CA2351017A1 - Gene tfiiia de candida albicans (catfiiia) et la proteine codee catfiiia - Google Patents
Gene tfiiia de candida albicans (catfiiia) et la proteine codee catfiiia Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne le facteur de transcription de Candida albica ns nommé ci-après CATFIIIA et ses analogues ainsi que les polynucléotides (ARN, ADN) codant pour cette protéine ou pour les polypeptides analogues de cette protéine et également le procédé de préparation de ces polypeptides et polynucléotides, leur utilisation pour la préparation d'inhibiteurs de ce facteur de transcription CATFIIIA pouvant être utilisés comme agents antifongiques et les compositions pharmaceutiques contenant de tels inhibiteurs.
Description
Gène tfIIIA de Candida albicans (CatfIIIA) et la protéine codée CATFIIIA_ La présente invention concerne le facteur de transcrip-tion de Candida albicans nommé ci-après CATFIIIA et ses analogues ainsi que les polynucléotides (ARN, ADN) codant pour cette protéine ou pour les polypeptides analogues de cette protéine.
La présente invention concerne êgalement le procédé de préparation de ces polypeptides et polynucléotides, leur utilisation pour l'étude des mêcanismes de la transcription chez Candida albicans et pour la préparation d'inhibiteurs de ce facteur de transcription CATFIIIA pouvant être utilisês comme agent antifongiques et les compositions pharmaceutiques contenant de tels inhibiteurs.
La présente invention concerne donc notamment un nouveau facteur de transcription de Candida albicans et la séquence d'ADN codant pour ce facteur de transcription, leur prépara-tion et leurs utilisations.
Nous utiliserons également ci-après les abréviations suivantes . AA pour acides aminés, AN pour acides nucléiques, ARN pour acide ribonucléique, RNase pour ribonucléase, ADN ou DNA pour acide désoxyribonucléique, ADNc pour ADN complémen-taire, pb pour paires de bases, PCR pour réaction en chaîne par une polymérase, CA ou Candida a. pour Candida albicans et SC ou Saccharomyces c. pour Saccharomyces cerevisiae.
On utilisera également le terme screening qui désigne une technique de criblage spécifique et le terme primer qui désigne un oligonucléotide utilisé en amorce.
Le terme polynucléotides désigne ci-après les polynucléotides de la prêsente invention soit les séquences d'ADN et également ARN codant pour le facteur CATFIIIA de la présente invention et ses homologues ayant la même fonction de facteur de transcription. Le terme CAtfIIIA a le sens donné ci-dessus à polynucléotides.
Le terme polypeptides désigne ci-après les polypeptides de la prësente invention soit le facteur CATFIIIA de la présente invention et ses analogues ou homologues .WO 00/28037 PCT/FR99/02739
La présente invention concerne êgalement le procédé de préparation de ces polypeptides et polynucléotides, leur utilisation pour l'étude des mêcanismes de la transcription chez Candida albicans et pour la préparation d'inhibiteurs de ce facteur de transcription CATFIIIA pouvant être utilisês comme agent antifongiques et les compositions pharmaceutiques contenant de tels inhibiteurs.
La présente invention concerne donc notamment un nouveau facteur de transcription de Candida albicans et la séquence d'ADN codant pour ce facteur de transcription, leur prépara-tion et leurs utilisations.
Nous utiliserons également ci-après les abréviations suivantes . AA pour acides aminés, AN pour acides nucléiques, ARN pour acide ribonucléique, RNase pour ribonucléase, ADN ou DNA pour acide désoxyribonucléique, ADNc pour ADN complémen-taire, pb pour paires de bases, PCR pour réaction en chaîne par une polymérase, CA ou Candida a. pour Candida albicans et SC ou Saccharomyces c. pour Saccharomyces cerevisiae.
On utilisera également le terme screening qui désigne une technique de criblage spécifique et le terme primer qui désigne un oligonucléotide utilisé en amorce.
Le terme polynucléotides désigne ci-après les polynucléotides de la prêsente invention soit les séquences d'ADN et également ARN codant pour le facteur CATFIIIA de la présente invention et ses homologues ayant la même fonction de facteur de transcription. Le terme CAtfIIIA a le sens donné ci-dessus à polynucléotides.
Le terme polypeptides désigne ci-après les polypeptides de la prësente invention soit le facteur CATFIIIA de la présente invention et ses analogues ou homologues .WO 00/28037 PCT/FR99/02739
2 fonctionnels tels que définis ci-après, ayant donc la même fonction de facteur de transcription. Le terme CATFIIIA a le sens donné ci-dessus à polypeptides.
Nous appellerons tfIIIA (ou tfC2) le gène codant pour le facteur de transcription TFIIIA tandis que CAtfIIIA (ou CAtfC2) dêsigne le gène codant-pour le facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA.
Le spectre des infections fongiques connues s'étend de l'attaque fongique de la peau ou des ongles à des infections mycotiques plus graves d'organes internes. De telles infections et les maladies qui en résultent sont identifiées comme des mycoses. Des substances antimycotiques à effets fongistatiques ou fongicides, sont utilisées pour le traitement de ces mycoses.
15 La présente invention concerne ainsi l'identification de substances antimycotiques et notamment de substances anti-Candida albicans.
La présente invention concerne ainsi des inhibiteurs de facteurs de transcription pouvant être utilisés comme agents 20 antifongiques.
Candida albicans est une levure pathogène qui cause des maladies infectieuses dans l'organisme humain. Dans le but de trouver des moyens de traiter des maladies, on peut choisir des cibles intracellulaires et le facteur de transcription 25 TFIIIA peut être l'une de ces cibles.
Dans les organismes eucaryotes, ce facteur-joue un rôle clé
dans l'initiation de la transcription des gènes ARN 5S par la RNA-polymérase III. En particulier, pour SC qui est une levure proche de CA, il a été montré que cette levure SC ne 30 pouvait pas survivre sans une source additionnelle de ARN 5S
lorsque le gène chromosomique du facteur TFIIIA était inter rompu, cet ARN 5S additionnel étant synthétisé au moyen d'un plasmide sans la participation du facteur TFIIIA (référence:
S. Carnier, A.-M. Dechampesme, A. Sentenac./Proc. Natl. Acad.
35 Sci. (1995) 92, 9338-9342).
Le gène tfIIIA et la protéine correspondante TFIIIA
seraient impliqués dans la rëgulation du mécanisme biologique de la transcription comme indiqué ci-après.
Nous appellerons tfIIIA (ou tfC2) le gène codant pour le facteur de transcription TFIIIA tandis que CAtfIIIA (ou CAtfC2) dêsigne le gène codant-pour le facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA.
Le spectre des infections fongiques connues s'étend de l'attaque fongique de la peau ou des ongles à des infections mycotiques plus graves d'organes internes. De telles infections et les maladies qui en résultent sont identifiées comme des mycoses. Des substances antimycotiques à effets fongistatiques ou fongicides, sont utilisées pour le traitement de ces mycoses.
15 La présente invention concerne ainsi l'identification de substances antimycotiques et notamment de substances anti-Candida albicans.
La présente invention concerne ainsi des inhibiteurs de facteurs de transcription pouvant être utilisés comme agents 20 antifongiques.
Candida albicans est une levure pathogène qui cause des maladies infectieuses dans l'organisme humain. Dans le but de trouver des moyens de traiter des maladies, on peut choisir des cibles intracellulaires et le facteur de transcription 25 TFIIIA peut être l'une de ces cibles.
Dans les organismes eucaryotes, ce facteur-joue un rôle clé
dans l'initiation de la transcription des gènes ARN 5S par la RNA-polymérase III. En particulier, pour SC qui est une levure proche de CA, il a été montré que cette levure SC ne 30 pouvait pas survivre sans une source additionnelle de ARN 5S
lorsque le gène chromosomique du facteur TFIIIA était inter rompu, cet ARN 5S additionnel étant synthétisé au moyen d'un plasmide sans la participation du facteur TFIIIA (référence:
S. Carnier, A.-M. Dechampesme, A. Sentenac./Proc. Natl. Acad.
35 Sci. (1995) 92, 9338-9342).
Le gène tfIIIA et la protéine correspondante TFIIIA
seraient impliqués dans la rëgulation du mécanisme biologique de la transcription comme indiqué ci-après.
3 Depuis que la protéine TFIIIA a été purifiée comme facteur de transcription pour la première fois en 1980 à
partir d'ovocytes de Xénope [Segall et A1, J. Biol. Chem., 255, 11986-11991 (1980)], des travaux ont été menés in vivo et in vitro dans le Xênope pour étudier le mëcanisme de contrôle de la transcription exercé par TFIIIA. On a ainsi montré que TFIIIA de Xénope est nêcessaire pour l'initiation de la transcription du gène ARN -5S [Sakonji et al, Cell 19, 13-25 (1980)] et se lie à une rêgion de contrôle interne du gène ARN 5S [Bogenhagen et al, Cell, 19,..'27-35 (1980) ] .
La séquence en nucléotides de l'ADNc de tfIIIA de xénope et la séquence correspondante en acides aminés ont déjà été
publiées [Ginberg et al, Cell, 39,479-489 (1984)]. 0n peut noter que ce gène code pour une protéine ayant 9 doigts de zinc, un doigt de zinc correspondant à un motif contenant deux cystéines et deux histidines reliées par un atome de zinc (CYS2 HIS2) (C2H2). Cette structure en doigt de zinc constitue un domaine de liaison des protéines à l'ADN et est donc considérée comme un domaine essentiel pour un groupe de protéines qui se lient à l'ADN (DNA binding proteins).[Miller et al, Embo J., 4, 1607-1614 (1985)]
On peut noter que l'on connaît d'autres facteurs de transcription se liant à l'ADN qui possèdent également cette structure en doigt de zinc tels que par exemple, chez;~Z~'être humain, XT1 du gène de la tumeur humaine de Wilms, [Gessier et al, Nature, 343, 774-778 (1990)], le répresseur humain de transcription YY1 [Shi et al, Cell, 67, 377-388 (1991)], la protéine MAZ associée au promoteur cMYC [Bossone et al, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, _89, 7452-7456 (1992)] ou encore spl [Kuwahara et al, J. Biol. Chem, 29, 8627-8631 (1990)].
L'étude de différents organismes tels que notamment l'homme, le xénope ou Candida albicans a montré qu'il existe ce que l'on peut appeler une famille de facteurs de trans-criptions TFIIIA possédant les caractéristiques suivantes .
- ils sont associés à l'ARN polymérase III
- ils possèdent 9 doigts de zinc - ils sont indispensables pour la transcription du gène codant pour l'ARN 5S.
pC'f/pR99/02739
partir d'ovocytes de Xénope [Segall et A1, J. Biol. Chem., 255, 11986-11991 (1980)], des travaux ont été menés in vivo et in vitro dans le Xênope pour étudier le mëcanisme de contrôle de la transcription exercé par TFIIIA. On a ainsi montré que TFIIIA de Xénope est nêcessaire pour l'initiation de la transcription du gène ARN -5S [Sakonji et al, Cell 19, 13-25 (1980)] et se lie à une rêgion de contrôle interne du gène ARN 5S [Bogenhagen et al, Cell, 19,..'27-35 (1980) ] .
La séquence en nucléotides de l'ADNc de tfIIIA de xénope et la séquence correspondante en acides aminés ont déjà été
publiées [Ginberg et al, Cell, 39,479-489 (1984)]. 0n peut noter que ce gène code pour une protéine ayant 9 doigts de zinc, un doigt de zinc correspondant à un motif contenant deux cystéines et deux histidines reliées par un atome de zinc (CYS2 HIS2) (C2H2). Cette structure en doigt de zinc constitue un domaine de liaison des protéines à l'ADN et est donc considérée comme un domaine essentiel pour un groupe de protéines qui se lient à l'ADN (DNA binding proteins).[Miller et al, Embo J., 4, 1607-1614 (1985)]
On peut noter que l'on connaît d'autres facteurs de transcription se liant à l'ADN qui possèdent également cette structure en doigt de zinc tels que par exemple, chez;~Z~'être humain, XT1 du gène de la tumeur humaine de Wilms, [Gessier et al, Nature, 343, 774-778 (1990)], le répresseur humain de transcription YY1 [Shi et al, Cell, 67, 377-388 (1991)], la protéine MAZ associée au promoteur cMYC [Bossone et al, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, _89, 7452-7456 (1992)] ou encore spl [Kuwahara et al, J. Biol. Chem, 29, 8627-8631 (1990)].
L'étude de différents organismes tels que notamment l'homme, le xénope ou Candida albicans a montré qu'il existe ce que l'on peut appeler une famille de facteurs de trans-criptions TFIIIA possédant les caractéristiques suivantes .
- ils sont associés à l'ARN polymérase III
- ils possèdent 9 doigts de zinc - ils sont indispensables pour la transcription du gène codant pour l'ARN 5S.
pC'f/pR99/02739
4 Une fonction essentielle connue de la protéine codée par le gène tfIIIA (tfC2) de la levure est d'initier la transcription du gène de l'ARN 5S chez Saccharomyces cerevisiae (Carnier et al., Proc. Natl. Acad. Sa USA (1995) 92 . 9338-9342).
La présente invention a ainsi permis d'isoler les polynucléotides ADN et ARN codant pour la protéine du facteur de transcription CATFIIIA de Candida albicans et de révéler leurs séquences nucléotidiques.
l0 La présente invention a donc pour objet un polynucléotide isolé contenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe suivant .
a) un polynucléotide ayant au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % d'identité avec un polynucléotide codant pour un polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription et ayant une séquence en acides aminés homologue de la sêquence SEQ ID N°3 indiquée ci-après.
b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) c) un polynucléotide comprenant au moins 15 bases consé-cutives du polynuclëotide défini en a) et b).
La présente invention a ainsi pour objet un polynucléotide défini ci-dessus tel que ce polynucléotide est un ADN.
La présente invention a ainsi pour objet un polynu-cléotide défini ci-dessus tel que ce polynuclëotide est un ARN.
La présente invention a plus précisément poux objet le polynucléotide tel que défini ci-dessus comprenant la sêquence de nucléotides SEQ ID N°1.
La présente invention a ainsi permis d'isoler la séquence d'ADN codant pour le facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA.
La prësente invention a également permis de révéler la séquence d'acides nucléiques du gëne CAtfIIIA et également la séquence d'acides aminés de la protéine CATFIIIA codée par ce gène.
La présente invention a ainsi pour objet une séquence d'ADN telle que définie par le polynucléotide ci-dessus caractérisée en ce que cette séquence d'ADN est celle du gène W O 00/28037 PCT/FR9.9/02739 CAtfIIIA codant pour une protêine ayant la fonction biologique du facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA et contenant la séquence de nucléotides SEQ ID N°1.
Une telle séquence SEQ ID n°1 de la présente invention
La présente invention a ainsi permis d'isoler les polynucléotides ADN et ARN codant pour la protéine du facteur de transcription CATFIIIA de Candida albicans et de révéler leurs séquences nucléotidiques.
l0 La présente invention a donc pour objet un polynucléotide isolé contenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe suivant .
a) un polynucléotide ayant au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % d'identité avec un polynucléotide codant pour un polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription et ayant une séquence en acides aminés homologue de la sêquence SEQ ID N°3 indiquée ci-après.
b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) c) un polynucléotide comprenant au moins 15 bases consé-cutives du polynuclëotide défini en a) et b).
La présente invention a ainsi pour objet un polynucléotide défini ci-dessus tel que ce polynucléotide est un ADN.
La présente invention a ainsi pour objet un polynu-cléotide défini ci-dessus tel que ce polynuclëotide est un ARN.
La présente invention a plus précisément poux objet le polynucléotide tel que défini ci-dessus comprenant la sêquence de nucléotides SEQ ID N°1.
La présente invention a ainsi permis d'isoler la séquence d'ADN codant pour le facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA.
La prësente invention a également permis de révéler la séquence d'acides nucléiques du gëne CAtfIIIA et également la séquence d'acides aminés de la protéine CATFIIIA codée par ce gène.
La présente invention a ainsi pour objet une séquence d'ADN telle que définie par le polynucléotide ci-dessus caractérisée en ce que cette séquence d'ADN est celle du gène W O 00/28037 PCT/FR9.9/02739 CAtfIIIA codant pour une protêine ayant la fonction biologique du facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA et contenant la séquence de nucléotides SEQ ID N°1.
