DE19930959A1 - Neue Antimycotika und Fungizide, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die gentechnische Bereitstellung von Proteintoxinen aus Hefen - sogenannten Killerhefen - zur Bekämpfung von human- und pflanzenpathogenen Hefen und/oder Pilzen, wobei diese selektiv abgetötet werden. Die hohe Spezifität gewährleistet den Einsatz der Proteintoxine als Antimycoticum und/oder Fungizid. Zudem können derartige Proteintoxine zum Pflanzenschutz verwendet werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Antimycotika und Fungizide erhältlich aus Hefe, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.

Selektive Antimycotika haben größte Bedeutung, da Pilz- und/oder Hefe-bedingte Infektionen beim Menschen in den letzten Jahren stark zugenommen haben und ebenfalls in Lebens- und Futtermittel immer wieder zu unerwünschten Kontaminati­ on führen. Besonders schwerwiegende Folgen haben Mycosen bei immunsuppri­ mierten Patienten, deren zelluläres und humorales Abwehrsystem auf einem nicht voll funktionstüchtigen Niveau gehalten werden muß [Analssie, 1992; Meunier et al., 1992; Wingard, 1995]. Extrem Mycose-gefährdet sind HIV 1-infizierte Personen (AIDS), die im fortgeschrittenen Krankheitsstadium sehr häufig an opportunistischen Infektionen durch Human-pathogene Pilze und/oder Hefen sterben [Levy, 1993]. Die gegenwärtig zur Therapie solcher Infektionen eingesetzten Antimycotika (wie Am­ photerizin B, Fluconazol, Itraconazol, Ketoconazol) besitzen beträchtliche Neben­ wirkungen, da sie die strukturelle Integrität der eukaryotischen Cytoplasmamembran zerstören und dadurch ebenfalls den infizierten Wirtsorganismus schädigen [Hector, 1993]. Die Applikation herkömmlicher Antimycotika hat zudem in nur kurzer Zeit zu einer rapiden Zunahme an Fluconazol-Resistenzen geführt, die sich unter den hu­ manpathogenen Mikroorganismen rasch ausbreiten und ein immer größer werden­ des Problem darstellen [Cameron et al., 1993; Chavenet et al., 1994; Maenza et al., 1996; Pfaller et al., 1994; Rex et al., 1995; Troillet et al., 1993]. Es ist daher ein wichtiges Anliegen, Antimycotika zu entwickeln, die sich - ähnlich wie bakterielle Antibiotika - durch hohe Selektivität auszeichnen und möglichst nur humanpathoge­ ne Pilze und Hefen angreifen. Da jedoch die Mehrheit aller zellulären Prozesse bei höheren Organismen von Genprodukten gesteuert wird, die bei Eukaryoten ein ho­ hes Maß an funktioneller Homologie zeigen, ist es bislang nicht gelungen, "spezifisch-antifungale Antibiotika" zu entwickeln [Kurz, 1998; Komiyama et al., 1998].

Ein target von selektiven Antimycotika sind die β-1,3-D-Glukane der Hefezellwand, die für die mechanische und osmotische Stabilität der Zelle unerläßlich sind, jedoch in höheren Eukaryoten nicht vorkommen und daher als "Achillesverse" bei der Be­ kämpfung pathogener Hefen genutzt werden könnten [Roemer et ai., 1994]. Obwohl Substanzen, die selektiv in die Zellwandstruktur von Hefen und Pilzen eingreifen, somit von großem Interesse sind, wurden bislang noch keine Antibiotika-ähnlichen Hemmstoffe zur Behandlung von Mycosen eingesetzt. Während bakterielle Antibio­ tika-Produzenten bereits zu Beginn dieses Jahrhunderts entdeckt wurden, konnten ähnliche Effekte bei Hefen erst Anfang der Sechziger Jahre mit der Identifizierung sogenannter 'Killer'-Hefen beobachtet werden [Bevan & Makower, 1963]: Toxinpro­ duzierende 'Killer'-Stämme der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae produzieren und sezernieren sogenannte "Killertoxine" bezeichneten Proteine, welche sensitive Hefen in einem Rezeptor-abhängigen Prozeß abtöten [Bussey, 1991; Tipper & Schmitt, 1991]. Die Fähigkeit zur Toxinproduktion beruht bei S. cerevisiae auf einer Infektion mit Reovirus-ähnlichen Doppelstrang-RNA-Viren, die im Cytoplasma der Hefe stabil und in hoher Kopienzahl persistieren, ohne die eukaryotische Wirtszelle in erkennbarer Weise zu schädigen [Tipper & Schmitt, 1991]. Bei den drei bislang bekannten Killertoxinen (K1, K2, K28) der Hefe S. cerevisiae handelt es sich um nicht-glykosylierte aJß-Heterodimere, die von der infizierten Zelle als höhermoleku­ lare Präprotoxine translatiert und auf dem intrazellulären Sekretionsweg durch kom­ plexe Modifikationen zu den biologisch aktiven Killerproteinen prozessiert werden [Hanes et al., 1986; Dignard et al., 1991; Schmitt & Tipper, 1995]. Die toxische Wir­ kung der S. cerevisiae Toxine beruht entweder auf einer Zerstörung der Membra­ nintegrität (Toxine K1, K2) oder (wie im Falle von Killertoxin K28) auf einem Zellzy­ klus-Arrest mit gezielter Hemmung der DNA-Synthese [Bussey, 1991; Schmitt & Compain, 1995; Schmitt et al., 1996]. Obwohl sich Killertoxine der Klassen K1, K2 und K28 in ihren Wirkungsweisen und physikochemischen Eigenschaften deutlich voneinander unterscheiden, ist ihnen gemeinsam, daß sie enge Wirkungsspektren besitzen und überwiegend sensitive Hefen nahe verwandter Arten abtöten. Dieses eingeschränkte Wirkspektrum beruht darauf, daß die bislang charakterisierten Kil­ lertoxine der Bäckerhefe mit unterschiedlichen Rezeptor-Populationen auf den Ebe­ nen von Hefezellwand und Cytoplasmamembran interagieren müssen, um eine sen­ sitive Zielzelle abtöten zu können. Bei den primären Toxinrezeptoren der Hefezell­ wand handelt es sich entweder um stark verzweigte β-1,6-D-Glukane oder um die äußeren Mannotriose-Seitenketten eines Zellwand-Mannoproteins [Bussey, 1991; Schmitt & Radler 1987, 1988].

Neben den viralen Proteintoxinen der Hefen S. cerevisiae, Hanseniaspora uvarum, Zygosaccharomyces bailii und Ustilago maydis, wurden Killerstämme auch in den Gattungen Debaryomyces, Hansenula, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon, Pichia, Kluyveromyces, Torulopsis und Williopsis beschrieben [McCracken et al., 1994; Park et al., 1996; Schmitt & Neuhausen, 1994; Walker et al., 1995]. Die gene­ tische Grundlage des Killerphänomens beruht in diesen Hefen jedoch nicht auf vi­ ralen Genomen, sondern entweder auf linearen dsDNA-Plasmiden oder auf chro­ mosomalen Hefegenen [Schründer et al., 1994].

Intensive molekularbiologische Untersuchungen verschiedener Toxin­ produzierender "Killerhefen" haben gezeigt, daß die Sekretion toxischer Proteine ('Killertoxine') bei Hefen weitverbreitet ist und ein nicht zu unterschätzendes Poten­ tial bei der Entwicklung selektiver Antimycotika darstellt [Walker et al., 1995; Hod­ gson et al., 1995; Polonelli et al., 1986; Schmitt & Neuhausen, 1994; Neuhausen & Schmitt, 1996; Schmitt et al., 1997], jedoch konnten solche Proteintoxine bisher nicht bereitgestellt werden.

Daher ist es Aufgabe dieser Erfindung geeignete hochwirksame Proteintoxine mit antimycotischer oder fungizider Wirkung zur Bekämpfung von human und pflanzen­ pathogenen Hefen und/oder Pilzen bereitzustellen.

In überraschender Weise erweist sich nunmehr das hochwirksam produzierte und sezernierte Killertoxin WICALTIN (auch Proteintoxin) aus der Wildtyphefe Williopsis californica Stamm 3/57 (DSM 12865) und das viruskodierte ZYGOCIN (auch Pro­ teintoxin) der Hefe Zygosaccharomyces bailii (DSM 12864) als besonders geeignet zur Bekämpfung von human- und pflanzenpathogenen Hefen und/oder Pilzen. Zu­ dem können im Lebens- und Futtermittelbereich gefürchtete Schadhefen und Pilze abgetötet werden. Beide Proteintoxine besitzen daher das Potential als Antimycoti­ kum und/oder Fungizid zur Bekämpfung von Hefe und/oder Pilzinfektionen, insbe­ sondere Mycosen, eingesetzt zu werden. Diese Indikationen werden in der vorlie­ genden Erfindung durch Untersuchungen zur Wirkungsweise verifiziert. Die Toxin­ gene werden im Rahmen dieser Erfindung geeignet kloniert und sequenziert und somit wird ein Verfahren für die gentechnische Herstellung und Überexpression in Kultur von WICALTIN und ZYGOCIN etabliert.

Ein Gegenstand der Erfindung betrifft daher Proteintoxine erhältlich aus Williopsis californica, besonders bevorzugt der Stamm DSM 12865 und Zygosaccharomyces bailü, besonders bevorzugt der Stamm DSM 12864. Beide Stämme wurden am 09. Juni 1999 am DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b nach dem Budapester Ver­ trag hinterlegt (www.dsmz.de).

