CZ200249A3 - Antimykotika a fungicidy, způsob jejich přípravy a jejich pouľití - Google Patents

Description

Antimykotika a fungicidy, způsob jejich přípravy a jejich použití

Oblast techniky

Tento vynález se týká antimykotik a fungicidů, které je možno získat z kvasinek, způsobu jejich přípravy a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Selektivní antimykotika mají velký význam, poněvadž infekce způsobované houbami nebo kvasinkami u člověka se v posledních letech velmi rozšířily a ve stále větší míře dochází i k nežádoucí kontaminaci potravin a krmiv. Obzvláště závažné následky mají mykózy u imunosuprimovaných pacientů, jejichž buněčný a humorální obranný systém musí být udržován na ne zcela funkční úrovni [Anaissie, 1992; Meunier a spol., 1992; Vingard, 1995]. Obzvláště jsou mykózami ohroženy HIV-1-infikované osoby (AIDS), které v pokročilém stadiu choroby umírají velmi často na oportunistické infekce vyvolané humánně-patogenními plísněmi a/nebo kvasinkami

Λ [Levý, 1993]. Antimykotika, která se používají pro terapii těchto infekcí v současné době (jako jsou Amphotericin B, Fluconazol, Itraconazol, Ketoconazol), mají značné vedlejší ' účinky, poněvadž rozrušují strukturní integritu eukaryotické membrány cytoplasmy a tím poškozují i infikovaný hostitelský organismus [Hector, 1993]. Aplikace běžných antimykotik vede kromě toho již za krátký čas k rychlému nárůstu fluconazolové resístence, která se v humánně-patogenních mikroorganis• «· ♦ · · · « · · ··· • · · » · » ' »· • ······* 9 9 99 · 9 ··· · · · · · » mech rychle rozšiřuje a představuje tak stále větší problém [Cameron a spol., 1993; Chavenet a spol., 1994; Maenza a spol., 1996; Pfaller a spol., 1994; Rex a spol., 1995; Troillet a spol., 1993]. Je proto důležité vyvinout taková antimykotika, která se budou vyznačovat - podobně jako bakteriální antibiotika - vysokou selektivitou a tím, že budou napadat pokud možno pouze houby a kvasinky patogenní pro člověka. Poněvadž však většina buněčných procesů je u vyšších organismů řízena genovými produkty které

Λ u eukaryotů vykazují vysokou míru funkční homologie, nepodařilo se dosud vyvinout specifická antifungální antibiotika [Kurz, 1998; Komiyama a spol., 1998].

Cílovou oblastí selektivních antimykotik jsou β-l,3-glukany buněčné stěny kvasinek, které jsou nezbytné pro mechanickou a osmotickou stabilitu buňky, které se však u vyšších eukaryontů nevyskytují, takže by bylo možno je použít jako Achillovu patu (pozn. překl.: v orig. je Achillesverse, má být asi Achillesf erse) při likvidaci patogenních kvasinek [Roemer a spol., 1994], Přes to, že látky, které selektivně napadají strukturu buněčných stěn kvasinek a hub, jsou předmětem velkého zájmu, nebyly dosud žádné látky podobné antibiotikům pro léčbu mykos použity. Zatímco producenti bakteriálních antibiotik byli objeveni již počátkem tohoto století, podobné efekty u kvasinek byly pozorovány až teprve počátkem šedesátých let, kdy byly identifikovány a pozorovány tzv. killer-kvasinky [Bevan and Makower, 1963]. Toxiny produkující killer-kmeny ‘ pekařského droždí Saccharomyces cerevisiae produkují a vylučují proteiny označené jako killertoxiny, které usmrcují senzitivní kvasinky při procesu závislém na receptoru (Rezeptor-abhángigen Prozess) [Bussey, 1991; Tipper a Schmitt, 1991]. Schopnost produkovat toxin spočívá • · • · · · · · w ··«« ···· · · · · * « « ····*·· · · - · « , u S.cerevisiae na infekci viry s dvouvláknovou RNA, které se podobají reoviru (Reovirus-áhnliche Dopplestrang-RNA-Viren), které jsou v cytoplasmě kvasinek stabilní a ve velkém počtu kopiíí zde přetrvávají, aniž by eukaryotickou hostitelskou buňku znatelným způsobem poškodily [Tipper a Schmitt, 1991]. U třech dosud známých killer-toxinů (ΚΙ, K2, K28) z kvasinek S.cerevisiae jde o neglykosylované α/β heterodimery, které jsou přenášeny z infikované buňky jako vysokomolekulární preprotoxiny a přeměněny na intracelulární sekreční cestě komplexními modifikacemi na biologicky aktivní killer-proteiny [Hanes a spol., 1986; Dignard a spol., 1991; Schmitt a Tipper, 1995]. Toxické působení toxinu ze S.cerevisiae spočívá, buď v rozrušení celistvosti membrány (toxiny ΚΙ, K2) nebo (jako je tomu u killer-toxinu K28) v pozastavení buněčného cyklu (Zellcyklus-Arrest) s cílenou inhibici syntézy DNA [Bussey, 1991; Schmitt a Compain, 1995; Schmitt a spol., 1996]. Killer-toxiny tříd ΚΙ, K2 a K28 se sice ve svém způsobu účinku a ve svých fyzikálně-chemických vlastnostech navzájem značně liší, mají však společné úzké spektrum účinnosti a dále to, že usmrcují převážně senzitivní kvasinky úzce příbuzných druhů. Toto omezené spektrum účinnosti je dáno tím, že dosud charakterizované killer-toxiny z pekařského droždí s různými populacemi receptorů na úrovních buněčné stěny kvasinek a cytoplasmové membrány musí reagovat navzájem, aby mohly usmrtit senzitivní cílové buňky. U primárních toxinreceptorů buněčné stěny kvasinek jde buď o velmi rozvětvené β-Ι,ό-D-glukany nebo o vnější mannotriosové postranní řetězce mannoproteinu buněčné stěny [Bussey, 1991; Schmitt a Radler 1987, 1988].

Kromě virálních proteintoxinů kvasinek S.cerevisiae, Hanseniaspora uvarum, Zygosaccaromyces bailii a Ustilago maydis byly popsány killer-kmeny i v rodech Debaromyces, Hansenula, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon, Ptchia, Kluyveromyces, Torulopsis a WHliopsis [McCracken a spol., 1994; Park a spol., 1996; Schmitt a Neuhausen, 1994; Valker a spol., 1995]. Genetické základy tohoto killer-jevu však u těchto kvasinek nespočívají ve virálních genomech, nýbrž buď v lineárních DNA-plasmidech nebo v chromosomálních kvasinkových genech [Schrůnder a spol., 1994].

Intenzivní molekulárně-biologické výzkumy různých killer-kvasinek produkujících toxin prokázaly, že sekrece toxických proteinů (killer-toxiny) je u kvasinek velmi rozšířena a že při vývoji selektivních antimykotik představuje potenciál, který nelze přehlédnout [Valker a spol., 1995; Hodgson a spol., 1995; Polonelli a spol., 1986; Schmitt a Neuhausen, 1994; Neuhausen a Schmitt, 1996; Schmitt a spol., 1997], doposud však tyto proteintoxiny nebyly připraveny.

Úkolem tohoto vynálezu je proto příprava vhodných vysoce účinných proteintoxinů s antimykotickými nebo fungicidními účinky pro ničení kvasinek a/nebo hub s patogenním působením na člověka nebo rostliny.

Podstata vynálezu

Pro ničení kvasinek a/nebo hub s patogenním působením na člověka nebo rostliny se jako obzvláště vhodné překvapivě ukázaly toxiny produkované a secernované s vysokou účinností, a to killer-toxin VICALTIN (rovněž proteintoxin) z divokého kmene kvasinek Williopsis californica kmen 3/57 (DSM 12865) a viruskódovaný ZYGOCIN (rovněž proteintoxin) z kvasinek Zygosaccharomyces baílii (DSM 12864). Kromě toho bylo těmito prostředky možno usmrtit i obávané škodlivé kvasinky v potravinách a v krmivech. Oba tyto proteintoxiny je proto možno potenciálně použit jako antimykotikum a/nebo fungicid pro likvidaci infekci vyvolaných kvasinkami a/nebo houbami, zejména pro likvidaci mykóz. Tyto indikace jsou v tomto vynálezu ověřovány zkoumáním způsobu působení těchto látek. V rámci tohoto vynálezu byly toxingeny vhodným způsobem klonovány a sekvencovány a byl tak vypracován postup i genově-technické přípravy a exprese (Úberexpression) v kultuře preparátů VICALTIN a ZYGOCIN.

·«

Předmětem tohoto vynálezu jsou tudíž proteintoxiny, které je možno získat z Williopsis californica, zejména z kmene DSM 12865 a Zygosaccharomyces bailii, zejména z kmene DSM 12864. Oba tyto kmeny byly podle Budapešťské smlouvy dne 9.června 1999 uloženy do Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, 38124 Braunschweig, Mascheroder Veg lb (www.dsmz.de).

V rámci tohoto vynálezu secernovaly zejména kmeny DSM 12864 a DSM 12865 biologicky vysoce účinné proteintoxiny, které díky širokému spektru jejich účinnosti (viz příklady 4 a 7) usmrcovaly i četné humánně- a rostlinně-patogenní kvasinky a houby. Proto se tento vynález týká i selektivních antimykotik nebo fungicidů v tom smyslu, že u proteintoxinů - a dále uvedených polypeptidů podle tohoto vynálezu a jimi < kódovaných nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, zejména ve funkční jednotce toxingenu - jde o potenciální bíofarma* ka, která na základě jejich specifického působení zprostředkovaného receptory usmrcuji výhradně kvasinky a/nebo houby a pro vyšší eukaryoty - a samozřejmě pro lidské a savčí • · buňky - a rovněž pro rostliny, zejména pro kulturní rostliny, jsou zcela neškodné [viz Pfeiffer a spol., 1988].

Bylo možno selektivně usmrcovat následující humánněa rostlinně-patogenní a rovněž apatogenní kvasinky a/nebo houby:

Zygocin-senzitivní druhy kvasinek: Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida krusei, Candída glabrata, Candida vinii, Hanseniaspora uvarum, Kluyveromyces marxianus,

Metschnikowia pulcherrima, Ustilago maydis, Debaromyces * hansenii, Pichia anomala, Pichia jadinii, Pichia membranefaciens, Yarowia lipolytica a Zygosaccharomyces rouxii.

Vicaltin-senzitivní druhy kvasinek: Candida albicans,

Candida glabrata, Candida tropicalis, Debaromyces hansenii, Kluyveromyces lactis, Metschnikowia pulcherrima, Pichia anomala, Pichia jadinii, Saccharomyces cerevisiae, Sporthrix spec., Torulaspora delbrueckii, Torulaspora pretoriensis, Yarowia lipolytice a Zygosaccharomyces bailii.