Une telle séquence SEQ ID n°1 de la présente invention
5 comprend donc 2060 nucléotides.
La présente invention a précisément pour objet une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ayant la séquence commençant au nuclëotide 720 et se terminant au nucléotide 1955 de SEQ ID N°1.
Une telle séquence comprend donc 1236 nucléotides.
La présente invention a aussi pour objet la séquence d'ADN du gène CAtfIIIA telle que définie ci-dessus codant pour la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3.
La sëquence SEQ ID N°3 comprend donc 412 AA.
15 La présente invention a particulièrement pour objet la séquence d'ADN codant pour le facteur de transcription CATFIIIA telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN qui hybrident avec celle-ci et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
La présente invention a également pour objet une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus comprenant des modifications introduites par suppression, insertion et/ou substitution d'au moins un nucléotide codant pour unE~
25 protéine ayant la même activité biologique què le facteur de transcription CATFIIIA.
La présente invention a notamment pour objet la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN qui ont une homologie de séquence nucléotidique d'au 30 moins 50 % ou au moins 60 % et de prëfêrence au moins 70 %
avec ladite séquence d'ADN.
La présente invention a ainsi également pour objet la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN qui codent pour une protéine de fonction 35 similaire dont la séquence en AA a une homologie d'au moins 40 % et notamment de 45 % ou d'au moins 50 %, plutôt au moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec la séquence en AA
codée par ladite séquence d'ADN.
La présente invention a précisément pour objet une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ayant la séquence commençant au nuclëotide 720 et se terminant au nucléotide 1955 de SEQ ID N°1.
Une telle séquence comprend donc 1236 nucléotides.
La présente invention a aussi pour objet la séquence d'ADN du gène CAtfIIIA telle que définie ci-dessus codant pour la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3.
La sëquence SEQ ID N°3 comprend donc 412 AA.
15 La présente invention a particulièrement pour objet la séquence d'ADN codant pour le facteur de transcription CATFIIIA telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN qui hybrident avec celle-ci et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
La présente invention a également pour objet une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus comprenant des modifications introduites par suppression, insertion et/ou substitution d'au moins un nucléotide codant pour unE~
25 protéine ayant la même activité biologique què le facteur de transcription CATFIIIA.
La présente invention a notamment pour objet la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN qui ont une homologie de séquence nucléotidique d'au 30 moins 50 % ou au moins 60 % et de prëfêrence au moins 70 %
avec ladite séquence d'ADN.
La présente invention a ainsi également pour objet la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN qui codent pour une protéine de fonction 35 similaire dont la séquence en AA a une homologie d'au moins 40 % et notamment de 45 % ou d'au moins 50 %, plutôt au moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec la séquence en AA
codée par ladite séquence d'ADN.
6 Par séquences qui hybrident, on inclut les séquences d'ADN
qui hybrident avec l'une des séquences d'ADN ci-dessus sous des conditions standard de stringence élevée, moyenne ou basse et qui codent pour un polypeptide ayant la même 5 fonction de facteur de transcription. Les conditions de stringence sont celles réalisées dans les conditions connues de l'homme du métier telles que celles décrites par Sambrook et al, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. De telles conditions de stringence sont par 10 exemple une hybridation à 65°C, pendant 18 heures dans une solution 5 x SSPE ; 10 x Denhardt's ; 100 ug/ml ADNss ; 1 %
SDS suivie de 3 lavages pendant 5 minutes avec 2 x SSC ;
0,05 % SDS, puis 3 lavages pendant 15 minutes â 65°C dans 1 x SSC ; 0,1 % SDS. Les conditions de forte stringence 15 comprennent par exemple une hybridation â 65°C, pendant 18 heures dans une solution 5 x SSPE ; 10 x Denhardt ; 100 ~g/ml ADNss ; 1 % SDS suivie de 2 lavages pendant 20 minutes avec une solution 2 x SSC ; 0,05 % SDS à 65°C suivis d'un dernier lavage pendant 45 minutes dans une solution 0,1 x SSC ; 0,1 %
20 SDS â 65°C. Les conditions de stringence moyenne comprennent par exemple un dernier lavage pendant 20 minutes dans une solution 0,2 x SSC, 0,1 % SDS à 65°C.
Par sëquences qui présentent des homologies signifi-catives, on inclut les séquences ayant une identité: modérée 25 ou importante de séquence nucléotidique avec l'une des sëquences d'ADN ci-dessus et qui codent pour une protéine ayant la même fonction de facteur de transcription.
Par séquence d'ADN similaires, on entend ainsi des séquences d'ADN qui peuvent appartenir à d'autres mycètes que 30 Candida albicans et notamment â SC, et qui sont similaires ou identiques à la séquence d'ADN du gène de Candida albicans, CatfIIIA. Ces séquences d'ADN similaires ne sont pas forcément identiques à la séquence d'ADN du gène de Candida albicans CatfIIIA. L'homologie de séquence au niveau 35 nucléotidique peut-être modérée ou importante. La présente invention concerne ainsi. notamment les séquences d'ADN qui prësentent une homologie de séquence nuclêotidique d'au moins 50 %, de façon prëférée d'au moins 60 % et de façon encore ~VO 00/28037 PCT/FR99/02739
qui hybrident avec l'une des séquences d'ADN ci-dessus sous des conditions standard de stringence élevée, moyenne ou basse et qui codent pour un polypeptide ayant la même 5 fonction de facteur de transcription. Les conditions de stringence sont celles réalisées dans les conditions connues de l'homme du métier telles que celles décrites par Sambrook et al, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. De telles conditions de stringence sont par 10 exemple une hybridation à 65°C, pendant 18 heures dans une solution 5 x SSPE ; 10 x Denhardt's ; 100 ug/ml ADNss ; 1 %
SDS suivie de 3 lavages pendant 5 minutes avec 2 x SSC ;
0,05 % SDS, puis 3 lavages pendant 15 minutes â 65°C dans 1 x SSC ; 0,1 % SDS. Les conditions de forte stringence 15 comprennent par exemple une hybridation â 65°C, pendant 18 heures dans une solution 5 x SSPE ; 10 x Denhardt ; 100 ~g/ml ADNss ; 1 % SDS suivie de 2 lavages pendant 20 minutes avec une solution 2 x SSC ; 0,05 % SDS à 65°C suivis d'un dernier lavage pendant 45 minutes dans une solution 0,1 x SSC ; 0,1 %
20 SDS â 65°C. Les conditions de stringence moyenne comprennent par exemple un dernier lavage pendant 20 minutes dans une solution 0,2 x SSC, 0,1 % SDS à 65°C.
Par sëquences qui présentent des homologies signifi-catives, on inclut les séquences ayant une identité: modérée 25 ou importante de séquence nucléotidique avec l'une des sëquences d'ADN ci-dessus et qui codent pour une protéine ayant la même fonction de facteur de transcription.
Par séquence d'ADN similaires, on entend ainsi des séquences d'ADN qui peuvent appartenir à d'autres mycètes que 30 Candida albicans et notamment â SC, et qui sont similaires ou identiques à la séquence d'ADN du gène de Candida albicans, CatfIIIA. Ces séquences d'ADN similaires ne sont pas forcément identiques à la séquence d'ADN du gène de Candida albicans CatfIIIA. L'homologie de séquence au niveau 35 nucléotidique peut-être modérée ou importante. La présente invention concerne ainsi. notamment les séquences d'ADN qui prësentent une homologie de séquence nuclêotidique d'au moins 50 %, de façon prëférée d'au moins 60 % et de façon encore ~VO 00/28037 PCT/FR99/02739
7 _ plus préférëe d'au moins 70 % avec la séquence CAtfIIIA de la présente invention.
De plus, ces séquences d'ADN similaires ne codent pas forcément pour des protéines identiques, au niveau de la séquence en acides aminés, à la protéine codée par le gène CAtfIIIA. Ainsi la présente invention concerne notamment les séquences d'ADN qui codent pour des protêines dites homolo-gues ayant une homologie de séquence en acides aminés d'au moins 40 %, notamment 45 %, de façon préférêe au moins de 50 %, de façon plus préférée au moins de 60 % et de façon encore plus préférée au moins de 70 % avec la protéine codée par CAtfIIIA de la présente invention.
Le gène de la présente invention est représenté comme une séquence ADN simple brin comme indiqué dans SEQ ID N°1 mais il est entendu que la prêsente invention inclut la sêquence ADN complémentaire de cette séquence ADN simple brin et inclut également la séquence ADN dite double brin consti-tuée de ces deux sêquences ADN complémentaires d'une de l'autre.
La séquence d'ADN telle que définie ci-dessus est un exemple de combinaison de codons codant pour les acides aminés correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID
N°3, mais il est entendu également que la présente invention inclut toute autre combinaison arbitraire de codons codant pour cette même séquence d'acides aminés SEQ ID~N°3.
Pour la préparation des polynuclëotides et notamment des séquences d'ADN telles que définies ci-dessus, des séquences d'ADN modifiées comme indiqué ci-dessus ou encore des séquences d'ADN homologues telles que définies ci-dessus, on peut utiliser les techniques connues de l'homme du métier et notamment celles décrites dans l'ouvrage de Sambrook, J.
Fritsh, E. F. ~ Maniatis, T. (1989) intitulé . 'Molecular cloning . a laboratory manual', Laboratory, Cold Spring Harbor NY.
Les séquences d'ADN homologues telles que définies ci-dessus peuvent notamment être isolêes selon les méthodes connues de l'homme du métier par exemple par la technique de PCR en utilisant des amorces nucléotidiques dégénérées pour
De plus, ces séquences d'ADN similaires ne codent pas forcément pour des protéines identiques, au niveau de la séquence en acides aminés, à la protéine codée par le gène CAtfIIIA. Ainsi la présente invention concerne notamment les séquences d'ADN qui codent pour des protêines dites homolo-gues ayant une homologie de séquence en acides aminés d'au moins 40 %, notamment 45 %, de façon préférêe au moins de 50 %, de façon plus préférée au moins de 60 % et de façon encore plus préférée au moins de 70 % avec la protéine codée par CAtfIIIA de la présente invention.
Le gène de la présente invention est représenté comme une séquence ADN simple brin comme indiqué dans SEQ ID N°1 mais il est entendu que la prêsente invention inclut la sêquence ADN complémentaire de cette séquence ADN simple brin et inclut également la séquence ADN dite double brin consti-tuée de ces deux sêquences ADN complémentaires d'une de l'autre.
La séquence d'ADN telle que définie ci-dessus est un exemple de combinaison de codons codant pour les acides aminés correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID
N°3, mais il est entendu également que la présente invention inclut toute autre combinaison arbitraire de codons codant pour cette même séquence d'acides aminés SEQ ID~N°3.
Pour la préparation des polynuclëotides et notamment des séquences d'ADN telles que définies ci-dessus, des séquences d'ADN modifiées comme indiqué ci-dessus ou encore des séquences d'ADN homologues telles que définies ci-dessus, on peut utiliser les techniques connues de l'homme du métier et notamment celles décrites dans l'ouvrage de Sambrook, J.
Fritsh, E. F. ~ Maniatis, T. (1989) intitulé . 'Molecular cloning . a laboratory manual', Laboratory, Cold Spring Harbor NY.
Les séquences d'ADN homologues telles que définies ci-dessus peuvent notamment être isolêes selon les méthodes connues de l'homme du métier par exemple par la technique de PCR en utilisant des amorces nucléotidiques dégénérées pour
8 amplifier ces ADN à partir de banques génomiques ou de banques d'ADNc des mycètes correspondants. Les ADNc peuvent également être préparés à partir de mARN isolés de mycètes d'espèces différentes étudiées dans le cadre de la présente invention telles que Candida albicans mais par exemple et tout aussi bien . Candida stellatoidea, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida pseudotro-picalis, Candida quillermondii, Candida glabrata, Candida lusianiae ou Candida rugosa ou encore des mycètes telles que Saccharomyces cerevisiae ou encore des mycètes du type Asper-gillus ou Cryptococcus et notamment, par exemple, Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoc-cidioides brasiliens and Sporothrix schenckii ou encore des mycètes des classes des phycomycètes or eumycètes en particu-lier les sous-classes de basidiomycètes, ascomycètes, mehiascomycétales (levure) et plectascales, gymnascales (champignon de la peau et des cheveux) ou de la classe des hyphomycètes, notamment les sous-classes conidiosporales et thallosporales parmi lesquels les espëces suivantes . mucor, rhizopus, coccidioides, paracoccidioides (blastomyces, brasiliensis), endomyces (blastomyces), aspergillus, menici-lium (scopulariopsis), trichophyton (ctenomyces), epidermo-phton, microsporon, piedraia, hormodendron, phialophora-, sporotrichon, cryptococcus, candida, geotrichum; trichosporon ou encore toropsulosis.
Les polynucléotides de la présente invention peuvent ainsi être obtenus en utilisant les méthodes usuelles de clonage et de criblage telles que celles de clonage et séquençage à partir de fragments d'ADN chromosomique extraits de cellules. Par exemple, pour obtenir les polynucléotides de la présente invention, on peut partir d'une banque de fragments d'ADN chromosomique. On peut préparer une sonde correspondant à un oligonucléotide marqué par un élëment radioactif, constituée de préférence de 17 nucléotides ou plus et dérivée d'une sëquence partielle. Les clones contenant un ADN identique à cèlui de la sonde peuvent être ainsi identifiés sous des conditions stringentes. Par le
Les polynucléotides de la présente invention peuvent ainsi être obtenus en utilisant les méthodes usuelles de clonage et de criblage telles que celles de clonage et séquençage à partir de fragments d'ADN chromosomique extraits de cellules. Par exemple, pour obtenir les polynucléotides de la présente invention, on peut partir d'une banque de fragments d'ADN chromosomique. On peut préparer une sonde correspondant à un oligonucléotide marqué par un élëment radioactif, constituée de préférence de 17 nucléotides ou plus et dérivée d'une sëquence partielle. Les clones contenant un ADN identique à cèlui de la sonde peuvent être ainsi identifiés sous des conditions stringentes. Par le
9 sëquençage de clones individuels ainsi identifiés, en utilisant des primers de séquençage issus de la séquence d'origine, il est alors possible de prolonger la séquence dans les deux directions pour déterminer la séquence du gène complet. De façon usuelle et efficace, un tel séquençage peut être réalisé en utilisant un ADN double brin dénaturé préparé
à partir d'un plasmide. De telles techniques sont décrites par Maniatis, T. Fritsch, E.F. et Sambrook comme indiquë ci-dessus.(Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989) (notamment en 1.90 et 13.70 dans les chapitres de screening par hybridation et sêquençage à partir de ADN
double brin dénaturé).
Dans le cadre de la présente invention, on pourrait notamment utiliser une banque de fragments d'ADN
chromosomique de Candida albicans comme indiqué ci-après à
l'exemple 1 dans la partie expêrimentale.
Une description détaillée des conditions opératoires dans lesquelles a été réalisée la présente invention est donnée ci-après.
L'invention a tout particulièrement pour objet le polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription CATFIIIA et ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 codée par la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus et les analogues de ce polypeptide.
Par analogues de polypeptides, on entend les po¿ypeptides dont la séquence d'acides aminés a étë modifiée par substi-tution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés mais qui conservent la même fonction biologique. De tels polypeptides analogues peuvent être produits spontanément ou peuvent être produits par modification post-transcriptionnelle ou encore par modification de la séquence ADN de la présente invention comme indiqué ci-dessus, en utilisant les techniques connues de l'homme du métier . parmi ces techniques, on peut citer notamment la technique de mutagénèse dirigée connue de l'homme du métier (Kramer, W., et al., Nucl. Acids Res., 12, 9441 (1984) ; Kramer, W. and Fritz, H.J. , Methods in Enzymology, 154, 350 (1987) ;
Zoller, M.J. and Smith, M. Methods in Enzymology, 100, 468 ( 1983 ) ) .
La synthèse d'ADN modifiés peut être faite comme indiqué ci-dessus et notamment en utilisant des techniques de synthèse chimique bien connues telles que par exemple la méthode au 5 phosphotriester [Letsinger, R.L and Ogilvie, K.K., K. Am.