Im Rahmen dieser Erfindung sezernieren insbesondere DSM 12864 und DSM 12865 biologisch hochwirksame Proteintoxine, die aufgrund ihres breiten Wirkspek­ trums (siehe Beispiel 4 und 7) auch zahlreiche human- und pflanzenpathogene He­ fen und Pilze abtöten. Daher betrifft die Erfindung auch selektive Antimycotika oder Fungizide, in dem Sinne, daß es sich bei den Proteintoxinen - und den nachstehen­ den erfindungsgemäßen Polypeptiden und deren kodierenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere in der funktionellen Einheit eines Toxingens - um po­ tentielle Bio-Pharmaka handelt, die aufgrund ihrer spezifischen, rezeptorvermittelten Wirkung ausschließlich Hefen und/oder Pilze abtöten und für höhere Eukaryoten - und damit ebenfalls für den Menschen und Säugetierzellen- sowie Pflanzen, vor­ zugsweise Kulturpflanzen, völlig ungefährlich sind [Vgl. Pfeiffer et al., 1988].

Folgende human- und pflanzenpathogene sowie apathogene Hefen und 1 oder Pilze können selektiv abgetötet werden:
Zygocin-sensitive Hefearten: Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida vinit Nanseniaspora uvarum, Kluyveromyces marxianus, Metrischnikowia pilcherrima, Ustilago maydis, Debaryomyces hansenii Pichia anomala, Pichle jadinit Pichia membranefaciens, Yarrowia lipolytica und Zy­ gosaccharomyces rouxii.

Wicaltin-sensitive Hefearten: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropica­ lis, Debaryomyces hansenii Kluyveromyces lactis, Metschnikowia pulcherrima, Pichia anomala, Pichia jadinii, Saccharomyces cerevisiae, Sporthrix spec., Toru­ laspora delbrueckii Torulaspora pretoriensis, Yarrowia lipolytica und Zygosaccha­ romyces bailii.

Die besonders starke Aktivität des Wicaltin-produzierenden Hefestammes DSM 12865 beruht vermutlich auf dessen ausgeprägter Sekretionseffizienz, die im Ver­ gleich zu anderen Stämmen der gleichen Hefeart deutlich stärker ausgeprägt ist. Die 'Killer'-Eigenschaft des Zygocin-produzierenden Hefestammes DSM 12864 be­ ruht auf einer Infektion mit toxinkodierenden Doppelstrang-RNA-Viren (M_Zb-dsRNA), die stabil und in hoher Kopienzahl im Cytoplasma persistieren und die betreffende Hefe (Stamm DSM 12864) zur Produktion und Sekretion von Zygocin befähigen [Vgl. Schmitt & Neuhausen, 1994]. Andere Stämme der gleichen Art zeigten keine Toxinproduktion, da sie keine toxinkodierenden dsRNA-Viren im Cytoplasma beher­ bergen und somit phänotypisch als 'Nicht-Killer' zu klassifizieren sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Nukleinsäuren ko­ dierend für ein Proteintoxin - mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 1 und No 2 und einer Glucanase-Aktivität - oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 15 oder 20 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 100 Nukleotiden, vor allem mit minde­ stens 300 Nukleotiden (nachfolgend "erfindungsgemäße Nukleinsäure(n)" genannt).

Die vollständigen Nukleinsäuren kodieren für Proteintoxine, die nach intrazellulärer Prozessierung und Sekretion eine Größe von 309 Aminosäuren und eine molekula­ re Masse von 34 kDa (SEQ ID No 1) bzw. von 99 Aminosäuren und eine molekulare Masse von 10 kDa aufweisen (SEQ ID No 2). Die Expression der Nukleinsäure nach SEQ ID No 1 in der Hefe S. cerevisiae resultiert in einem rekombinanten WICALTIN, das als glykosyliertes Protein mit signifikanter β-1,3-D-Glukanase-Aktivität in den Kulturüberstand der Hefe sezerniert wird [Vgl. Beispiel 10]. Weitere Experimente gemäß der vorliegenden Erfindung bestätigten, daß es sich bei den erfindungsge­ mäßen Nukleinsäuren um Nukleinsäuren handelt, die im Falle von SEQ ID No 1 für ein Proteintoxin mit Glucanase - Aktivität und im Falle von SEQ ID No 2 für ein in vivo vermutlich O-glykosyliertes, als ZYGOCIN bezeichnetes Proteintoxin kodieren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind erhältlich aus DSM 12865 (SEQ ID No 1) und DSM 12864 (SEQ ID No 2).

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA, und insbesondere eine DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No 1 von Pos. 1 bis Pos. 947 und gemäß SEQ ID No 2 von Pos. 1 bis Pos. 713. Die beiden Positionen be­ stimmen gemäß der vorliegenden Erfindung den Start und das Ende des kodieren­ den Bereiches, d. h. die jeweils erste und letzte Aminosäure des betreffenden Le­ serasters.

Unter dem Begriff "funktionelle Variante" versteht man gemäß der vorliegenden Er­ findung eine Nukleinsäure, die funktionell mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäu­ ren verwandt sind. Beispiele verwandter Nukleinsäuren sind beispielsweise Nu­ kleinsäuren aus unterschiedlichen Hefezellen bzw. Stämmen und Kulturen oder al­ lelische Varianten. Ebenfalls umfaßt die vorliegende Erfindung Varianten von Nu­ kleinsäuren, die von verschiedenen Hefen/Hefestämmen oder anderen Infektion­ serregern wie Dermatophyten und Schimmelpilzen (gemäß dem DHS-System) stammen können.

Im weiteren Sinne versteht man unter dem Begriff "Varianten" gemäß der vorliegen­ den Erfindung Nukleinsäuren, die eine Homologie, insbesondere eine Sequenzi­ dentität von ca. 60%, vorzugsweise von ca. 75%, insbesondere von ca. 90% und vor allem von ca. 95% aufweisen.

Die Teile der erfindungsgemäßen Nukleinsäure können beispielsweise zur Herstel­ lung einzelner Epitope, als Sonden zur Identifizierung weiterer funktioneller Varian­ ten oder als Antisense-Nukleinsäuren verwendet werden. Beispielsweise eignet sich eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 8 Nukleotiden als Antisense-Nukleinsäure, eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 15 Nukleotiden als Primer beim PCR- Verfahren, eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 20 Nukleotiden für die Identifizie­ rung weiterer Varianten und eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 100 Nukleotiden als Sonde.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nu­ kleinsäure eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen und/oder eine Poly(A)- Sequenz, eine oder mehrere (für die intrazelluläre Pro-Protein-Prozessierung not­ wendige) Kex2p Endopeptidase Erkennungssequenzen sowie eine oder mehrere potentielle N-Glykosylierungsstellen. Die nicht-kodierenden Sequenzen sind regu­ latorische Sequenzen, wie Promotor- oder Enhancer-Sequenzen, zur kontrollierten Expression des kodierenden Toxingens, enthaltend die erfindungsgemäßen Nu­ kleinsäuren.

In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure daher in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor enthalten.

Die Expressionsvektoren können beispielsweise im Falle der Nukleinsäure nach SEQ ID No 2 prokaryotische und/oder eukaryotische Expressionsvektoren bzw. im Falleder Nukleinsäure nach SEQ ID No 1 ausschließlich eukaryotische Expressi­ onsvektoren sein. Die Expression der toxinkodierenden Nukleinsäure nach SEQ ID No 1 in Escherichia coli ist nicht möglich, da das betreffende, heterolog exprimierte Proteintoxin für die Bakterienzelle toxisch ist. Eine Klonierung der WICALTIN­ kodierenden Nukleinsäure nach SEQ ID No 1 ist in E. coli nur mit Plasmiden mög­ lich, die keinen Promotor tragen (z. B. mit Hilfe von Derivaten des Plasmids pBR322). Ein Beispiel für einen prokaryotischen Vektor, der eine heterologe Ex­ pression der ZYGOCIN-kodierenden Nukleinsäure nach SEQ ID No 2 erlaubt, ist der kommerziell erhältliche Vektor pGEX-4T-1, der in E. coli die Expression eines Gluthation-S-Transferase-ZYGOCIN-Fusionsproteins erlaubt. Ein weiterer Vektor für die Expression von ZYGOCIN in E. coli ist z. B. der T7 Expressionsvektor pGM10 (Martin, 1996), welcher für einen N-terminalen Met-Ala-His6-Tag kodiert, der eine vorteilhafte Reinigung des exprimierten Proteins über eine Ni²⁺-NTA-Säule ermög­ licht. Als eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae eignen sich z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767), für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren wie in EP-B1-0127839 oder EP-B1-0549721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. SV40-Vektoren, welche allgemein erhältlich sind.

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die Wirtszelle geeignete regulatorische Sequenzen, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (s. z. B. EP-B1-0154133), den ADH-2-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen (s. z. B. EP-B1-0127839) oder den frühen SV40- Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (Mouse Mammary Tumour Virus; Lee et al. (1981) Nature, 214, 228).

Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, vorzugs­ weise Adenovirusvektoren, insbesondere replikationsdefiziente Adenovirusvektoren, oder Adenoassoziierte Virusvektoren, z. B. ein Adenoassoziierter Virusvektor, der ausschließlich aus zwei insertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR) be­ steht.

Geeignete Adenovirusvektoren sind beispielsweise in McGrory, W. J. et al. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman, Y. et al. (1982) in "Eukaryotic Viral Vectors" (Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, New York; Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280; Karlsson, S. et al. (1986) EMBO J. 5, 2377 oder WO95/00655 beschrieben.

Geeignete Adeno-assoziierte Virusvektoren sind beispielsweise in Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. immunol. 158, 97; WO95/23867; Samulski, R. J. (1989) J. Virol, 63, 3822; WO95/23867; Chiorini, J. A. et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531 oder Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793 beschrieben.

Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert. Hierzu eignen sich Lipidmischungen wie bei Felgner, P. L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84, 7413; Behr, J. P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982; Felgner, J. H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 oder Gao, X. & Huang, L. (1991) Biochim. Bio­ phys. Acta 1189, 195 beschrieben. Bei der Herstellung der Liposomen wird die DNA ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die DNA vollständig von den Liposomen komplexiert wird.

