektorého z nárokov 6 až 10 alebo polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a 13 alebo protilátku podľa nároku 15 a pripadne vhodné prísady a/alebo pomocné látky.
20. 20. Spôsob prípravy diagnostika pre diagnózu mykóz, ako sú povrchové, kutánne a subkutánne dermatomykózy, mykózy slizníc a systémové mykózy, hlavne Cand/da-mykózy, vyznačujúca satým, že nukleová kyselina podľa niektorého z nárokov 6 až 10 alebo polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a 13 alebo protilátka podľa nároku 15 sa kombinuje s farmaceutický prípustným nosičom.
21. 21. Test na identifikáciu funkčných interaktorov obsahujúcich nukleovú kyselinu podľa niektorého z nárokov 6 až 10 alebo polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a 13 alebo protilátku podľa nároku 15 a prípadne vhodné prísady a/alebo pomocné látky.
22. 22. Použitie nukleovej kyseliny podľa niektorého z nárokov 6 až 10 alebo polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a 13 na identifikáciu funkčných interaktorov.
23. 23. Použitie nukleovej kyseliny podľa niektorého z nárokov 6 až 10 na vyhľadávanie variantov, vyznačujúce sa tým, že sa génová banka prehľadáva touto nukleovou kyselinou a nájdený variant sa izoluje.
24. 24. Použitie polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a 13 na ničenie škodlivých kvasiniek a húb v potravinách a v krmivách.
25. 25. Spôsob kultivácie DSM 12864 a DSM 12865, vyznačujúci sa tým, že sa tento postup vykonáva v syntetickom B- a/alebo BAVC-médiu.
26. 26. Použitie nukleových kyselín podľa niektorého z nárokov 6 až 11 na prípravu transgénnych rastlín a rastlinných buniek.