CHEM. Soc., 91, 3350 (1969) ; Merrifield, R.B., Sciences, 150, 178 (1968)] ou la mëthode à la phosphoamidite [Beaucage, S.L and Caruthers, M .H., Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981) ; McBRIDE, L.J. and Caruthers, M.H. Tetrahedron Lett.,
à partir d'un plasmide. De telles techniques sont décrites par Maniatis, T. Fritsch, E.F. et Sambrook comme indiquë ci-dessus.(Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989) (notamment en 1.90 et 13.70 dans les chapitres de screening par hybridation et sêquençage à partir de ADN
double brin dénaturé).
Dans le cadre de la présente invention, on pourrait notamment utiliser une banque de fragments d'ADN
chromosomique de Candida albicans comme indiqué ci-après à
l'exemple 1 dans la partie expêrimentale.
Une description détaillée des conditions opératoires dans lesquelles a été réalisée la présente invention est donnée ci-après.
L'invention a tout particulièrement pour objet le polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription CATFIIIA et ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 codée par la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus et les analogues de ce polypeptide.
Par analogues de polypeptides, on entend les po¿ypeptides dont la séquence d'acides aminés a étë modifiée par substi-tution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés mais qui conservent la même fonction biologique. De tels polypeptides analogues peuvent être produits spontanément ou peuvent être produits par modification post-transcriptionnelle ou encore par modification de la séquence ADN de la présente invention comme indiqué ci-dessus, en utilisant les techniques connues de l'homme du métier . parmi ces techniques, on peut citer notamment la technique de mutagénèse dirigée connue de l'homme du métier (Kramer, W., et al., Nucl. Acids Res., 12, 9441 (1984) ; Kramer, W. and Fritz, H.J. , Methods in Enzymology, 154, 350 (1987) ;
Zoller, M.J. and Smith, M. Methods in Enzymology, 100, 468 ( 1983 ) ) .
La synthèse d'ADN modifiés peut être faite comme indiqué ci-dessus et notamment en utilisant des techniques de synthèse chimique bien connues telles que par exemple la méthode au 5 phosphotriester [Letsinger, R.L and Ogilvie, K.K., K. Am.
CHEM. Soc., 91, 3350 (1969) ; Merrifield, R.B., Sciences, 150, 178 (1968)] ou la mëthode à la phosphoamidite [Beaucage, S.L and Caruthers, M .H., Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981) ; McBRIDE, L.J. and Caruthers, M.H. Tetrahedron Lett.,
10 24 245 (1983)] ou encore par la combinaison de ces méthodes.
Les polypeptides de la présente invention peuvent donc être préparés par les techniques connues de l'homme du métier, notamment partiellement par synthèse chimique ou encore par la technique de l'ADN recombinant par expression dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote comme indiqué
ci-après.
La présente invention a particulièrement pour objet le procédé de préparation de la protéine recombinante CATFIIIA
ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 comprenant l'expression de la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus dans un hôte approprié puis l'isolement et la purification de ladite protéine recombinante.
Pour produire le polypeptide de la prêsente invention, on peut notamment utiliser les techniques de l'ADN recombi nant en utilisant les méthodes de génie génétique et de culture cellulaire connues de l'homme du métier. On peut ainsi procéder par les étapes suivantes . d'abord préparation du gène approprië, puis incorporation de ce gène dans un vecteur, transfert du vecteur porteur du gène dans une cellule hôte appropriée, production du polypeptide par expression du gène, isolement du polypeptide, le polypeptide ainsi produit pouvant être ensuite purifiê.
Les polypeptides de la présente invention obtenus par l'expression des polynucléotides de la présente invention peuvent être purifiës à partir de cultures de cellules transformées par les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que précipitation au sulfate d'ammonium ou à
l'éthanol, extraction en conditions acides, chromâtograpi~ie
Les polypeptides de la présente invention peuvent donc être préparés par les techniques connues de l'homme du métier, notamment partiellement par synthèse chimique ou encore par la technique de l'ADN recombinant par expression dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote comme indiqué
ci-après.
La présente invention a particulièrement pour objet le procédé de préparation de la protéine recombinante CATFIIIA
ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 comprenant l'expression de la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus dans un hôte approprié puis l'isolement et la purification de ladite protéine recombinante.
Pour produire le polypeptide de la prêsente invention, on peut notamment utiliser les techniques de l'ADN recombi nant en utilisant les méthodes de génie génétique et de culture cellulaire connues de l'homme du métier. On peut ainsi procéder par les étapes suivantes . d'abord préparation du gène approprië, puis incorporation de ce gène dans un vecteur, transfert du vecteur porteur du gène dans une cellule hôte appropriée, production du polypeptide par expression du gène, isolement du polypeptide, le polypeptide ainsi produit pouvant être ensuite purifiê.
Les polypeptides de la présente invention obtenus par l'expression des polynucléotides de la présente invention peuvent être purifiës à partir de cultures de cellules transformées par les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que précipitation au sulfate d'ammonium ou à
l'éthanol, extraction en conditions acides, chromâtograpi~ie
11 échangeuse d'anions ou de cations, chromatographie d'interaction hydrophobique, chromatographie d'affinité, chromatographie à l'hydroxylapatite et la chromatographie à
haute performance liquide (HPLC). Des techniques bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour rêgénérer la protéine lorsque celle-ci est dénaturëe durant son isolement ou sa purification.
Les sëquences d'ADN selon la présente invention et notamment SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 peuvent être préparëes selon les techniques connues de l'homme du métier notamment par synthèse chimique ou par criblage d'une banque génomique ou d'une banque d'ADNc à l'aide de sondes d'oligonucléotides de synthèse par les techniques connues d'hybridation, ainsi amplification d'ADN à partir de fragments isolés ou encore par réverse transcriptase à partir d'ARN messager (ARNm).
L'avantage de la technique comprenant d'abord l'isolement d'ARNm par extraction des ARN totaux puis la synthèse d'ADNc à partir de ces ARNm par réverse transcriptase réside notamment dans le fait que l'ARNm ne contient pas les introns alors que ces séquences non codantes sont présentes dans l'ADN génomique.
On peut procéder en utilisant les techniques usuelles de clonage connues de l'homme du métier et notamment décrites dans l'ouvrage de Sambrook, J. Fritsh, E. F. ~ Maniat.i~s, T.
(1989) intitulé: 'Molecular cloning . a laboratôry manual', Laboratory, Cold Spring Harbor NY.
Dans ces techniques, on peut procèder au clonage par insertion de fragment dans un plasmide qui peut être fourni avec un kit commercial adapté puis transformation d'une souche bactérienne par le plasmide ainsi obtenu. On peut utiliser notamment la souche E, coli XL1 Blue ou DH5 alpha.
Les clones peuvent ensuite être cultivés pour extraire l'ADN
plasmidique selon les techniques classiques de l'homme du métier référencées ci-dessus (Sambrook, Fritsh et Maniatis).
On peut procéder au séquençage de l'ADN du fragment amplifié
contenu dans l'ADN plasmidique.
Les polypeptides de la présente invention peuvent être obtenus par expression dans une cellule hôte contenant un
haute performance liquide (HPLC). Des techniques bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour rêgénérer la protéine lorsque celle-ci est dénaturëe durant son isolement ou sa purification.
Les sëquences d'ADN selon la présente invention et notamment SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 peuvent être préparëes selon les techniques connues de l'homme du métier notamment par synthèse chimique ou par criblage d'une banque génomique ou d'une banque d'ADNc à l'aide de sondes d'oligonucléotides de synthèse par les techniques connues d'hybridation, ainsi amplification d'ADN à partir de fragments isolés ou encore par réverse transcriptase à partir d'ARN messager (ARNm).
L'avantage de la technique comprenant d'abord l'isolement d'ARNm par extraction des ARN totaux puis la synthèse d'ADNc à partir de ces ARNm par réverse transcriptase réside notamment dans le fait que l'ARNm ne contient pas les introns alors que ces séquences non codantes sont présentes dans l'ADN génomique.
On peut procéder en utilisant les techniques usuelles de clonage connues de l'homme du métier et notamment décrites dans l'ouvrage de Sambrook, J. Fritsh, E. F. ~ Maniat.i~s, T.
(1989) intitulé: 'Molecular cloning . a laboratôry manual', Laboratory, Cold Spring Harbor NY.
Dans ces techniques, on peut procèder au clonage par insertion de fragment dans un plasmide qui peut être fourni avec un kit commercial adapté puis transformation d'une souche bactérienne par le plasmide ainsi obtenu. On peut utiliser notamment la souche E, coli XL1 Blue ou DH5 alpha.
Les clones peuvent ensuite être cultivés pour extraire l'ADN
plasmidique selon les techniques classiques de l'homme du métier référencées ci-dessus (Sambrook, Fritsh et Maniatis).
On peut procéder au séquençage de l'ADN du fragment amplifié
contenu dans l'ADN plasmidique.
Les polypeptides de la présente invention peuvent être obtenus par expression dans une cellule hôte contenant un
12 polynucléotide selon la présente invention et notamment une séquence d'ADN codant pour un polypeptide de la présente invention précédée d'une séquence promoteur convenable. La cellule hôte peut être une cellule procaryote, par exemple E.
coli ou une cellule eucaryote telle que les levures comme par exemple les ascomycètes parmi lesquels les saccharomyces ou encore des cellules de mammifères comme par exemple des cellule Cos.
La présente invention a particulièrement pour objet le vecteur d'expression contenant une sëquence d'ADN telle que définie ci-dessus.
Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est donc ainsi notamment la séquence d'ADN du gène CAtfIIIA
codant pour une protéine ayant la fonction biologique du facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA et contenant la séquence de nuclêotides SEQ ID N°1 .
Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est ainsi plus particulièrement la séquence d'ADN commençant au nucléotide 720 et se terminant au nuclêotide 1955 de SEQ ID
N°1.
Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est ainsi encore plus particulièrement celle du gène CAtfIIIA tel que dêfini ci-dessus codant pour la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3.
Dans le vecteur d'expression, une telle séquencè d'ADN est ainsi une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus codant pour le facteur de transcription CATFIIIA ainsi que les séquences d'ADN qui hybrident avec celle-ci et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci ou encore les séquences d'ADN
comprenant des modifications introduites par suppression, insertion et/ou substitution d'au moins un nucléotide codant pour une protéine ayant la même activité biologique que le facteur de transcription CATFIIIA.
Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est notamment une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN similaires qui ont une homologie de séquence nucléotidique d'au moins 50 °s ou au
coli ou une cellule eucaryote telle que les levures comme par exemple les ascomycètes parmi lesquels les saccharomyces ou encore des cellules de mammifères comme par exemple des cellule Cos.
La présente invention a particulièrement pour objet le vecteur d'expression contenant une sëquence d'ADN telle que définie ci-dessus.
Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est donc ainsi notamment la séquence d'ADN du gène CAtfIIIA
codant pour une protéine ayant la fonction biologique du facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA et contenant la séquence de nuclêotides SEQ ID N°1 .
Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est ainsi plus particulièrement la séquence d'ADN commençant au nucléotide 720 et se terminant au nuclêotide 1955 de SEQ ID
N°1.
Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est ainsi encore plus particulièrement celle du gène CAtfIIIA tel que dêfini ci-dessus codant pour la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3.
Dans le vecteur d'expression, une telle séquencè d'ADN est ainsi une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus codant pour le facteur de transcription CATFIIIA ainsi que les séquences d'ADN qui hybrident avec celle-ci et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci ou encore les séquences d'ADN
comprenant des modifications introduites par suppression, insertion et/ou substitution d'au moins un nucléotide codant pour une protéine ayant la même activité biologique que le facteur de transcription CATFIIIA.
Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est notamment une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN similaires qui ont une homologie de séquence nucléotidique d'au moins 50 °s ou au
13 moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec ladite séquence d'ADN ou encore les séquences d'ADN similaires qui codent pour une protéine dont la séquence en AA a une homologie d'au moins 40 % et notamment de 45 % ou d'au moins S 50 %, plutôt au moins 60 % et de préfêrence au moins 70 %
avec la séquence en AA codêe par ladite séquence d'ADN.
Les vecteurs d'expression sont des vecteurs permettant l'expression de la protêine sous le contrôle d'un promoteur convenable. Un tel vecteur peut être un plasmide, un cosmide l0 ou un ADN viral. Pour les cellules procaryotes, le promoteur peut être par exemple le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur tac, le promoteur ~i-lactamase ou le promoteur PL.
Pour les cellules de levure, le promoteur peut être par exemple le promoteur PGK ou le promoteur GAL. Pour les 15 cellules de mammifères, le promoteur peut être par exemple le promoteur SV40 ou les promoteurs de l'adénovirus.
Des vecteurs type Baculovirus peuvent être aussi utilisés pour l'expression dans des cellules d'insectes.
Les cellules hôtes sont par exemple des cellules procaryotes 20 ou des cellules eucaryotes. Les cellules procaryotes sont par exemple E. coli, Bacillus ou Streptomyces. Les cellules hôtes eucaryotes comprennent des levures ainsi que des cellules d'organismes supérieurs, par exemple des cellules de mammi-fères ou des cellules d'insectes. Les cellules de mammifères 25 sont par exemple des fibroblastes tels que des cellules CHO
ou BHK de hamster et des cellules Cos de singe. Les cellules d'insectes sont par exemple des cellules SF9.
La présente invention concerne donc un procédé qui comprend l'expression d'un polynuclëotide selon la présente 30 invention codant pour la protéine CATFIIIA dans une cellule hôte transformée par un polynucléotide selon la présente invention et notamment une séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés SEQ ID N°3. Dans la réalisation d'un tel procédé, la cellule hôte est notamment une cellule 35 eucaryote.
Pour la réalisation de la présente invention, les vecteurs utilisés peuvent être par exemple pGEX ou pBAD et la cellule hôte peut être E. coli ou par exemple le vecteur pYX222 et ~VO 00/28037 PCT/FR99/02739
avec la séquence en AA codêe par ladite séquence d'ADN.
Les vecteurs d'expression sont des vecteurs permettant l'expression de la protêine sous le contrôle d'un promoteur convenable. Un tel vecteur peut être un plasmide, un cosmide l0 ou un ADN viral. Pour les cellules procaryotes, le promoteur peut être par exemple le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur tac, le promoteur ~i-lactamase ou le promoteur PL.
Pour les cellules de levure, le promoteur peut être par exemple le promoteur PGK ou le promoteur GAL. Pour les 15 cellules de mammifères, le promoteur peut être par exemple le promoteur SV40 ou les promoteurs de l'adénovirus.
Des vecteurs type Baculovirus peuvent être aussi utilisés pour l'expression dans des cellules d'insectes.
Les cellules hôtes sont par exemple des cellules procaryotes 20 ou des cellules eucaryotes. Les cellules procaryotes sont par exemple E. coli, Bacillus ou Streptomyces. Les cellules hôtes eucaryotes comprennent des levures ainsi que des cellules d'organismes supérieurs, par exemple des cellules de mammi-fères ou des cellules d'insectes. Les cellules de mammifères 25 sont par exemple des fibroblastes tels que des cellules CHO
ou BHK de hamster et des cellules Cos de singe. Les cellules d'insectes sont par exemple des cellules SF9.
La présente invention concerne donc un procédé qui comprend l'expression d'un polynuclëotide selon la présente 30 invention codant pour la protéine CATFIIIA dans une cellule hôte transformée par un polynucléotide selon la présente invention et notamment une séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés SEQ ID N°3. Dans la réalisation d'un tel procédé, la cellule hôte est notamment une cellule 35 eucaryote.
Pour la réalisation de la présente invention, les vecteurs utilisés peuvent être par exemple pGEX ou pBAD et la cellule hôte peut être E. coli ou par exemple le vecteur pYX222 et ~VO 00/28037 PCT/FR99/02739
14 ' la cellule hôte peut être notamment Saccharomyces cerevisiae.
La présente invention a notamment pour objet la cellule hôte transformée avec un vecteur tel que dêfini ci-dessus et renfermant une séquence d'ADN selon la présente invention.