In einer weiteren Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren da­ her in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor zur Herstellung von transgenen Pflanzen, enthalten. Da die beschriebenen Killertoxine WICALTIN und ZYGOCIN ein breites Wirkungsspektrum besitzen und auch pflanzenpathogene Hefen und Pilze abtöten, ist es möglich transgene Pflanzen bereitzustellen, die sich beispielsweise gegenüber einer Infektion mit dem Mais-pathogenen Erreger Usti­ lago maydis resistent verhalten. Ähnliche Versuche wurden bereits an Tabak- Pflanzen durchgeführt, die durch heterologe Expression des natürlicherweise viral kodierten Killertoxins KP4 von U. maydis in der Lage waren, das betreffende Pro­ teintoxin zu sezernieren und dadurch einen spezifischen Schutz gegen Infektionen mit bestimmten phytopathogenen Stämmen von U. maydis aufbauten (Park et al., 1996; Kinal et al., 1995; Bevan, 1984). Aufbauend auf kommerziell erhältlichen Transformationssystemen, die auf modifizierten Derivaten des natürlichen Ti- Plasmids von Agrobacterium tumefaciens beruhen, können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ebenfalls repräsentiert in den Toxingenen INCT und ZBT, in soge­ nannte bidirektionale pBl-Vektroen (Fa. CLONTECH) einkloniert und zur Herstel­ lung transgener Pflanzen eingesetzt werden. Die betreffenden Toxingene WCT und ZBT werden hierzu unter Transkriptionskontrolle des starken Blumenkohl- Mosaikvirus-Promotors (CaMV-P) gebracht. Der genauere Aufbau der zu konstruie­ renden Vektoren ist im Beispiel 9 schematisch dargestellt.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können beispielsweise chemisch anhand der SEQ ID No 1 und No 2 offenbarten Sequenzen oder anhand der in SEQ ID No 1 und No 2 offenbarten Peptidsequenzen unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z. B. Uhl­ man, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No. 4). Eine weitere Mög­ lichkeit, die erfindungsgemäße Nukleinsäure in die Hand zu bekommen, ist die Iso­ lierung aus einer geeigneten Genbank anhand einer geeigneten Sonde (s. z. B. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York). Als Sonde eignen sich beispielsweise einzelsträn­ gige DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 100 bis 1000 Nucleotiden, vorzugs­ weise mit einer Länge von ca. 200 bis 500 Nucleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300 bis 400 Nucleotiden, deren Sequenz aus der Nukleinsäurese­ quenz gemäß SEQ ID No 1 und No 2 abgeleitet werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die Polypeptide als solche mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 1 und No 2 oder einer funktionel­ len Variante davon, und Teile davon mit mindestens sechs Aminosäuren, vorzugs­ weise mit mindestens 12 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 65 Aminosäu­ ren und vor allem mit 309 Aminosäuren (SEQ ID No 1) und mit 99 Aminosäuren (SEQ ID No 2) (nachfolgend "erfindungsgemäße Polypeptid(e)" genannt). Bei­ spielsweise kann ein ca. 6-12, vorzugsweise ca. 8 Aminosäuren-langes Polypeptid ein Epitop enthalten, das nach Kopplung an einen Träger zur Herstellung von spe­ zifischen poly- oder monoklonalen Antikörper dient (siehe hierzu z. B. US 5,656,435). Polypeptide mit einer Länge von mindestens ca. 65 Aminosäuren kön­ nen auch direkt ohne Träger zur Herstellung von poly- oder monoklonalen Antikör­ per dienen.

Unter dem Begriff "funktionelle Variante" im Sinne der vorliegenden Erfindung ver­ steht man Polypeptide, die funktionell mit dem erfindungsgemäßen Peptid verwandt sind, d. h. eine Glucanase-Aktivität aufweisen. Unter Varianten versteht man auch allelische Varianten oder Polypeptide, die von verschiedenen Hefen 1 Hefestämmen oder anderen Infektionserregern wie Dermatophyten, Schimmelpilzen (gemäß dem DHS-System) stammen können.

Im weiteren Sinne versteht man darunter auch Polypeptide, die eine Sequenzho­ mologie, insbesondere eine Sequenzidentität von ca. 70%, vorzugsweise von ca. 80%, insbesondere von ca. 90%, vor allem von ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 2 haben. Ferner zählen hierzu auch Deletion des Polypeptids im Bereich von ca. 1-60, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptids wesentlich verändert wird. Daneben zählen hierzu auch Fusionsproteine, die die oben be­ schriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion einer Glucanase haben oder erst nach Abspaltung des Fusionsanteils die spezifische Funktion bekommen können. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit einem Anteil von insbesondere nicht-humanen Sequenzen von ca. 1-200, vorzugsweise ca. 1-150, insbesondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 Aminosäuren. Beispiele von nicht-humanen Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, z. B. aus der Galactosidase von E. coli oder ein sogenannter Hi­ stidin-Tag, z. B. ein Met-Ala-His₆-Tag. Ein Fusionsprotein mit einem sogenannten Histidin-Tag eignet sich besonders vorteilhaft zur Reinigung des exprimierten Pro­ teins über Metallionen-haltige Säulen, beispielsweise über eine Ni²⁺-NTA-Säule. "NTA" steht für den Chelator "nitrilotriacetic acid" (Qiagen GmbH, Hilden). Insofern umfaßt die Erfindung auch solche erfindungsgemäße Polypeptide die maskiert sind, im Sinne eines Proproteins oder im weitesten Sinne als Pre-drug.

Die Teile der erfindungsgemäßen Polypeptide repräsentieren beispielsweise Epito­ pe, die spezifisch von Antikörpern erkannt werden können.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden beispielsweise durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits beschrieben, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Wirtzellen zur Herstellung korrekt prozessierter und damit biologisch aktiver Proteintoxine eignen sich ausschließlich eukaryotische Organismen, vor­ zugsweise die Sproßhefe Saccharomyces cerevisiae und die Spalthefe Schizosac­ charomyces pombe.

Insbesondere die genannten Teile des Polypeptids können auch mit Hilfe der klas­ sischen Peptidsynthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden. Sie eignen sich insbesondere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpres­ sionsbanken durchsucht werden können, um so zu weiteren funktionellen Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids zu gelangen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wobei eine erfin­ dungsgemäße Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert und gegebe­ nenfalls isoliert wird.

Ganz besonders bevorzugt ist die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe, da sich diese Hefe natürlicherweise WICALTIN- und ZYGOCIN-resistent verhält und bereits mehrfach erfolgreich zur heterologen Expression von Fremdproteinen eingesetzt wurde [Giga-Hama & Kumagai (1997), in "Foreign Gene Expression in Fission Yeast: Schizosaccharomyces pombe", Springer Verlag]. Wie in Beispiel 11 ausge­ führt, können die toxinkodierenden Nukleinsäuren nach SEQ ID No 1 und SEQ ID No 2 beispielsweise in-den S. pombe Vektor pREP1 einkloniert werden [Maundrell (1990), J. Biol. Chem. 265: 10857-10864], in dem sie unter Transkriptions-Kontrolle des Thiaminregulierten nmtl Promotors der Spalthefe stehen [nmt = 'no message with thiamine'] Hefen, die mit einem solchen Vektor transformiert werden, exprimie­ ren das betreffende Fremdgen in Abhängigkeit von der jeweiligen Thiamin- Konzentration im Kulturmedium der Hefe. Hierdurch läßt sich gegebenenfalls die Phase des Hefewachstums von der Phase der Produktion des Fremdproteins zeit­ lich trennen, so daß es prinzipiell auch möglich ist, für die Hefe toxische Proteine zur Expression zu bringen. Um gleichzeitig eine Sekretion und damit eine deutlich leichtere Reinigung der in S. pombe heterolog exprimierten Toxine WICALTIN und ZYGOCIN zu ermöglichen, haben wir bereits einen Expressions-/Sekretions-Vektor konstruiert [Vektor pTZα/γ; siehe Beispiel 11], der das Sekretions- und Prozessie­ rungssignal des viralen K28-Präprotoxingens enthält [Schmitt & Tipper, 1995] und dadurch eine effektive Sekretion des jeweils 'in-frame' nachgeschalteten Fremdproteins ermöglicht.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auch auf Antikör­ per, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid spezifisch reagieren, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immunogen sind oder durch Koppelung an geeignete Träger, wie z. B. bovines Serumalbumin, immunogen ge­ macht bzw. in ihrer Immunogenität gesteigert werden können.

Die Antikörper sind entweder polyklonal oder monoklonal. Die Herstellung, die auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellt, erfolgt beispielsweise nach allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielswei­ se eines Kaninchens, mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder den genannten Teilen davon, gegebenenfalls in Anwesenheit von z. B. Freunds Adjuvant und/oder Aluminiumhydroxidgelen (s. z. B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein be­ kannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z. B. über Säulenchromatogra­ phie reinigen. Bevorzugt wird eine Affinitätsreinigung der Antikörper, bei der bei­ spielsweise das jeweilige Antigen (ZYGOCIN oder WICALTIN) kovalent an eine all­ gemein erhältliche CnBr-aktivierte Sepharose-Matrix gekoppelt und zur Reinigung der jeweils toxinspezifischen Antikörper eingesetzt wird.

Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293) hergestellt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel, das die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die erfindungsgemäßen Polypeptide (einzeln oder in Kombination) und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Mycosen, wie oberflächliche, kutane und subkutane Dermatomykosen, Schleimhaut- und Systemmykosen, besonders bevozugt Candida-Mykosen, bei dem eine erfin­ dungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit pharma­ zeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfsstoffen formuliert wird.

In Beispiel 12 ist ausgeführt, dass das von Stamm DSM 12865 produzierte und ge­ reinigte Toxin WICALTIN sogar eine deutlich stärkere Toxizität auf Hefen besitzt, als die im Vergleich getesteten und zur Therapie von Mycosen häufig eingesetzten, topischen Antimycotika Clotrimazol und Miconazol.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Arzneimittel im obigen Sinne enthaltend ein Antimycotikum oder ein Proteintoxin erhältlich aus DSM 12864 und/oder DSM 12865 und/oder erfindungsgemäße Polypeptide mit antimycotischer Wirkung.

Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel geeignet, das die erfindungsgemäße Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen komplexierter Form enthält.

Als geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe eignen sich z. B. eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren etc.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Diagnostikum ent­ haltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder erfindungsgemäße Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe und ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Mycosen, wie oberflächliche, kutane und subkutane Dermatomykosen, Schleimhaut- und Systemmykosen, besonders bevozugt Candida-Mykosen, bei dem eine erfin­ dungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder erfindungs­ gemäße Antikörper mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen versetzt werden.

Beispielsweise können gemäß der vorliegenden Erfindung anhand der erfindungs­ gemäßen Nukleinsäure ein Diagnostikum auf der Basis der Polymerasekettenreak­ tion (PCR-Diagnostik, z. B. gemäß EP-0200362) oder eines Northern und/oder Southern Blots, wie in Beispiel 13 näher beschrieben, hergestellt werden. Diese Tests beruhen auf der spezifischen Hybridisierung der erfindungsgemäßen Nuklein­ säure mit dem komplementären Gegenstrang üblicherweise der entsprechenden mRNA. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann hierbei auch modifiziert sein, wie z. B. in EP0063879 beschrieben. Vorzugsweise wird ein erfindungsgemäßes DNA- Fragment mittels geeigneter Reagenzien, z. B. radioaktiv mit α-P³²-dATP oder nicht­ radioaktiv mit Biotin, nach allgemein bekannten Methoden markiert und mit isolierter RNA, die vorzugsweise an geeignete Membranen aus z. B. Zellulose oder Nylon ge­ bunden wurde, inkubiert. Zudem ist es vorteilhaft, die isolierte RNA vor der Hybridi­ sierung und Bindung an eine Membran der Größe nach, z. B. mittels Agarose- Gelelektrophorese, aufzutrennen. Bei gleicher Menge an untersuchter RNA aus je­ der Gewebeprobe kann somit die Menge an mRNA bestimmt werden, die spezifisch durch die Sonde markiert wurde.

Ein weiteres Diagnostikum enthält das erfindungsgemäße Polypeptid bzw. die oben näher beschriebenen immunogenen Teile davon. Das Polypeptid bzw. Teile davon, die vorzugsweise an eine Festphase, z. B. aus Nitrocellulose oder Nylon, gebunden sind, können beispielsweise mit der zu untersuchenden Körperflüssigkeit z. B. Blut, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Antikörper reagie­ ren zu können. Der Antikörper-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter Antihuman-IgG- oder Antihuman-IgM-Antikörper nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispielsweise um ein Enzym, wie Per­ oxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwesenheit und die Menge an an­ wesenden Autoimmunantikörpern kann somit über die Farbreaktion leicht und schnell nachgewiesen werden.

Ein anderes Diagnostikum enthält die erfindungsgemäßen Antikörper selbst. Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise eine Gewebeprobe des Menschen leicht und schnell dahingehend untersucht werden, ob das betreffende Polypeptid vor­ handen ist. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antikör­ per-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymati­ sche Farbreaktion nachgewiesen werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Fungizid das die erfindungsge­ mäßen Nukleinsäuren und/oder die erfindungsgemäßen Polypeptide (einzeln oder in Kombination) und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines Fungizids zur Bekämpfung von Schadhefen und Schadpilzen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsge­ mäßes Polypeptid mit landwirtschaftlich annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfsstoffen formuliert wird.

Wie bereits beschrieben wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine transgene Pflanzen hergestellt, welche das erfindungsgemäße Proteintoxin exprimiert. Daher betrifft die Erfindung ebenfalls Pflanzenzellen sowie inhärent die transgene Pflanze als solche enthaltend die erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder Proteintoxine.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft auch einen Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren, wie z. B. Inhibitoren oder Stimulatoren, ent­ haltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder die erfindungsgemäßen Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

Ein geeigneter Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren, insbesondere sol­ cher, die in der sensitiven Hefezelle mit dem Proteintoxin ZYGOCIN nach SEQ ID No 2 wechselwirken, ist z. B. das sogenannte "Two-Hybrid System" (Fields, S. & Sternglanz, R. (1994) Trends in Genetics, 10, 286). Bei diesem Test wird eine Zelle, beispielsweise eine Hefezelle, mit einem oder mehreren Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das das erfin­ dungsgemäße Polypeptid und eine DNA-Bindedomäne eines bekannten Proteins, beispielsweise von Gal4 oder LexA aus E. coli, enthält und/oder ein Fusionsprotein exprimieren, das ein unbekanntes Polypeptid und eine Transkriptions- Aktivierungsdomäne, beispielsweise von Gal4, Herpesvirus VP16 oder B42, enthält. Zudem enthält die Zelle ein Reportergen, beispielsweise das LacZ-Gen aus E. coli, "Green Fluorescence Protein" oder die Aminosäure-Biosynthesegene der Hefe His3 oder Leu2, das durch regulatorische Sequenzen, wie z. B. den lexA- Promotor/Operator oder durch eine sogenannte "Upstream Activation Sequence" (UAS) der Hefe kontrolliert wird. Das unbekannte Polypeptid wird beispielsweise durch ein DNA-Fragment kodiert, das aus einer Genbank, beispielsweise aus einer humanen Genbank, stammt. Üblicherweise wird gleich eine cDNA-Genbank mit Hilfe der beschriebenen Expressionsvektoren in Hefe hergestellt, so daß der Test unmit­ telbar danach durchgeführt werden kann.

Beispielsweise wird in einem Hefe-Expressionsvektor die erfindungsgemäße Nu­ kleinsäure in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die lexA-DNA- Bindedomäne kloniert, so daß ein Fusionsprotein aus dem erfindungsgemäßen Po­ lypeptid und der LexA-DNA-Bindedomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. In einem anderen Hefe-Expressionsvektor werden cDNA-Fragmente aus einer cDNA-Genbank in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die Gal4- Transkriptions-Aktivierungsdomäne kloniert, so daß ein Fusionsprotein aus einem unbekannten Polypeptid und der Gal4-Transkriptions-Aktivierungsdomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. Die mit beiden Expressionsvektoren transfor­ mierte Hefe, die beispielsweise Leu2^- ist, enthält zusätzlich eine Nukleinsäure, die für Leu2 kodiert, und durch den LexA-Promotor/Operator kontrolliert wird. Im Falle einer funktionellen Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und dem unbekannten Polypeptid bindet die Gal4-Transkriptions-Aktivierungsdomäne über die LexA-DNA-Bindedomäne an den LexA-Promotor/Operator, wodurch dieser aktiviert und das Leu2-Gen exprimiert wird. Dies hat zur Folge, daß die Leu2^- Hefe auf Minimalmedium, das kein Leucin enthält, wachsen kann.

Bei Verwendung des LacZ- bzw. "Green Fluorescence Protein"-Reportergens an­ stelle eines Aminosäure-Biosynthesegens kann die Aktivierung der Transkription dadurch nachgewiesen werden, daß sich blau- bzw. grün-fluoreszierende Kolonien bilden. Die Blau- bzw. Fluoreszenzfärbung läßt sich aber auch leicht im Spectro­ photometer z. B. bei 585 nM im Falle einer Blaufärbung quantifizieren.

Auf diese Weise können Expressionsgenbanken leicht und schnell auf Polypeptide durchsucht werden, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid interagieren. An­ schließend können die gefundenen neuen Polypeptide isoliert und weiter charakte­ risiert werden.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des "Two-Hybrid-Systems" ist die Beeinflus­ sung der Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem be­ kannten oder unbekannten Polypeptid durch weitere Substanzen, wie z. B. chemi­ sche Verbindungen. Auf diese Weise lassen sich auch leicht neue wertvolle che­ misch synthetisierbare Wirkstoffe auffinden, die als Therapeutikum eingesetzt wer­ den können. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht nur auf ein Verfahren zum Auffinden von polypeptidartigen Interaktoren bestimmt, sondern erstreckt sich auch auf ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die mit dem oben beschriebenen Protein-Protein-Komplex interagieren können. Derartige peptidartige, wie auch chemische lnteraktoren werden daher im Sinne der vorliegenden Erfindungs als funktionelle Interaktoren bezeichnet, die eine inhibierende oder eine stimulierende Wirkung haben können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Proteintoxine mittels Kultivierung und Sekretion der Proteintoxine in ein Medium, welches ein synthetisches Kulturmedium (BAVC-Medium) darstellt, das eine chro­ matographische Reinigung der sezernierten Toxine wesentlich erleichtert [Vgl. Bei­ spiel 1 sowie Anhang zu Beispielen]. Im Falle des von Stamm DSM 12865 produ­ zierten und sezernierten WICALTINS läßt sich eine weitere Steigerung in der To­ xinproduktion erreichen, wenn das Medium durch Zusatz von des pflanzlichen (und allgemein erhältlichen) β-1,3-D-Glukans Laminarin in einer Endkonzentration von 1% supplementiert wird. Wie in Beispiel 14 ausgeführt, führt der Zusatz von Lamina­ rin zum Kulturmedium zu einer Induktion der WICALTIN-Produktion, die durch Nort­ hern-Analysen auf eine Induktion der Transkription zurückgeführt werden konnte.

Zur Produktion des von DSM 12864 sezernierten Toxins ZYGOCIN kann syntheti­ sches B-Medium eingesetzt werden [Vgl. Radler et al., 1993].

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung ohne die Erfin­ dung auf diese Beispiele zu begrenzen.