Obzvláště vysoká aktivita wicaltin-produkujícího kmene DSM 12865 spočívá pravděpodobně ve výrazné sekreční účinnosti tohoto kmene, která je v porovnání s jinými kmeny stejného druhu kvasinek podstatně vyšší. Killer-vlastnost zygocin-produkujícího kmene kvasinek DSM 12864 spočívá v infekci toxinkódujícími viry s dvouvláknovou RNA i (M^^-dsRNA), které jsou stabilní, v cytoplasmě přetrvávají ve vysokém počtu kopií a v příslušných kvasinkách (kmen DSM , 12864) vyvolávají produkci a sekreci zygocinu [viz Schmitt a Neuhausen, 1994]. Ostatní kmeny stejného druhu nevykazovaly žádnou produkci toxinů, poněvadž v cytoplazmě neobsahují žádné toxinkódující dsRNA-viry, takže jsou • · ·

9 ^rf 9 9 · · · fenotypově klasifikovány jako Ne-Killer- typy.

Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou nukleové kyseliny kódující proteintoxin - s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID No 1 a No 2 a s glukanasovou aktivitou - nebo funkční varianty těchto nukleových kyselin a jejich části minimálně s 8 nukleotidy, zejména minimálně s 15 nebo 20 nukleotidy, obzvláště minimálně se 100 nukleotidy, především minimálně s 300 nukleotidy (dále jsou uváděny jako nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu).

Kompletní nukleové kyseliny kódují proteintoxiny, které vykazují po intracelulárním zpracování a sekreci velikost 309 aminokyselin a molekulovou hmotnost 34 kDa (SEQ ID No 1), resp. 99 aminokyselin a molekulovou hmotnost 10 kDa (SEQ ID No 2). Exprese této nukleové kyseliny podle SEQ ID No 1 v kvasinkách S.cerevisiae vede k rekombinantnímu VICALTINU, který se v supernatantu kultury kvasinek secernuje jako glykosylovaný protein se signifikantní β-l,3-D-glukanasovou aktivitou [viz příklad 10]. Další experimenty provedené podle tohoto vynálezu potvrdily, že u nukleových kyselin podle tohoto vynálezu jde o nukleové kyseliny, které v případě SEQ ID No 1 kódují proteintoxin s glukanasovou aktivitou a v případě SEQ ID No 2 kódují in vivo pravděpodobně O-glykosylovaný proteintoxin označovaný jako ZYGOCIN.

Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu je možno získat z DSM 12865 (SEQ ID No 1) a z DSM 12864 (SEQ ID No 2).

V jedné preferované formě provedení jsou nukleovými kyselinami podle tohoto vynálezu DNA nebo RNA, především dvouvláknová DNA, a zejména DNA se sekvencí nukleových kyselin podle SEQ ID No 1 od pozice 1 do pozice 947 a podle SEQ ID No 2 od pozice 1 do pozice 713. Obě tyto pozice ur• « ··»·»·· · · < · * 9 * · 9 · · · ··· • » 9 · · · · 9 · 9 · 9 9 9 čují podle tohoto vynálezu začátek a konec kódující oblasti, tj. vždy první a poslední aminokyselinu v příslušném čtecím rámci (Leseraster).

Pojmem funkční varianta se rozumí podle tohoto vynálezu nukleová kyselina, která je funkčně příbuzná s nukleovými kyselinami podle tohoto vynálezu. Tak na příklad j sou příbuznými nukleovými kyselinami nukleové kyseliny z různých kvasinkových buněk resp. kmenů a kultur _f nebo alelické varianty. Tento vynález zahrnuje i varianty nukleových kyselin, které mohou pocházet z různých kvasi« nek/kmenů kvasinek nebo jiných původců infekcí jako jsou dermatofyty a plísně (podle DHS systému).

V dalším smyslu se pod pojmen varianty podle tohoto vynálezu rozumějí nukleové kyseliny, které vykazují homologii, zejména identitu sekvencí z cca 60%, raději z cca 75 %, obzvláště z cca 90 % a především z cca 95 %.

Části nukleových kyselin podle tohoto vynálezu se mohou používat např. pro přípravu jednotlivých epitopů, jako sondy pro identifikaci dalších funkčních variant nebo jako antisense-nukleové kyseliny. Tak na příklad nukleová kyselina skládající se minimálně z cca 8 nukleotidů je vhodná jako antisense-nukleová kyselina, nukleová kyselina skládající se minimálně z cca 15 nukleotidů je vhodná jako primér při PCR-postupu, nukleová kyselina skládající se minimálně z cca 20 nukleotidů je vhodná pro identifikaci dalších variant a nukleová kyselina skládající se minimálně z cca 100 nukleotidů je vhodná jako sonda.

V další výhodné formě provedení tohoto vynálezu obsahuje nukleová kyselina podle tohoto vynálezu jednu nebo • ♦ 4 *· « ·· ·· • · 9 ♦ · * * ···« • · · · « · 4 » » v • ······· · · < « · · • · I ··· · · * •· * ·· »·· ·· ···· více nekódujících sekvencí a/nebo póly(A)-sekvenci, jednu nebo více (pro intracelulární pro-protein-zpracování nezbytných) Kex2p-endopeptidasových rozlišujících sekvencí (Endopeptidase Erkennungssequenzen) a rovněž jedno nebo více potenciálních N-glykosylačních míst. Nekódujícími sekvencemi jsou řídící sekvence, jako jsou promotor- nebo enhancer- sekvence pro řízenou expresi kódujícího toxingenu obsahujícího nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu.

/ V další formě provedení je proto nukleová kyselina obsažena ve vektoru, přednostně v expresním vektoru nebo * v genově-terapeuticky účinném vektoru.

Expresními vektory mohou být např. v případě nukleových kyselin podle SEQ ID No 2 prokaryotické a/nebo eukaryotické expresní vektory resp. v případě nukleových kyselin podle SEQ ID No 1 výhradně eukaryotické expresní vektory. Exprese toxinkódujících nukleových kyselin podle SEQ ID No 1 v Escherichia coli není možná, poněvadž příslušný heterologicky exprimovaný proteintoxin je pro bakteriální buňky toxický. Klonování VITCALTIN-kódujících nukleových kyselin podle SEQ ID No 1 v E. coli je možné pouze s plasmidy, které nenesou žádný promotor (např. pomocí derivátů plasmidů pBR322). Příkladem prokaryotického vektoru, který umožňuje heterologickou expresi ZYGOCIN-kódující nukleové kyseliny podle SEQ ID No 2 je komerčně dostupný vektor pGEX-4T-l, který umožňuje provádět v E.coli expresi glutathion-S-transferasa-ZYGOCIN-fúzního proteinu. Dalším vektorem pro r expresi ZYGOCINU v E.coli je např. T7 expresní vektor pGMÍO (Martin, 1996) , který kóduje N-terminální Met-Ala-His6-část • (tag), což umožňuje výhodné čištění exprimovaného proteinu na sloupci Ni -NTA. Jako eukaryotické expresní vektory pro expresi v Saccharomyces cerevisiae jsou vhodné např. vektory • * · • · • · • ······« · ·· · · ··· · · « ··· • · · ·· · · · «» ···· p426Met25 nebo p426GALl [Mumberg a spol., (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767], pro expresi v buňkách hmyzu jsou použitelné např. Baculovirus-vektory jako jsou EP-B1-0127839 nebo EP-B1-0549721 a pro expresi v buňkách savců lze použít např. SV40-vektory, které jsou běžně dostupné.

Expresní vektory obsahuj i obecně regulační sekvence vhodné i pro hostitelskou buňku, jako jsou např. trp-promotor pro expresi v E.coli (viz např. EP-B1-0154133), _Λ ADH-2-promotor pro expresi v kvasinkách [Russel a spol.

(1983). J.Biol.Chem 2588, 2674], baculovirus-polyhedrin-* promotor pro expresi v buňkách hmyzu (viz například

EP-B1-0127839) nebo starší SV40-promotor nebo LTR-promotory např. z MMTV (Mouše Mammary Tumour Virus; Lee a spol., (1981) Nátuře, 214, 228).

Příkladem genově-terapeuticky účinných vektorů jsou virusvektory, zejména adenovirusvektory, obzvláště replikačně-deficientní adenovirusvektory, nebo adenoasociované virusvektory, např. adenoasociovaný virusvektor, který se skládá výhradně ze dvou vložených terminálních opakujících se sekvencí (Viederholungssequenz) (ITR).

Vhodné adenovirusvektory j sou popsány např. v pracích McGroy, V.J. a spol. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman, Y. a spol. (1982) v publikaci Eukaryotic Viral Vectors (Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Chroboczek, J. a spol. (1992) Virol. 186, * 280; Karlsson, S. a spol. (1986) EMBO J., 5, 2377 nebo ve

V095/00655.

Vhodné adenoasociované virusvektory jsou popsány např. v pracích Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol.

· 44 • · · · · · » • · · · · · < · · 4

158, 97; VO95/23867; Samulski, R.J. (1989) J. Virol., 63, 3822; VO95/23867; Chiorini, J.A. a spol. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531 nebo Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793.

Genově-terapeuticky účinné vektory je možno získat i tak, že se nukleová kyselina podle tohoto vynálezu váže do komplexu s liposomy. K tomu jsou vhodné směsi lipidů, které jsou popsány např. v pracích Felgner, P.L. a spol., (1987) Proč. Nati. Acad. Sci USA 84, 7413; Behr, J.P. a spol.

(1989) Proč. Nati. Acad. Sci USA 86, 6982; Felgner J.H. a spol. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 nebo Gao, X. a Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195. Při přípravě těchto liposomů se DNA naváže iontově na povrch liposomů, a to v takovém poměru, aby na povrchu zůstal zachován kladný náboj a aby DNA byla s liposomy úplně vázána v komplexu.