5 La présente invention a ainsi pour objet le procédé de préparation d'une protéine recombinante selon la présente invention, tel que défini ci-dessus, dans lequel la cellule hôte est E. coli DHS alpha ou E. coli XL1-Blue ou notamment Saccharomyces cerevisiae.
10 Un exposé détaillé des conditions dans lesquelles peuvent être menées les opérations indiquées ci-dessus est donné ci-après dans la partie expêrimentale. On a ainsi obtenu un plasmide dans lequel est inséré le gëne de la présente invention et on obtient ainsi également ce plasmide introduit
La présente invention a notamment pour objet la cellule hôte transformée avec un vecteur tel que dêfini ci-dessus et renfermant une séquence d'ADN selon la présente invention.
5 La présente invention a ainsi pour objet le procédé de préparation d'une protéine recombinante selon la présente invention, tel que défini ci-dessus, dans lequel la cellule hôte est E. coli DHS alpha ou E. coli XL1-Blue ou notamment Saccharomyces cerevisiae.
10 Un exposé détaillé des conditions dans lesquelles peuvent être menées les opérations indiquées ci-dessus est donné ci-après dans la partie expêrimentale. On a ainsi obtenu un plasmide dans lequel est inséré le gëne de la présente invention et on obtient ainsi également ce plasmide introduit
15 dans une cellule hôte en opérant selon les techniques usuelles connues de l'homme du métier.
La présente invention a très prëcisément pour objet le plasmide déposê à la CNCM sous le numéro I-2072.
I1 s'agit ainsi précisëment de la souche XL1-Blue/Yep24-20 Catfc2 renfermant le gène CAtfIIIA selon la présente invention.
Ce gène correspond donc â la séquence 720-1955 de SEQ ID
N°1.
Les conditions opératoires dans lesquelles a étê réalisée la 25 présente invention sont décrites ci-après dans la partie expérimentale.
La protéine TFIIIA codée par le gène CAtfIIIA est donc un facteur de transcription. En effet, la protéine TFIIIA
codêe par le gène de la présente invention a un rôle 30 biologique comme protéine se liant à l'ADN et serait utile comme facteur de transcription.
En particulier, le gène de 1a présente invention est exprimé
dans différents tissus et joue un rôle important dans l'ini-tiation de la transcription du gène de l'ARN ribosomal SS.
35 L'étude de ces facteurs peut également être utile dans l'analyse des mëcanismes de régulation de la transcription.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé de criblage de produits antifongiques caractérisê en ce qu'il i~VO 00/28037 PCT/FR99/02739 comprend une étape où l'on mesure l'activité de facteur de transcription de CATFIIIA tel que dêfini ci-dessus en présence de chacun des produits dont on souhaite dëterminer les propriétés antifongiques et l'on sélectionne les produits 5 ayant un effet inhibiteur sur cette activité.
La mise en évidence dans le cadre de la présente invention de l'homologie fonctionnelle des facteurs de transcription de Candida albicans et Saccharomyces cerevisiae, illustrée dans la partie expérimentale ci-après, 10 permet d'envisager de nombreuses applications pour le facteur de transcription CATFIIIA de la présente invention.
En particulier du fait qu'il apparaît que l'activité de SCTFIIIA est essentielle pour la survie cellulaire, des substances inhibitrices de cette activité peuvent être 15 utilisables comme agents antifongiques, soit en tant que médicaments soit sur le plan industriel.
Par exemple, pour cribler des substances antifongiques telles que des substances actives sur Candida albicans, on mesure l'activité de CATFIIIA ou de l'un de ses homologues fonctionnels constituê par un facteur de transcription TFIIIA
en présence de chacun des produits dont on souhaite déterminer les propriétés antifongiques et l'on sëlectionne les produits ayant un effet inhibiteur sur cette activitê.
On peut effectuer un tel criblage en mesurant l'activitë
de transcription de TFIIIA en présence d'activateurs ou d'inhibiteurs potentiels à tester. La transcription de l'ARN
SS peut par exemple être mesurée in vitro directement en détectant la synthèse de l'ARN 5S dans un milieu réactionnel approprié.
L'activité de transcription peut également être mesurée in vivo par un test de viabilitë cellulaire. Par exemple, l'activité de transcription peut être avantageusement mesurée dans des cellules d'un mutant de Saccharomyces cerevisiae n'exprimant pas TFIIIA de SC transformées par le gène CAtf IIIA.
L'invention englobe également l'utilisation d'un produit sêlectionnë comme indiquë ci-dessus pour ses propriétés inhibitrices d'un facteur de transcription TFIIIA pour
La présente invention a très prëcisément pour objet le plasmide déposê à la CNCM sous le numéro I-2072.
I1 s'agit ainsi précisëment de la souche XL1-Blue/Yep24-20 Catfc2 renfermant le gène CAtfIIIA selon la présente invention.
Ce gène correspond donc â la séquence 720-1955 de SEQ ID
N°1.
Les conditions opératoires dans lesquelles a étê réalisée la 25 présente invention sont décrites ci-après dans la partie expérimentale.
La protéine TFIIIA codée par le gène CAtfIIIA est donc un facteur de transcription. En effet, la protéine TFIIIA
codêe par le gène de la présente invention a un rôle 30 biologique comme protéine se liant à l'ADN et serait utile comme facteur de transcription.
En particulier, le gène de 1a présente invention est exprimé
dans différents tissus et joue un rôle important dans l'ini-tiation de la transcription du gène de l'ARN ribosomal SS.
35 L'étude de ces facteurs peut également être utile dans l'analyse des mëcanismes de régulation de la transcription.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé de criblage de produits antifongiques caractérisê en ce qu'il i~VO 00/28037 PCT/FR99/02739 comprend une étape où l'on mesure l'activité de facteur de transcription de CATFIIIA tel que dêfini ci-dessus en présence de chacun des produits dont on souhaite dëterminer les propriétés antifongiques et l'on sélectionne les produits 5 ayant un effet inhibiteur sur cette activité.
La mise en évidence dans le cadre de la présente invention de l'homologie fonctionnelle des facteurs de transcription de Candida albicans et Saccharomyces cerevisiae, illustrée dans la partie expérimentale ci-après, 10 permet d'envisager de nombreuses applications pour le facteur de transcription CATFIIIA de la présente invention.
En particulier du fait qu'il apparaît que l'activité de SCTFIIIA est essentielle pour la survie cellulaire, des substances inhibitrices de cette activité peuvent être 15 utilisables comme agents antifongiques, soit en tant que médicaments soit sur le plan industriel.
Par exemple, pour cribler des substances antifongiques telles que des substances actives sur Candida albicans, on mesure l'activité de CATFIIIA ou de l'un de ses homologues fonctionnels constituê par un facteur de transcription TFIIIA
en présence de chacun des produits dont on souhaite déterminer les propriétés antifongiques et l'on sëlectionne les produits ayant un effet inhibiteur sur cette activitê.
On peut effectuer un tel criblage en mesurant l'activitë
de transcription de TFIIIA en présence d'activateurs ou d'inhibiteurs potentiels à tester. La transcription de l'ARN
SS peut par exemple être mesurée in vitro directement en détectant la synthèse de l'ARN 5S dans un milieu réactionnel approprié.
L'activité de transcription peut également être mesurée in vivo par un test de viabilitë cellulaire. Par exemple, l'activité de transcription peut être avantageusement mesurée dans des cellules d'un mutant de Saccharomyces cerevisiae n'exprimant pas TFIIIA de SC transformées par le gène CAtf IIIA.
L'invention englobe également l'utilisation d'un produit sêlectionnë comme indiquë ci-dessus pour ses propriétés inhibitrices d'un facteur de transcription TFIIIA pour
16 l'obtention d'un agent antifongique.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide de la partie expérimentale qui suit et qui décrit le clonage du gène CAtfIIIa de la présente invention.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné par le.procédé de criblage de produits antifongiques tel que défini ci-dessus pour l'obtention d'un agent antifongique.
La présente invention a également pour objet l'utili-sation du gène du facteur de transcription CAtfIIIA de Candida albicans ou du facteur de transcription codé par ce gène tel que dêfini ci-dessus pour la sélection d'un produit ayant des propriétés antifongiques tei que dëfini ci-dessus et utilisé comme inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans.
La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans telles que définies ci-dessus.
De telles compositions peuvent notamment être utiles pour traiter les infections fongiques topiques et systémiques.
Les compositions pharmaceutiques indiquées ci-dessus peuvent être administrées par voie buccale, rectale, par voie parentérale ou par voie locale en application topique-sur la peau et les muqueuses ou par injection par voie intraveineuse ou intramusculaire. Ces compositions peuvènt être solides ou liquides et se présenter sous toutes les formes pharmaceu-tiques couramment utilisées en médecine humaine comme, par exemple, les comprimês simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les suppositoires, les préparations injec-tables, les pommades, les crèmes, les gels et les prépa-rations en aérosols ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le principe actif peut y être incorporé à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou vêgétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, i~VO 00/28037 PCT/FR99/02739
La présente invention sera mieux comprise à l'aide de la partie expérimentale qui suit et qui décrit le clonage du gène CAtfIIIa de la présente invention.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné par le.procédé de criblage de produits antifongiques tel que défini ci-dessus pour l'obtention d'un agent antifongique.
La présente invention a également pour objet l'utili-sation du gène du facteur de transcription CAtfIIIA de Candida albicans ou du facteur de transcription codé par ce gène tel que dêfini ci-dessus pour la sélection d'un produit ayant des propriétés antifongiques tei que dëfini ci-dessus et utilisé comme inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans.
La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans telles que définies ci-dessus.
De telles compositions peuvent notamment être utiles pour traiter les infections fongiques topiques et systémiques.
Les compositions pharmaceutiques indiquées ci-dessus peuvent être administrées par voie buccale, rectale, par voie parentérale ou par voie locale en application topique-sur la peau et les muqueuses ou par injection par voie intraveineuse ou intramusculaire. Ces compositions peuvènt être solides ou liquides et se présenter sous toutes les formes pharmaceu-tiques couramment utilisées en médecine humaine comme, par exemple, les comprimês simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les suppositoires, les préparations injec-tables, les pommades, les crèmes, les gels et les prépa-rations en aérosols ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le principe actif peut y être incorporé à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou vêgétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, i~VO 00/28037 PCT/FR99/02739
17 ' les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
La posologie sera variable selon le produit utilisé, le sujet traitê et l'affection en cause.
La présente invention a ainsi notamment pour objet l'utilisation des compositions belles que définies ci-dessus comme agents antifongiques.
La présente invention a encore pour objet une méthode d'induction d'une réponse immunologique chez un mammifère comprenant l'inoculation à ce mammifère du polypeptide selon la présente invention tel que défini ci-dessus ou un fragment de ce polypeptide ayant la même fonction de façon à produire un anticorps permettant de protéger l'animal contre la maladie.
La présente invention a ainsi pour objet des anticorps dirigés contre les polypeptides de la présente invention tels que définis ci-dessus ayant la fonction de facteur de trans-cription CATFIIIA ou contre un fragment de ces polypeptides ayant la même fonction et codés par les polynucléotides de la présente invention et notamment par une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus.
Les polypeptides de la présente invention peuvent ainsi être utilisés comme immunogènes pour produire des anticorps immunospécifiques de ces polypeptides. Le terme anticorps utilisé désigne les anticorps aussi bien monoclonaux que polyclonaux, chimériques, simple chaîne, les anticorps non humains et les anticorps humains, aussi bien que les fragments Fab, incluant ainsi les produits d'une banque d'immunoglobuline Fab. Les anticorps générês contre les polypeptides de la présente invention peuvent être obtenus par administration des polypeptides de la présente invention ou de fragments portant des ëpitopes, leurs analogues ou encore des cellules à un animal, de préférence non humain, en utilisant des protocoles de routine pour la préparation d'anticorps monoclonaux. De tels anticorps peuvent être préparés par les méthodes bien connues dans ce domaine telles que celles décrites dans l'ouvrage Antibodies, Laboratory manuel Ed. Harbow et David Larre, Cold Spring Harbor i~VO 00/28037 PCT/FR99/02739
La posologie sera variable selon le produit utilisé, le sujet traitê et l'affection en cause.
La présente invention a ainsi notamment pour objet l'utilisation des compositions belles que définies ci-dessus comme agents antifongiques.
La présente invention a encore pour objet une méthode d'induction d'une réponse immunologique chez un mammifère comprenant l'inoculation à ce mammifère du polypeptide selon la présente invention tel que défini ci-dessus ou un fragment de ce polypeptide ayant la même fonction de façon à produire un anticorps permettant de protéger l'animal contre la maladie.
La présente invention a ainsi pour objet des anticorps dirigés contre les polypeptides de la présente invention tels que définis ci-dessus ayant la fonction de facteur de trans-cription CATFIIIA ou contre un fragment de ces polypeptides ayant la même fonction et codés par les polynucléotides de la présente invention et notamment par une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus.
Les polypeptides de la présente invention peuvent ainsi être utilisés comme immunogènes pour produire des anticorps immunospécifiques de ces polypeptides. Le terme anticorps utilisé désigne les anticorps aussi bien monoclonaux que polyclonaux, chimériques, simple chaîne, les anticorps non humains et les anticorps humains, aussi bien que les fragments Fab, incluant ainsi les produits d'une banque d'immunoglobuline Fab. Les anticorps générês contre les polypeptides de la présente invention peuvent être obtenus par administration des polypeptides de la présente invention ou de fragments portant des ëpitopes, leurs analogues ou encore des cellules à un animal, de préférence non humain, en utilisant des protocoles de routine pour la préparation d'anticorps monoclonaux. De tels anticorps peuvent être préparés par les méthodes bien connues dans ce domaine telles que celles décrites dans l'ouvrage Antibodies, Laboratory manuel Ed. Harbow et David Larre, Cold Spring Harbor i~VO 00/28037 PCT/FR99/02739
18 laboratory Eds, 1988.
La prêsente invention a ainsi tout particulièrement pour objet un anticorps dirigé contre la protéine CATFIIIA de la présente invention ou un fragment de cette protéine ayant notamment la même fonction.
La prësente invention a encore pour objet l'utilisation du gène du facteur de transcription CAtfIIIA ou du facteur de transcription codé par ce gène tel que défini ci-dessus pour la prêparation de compositions utiles pour le diagnostic ou le traitement de maladies causées par la levure pathogène Candida albicans.
La présente invention concerne aussi l'utilisation des polynucléotides de la présente invention comme réactifs de diagnostic. La dëtection d'un polynucléotide selon la prêsente invention codant pour la protéine TFIIIA de Candida albicans ou de ses analogues chez un eucaryote en particulier un mammifère et plus particulièrement un être humain, peut constituer un moyen de diagnostic d'une maladie . ainsi, on peut détecter un tel polynuclêotide selon la présente invention et notamment une séquence d'ADN par une grande variété de techniques chez un eucaryote en particulier un mammifère et plus particulièrement un être humain, infectés par un organisme contenant au moins l'un des polynucléotides de la présente invention. Les acides nuclêiques pour.une telle utilisation d'outil de diagnostic peuvent être dêtectés à partir de cellules ou de tissus infectês~, tels que l'os, le sang, le muscle, le cartilage ou la peau. Pour cette détection, l'ADN génomique peut être utilisë directement ou encore être amplifié par PCR ou une autre technique d'amplification. Les ARN ou ADN et ADNc peuvent également être utilisés dans le même but. Par les techniques d'amplification, la lignée du mycète présent dans un eucaryote en particulier un mammifère et plus particuliè-rement un être humain, peut être caractérisée par l'analyse du génotype. Des délétions ou des insertions peuvent être détectées par le changement de taille du produit amplifié par comparaison avec le génotype de la sêquence de référence. Les points de mutations peuvent être identifiés par hybridation ~VO 00/28037 PCT/FR99/02739
La prêsente invention a ainsi tout particulièrement pour objet un anticorps dirigé contre la protéine CATFIIIA de la présente invention ou un fragment de cette protéine ayant notamment la même fonction.
La prësente invention a encore pour objet l'utilisation du gène du facteur de transcription CAtfIIIA ou du facteur de transcription codé par ce gène tel que défini ci-dessus pour la prêparation de compositions utiles pour le diagnostic ou le traitement de maladies causées par la levure pathogène Candida albicans.