Beispiele Beispiel 1 Isolierung, Anreicherung und Reinigung des anti-Candida-Toxins WICALTIN aus Kulturüberständen der Killerhefe W. californica Stamm 3/57 (DSM 12865)

Das von der Killerhefe W. californica 3/57 sezernierte Killertoxin WICALTIN zeigt im Agardiffusionstest auf Methylenblau-Agar gegen sensitive Hefen eine optimale Hemmwirkung bei pH 4,7 und 20°C. In synthetischem Flüssigmedium zeigt die Kil­ lerhefe W. californica Stamm 3/57 eine maximale Toxinproduktion bei Kultivierung in BAVC-Medium (pH 4,7). Zur Toxinanreicherung wurde die Killerhefe zunächst für 24 h in 5 ml YEPD-Medium bei 30°C unter Schütteln inkubiert, anschließend vollstän­ dig in 200 ml BAVC-Medium überführt und erneut 48 h bei 20°C auf dem Schüttler (140 Upm) kultiviert. Vier Hauptkulturen zu je 2,5 l BAVC-Medium (pH 4,7 in 5 l Ei­ lenmeyer-Kolben) wurden mit der zweiten Vorkultur beimpft (1%-iges Inokulum) und fünf Tage bei 20°C unter leichtem Schütteln (60 Upm) bebrütet. Zur Konzentrierung des sezernierten Killertoxins wurde der zellfreie Kulturüberstand bei +4°C und ei­ nem Druck von 1 bar durch Ultrafiltration an Polysulfonsäure-Membranen ('EasyFlow' [Fa. Sartorius]; Ausschlußgrenze 10 kDa) 200-fach auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. Zur Entfernung niedermolekularer Verbindungen und Entsalzung des so gewonnenen Konzentrates wurde das Toxin über Nacht bei +4°C im Dialyse­ schlauch (Ausschlußgrenze 10-20 kDa) gegen 5 mM Citrat-Phosphat-Puffer (pH 4,7) dialysiert. Zur Lagerung des Toxinkonzentrates wurde das dialysierte Präparat über eine 0,2 µm Membran sterilfiltriert und in 1 ml Aliquots bei -20°C eingefroren. Nachweis und Eichung der Toxinaktivität erfolgten im Agardiffusionstest auf Methy­ lenblau-Agar (MBA; pH 4,7) gegen die sensitive Indikatorhefe Saccharomyces cere­ visiae 192.2d. Hierzu wurden vom Toxinkonzentrat logarithmische Verdünnungs­ stufen in 0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer (pH 4,7) hergestellt und zu jeweils 100 µl in zuvor ausgestanzte Löcher (Lochdurchmesser 9 mm) einer mit der sensitiven Indi­ katorhefe beimpften MBA-Platte (2 × 10⁵ Zellen/ml) einpipettiert. Nach dreitägiger Bebrütung der Platten bei 20°C wurden die deutlich sichtbaren Hemmhöfe ausge­ messen. Hierbei zeigte sich, daß zwischen dem Hemmhofdurchmesser und dem Logarithmus der Toxinkonzentration eine lineare Beziehung besteht. Einem (um den Lochdurchmesser korrigierten) Hemmhofdurchmesser von 20 mm wurde eine will­ kürliche Toxinaktivität von 1 × 10⁴ Einheiten/ml zugeordnet.

Die Reinigung des konzentrierten WICALTINS erfolgte entweder durch Kationen­ austausch-Chromatographie an Bioscale-S (FPLC) oder durch Affinitäts- Chromatographie an einer epoxyaktivierten Sepharose-6B-Matrix (Fa. Pharmacia), an die zuvor das pflanzliche β-1,6-D-Glukan Pustulan gekoppelt wurde. Das auf diese Weise in seiner spezifischen Aktivität 625-fach angereicherte Toxinpräparat (Tabelle 1) war gelelektrophoretisch rein und zeigte nach SDS-PAGE (im 10-22%- igen Gradientengel) nur noch eine einzelne Bande bei etwa 37 kDa, die gleicher­ maßen mit Coomassie-Blau (Proteinfärbung) und Perjodsäure-Schiffs-Reagenz (PAS; Kohlenhydratfärbung) nachweisbar war. Die positive PAS-Färbung deutet auf eine potentielle N-Glykosylierung des anti-Candida-Toxins WICALTIN hin. Durch Behandlung des gereinigten Toxins mit Endoglykosidase-H konnte bestätigt werden, daß WICALTIN einen N-glykosidisch verknüpften Kohlenhydratanteil von etwa 3 kDa besitzt, der in dieser Größe in Hefe ebenfalls auf eine einzige N- Glykosylierungsstelle im Proteintoxin hindeutet. Da das deglykosylierte WICALTIN eine deutlich eingeschränkte Toxizität aufweist, kann gefolgert werden, daß der Kohlenhydratanteil von WICALTIN vermutlich für die Bindung an die sensitive Ziel­ zelle notwendig ist und dadurch indirekt die biologische Aktivität des Toxins beein­ flußt.

Tabelle 1

Anreicherung von WICALTIN aus dem Kulturüberstand der Killerhefe Williopsis californica [UF, Ultrafiltration]

Beispiel 2 Bestimmung der NH₂-terminalen Aminosäuresequenz von WICALTIN und Nachweis einer enzymatischen β-1,3-Glukanase-Aktivität

Durch N-terminale Aminosäuresequenzierung des gereinigten Killertoxins wurden die ersten zehn Aminosäuren bestimmt. Wie aus Fig. 1 zu erkennen ist, weist der N-Terminus von WICALTIN eine signifikante Homologie zum Aminoterminus der vom BGL2 Gen der Hefe Saccharomyces cerevisiae kodierten Endo-β-1,3- Glucanase auf.

Aufgrund der ermittelten Homologie von WICALTIN zu Bgl2 wurde untersucht, ob im ungereinigten Toxinkonzentrat sowie im gereinigten Toxinpräparat eine Glucanase- Aktivität nachweisbar ist. Sowohl im enzymatischen Test mit dem β-1,3-D-Glucan Laminarin als Substrat als auch im Fluoreszenztest mit 4-Methyl-Umbelliferyl-β-D- Glucosid (MUC) als Substrat konnte in den WICALTIN-Präparaten eine deutliche β- 1,3-D-Glukanaseaktivität nachgewiesen werden; das ebenfalls getestete β-1,6-D- Glukan Pustulan wurde durch WICALTIN nicht hydrolysiert.

Beispiel 3 Überlebensraten WICALTIN-behandelter Hefezellen in Gegenwart und Abwe­ senheit von Zellwand-Glukanen: Kompetitionsanalysen

Sensitive Hefezellen des Stammes S. cerevisiae 192.2d, die in YEPD- Flüssigmedium (pH 4,7) bei 20°C in Gegenwart von 1 × 10⁵ E/ml gereinigtem WICALTIN kultiviert werden, zeigten die in Fig. 2 dargestellte Abtötungskinetik. Durch Zusatz des pflanzlichen β-1,6-D-Glukans Pustulan konnte die Überlebensrate toxinbehandelter Hefezellen signifikant gesteigert werden und führte in Konzentra­ tionen von 10 mg/ml zu einer vollständigen Aufhebung der WICALTIN-Toxizität. Im Unterschied zu Pustulan war das β-1,3-D-Glukan Laminarin nicht in der Lage, die Überlebensrate der toxinbehandelten Hefen zu steigern (Fig. 2).

Die dargestellten Befunde lassen somit darauf schließen, daß die Wirkung von WICALTIN eine Bindung an β-1,6-D-Glukane erfordert, die als primäre Andockstel­ len (Toxinrezeptoren) der Hefezellwand fungieren. In Übereinstimmung hiermit konnte gezeigt werden, daß sich Hefen mit einer Deletion im chromosomalen KRE1- Genlocus toxinresistent verhalten und nach Retransformation mit einem KRE1- tragenden episomalen Vektor wieder toxinsensitiv werden (Fig. 3). In kre1 Mutan­ ten beruht die Toxinresistenz auf einem deutlich verringerten β-1,6-D-Glukangehalt und einer dadurch bedingten Verringerung der zur letalen Wirkung notwendigen Toxinbindung an die Hefezelloberfläche.

Beispiel 4 Wirkungs- und Abtötungsspektren von WICALTIN

Im Agardiffusionstest zeigte das gereinigte W. californica Toxin WICALTIN eine ausgeprägte Toxizität gegen die in Tabelle 2 dargestellten Hefen. Mit Ausnahme von drei Stämmen der Hefe Candida krusei wurden alle 22 getesteten, klinischen Patientenisolate sowie alle weiteren Kontrollstämme humanpathogener Candida- Arten sehr effektiv durch WICALTIN abgetötet. Mit 14 toxinsensitiven Hefearten aus insgesamt 10 verschiedenen Gattungen zeigt WICALTIN ein für Killertoxine unge­ wöhnlich breites Wirkungsspektrum.

Tabelle 2

Wirkungsspektrum von WICALTIN auf pathogene und apathogene Hefen unterschiedlicher Gattungen. Alle Stämme wurden im Agardiffusionstest (MBA; pH 4,7) gegen gereinigtes WICALTIN getestet. Die applizierte Toxinaktivität betrug in allen Fällen 1 × 10⁶ E/ml. Der Stamm C. tropicalis (Patientennummer 541965) stammte von dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universi­ tätsklinik Mainz.

Beispiel 5 Klonierung, Sequenzierung und molekulare Charakterisierung des WICALTIN­ codierenden WCT Gens der Hefe W. californica Stamm 3157 (DSM 12865)

Aufbauend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz von WICALTIN wurden spezi­ fische DNA-Oligonukleotide hergestellt, die zur Identifizierung und Klonierung sowie zur molekularbiologischen Charakterisierung des chromosomal lokalisierten Toxin­ gens WCT führten. Die DNA-Sequenz von WCT (SEQ ID No. 1) zeigt einen einzel­ nen offenen Leserahmen, der für ein potentiell N-glykosyliertes Protein aus 309 Aminosäuren und einem errechneten Molekulargewicht von 34.017 Da kodiert. Un­ tersuchungen zur Wirkung des WCT kodierten Killertoxins machten deutlich, daß es sich bei WICALTIN um ein für Hefen äußerst toxisches Glykoprotein handelt, des­ sen primäres "target" die in Hefen vorkommenden Zellwand-β-1,3-D-Glukane sind. Seine selektive Toxizität auf Hefen und Pilze beruht darauf, daß WICALTIN in der sensitiven Zielzelle die Struktur und/oder Integrität der Zellwand zerstört und Hefen somit an ihrer empfindlichsten Stelle angreift und letztlich auch abtötet.