V další formě provedení jsou nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu obsaženy ve vektoru, přednostně v expresním vektoru pro přípravu transgenních rostlin. Vzhledem k tomu, že popisované killer-toxiny VICALTIN a ZYGOCIN mají široké spektrum účinnosti a usmrcují i fytopatogenní kvasinky a houby, je možno získat takové transgenní rostliny, které j sou odolné např. proti infekci vyvolávané u kukuřice patogenem Ustilago maydis. Podobné pokusy byly již prováděny na rostlinách tabáku, které po heterologické expresi přirozeného virálně kódovaného killertoxinu KP4 z U.maydis měly schopnost secernovat příslušný proteintoxin a získat tak specifickou ochranu proti infekcím určitými fytopatogenními kmeny U.maydis (Park a spol., 1996; Kinal a spol., 1995; Bevan, 1984). Na základě komerčně dostupných transformačních systémů, založených na modifikovaných derivátech přirozených ··· ·· · ·« · · · · · · · · · *··»

- ···· · · · · » ·

Ti-plasmidů z Agrobacterium tumefaciens, je možno nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu zastoupené i v toxingenech WCT a ZBT nakloňovat do tzv. dvousměrných pBI-vektorů (fa. CLONTECH) a použít pro získání transgenních rostlin. Příslušné toxingeny WCT a ZBT se přitom vkládají pod transkripční kontrolou silného promotoru viru květákové mosaiky (CaMV-P). Bližší podrobnosti o výstavbě tohoto konstruovaného vektoru jsou schematicky uvedeny v příkladu 9.

λ Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu je možno např.

syntetizovat chemicky s použitím sekvencí ze SEQ ID No 1 ’ a No 2 nebo s použitím peptidových sekvencí ze SEQ ID No a No 2 s využitím genetického kódu např. fosfotriesterovou metodou (viz např. Uhlman, E. a Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No.4). Další možností pro získání nukleových kyselin podle tohoto vynálezu je izolace z vhodné genové banky s použitím vhodné sondy (viz např. Sambrook, J. a spol. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor, New York). Jako sondy jsou vhodné např. jednovláknové fragmenty DNA o délce cca 100 až 1000 nukleotidů, zejména o délce 200 až 500 nukleotidů, obzvláště o délce cca 300 až 400 nukleotidů, jejichž sekvenci je možno odvodit ze sekvence nukleových kyselin podle SEQ ID No 1 a No 2.

Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou polypeptidy jako takové s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID No 1 a No nebo jejich funkční varianty a jejich části minimálně se • šesti aminokyselinami, zejména minimálně s 12 aminokyselinami, obzvláště minimálně s 65 aminokyselinami a především ' s 309 aminokyselinami (SEQ ID No 1) a s 99 aminokyselinami (SEQ ID No 2) (dále jsou uváděny jako polypeptidy podle tohoto vynálezu). Tak např. může polypeptid o délce cca

6-12, zejména o délce cca 8 aminokyselin obsahovat epitop, který slouží po navázání na nosič k přípravě specifických póly- nebo monoklonálních protilátek (viz např. US 5,656,435). Polypeptidy o délce minimálně ca 65 aminokyselin mohou být použity přímo i bez nosiče k přípravě póly- nebo monoklonálních protilátek.

Pojmem funkční varianta ve smyslu tohoto vynálezu se rozumí polypeptidy, které jsou příbuzné s peptidem podle , tohoto vynálezu, t.zn., že vykazují glukanasovou aktivitu.

Variantami se rozumí i alelické varianty nebo polypeptidy,

- které mohou pocházet i z různých kvasinek / kmenů kvasinek nebo jiných původců infekcí, jako jsou dermatofyty nebo plísně (podle DHS-systému).

V dalším smyslu se do tohoto vynálezu zahrnují i polypeptidy, které vykazují homologii sekvencí, zejména identitu sekvencí z cca 70 %, zejména z cca 80%, obzvláště z cca 90 % a především z cca 95 % s polypeptidem s aminokyselinovou sekvencí podle obr. 2. Dále se sem řadí i vyštěpení polypeptidu v rozsahu cca 1-60, zejména 1-30, obzvláště cca 1 - 15 a především cca 1-5 aminokyselin. Tak na příklad může chybět první aminokyselina methionin, aniž by se funkce tohoto polypeptidu podstatně změnila. Kromě toho sem patří i fúzní proteiny, které obsahují výšeuvedené polypeptidy podle tohoto vynálezu, přičemž tyto fúzní proteiny již samy mají funkci glukanasy nebo tuto specifickou funkci mohou získat až po odštěpení fúzního podílu. Patří sem především • fúzní proteiny s podílem zejména ne-humánních sekvencí obsahujících cca 1 - 200, zejména cca 1 - 150, obzvláště cca • 1 - 100 a především cca 1-50 aminokyselin. Jako příklady ne-humánních peptidových sekvencí je možno uvést prokaryotické peptidové sekvence, např. z galaktosidasy z E.coli • · · ♦ · · ·· · · ··· · · · · ·«· • ······· · · ·· · · *· * · · · · * · · « nebo tzv. histidinový řetězec (Histidin-Tag), např.

Met-Ala-Hisg-řetězec (Tag). Fúzní protein s tzv. histidinovým řetězcem je obzvláště vhodný pro čištění exprlinovaného proteinu na koloně s kovovými ionty, např. s použitím o .

sloupce Ni -NTA. NTA představuje chelátor, kterým je nitrilotrioctová kyselina (Qiagen GmbH, Hilden). Tento vynález zahrnuje i polypeptidy podle tohoto vynálezu, které jsou skryté jako pro-protein nebo v nej širším smyslu jako Pre-drug.

Části polypeptidů podle tohoto vynálezu představují např. epitopy, které je možno specificky rozeznat pomocí protilátek.

Polypeptidy podle tohoto vynálezu je možno připravit např. expresí nukleových kyselin podle tohoto vynálezu ve vhodném expresním systému s použitím dříve popsaných metod, které jsou odborníkům známy. Jako hostitelské buňky pro přípravu správně zpracovaných a tím i biologicky aktivních proteintoxinů jsou vhodné výhradně eukaryotické organismy, zejména pučící kvasinky (Sprosshefe) Saccharomyces cerevisiae a štěpné kvasinky (Spalthefe) Schizosaccharomyces pombe.

Uvedené části polypeptidů je možno rovněž syntetizovat i pomocí klasické syntézy peptidů (technika Merrifield). Tyto části jsou vhodné zejména pro získání antisér, s jejichž pomocí je možno prozkoumávat vhodné genexpresní banky tak, aby bylo možno získat další funkční varianty polypeptidů podle tohoto vynálezu.

Další předmět tohoto vynálezu se proto vztahuje na postup pro přípravu polypeptidů podle tohoto vynálezu, přičemž ··· ·· · ·* ·· • · * · · · · ···« ···· · · · · · · • ······· · 9 9 9 9 · • · · 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9 9 9 nukleová kyselina podle tohoto vynálezu se ve vhodné hostitelské buňce exprimuje a případně izoluje.

Obzvláště preferovány jsou dělící se kvasinky Schizosaccharomyces pombe, poněvadž tyto kvasinky vykazují přirozenou resistenci proti VICALTINU a ZYGOCINU a byly již několikrát úspěšně použity pro heterologickou expresi cizích proteinů [Giga-Hama a Kumagai (1997) v publikaci Foreign Gene Expresion in Fission Yeast (Exprese cizích genů v dělících se kvasinkách): Schizosaccharomyces pombe, nakl. Springer]. Jak je uvedeno v příkladu 11, mohou být toxin-kódující nukleové· kyseliny podle SEQ ID No 1 a No 2 nakloňovány např. do S. pombe-vektoru pREPl [Maundrell (1990), J. Biol. Chem. 265:10857-10864], v němž jsou pod transkripční kontrolou thiamin-regulovaného nmtl promotoru dělících se kvasinek [nmt = no message with thíamine]. Kvasinky transformované tímto vektorem exprimují příslušný cizorodý gen v závislosti na koncentraci thiaminu v kultivačním mediu kvasinek. Tímto způsobem je případně možno časově oddělit fázi růstu kvasinek od fáze produkce cizorodého proteinu, takže je principiálně možno provést i expresi proteinů, které jsou pro kvasinky toxické. Aby bylo možno provádět současnou sekreci a tím podstatně usnadnit čištění heterologicky exprimovaných toxinů VICALTIN a ZYGOCIN v S.pombe, provedli jsme konstrukci expresního/ /sekrečního vektoru [vektor ρΤΖατ; viz příklad 11], který obsahuje sekreční a procesní signál virálního K28-preprotoxingenu [Schmitt a Tipper, 1995] a tím umožňuje účinnou sekreci příslušného in-frame zařazeného cizorodého proteinu.

Další předmět tohoto vynálezu se vztahuje i na protilátky, které specificky reagují s polypeptidem podle tohoto

-16·«· · · · ·· · · vynálezu, přičemž výšeuvedené části tohoto polypeptidu jsou buď samy imunogenní nebo může být jejich imunogenita vyvolána nebo zvýšena navázáním na vhodný nosič, jako je např. bovinní sérový albumin.

Tyto protilátky jsou buď polyklonální nebo monoklonální. Jejich příprava, která je rovněž předmětem tohoto vynálezu, se provádí např. podle všeobecně známých metod imunizací nějakého savce, jako je na příklad králík, polypeptidem nebo jeho výšeuvedenou částí podle tohoto vynálezu, případně za přítomnosti např. Freundova adjuvantu a/nebo aluminiumhydroxidových gelů (viz např. Diamond, B.A. a spol. (1981)

The New England Journal of Medicíně, 1344). Polyklonální protilátky vzniklé ve zvířeti imunologickou reakcí je možno nakonec pomocí obecně známých metod snadno izolovat z krve a čistit např. pomocí sloupcové chromatografie. Preferováno je afinitní čištění protilátek, při němž se např. příslušný antigen (VICALTIN nebo ZYGOCIN) kovalentně naváže na všeobecně dostupnou CnBr-aktivovanou Sepharosovou matrici a použije se pro čištění příslušných toxinspecifických protilátek.

Monoklonální protilátky je možno připravit např. podle známé metody kterou publikovali Vinter a Milstein (Vinter, G. a Milstein, C. (1991) Nátuře, 349, 293).

Dalším předmětem tohoto vynálezu je i léčivo, které obsahuje nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu nebo polypeptidy podle tohoto vynálezu (samotné nebo v kombinaci) a případně vhodné přísady nebo pomocné látky a postup pro přípravu tohoto léčiva pro léčbu mykóz, jako jsou povrchové, kutánní a subkutánní dermatomykózy, mykózy sliznic a systémové mykózy, a to zejména Candida-mykózy,

-17přičemž se nukleová kyselina podle tohoto vynálezu nebo polypeptid podle tohoto vynálezu kombinují s farmaceuticky vhodnými přísadami a/nebo pomocnými látkami.

V příkladu 12 je uvedeno, že čištěný toxin VICALTIN produkovaný kmenem DSM 12865 má dokonce podstatně vyšší toxicitu pro kvasinky než srovnávaná antimykotika Clotrimazol a Miconazol, která se pro léčbu mykóz často používají.

Proto se tento vynález týká i léčiva ve výše uvedeném smyslu, které obsahuje antimykotikum nebo proteintoxin izolovaný z DSM 12864 a/nebo DSM 12865 a/nebo polypeptidy s antimykotickým účinkem podle tohoto vynálezu.

Pro genově-terapeutické použití u člověka je vhodné zejména takové léčivo, které obsahuje nukleovou kyselinu podle tohoto vynálezu v základní formě (nackte Form) nebo ve formě některého z výšeuvedených genově-terapeuticky účinných vektorů nebo ve formě komplexu s liposomy.

Jako vhodné přísady a/nebo pomocné látky je možno použít např. fyziologický roztok kuchyňské soli, stabilizátory, proteinasové inhibitory, nukleasové inhibitory atd.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je diagnostický prostředek obsahující nukleovou kyselinu podle tohoto vynálezu, polypeptid podle tohoto vynálezu nebo protilátky podle tohoto vynálezu a případně vhodné přísady a/nebo pomocné látky a postup přípravy tohoto diagnostického prostředku pro diagnózu mykóz, jako jsou povrchové, kutánní a subkutánní dermatomykózy, mykózy sliznic a systémové mykózy, a to zejméma Candida-mykózy, při němž se nukleová kyselina podle tohoto vynálezu, polypeptid podle tohoto • · • · • · vynálezu nebo protilátky podle tohoto vynálezu kombinují s vhodnými přísadami a/nebo pomocnými látkami.

Tak je možno na příklad podle tohoto vynálezu s použitím nukleových kyselin podle tohoto vynálezu získat diagnostikům na základě polymerasové řetězové reakce (PCR-diagnostika, např. podle EP-0200362), nebo Northern a/nebo Southern Blot-analýzy, jak je blíže popsáno v příkladu 13. Tyto testy jsou založeny na specifické hybridizaci nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu s komplementárním protivláknem (Gegenstrang) zpravidla odpovídající mRNA. Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu mohou být přitom modifikovány i způsobem popsaným např. v EP0063879. Přitom se zejména DNA-fragment podle tohoto vynálezu označí podle známých metod vhodnými činidly, jako je např. radioaktivní a-P^J -dATP nebo neradioaktivní biotin a inkubuje se s izolovanou RNA, zpravidla navázanou na vhodné membráně např. z celulózy nebo nylonu.-Přitom je výhodné izolovanou RNA před hybridizaci a navázáním na membránu rozdělit v závislosti na její velikosti např. pomocí elektroforézy na agarosovém gelu. Při stejném množství sledované RNA z každého vzorku tkáně je tak možno stanovit množství mRNA specificky značené pomocí sondy.

Další diagnostikům obsahuje polypeptid podle tohoto vynálezu resp. jeho výšeuvedené imunogenní části. Tento polypeptid resp. jeho části, vázané především na pevné fázi, např. na nitrocelulóze nebo nylonu, je možno např. dát in vitro do styku s vyšetřovanou tělesnou tekutinou, např. krví, aby mohlo např. dojít k reakci s protilátkou. Tento komplex protilátka-peptid může být potom prokázán např. pomocí značené antihuman-IgG-protilátky nebo antihuman-Igří-protilátky. Při tomto značení se jedná např. o enzym, jako

je peroxidasa, který katalýzuje barevnou reakci. Přítomnost a množství přítomných autoimunitních protilátek je tak možno snadno a rychle prokázat pomocí barevné reakce.

Další diagnostikům obsahuje protilátky podle tohoto vynálezu jako takové. Pomocí těchto protilátek je možno např. snadno a rychle vyšetřovat vzorky lidské tkáně na přítomnost příslušného polypeptidu. V tomto případě se protilátky podle tohoto vynálezu značí např. enzymem, jak bylo popsáno dříve. Specifický komplex protilátka-peptid je tak možno snadno a rychle prokázat pomocí enzymatické barevné reakce.

Další předmět tohoto vynálezu se týká fungicidu, který obsahuje nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu a/nebo polypeptidy podle tohoto vynálezu (jednotlivě nebo v kombinaci) a případně vhodné přísady nebo pomocné látky a dále postupu přípravy fungicidu pro ničení škodlivých kvasinek a škodlivých hub, při němž se kombinuje nukleová kyselina podle tohoto vynálezu nebo polypeptid podle tohoto vynálezu se zemědělsky přípustnými přísadami a/nebo pomocnými látkami.

Jak bylo popsáno dříve, byla v jedné výše uvedené formě provedení získána transgenní rostlina, která exprimuje proteintoxin podle tohoto vynálezu. Proto se tento vynález týká i rostlinných buněk a rovněž transgenní rostliny jako takové, které obsahují polypeptidy a/nebo proteintoxiny podle tohoto vynálezu.

Další předmět tohoto vynálezu se týká testu pro identifikaci funkčních interaktorů, jako jsou např. inhibitory nebo stimulátory obsahující nukleovou kyselinu podle tohoto vynálezu, polypeptid podle tohoto vynálezu nebo protilátku podle tohoto vynálezu a případně vhodné přísady a/nebo pomocné látky.

Vhodným testem pro identifikaci funkčních interaktorů, zejména takových, které v senzitivní buňce kvasinek reagují s proteintoxinem ZYGOCINEM podle SED ID No 2 je např. tzv. Two-Hybrid System (Fields, S. a Sternglanz, R. (1994) Trends in Genetics, 10, 286). Při tomto testu se buňka, např. buňka kvasinek transformuje nebo transferuje s jedním nebo několika expresními vektory, exprimujícími fúzní protein, který obsahuje polypeptid podle tohoto vynálezu a DNA-vaznou doménu známého proteinu, např. z Gal4 nebo LexA z E.coli a/nebo s vektory, které exprimuji fúzní protein, který obsahuje neznámý polypeptid a jednu transkripčně-aktivační doménu, např. z Gal4, herpesviru VP16 nebo B42. Kromě toho obsahuje tato buňka reportergen, např. LacZ-gen z E.coli, Green (zelený) Fluorescence Protein nebo kvasinkové geny biosyntézy aminokyselin (AS-Biosynthesegene der Hefe) His3 nebo Leu2, které prostřednictvím regulačních sekvencí, jako jsou např. IexA-promotor/operátor nebo tzv. Upstream (vzestupná) Activation Sequence (UAS) kvasinku řídí. Neznámý polypeptid se např. kóduje DNA-fragmentem pocházejícím z genové banky, např z humánní genové banky. V kvasinkách se zpravidla připravuje pomocí popsaných expresních vektorů cDNA-genová banka, takže ihned potom je možno test provést.

Tak na příklad se v kvasinkovém expresním vektoru klonují nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu ve funkční jednotce na nukleovou kyselinu kódující LexA-DNA-vaznou doménu, takže dochází k expresi fúzního proteinu z polypeptidu podle tohoto vynálezu a LexA-DNA-vazné domény v trans• · · • · · · · · · ···· • · » · ·· · ·« « • ······· · » · · · · • · · · · · · · · *· · ·· ··· ·· ···· formovaných kvasinkách. V jiném kvasinkovém expresním vektoru se cDNA-fragmenty z cDNA-genové banky ve funkční jednotce klonují na nukleovou kyselinu kódující Gal4-transkripčně-aktivační doménu, takže dochází k expresi fúzního proteinu z neznámého polypeptidu a Gal4-transkripčně-aktivační domény v transformovaných kvasinkách. Kvasinka transformovaná pomocí obou těchto vektorů, např. Leu2’, obsahuje kromě toho nukleovou kyselinu kódující Leu2, která je řízena LexA-promotor-operátorem. V případě funkční interakce mezi polypeptidem podle tohoto vynálezu a neznámým polypeptidem se váže Gal4-transkripčně-aktivační doména prostřednictvím LexA-DNA-vazné domény na LexA-promotor-operátor, který se aktivuje a exprimuje Leu2-gen. To má za následek, že kvasinky Leu2’ mohou růst na minimálním mediu, které neobsahuje žádný leucin.

Při použití LacZ- resp. Green Fluorescence Protein” -reportergenu namísto genu biosyntézy aminokyselin je možno aktivaci transkripce prokázat tvorbou modře, resp. zeleně fluoreskujících kolonií. Míru modré resp. zelené fluorescence je možno snadno kvantifikovat spektrofotometricky např. v případě modré barvy při 585 nm.

Tímto způsobem je možno snadno a rychle zjišťovat v expresních genových bankách přítomnost polypeptidů, které reagují s polypeptidem podle tohoto vynálezu. Potom je možno nalezený nový polypeptid izolovat a dále charakterizovat.

Další možností použití systému Two-Hybrid System je ovlivnění interakce mezi polypeptidem podle tohoto vynálezu a známým nebo neznámým polypeptidem působením dalších látek, jako jsou např. chemické sloučeniny. Tento způsob umožňuje i snadné vyhledávání nové chemicky syntetizovatelné účinné látky, kterou je možno použít jako terapeutika. Tento vynález proto není zaměřen pouze na postup pro vyhledávání polypeptidických interaktorů, nýbrž se vztahuje i na postup vyhledávání látek, které mohou reagovat s výšeuvedeným protein-protein-komplexem. Tyto peptidické a rovněž chemické interaktory jsou označovány ve smyslu tohoto vynálezu jako funkční interaktory, které mohou mít inhibiční nebo stimulační účinky.

Další předmět tohoto vynálezu se týká postupu pro přípravu proteintoxinů zahrnujícího kultivaci a sekreci proteintoxinů v mediu, které je syntetickým kultivačním mediem (BAVC-medium), chromatografické čištění secernovaného toxinu, např. pomocí ultrafiltrace a katexové chromatografie a/nebo afinitní chromatografie na Laminarin-Sepharose a/nebo na Mannoprotein-Sepharose [viz příklad 1 a dodatek k příkladům]. V případě VICALTINU produkovaného a secernovaného kmenem DSM 12865 je možno dosáhnout dalšího zvýšení produkce toxinu tím, že se do media přidá rostlinný (a všeobecně dostupný) β-l,3-D-glukan laminarin na konečnou koncentraci 1 %. Jak je uvedeno v příkladu 14, vede přídavek laminarinu do kultivačního media k podnícení tvorby VICALTINU, která je podle Northern-analýzy vyvolána indukcí transkripce.

Pro tvorbu toxinu ZYGOCINU secernovaného DSM 12864 je možno používat syntetické B-medium [viz Radler a spol.,

1993] .

Dále uvedené příklady slouží pro ilustraci tohoto vynálezu a neznamenaj í žádné omezení tohoto vynálezu pouze na tyto příklady.

•« · • ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace, koncentrace a čištění anti-Candida-toxinu VICALTIN ze supernatantu kultivačního roztoku killer-kvasinek H⁷. californica kmen 3/57 Q)SM 12865)

Killer-toxin VICALTIN secernovaný killer-kvasinkami W. californica 3/57 vykázal při agarovém difuzním testu na agaru s methylenovou modří (Methylenblau-Agar) optimální inhibiční působení na senzitivní kvasinky při pH 4,7 a 20 °C. V syntetickém kapalném mediu vykazují killer-kvasinky W. californica 3/51 maximální produkci toxinu při kultivaci v BAVC-mediu (pH 4,7). Pro zvýšení tvorby toxinu byly killer-kvasinky nejprve inkubovány za protřepávání po dobu 24 hodin v 5 ml YEPD-media při teplotě 30 °C a potom byly kvantitativně převedeny do 200 ml BAVC-media a znovu byly kultivovány po dobu 48 hodin při teplotě 20 °C na třepačce (140 ot./min.). Čtyři hlavní kultury (Hauptkultur) byly zaočkovány předpěstovanou kulturou (Vorkultur) (l%ní inokulum) vždy do 2,5 1 BAVC-media (pH 4,7 v 5 1 Erlenmeyerově baňce) a inkubovány po dobu 5 dnů za mírného třepání (60 ot./min.). Pro zkoncentrování secernovaného killer-toxinu byl bezbuněčný supernatant při teplotě +4 °C a tlaku 1 bar 200-násobně zahuštěn ultrafiltrací na membránách z polysulfonových kyselin (EasyFlow [fa.Sartorius]; vylučovací mez /Ausschlussgrenze/ 10 kDa) na objem 50 ml.

Pro odstranění nízkomolekulárních sloučenin a pro odstranění solí z takto získaného koncentrátu byl toxin dialyzován přes noc při 4 °C v dialyzační trubici (vylučovací mez 10-20 kDa) proti 5 mM citrát-fosfátovému pufru (pH 4,7). Pro uchování ·· « * koncentrátu toxinu byl dialyzovaný preparát sterilně zfiltrován přes membránu 0,2 pm a v dávkách po 1 ml byl zmrazen na -20 °C.

Důkaz a kalibrace aktivity toxinu byly provedeny při agarovém difuzním testu na agaru s methylenovou modří (MBA;

i pH 4,7) proti senzitivním indikačním kvasinkám Saccharomyces cerevzsiae 192.2d. Přitom byly z koncentrátu toxinu připraveny logaritmické zřeďovací stupně v 0,1 M citrát-fosfátovém pufru (pH 4,7) a bylo pipetováno vždy 100 pl do předem vyseknutých otvorů (průměr otvoru 9 mm) v MBA-desce zaočkované senzitivními indikačními kvasinkami (2x10$ buněk/ml). Po třídenní inkubaci desek při teplotě 20 °C byly změřeny dobře viditelné inhibiční dvorce (Hemmhof). Přitom se prokázalo, že mezi průměrem inhibičního dvorce a logaritmem koncentrace toxinu existuje lineární vztah. Průměru inhibičního dvorce (korigovanému na průměr otvoru) 20 mm byla uzančně přiřazena aktivita toxinu 1 x 10^ jednotek/ml.

Čištění koncentrovaného toxinu VITCALTIN bylo prováděno buď katexovou chromatografií na Bioscale-S (FPLC) nebo afinitní chromatografií na epoxy-aktivované Sepharose-68-Matrix (Fa. Pharmacia), na kterou byl předem navázán rostlinný β-l,6-D-glukan pustulan. Tento toxinový preparát, u něhož byla tímto způsobem prokázána specifická aktivita odpovídající 625-násobnému obohacení (Tabulka 1) se při gelové elektroforéze jevil jako čistý a vykazoval po SDS-PAGE (v 10-22%ním gradientovém gelu) pouze samostatné oddělené pásy při cca 37 kDa, které bylo možno prokázat jak modří Coomassie-Blau (zbarvení proteinu) tak i Schiffovým činidlem s jodistou kyselinou (Perjodsáure-Schiffs-Reagent - PAS; zbarvení sacharidů). Pozitivní PAS-zbarvení ukazuje na potenciální N-glykosylaci arzti-Candida-toxinu VITCALTIN.

»* · ·· · *· »» • » · · 4 4 · · · · · • · · » · 4 · 4 w 4 *·*··»· · · * β « • · * 4 4« » · » ·« · ·« · «4 -9 ·»>4

Reakcí vyčištěného toxinu s endoglykasou-H bylo možno prokázat, že VITCALTIN obsahuje N-glykosidicky vázanou sacharidickou část o délce cca 3 kDa, která vzhledem ke své velikosti v kvasinkách rovněž ukazuje na jediné N-glykosylační místo v proteintoxinu. Vzhledem k tomu, že deglykosylovaný VITCALTIN vykazuje podstatně sníženou toxicitu, je možno soudit, že sacharidická část VITCALTINU je zřejmě pro navázání na senzitivní cílovou buňku nezbytná, t.zn., že nepřímo ovlivňuje biologickou aktivitu toxinu.

Tabulka 1:

Zahuštění toxinu VITCALTIN ze supernatantu kultivačního media killer-kvasinek Williopsis californica [UF, ultrafiltrace]

Preparát	Objem [ml]	Celk.protein [mg]	Celková aktivita toxinu [Ε] ,	Specifická aktivita toxinu [E/mg]	Aktivitní výtěžek [%]	Faktor vyčištění (Reini- gungsf.)
Supernatant kultiv. media	10000	24600	7,9x105	3,2x10	100	1
UF-retentát	50	162	6,3x105	3,9x103	80	122
Ivofil.dialyzát	25	45,8	3,1x105	6,8x103	39	213
Bioscale S (katex)	64	1,28	2,5x104	2,0x104	3,2	625

Příklad 2

Stanovení NH₂-terminální aminokyselinové sekvence preparátu VICALTIN a důkaz enzymatické β-1,3-glukonasové aktivity

Sekvencováním N-terminálních aminokyselin ve vyčištěném killer-toxinu bylo stanoveno prvních deset aminokyselin. Jak vyplývá» z obr. 1, vykazuje N-konec preparátu VICALTIN signifikantní homologii s amino-koncem endo-β-Ι,3-glukanasy kódované RG£2-genem z kvasinek

Saccharomyces cerevisiae.

Na základě této zjištěné homologie preparátu VICALTIN a BgI2 bylo zjišťováno, zda je v nečištěném koncentrátu toxinu a rovněž v čištěném toxinovém preparátu prokazatelná glukanasová aktivita. Jak při enzymatickém testu, při němž byl použit jako substrát β-1,3-D-glukan laminarin, tak i při fluorescenčním testu, při němž byl použit jako substrát

4-methyl-umbelliferyl-p-D-glukosid (MUC), bylo možno u preparátů VICALTINU prokázat výraznou β-1,3-D-glukanasovou aktivitu; souběžně testovaný β-1,6-D-glukan pustulan se působením preparátu VICALTIN nehydrolyzoval.

Příklad 3

Míra přežití kvasinkových buněk po působení VICALTINU za přítomnosti a nepřítomnosti glukanů buněčné stěny: kompetiční analýzy

Senzitivní buňky kvasinek kmene 5. cerevisiae 192.2d, které byly kultivovány v kapalném mediu YEPD (pH 4,7) při 20 °C za přítomnosti čištěného VICALTINU o aktivitě lx 10$ E/ml, vykázaly kinetiku usmrcování uvedenou v obr. 2. Přídavkem rostlinného β-1,6-D-glukanu pustulanu bylo možno míru přežití kvasinkových buněk po působení toxinu výrazně zvýšit. Tento přídavek při koncentracích 10 mg/ml způsobil úplné potlačení toxicity preparátu VICALTIN. Na rozdíl od pustulanu nevykázal β-1,3-D-glukan laminarin schopnost zvýšit míru přežití toxinem upravovaných kvasinkových buněk (obr.2).

Z uvedených poznatků je možno vyvodit závěr, že působení preparátu VICALTIN vyžaduje vazbu na β-1,6-ϋ^1η27 kaný, které fungují jako primární místo vazby (Andockstelle) (receptory toxinu) na buněčné stěně kvasinek. V souladu s tím bylo prokázáno, že kvasinky s vyštěpením v chromosomálním - genovém centru (Genlocus) mají toxinrezistentní chování a po retransformaci s KRE1-nesoucím episomálním vektorem jsou opět toxinsenzitivní (obr. 3).

V kreí-mutantech spočívá rezistence vůči toxinu na podstatně sníženém obsahu β-l,6-D-glukanu a tím podmíněným snížením vazby toxinu na povrch buněk kvasinek, potřebné k letálnímu účinku.

Příklad 4

Spektrum účinnosti a usmrcování působením VICALTINU

Při agarovém difuzním testu prokázal čištěný toxin VICALTIN z W. californica výraznou toxicitu vůči kvasinkám uvedeným v tabulce 2. S výjimkou tří kmenů kvasinek Candžda crusei bylo u všech 22 sledovaných klinickcých izolátů od pacientů a rovněž u všech ostatních kontrolních kmenů humánně-patogenních druhů Candida prokázáno velice účinné ničení působením VICALTINU. U 14 toxinsenzitivních druhů kvasinek z celkem 10 různých rodů prokázal VICALTIN jako killer-toxin neobyčejně, široké spektrum účinnosti.

·· ··· ·· · ···

Tabulka 2:

Spektrum účinnosti preparátu VICALTIN na patogenní a apatogenní kvasinky různých rodu. Všechny kmeny byly zkoušeny při agarovém difuzmm testu (MBA; pH 4,7) proti čištěnému preparátu VICALTIN. Aktivita aplikovaného toxinu byla ve všech případech 1 x 10^ E/ml. Kmen C. tropicalis (pacient č. 541965) pocházel z ústavu Institut fůr Medizinische Mikrobiologie und Hygiene z univerzitní kliniky v Mainzu.

Kmen kvasinek	Fenotyp	Průměr inhibičního dvorce [mm]
Candída albicans ATCC 10231	S	11
C. glabrata NCYC 388	S	12
C. krusei 185	R	0
C. tropicalis pacient č.541965	S	11
Debaromyces hansenii 233	S	16
Hanseniaspora uvarum ATCC 64295	R	0
Hasegawaea japonica var.Versatilis 191	R	0
Kluyveromyces lactis CBS 2359/152	S	22
K. marxianus C 8,1	R	0
Metchnikowia pulcherrima K/3I B6	S	8
Pichia anomala 245	S	17
P. farinosa 258	R	0
P. jardinii 258	R	0
P. kluyveri ATCC 64301	R	0
P. membranaefaciens NCYC 333	R	0
Saccharomyces cerevisiae 192.2d	S	30
381	S	23
ATCC 42017 (K1 -superkiller)	S	19
NCYC 738 <K2-killer)	S	14
452 (=NCYC 1006)	S	16
Saccharomyces ludwigii 240	R	0
Schizosaccharomyces pombe CBS 1042	R	0
Sporothríx spec. 1129	S	11
Torulospora delbrueckii 208	S	18
T. pretoriensis 186	S	10
Yarrowia lipolytica 271	S	8
Zygosaccharomyces bailii	S	23

• · * · · · « · · · ··· · · · · · · · ·

Příklad 5

Klonování, sekvencování a molekulární charakterizace

VICALTIN-kódujícího VCT-genu kvasinek V. californica kmen 3/57 (DSM 12865)

Na základě N-terminální aminokyselinové sekvence preparátu VICALTIN byly připraveny specifické DNA-oligonukleotidy, které vedly k identifikaci a klonování a rovněž k molekulárně-biologické charakterizaci chromosomálně lokalizovaného toxingenu WCT. DNA-sekvence WCT (SEQ ID No.l) vykazuje jediný otevřený čtecí rámec, který kóduje potenciálně N-glykosylovaný protein ze 309 aminokyselin a s vypočtenu molekulovou hmotností 34 017 Da.

Sledování účinnosti WCT-kódovaného killer-toxinu prokázalo, že v případě preparátu VICALTIN jde o glykoprotein, který je pró kvasinky mimořádně toxický, jehož primárním cílem (target) jsou β-1,3-D-glukany, které se vyskytují v buněčné stěně kvasinek. Jeho selektivní toxicita vůči kvasinkám a houbám spočívá v tom, že VICALTIN rozrušuje v senzitivní cílové buňce strukturu a/nebo integritu buněčné stěny, takže napadá kvasinky v jejich nejcitlivějším místě a tím je ničí.

Příklad 6

Úprava a čištění virus-toxinu ZYGOCINU získaného ze supernatantu po kultivaci killer-kvasinek Z. baÍlii kmen 412 (DSM 12864)

Z kvasinek Z. bailii kmen 412 byl ze supernatantu kultivačního media killer-kvasinek metodou kterou popsali • · · ·· · ·· ·· ··· ···· · · · ·

• · · · · · · · ·· ····

Radler a spol. (1993) izolován virus-kódovaný killer-toxin ZYGOCIN, který byl dále zahuštěn ultrafiltrací a potom byl čištěn pomocí afinitní chromatografie. Jednostupňové čištění ZYGOCINU popsané v citované studii využívá přirozené afinity toxinu k mannoproteinům buněčné stěny senzitivních kvasinek. Podle metody kterou popsali Schmitt a Radler (1997) byl izolovaný a částečně vyčištěný mannoprotein ze S.cerevžsiae kmen 192.2d kovalentně navázán na epoxyaktivovanou Sepharose-6B-matrici (Fa. Pharmacia) a použit pro FPLC čištění toxinu pomocí sloupcové chromatografie. Podle SDS-PAGE vykázal tímto způsobem čištěný, biologicky vysoce aktivní ZYGOCIN oddělené proteinové pásy se zjevnou molekulovou hmotností cca 10 kDa (obr. 4).

Příklad 7

Spektrum účinnosti a a usmrcování působením ZYGOCINU

Spektrum účinnosti virálního ZYGOCINU z kvasinek Z. bailii 412 (DSM 12864), stanovené při agarovém difuzním testu zahrnuje patogenní a apatogenní rody kvasinek, z nichž jsou Candida albicans a Sporothrix schenkii obávané jako původci chorob u člověka a zvířat a Ustilago maydis a Debaromyces hansenii jako škodlivé kvasinky v zemědělství a potravinářství (tab.3) • · · ·· · ·· ·· ··· · · · · ···· • ······· · · ·· · · • · · · * · é · · · · · · ·

Tabulka 3:

Spektrum účinnosti ZYGOCINU vůči patogenním a apatogenním kvasinkám různých rodů. Všechny kmeny byly testovány při agarovém difuzním testu (MBA; pH 4,5) na preparát ZYGOCIN s aktivitou 1 x 10^ E/ml.

ZYGOCIN-senzitivní kvasinky	Relativní stupeň senzitivity
Saccharomyces cerevisiae	++
Candida albicans	+
Candida krusei	++
Candida glabrata	++
Candida vinii	+
Hanseniaspora uvarum	++
Kluyveromyces marxianus	+
Metchnikowia pulcherrima	+
Ustilago maydis	++
Debaromyces hansenii	++
Pichia anomala	++
Pichia jadinii	+
Pichia membranefaciens	+
Yarrowia lipolytica	+
Zygosaccharomyces rouxii	++

Příklad 8

Klonování a sekvencování ZYGOCIN-kódujícího

ZBT-gemi (ZBT) kvasinek Z.bailÍi kmen 412 (DSM 12864) cDNA-syntéza toxinkódujícího dvouvláknového RNA-genomu killer-kvasinek Z.bailÍi 412 byla provedena podle metody kterou popsal Schmitt s čištěnou a methylrtuťhydroxidem denaturovanou M-dsRNA jako matricí a s různými hexanukleotidy jako priméry. Po ligaci do EcoRI-restringovaného vektoru pUC18, transformaci v E.coli a izolaci rekombinantního plasmidu bylo možno identifikovat a sekvencovat několik • ····· · · ··· · · ···· cDNA-klonů. cDNA-sekvence ZYGOCINEM kódovaného čtecího rámce (SEQ ID No.2) obsahuje genetickou informaci pro prvotní protein (Vorláuferprotein) (Pro-Toxin) z 238 aminokyselin, který má v aminokyselinové pozici RR potenciální Kex2-endopeptidasové štěpné místo. Při in vivo prováděné přeměně Pro-ZYGOCINU v pozdním Golgiho stadiu (im spáten Golgi-Stadium) zprostředkované Kex2 vzniká biologicky aktivní ZYGOCIN, jehož molekulová hmotnost (10 kDA; 99 aminokyselin) a N-terminální aminokyselinová sekvence souhlasí přesně s hodnotami odpovídajícími čištěnému ZYGOCINU.

Heterologická exprese ZUT-cDNA v kvasinkách S. cerevisiae vedla vzhledem k toxicitě ZYGOCINU k tomu, že transformované kvasinky byly usmrceny svým vlastním toxinem. V budoucnosti bude heterologická exprese ZYGOCINU zaměřena na toxinrezistentní dělící se kvasinky Schizosaccharomyces pombe, poněvadž - jak bylo již uvedeno na příkladu virálního K28-toxinu - jsou tyto dělící se kvasinky pro expresi a sekreci cizorodých proteinů obzvláště vhodné.

Příklad 9

Exprese toxingenu WCT a ZBT v transgenních rostlinách

Vzhledem k tomu, že popsané killer-toxiny VICALTIN a ZYGOCIN mají široké spektrum účinnosti a usmrcuji i fytopatogenní kvasinky a houby, mělo by být možno připravit takové transgenní rostliny, které by byly odolné např. proti infekci kukuřice způsobované patogenem Ustilago maydis. Podobné pokusy byly již provedeny s rostlinami tabáku, které při heterologické expresi přirozeného virálně kódovaného killer-toxinu KP4 z U. maydis měly schopnost secernovat

Μ · « * · ·· · · ··· · · · · · · · • ······· · · · · · · ·· · · · ··· ·· ···» příslušný killer-toxin a tak získat specifickou ochranu proti infekcím vyvolaným určitými fytopatogenními kmeny U. maydis (Park a spol., 1996; Kinal a spol., 1995; Bevan,

1984). Na základě komerčně dostupných transformačních systémů založených na modifikovaných derivátech přírodního Ti-plasmidu z Agrobacterium tumefaciens bylo možno klonované toxingeny WCT a ZBT nakloňovat do tzv. dvousměrných pBI-vektorů (Fa. Clontech)' a použít pro získání transgenních rostlin. Příslušné toxingeny WCT a ZBT byly pod transkripční kontrolou silného promotoru viru květákové mozaiky (CaMV-P). Výstavba konstruovaných vektorů je schematicky znázorněna v obr. 5.

Příklad 10

Heterologická exprese VICALTIN-kódujícího WCT-genu kvasinek W. californica 3/57 (DSM 12865) v S .cerevisiae

Pro heterologickou expresi WCT-genu v kvasinkách S. cerevisiae byl VICALTIN-kódující WCT-gen jako 930 bp EcoR/Smal-fragment nakloňován do všeobecně dostupného 2 μ vektoru pYX242. Výsledný vektor pSTH2 (obr. 6) obsahuje toxingen pod transkripční kontrolou vlastního kvasinkového triosa-fosfát-isomerasa-promotoru (ΤΡΓ) a umožňuje tak po transformaci v kvasinkách (S.cerevisiae) provést konstitutivní expresi VITCALTINU. Gelová elektroforéza supernatantu kultivačního media prokázala u takto získaných kvasinkových transformantů, že rekombinantní VITCALTIN se secernuje do kultivačního media a vykazuje β-l,3-D-glukanasovou aktivitu (obr.6) odpovídající homologickému VITCALTINU (z divokého kmene DSM 12865).

·»· «· · »· «« » » * · ♦ · · ···<

Příklad 11

Pokusy s heterologickou expresí VITCALTINU a ZYGOCINU v dělících se kvasinkách Schizosaccharomyces pombe

Vzhledem k tomu, že dělící se kvasinky jak ve formě intaktní buňky tak i jako sféroplast bez buněčné stěny jsou vůči VITCALTINU a ZYGOCINU rezistentní, jsou vhodné jako hostitelské buňky pro heterologickou expresi těchto toxinů. Aby bylo zaručeno, že tyto rekombinantní toxiny se v dělících se kvasinkách nejenom exprimuji, ale že se dostávají i do intracelulární sekreční cesty a tím se secernuji do vnějšího akultivačního media, byl zkonstruován vektor (ρΤΖ/ατ; obr.7), který je nositelem funkčního signálu pro sekreci a zpracování v S.pombe (S/P), a který pochází z cDNA virálního K28-preprotoxingenu kvasinek S.cerevisiae [viz Schmitt, 1995; Schmitt a Tipper, 1995]. Tento sekreční a procesní signál zajišťuje, že se vždy in-frame zařazený cizorodý protein v dělicích se kvasinkách importuje do dutiny (Lumen) endoplaámatického retikula a tím se dostane do sekreční cesty kvasinek. Prostřednictvím Kex2p-štěpného místa na C-konci S/P oblasti se odštěpí požadovaný cizorodý protein v pozdním Golgiho prostoru v buňkách (in spátem Golgi-Kompartiment) působením vlastní kvasinkové Kex2p-endopeptidasy od svého intracelulárního transportního prostředku (Transport-Vehikel) a může být nakonec secernován jako biologicky aktivní protein (ZYGOCIN a/nebo VITCALTIN) do vnějšího kultivačního media.

Příklad 12

Srovnání biologické aktivity čištěného VITCALTINU a topických antimykotik Clotrimazol a Miconazol • · · • · »· * • *4 • · · · e · · · · ·

Vzhledem k tomu, že čištěný VITCALTIN vykazuje široké spektrum účinnosti a účinně ničí i lidské patogenní kvasinky a/nebo houby, má značný význam i jako potenciální antimykotikum. Proto byly provedeny studie, při nichž byl VITCALTIN srovnáván s velmi často používanými topickými antimykotiky Clotrimazol a Miconazol. Nejprve bylo testováno toxické působení Clotrimazolu a Miconazolu při MBA-agarovém difúzním testu, při němž byly jako indikátorové kvasinky použity Sporothrix spec. Přitom byl Clotrimazol rozpuštěn na koncentraci 10 mg/ml v ethanolu (96%); tento základní roztok byl zředěn redestilovanou vodou a použit vždy po 100 μΐ při MBA-testu v koncentracích od 0,1 do 10 mg/ml. Průměr inhibičního dvorce (Hemmhof) byl při použitém množství 10

- 50 pg Clotrimazolu mezi 12 a 32 mm. Z Miconazolu byl připraven základní roztok 100 pg/ml v DMSO (100%), který byl při MBA-testu sledován stejným způsobem jako u Clotrimazolu na biologickou aktivitu vůči Sporothrix spec. Použití 0,08

- 0,3 pg Miconazolu vedlo při Bioassay k inhibičním dvorcům o průměru mezi 22 a 36 mm. Biologická aktivita 10 pg Clotrimazolu resp. 0,08 g Miconazolu odpovídala toxicitě 2 g čištěného VICALTINU. Z porovnání těchto tří zkoušených sloučenin vztaženého na jejich molekulové hmotnosti vyplývá, že VICALTIN již v koncentraci 0,07 pmol vykazuje stejnou aktivitu jako 0,2 pmol Miconazolu a 29 pmol Clotrimaziolu; to znamená, že VICALTIN je jako antimykotikum vysoce účinný (obr. 8) .

Příklad 13

Důkaz VICALTIN-kódujídího UCT-genu kvasinek W. californica 3/57 (DSM 12865) pomocí Southern-hybridizace s genově-specifickou DNA-sondou • · 9 • · *

Pro důkaz toho, že nukleovou kyselinu podle SEQ ID No.l je možno použít pro přípravu VICALTIN-specifické DNA-sondy pro následující Southern-hybridizaci, byla DIG-značená, 930 bp dlouhá DNA-sonda použita pro důkaz HLT-genu nakloňovaného do vektoru pSTHl. Konstruovaný vektor pSTHl představuje derivát obecně dostupného prokaryotického klonovacího vektoru pBR322.

Výsledky elektroforézy na agarosovém gelu uvedené v obr 9 a příslušné Southern-Blot-analýzy nepochybně prokázaly, že VICALTIN-kódující WCT-gen je možno pomocí sondy připravené z nukleových kyselin prokázat.

Příklad 14

Northern-Blot-analýza pro důkaz transkripční indukce VICALTIN-kódujícího UCT-genu kvasinek Williopsis californica 3/57 (DSM 12865) pomocí β-1,3-D-glukanu

Pro důkaz WCT-transkripce indukované β-1,3-D-glukanem byl kultivován kmen kvasinek DSM 12865 ve 300 ml BAVC-media resp. v BAVC-mediu s přídavkem 0,03% přírodního β-l,3-Dglukanu laminarinu po dobu 48 hodin při teplotě 20 °C za mírného třepání (60 ot./min.) a postupně byl v různých intervalech použit pro přípravu celkové RNA. Všechny vzorky (10 ml) byly před izolací RNA upraveny na stejný počet buněk

Q

1,8 x 10 buněk/ml a potom byly tyto vzorky elektroforeticky děleny v denaturujících agarosa-formaldehydových gelech. Jak vyplývá z obr. 10, bylo možno prokázat jak za neindukčních podmínek (BAVC-medium bez přídavku) tak i v laminarinem obohaceném BAVC-mediu, že UCT-transkript má velikost 1 100 bází. Bez přídavku glukanu bylo dosaženo maximální exprese • ·

WCT ke konci fáze exponenciálního růstu (po 19 hodinách); podstatně slabší hybridizační signály ve stacionární fázi růstu ukazují na zeslabenou transkripci. Při indukujících podmínkách kultivace (za přítomnosti laminarinu) vykázal HUT-transkript po 10 hodinách podstatně vyšší intenzitu než v neindukujícím kultivačním mediu, z čehož vyplývá, že tato transkripce VICALTINEM kódovaného WCT-genu může být vyvolána přídavkem β-l,3-D-glukanu.

Dodatek k příkladům provedení vynálezu

Media a roztoky použité v příkladech:

a) BAVC-medium

glukosa	50 g/1
D,L-j ablečnan	20 g/1
trinatriumcitrát	0,5 g/1
(nh4)2so4	1,5 g/1
MgS04	1,0 mg/l
myoinosit	0,04 g/1
základní roztok aminokyselin (lOx)	200 ml/1
základní roztok stopových prvků (lOOx)	10 ml/1
základní roztok vitaminů (lOOx)	20 ml/1

b) základní roztok aminokyselin (lOx)
alanin	0,75 g/1
argininmonohydrochlorid	3,5 g/1
asparagová kyselina	0,5 g/1
glutamová kyselina	3 g/1
histidinmonohydrochlorid	0,2 g/1

• · · «· · • · · ♦ · · · • · · · · * · • ······· · · • · · · · · • · · ·» «· ·

methionin serin threonin tryptofan	0,4 g/l 0,5 g/l 2 g/l 0,4 g/l
c) základní roztok stopových prvků	(lOOx)
boritá kyselina	200 mg/1
FeCl3.6 H20	200 mg/1
ZnS04.7 H20	200 mg/1
aici3	200 mg/1
CuSO4.5 H20	100 mg/1
Na2Mo04.2 H20	100 mg/1
lí2so4.h2o	100 mg/1
KJ	100 mg/1
hydrogenvinan draselný	2 g/l

d) základní roztok vitaminů (lOOx)

4-aminobenzoová kyselina	20	mg/1
biotin	2	mg/1
listová kyselina	2	mg/1
nikotinová kyselina	100	mg/1
pyridoxolhydrochlorid	100	mg/1
riboflavin	50	mg/1
thiaminiumdichlorid	50	mg/1
Ca-D-pant othenát	100	mg/1

Biotin: byl rozpuštěn v roztoku 5 g KH₂PO₄ v 50 ml destilované vody ··· «· · ·· ·· • » · ♦ · · · · ·· • ······· · · ·· · • · · · · ··· ·· ····

Listová kyselina: byla rozpuštěna v 50 ml destilované vody s přídavkem několika kapek zředěného NaOH.

Riboflavin: byl rozpuštěn za zahřívání v 500 ml destilované vody s několika kapkami HCI.

Ostatní vitaminy jsou rozpustné v malém množství destilované vody.

Hodnota pH BAVC-media byla upravena přídavkem KOH na pH 4,7. Glukosa a základní roztoky byly sterilovány odděleně. Základní roztoky aminokyselin, vitaminů a stopových prvků byly sterilovány po dobu 20 minut proudem páry při 100 °C a potom bylo přidáno BAVC-medium upravené v autokloávu.

Vysvětlení obrázků na výkresech a nejdůležitějších sekvencí

SEQ ID No.l: DNA- a odvozená aminokyselinová sekvence

WCT-kódovaného proteintoxinů VICALTINU z kvasinek Williopsis californica kmen 3/57.

SEQ ID No.2: cDNA- a odvozená aminokyselinová sekvence ZBT-kódovaného proteintoxinů ZYGOCINU z kvasinek Z.bailii .

Obr.l: N-terminální aminokyselinové sekvence W.

californica-toxinu VICALTINU a endo-β-1,3-glukanasy BgI2 z kvasinek S. cerevisiae. Tučně jsou vytištěny jednotlivé odchylky jinak stejných dílčích sekvencí (BgI2p- sekvence jak uvádějí Klebl a Tanner, 1989).

Obr.2: Kinetika usmrcování buněk senzitivních kvasinek S.cerevisiae 192.2 VICALTINEM za přítomnosti (2a)

a nepřítomnosti (2b) β-D-glukanu laminarinu (L) a pustulanu (P). Použitý toxin měl celkovou aktivitu 4,0 x 10$ E/ml při specifické aktivitě 4,2 x 10⁵ E/mg proteinu.

Obr. 3 (a,b,c,d): Agarový difuzní test pro důkaz senzitivity/rezistence vůči VICALTINU u Krel⁺ a Krel^- kmenů kvasinek S.cerevisiae. Po transformaci VICALTIN-rezistentního kreř-nulmutantu S.cerevisiae SEY6210[ krel} s KRE1- nesoucím vektorem pPGK[KR£7] byla opět obnovena plná citlivost vůči VICALTINU.

Obr. 4: (A) Gelová elektroforéza (SDS-PAGE) ZYGOCINU produkovaného a secernovaného kvasinkami Z. bailii kmen 412 (DSM 12864) po afinitní chromatografií na mannoprotein-Sepharose. (B) Agarový difúzní test pro důkaz biologické aktivity čištěného killer-toxinu ZYGOCINU.

Obr. 5: Schéma struktury ZBT- resp. WCT-nesouciho expresního vektoru pro přípravu transgenních rostlin.

[Vysvětlivky: RB, LB: pravé a levé okrajové (right and left border) sekvence přírodního TI-plasmidů z Agrobacterium tumefaciens; CaMV-P: 35S promotor viru květákové mozaiky; NOS-P, NOS-T: transkripční promotor a terminátor nopalinsynthasy; kan : kanamycm-rezistentní gen ze Streptococcus pro selekci v E. coli; NPT-II:

neomycin-fosfotransferasový gen z transposonu Tn5 pro selekci v rostlině].

Obr. 6:

(A) Parciální restrikčni karta episomálního vektoru pSTH2 pro heterologickou expresi VICALTIN-kódujícího toxingenu WUT v kvasinkách Saccaromyces cerevisiae. Vektor pSTH2 je konstruovaný plasmid vycházející z komerčně

dostupného 2μ Multi-Copy-vektoru pYX242, ve kterém je WCT-gen klonován z kmene DSM 12865 jako 930 bp EcoRI/Smál-fragment.

Příslušný toxingen podléhá transkripční kontrole vlastního kvasinkového TPI-promotoru a umožňuje tak po transformaci v S.cerevisiae intenzivní a konstitutivní expresi VICALTINU.

(B) Gelová elektroforéza (SDS-PAGE; 10 - 22,5%ní gradientový gel) koncentrovaného supernatantu kultivačního media

S.cerevisiae po transformaci s konstruovaným

VICALTIN-expresním vektorem pSTH2 (záznam /Spur/ 1).

VICALTIN heterologicky exprimovaný v S. cerevisiae je označen šipkou.

(C) Důkaz extracelulární β-1,3-glukanasové aktivity kvasinek S.cerevisiae po transformaci s VICALTIN-exprimujícím kvasinkovým vektorem pSTH2. Pro stanovení exo-β-Ι,3-glukanasové aktivity byly kvasinkové kolonie kultivované na bezleucinovém SC-agaru postříkány 0,04%ním 4-methylumbelliferyl^-D-glukosidem (MUG) v 50 mM natriumacetátovém pufru (pH 5,2). Po inkubaci při 37 °C po dobu 30 minut byly agarové desky ozářeny UV-světlem (vlnová délka 254 nm). Glukanasová aktivita byla prokázána fluorescencí na základě MUG-hydrolýzy.

[Vysvětlivky: 1 a 4, S.cerevisiae transformované vektorem (pEP-VCT), který exprimuje VICALTIN-kódující UCT-gen za působení vlastního promotoru; 2, kvasinky divokého typu W. californica 3/57 (DSM 12865); 3. divoké kvasinky W. californica 3/111; 5, S. cerevisiae po transformaci s VICALTIN-exprimujícím vektorem pYX-VCT; 6, S.cerevisiae transformované se základním vektorem pYX242 (bez toxingenu)].

Obr.7: Schéma struktury vektoru pTZ α/τ pro heterologickou expresi a sekreci cizorodých proteinů (zejména VICALTINU a ZYGOCINU) v dělících se kvasinkách Schizosaccaromyces pombe.

[Vysvětlivky: , T_nnrti, transkripční promotor a terminátor nmtl genu dělících se kvasinek S. pombe regulovaný thiaminem; S/P sekreční a procesní sekvence virálního K28-preprotoxinu pučících kvasinek S.cerevisiae·, arsl, automomně se replikující sekvence z chromosomu 1 dělících se kvasinek; leu2, leucin-2-markerový gen pro selekci leucin-prototrofních transformantů S.pombe].

Obr 8: porovnání biologické aktivity čištěného VICALTINU, Clotrimazolu a Miconazolu; uvedená molární množství vyvolala při Bioassay (agarový difuzní test) vůči senzitivním indikačním kvasinkám Sporothrix spec. průměr inhibičního dvorce 12 mm.

Obr. 9: Důkaz VICALTIN-kódujícího WCT-genu kvasinek

W. californica 3/57 (DSM 12865) klonovaného v pSTHl (derivát pBR322) provedený pomocí elektroforézy na agarosovém gelu (A) a pomocí Southern-hybridizace s DIG-značenou WCT-sondou (B) .

[Vysvětlivky: DIG-značený DNA-délkový standard II;

záznam 1, pSTHl restringovaný s .EcoRI a Sa/I; záznam 2, DNA-marker Smart-ladder]

Obr. 10: Northern-analýza transkripční indukce

VICALTIN-kódujícího WCT-genu kvasinek W. californica 3/57 (DSM 12865) za neindukujících podmínek kultivace v BAVC-mediu (A) a za indukujících podmínek v BAVC-mediu ·* · ·· 4 ·· ·· • · · ···· ···· • · · · · · · · ₉ φ • ······· · · · I · φ ·· · · 4 ··» ·· ···· s přídavkem 0,03% laminarinu (B). Elektroforetické dělení celkové RNA izolované z kmene DSM 12865 bylo prováděno v denaturujícím agarosa/formaldehydovém gelu při konstantním napětí (7V/cm). RNA byla na nylonové membráně hybridizována proti VICALTIN-specifické DIG-značené sondě (630 bp) a detekována pomocí chemiluminiscence.

[Vysvětlivky: M, DIG-značený DNA-délkový standard I; záznamy 1-8 odpovídají dobám*odběru vzorků pro izolaci celkové RNA; záznam 1, 10 h, záznam 2, 15 h, záznam 3, 19 h, záznam 4, h, záznam 5, 33 h, záznam 6, 38 h, záznam 7, 43 h, záznam 8, 48 h.

Zkratky použité v textu

VCT Villiopsis Californica Toxin

ZBT Zygosaccharomyces Bailii Toxin

ZYGOCIN název; toxin secernovaný z DSM 12864

VICATIN název; toxin secernovaný z DSM 12865

Dále uvedené mikroorganismy použité podle tohoto vynálezu byly uloženy do mezinárodně uznávané Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Maschenroder Veg lb, 38124 Braunschweig, SRN, podle požadavků Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznání deponování mikroorganismů pro patentové účely (číslo uložení, datum uložení):

Wi lliopsis californica kmen 3/57 (DSM 12865) (09.06.1999) Zygosaccharomyces bailii kmen 412 (DSM 12864) (09.06.1999)

Claims (26)

1. Proteintoxiny získatelné z Milliopsis californica a/nebo Zygosaccharomyces bažIii.

2. Proteintoxiny podle nároku 1, získatelné z DSM 12864 a/nebo DSM 12865.

3. Proteintoxiny podle nároku 1 a 2, vyznačující se tím, že mají antimykotické a/nebo fungicidní účinky.

4. Proteintoxin podle některého z nároků 1 až 3 s glukanasovou aktivitou.

5. Proteintoxin podle nároku 4, vyznačující se tím, že se váže na β-l,6-D-glukan a vykazuje β-l,3-D-glukanasovou aktivitu a/nebo β-l,3-D-glukanosyltransferasovou aktivitu.

6. Nukleová kyselina kódující glukanasu a/nebo proteintoxin podle některého z nároků 1. až 5 s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID No 1 nebo SEQ ID No 2 nebo její funkční varianta a její části minimálně s 8 nukleotidy, přičemž SEQ ID No 1 nebo SEQ ID No· 2 je součástí tohoto nároku.

7. Nukleová kyselina podle nároku 6, vyznačující se tím, že tato nukleová kyselina je DNA nebo RNA, přednostně dvouvláknová DNA.

* · · * · « · · • · · · · · ·· • · · ·· · · · ······· · · · · ·

8. Nukleová kyselina podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že tato nukleová kyselina je DNA s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID No 1 s pozicí bází 1 až 951 nebo SEQ ID No 2 s pozicí bází 1 až 717, přičemž SEQ ID No 1 nebo SEQ ID No 2 je součástí tohoto nároku.

9. Nukleová kyselina podle nároku 8, vyznačující se tím, že tato nukleová kyselina obsahuje jednu nebo více regulačních oblastí, jako je promotor, enhancer, terminátor a/nebo 3’-terminální PolyA-sekvenci a/nebo Kex2p-endopeptidasové štěpné místo nezbytné pro intracelulární zpracování pro-toxinu a/nebo jedno nebo několik potenciálních N-glykosylačních míst.

10. Nukleová kyselina podle některého z nároků 8 až 9, získatelná z DSM 12864 a/nebo DSM 12865.

11. Nukleová kyselina podle některého z nároků 6 až 10, vyznačující se tím, že tato nukleová kyselina je obsažena ve vektoru, přednostně v expresním vektoru nebo v genově-terapeuticky účinném vektoru.

12. Způsob přípravy nukleové kyseliny podle některého z nároků 6 až 10, vyznačující se tím, že tato nukleová kyselina je syntetizována chemicky nebo je izolována pomocí sondy z genové banky.

13. Polypeptid s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID No 1 nebo SEQ ID No 2 nebo jeho funkční varianta a jeho části minimálně se šesti aminokyselinami.

14. Způsob přípravy polypeptidu podle nároků 1 až 5 a 13, vyznačující se tím, že se nukleová kyselina podle některého z- nároků 6 až 11 exprimuje ve vhodné hostitelské buňce.

15. Protilátka proti peptidu podle některého z nároků 1 až 5 a 13 .

16. Způsob přípravy protilátky podle nároku 15, vyznačující se tím, že se savec imunizuje polypeptidem podle nároku 7 a případně vzniklá protilátka se izoluj e.

17. Léčivo obsahující nukleovou kyselinu podle některého z nároků 6 až 10 nebo polypeptid podle některého z nároků 1 až 5 a 13 nebo protilátku podle nároku 15 a případně farmaceuticky přípustné přísady nebo pomocné látky.

18. Způsob přípravy léčiva pro léčení mykóz jako jsou povrchové, kutánní a subkutánní dermatomykózy, mykózy sliznic a systémové mykózy, zejména Candida-mykózy, vyznačující se tím, že nukleová kyselina podle některého z nároků 6 až 10 nebo polypeptid podle některého z nároků 1 až 5 a 13 nebo protilátka podle nároku 15 se kombinuje s farmaceuticky přípustnou přísadou nebo pomocnou látkou.

19. Diagnostikům obsahující nukleovou kyselinu podle některého z nároků 6 až 10 nebo polypeptid podle některého z nároků 1 až 5 a 13 nebo protilátku podle nároku 15 a případně vhodné přísady a/nebo pomocné látky.

20. Způsob přípravy diagnostika pro diagnózu mykóz, jako • · » · · · 9 • ··· · * · « • · · · · · • · · · · · · • · · « · · · ···· jsou povrchové, kutánní a subkutánní dermatomykózy, mykózy sliznic a systémové mykózy,· zejména Candida-mykózy, vyznačující se tím, že nukleová kyselina podle některého z nároků 6 až 10 nebo polypeptid podle některého z nároků 1 až 5 a 13 nebo protilátka podle nároku 15 se kombinuje s farmaceuticky přípustným nosičem.

21. Test pro identifikaci funkčních interaktorů obsahujících nukleovou kyselinu podle některého z nároků 6 až 10 nebo polypeptid podle některého z nároků 1 až 5 a 13 nebo protilátku podle nároku 15 a případně vhodné přísady a/nebo pomocné látky.

22. Použití nukleové kyseliny podle některého z nároků 6 až 10 nebo polypeptidu podle některého z nároků 1 až 5 a 13 pro identifikaci funkčních interaktorů.

23. Použití nukleové kyseliny podle některého z nároků 6 až

10 pro vyhledávání variant, vyznačující se tím, že se genová banka prohledává touto nukleovou kyselinou a nalezená varianta se izoluj e.

24. Použití polypeptidu podle některého z nároků 1 až 5 a 13 k ničení škodlivých kvasinek a hub v potravinách a v krmivech.

25. Způsob kultivace DSM 12864 a DSM 12865, vyznačující se tím, že se tento postup provádí v syntetickém B- a/nebo BAVC-mediu.

26. Použití nukleových kyselin podle některého z nároků 6 až

11 pro přípravu transgenních rostlin a rostlinných buněk.