La présente invention concerne aussi l'utilisation des polynucléotides de la présente invention comme réactifs de diagnostic. La dëtection d'un polynucléotide selon la prêsente invention codant pour la protéine TFIIIA de Candida albicans ou de ses analogues chez un eucaryote en particulier un mammifère et plus particulièrement un être humain, peut constituer un moyen de diagnostic d'une maladie . ainsi, on peut détecter un tel polynuclêotide selon la présente invention et notamment une séquence d'ADN par une grande variété de techniques chez un eucaryote en particulier un mammifère et plus particulièrement un être humain, infectés par un organisme contenant au moins l'un des polynucléotides de la présente invention. Les acides nuclêiques pour.une telle utilisation d'outil de diagnostic peuvent être dêtectés à partir de cellules ou de tissus infectês~, tels que l'os, le sang, le muscle, le cartilage ou la peau. Pour cette détection, l'ADN génomique peut être utilisë directement ou encore être amplifié par PCR ou une autre technique d'amplification. Les ARN ou ADN et ADNc peuvent également être utilisés dans le même but. Par les techniques d'amplification, la lignée du mycète présent dans un eucaryote en particulier un mammifère et plus particuliè-rement un être humain, peut être caractérisée par l'analyse du génotype. Des délétions ou des insertions peuvent être détectées par le changement de taille du produit amplifié par comparaison avec le génotype de la sêquence de référence. Les points de mutations peuvent être identifiés par hybridation ~VO 00/28037 PCT/FR99/02739
19 ' de l'ADN amplifié avec les séquences, marquées par un élément radioactif, de polynucléotides de la présente invention. Des séquences parfaitement complémentaires peuvent ainsi être distinguées de duplex qui résistent mal à ia digestion par des nucléases. Les différences de séquences d'ADN peuvent aussi être détectées par des altérations de la mobilitê
électrophorétique de fragments d'ADN dans des gels, avec ou sans agent dénaturant, ou par un séquençage direct d'ADN
(rêfêrence . Myers et al. Science, 230 . 1242 (1985)).
Des changements de séquences à des localisations spécifiques peuvent aussi être révélées par des expériences de protection contre des nuclëases telles que RNase I et S1 ou par des méthodes de clivage chimique (rêférence . Cotton et al., Proc Natl Acad Sci, USA, 85 . 4397-4401 (1985).
Des cellules contenant l'un des polynucléotides de la présente invention portant des mutations ou des polymor-phismes peuvent aussi être détectées par un grand nombre de techniques permettant notamment de déterminer le sérotype.
Par exemple, la technique RT-PCR peut être utilisée pour détecter les mutations. I1 est particulièrement préféré
d'utiliser les techniques de RT-PCR en conjonction avec des systèmes de détection automatique, tels que par exemple dans la technique GeneScan. ARN et ADNC peuvent être utilisés dans les techniques PCR ou RT-PCR. Par exemple, des amorces complémentaires des polynuclêotides codant poûr les.
polypeptides de la présente invention peuvent être utilisés pour identifier et analyser les mutations.
Des amorces peuvent ainsi être utilisées pour amplifier un ADN isolê de l'individu infecté. De cette façon des mutations dans la séquence d'ADN peuvent être détectées et utilisées pour diagnostiquer l'infection et déterminer le sérotype ou le classement de l'agent infectieux. De telles techniques sont usuelles pour l'homme du mêtier et sont dêcrites notamment dans le manuel 'Carrent Protocols in Molecular Biology', Ausubel et al, ed. John Wiley ~ sons, Inc., 1995).
La présente invention concerne ainsi un procédé de diagnostic d'une maladie et de préférence d'une infection fongique provoquëe notamment par Candida albicans telles que des mycoses comme indiqué ci-dessus, ce procédé comprenant la détermination à partir d'un échantillon prélevé sur un individu infecté, d'une augmentation de la quantité de polynucléotide de la présente invention. Un tel polynu-5 cléotide peut notamment avoir une séquence d'ADN de la présente invention telle que définie ci-dessus.
Des augmentations ou des diminutions de la quantité de poly-nucléotides peuvent être mesurées par les techniques bien connues de l'homme du métier telles que notamment l'amplifi-10 cation, la PCR, RT PCR, Northern blotting ou autres techniques d'hybridation.
De plus, une mêthode de diagnostic en accord avec la présente invention consiste en la détection d'une expression trop importante de polypeptides de la présente invention, par 15 comparaison avec des échantillons de contrôle constitués de tissus normaux non infectés utilisës pour détecter la présence d'une infection.
Les techniques qui peuvent être utilisées pour détecter ainsi les quantités de protéines exprimées dans un échantillon
électrophorétique de fragments d'ADN dans des gels, avec ou sans agent dénaturant, ou par un séquençage direct d'ADN
(rêfêrence . Myers et al. Science, 230 . 1242 (1985)).
Des changements de séquences à des localisations spécifiques peuvent aussi être révélées par des expériences de protection contre des nuclëases telles que RNase I et S1 ou par des méthodes de clivage chimique (rêférence . Cotton et al., Proc Natl Acad Sci, USA, 85 . 4397-4401 (1985).
Des cellules contenant l'un des polynucléotides de la présente invention portant des mutations ou des polymor-phismes peuvent aussi être détectées par un grand nombre de techniques permettant notamment de déterminer le sérotype.
Par exemple, la technique RT-PCR peut être utilisée pour détecter les mutations. I1 est particulièrement préféré
d'utiliser les techniques de RT-PCR en conjonction avec des systèmes de détection automatique, tels que par exemple dans la technique GeneScan. ARN et ADNC peuvent être utilisés dans les techniques PCR ou RT-PCR. Par exemple, des amorces complémentaires des polynuclêotides codant poûr les.
polypeptides de la présente invention peuvent être utilisés pour identifier et analyser les mutations.
Des amorces peuvent ainsi être utilisées pour amplifier un ADN isolê de l'individu infecté. De cette façon des mutations dans la séquence d'ADN peuvent être détectées et utilisées pour diagnostiquer l'infection et déterminer le sérotype ou le classement de l'agent infectieux. De telles techniques sont usuelles pour l'homme du mêtier et sont dêcrites notamment dans le manuel 'Carrent Protocols in Molecular Biology', Ausubel et al, ed. John Wiley ~ sons, Inc., 1995).
La présente invention concerne ainsi un procédé de diagnostic d'une maladie et de préférence d'une infection fongique provoquëe notamment par Candida albicans telles que des mycoses comme indiqué ci-dessus, ce procédé comprenant la détermination à partir d'un échantillon prélevé sur un individu infecté, d'une augmentation de la quantité de polynucléotide de la présente invention. Un tel polynu-5 cléotide peut notamment avoir une séquence d'ADN de la présente invention telle que définie ci-dessus.
Des augmentations ou des diminutions de la quantité de poly-nucléotides peuvent être mesurées par les techniques bien connues de l'homme du métier telles que notamment l'amplifi-10 cation, la PCR, RT PCR, Northern blotting ou autres techniques d'hybridation.
De plus, une mêthode de diagnostic en accord avec la présente invention consiste en la détection d'une expression trop importante de polypeptides de la présente invention, par 15 comparaison avec des échantillons de contrôle constitués de tissus normaux non infectés utilisës pour détecter la présence d'une infection.
Les techniques qui peuvent être utilisées pour détecter ainsi les quantités de protéines exprimées dans un échantillon
20 d'une cellule hôte sont bien connues de l'homme du métier. On peut ainsi citer par exemple les techniques de radioimmu-noassay ou de competitive-binding, analyse par Western Blot et test ELISA (ref Ausubel indiqué ci-dessus).
La présente invention a encore pour objet un kia~pour le diagnostic d'infections fongiques comprenant une séquence d'ADN selon la présente invention telle què définie ci-dessus ou une séquence ayant une fonction similaire ou un fragment fonctionnel de cette séquence, le polypeptide codé par cette séquence ou un fragment polypeptidique ayant la même fonction ou un anticorps dirigé contre un tel polypeptide codé par cette séquence d'ADN ou contre un fragment de ce polypeptide.
Ce kit pourra ainsi contenir une séquence d'ADN selon la présente invention telle que dëfinie ci-dessus et par exemple la séquence d'ADN SEQ ID N°1 ou un fragment de cette séquence ou encore la séquence 720 à 195S de SEQ ID-N°1.
Un tel kit pourra de même contenir un polypeptide selon la présente invention ou un fragment de ce polypeptide et notamment la protêine ayant la sêquence en AA SEQ ID N°3 ou
La présente invention a encore pour objet un kia~pour le diagnostic d'infections fongiques comprenant une séquence d'ADN selon la présente invention telle què définie ci-dessus ou une séquence ayant une fonction similaire ou un fragment fonctionnel de cette séquence, le polypeptide codé par cette séquence ou un fragment polypeptidique ayant la même fonction ou un anticorps dirigé contre un tel polypeptide codé par cette séquence d'ADN ou contre un fragment de ce polypeptide.
Ce kit pourra ainsi contenir une séquence d'ADN selon la présente invention telle que dëfinie ci-dessus et par exemple la séquence d'ADN SEQ ID N°1 ou un fragment de cette séquence ou encore la séquence 720 à 195S de SEQ ID-N°1.
Un tel kit pourra de même contenir un polypeptide selon la présente invention ou un fragment de ce polypeptide et notamment la protêine ayant la sêquence en AA SEQ ID N°3 ou
21 encore un anticorps tel que défini ci-dessus.
Un tel kit peut-être préparé selon les méthodes bien connues de l'homme du métier.
Les sêquences SEQ ID N° 1 à 9 indiquées dans la présente invention sont décrites ci-après.
La partie expérimentale ci-après permet de décrire la présente invention sans toutefois la limiter.
Partie expérimentale Exemple 1 . Clonage et séquençage du gène CAtfIIIA
a) Conditions de culture .
La bactërie Escherichia coli (E. coli) de la lignée DH5 alpha (Gibco BRL) ou XL1- Blue type K12 (Stratagêne) a été
utilisée pour la préparation des plasmides de la présente invention.
La croissance de cette bactérie a êté effectuée selon les conditions usuelles en milieu liquide LB qui renferme 10 g de bactotryptone, 5 g d'extrait de levure et 10 g de NaCl pour un litre d'eau et qui renferme également 100 microg/ml d'ampicilline (SIGMA).
La colonie a été prélevée sur milieu solide LB + agar +
ampicilline puis cultivée dans 100 ml de milieu LB et incubée jusqu'â DO (600 nm) - 0.8.
L'incubation a étê effectuée â 37°C sous atmosphère normale et agitation à 225 rpm.
La viabilité de la souche est vérifiée lorsqué la souche pousse sur milieu LB + ampicilline à 100 microg/ml.
On peut noter qu'un gène de résistance â l'ampicilline Bla fait partie du vecteur dans lequel sont clonés les fragments de CAtfIIIA. Ainsi, la sélection des souches renfermant les plasmides contenant le gène tfIIIA de Candida albicans de la présente invention peut être opérée par la culture des souches dans ce milieu renfermant de l'ampicilline (100 microg/ml), un tel milieu permettant la survie uniquement des souches qui renferment le gène de résistance à l'ampicilline et ainsi uniquement des souches qui renferment le gène tfIIIA
de Candida a. de la présente invention.
Pour la conservation des souches obtenues, 15 % de glycérol sont ajoutés au milieu de culture . les cultures sont donc
Un tel kit peut-être préparé selon les méthodes bien connues de l'homme du métier.
Les sêquences SEQ ID N° 1 à 9 indiquées dans la présente invention sont décrites ci-après.
La partie expérimentale ci-après permet de décrire la présente invention sans toutefois la limiter.
Partie expérimentale Exemple 1 . Clonage et séquençage du gène CAtfIIIA
a) Conditions de culture .
La bactërie Escherichia coli (E. coli) de la lignée DH5 alpha (Gibco BRL) ou XL1- Blue type K12 (Stratagêne) a été
utilisée pour la préparation des plasmides de la présente invention.
La croissance de cette bactérie a êté effectuée selon les conditions usuelles en milieu liquide LB qui renferme 10 g de bactotryptone, 5 g d'extrait de levure et 10 g de NaCl pour un litre d'eau et qui renferme également 100 microg/ml d'ampicilline (SIGMA).
La colonie a été prélevée sur milieu solide LB + agar +
ampicilline puis cultivée dans 100 ml de milieu LB et incubée jusqu'â DO (600 nm) - 0.8.
L'incubation a étê effectuée â 37°C sous atmosphère normale et agitation à 225 rpm.
La viabilité de la souche est vérifiée lorsqué la souche pousse sur milieu LB + ampicilline à 100 microg/ml.
On peut noter qu'un gène de résistance â l'ampicilline Bla fait partie du vecteur dans lequel sont clonés les fragments de CAtfIIIA. Ainsi, la sélection des souches renfermant les plasmides contenant le gène tfIIIA de Candida albicans de la présente invention peut être opérée par la culture des souches dans ce milieu renfermant de l'ampicilline (100 microg/ml), un tel milieu permettant la survie uniquement des souches qui renferment le gène de résistance à l'ampicilline et ainsi uniquement des souches qui renferment le gène tfIIIA
de Candida a. de la présente invention.
Pour la conservation des souches obtenues, 15 % de glycérol sont ajoutés au milieu de culture . les cultures sont donc
22 conservées dans le milieu de suspension LB +100 microgram-mes/ml d'ampicilline + 15 % de glycérol à la concentration bactérienne de DO (600 nm = 0.8 sous forme d'aliquots en cryotubes de 1 ml par tube.
5 Pour le séquençage, l'ADN plasmidique de plusieurs bactéries issues de chacun des clonages indiqués ci-après est prëparé
en utilisant un kit commercial (Qiagen Plasmids kit). Les fragments correspondant à la séquence du gêne CAtfIIIA sont séquencés sur les deux brins suivant les techniques 10 classiques connues de l'homme du métier (utilisation du séquenceur ABI 377 XL, Perkin Elmer).
b) Clonage et séquençage du gène CAtfIIIA .
Dans le cadre de la présente invention, le gène codant pour le facteur de transcription de CA soit SEQ ID N°1 représenté
15 à la figure 1 a été isolê à partir de la banque de fragment génomique de Candida albicans. (Sanglard et al., Antimicrobial agents and chemotherapy 39, 2378-2386, (1995)).
La structure du gène a été identifiée par sêquençage.
La stratégie utilisée repose sur l'hypothèse que SC et CA
20 sont des levures proches dont la structure des gènes peut être homologue.
On a procédé comme suit .
Dans le cadre de la présente invention, en utilisant le site internet de Standford qui permet d'accéder aux séquences 25 préliminaires du génome de Candida albicans, ûne fraction de séquence homologue à tfIIIA de S. cerevisiae a été
identifiée. Ce fragment contient un cadre ouvert de lecture (258 pb) codant pour une protéine pour laquelle on peut identifier deux motifs en doigts de zinc et une rëgion riche 30 en résidus sérine caractéristique du facteur TFIIIA de SC. Ce cadre ouvert de lecture contient en réalité 259 nucléotides.
Afin d'amplifier le fragment correspondant de Candida albicans, deux oligonuclëotides ont été sélectionnés dans cette séquence. Ces oligonucléotides sont les suivants .
35 INT GAND situé à la position 720-740 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°4 et 3' CAND situé à la position 955-978 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°5.
5 Pour le séquençage, l'ADN plasmidique de plusieurs bactéries issues de chacun des clonages indiqués ci-après est prëparé
en utilisant un kit commercial (Qiagen Plasmids kit). Les fragments correspondant à la séquence du gêne CAtfIIIA sont séquencés sur les deux brins suivant les techniques 10 classiques connues de l'homme du métier (utilisation du séquenceur ABI 377 XL, Perkin Elmer).
b) Clonage et séquençage du gène CAtfIIIA .
Dans le cadre de la présente invention, le gène codant pour le facteur de transcription de CA soit SEQ ID N°1 représenté
15 à la figure 1 a été isolê à partir de la banque de fragment génomique de Candida albicans. (Sanglard et al., Antimicrobial agents and chemotherapy 39, 2378-2386, (1995)).
La structure du gène a été identifiée par sêquençage.