Beispiel 6 Anreicherung und Reinigung des Virustoxins ZYGOCIN aus Kulturüberständen der Killerhefe Z. bailii Stamm 412 (DSM 12864)

Das viruskodierte Killertoxin ZYGOCIN der Hefe Z. bailii Stamm 412 wurde entspre­ chend der von Radler et al. (1993) beschriebenen Methode aus dem Kulturüber­ stand der Killerhefe isoliert, durch Ultrafiltration konzentriert und schließlich durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Die in vorliegender Studie entwickelte Reini­ gung von ZYGOCIN in nur einem Schritt nutzt die natürliche Affinität des Toxins zu Zellwand-Mannoproteinen sensitiver Hefen. Das nach einer von Schmitt & Radler (1997) beschriebenen Methode aus S. cerevisiae Stamm 192.2d isolierte und teilge­ reinigte Mannoprotein wurde kovalent an eine epoxyaktivierte Sepharose-6B-Matrix (Fa. Pharmacia) gekoppelt und mittels FPLC zur säulenchromatographischen Toxin­ reinigung eingesetzt. Nach SDS-PAGE zeigte das in dieser Weise gereinigte, biolo­ gisch hoch aktive ZYGOCIN eine einzelne Proteinbande mit einem apparenten Mo­ lekulargewicht von etwa 10 kDa (Fig. 4).

Beispiel 7 Wirkungs- und Abtötungsspektrum von ZYGOCIN

Das im Agardiffusionstest bestimmte Wirkungsspektrum des viralen ZYGOCINS der Hefe Z. bailii 412 (DSM 12864) umfaßt pathogene und apathogene Hefegattungen, von denen Candida albicans und Sporothrix schenkii als Krankeitserreger bei Mensch und Tier, und Ustilago maydis und Debaryomyces hansenii als Schadhefen in der Landwirtschaft und im Lebensmittelbereich gefürchtet sind (Tab. 3).

Tabelle 3

Wirkungsspektrum von ZYGOCIN auf pathogene und apathogene Hefen unterschiedlicher Gattungen. Alle Stämme wurden im Agardiffusionstest (MBA; pH 4,5) gegen ein ZYGOCIN-Präparat mit einer Aktivität von 1 × 10⁴ E/ml getestet.

Beispiel 8 Klonierung und Sequenzierung des ZYGOCIN-codierenden ZBT Gens (ZBT,) der Hefe Z. bailii Stamm 412 (DSM 12864)

Die cDNA-Synthese des toxincodierenden Doppelstrang-RNA-Genoms der Killer­ hefe Z. bailii 412 erfolgte in Anlehnung an die von Schmitt (1995) beschriebene Methode mit gereinigter, durch Methylquecksilberhydroxid denaturierter M-dsRNA als Matritze und verschiedenen Hexanukleotiden als 'Primern'. Nach Ligation in den EcoRl-restringierten Vektor pUC18, Transformation in E. coli und Isolierung der re­ kombinanten Plasmide konnten mehrere cDNA-Klone identifiziert und sequenziert werden. Die cDNA-Sequenz des ZYGOCIN-kodierenden Leserasters (SEQ ID No 2) enthält die genetische Information für ein Vorläuferprotein (Pro-Toxin) aus 238 Ami­ nosäuren, welches in Aminosäureposition RR¹³⁹ eine potentielle Kex2- Endopeptidase-Spaltstelle trägt. Durch die in vivo im späten Golgi-Stadium erfol­ gende Kex2-vermittelte Pro-ZYGOCIN-Prozessierung entsteht das biologisch aktive ZYGOCIN, dessen Molekulargewicht (10 kDa; 99 Aminosäuren) und N-terminale Aminosäuresequenz exakt mit den für das gereinigte ZYGOCIN ermittelten Werten übereinstimmen.

Eine heterologe Expression der ZBT cDNA in der Hefe S. cerevisiae führte aufgrund der Toxizität von ZYGOCIN dazu, daß sich die transformierten Hefen durch ihr ei­ genes Toxin abtöteten. In Zukunft wird eine heterologe ZYGOCIN-Expression in der toxinresistenten Spalthefe Schizosacchlaromyces pombe angestrebt, da wie am Bei­ spiel des viralen K28-Toxins bereits gezeigt werden konnte, daß sich die Spalthefe besonders gut zur Expression und Sekretion von Fremdproteinen eignet.

Beispiel 9 Expression der Toxingene WCT und ZBT in transgenen Pflanzen

Da die beschriebenen Killertoxine WICALTIN und ZYGOCIN ein breites Wirkungs­ spektrum besitzen und auch pflanzenpathogene Hefen und Pilze abtöten, sollte es möglich sein transgene Pflanzen zu konstruieren, die sich beispielsweise gegen­ über einer Infektion mit dem Mais-pathogenen Erreger Ustilago maydis resistent verhalten. Ähnliche Versuche wurden bereits an Tabak-Pflanzen durchgeführt, die durch heterologe Expression des natürlicherweise viral kodierten Killertoxins KP4 von U. maydis in der Lage waren, das betreffende Killertoxin zu sezernieren und dadurch einen spezifischen Schutz gegen Infektionen mit bestimmten phytopatho­ genen Stämmen von U. maydis aufbauten (Park et al., 1996; Kinal et al., 1995; Be­ van, 1984). Aufbauend auf kommerziell erhältlichen Transformationssystemen, die auf modifizierten Derivaten des natürlichen Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefa­ ciens beruhen, können die von uns klonierten Toxingene WCT und ZBT in soge­ nannte bidirektionale pBl-Vektoren (Fa. CLONTECH) einkloniert und zur Herstel­ lung transgener Pflanzen eingesetzt werden. Die betreffenden Toxingene WCT und ZBT werden hierzu unter Transkriptionskontrolle des starken Blumenkohl- Mosaikvirus-Promotors (CaMV-P) gebracht. Der Aufbau der zu konstruierenden Vektoren ist in Fig. 5 schematisch dargestellt.

Beispiel 10 Heterologe Expression des WICALTIN-kodierenden WCT Gens der Hefe W. californica 3/57 (DSM 12865) in S. cerevisiae

Zur heterologen Expression des WCT Gens in der Hefe S. cerevisiae wurde das WICALTIN-kodierende WCT Gen als 930 bp EcoRl/Smal-Fragment in den allge­ mein erhältlichen 2µ Vektor pYX242 einkloniert. Der resultierende Vektor pSTH2 (Fig. 6) enthält das Toxingen unter Transkriptionskontrolle des hefeeigenen Trio­ se-Phosphat-Isomerase-Promotors (TPI) und ermöglicht dadurch nach Transforma­ tion in Hefe (S. cerevisiae) eine konstitutive Expression von WICALTIN. Eine gele­ lektrophoretische Analyse des Kulturüberstandes der auf diese Weise erhaltenen Hefetransformanten zeigte, daß das rekombinante WICALTIN in das Außenmedium sezerniert wird und eine dem homologen WICALTIN (aus Wildtyp-Stamm DSM 12865) entsprechende -1,3-D-Glukanase-Aktivität besitzt (Fig. 6).

Beispiel 11 Versuche zur heterologen Expression von WICALTIN und ZYGOCIN in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Da sich die Spalthefe sowohl als intakte Zeile als auch als zellwandfreier Spha­ eroplast resistent gegen WICALTIN und ZYGOCIN verhält, ist sie als Wirt zur he­ terologen Expression der betreffenden Toxine geeignet. Um zu gewährleisten, daß die rekombinanten Toxine von der Spalthefe nicht nur exprimiert, sondern gleichzei­ tig auch in den intrazellulären Sekretionsweg eingeschleust und damit in das Au­ ßenmedium sezerniert werden, wurde ein Vektor konstruiert (pTZα/γ; Fig. 7), der ein in S. pombe funktionelles Sekretions- und Prozessierungs-Signal (S/P) trägt, welches aus der cDNA des viralen K28-Präprotoxingens der Hefe S. cerevisiae stammt [Vgl. Schmitt, 1995; Schmitt & Tipper, 1995]. Das Sekretions- und Prozes­ sierungssignal gewährleistet, daß das jeweils 'in-frame' nachgeschaltete Fremdprotein in der Spalthefe in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums importiert und damit in den Sekretionsweg der Hefe eingeschleust wird. Durch die am C-Terminus der S/P-Region vorhandene Kex2p-Spaltstelle wird das gewünschte Fremdprotein in einem späten Golgi-Kompartiment durch die hefeeigene Kex2p- Endopeptidase von seinem intrazellulären 'Transport-Vehikel' abgespalten und kann schließlich als biologisch aktives Protein (ZYGOCIN und/oder WICALTIN) in das Außenmedium sezerniert werden.