La stratégie utilisée repose sur l'hypothèse que SC et CA
20 sont des levures proches dont la structure des gènes peut être homologue.
On a procédé comme suit .
Dans le cadre de la présente invention, en utilisant le site internet de Standford qui permet d'accéder aux séquences 25 préliminaires du génome de Candida albicans, ûne fraction de séquence homologue à tfIIIA de S. cerevisiae a été
identifiée. Ce fragment contient un cadre ouvert de lecture (258 pb) codant pour une protéine pour laquelle on peut identifier deux motifs en doigts de zinc et une rëgion riche 30 en résidus sérine caractéristique du facteur TFIIIA de SC. Ce cadre ouvert de lecture contient en réalité 259 nucléotides.
Afin d'amplifier le fragment correspondant de Candida albicans, deux oligonuclëotides ont été sélectionnés dans cette séquence. Ces oligonucléotides sont les suivants .
35 INT GAND situé à la position 720-740 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°4 et 3' CAND situé à la position 955-978 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°5.
23 On a ainsi obtenu un fragment de 259 paires de bases.
I1 a d'abord été confirmé par PCR qu'il est possible d'amplifier un fragment d'ADN génomique de CA, préparé â
partir de cellules de CA par les méthodes usuelles connues de l'homme du métier, et d'autre part dans la banque de gènes de CA. Ces oligonuclêotides ont aussi permis de synthétiser un fragment d'ADN â partir d'ADN gênomique de Candida albicans afin de préparer une sonde marquée au 32P (phosphore 32) en utilisant un kit (Mega Prime, Amersham).
Ce fragment a été utilisé pour le criblage de la banque de fragments génomiques Sau 3A de Candida albicans clonés dans le site BamHI du vecteur YEp24 (multicopie-Ura3) [Botstein et al., Gene, 8, 17-24, (1979)].
Les cellules E. coli DH5 alpha transformëes avec le vecteur YEp24 (vecteur multicopie avec gène de sélection UR.A3) contenant les fragments dëcrits ci-dessus (17000 clones) sont étalées sur des boîtes contenant un milieu LB + ampicilline et cultivées à 37°C.
Une réplique sur filtre de nitrocellulose est ensuite traitée par des techniques connues de l'homme du métier comme par exemple NaOH . 0,5M, 5 minutes ; Tris-HC1 . 1M (pH = 7,5) 5 minutes ; NaCl 1,5M/Tris-HC1 0,5M (pH 7,5).
Pour le séchage, les filtres sont gardés pendant 10 minutes à
80°C puis fixés aux UV (Stratalinker). Préhybridation~et hybridation sont réalisées dans un tampon de NaP04 (pH 7,2) O,SM ; EDTA lOmM ; SDS 7 % (réf.,' Church et Gilbert, PNAS 81 . 1991 (1984)).
La sonde est marquée au 32P avec le kit MegaPrime et(alpha 32P)dCTP (Amersham UK). L'hybridation est réalisëe pendant toute la nuit à 65°C. Les filtres sont ensuite lavés dans 1 %
SDS, 40 mM NaP04 (pH 7,2), six fois pendant 5 minutes à 65°C
et ils sont ensuite soumis à une autoradiographie pendant toute la nuit.
L'hybridation sur filtre avec la sonde marquée au 32P a permis de sélectionner plusieurs clones positifs qui ont été
réensemencés.sur boftes afin de les isoler. Des clones individuels ont ainsi ëté isolés.
On a ainsi obtenu trois types de clones que l'on nomme 9, 18
I1 a d'abord été confirmé par PCR qu'il est possible d'amplifier un fragment d'ADN génomique de CA, préparé â
partir de cellules de CA par les méthodes usuelles connues de l'homme du métier, et d'autre part dans la banque de gènes de CA. Ces oligonuclêotides ont aussi permis de synthétiser un fragment d'ADN â partir d'ADN gênomique de Candida albicans afin de préparer une sonde marquée au 32P (phosphore 32) en utilisant un kit (Mega Prime, Amersham).
Ce fragment a été utilisé pour le criblage de la banque de fragments génomiques Sau 3A de Candida albicans clonés dans le site BamHI du vecteur YEp24 (multicopie-Ura3) [Botstein et al., Gene, 8, 17-24, (1979)].
Les cellules E. coli DH5 alpha transformëes avec le vecteur YEp24 (vecteur multicopie avec gène de sélection UR.A3) contenant les fragments dëcrits ci-dessus (17000 clones) sont étalées sur des boîtes contenant un milieu LB + ampicilline et cultivées à 37°C.
Une réplique sur filtre de nitrocellulose est ensuite traitée par des techniques connues de l'homme du métier comme par exemple NaOH . 0,5M, 5 minutes ; Tris-HC1 . 1M (pH = 7,5) 5 minutes ; NaCl 1,5M/Tris-HC1 0,5M (pH 7,5).
Pour le séchage, les filtres sont gardés pendant 10 minutes à
80°C puis fixés aux UV (Stratalinker). Préhybridation~et hybridation sont réalisées dans un tampon de NaP04 (pH 7,2) O,SM ; EDTA lOmM ; SDS 7 % (réf.,' Church et Gilbert, PNAS 81 . 1991 (1984)).
La sonde est marquée au 32P avec le kit MegaPrime et(alpha 32P)dCTP (Amersham UK). L'hybridation est réalisëe pendant toute la nuit à 65°C. Les filtres sont ensuite lavés dans 1 %
SDS, 40 mM NaP04 (pH 7,2), six fois pendant 5 minutes à 65°C
et ils sont ensuite soumis à une autoradiographie pendant toute la nuit.
L'hybridation sur filtre avec la sonde marquée au 32P a permis de sélectionner plusieurs clones positifs qui ont été
réensemencés.sur boftes afin de les isoler. Des clones individuels ont ainsi ëté isolés.
On a ainsi obtenu trois types de clones que l'on nomme 9, 18
24 et 47 contenant trois inserts différents du gène CAtfIIIA de la présente invention . l'analyse par PCR a confirmé la présence du fragment de 259 pb.
Les plasmides YEp24 contenant des inserts de Candida albicans ont été récupërés à partir de ces colonies. La carte de restriction de chacun de ces plasmides a étê établie, et a permis de constater que tous les inserts provenaient d'une même région du génome de Candida albicans. Pour le séquençage de cette rêgion on a utilisé les oligonucléotides suivants .
10 INT-Cand situé à la position . 720-740 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°4 3'-Cand situé à la position . 955-978 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°5 Cont-Int situé à la position . 719-741 de SEQ ID N°1 et nommê
SEQ ID N°6 Can-Korl situé à la position 1365-1389 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°7 et le séquenceur ABI 377 XL (Perkin Elmer). Le sêquençage de cette région a permis de mettre en êvidence les points suivants .
1) Les trois clones contiennent tous seulement un cadre de lecture ouvert, ininterrompu de 1236 pb avec la même séquence qui code pour une protéine.
2) Le cadre de lecture ouvert code pour une protêine ~de 412 AA qui montre une homologie importante avec lè facteur TFIIIA de Saccharomyces cerevisiae. L'anal~se de la protéine permet de retrouver les 9 motifs en doigt de zinc qui sont caractéristiques du facteur de transcription TFIIIA. La comparaison des séquences protéique de CATFIIIA et TFIIIA de 30 SC, permet de mettre en évidence une similarité de 50 % et une identité de 45 %. Pour la traduction en acides aminés il a été tenu compte du fait que dans Candida albicans le codon CTG est traduit en sérine et qu'il y a 2 codons CTG dans Candides albicans TFIIIA.
On peut noter .
- La conservation de la région riche en Sérine dans la partie N-terminale - la présence d'une très longue région intermédiaire entre les doigts de zinc 8 et 9 caractéristique de SC.
Les différences de séquence entre les protéines TFIIIA de SC
et TFIIIA de Candida albicans se situent dans la partie C-terminale en dehors des motifs en doigt de zinc.
5 Le plasmide YEp24 contenant la région promotrice et la sëquence codante pour CATFIIIA a été transformé dans la souche E. Coli XL1 Blue puis déposé sous le numéro I-2072 à
la CNCM, Institut Pasteur 25 rue de Docteur ROUX 75015 Paris, le 15 septembre 1998.
ZO Exemple 2 . expression du gène tfIIIA
Un fragment contenu dans le clone 9 a été amplifié par PCR en utilisant des amorces contenant les séquences reconnues par les enzymes de restriction EcoR2 et XhoI et s'hybridant au gène tfC2, les amorces sont les suivantes .
15 5-EcoTF.situé à la position 720-732 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°8 et 3'-XhoI situé à la position 1946-1960 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°9.
On procède donc à une amplification par PCR de l'ADN
20 gënomique de la façon suivante .
0,5 microgrammes d'ADN du clone 9 sont ajoutés à 50 microlitres d'une solution rëactionnelle contenant 200 nanogrammes/ml de chaque dNTP, les primers indiqués ci-dessus à raison de 25 micromoles/1 pour chacun, 2mM MgCl2, ~-x Pfu
Les plasmides YEp24 contenant des inserts de Candida albicans ont été récupërés à partir de ces colonies. La carte de restriction de chacun de ces plasmides a étê établie, et a permis de constater que tous les inserts provenaient d'une même région du génome de Candida albicans. Pour le séquençage de cette rêgion on a utilisé les oligonucléotides suivants .
10 INT-Cand situé à la position . 720-740 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°4 3'-Cand situé à la position . 955-978 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°5 Cont-Int situé à la position . 719-741 de SEQ ID N°1 et nommê
SEQ ID N°6 Can-Korl situé à la position 1365-1389 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°7 et le séquenceur ABI 377 XL (Perkin Elmer). Le sêquençage de cette région a permis de mettre en êvidence les points suivants .
1) Les trois clones contiennent tous seulement un cadre de lecture ouvert, ininterrompu de 1236 pb avec la même séquence qui code pour une protéine.
2) Le cadre de lecture ouvert code pour une protêine ~de 412 AA qui montre une homologie importante avec lè facteur TFIIIA de Saccharomyces cerevisiae. L'anal~se de la protéine permet de retrouver les 9 motifs en doigt de zinc qui sont caractéristiques du facteur de transcription TFIIIA. La comparaison des séquences protéique de CATFIIIA et TFIIIA de 30 SC, permet de mettre en évidence une similarité de 50 % et une identité de 45 %. Pour la traduction en acides aminés il a été tenu compte du fait que dans Candida albicans le codon CTG est traduit en sérine et qu'il y a 2 codons CTG dans Candides albicans TFIIIA.
On peut noter .
- La conservation de la région riche en Sérine dans la partie N-terminale - la présence d'une très longue région intermédiaire entre les doigts de zinc 8 et 9 caractéristique de SC.
Les différences de séquence entre les protéines TFIIIA de SC
et TFIIIA de Candida albicans se situent dans la partie C-terminale en dehors des motifs en doigt de zinc.
5 Le plasmide YEp24 contenant la région promotrice et la sëquence codante pour CATFIIIA a été transformé dans la souche E. Coli XL1 Blue puis déposé sous le numéro I-2072 à
la CNCM, Institut Pasteur 25 rue de Docteur ROUX 75015 Paris, le 15 septembre 1998.
ZO Exemple 2 . expression du gène tfIIIA
Un fragment contenu dans le clone 9 a été amplifié par PCR en utilisant des amorces contenant les séquences reconnues par les enzymes de restriction EcoR2 et XhoI et s'hybridant au gène tfC2, les amorces sont les suivantes .
15 5-EcoTF.situé à la position 720-732 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°8 et 3'-XhoI situé à la position 1946-1960 de SEQ ID N°1 et nommé
SEQ ID N°9.
On procède donc à une amplification par PCR de l'ADN
20 gënomique de la façon suivante .
0,5 microgrammes d'ADN du clone 9 sont ajoutés à 50 microlitres d'une solution rëactionnelle contenant 200 nanogrammes/ml de chaque dNTP, les primers indiqués ci-dessus à raison de 25 micromoles/1 pour chacun, 2mM MgCl2, ~-x Pfu
25 Buffer, 5U Pfu polymérase (Perkin Elmer).
Le milieu réactionnel est soumis à 30 cyclés PCR correspon-dant chacun à 94°C pendant 30 secondes, puis à 60°C pendant 45 secondes puis à 72°C pendant 1 minute.
Le fragment contenant la séquence codante de CATFIIIA a été
sous-cloné dans les vecteurs pYX122 (CEN, HIS 3) et pYX222 (2 micron, HIS3) (R et D System). Ce plasmide a étë utilisê pour transformer des cellules de Saccharomyces c. YwRI (Mat alpha, can 1-100, his 3-11, leu 2-3, 112 trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, tfC2 .. leu2 + pJA230), (Carnier et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. 92 9338-9342, 1995).
La souche transformée selon les mêmes méthodes que celles indiquées ci-dessus permet l'expression du facteur de transcription TFIIIA de Candida albicans contenant un tag HA.
Le milieu réactionnel est soumis à 30 cyclés PCR correspon-dant chacun à 94°C pendant 30 secondes, puis à 60°C pendant 45 secondes puis à 72°C pendant 1 minute.
Le fragment contenant la séquence codante de CATFIIIA a été
sous-cloné dans les vecteurs pYX122 (CEN, HIS 3) et pYX222 (2 micron, HIS3) (R et D System). Ce plasmide a étë utilisê pour transformer des cellules de Saccharomyces c. YwRI (Mat alpha, can 1-100, his 3-11, leu 2-3, 112 trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, tfC2 .. leu2 + pJA230), (Carnier et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. 92 9338-9342, 1995).
La souche transformée selon les mêmes méthodes que celles indiquées ci-dessus permet l'expression du facteur de transcription TFIIIA de Candida albicans contenant un tag HA.
26 Conclusion Les réalisations expérimentales indiquêes ci-dessus montrent donc les points suivants .
1) Le gène du facteur TFIIIA de Candida albicans a été isolé
dans trois clones 9, 18 et 47 obtenus comme indiqué ci-dessus à l'exemple 1 à partir de la banque de gènes de Candida albicans en utilisant une technique d'hybridation. La structure de ce gène a été identifiêe par séquençage.
2) La protéine CATFIIIA du gène CAtfIIIA obtenue à l'exemple 1 est constituée de 412 AA et montre une forte homologie avec le facteur TFIIIA de SC. Cette protéine contient une région riche en résidus SER dans la partie N-terminale et 9 doigts de zinc dont la disposition est identique à celle de la protéine TFIIIA de SC.
15 3) Le sous-clonage du gène du facteur TFIIIA de Candida albicans a été réalisé et le gène a été placé sous contrôle d'un promoteur de SC.
I
LISTAGE DE SEQUENCE
<110> Hoechst Marion Roussel <120> Gène tfIIIA de Candida albicans (CAtfIIIA) et la protéine codée CATFIIIA.
<130> BREVET 9824 <140>
<141>
<I60> 9 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 2060 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 1 ctttattagg aagattggct aggccatttt gtattacggg tctccaaagt gcaattgttt 60 tagtaaatat ccaatcattg ggcttcagtg tgaatggggg ttgtcaatct cttggtgtag 120 aaataggcgc aggcctccga atcccaaaaa aagaagaatc aggatgtctc ggctgcaaga 180 tttgtagcca tggcaaatgc cgaaaaatga aaaaaaaaaa aaagtctact gggcccacct 240 acaaaaggaa aagtgattga actagatcag tagtggtctg gaccctctat aattttataa 300 tattgtcacg ggctttagaa tttgtataat tgtgtgtctg acactctgtg gttaatatct 360 ggacatctcg ttccccttgt gaagggtcgt ctgtaatgaa ttcatgatca agaataatat 420 gactttgctc acttcataga gtgccgactt gattattatt gagctttatc ctctgtaata 480 tatcgtaacc acttgactta tttccttgtt gtgggattca ctttggatga tgatgttaac 540 caaatgtaat tggtacaatc ctttttgtcc ttgtcgcgac ttcctttaat atcgcgactt 600 atttcattaa tgagacgcaa cgcattcctc tctccataga aaaaaaaaat aacaaactga 660 aaaaataaac agcggacctc atctcttttt ttcaaatcca ctttttatta ctttattcaa 720 tgagtgaaag tgacgaaacc aaatcgatat catctttaat atcttcttct tcttcatcac 780 gtcccaaaaa gtatatttgc acatatgaag ggtgtgataa agcctataat cgaccatcat 840 tattagagca acatttaaga acccacagta atgatcgacc gtataaatgt acagtggacg 900 attgtgataa agcatttttc agaaaatcac atttggaaac acatattgta tcacattccg 960 aaaaaaaacc attccattgt tcagtgtgtg gtaaaggggt taattctcga caacacttga 1020 aaagacatga aatcacccat acaaagtcat ttaaatgtac atttgaaaat tgtcaagaag 1080' cattttataa acatcaatct ttaagacatc atatattatc tgttcatgaa aaaacattaa 1140 cgtgtaaaca atgtaataaa gttttcactc gaccttcaaa attagcacaa cataaattaa 1200 aacatcatgg tggatctcct gcttatcaat gtgatcatcc tggttgtttt aaaaatttcc 1260 aaacttggtc agtattacaa tttcatataa aacaactgca tccaaaactt aaatgtccta 1320 aatgtggtaa aggttgtgtt gggaaaaaag gtttatcttc acatatgtta âgtcatgatg 1380 attctaccat gatcaaaata tggacttgtg attattgtga tgtggggaaa tttgcaaaga 1440 aaaatgaatt agttgaacat tataatatct tccatgatgg taatatccct gatgatttat 1500 taaaggaaac tgaagtgaaa aaattagaga acctattaga tcaaggatcg aaattaaata 1560 atttgcatga attagaaaca gagaaattaa aagtggaaga agatgaagaa gatgaagaag 1620 atagtctaga tgaaaaaaga agtgatgtta gatcagactc aatgtcagct caaagatcaa 1680 taaaatcatt tactgcttct ttggaaggtt caaagagtgt ttctaaactt attctgaata 1740 gtgggaagaa gatcaattgt cctaagaata attgtgatag aatgttttct agagaatatg 1800 atttacgtcg acatttgaaa tggcatgatg ataatttaca aagaattgag tcattcttaa 1860 atagtataga aaaagaagaa actccagaag gtgaaccatt ggttaaaaaa gccaggatgg 1920 atttattgcc aaatgaaaca tcagtgattt ctcgataata tacatttaaa attatattaa 1980 catttttatt tcctttaatt tttatttttt gtgggctttt tattttacat tatttaactt 2040 gacatattac tctcttaatg 2060 <210> 2 <211> 1239 <212> ADN
<213> Candida albicans <220>
<221> CDS
<222> (1}..(1236) <400>
atgagtgaa agtgacgaa accaaatcg atatcatcttta atatcttct 48 MetSerGlu SerAspGlu ThrLysSer IleSerSerLeu IleSerSer tcttcttca tcacgtccc aaaaagtat atttgcacatat gaagggtgt 96 SerSerSer SerArgPro LysLysTyr IleCysThrTyr GluGlyCys gataaagcc tataatcga ccatcatta ttagagcaacat ttaagaacc 144 AspLysAla TyrAsnArg ProSerLeu LeuGluGlnHis LeuArgThr cacagtaat gatcgaccg tataaatgt acagtggacgat tgtgataaa 192 HisSerAsn AspArgPro TyrLysCys ThrValAspAsp CysAspLys gcatttttc agaaaatca catttggaa acacatattgta tcacattcc 240 AlaPhePhe ArgLysSer HisLeuGlu ThrHisIleVal SerHisSer gaaaaaaaa ccattccat tgttcagtg tgtggtaaaggg gttaattct 288 GluLysLys ProPheHis CysSerVal CysGlyLysGly ValAsnSer 3 ' cgacaa cacttgaaa agacatgaaatc acccatacaaag tcatttaaa 336 ArgGln HisLeuLys ArgHisGluIle ThrHisThrLys SerPheLys tgtaca tttgaaaat tgtcaagaagca ttttataaacat caatcttta 384 CysThr PheGluAsn CysGlnGluAla PheTyrLysHis GlnSerLeu agacat catatatta tctgttcatgaa aaaacattaacg tgtaaacaa 432 ArgHis HisIleLeu SerValHisGlu Lys_ThrLeuThr CysLysGln tgtaat aaagttttc actcgaccttca aaattagcacaa cataaatta 480 CysAsn LysValPhe ThrArgProSer LysLeuAlaGln Hs LysLeu aaacat catggtgga tctcctgcttat caatgtgatcat cctggttgt 528 LysHis HisGlyGly SerProAlaTyr GlnCysAspHis ProGlyCys tttaaa aatttccaa acttggtcagta ttacaatttcat ataaaacaa 576 PheLys AsnPheGln ThrTrpSerVal LeuGlnPheHis IleLysGln ctgcat ccaaaactt aaatgtcctaaa tgtggtaaaggt tgtgttggg 624 SerHis ProLysLeu LysCysProLys CysGlyLysGly CysValGly aaaaaa ggtttatct tcacatatgtta agtcatgatgat tctaccatg 672 LysLys GlyLeuSer SerHisMetLeu SerHisAspAsp SerThrMet atcaaa atatggact tgtgattattgt gatgtggggaaa tttgcaaag 720 IleLys IleTrpThr CysAspTyrCys AspValGlyLys PheAlaLys aaaaat gaattagtt gaacattataat atcttccatgat ggtaatatc 768 LysAsn GluLeuVal GluHisTyrAsn IlePheHisAsp GlyAsnIle cctgat gatttatta aaggaaactgaa gtgaaaaaatta gagaaccta 816 ProAsp AspLeuLeu LysGluThrGlu ValLysLysLeu GluAsnLeu ttagat caaggatcg aaattaaataat ttgcatgaatta gaaacagag 864 LeuAsp GlnGlySer LysLeuAsnAsn LeuHisGluLeu GluThrGlu aaatta aaagtggaa gaagatgaagaa gatgaagaagat agtctagat 912 LysLeu LysValGlu GluAspGluGlu AspGluGluAsp SerLeuAsp gaaaaa agaagtgat gttagatcagac tcaatgtcagct caaagatca 960 GluLys ArgSerAsp ValArgSerAsp SerMetSerAla GlnArgSer ataaaa tcatttact gcttctttggaa ggttcaaagagt gtttctaaa 1008 IleLys SerPheThr AlaSerLeuGlu GlySerLysSer ValSerLys ~
cttatt ctgaatagt gggaagaagatc aattgtcctaag aataattgt 1056 LeuIle SerAsnSer GlyLysLysIle AsnCysProLys AsnAsnCys 4 ' gat aga atg ttt tct aga gaa tat gat tta cgt cga cat ttg aaa tgg 1104 Asp Arg Met Phe Ser Arg Glu Tyr Asp Leu Arg Arg His Leu Lys Trp cat gat gat aat tta caa aga att gag tca ttc tta aat agt ata gaa 1152 His Asp Asp Asn Leu Gln Arg Ile Glu Ser Phe Leu Asn Ser IIe Glu aaa gaa gaa act cca gaa ggt gaa cca ttg gtt aaa aaa gcc agg atg 1200 Lys Glu Glu Thr Pro Glu Gly Glu Pro Leu Val Lys Lys Ala Arg Met gat tta ttg cca aat gaa aca tca gtg att tct cga taa 1239 Asp Leu Leu Pro Asn Glu Thr Ser Val Ile Ser Arg <210> 3 <211> 412 <212> PRT
<213> Candida albicans <400> 3 Met Ser Glu Ser Asp Glu Thr Lys Ser Ile Ser Ser Leu Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Pro Lys Lys Tyr Ile Cys Thr Tyr Glu Gly Cys Asp Lys Ala Tyr Asn Arg Pro Ser Leu Leu Glu Gln His Leu Arg Thr His Ser Asn Asp Arg Pro Tyr Lys Cys Thr Val Asp Asp Cys Asp Lys Ala Phe Phe Arg Lys Ser His Leu Glu Thr His Ile Val Ser His Ser Glu Lys Lys Pro Phe His Cys Ser Val Cys Gly Lys Gly Val Asn Ser Arg GIn His Leu Lys Arg His Glu Ile Thr His Thr Lys Ser Phe Lys Cys Thr Phe Glu Asn Cys Gln GIu Ala Phe Tyr Lys His Gln Ser Leu Arg His His Ile Leu Ser Val His Glu Lys Thr Leu Thr Cys Lys Gln Cys Asn Lys Val Phe Thr Arg Pro Ser Lys Leu Ala GIn His Lys Leu Lys His His Gly Gly Ser Pro Ala Tyr Gln Cys Asp His Pro Gly Cys Phe Lys Asn Phe Gln Thr Trp Ser Val Leu Gln Phe His Ile Lys Gln Ser His Pro Lys Leu Lys Cys Pro Lys Cys Gly Lys Gly Cys Val Gly Lys Lys Gly Leu Ser Ser His Met Leu Ser His Asp Asp Ser Thr Met Ile Lys Ile Trp Thr Cys Asp Tyr Cys Asp Val Gly Lys Phe Ala Lys Lys Asn Glu Leu Val Glu His Tyr Asn Ile Phe His Asp Gly Asn Ile Pro Asp Asp Leu Leu Lys Glu Thr Glu Val Lys Lys Leu Glu Asn Leu Leu Asp Gln Gly Ser Lys Leu Asn Asn Leu His Glu Leu Glu Thr Glu Lys Leu Lys Val Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp Ser Leu Asp Glu Lys Arg Ser Asp Val Arg Ser Asp Ser Met Ser Ala Gln Arg Ser Ile Lys Ser Phe Thr Ala Ser Leu Glu Gly Ser Lys Ser Val Ser Lys Leu Ile Ser Asn Ser Gly Lys Lys Ile Asn Cys Pro Lys Asn Asn Cys Asp Arg Met Phe Ser Arg Glu Tyr Asp Leu Arg Arg His Leu Lys Trp His Asp Asp Asn Leu Gln Arg Ile Glu Ser Phe Leu Asn Ser Ile Glu Lys Glu Glu Thr Pro Glu Gly Glu Pro Leu Val Lys Lys Ala Arg Met Asp Leu Leu Pro Asn Glu Thr Ser Val Ile Ser Arg <210> 4 <211> 21 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 4 atgagtgaaa gtgacgaaac c 21 <210> 5 <211> 24 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> S
attggaatgg ttttttttcg gaat 24 <210> 6 <211> 23 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 6 tggtttcgtc actttcactc att 23 <210> 7 <211> 25 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 7 atgttaagtc atgatgattc tacca 25 <210> 8 <211> 27 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 8 ccttagaatt caccatgagt gaaagtg 27 <210> 9 <211> 27 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 9 gctgagctcg agtattatcg agaaatc 27
1) Le gène du facteur TFIIIA de Candida albicans a été isolé
dans trois clones 9, 18 et 47 obtenus comme indiqué ci-dessus à l'exemple 1 à partir de la banque de gènes de Candida albicans en utilisant une technique d'hybridation. La structure de ce gène a été identifiêe par séquençage.
2) La protéine CATFIIIA du gène CAtfIIIA obtenue à l'exemple 1 est constituée de 412 AA et montre une forte homologie avec le facteur TFIIIA de SC. Cette protéine contient une région riche en résidus SER dans la partie N-terminale et 9 doigts de zinc dont la disposition est identique à celle de la protéine TFIIIA de SC.
15 3) Le sous-clonage du gène du facteur TFIIIA de Candida albicans a été réalisé et le gène a été placé sous contrôle d'un promoteur de SC.
I
LISTAGE DE SEQUENCE
<110> Hoechst Marion Roussel <120> Gène tfIIIA de Candida albicans (CAtfIIIA) et la protéine codée CATFIIIA.