Beispiel 12 Vergleichende biologische Aktivitäten von gereinigtem WICALTIN und der to­ pischen Antimycotika Clotrimazol und Miconazol

Da gereinigtes WICALTIN ein breites Wirkungsspektrum besitzt und auch hu­ manpathogene Hefen und/oder Pilze effektiv abtötet, kommt ihm eine Bedeutung als potentielles Antimycotikum zu. Daher wurden mit WICALTIN vergleichende Studien zu den derzeit sehr häufig eingesetzten topischen Antimycotika Clotrimazol und Mi­ conazol durchgeführt. Zunächst wurde die toxische Wirkung von Clotrimazol und Miconazol im MBA-Agardiffusionstest gegen Sporothrix spec. als Indikatorhefe ge­ testet. Hierzu wurde Clotrimazol in einer Konzentration von 10 mg/ml in Ethanol (96%) gelöst; diese Stammlösung wurde mit H₂O_bidest verdünnt und in Konzentratio­ nen von 0,1 bis 10 mg/ml zu je 100 µl im MBA-Test eingesetzt. Der Hemmhofdurch­ messer lag bei einer eingesetzten Menge von 10-50 µg Clotrimazol zwischen 12 und 32 mm. Von Miconazol wurde eine Stammlösung von 100 µg/ml in DMSO (100%) hergestellt, die in gleicher Weise wie Clotrimazol im MBA-Test auf biologi­ sche Aktivität gegen Sporothrix spec. untersucht wurde. Der Einsatz von 0,08-0,3 µg Miconazol führte im 'Bioassay' zu Hemmhöfen zwischen 22 und 36 mm. Die biologi­ schen Aktivitäten von 10 µg Clotrimazol bzw. von 0,08 µg Miconazol entsprechen somit der Toxizität von 2 µg gereinigtem WICALTIN. Ein auf das Molekulargewicht der drei getesteten Verbindungen basierender Vergleich zeigt, daß WICALTIN be­ reits in einer Konzentration von 0,07 µmol die gleiche Aktivität zeigt wie 0,2 pmol Miconazol und 29 pmol Clotrimazol; bei WICALTIN handelt es sich somit um ein überaus wirksames Antimycotikum (Fig. 8).

Beispiel 13 Nachweis des WICALTIN-kodierenden WGT Gens der Hefe W. californica 3/57 (DSM 12865) durch Southern-Hybridisierung mit genspezifischen DNA-Sonde

Zum Nachweis, daß die Nukleinsäure nach SEQ ID No. 1 zur Herstellung einer WICALTIN-spezifischen DNA-Sonde für eine anschließende Southern- Hybridisierung eingesetzt werden kann, wurde eine DIG-markierte, 930 bp lange DNA-Sonde zum Nachweis des in den Vektor pSTH1 einklonierten WCT Gens ein­ gesetzt. Der konstruierte Vektor pSTH1 repräsentiert ein Derivat des allgemein er­ hältlichen, prokaryotischen Klonierungsvektors pBR322. Die in Fig. 9 dargestellte Agarosegelelektrophorese und der entsprechende Southern-Blot zeigen zweifelsfrei, daß mit der hergestellten Nukleinsäuresonde, das WICALTIN-kodierende WCT Gen nachgewiesen werden kann.

Beispiel 14 Northern-Blot Analyse zum Nachweis einer Transkriptions-Induktion des WICALTIN-kodierenden WCT Gens der Hefe Williopsis californica 3/57 (DSM 12865) durch β-1,3-D-Glukane

Zum Nachweis einer β-1,3-D-Glukan-induzierten WCT Transkription wurde der He­ festamm DSM 12865 in 300 ml BAVC-Medium bzw. in BAVC-Medium mit Zusatz von 0,03% des pflanzlichen β-1,3-D-Glukans Laminarin für 48 h bei 20°C und leichtem Schütteln (60 Upm) kultiviert und nach unterschiedlichen Zeiten zur Präparation der Gesamt-RNA eingesetzt. Alle Proben (10 ml) wurden vor der RNA-Isolierung auf eine gleiche Zellzahl von 1,8 × 10⁸ Zellen/ml eingestellt und in denaturierenden Aga­ rose-Formaldehydgelen elektrophoretisch aufgetrennt. Wie aus Fig. 10 zu erken­ nen ist, konnte sowohl unter nichtinduzierenden Bedingungen (BAVC-Medium ohne Zusatz) als auch im Laminarin-supplementierten BAVC-Medium für das WCT Transkript eine Größe von 1.100 Basen nachgewiesen werden. Ohne Glukanzusatz wurde gegen Ende der exponentiellen Wachstumsphase (nach 19 h) eine maximale WCT Expression erreicht; die in der stationären Wachstumsphase deutlich schwä­ cher werdenden Hybridisierungssignale deuten auf eine abgeschwächte Transkrip­ tion hin. Unter induzierenden Kulturbedingungen (in Gegenwart von Laminarin) zeigte das WCT Transkript nach 10 h eine deutlich höhere Intensität als in der nicht-induzierten Kultur, so daß gefolgert werden kann, daß die Transkription des WICALTIN-kodierenden WCT Gens durch Zusatz von β-1,3-D-Glukanen induziert werden kann.

Anhang Beispiele

Verwendete Medien und Lösungen in den Beispielen:
a.) BAVC-Medium
Glucose: 50 g/l
D,L-Malat: 20 g/l
tri-Natriumcitrat: 0,5 g/l
(NH₄)₂SO₄: 1,5 g/l
MgSO₄: 1,0 g/l
CaCl₂: 0,5 g/l
myo-Inosit: 0,04 g/l
Aminosäure-Stammlösung (10 ×) 200 ml/l Spurenelemente-Stammlösung (100 ×) 10 ml/l Vitamin-Stammlösung (100 ×) 20 ml/l
Mit:
b.) Aminosäure-Stammlösung (10 ×)
Alanin: 0,75 g/l
Argininmonohydrochlorid: 3,5 g/l,
Asparaginsäure: 0,5 g/l,
Glutaminsäure: 3 g/l
Histidiniummonochlorid: 0,2 g/l
Methionin: 0,4 g/t
Serin: 0,5 g/l
Threonin: 2 g/l
Tryptophan: 0,4 g/l,
c.) Spurenelement-Stammlösung (100 ×)
Borsäure: 200 mg/l
FeCl₃ × 6 H₂O: 200 mg/l,
ZnSO₄ × 7 H₂O: 200 mg/l
AlCl₃: 200 mg/l
CuSO₄ × 5 H₂O: 100 mg/l
Na₂MoO₄ × 2 H₂O: 100 mg/l
Li₂SO₄ x H₂O: 100 mg/l
KJ: 100 mg/l
Kaliumhydrogentartrat 2 g/l
d.) Vitamin-Stammlösung (100 ×)
4-Aminobenzoesäure: 20 mg/l
Biotin: 2 mg/l,
Folsäure: 2 mg/l
Nicotinsäure: 100 mg/l
Pyridoxolhydrochlorid: 100 mg/l
Riboflavin: 50 mg/l
Thiaminiumdichlorid: 50 mg/l
Ca-D-Panthothenat: 100 mg/l
Biotin: in 5 g KH₂PO₄/50 ml Aqua dest. lösen.
Folsäure: in 50 ml Aqua dest. unter Zusatz von einigen Tropfen verdünnter NaOH lösen.
Riboflavin: in 500 ml Aqua dest. und einigen Tropfen HOl unter Erwärmen lösen. Die übrigen Vitamine sind in wenig Aqua dest. löslich.

Der pH-Wert des BAVC-Mediums wurde durch Zusatz von KOH auf pH 4,7 einge­ stellt. Glucose und Stammlösungen wurden getrennt voneinander sterilisiert. Ami­ nosäure-, Vitamin- und Spurenelement-Stammlösung wurden 20 Minuten im stö­ menden Dampf bei 100°C sterilisiert und danach dem autoklavierten BAVC-Medium zugesetzt.

Figuren und die wichtigsten Sequenzen

SEQ ID No. 1: DNA- und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des WCT kodierten Proteintoxins WICALTIN der Hefe Williopsis californica Stamm 3/57.

SEQ ID No. 2: cDNA- und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des ZBT kodierten Proteintoxins ZYGOCIN der Hefe Z. bailii

Fig. 1: N-terminale Aminosäuresequenzen des W. californica Toxins WICALTIN und der Endo-β-1,3-Glucanase Bgl2 der Hefe S. cerevisiae. Im Fettdruck ist die ein­ zige Abweichung der ansonsten identischen Teilsequenzen dargestellt (Bgl2p- Sequenz nach Klebl & Tanner, 1989)

Fig. 2: Abtötungskinetik WICALTIN-behandelter Zellen der sensitiven Hefe S. ce­ revisiae 192.2d in Gegenwart (2a)und Abwesenheit (2b) der β-D-Glukane Laminarin (L) und Pustulan (P). Das eingesetzte Toxin hatte eine Gesamtaktivität von 4,0 × 10⁵ E/ml bei einer spezifischen Aktivität von 4,2 × 10⁵ E/mg Protein.

Fig. 3: Agardiffusionstest zum Nachweis einer WICALTIN-Sensitivität/Resistenz in Kre1⁺ und Kre1^- Stämmen der Hefe S. cerevisiae. Durch Transformation der WICALTIN-resistenten kre1 Nullmutante S. cerevisiae SEY6210[Δkre1] mit dem KRE1-tragenden Vektor pPGK[KRE1] wird die volle WICALTIN-Sensitivität wieder­ hergestellt.

Fig. 4: (A) Gelelektrophoretische Analyse (SDS-PAGE) des von der Hefe Z. bailii Stamm 412 (DSM 12864) produzierten und sezernierten ZYGOCINS nach Affinitäts- Chromatographie an Mannoprotein-Sepharose. (B) Agardiffusionstest zum Nach­ weis der biologischen Aktivität des gereinigten Killertoxins ZYGOCIN.

Fig. 5: Schematischer Aufbau eines ZBT bzw. WCT tragenden Expressionsvek­ tors zur Herstellung transgener Pflanzen.
[Erklärungen: RB, LB: 'right and left border'-Sequenzen des natürlichen Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens; CaMV-P: 35S Promotor des Blumenkohl- Mosaikvirus; NOS-P, NOS-T: Transkriptions-Promotor und -Terminator der Nopalin- Synthase; kan^R: Kanamycin-Resistenzgen aus Streptococcus zur Selektion in E. coli; NPT-II: Neomycin-Phosphotransferasegen aus dem Transposon Tn5 zur Se­ lektion in Pflanze].