<130> BREVET 9824 <140>
<141>
<I60> 9 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 2060 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 1 ctttattagg aagattggct aggccatttt gtattacggg tctccaaagt gcaattgttt 60 tagtaaatat ccaatcattg ggcttcagtg tgaatggggg ttgtcaatct cttggtgtag 120 aaataggcgc aggcctccga atcccaaaaa aagaagaatc aggatgtctc ggctgcaaga 180 tttgtagcca tggcaaatgc cgaaaaatga aaaaaaaaaa aaagtctact gggcccacct 240 acaaaaggaa aagtgattga actagatcag tagtggtctg gaccctctat aattttataa 300 tattgtcacg ggctttagaa tttgtataat tgtgtgtctg acactctgtg gttaatatct 360 ggacatctcg ttccccttgt gaagggtcgt ctgtaatgaa ttcatgatca agaataatat 420 gactttgctc acttcataga gtgccgactt gattattatt gagctttatc ctctgtaata 480 tatcgtaacc acttgactta tttccttgtt gtgggattca ctttggatga tgatgttaac 540 caaatgtaat tggtacaatc ctttttgtcc ttgtcgcgac ttcctttaat atcgcgactt 600 atttcattaa tgagacgcaa cgcattcctc tctccataga aaaaaaaaat aacaaactga 660 aaaaataaac agcggacctc atctcttttt ttcaaatcca ctttttatta ctttattcaa 720 tgagtgaaag tgacgaaacc aaatcgatat catctttaat atcttcttct tcttcatcac 780 gtcccaaaaa gtatatttgc acatatgaag ggtgtgataa agcctataat cgaccatcat 840 tattagagca acatttaaga acccacagta atgatcgacc gtataaatgt acagtggacg 900 attgtgataa agcatttttc agaaaatcac atttggaaac acatattgta tcacattccg 960 aaaaaaaacc attccattgt tcagtgtgtg gtaaaggggt taattctcga caacacttga 1020 aaagacatga aatcacccat acaaagtcat ttaaatgtac atttgaaaat tgtcaagaag 1080' cattttataa acatcaatct ttaagacatc atatattatc tgttcatgaa aaaacattaa 1140 cgtgtaaaca atgtaataaa gttttcactc gaccttcaaa attagcacaa cataaattaa 1200 aacatcatgg tggatctcct gcttatcaat gtgatcatcc tggttgtttt aaaaatttcc 1260 aaacttggtc agtattacaa tttcatataa aacaactgca tccaaaactt aaatgtccta 1320 aatgtggtaa aggttgtgtt gggaaaaaag gtttatcttc acatatgtta âgtcatgatg 1380 attctaccat gatcaaaata tggacttgtg attattgtga tgtggggaaa tttgcaaaga 1440 aaaatgaatt agttgaacat tataatatct tccatgatgg taatatccct gatgatttat 1500 taaaggaaac tgaagtgaaa aaattagaga acctattaga tcaaggatcg aaattaaata 1560 atttgcatga attagaaaca gagaaattaa aagtggaaga agatgaagaa gatgaagaag 1620 atagtctaga tgaaaaaaga agtgatgtta gatcagactc aatgtcagct caaagatcaa 1680 taaaatcatt tactgcttct ttggaaggtt caaagagtgt ttctaaactt attctgaata 1740 gtgggaagaa gatcaattgt cctaagaata attgtgatag aatgttttct agagaatatg 1800 atttacgtcg acatttgaaa tggcatgatg ataatttaca aagaattgag tcattcttaa 1860 atagtataga aaaagaagaa actccagaag gtgaaccatt ggttaaaaaa gccaggatgg 1920 atttattgcc aaatgaaaca tcagtgattt ctcgataata tacatttaaa attatattaa 1980 catttttatt tcctttaatt tttatttttt gtgggctttt tattttacat tatttaactt 2040 gacatattac tctcttaatg 2060 <210> 2 <211> 1239 <212> ADN
<213> Candida albicans <220>
<221> CDS
<222> (1}..(1236) <400>
atgagtgaa agtgacgaa accaaatcg atatcatcttta atatcttct 48 MetSerGlu SerAspGlu ThrLysSer IleSerSerLeu IleSerSer tcttcttca tcacgtccc aaaaagtat atttgcacatat gaagggtgt 96 SerSerSer SerArgPro LysLysTyr IleCysThrTyr GluGlyCys gataaagcc tataatcga ccatcatta ttagagcaacat ttaagaacc 144 AspLysAla TyrAsnArg ProSerLeu LeuGluGlnHis LeuArgThr cacagtaat gatcgaccg tataaatgt acagtggacgat tgtgataaa 192 HisSerAsn AspArgPro TyrLysCys ThrValAspAsp CysAspLys gcatttttc agaaaatca catttggaa acacatattgta tcacattcc 240 AlaPhePhe ArgLysSer HisLeuGlu ThrHisIleVal SerHisSer gaaaaaaaa ccattccat tgttcagtg tgtggtaaaggg gttaattct 288 GluLysLys ProPheHis CysSerVal CysGlyLysGly ValAsnSer 3 ' cgacaa cacttgaaa agacatgaaatc acccatacaaag tcatttaaa 336 ArgGln HisLeuLys ArgHisGluIle ThrHisThrLys SerPheLys tgtaca tttgaaaat tgtcaagaagca ttttataaacat caatcttta 384 CysThr PheGluAsn CysGlnGluAla PheTyrLysHis GlnSerLeu agacat catatatta tctgttcatgaa aaaacattaacg tgtaaacaa 432 ArgHis HisIleLeu SerValHisGlu Lys_ThrLeuThr CysLysGln tgtaat aaagttttc actcgaccttca aaattagcacaa cataaatta 480 CysAsn LysValPhe ThrArgProSer LysLeuAlaGln Hs LysLeu aaacat catggtgga tctcctgcttat caatgtgatcat cctggttgt 528 LysHis HisGlyGly SerProAlaTyr GlnCysAspHis ProGlyCys tttaaa aatttccaa acttggtcagta ttacaatttcat ataaaacaa 576 PheLys AsnPheGln ThrTrpSerVal LeuGlnPheHis IleLysGln ctgcat ccaaaactt aaatgtcctaaa tgtggtaaaggt tgtgttggg 624 SerHis ProLysLeu LysCysProLys CysGlyLysGly CysValGly aaaaaa ggtttatct tcacatatgtta agtcatgatgat tctaccatg 672 LysLys GlyLeuSer SerHisMetLeu SerHisAspAsp SerThrMet atcaaa atatggact tgtgattattgt gatgtggggaaa tttgcaaag 720 IleLys IleTrpThr CysAspTyrCys AspValGlyLys PheAlaLys aaaaat gaattagtt gaacattataat atcttccatgat ggtaatatc 768 LysAsn GluLeuVal GluHisTyrAsn IlePheHisAsp GlyAsnIle cctgat gatttatta aaggaaactgaa gtgaaaaaatta gagaaccta 816 ProAsp AspLeuLeu LysGluThrGlu ValLysLysLeu GluAsnLeu ttagat caaggatcg aaattaaataat ttgcatgaatta gaaacagag 864 LeuAsp GlnGlySer LysLeuAsnAsn LeuHisGluLeu GluThrGlu aaatta aaagtggaa gaagatgaagaa gatgaagaagat agtctagat 912 LysLeu LysValGlu GluAspGluGlu AspGluGluAsp SerLeuAsp gaaaaa agaagtgat gttagatcagac tcaatgtcagct caaagatca 960 GluLys ArgSerAsp ValArgSerAsp SerMetSerAla GlnArgSer ataaaa tcatttact gcttctttggaa ggttcaaagagt gtttctaaa 1008 IleLys SerPheThr AlaSerLeuGlu GlySerLysSer ValSerLys ~
cttatt ctgaatagt gggaagaagatc aattgtcctaag aataattgt 1056 LeuIle SerAsnSer GlyLysLysIle AsnCysProLys AsnAsnCys 4 ' gat aga atg ttt tct aga gaa tat gat tta cgt cga cat ttg aaa tgg 1104 Asp Arg Met Phe Ser Arg Glu Tyr Asp Leu Arg Arg His Leu Lys Trp cat gat gat aat tta caa aga att gag tca ttc tta aat agt ata gaa 1152 His Asp Asp Asn Leu Gln Arg Ile Glu Ser Phe Leu Asn Ser IIe Glu aaa gaa gaa act cca gaa ggt gaa cca ttg gtt aaa aaa gcc agg atg 1200 Lys Glu Glu Thr Pro Glu Gly Glu Pro Leu Val Lys Lys Ala Arg Met gat tta ttg cca aat gaa aca tca gtg att tct cga taa 1239 Asp Leu Leu Pro Asn Glu Thr Ser Val Ile Ser Arg <210> 3 <211> 412 <212> PRT
<213> Candida albicans <400> 3 Met Ser Glu Ser Asp Glu Thr Lys Ser Ile Ser Ser Leu Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Pro Lys Lys Tyr Ile Cys Thr Tyr Glu Gly Cys Asp Lys Ala Tyr Asn Arg Pro Ser Leu Leu Glu Gln His Leu Arg Thr His Ser Asn Asp Arg Pro Tyr Lys Cys Thr Val Asp Asp Cys Asp Lys Ala Phe Phe Arg Lys Ser His Leu Glu Thr His Ile Val Ser His Ser Glu Lys Lys Pro Phe His Cys Ser Val Cys Gly Lys Gly Val Asn Ser Arg GIn His Leu Lys Arg His Glu Ile Thr His Thr Lys Ser Phe Lys Cys Thr Phe Glu Asn Cys Gln GIu Ala Phe Tyr Lys His Gln Ser Leu Arg His His Ile Leu Ser Val His Glu Lys Thr Leu Thr Cys Lys Gln Cys Asn Lys Val Phe Thr Arg Pro Ser Lys Leu Ala GIn His Lys Leu Lys His His Gly Gly Ser Pro Ala Tyr Gln Cys Asp His Pro Gly Cys Phe Lys Asn Phe Gln Thr Trp Ser Val Leu Gln Phe His Ile Lys Gln Ser His Pro Lys Leu Lys Cys Pro Lys Cys Gly Lys Gly Cys Val Gly Lys Lys Gly Leu Ser Ser His Met Leu Ser His Asp Asp Ser Thr Met Ile Lys Ile Trp Thr Cys Asp Tyr Cys Asp Val Gly Lys Phe Ala Lys Lys Asn Glu Leu Val Glu His Tyr Asn Ile Phe His Asp Gly Asn Ile Pro Asp Asp Leu Leu Lys Glu Thr Glu Val Lys Lys Leu Glu Asn Leu Leu Asp Gln Gly Ser Lys Leu Asn Asn Leu His Glu Leu Glu Thr Glu Lys Leu Lys Val Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp Ser Leu Asp Glu Lys Arg Ser Asp Val Arg Ser Asp Ser Met Ser Ala Gln Arg Ser Ile Lys Ser Phe Thr Ala Ser Leu Glu Gly Ser Lys Ser Val Ser Lys Leu Ile Ser Asn Ser Gly Lys Lys Ile Asn Cys Pro Lys Asn Asn Cys Asp Arg Met Phe Ser Arg Glu Tyr Asp Leu Arg Arg His Leu Lys Trp His Asp Asp Asn Leu Gln Arg Ile Glu Ser Phe Leu Asn Ser Ile Glu Lys Glu Glu Thr Pro Glu Gly Glu Pro Leu Val Lys Lys Ala Arg Met Asp Leu Leu Pro Asn Glu Thr Ser Val Ile Ser Arg <210> 4 <211> 21 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 4 atgagtgaaa gtgacgaaac c 21 <210> 5 <211> 24 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> S
attggaatgg ttttttttcg gaat 24 <210> 6 <211> 23 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 6 tggtttcgtc actttcactc att 23 <210> 7 <211> 25 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 7 atgttaagtc atgatgattc tacca 25 <210> 8 <211> 27 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 8 ccttagaatt caccatgagt gaaagtg 27 <210> 9 <211> 27 <212> ADN
<213> Candida albicans <400> 9 gctgagctcg agtattatcg agaaatc 27
Claims (5)
1) Polynucléotide isolé contenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe suivant:
a) un polynucléotide ayant au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % d'identité avec un polynucléotide codant pour un polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription et ayant une séquence en acides aminés homologue de la séquence SEQ ID N°3.
b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a).
c) un polynucléotide comprenant au moins 15 bases consécutives du polynucléotide défini en a) et b).
a) un polynucléotide ayant au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % d'identité avec un polynucléotide codant pour un polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription et ayant une séquence en acides aminés homologue de la séquence SEQ ID N°3.
b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a).
c) un polynucléotide comprenant au moins 15 bases consécutives du polynucléotide défini en a) et b).
2) Polynucléotide selon la revendication 1 tel que ce polynucléotide est un ADN.
3) Polynucléotide selon la revendication 1 tel que ce polynucléotide est un ARN.
4) Polynucléotide tel que défini à la revendication 2 comprenant la séquence de nucléotides SEQ ID N°1 5) Séquence d'ADN telle que définie aux revendications 1, 2 et 4 caractérisée en ce que cette séquence d'ADN est celle du gène CAtfIIIA codant pour une protéine ayant la fonction biologique du facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA et contenant la séquence de nucléotides SEQ ID N°1 6) Séquence d'ADN selon la revendication 5 ayant la séquence commençant au nucléotide 720 et se terminant au nucléotide 1955 de SEQ ID N°1.
7) Séquence d'ADN du gène CAtfIIIA selon la revendication 5 ou 6 codant pour la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 (412 AA).
8) Séquence d'ADN codant pour le facteur de transcription CATFIIIA selon les revendications 5 à 7 ainsi que les séquences d'ADN qui hybrident avec celle-ci et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
9) Séquence d'ADN selon les revendications 5 à 8 comprenant des modifications introduites par suppression, insertion et/ou substitution d'au moins un nucléotide codant pour une protéine ayant la même activité biologique que le facteur de transcription CATFIIIA.
10) Séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 9 ainsi que les sëquences d'ADN qui ont une homologie de séquence nucléotidique d'au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec ladite séquence d'ADN.
12) Séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 10 ainsi que les séquences d'ADN qui codent pour une protëine de fonction similaire dont la séquence en AA a une homologie d'au moins 40 % et notamment de 45 % ou d'au moins 50 %, plutôt au moins 60 % et de préfêrence au moins 70 % avec la séquence en AA codée par ladite séquence d'ADN.
12) Polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription CATFIIIA et ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 codée par la séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 11 et les analogues de ce polypeptide.
13) Procédé de préparation de la protéine recombinante CATFIIIA ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 comprenant l'expression de la séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 11 dans un hôte approprié puis l'isolement et la purification de ladite protëine recombinante.
14) Vecteur d'expression contenant la séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 11.
15) Cellule hôte transformée avec un vecteur selon la revendication 14.
16) Procédé tel que défini à la revendication 13 dans lequel la cellule hôte est E. coli DH5 alpha ou E.coli XL1-Blue.
17) Procédé tel que défini à la revendication 13 dans laquelle la cellule hôte est Saccharomyces cerevisae.
18) Plasmide déposé à la CNCM sous le numêro I-2072.
19) Procédë de criblage de produits antifongiques caractérisê
en ce qu'il comprend une étape où l'on mesure l'activité de facteur de transcription de CATFIIIA tel que défini à la revendication 12 en présence de chacun des produits dont on souhaite dêterminer les propriétés antifongiques et l'on sélectionne les produits ayant un effet inhibiteur sur cette activité.
20) Utilisation d'un produit sélectionné par le procédé selon la revendication 19 pour l'obtention d'un agent antifongique.
21) Utilisation du gène du facteur de transcription CAtfIIIA
de Candida albicans ou du facteur de transcription codé par ce gène selon l'une des revendications 5 à 12 pour la sélection d'un produit ayant des propriétés antifongiques selon la revendication 19 comme inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans.
22) Compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans tel que défini à la revendication 21.
23) Utilisation des compositions telles que définies à la revendication 22 comme agents antifongiques.
24) Méthode d'induction d'une réponse immunologique chez un mammifère comprenant l'inoculation à ce mammifère du polypeptide tel que défini à la revendication 12 ou un fragment de ce polypeptide ayant la même fonction de façon à
produire un anticorps permettant de protéger l'animal contre la maladie.
25) Anticorps dirigé contre le polypeptide tel que défini à
la revendication 12 ou un fragment de ce polypeptide ayant la même fonction.
26) Utilisation du gêne CAtfIIIA ou du facteur de transcription codé par ce gène selon l'une des revendications 5 à 12 pour la préparation de compositions utiles pour le diagnostic ou le traitement de maladies causées par la levure pathogène Candida albicans.
27) Kit pour le diagnostic d'infections fongiques comprenant une séquence d'ADN tel que défini à l'une des revendications
7) Séquence d'ADN du gène CAtfIIIA selon la revendication 5 ou 6 codant pour la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 (412 AA).
8) Séquence d'ADN codant pour le facteur de transcription CATFIIIA selon les revendications 5 à 7 ainsi que les séquences d'ADN qui hybrident avec celle-ci et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
9) Séquence d'ADN selon les revendications 5 à 8 comprenant des modifications introduites par suppression, insertion et/ou substitution d'au moins un nucléotide codant pour une protéine ayant la même activité biologique que le facteur de transcription CATFIIIA.
10) Séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 9 ainsi que les sëquences d'ADN qui ont une homologie de séquence nucléotidique d'au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec ladite séquence d'ADN.
12) Séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 10 ainsi que les séquences d'ADN qui codent pour une protëine de fonction similaire dont la séquence en AA a une homologie d'au moins 40 % et notamment de 45 % ou d'au moins 50 %, plutôt au moins 60 % et de préfêrence au moins 70 % avec la séquence en AA codée par ladite séquence d'ADN.
12) Polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription CATFIIIA et ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 codée par la séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 11 et les analogues de ce polypeptide.
13) Procédé de préparation de la protéine recombinante CATFIIIA ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 comprenant l'expression de la séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 11 dans un hôte approprié puis l'isolement et la purification de ladite protëine recombinante.
14) Vecteur d'expression contenant la séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 11.
15) Cellule hôte transformée avec un vecteur selon la revendication 14.
16) Procédé tel que défini à la revendication 13 dans lequel la cellule hôte est E. coli DH5 alpha ou E.coli XL1-Blue.
17) Procédé tel que défini à la revendication 13 dans laquelle la cellule hôte est Saccharomyces cerevisae.
18) Plasmide déposé à la CNCM sous le numêro I-2072.
19) Procédë de criblage de produits antifongiques caractérisê
en ce qu'il comprend une étape où l'on mesure l'activité de facteur de transcription de CATFIIIA tel que défini à la revendication 12 en présence de chacun des produits dont on souhaite dêterminer les propriétés antifongiques et l'on sélectionne les produits ayant un effet inhibiteur sur cette activité.
20) Utilisation d'un produit sélectionné par le procédé selon la revendication 19 pour l'obtention d'un agent antifongique.
21) Utilisation du gène du facteur de transcription CAtfIIIA
de Candida albicans ou du facteur de transcription codé par ce gène selon l'une des revendications 5 à 12 pour la sélection d'un produit ayant des propriétés antifongiques selon la revendication 19 comme inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans.
22) Compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans tel que défini à la revendication 21.
23) Utilisation des compositions telles que définies à la revendication 22 comme agents antifongiques.
24) Méthode d'induction d'une réponse immunologique chez un mammifère comprenant l'inoculation à ce mammifère du polypeptide tel que défini à la revendication 12 ou un fragment de ce polypeptide ayant la même fonction de façon à
produire un anticorps permettant de protéger l'animal contre la maladie.
25) Anticorps dirigé contre le polypeptide tel que défini à
la revendication 12 ou un fragment de ce polypeptide ayant la même fonction.
26) Utilisation du gêne CAtfIIIA ou du facteur de transcription codé par ce gène selon l'une des revendications 5 à 12 pour la préparation de compositions utiles pour le diagnostic ou le traitement de maladies causées par la levure pathogène Candida albicans.
27) Kit pour le diagnostic d'infections fongiques comprenant une séquence d'ADN tel que défini à l'une des revendications
5 à 11 ou une séquence ayant une fonction similaire ou un fragment fonctionnel de cette séquence, le polypeptide codé
par cette séquence ou un fragment polypeptidique ayant la même fonction ou un anticorps dirigé contre un tel polypeptide codé par cette séquence d'ADN ou contre un fragment de ce polypeptide.
par cette séquence ou un fragment polypeptidique ayant la même fonction ou un anticorps dirigé contre un tel polypeptide codé par cette séquence d'ADN ou contre un fragment de ce polypeptide.
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JP2000228992A (ja) | 抗真菌物質のスクリーニング方法 |
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