Fig. 6: (A) Partielle Restriktionskarte des episomalen Vektors pSTH2 zur heterolo­ gen Expression des WICALTIN-kodierenden Toxingens WCT in der Hefe Saccha­ romyces cerevisiae. Vektor pSTH2 ist ein konstruiertes Plasmid auf der Basis des kommerziell erhältlichen 2 µ Multi-Copy-Vektors pYX242, in welches das WCT Gen aus Stamm DSM 12865 als 930 bp EcoRI/Smal-Fragment einkloniert wurde. Das betreffende Toxingen steht unter Transkriptionskontrolle des hefeeigenen TPI- Promotors und ermöglicht dadurch nach Transformation in S. cerevisiae eine starke und konstitutive Expression von WICALTIN.

(B) Gelelektrophoretische Analyse (SDS-PAGE; 10-22,5%-iges Gradientengel) konzentrierter Kulturüberstände von S. cerevisiae nach Transformation mit dem konstruierten WICALTIN-Expressionsvektor pSTH2 (Spur 1) und dem Grundvektor pYX242 (Spur 2). Das in S. cerevisiae heterolog exprimierte WICALTIN ist mit ei­ nem Pfeil gekennzeichnet.

(C) Nachweis einer extrazellulären β-1,3-D-Glukanase-Aktivität der Hefe S. cerevi­ siae nach Transformation mit dem WICALTIN exprimierenden Hefevektor pSTH2. Zur Bestimmung der Exo-β-1,3-D-Glukanase-Aktivität wurden die auf leucinfreiem SC-Agar kultivierten Hefekolonien mit 0,04% 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucosid (MUG) in 50 mM Na-Acetat-Puffer (pH 5,2) besprüht. Nach einer Inkubation bei 37°C für 30 min wurden die Agarplatten mit UV-Licht (Wellenlänge 254 nm) be­ strahlt. Die Glucanase-Aktivität wurde aufgrund der MUG-Hydrolyse durch Fluores­ zenz nachgewiesen.
[Erklärungen: 1 und 4, S. cerevisiae transformiert mit einem Vektor (pEP-WCT), der das WICALTIN-kodierende WCT Gen unter dessen eigenem Promotor exprimiert; 2, Wildtyphefe V. californica 3/57 (DSM 12865); 3, Wildtyphefe W. californica 3/111; 5, S. cerevisiae nach Transformation mit dem WICALTIN exprimierenden Vektor pYX- WCT; 6, S. cerevisiae transformiert mit dem Grundvektor pYX242 (ohne Toxingen)]

Fig. 7: Schema des strukturellen Aufbaus des Vektors pTZα/γ zur heterologen Ex­ pression und Sekretion von Fremdproteinen (insbesondere von WICALTIN und ZYGOCIN) in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe.
[Erklärungen: P_nmt1, T_nmt1, Transkriptions-Promotor und -Terminator des Thiamin­ regulierten nmtl Gens der Spalthefe S. pombe; S/P, Sekretions- und Prozessie­ rungssequenz des viralen K28-Präprotoxins der Sproßhefe S. cerevisiae; ars1, au­ tonom replizierende Sequenz aus Chromosom 1 der Spalthefe; leu2, Leucin-2- Markergen zur Selektion Leucin-prototropher Transformanten von S. pombe]

Fig. 8: Vergleichende biologische Aktivitäten von gereinigtem WICALTIN, Clotri­ mazol und Miconazol; die angegebenen molaren Mengen erzeugen im 'Bioassay' (Agardiffusionstest) gegen die sensitive Indikatorhefe Sporothrix spec. einen Hemmhof-Durchmesser von 12 mm.

Fig. 9: Nachweis des in pSTH1 (pBR322-Derivat) einklonierten WICALTIN­ kodierenden WCT Gens der Hefe W. californica 3/57 (DSM 12865) durch Agarose­ gelelektrophorese (A) und Southern-Hybridisierung mit einer DIG-markierten WCT Sonde (B).
[Erklärungen: M, DIG-markierter DNA-Längenstandard II; Spur 1, pSTH1 restringiert mit EcoRl und Sa/l; Spur 2, DNA-Marker "Smart-Ladder"]

Fig. 10: Northern-Analyse zur Transkriptions-Induktion des WICALTIN­ kodierenden WCT Gens der Hefe W. californica 3157 (DSM 12865) unter nicht­ induzierenden Kulturbedingungen in BAVC-Medium (A) und unter induzierenden Bedingungen in BAVC-Medium mit Zusatz von 0,03% Laminarin (B). Die elektro­ phoretische Auftrennung der aus Stamm DSM 12865 isolierten Gesamt-RNA er­ folgte in einem denaturierenden Agarose/Formaldehyd-Gel bei konstanter Span­ nung (7 V/cm). Die RNA wurde auf einer Nylonmembran gegen eine WICALTIN­ spezifische, DIG-markierte DNA-Sonde (630 bp) hybridisiert und durch Chemilumi­ neszenz detektiert.
[Erklärungen: M, DIG-markierter RNA-Längenstandard l; Spuren 1-8 entsprechen den Zeitpunkten der Probennahme zur Isolierung der Gesamt-RNA: Spur 1, 10 h; Spur 2, 1.5 h; Spur 3, 19 h; Spur 4, 24 h; Spur 5, 33 h; Spur 6, 38 h; Spur 7, 43 h; Spur 8, 48 h]

Im Text verwendete Abkürzungen

WCT = Williopsis Californica Toxin
ZBT = Zygosaccharomyces Bailii Toxin
ZYGOCIN = Eigenname sezerniertes Toxin aus DSM 12864
WICATIN = Eigenname; sezerniertes Toxin aus DSM 12865

Literaturnachweise

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Claims (26)

1. Proteintoxine erhältlich aus Williopsis californica und/oder Zygosaccharomy­ ces bailii.

2. Proteintoxine nach Anspruch 1, erhältlich aus DSM 12864 und/oder DSM 12865.

3. Proteintoxine nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese eine antimycotische und/oder fungizide Wirkung inne haben.

4. Proteintoxin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit der Aktivität einer Glucana­ se.

5. Proteintoxin nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es an β-1,6-D- Glukane bindet und β-1,3-D-Glucanase- und/oder β-1,3-Glucanosyltransferase- Aktivität besitzt.

6. Nukleinsäure kodierend für eine Glucanase und/oder für ein Proteintoxin ge­ mäß einer der Ansprüche 1-5 mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 1 oder SEQ ID No 2 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, wobei SEQ ID No 1 oder SEQ ID No 2 Teil des An­ spruchs ist.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA ist.

8. Nukleinsäure nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nu­ kleinsäure eine DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No 1 von Basenposition 1 bis 950 oder SEQ ID No 2 von Basenposition 1 bis 717 ist, wobei SEQ ID No 1 oder SEQ ID No 2 Teil des Anspruchs ist.

9. Nukleinsäure nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine oder mehrere regulatorische Regionen (Promotor, 'Enhancer', Terminator) und/oder eine 3'-terminale PolyA-Sequenz und/oder eine zur intrazellulären Pro-Toxinprozessierung notwendige Kex2p-Endopeptidase-Spaltstelle und/oder eine oder mehrere potentielle N-Glykosylierungsstellen enthält.

10. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 89 erhältlich aus DSM 12864 und/oder DSM 12865.

11. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor, enthalten ist.

12. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6-10 dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure chemisch synthetisiert oder an­ hand einer Sonde aus einer Genbank isoliert wird.

13. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 1 oder SEQ ID No 2 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Ami­ nosäuren.

14. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Ansprüchen 1-5 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6-11 in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird.

15. Antikörper gegen ein Polypeptid gemäß Anspruch 1-5 und 13.

16. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 15, dadurch ge­ kennzeichnet, daß ein Säugetier mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 7 im­ munisiert und gegebenenfalls die entstandenen Antikörper isoliert werden.

17. Arzneimittel enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6-10 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1-5 und 13 oder Antikörper gemäß An­ spruch 15 und gegebenenfalls pharmazeutisch annehmbare Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

18. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Mycosen, wie oberflächliche, kutane und subkutane Dermatomykosen, Schleimhaut- und Systemmykosen, besonders bevozugt Candida-Mykosen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6-10 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1-5 und 13 oder Antikörper gemäß Anspruch 15 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfs­ stoff formuliert wird.

19. Diagnostikum enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6-10 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1-5 und 13 oder Antikörper gemäß An­ spruch 15 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

20. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Mycosen, wie oberflächliche, kutane und subkutane Dermatomykosen, Schleimhaut- und Systemmykosen, besonders bevozugt Candida-Mykosen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6-10 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1-5 und 13 oder Antikörper gemäß Anspruch 15 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger versetzt wird.

21. Test zur Identifizierung von funktionellen Interaktoren enthaltend eine Nuklein­ säure gemäß einem der Ansprüche 6-10 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1-5 und 13 oder Antikörper gemäß Anspruch 15 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

22. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6-10 oder eines Polypeptids gemäß Anspruch 1-5 und 13 zur Identifizierung funktioneller Inter­ aktoren.

23. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6-10 zum Auffin­ den von Varianten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Genbank mit der ge­ nannten Nukleinsäure abgesucht und die gefundene Variante isoliert wird.

24. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1-5 und 13 gemäß einem der Ansprüche zur Bekämpfung von Schadhefen und Pilzen in Lebens- und Futtermittel.

25. Verfahren zur Kultivierung von DSM 12864 und DSM 12865, dadurch gekenn­ zeichnet, daß diese in synthetischem B- und/oder BAVC-Medium kultiviert wer­ den und anschließend mittels Ultrafiltration und Kationenaustausch- Chromatiographie und/oder Affinitäts-Chromatographie an Laminarin- Sepharose und/oder Mannoprotein-Sepharose gereinigt werden.

26. Verwendung der Nukleinsäuren gemäß einer der Ansprüche 6-11 zur Herstel­ lung von transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen.