SE505213C2 - Dideoxikarbocykliska nukleosidanaloger, farmaceutiska beredningar därav samt mellanprodukter - Google Patents

Description

¿v _. 505 ziz 2 zidovudin har allvarliga bieffekter och medför suppression av benmärg, vilket leder till en minskning i antalet vita blod- celler med uttalad anemi som följd och det finns därför ett behov av effektiva medel som är mindre cytotoxiska.

Vi har nu funnit en ny klass av nukleosidanaloger med anti- viral aktivitet. Följaktligen tillhandahålles enligt en första aspekt en förening med formeln (I) X I N O I \ / O t? I' \\ /°\\ /'\ / u) Z N N H0-CH2 0 \ \.( \. \ / .__,_.O vari X är väte, NRRl, SR, OR eller halogen; Z är väte, OR2 eller NRRl; R, Rl och R2 kan vara lika eller olika och utväljes bland väte, Cl_4alkyl och aryl; och farmaceutiskt godtagbara derivat därav.

En fackman på området inser att föreningarna med formeln (I) är cis-föreningar och vidare att cyklopentenringen av före- ningarna med formeln (I) innehåller två chirala centra (visade i formeln (I) genom *) och kan således existera i form av två optiska isomerer (dvs. enantiomerer) och blandningar därav innefattande racemiska blandningar. Alla sådana isomerer och blandningar därav innefattande racemiska blandningar inne- fattas inom ramen för uppfinningen. I föreningarna med formeln (I) är således antingen det chirala centret till vilket basen är fäst i R-konfiguration och det chirala centret till vilket CHZOH-gruppen är fäst är i S-konfiguration (nedan D-isomeren) eller det chirala centret till vilket basen är fästad är i S- konfiguration och det till vilket CHZOH-gruppen är fästad är i “f __ 3 asus 215 R-konfiguration (nedan L-isomeren). Lämpligen är föreningarna i form av antingen en racemisk blandning eller huvudsakligen den rena D-isomeren. D-isomererna kan åskådliggöras av formeln (Ia) É N rïfl \ï/ \\ Z/°\\N/ \N/ rio-w \ / .__- 0_._0 (Ia) vari X och Z har den i formeln (I) angivna definitionen. Refe- rens nedan till föreningar med formeln (I) innefattar före- ningar med formeln (Ia).

Det inses även av en fackman på området att vissa av förenin- garna med formeln (I) kan existera som ett antal tautomera former och alla sådana tautomerer är inbegripna inom ramen för uppfinningen.

Använt i detta sammanhang hänför sig uttrycket "halogen" till fluor, klor, brom och jod; när X är halogen är den företrä- desvis klor.

Använt häri betecknar "Cl_4alkyl" en rak eller grenad alkyl- kedja, exempelvis metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sek.-butyl och t-butyl. Lämpligen är Cl_4alkyl metyl.

Uttrycket "aryl" avser i detta sammanhang vilken som helst mono- eller polycyklisk aromatisk grupp och innefattar osub- stituerad och substituerad aryl (såsom fenyl, tolyl, xylyl, anisyl) och osubstituerad och substituerad aralkyl innefattan- de ar(Cl_4)alkyl, såsom fen(Cl_4)alkyl, exempelvis bensyl .* v'-f|.. 505 213 4 eller fenetyl.

I föreningarna med formeln (I) är Z företrädesvis amino.

I en föredragen klass av föreningar med formeln (I) är X OR, speciellt OH.

Enligt en ytterligare föredragen klass av föreningar med formeln (I) är X NRRl, speciellt NH2 eller väte.

Särskilt föredragna föreningar med formeln (I) är de vari Z är NH2 och X är H, NH2 eller, speciellt, OH. I synnerhet sådana föreningar har speciellt önskvärda terapeutiska kännetecken som antivirala medel.

Med "ett farmaceutiskt godtagbart derivat" menas alla farma- ceutiskt godtagbara salter, estrar, eller salter av sådana estrar, av föreningar med formeln (I) eller någon annan före- ning som vid administration till mottagaren har förmåga att ge (direkt eller indirekt) en förening med formeln (I) eller en antiviralt aktiv metabolit eller rest därav.

Föredragna estrar av föreningarna med formeln (I) innefattar karboxylsyraestrar, vari icke-karbonyldelen av estergruppen utväljes bland väte, rak eller grenkedjig alkyl (t.ex. metyl, etyl, n-propyl, t-butyl, n-butyl), alkoxialkyl (t.ex. metoxi- metyl),aralkyl (t.ex. bensyl), aryloxialkyl (t.ex. fenoxime- tyl), aryl (t.ex. fenyl valfritt substituerad med halogen, -alkyl eller C -alkoxi); sulfonatestrar såsom alkyl- C l-4 l-4 eller aralkylsulfonyl (t.ex. metansulfonyl); aminosyraestrar (t.ex. L-valyl eller L-isoleucyl) och mono-, di- eller tri- fosfatestrar.

Med hänsyn till de ovan beskrivna estrarna innehåller, om icke annat anges, vilken som helst av de närvarande alkylgrupperna företrädesvis l-18 kolatomer, speciellt l-4 kolatomer. Alla närvarande arylgrupper i sådana estrar innefattar företrädes- vis en fenylgrupp.

N l\ _ sos 213 Farmaceutiskt godtagbara salter av föreningarna med formeln (I) innefattar sådana som härleds från farmaceutiskt god- tagbara oorganiska och organiska syror och baser. Exempel på lämpliga syror innefattar saltsyra, bromvätesyra, svavelsyra, salpetersyra, perklorsyra, fumarsyra, maleinsyra, fosforsyra, glykolsyra, mjölksyra, salicylsyra, bärnstenssyra, toluen-p- sulfonsyra, vinsyra, ättiksyra, citronsyra, metansulfonsyra, myrsyra, bensoesyra, malonsyra, naftalen-2-sulfonsyra och bensensulfonsyra. Andra syror såsom oxalsyra kan, även om de inte i sig själva är farmaceutiskt godtagbara, användas vid framställningen av salter användbara som intermediat vid framställningen av föreningarna enligt uppfinningen och deras farmaceutiskt godtagbara syraadditionssalter.

Salter härledda från ändamålsenliga baser innefattar alkali- metall- (t.ex. natrium), alkaliska jordartsmetall- (t.ex. mag- nesium), ammonium- och NR4+- (vari R är Cl_4-alkyl) salter.

Hänvisningar häri till en förening enligt uppfinningen inne- fattar både föreningar med formeln (I) och deras farmaceutiskt godtagbara derivat.

Specifika föreningar med formeln (I) innefattar: (lw,4%)-4-(6-klor-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-karbinol; (la,4N)-4-(6-hydroxi-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-karbinol; (lu,4u)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-karbinol; (l«,4G)-4-(6-merkapto-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-karbinol; (la,4G)-4-(2-amino-6-klor-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-kar- binol; (lm,4q)-4-(2-amino-6-hydroxi-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl- karbinol, (la,.4a)-4-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-kar- binol; i form av en racemisk blandning eller en enkel enantiomer.

Föreningarna enligt uppfinningen besitter antingen i sig själva antiviral aktivitet och/eller är metaboliserbara till sådana föreningar. Speciellt är dessa föreningar effektiva vid Läf sos 213 6 inhibering av replikation av retrovirus innefattande humant retrovirus såsom humant immunbristvirus (HIV), det orsakande medlet till AIDS.

Vissa föreningar enligt uppfinningen, speciellt de vari Z är H, har även anticancer-aktivitet.

Enligt en ytterligare aspekt av uppfinningen tillhandahålles således en förening med formeln (I) eller ett farmaceutiskt godtagbart derivat därav, till användning som aktivt terapeu- tiskt medel, speciellt som antiviralt medel, exempelvis vid behandling av retrovirala infektioner, eller som anticancer- medel.

Enligt en ytterligare eller alternativ aspekt tillhandahållas ett sätt för behandling av en viral infektion, speciellt en infektion orsakad av ett retrovirus, såsom HIV, i ett däggdjur innefattande människa, som innebär att man administrerar en effektiv mängd av en antiviral förening med formeln (I) eller ett farmaceutiskt godtagbart derivat därav.

Enligt en ytterligare eller alternativ aspekt tillhandahålles således användningen av en förening med formeln (I) eller ett farmaceutiskt godtagbart derivat därav för framställning av ett läkemedel för behandling av en virusinfektion eller för användning som anticancer-medel.

Föreningarna enligt uppfinningen med antiviral aktivitet är även användbara för behandling av AIDS-relaterade betingelser, såsom AIDS-relaterat komplex (ARC), progressiv generaliserad lymfadenopati (PGL), AIDS-relaterade neurologiska tillstånd (såsom demens eller tropisk paraparesis), anti-HIV-antikropp- positiv och HIV-positiva betingelser, Kaposi's sarcoma och trombocytopenia purpura.

De antivirala föreningarna enligt uppfinningen är även använd- bara för att förhindra fortskridande av klinisk sjukdom hos individer som är anti-HIV-antikropp- eller HIV-antigen-posi- M 7 Fsos 213 tiva och för profylax efter exponering mot HIV.

De antivirala föreningarna med formeln (I) eller de farma- ceutiskt godtagbara derivaten därav kan även användas för att förhindra viral kontamination av fysiologiska vätskor, såsom blod eller semen in vitro.

Vissa av föreningarna med formeln (I) är även användbara som intermediat vid framställningen av andra föreningar enligt uppfinningen.

Det inses av en fackman på området att referens häri till behandling innefattar profylax liksom behandling av etablerade infektioner eller symtom.

Det inses vidare av en fackman att mängden av en förening enligt uppfinningen som erfordras till användning vid behand- ling varierar inte endast med den särskilt valda föreningen utan även med administrationssättet, naturen av tillståndet som skall behandlas och åldern och tillståndet hos patienten och bestämmes slutligen av den ansvarige läkaren eller vete- rinären. I allmänhet är emellertid en lämplig dos inom ett område av från ungefär 1 till 750 mg/kg, t.ex. från ungefär l0 till ungefär 750 mg/kg kroppsvikt per dag, såsom 3 till ungefär 120 mg/kg kroppsvikt hos mottagaren per dag, företrä- desvis inom området från 6 till 90 mg/kg/dag, allra helst i området 15 till 60 mg/kg/dag.

Den önskade dosen kan lämpligen tillhandahållas som en enkel- dos eller som delade doser administrerade vid ändamålsenliga intervall, exempelvis som två, tre, fyra eller flera sub-doser per dag.

Föreningen administreras lämpligen i enhetsdosform; exempelvis innehållande 10 till 1500 mg, lämpligen 20 till 1000 mg, allra helst 50 till 700 mg av den aktiva ingrediensen per enhetsdos- form.

.Ilfyí 'u -,-| 1nw 505 zís 8 Helst bör den aktiva beståndsdelen administreras för att uppnå topplasmakoncentrationer av den aktiva föreningen av från ungefär l till ungefär 75 uM, företrädesvis ungefär 2 till 50 uM, allra helst ungefär 3 till ungefär 30 uM. Detta kan exem- pelvis åstadkommas genom intravenös injektion av en 0,1 till %-ig lösning av den aktiva ingrediensen, valfritt i saltlake, eller genom oral administration som en bolus innehållande ungefär l till ungefär l00 mg av den aktiva ingrediensen.

Lämpliga blodnivåer kan hållas genom kontinuerlig infusion för att tillhandahålla ungefär 0,01 till ungefär 5,0 mg/kg/timme eller genom intermittenta infusioner innehållande ungefär 0,4 till ungefär 15 mg/kg av den aktiva ingrediensen.

Trots att det för användning inom terapin är möjligt att en förening enligt uppfinningen administreras som råmaterial föredrar man att tillhandahålla den aktiva ingrediensen som en farmaceutisk formulering.

Uppfinningen tillhandahåller således ytterligare en farmaceu- tisk formulering innefattande en förening med formeln (I) eller ett farmaceutiskt godtagbart derivat därav, tillsammans med en eller flera farmaceutiskt godtagbara bärare därav och, valfritt, andra terapeutiska och/eller profylaktiska ingre- dienser. Bäraren(na) måste vara "godtagbar" i det hänseendet att den måste vara förenlig med andra ingredienser i formu- leringen och inte skadlig för mottagaren därav.

Farmaceutiska formuleringar innefattar sådana lämpliga för oral, rektal, nasal, topisk (innefattande bukal och sub-lin- gual), vaginal eller parenteral (innefattande intramuskulär, subkutan och intravenös) administration eller i en form lämp- lig för administration genom inhalation eller insufflation.

Formuleringarna kan, när så är ändamålsenligt, lämpligen till- handahållas i separata dosenheter och kan framställas enligt någon av de metoder som är välkända inom farmacin. Alla meto- der innefattar steget att den aktiva föreningen bringas till- sammans med flytande bärare eller finfördelade fasta bärare eller båda delarna och att därefter, om så erfordras, pro- \. u 9 .5Û5 213 dukten formas till önskad formulering.

Farmaceutiska formuleringar lämpliga för oral administration kan lämpligen tillhandahållas som separata enheter såsom kapslar, oblatkapslar eller tabletter, var och en innehållande en förutbestämd mängd av den aktiva ingrediensen; såsom ett pulver eller granuler; som en lösning, en suspension eller som en emulsion. Den aktiva ingrediensen kan även tillhandahållas som en boli, electuarium eller pasta. Tabletter och kapslar för oral administration kan innehålla konventionella konsti- tuenter såsom bindemedel, fyllnadsmedel, smörjmedel, spräng- medel eller vätmedel. Tabletterna kan beläggas enligt metoder väl kända inom tekniken. Andra flytande preparationer kan exempelvis vara i form av vattenhaltiga eller oljehaltiga suspensioner, lösningar, emulsioner, siraper eller elixir, eller kan tillhandahållas som en torr produkt för ombildning med vatten eller annan lämplig vehikel innan användningen.

Sådana flytande preparationer kan innehålla konventionella additiv, såsom suspenderingsmedel, emulgeringsmedel, icke- vattenhaltiga vehiklar (vilka kan innefatta ätliga oljor) eller konserveringsmedel.

Föreningarna enligt uppfinningen kan även formuleras för parenteral administration (t.ex. genom injektion, exempelvis bolusinjektion eller kontinuerlig infusion) och kan till- handahållas i enhetsdosform i ampuller, för-fyllda sprutor, liten volym-infusion eller i multidos-behållare med ett till- satt konserveringsmedel. Kompositionerna kan ta sådana former som suspensioner, lösningar eller emulsioner i en oljehaltig eller vattenhaltig vehikel och kan innehålla formulerings- medel såsom suspenderings-, stabiliserings- och/eller disper- geringsmedel. Alternativt kan den aktiva ingrediensen vara i pulverform erhållen genom aseptisk isolering av en steril fast substans eller genom lyofilisering ur lösning, för ombildning med en lämplig vehikel, t.ex. sterilt, pyrogenfritt vatten, innan användningen.

För topisk administration till epidermis kan föreningarna f* 1 . 505 213 .L |'«_?|-.-l-" enligt uppfinningen formuleras som salvor, krämer eller lotio- ner, eller som en transdermal lapp (patch). Salvor och krämer kan exempelvis formuleras med en vattenhaltig eller oljehaltig bas med tillsats av lämpliga förtjocknings- och/eller gel- ningsmedel. Lotioner kan formuleras med en vattenhaltig eller oljehaltig bas och innehåller även i allmänhet ett eller flera emulgeringsmedel, stabiliseringsmedel, dispergeringsmedel, suspenderingsmedel, förtjockningsmedel eller färgämnen.

Formuleringar lämpliga för topisk administration i munnen innefattar lozenger innefattande den aktiva ingrediensen i en aromatiserad bas, i allmänhet sackaros och akacia eller dra- gant; pastiller innefattande den aktiva ingrediensen i en inert bas, såsom gelatin och glycerin eller sackaros och aka- cia; och munvatten innefattande den aktiva ingrediensen i en lämplig flytande bärare.

Farmaceutiska formuleringar lämpliga för rektal administra- tion vari bäraren är en fast substans tillhandahålles allra helst som enhetsdossuppositorier. Lämpliga bärare innefattar kakaosmör och andra material som vanligtvis användes inom tek- niken och suppositorier kan lämpligen bildas genom blandning av den aktiva föreningen med mjuka eller smälta bärare följt av kylning och formning i formar.

Formuleringar lämpliga för vaginal administration kan till- handahållas som pessarier, tamponger, krämer, geler, pastor, skum eller spray innehållande förutom den aktiva ingrediensen sådana bärare som är kända för att vara ändamålsenliga enligt tekniken.

För intra-nasal administration kan föreningarna enligt upp- finningen användas som en vätskespray eller i form av droppar.

Droppar kan formuleras med en vattenhaltig eller icke-vatten- haltig bas som även innefattar ett eller flera andra disper- geringsmedel, solubiliseringsmedel eller suspenderingsmedel.

Vätskesprayer tillhandahålles lämpligen från tryckluftsför- M ll *S05 213 packningar.

För administration genom inhalation tillhandahålles före- ningarna enligt uppfinningen lämpligen från en insufflator, nebulisator eller en tryckluftsförpackning eller någon annan lämplig anordning för tillhandahållandet av en aerosolspray.

Tryckluftsförpackningar kan innefatta ett lämpligt drivmedel såsom diklordifluormetan, triklorflurometan, diklortetra- fluoretan, koldioxid eller någon annan lämplig gas. I fallet med tryckluftsförpackad aerosol kan dosenheten fastställas genom att man tillhandahåller en ventil som avger en uppmätt mängd.

Alternativt kan för administration genom inhalation eller in- sufflation, föreningarna enligt uppfinningen ha formen av en torr pulverkomposition, exempelvis en pulverblandning av föreningarna och en lämplig pulverbas, såsom laktos eller stärkelse. Pulverkompositionen kan tillhandahållas som en- hetsdosform i exempelvis kapslar eller cylinderampuller, eller t.ex. gelatin eller plåsterförpackningar från vilka pulvret administreras med hjälp av en inhalator eller insufflator.

När så önskas kan de ovan beskrivna formuleringarna användas anpassade att ge kontinuerlig frigöring av den aktiva ingre- diensen.

De farmaceutiska kompositionerna enligt uppfinningen kan även innehålla andra aktiva ingredienser såsom antimikrobiella medel eller konserveringsmedel.

Föreningarna enligt uppfinningen kan även användas i kombina- tion med andra terapeutiska medel, såsom exempelvis andra anti-infektionsmedel. Speciellt kan föreningarna enligt upp- finningen användas tillsammans med kända antivirala medel.

Uppfinningen tillhandahåller således enligt en ytterligare aspekt en kombination innefattande en förening med formeln (I) eller ett fysiologiskt godtagbart derivat därav, tillsammans med ett annat terapeutiskt aktivt medel, speciellt ett anti- 'M \, 4,» |-_'..-r 505 213 12 viralt medel.

De ovan angivna kombinationerna kan lämpligen tillhandahållas för användning i form av en farmaceutisk formulering och således utgör farmaceutiska formuleringar innefattande en kombination som definierats ovan tillsammans med en farma- ceutiskt godtagbar bärare därav, en ytterligare aspekt av uppfinningen.

Lämpliga terapeutiska medel att använda i sådana kombinationer innefattar acykliska nukleosider såsom aciclovir, interferoner såsom o(-interferon, renala exkretionsinhibitorer såsom pro- benicid, nukleosidtransportinhibitorer såsom dipyridamol, 2',3'-dideoxinukleosider såsom 2',3'-dideoxicytidin, 2',3'- dideoxiadenosin, 2',3'-dideoxiinosin, 2',3'-dideoxitymidin och 2',3'-dideoxi-2',3'-didehydrotymidin och immunomodulatorer såsom interleukin II (IL2) och granulocytmakrofagkolonistimu- lerande faktor (GM-CSF), erytropoetin och ampligen.

De individuella komponenterna i sådana kombinationer kan administreras antingen i följd eller samtidigt i separat eller kombinerade farmaceutiska formuleringar.

När föreningen med formen (I) eller ett farmaceutiskt godtag- bart derivat därav användes i kombination med ett andra tera- peutiskt medel aktivt mot samma virus kan dosen av varje före- ning skilja sig från den som ges när föreningen användes sepa- rat. Ändamålsenliga doser inses lätt av en fackman på området.

Föreningar med formeln (I) och deras farmaceutiskt godtagbara derivat kan framställas enligt vilka som helst metoder kända inom tekniken för framställning av föreningar med analog struktur.

Lämpliga metoder för framställning av föreningar med formeln (I) och deras farmaceutiskt godtagbara derivat beskrives nedan; grupperna X och Z har ovan angiven definition förutom när annat anges. Det bör förstås att efterföljande reaktioner | dv' 13 1505 213 kan erfordra användningen av, eller lämpligen tillämpas på, utgångsmaterial med skyddade funktionella grupper och av- lägsning av dessa skyddade grupper kan således erfordras som ett mellansteg eller slutsteg för att ge den önskade före- ningen. Skydd med och avlägsnande av funktionella grupper kan åstadkommas med användning av konventionella anordningar.

Exempelvis kan aminogrupper skyddas med en grupp utvald bland aralkyl (t.ex. bensyl), acyl eller aryl (t.ex. 2,4-dinitro- fenyl); efterföljande avlägsning av den skyddande gruppen åstadkommes när så önskas genom hydrolys eller hydrogenolys när så är lämpligt med användning av standardbetingelser.

Hydroxylgrupper kan skyddas med användning av vilka som helst konventionella hydroxylskyddande grupper, såsom exempelvis beskrivits i "Protective Groups in Organic Chemistry", Ed.

J.F.W. McOmie (Plenum Press, 1973) eller “Protective Groups in Organic Synthesis" av Theodora W. Greene (John Wiley and Sons, l98l). Exempel på lämpliga hydroxylskyddande grupper inne- fattar grupper utvalda bland alkyl (t.ex. metyl, t-butyl eller metoximetyl), aralkyl (t.ex. bensyl, difenylmetyl eller tri- fenylmetyl), heterocykliska grupper såsom tetrahydropyranyl, acyl (t.ex. acetyl eller bensoyl) och silylgrupper såsom tri- alkylsilyl (t.ex. t-butyldimetylsilyl). De hydroxylskyddande grupperna kan avlägsnas med konventionella tekniker. Således kan exempelvis alkyl, silyl, acyl och heterocykliska grupper avlägsnas genom solvolys, t.ex. genom hydrolys under sura eller basiska betingelser. Aralkylgrupper såsom trifenylmetyl kan likaså avlägsnas genom solvolys, t.ex. genom hydrolys under sura betingelser. Aralkylgrupper såsom bensyl kan spjäl- kas genom hydrogenolys i närvaro av en ädelmetallkatalysator såsom palladium-på-träkol. Silylgrupper kan även lämpligen av- lägsnas med användning av en källa av fluoridjoner såsom tetra-n-butylammoniumfluorid.

I ett första förfarande (A) kan föreningar med formeln (I) och farmaceutiskt godtagbara derivat därav, framställas genom om- sättning av en förening med formeln (II) ¿_. 505 213 14 fxnrfll' i -en //'\ /""2 N 0 '. I Z/ \\N/ \NH m) Y'°"2\ /'\ ï T O~_._-Û (vari X och Z är substituenter med betydelsen i formeln (I) eller är skyddade former därav och Y är OH eller en skyddad form därav) eller ett farmaceutiskt godtagbart derivat därav med ett reagens utvalt bland myrsyra och reaktiva derivat därav följt, där så erfordras, av avlägsnandet av icke önska- de grupper införda genom nämnda reagens och/eller genom av- lägsnande av eventuellt närvarande skyddande grupper.

Exempel på lämpliga derivat av myrsyra som kan användas i förfarandet (A) ovan innefattar ortoformiater (t.ex. trietyl- ortoformiat), dialkoximetylacetater (t.ex. dietoximetylace- tat), ditiomyrsyra, formamid, s-triazin eller formamidin- acetat.

Icke önskade grupper införda genom myrsyra eller ett reaktivt derivat därav kan lämpligen avlägsnas genom mild hydrolys, exempelvis med användning av en oorganisk syra såsom vatten- haltig saltsyra.

När ett trialkylortoformiat såsom trietylortoformiat användes utgör detta lämpligen även lösningsmedlet för reaktionen.

Andra lösningsmedel som kan användas innefattar amider (t.ex. dimetylformamid eller dimetylacetamid), klorerade kolväten (t.ex. diklormetan), etrar (t.ex. tetrahydrofuran) eller nit- triler (t.ex. acetonitril).

I vissa fall (t.ex. när ett trialkylortoformiat, såsom tri- etylortoformiat, användes) kan reaktionen företrädesvis h asus 213 genomföras i närvaro av en katalysator, såsom en stark syra (t.ex. koncentrerad saltsyra, salpetersyra eller svavelsyra).

Reaktionen kan utföras vid en temperatur i området -25 till +l50°C, t.ex. 0 till l0O°C, och sker lämpligen vid rumstem- peratur.

I ett annat förfarande (B) utsättes föreningarna med formeln (I) och deras farmaceutiskt godtagbara derivat eller en skyddad form därav, för en interkonversionsreaktion, varigenom den ursprungligen närvarande substituenten X ersättes med en annan substituent X och/eller den ursprugnligen närvarande gruppen Z ersättes med en annan grupp Z följt, där så erford- ras, av avlägsnandet av eventuella närvarande skyddande grupper.

Enligt en utföringsform av förfarandet (B) kan föreningarna med formeln (I), vari X representerar en grupp NRRI (Vflri R 0Ch Rl har ovan angiven definition) framställas genom aminering av en motsvarande förening med formeln (I), vari X betecknar en halogenatom (t.ex. klor). Denna aminering kan åstadkommas genom omsättning med ett reagens HNRRI (vari R och Rl har ovan angiven definition) lämpligen i ett lösningsmedel, såsom en alkohol (t.ex. metanol). Reaktionen kan genomföras vid vilken som helst temperatur och sker lämpligen vid förhöjd tempera- tur såsom under återlopp eller, när flytande ammoniak använ- des, i ett förseglat rör vid ungefär 50 till 80°C. Lämpliga betingelser för överföringen av halogeniderna till sekundära eller tertiära aminer har även beskrivits av I.T. Harrison et al, Compendium of Organic Synthetic Methods, Wiley-Inter- science, New York (1971) på sidorna 250-252.

Enligt en annan utföringsform av förfarandet (B) kan före- ningarna med formeln (I), vari X betecknar en grupp OR (vari R har ovan angiven definition) framställas genom att halogen (t.ex. klor)-atomen ersättes med en ändamålsenlig anjon RO-.

När R betecknar en väteatom kan ersättningsreaktionen genom- föras genom hydrolys som kan åstadkommas i vatten eller i en blandning av vatten och ett med vatten blandbart lösningsmedel ¿__ sos 2013 16 üy«v“ såsom en alkohol (t.ex. metanol eller etanol), en eter (t.ex. dioxan eller tetrahydrofuran), en keton (t.ex. aceton), en amid (t.ex. dimetylformamid) eller en sulfoxid (t.ex. dimetyl- sulfoxid), lämpligen i närvaro av en syra eller en bas. Lämp- liga syror innefattar organiska syror såsom p-toluensulfon- syra och oorganiska syror, såsom saltsyra, salpetersyra eller svavelsyra. Lämpliga baser innefattar oorganiska baser, såsom alkalimetallhydroxider eller -karbonater (t.ex. natrium- eller kaliumhydroxid eller -karbonat). Vattenhaltiga syror eller baser kan även användas som reaktionslösningsmedel. Hydrolysen kan lämpligen åstadkommas vid en temperatur i området -10 till +l50°C, t.ex. vid återlopp. När R betecknar en Cl_4-alkyl eller arylgrupp bildas anjonen RO lämpligen från en motsva- rande alkohol ROH med användning av en oorganisk bas såsom en alkalimetall (t.ex. natriummetall) eller en alkalimetallhydrid (t.ex. natriumhydrid). Reaktionen med den in situ bildade anjonen kan lämpligen åstadkommas vid rumstemperatur.

Enligt en ytterligare utföringsform av förfarandet (B) kan föreningar med formeln (I), vari X betecknar en grupp SH, framställas genom omsättning av halogenföreningen med formeln (I) med tiokarbamid i ett lämpligt lösningsmedel, såsom en alkohol (t.ex. n-propanol) vid förhöjd temperatur (t.ex. återlopp) följt av alkalisk hydrolys. Lämpliga baser som kan användas innefattar alkalimetallhydroxider (t.ex. natrium- hydroxid). Reaktionen kan lämpligen genomföras enligt metoden enligt G.G. Urquart et al., Org. Syn. Coll. vol. Ä, 363 (1953) t.ex. genom återloppskokning av intermediatprodukten med vat- tenhaltig NaOH i ungefär 0,215 till ungefär 5 timmar.

Enligt en annan utföringsform av förfarandet (B) kan före- ningarna med formeln (I), vari X betecknar en väteatom framställas genom reducering av halogenföreningen med formeln (I) med användning av ett reducerande system, som inte på- verkar resten av molekylen. Lämpliga reducerande medel som kan användas för att åstadkomma den önskade dehalogeneringsreak- tionen innefattar zinkmetall/vatten med användning av metoden beskriven av J.R. Marshall et al., J. Chem. Soc., 1004 (1951). "r ...ff 17 3505 213 Alternativt kan reaktionen åstadkommas genom fotolys i ett lämpligt lösningsmedel såsom tetrahydrofuran innehållande 10 % trietylamin och lämpligen i en Rayonet-fotokemisk reaktor (2537A)_enligt metoden av V. Nair et al., J. Org. Chem., âå, 1344 (1987).

Enligt en ytterligare utföringsform av förfarandet (B) kan föreningarna med formeln (I), vari X betecknar en halogenatom, framställas från en annan halogenförening med formeln (I) enligt konventionella metoder för halogenid-halogenid-utbyte.

Alternativt kan när X är klor, denna substituent ersättas med en annan halogenatom med användning av olika p-(halo)bensen- diazoniumklorider enligt välkända förfaranden.

Föreningar med formeln (I), vari X betecknar en grupp SR, vari R är en Cl_4-alkyl- eller arylgrupp, kan framställas från motsvarande tioler med användning av standardmetoder för alky- lering eller arylering, såsom exempelvis beskrivits i US-pa- tentet nr. 4 383 114.

Föreningarna med formeln (I), vari Z betecknar en hydroxyl- grupp kan lämpligen framställas av en motsvarande förening med formeln (I), vari Z betecknar NH2 genom omsättning med salpetersyrlighet, exempelvis med användning av förfarandet använd av J. Davoll i J. Amer. Chem. Soc., lå, 3174 (1951).

Många av de ovan beskrivna reaktionerna har uttömmande rappor- terats i samband med purinnukleosidsynteser, exempelvis i Nucleoside Analogs - Chemistry, Biology and Medical Applica- tions, R. T. Walker et al., eds, Plenum Press, New York (1979) på sidorna 193-223, vilken härmed införlivas som referens.

Farmaceutiskt godtagbara salter av föreningarna enligt upp- finningen kan framställas såsom beskrivits i US-patentet nr. 4 383 114, vilket härmed införlivas som referens. Om således man exempelvis önskar framställa ett syraadditionssalt av en förening med formeln (I) kan produkten av vilket som helst av de ovan angivna förfarandena överföras i ett salt genom be- ¿_. rflww" 505 213 18 handling av den erhållna fria basen med en lämplig syra enligt konventionella metoder. Farmaceutiskt godtagbara syraaddi- tionssalter kan framställas genom omsättning av den fria basen med en ändamålsenlig syra, valfritt i närvaro av ett lämpligt lösningsmedel såsom en ester (t.ex. etylacetat) eller en alko- hol (t.ex. metanol, etanol eller isopropanol). Oorganiska basiska salter kan framställas genom omsättning av den fria basen med en lämplig bas såsom en alkoxid (t.ex. natrium- metoxid) valfritt i närvaro av ett lösningsmedel, såsom en alkohol (t.ex. metanol). Farmaceutiskt godtagbara salter kan även framställas av andra salter innefattande andra farma- ceutiskt godtagbara salter av föreningarna med formeln (I) med användning av konventionella metoder.

En förening med formeln (I) kan överföras i ett farmaceutiskt godtagbart fosfat eller annan ester genom omsättning med ett fosforyleringsmedel, såsom POCl eller ett lämpligt förest- 3! rande medel, såsom en syrahalogenid eller -anhydrid, enligt vad som är lämpligt. En ester eller ett salt av en förening med formeln (I) kan exempelvis överföras till moderföreningen genom hydrolys.

Föreningarna med formeln (II) och salterna därav är nya före- ningar och utgör en ytterligare utföringsform av föreliggande uppfinning.

Föreningarna med formeln (II), vari Z betecknar väte eller hydroxyl kan direkt framställas från föreningen 33 H2 '__-O 2a genom omsättning med ett överskott av en pyrimidin med formeln (III) 41' z 19 -505 213 X I N//°\ f” L 1 (III) Z/ \N/ \Y (vari Y är en halogenatom, t.ex. klor och Z är väte eller hydroxyl) i närvaro av en aminbas, såsom trietylamin, och i ett alkoholhaltigt lösningsmedel (t.ex. n-butanol), lämpligen vid återlopp.

Föreningar med formeln (II), vari Z betecknar NH2 kan fram- ställas med användning av föreningen med formeln ga genom om- sättning med ett överskott av en pyrimidin med formeln (IV) fl'\ (IV) --Z GC Q O /'\ / \ H2N N Y (vari Y har den i formeln (III) ovan angivna definitionen) under liknande betingelser som de som beskrivits ovan för framställningen av föreningar med formeln (II), vari Z beteck- nar väte eller hydroxyl, till en förening med formeln (V): /°\\ /°\ H2N N H (v) rio-CMA /-\ I som kan diazotiseras med användning av ett diazoniumsalt ¿__ '_ __ sos 213 20 ArN2+E_ (vari Ar betecknar en aromatisk grupp, t.ex. p-klor- fenyl och E betecknar en anjon, t.ex. en halogenid såsom klorid) i ett lösningsmedel såsom vatten, en organisk syra, såsom ättiksyra eller en blandning därav, lämpligen vid unge- fär rumstemperatur till en förening med formeln (VI) x I ø*\ / No '.! N/\/\H N=N-År H2 Ho-cn (vi). 2\ /°\ 1 1 flïí (vari Ar har den ovan just givna definitionen), som kan över- föras till den önskade föreningen med formeln (II) genom exem- pelvis reduktion med användning av en reducerande metall, såsom zink, i närvaro av en syra, t.ex. ättiksyra. Man inser att valet av reduceringsmedel beror på naturen av gruppen X.

Föreningen ga kan framställas från den vridbara (versatile) prekursorn la-acetylamino-3qbacetoxi-metylcyklopent-2-en (la) genom hydrolys i närvaro av en mild bas, såsom en alkalisk jordartsmetallhydroxid.

En särskilt lämplig syntes av föreningarna med formeln (I) via 6-klor-föreningarna med formeln (II) anges nedan. 21 ïsos 213 // \_/""2 1 .' Z/ \\N/ \NH HAC H2 AC ø H - H .

“W WT. “m 1___1 ___; |_| _;___> |_x la v 2a Ia 'fl 1 f //°\ / \ // \ /Wz //'\ /'\ *j H---\O/-°1 *f 1 'r -. \CH HZN/ \\N/\ H2 / \\N/\ Z/ \\ / \N ¿.

Qnap.. 505 213 w Föreningen ga och föreningarna med formlerna (V) och (VI) är nya intermediat och bildar ytterligare utföringsformer av föreliggande uppfinning.

Föreningen la är en känd förening beskriven i US-patentet nr. 4 138 562.

När föreningen med formeln (I) önskas som en enkel isomer kan den erhållas antingen genom uppspjälkning av slutprodukten eller genom stereospecifik syntes från isomeriskt rent ut- gångsmaterial eller vilket som helst lämpligt intermediat.

Spjälkning av slutprodukten eller ett intermediat eller ut- gångsmaterial därför kan åstadkommas enligt vilken som helst lämplig metod känd inom tekniken: jämför exempelvis “Stereo- chemistry of Carbon Compounds" av E.L. Eliel (McGraw Hill, 1962) och "Tables of Resolving Agents" av S.H. Wilen.

En lämplig metod att erhålla chiralt rena föreningar med formeln (I) är genom enzymatisk överföring av en racemisk blandning av föreningen eller en prekursor därför. Genom en sådan metod kan både (+)- och (-)-föreningarna med formeln (I) erhållas i optiskt ren form. Lämpliga enzymer innefattar de- aminaser, såsom adenosindeaminas.

Uppfinningen åskådliggöres ytterligare med hänvisning till följande detaljerade exempel, vari elementaranalyser genom- fördes av M-H-W Laboratories, Phoenix, AZ. Smältpunkterna fastställdes på en Mel-Temp-apparat och är korrigerade. Kärn- magnetiska resonansspektra erhölls på Jeol FX 90QFT eller Nicollet NT300-spektrometrar och noterades i DMSO-d6. Kemiska skift uttrycks i ppm nedströms från Me4Si. IR-spektra fast- ställdes som KBr-pellets i en Nicollet SOXC FT-IR-spektro- meter och UV-spektra fastställdes på en Beckman DU-8-spektro- fotometer. Masspektra erhölls med en AEI Scientific Appa- ratus Limited MS-30-masspektrometer. Tunnskiktskromatografi (TLC) genomfördes på 0,25 mm skikt av Merck kiselgel (230- 400 mesh). Alla kemikalier och lösningsmedel är av reagens- r?f 11 u' l' I! 23 ïsos 213 kvalitet om icke annat anges. Uttrycket "aktiv ingrediens" som användes i exemplen innebär en förening med formeln (I) eller ett farmaceutiskt godtagbart derivat därav.

L." 505 213 24 (f). m' r- " Exempel 1 (I)-(luy4d)-4-/(5-amino 6-klor-4-pyrimidinyl)-amino/-2- cyklopentenylkarbinol (3a) En blandning av 1Mkacetylamino-Bdracetoximety1-cyklopent-2-en (la) (3,0 g, 15 mmol) och vattenhaltig bariumhydroxid (0,5N, 300 ml) återloppskokades över natten. Efter kylning neutra- liserades med torr-is. Fällningen avfiltrerades och vatten- lösningen koncentrerades till torrhet. Återstoden extrahera- des med absolut etanol och koncentrerades åter och gav ga som en färglös sirap 1,6 g (14 mmol).

Till denna sirap sattes 5-amino-4,6-diklorpyrimidin (4,59 g, 28 mmol), trietylamin (4,2 g, 42 mmol) och n-butanol (50 ml) och blandningen âterloppskokades i 24 timmar. De flyktiga lösningsmedlen avlägsnades, återstoden absorberades på kisel- gel (7 g), packades i en snabb-kolonn (4,0 x 12 cm) och elue- rades med CHCl3-MeOH (20:l) och gav 2,69 g (74 %) av förening 33; smältpunkt 130-l32oC. Ett analytiskt prov erhölls genom omkristallisation ur etylacetat (EtOAc), smältpunkt 134-l35OC Ms (30 ev, 20o°c); m/e 240 och 242 (M+ och M++2), 209 (M+'31), 144 (B+); IR: 3600-2600 (OH), 1620, 1580 (C=C, C=N); analys. (clonuclullmc, H, N.

Exempel 2 (1)-(lu,4a)-4-/(2-amino-6-klor-4-pyrimidinyl)-amino/-2- cyklopentenylkarbinol (4a) Till 14 mmol oren 2a (exempel l) sattes 2-amino-4,6-diklor- pyrimidin (3,74 g, 22,8 mmol), trietylamin (15 ml) och n-buta- nol (75 ml) och blandningen âterloppskokades i 48 timmar.

De flyktiga lösningsmedlen avlägsnades, återstoden behandlades med metanol för att avskilja den olösta biprodukten (den dubb- la pyrimidinnukleosiden). Metanollösningen absorberades på kiselgel (8 g) packad i en kolonn (4,0 x 14 cm) och eluerades med CHCl3-MeOH (40:l) och gav 1,52 g (42 %) oren 43. Produk- ten omkristalliserades ur etylacetat och gav 43; smältpunkt 132-134°c, Ms (30 ev, 200°c); m/e 240 och 242 (M+ och M++2), 209 (M+_3l), 144 (B+); IR: 3600-3000 (NH2, OH), 1620, 1580 (C=C, C=N); Analys. (Cl0Hl3ClN4) C, H, N.

'LÛI "..-'|"' 5505 213 Exempel 3 (1)-(lo44d)-4-(/(2-amino-6-klor-5-(4-klorfenyl)-azo/-4-pyrimi- dinyl-amino)-2-cyklopentenylkarbinol (Sa) En kall diazoniumsaltlösning framställdes ur p-kloranilin (l,47 g, 11,5 mmol) i 3N HCl (25 ml) och natriumnitrit (870 mg, 12,5 mmol) i vatten (10 ml). Denna lösning sattes till en blandning av ia (2,40 g, 10 mmol), ättiksyra (50 ml), vatten (50 ml) och natriumacetattrihydrat (20 g). Reaktionsbland- ningen omrördes över natten vid rumstemperatur. Den gula fällningen filtrerades och tvättades med kallt vatten tills den var neutral, därefter lufttorkades den i dragskåp och gav 3,60 g (94 %) av gg, smältpunkt 229°c (sonacrac1ning>. Det analytiska provet erhölls ur aceton-metanol (l:2), smältpunkt 241-243oC (sönderdelning). MS (3o ev, 260oC): m/e 378 och 380 (M+ och M* +2), 282 (E+), IR: 3600-sooo (NH2, on), 1620, 1580 (C=C, C=N); Analys. (Cl6Hl6Cl2N6O) C, H, N.

Exempel 4 (1)-(lu,m1),4-/(2,5-diamino-6-klor-4-pyrimidinyl)-amino/- -2-cyklopentenylkarbinol (6a) En blandning av 53 (379 mg, l mmol), zinkstoft (0,65 g, 10 mmol), ättiksyra (0,32 ml), vatten (15 ml) och etanol (15 ml) återloppskokades under kväve i 3 timmar. Zinken avlägsnades och lösningsmedlen indunstades. Återstoden absorberades på kiselgel (2 g), packades i en kolonn (2,0 x 18 cm) och eluerades med CHCI3-MeOH (l5:l). En skär sirap erhölls.

Ytterligare rening ur metanol-eter gav Qa som skära kristal- lcr, 170 mg (se %), smältpunkt 168-17o°c, Ms (30 cv, 22o°c); m/c 255 och 257 (M+ och M* +2), 224 (M+ '31), 159 (B+); IR: 3600-3000 (NH2, OH) 1620, 1580 (C=C, C=N); Analys. (Cl0Hl4ClN5) C, H, N.

Exempel 5 (1)-(la,4«)-4-(6-klor-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-karbi- nol (7a) En blandning av 33 (l,30 g, 5,4 mmol), trietylortoformiat (30 ml) och saltsyra (12N, 0,50 ml) omrördes över natten vid rumstemperatur. Lösningsmedlet indunstades vid 35oC i vakuum. ¿___ |:-|'|..«'1" 505 2516 26 Till återstoden sattes vattenhaltig saltsyra (0,5N, 30 ml) och blandningen omrördes i en timme, blandningen neutralisera- des till pH 7-8 med lN natriumhydroxid och absorberades på kiselgel (8 g), packad i en kolonn (4,0 x 8 cm) och eluerades med CHCI3-Me0H (20:l) och gav vita kristaller av za, l,l2 g (82 %). Den orena produkten omkristalliserades ur etylacetat och gav za, smältpunkt 108-ll0°C, MS (30 ev, 200°C); m/e 250 och 252 (M+ och M* + 2), 219 2800 (OH), 1600 (C=C, C=N); Analys. (CllHllClN4O) C, H, N.

Exempel 6 (:)-(lu,4u)-4-(6-hydroxi-9H-purin-9-yl)-2-cyklopenteyl-karbi- nol (8a) En blandning av la (251 mg, l mmol) och vattenhaltig natrium- hydroxid (0,2N, 10 ml) âterloppskokades i 3 timmar. Efter kyl- ning justerades reaktionsblandningen till pH 5-6 med ättik- syra. Reaktionsblandningen absorberades på kiselgel (2 g) packad i en kolonn (2,0 x ll cm) och eluerades med CHCl3- MeOH (l0:l) och gav 105 mg (45 %) av §a. Den orena vita pro- dukten omkristalliserades ur vatten-metanol (3:l) och gav âa, smältpunkt 248-250°C (sönderdelning), Ms (30 ev, 300oC); m/e 232 (M*), 214 , 136 (E+), IR; 3600-2600 (on), 1680, 1600 (C=O, C=C, C=N): Analys. (CllHl2N4O2) C, H, N.

Exempel 7 (:)-(l0ç400-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-karbi- nol (9a) Flytande ammoniak infördes i en bomb som innehöll en lösning av 7a (250 mg, l mmol) i metanol (5 ml) vid -8000.

Bomben förseglades och upphettades vid 60°C i 24 timmar. Ammo- niak och metanol indunstades och återstoden omkristalliserades ur vatten och gav benvita kristaller av ga, 187 mg (81 %), smä1tpurkt 198-200°c. Ms (30 ev, 210°c)= m/e 231 (M+), 213 (M+ '1a), 135 (B+); 1R= 3600-2600 (NHZ, on), 1700, 1600 (c=c, C=N); Analys (CllHl3N5O) C, H,N.

INN, 27 b 505 213 Exempel 8 (i)-(lå,4K)-4-(6-merkapto-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl- karbinol (l0a) En blandning av la (125 mg, 0,5 mmol), tiokarbamid (40 mg, 0,64 mmol) och n-propanol (5 ml) âterloppskokades i 2 timmar.

Efter kylning isolerades fällningen genom filtrering, tvättades med n-propanol och löstes i natriumhydroxid (lN, ml). Lösningen justerades till pH 5 med ättiksyra. Den orena igâ (90 mg, 73 %> isoleraaes åter, smältpunkt 260-262°c (sönderdelning) och omkristalliserades ur N,N-dimetylformamid och gav lgâ, smältpunkt 263-265OC (sönderdelning). MS (30 ev, 290°c)= m/e 248 (M+), 230 (M+"1s), 152 (E+), IR: 3600-3200 (OH), 3100, 2400 (SH), 1600 (C=C, C=N); Analys (CllHl2N4OS) C, H, N.

Exempel 9 (i)-(lag4M)-4-(2-amino-6-klor-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl- karbinol (l3a) En blandning av 63 (l,4l g, 5,5 mmol) trietylortoformiat (30 ml) och saltsyra (l2N, 1,40 ml) omrördes över natten.

Suspensionen torkades i vakuum. Utspädd saltsyra (0,5 N, 40 ml) tillsattes och blandningen omsattes vid rumstemperatur i en timme. Blandningen neutraliserades till pH 8 med lN nat- riumhydroxid och adsorberades på kiselgel (7,5 g) packad i en kolonn (4,0 x 10 cm) och eluerades med CHCI3-MeOH (20:l) och gav benvita kristaller av låg, 1,18 g (80 %). Den orena pro- dukten omkristalliserades ur etanol och gav låg, smältpunkt 145-147°c, Ms (30 ev, 220°c)= m/e 265 och 267 (M+ och M*+2) 235 (M+'30), 169 (B+); IR: 3600-2600 (NH2, on), 1620-1580 (c=c, C=N); Analys (C1lHl2N5OCl,3/4 H20) C, H, N.

Exempel 10 (1)-(lM,4a)-4-(2-amino-6-hydroxi-9H-purin-9-yl)-2-cyklo- pentenyl-karbinol (l4a) En blandning av l3a (266 mg, l mmol) och vattenhaltig natrium- hydroxid (0,33N) âterloppskokades i 5 timmar, absorberades i kiselgel (2 g) packad i en kolonn (2,0 x 7,5 cm) och elue- rades med CHCl3-MeOH (5:l). Den orena produkten omkristalli- ¿__. sus 213 N V' v' V V. serades ur metanol-vatten (l:4) och gav vita kristaller av lig, 152 mg (61 %), smältpunkt 254-256°C (sönderdelning).

Ms (30 ev, 2oo°c)= m/e 247 (M*), 217 (M+'3o), 151 (E+), IR; 3600-2600 (NH2, OH), 1700, 1600 (C=O, C=C, C=N); Analys (cllHl3N5o2.3/4H2o) c, H, N.

Exempel ll (1)-(1«,4aO-4-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl- karbinol (15a) Flytande ammoniak infördes i en lösning av låg (265 mg, 1 mmol) i metanol (10 ml) vid -80°C i en bomb. Bomben förseg- lades och upphettades vid 75°C i 48 timmar. Ammoniak och metanol indunstades. Återstoden absorberades på kiselgel (2 g), packad i en kolonn (2,0 x 10 cm) och eluerades med CHCl3- MeOH) (15:l). Den orena produkten omkristalliserades ur eta- nol och gav 196 mg (80 %) låg, smältpunkt 152-155oC. MS (30 ev, 2oo°c)= m/e 246 (M+), 229 (M+'17>, 216 (m+'3o), 150 (E+), IR: 3600-3000 (NH2, OH), 1700, 1650, 1600 (C=O, C=C, C=N); Analys (CllHl4N6O) C, H, N.

Exempel 12 (lS,4R)-4-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-2-cyk1opentenyl-karbi- nol /(1S,4R)-4-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-meta- nol/- (a) Intermediat 1: (lR,2S,3R,SR)-3-/6-amino-9H-purin-9-yl/- -5-/((1,1-dimetyletyl)-dimetylsilyloxi)metyl/-1,2-cyklopentan- diol (-) Aristeromycinl (12,505 g), tert-buty1dimetylsilyl- klorid (7,8 g) och imidazol (12,96 g) i torr dimetylformamid (85 ml) omrördes vid rumstemperatur i 2,5 timmar. Den erhållna lösningen utspäddes med etylacetat (500 ml), tvättades sedan med vatten (3 x 100 ml) och saltlösning (50 ml) innan en vit fast substans utkristalliserade. Denna tillvaratogs genom filtrering, tvättades med etylacetat, torkades sedan i vakuum och gav titelprodukten (3,92 9): IH NMR (DMSO-d6) 8,15 (lH), 8,09 (lH), 7,19 (2H), 5,00 (lH), 4,72 (lH), 4,69 (lH), 4,36 (lH), 3,85 (lH) 3,67 (2H), 2,23 (lH), 2,09 (lH), 1,79 (lH), 0,89 (9H), 0,07 (6H). 1 Journal of the American Chemical Society 1983, vol, 105, 4049-4055 .HV 29 #505 213 (b) Intermediat 2: (4R,3aS,6R,6aR)-4-/6-amino-9H-purin-9-y1/- -6-/((1,1-dimetyletyl)-dimetylsilyloxi)metyl/-3a,5,6,6a-tetra- hydro-4H-cyklopenta-1,3-dioxol-2-tion.

En omrörd suspension av intermediat 1 (3,45 g) i torr dimetyl- formamid (56 ml) behandlades med 1,1'-tiokarbonyldiimidazol (3,3 g) och gav en gul lösning. Efter 15,5 timmar vid rums- temperatur kombinerades den erhållna lösningen med den från ett tidigare försök (6 % skala) och lösningsmedlet avlägsnades genom indunstning. Den kvarvarande oljan späddes med etylace- tat (100 ml), tvättades sedan med vatten (2 x 20 ml) och salt- lösning (2Vx 20 ml), torkades (MgSO4) och indunstades till en gul fast substans. Denna tvättades med dietyleter (25 ml), tillvaratogs genom filtrering, tvättades ytterligare med eter (25 ml), torkades sedan i vakuum och gav titelprodukten som en blek krämfärgad fast substans (3,6l g);j1max (etanol) 240,0 nm (Eíšm 459); lH NMR (DMSO-d6) 8,27 (lH), 8,13 (lH), 7,33 (2H), ,81 (lH), 5,37 (lH), 5,28 (lH), 3,78 (2H), 2,60 (lH), 2,28 (2H), 0,90 (9H), 0,09 (6H). (c) Intermediat 3: (l%%4'S)-9-/4-(((l,l-dimetyletyl)-dimetyl- silyloxi)-metyl)-2-cyklopenten-l-yl/-9H-purin-6-amin En lösning av intermediat 2 (3,57 g) i torr tetrahydrofuran (25 ml) behandlades med en lösning av 1,3-dimety1-2-fenyl- l,3,2-diazafosfolidin (4,94 g) i torr tetrahydrofuran (10 ml), omrördes sedan vid rumstemperatur i 8 3/4 timmar. Lösnings- medlet avlägsandes genom indunstning. Den kvarvarande oljan kombinerades med den från ett tidigare försök (40 % skala), underkastädes därefter kolonnkromatografi på kisel (200 g, Merck 7734), eluerades med klorform och därefter med kloroform- etanol-blandningar och gav en vit fast substans. Denna fasta substans tvättades med dietyleter (25 ml) och tillvaratogs därefter genom filtrering. Den fasta substansen tvättades ytterligare med eter (10 ml), torkades sedan i vakuum och gav titelprodukten (l,47 g); Ämax (etanol) 261,4 nm (Eââm 443); lH NMR (DMSO-d6) 8,14 (lH), 8,00 (lH), 7,20 (2H), 6,12 (lH), ,95 (lH), 5,60 (lH), 3,66 (2H), 2,96 (lH), 2,69 (lH), 1,65 (lH), 0,74 (9H), 0,02 (6H). 'hr _. 505 215 3° (d) Intermediat 4: (l'R,4'S)-9-/4-(((l,l-dimety1ety1)-di- mety1silyloxi)mety1)-2-cyklopenten-l-yl/-9H-purin-6-amin,1- oxid En lösning av intermediat 3 (l,37 g) i kloroform (30 ml) behandlades med 80-90 % m-klorperoxibensoesyra (l,29 g), om- rördes därefter vid rumstemperatur i 3 timmar. Lösnings- medlet avlägsnades genom indunstning och det kvarvarande gummit upplöstes i etylacetat (10 ml). En vit fast substans ut- kristalliserade. Denna fasta substans och material âtervunnet genom indunstning av filtratet upplöstes i kloroform (100 ml), tvättades därefter med mättad vattenhaltig natriumbikarbonat- lösning (2 x 10 ml) och saltlösning (2 x 10 ml). De vatten- haltiga uppslamningarna âterextraherades med kloroform (50 ml). De kombinerade organiska lösningarna torkades (MgSO4) och indunstades sedan till en fast substans. Denna fasta sub- stans tvättades med dietyleter (25 ml) och tillvaratogs sedan genom filtrering. Den vita fasta substansen tvättades ytter- ligare med eter (10 ml), torkades sedan i vakuum och gav ti- telproaukten (1,16 9); RHEX (etanøl) 235,4 nm (Eíëm 1324), 263,2 nm (síâm 248), 300,2 nm (ßíâm 75); ln NMR (lH), 8,02 (lH), 7,16 (2H), 6,21 (lH), 5,87 (lH), 5,72 (lH), 3,68 (2H), 3,04 (lH), 2,82 (lH), 1,74 (lH), 0,89 (9H), 0,06 (GH). (e) Intermediat 5: (l'R,4'S/-7-/4-(((l,l-dimetylety1)- dimetylsilyloxi)metyl)-2-cyklopenten-l-yl/-2-imino-l,2-dihyd- ro-/1,2,4/oxadiazolo/3,2-i/-9H-purin-hydrobromid En omrörd, iskyld suspension av intermediat 4 (1,08 g) i metanol (20 ml) behandlades med en lösning av cyanbromid (0,34 g) i metanol (20 ml) tillsatt under 5 minuter. Efter 15 minuter fick suspensionen värmas till rumstemperatur, vilket gav en lösning. Efter 90 minuter avlägsnades lösningsmedlet genom indunstning. Återstoden tvättades med dietyleter (25 ml), och tillvaratogs sedan genom filtrering. Den fasta substansen tvättades ytterligare med eter (25 ml), torkades sedan i vakuum och gav titelprodukten (l,37 g);.Änmx (etanol) 228,2 nm (ßíâm 530), 285,2 nm (síâm 445): ln NMR (cnc13> 10,20 (ln), ,02 (lH), 8,37 (lH), 6,25 (lH), 6,01 (lH), 5,90 (lH), 3,69 PN' f' 31 sos 213 (2H), 3,05 (lH), 2,86 (lH), 1,73 (lH), 0,86 (9H), 0,03 (6H). (f) Intermediat 6: (l'R,4'S),9-/4-(((1,1-dimetyletyl)dimetyl- silyloxi)metyl)-2-cyklopenten-l-yl/-6-cyanoimino-l,6-dihydro- -l-metoxi-9H-purin En lösning av intermediat 5 (l,36 g) i dimetylformamid (10 ml) omrördes vid rumstemperatur och behandlades sedan med trietyl- amin (l,2 ml). Efter 40 minuter tillsattes jodmetan (0,54 ml) vilket gav en gul lösning. Efter 33/4 timmar avlägsnades lös- ningsmedlet genom indunstning. Återstoden fördelades mellan etylacetat (100 ml) och vatten (20 ml). Den organiska lös- ningen tvättades ytterligare med vatten (2 x 20 ml) och salt- lösning (20 ml), torkades (MgSO4) och indunstades till en fast substans. Denna fasta substans tvättades med dietyleter (25 ml) och tillvaratogs sedan genom filtrering. Denna vita fasta substans tvättades ytterligare med eter (10 ml), torka- des sedan i vakuum och gav titelprodukten (0,865 g); Amax (etanol) 227,2 nm (Eååm 449), 287,0 nm (Eïfâm 544); in NMR 8,23 (lH), 7,96 (lH), 6,24 (lH), 5,85 (lH), 5,65 (lH), 4,21 (3H), 3,66 (2H), 3,04 (lH), 2,77 (lH), 1,68 (lH), 0,88 (9H), 0,05 (6H). (g) Intermediat 7: (l'R,4'S)-9-/4-(((l,l-dimetyletyl)-di- metylsilyloxi)metyl)-2-cyklopenten-l-yl/-6-metoxiamino-9H- purin-2-amin En lösning av intermediat 6 (802 mg) och l,8-diazabicyklo- /5,4,0/undec-7-en (0,45 ml) i etanol (80 ml) omrördes och upphettades vid âterflöde. Upphettningen stoppades efter 9 timmar och lösningen fick stå vid omgivningens temperatur över natten. Lösningsmedlet avlägsnades genom indunstning. Den kvarvarande oljan kombinerades med den från ett tidigare för- sök (4 % skala), underkastades sedan kolonnkromatografi på kisel (40 g, Merck 9385) under eluering med kloroform och därefter med klorofimmretanol-blandningar och gav ett skum.

Detta skum sönderdelades med dietyleter (10 ml) och den er- hållna fasta substansen tillvaratogs genom filtrering. Den fas- ta substansen tvättades ytterligare med eter (5 ml); torkades I.. 505 2213 32 'v-ffm' l'- sedan i vakuum och gav titelprodukten (594 mg); jLmax (etanol) 282,2 nm (Eââm 409); 1H NMR (DMSO-dö) 9,76 (lH), 7,32 (lH), 6,53 (2H), 6,08 (lH), 5,88 (lH), 5,26 (lH), 3,72 (3H), 3,61 (2H), 2,90 (lH), 2,50 (lH), 1,52 (lH), 0,83 (9H), 0,02 (6H). (h) Intermediat 8: (lS,4R)-4-/2-amino-6-metoxiamino-9H-purin- -9-yl/-2-cyklopenten-metanol En lösning av intermediat 7 (356 mg) i tetrahydrofuran (35 ml) omrördes vid rumstemperatur och behandlades sedan med tetra- butylammoniumfluorid (1,0M lösning i tetrahydrofuran, 1,4 ml).

Efter 90 minuter störtkyldes reaktionsblandningen med vatten (l ml), lösningsmedlen avlägsnades sedan genom industning.

Den kvarvarande oljan underkastades kolonnkromatografi på kisel (20 g, Merck 7734) under eluering med kloroform och sedan med kloroform-metanol-blandningar och gav titelprodukten som en fast substans (243 mg); )_maX (pH 6 buffert) 280,2 nm (ßíâm 534); ln NMR (nmso-66) 9,75 (ln), 7,39 (ln), 6,52 (zn), 6,10 (lH), 5,84 (lH), 5,27 (lH), 4,73 (lH), 3,40 (ZH), 2,83 (lH), 2,55 (lH, 1,52 (lH). (lS,4R)-4-/2,6-diamino-9H-purin-9fyl/-2-cyklopentenkarbinol En omrörd, iskyld lösning av intermediat 8 ( 210 mg) i vatten (10 ml) och tetrahydrofuran (50 ml) behandlades med aluminium- amalgam /från aluminium (237 mg) och 0,5 % vattenhaltig kvick- silverkloridlösning/, tillsatt i små portioner under 15 minuter.

Efter 40 minuter fick den omrörda blandningen värmas till rumstemperatur. Efter 15 timmar filtrerades den erhållna bland- ningen genom kiselgur för avlägsnande av olösligt material.

Dessa tvättades med vatten:tetrahydrofuran (l:5, 60 ml). De kombinerade filtraten indunstades. Återstoden underkastades kolonnkromatografi på kisel (10 g, Merck 9385), under eluering med kloroform-etanol-blandningar, vilket gav titelprodukten i form av ett skum (159 mg); /GUD -810 (c 1,04, metanol);2_ (pH 6 buffert) 255,0 nm (Eåâm 302), 280,8 nm (Eââm 381), ln NMR (nmso-66) 7,61 (la), 6,66 (zn), 6,10 (in), 5,87 <1n), ,76 (ZH), 5,38 (lH), 4,76 (lH), 3,45 (2H), 2,87 (lH), 2,60 (lH), 1,60 (lH). maX 'P 'n p' 22 505 213 Exempel l3 (lS,4R)-4-(2-amino-6-hydroxi-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl- karbinol (l'R,4'S),2-amino-l,9-dihydro-9-/4-hydroximetyl-2-cyklopenten- -l-yl/-6H-purin-6-on En grumlig lösning av titelföreningen från exempel l2 (l44 mg) i 0,lM pH 6 buffert (10 ml) (från 28,4 g dinatriumorto- fosfat i 2 liter vatten, justerad med ortofosforsyra) be- handlades med en lösning av adenosindeaminas (0,5 ml, 778 en- heter) i 50 % glycerol ' 0,0lM kaliumfosfat, pH 6,0, Omröïdes därefter och uppvärmdes till 370. Efter 18,5 timmar avkyldes den erhållna suspensionen. Den tillvaratagna fasta substansen omkristalliserades ur vatten och gav titelprodukten som en vit fast substans (se mg), /a7Dl;49° (C oís, dimety1su1fox1d)= Amax (pa 6 buffert) 252,6 nm (Elcm 531), H NMR (nmso-a6> ,60 (lH), 7,60 (lH), 6,47 (2H), 6,10 (lH), 5,86 (lH), 5,33 (lH), 4,72 (lH), 3,45 (2H), 2,59 (lH), 1,58 (lH).

Exempel 14 Framställning av enantiomerer av (lu,4K)-4-(2-amino-6-hydroxi- -9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenylkarbinol (a) (lS,4R)-4-(2-amino-6-hydroxi-9H-purin-9-yl)-2-cyklopente- nyl-karbinol Diaminoanalogen (100 mg) (exempel ll) löstes i 3 ml 0,05M KZPO4-buffert (pH 7,4) under upphettning (50°C). Lösningen kyldes till rumstemperatur och 40 enheter adenosindeaminas (Sigma, typ VI, kalv intestinal mucosa) tillsattes. Efter 3 dagars inkubation vid rumstemperatur bildades en fällning vilken avlägsnades genom filtrering, utbyte 18,2 mg. Filtra- tet koncentrerades till 1,5 ml och avkyldes i 2 dagar. Ytter- ligare fast substans erhölls genom filtrering, utbyte 26,8 mg. De två fasta fraktionerna omkristalliserades ur vatten och gav den rena titelprodukten, smältpunkt 269-272°C, AX/É4 -62,1° (C 0,3 meon). ¿ _ 505 2013 3,, (b) (lR,4S)-4-(2-amino-6-hydroxi-9H-purin-9-yl)-2-cyklo- pentenyl-karbinol Filtraten från framställningen av lS,4R-isomeren (exempel l4a) kombinerades och indunstades till torrhet. Det oför- ändrade diaminoutgångsmaterialet separerades på en kiselgel- snabbkolonn med användning av 10 % metanol/kloroform. Diamino- föreningen upplöstes i 0,05M KZPO4-buffert, pH 7,4 (15 ml) och 800 enheter adenosindeaminas tillsattes. Lösningen inkube- rades i 96 timmar vid 37OC. TLC indikerade att viss oreage- rad produkt fanns kvar. Lösningen upphettades i kokande vatten i 3 minuter och filtrerades för avlägsnande av de- naturerat protein. Ytterligare 800 enheter adenosindeaminas tillsattes och förfarandet upprepades. Den deproteinerade lösningen indunstades till torrhet och produkten kristalli- serades ur vatten. Titelprodukten i form av en vit fast substans tillvaratogs genom filtrering ur vatten, smältpunkt 265-27o°, /a7š4 +61,1 (c 0,3 meon).

Exempel 15 (i)-(lu,4N)-4-(2-amino-6-hydroxi-9H-purin-9-yl)-2-cyklo- pentenyl-acetoxikarbinol Till en suspension av produkten från exempel 10 (130 mg, 0,50 mmol) och 4-dimetylaminopyridin (5 mg, 0,04 mmol) i en blandning av acetonitril (6 ml) och trietylamin (0,09 ml, 0,66 mmol) sattes ättiksyraanhydrid (0,06 ml, 0,6 mmol).

Blandningen omrördes vid rumstemperatur i 3 timmar. Metanol (1 ml) tillsattes för störtkylning av reaktionen. Lösningen kon- centrerades och absorberades på kiselgel (1,5 g), packad på en kolonn (2,0 x 12 cm), eluering med CHCI3-MeOH (20:l). Pro- duktfraktionerna tillvaratogs och koncentrerades och gav en vit fast atßtans. Den fasta produkten tvättades med MeOH- AcOEt: utbyte, l23 mg (85 %). Ytterligare rening ur metanol gav titelprodukten som nållika kristaller, smältpunkt 237- 239°c. Analys (cl3Hl5N5o3) c, H, N. 'ru f i' W as 505 213 I Exempel 16 (lS,4R)-4-/2-amino-9H-purin-9-yl/-2-cyklopentenylkarbinol En omrörd, iskyld lösning av (lS,4R)-4-/2-amino-6-metoxi- amino-9H-purin-9-y1/-2-cyklopenten-metanol (intermediat 8, exempel 12) (l,202 g) i tetrahydrofuran (250 ml) och vatten (50 ml) behandlades med aluminiumamalgam (ur aluminium (l,76l g) och 0,5 % vattenhaltig kvicksilverkloridlösning), tillsatt i små portioner under en timme och 47 minuter.

Efter 35 minuter fick den omrörda blandningen antaga rums- temperatur. Efter l6 timmar och 50 minuter tillsattes mer aluminiumamalgam (frân 235 mg aluminium) under 14 minuter.

Efter ytterligare 4 timmar och 10 minuter filtrerades den erhållna blandningen genom kiselgur för avlägsnande av olösliga material. Dessa tvättades med tetrahydrofuranzvatten (5:l, 300 ml). De kombinerade filtraten indunstades och gav ett gult skum. Skummet underkastades kolonnkromatografi på kisel (33,8 g, Merck 7734) framställd i kloroform och eluerad med kloroform-etano1-blandningar och gav flera fraktioner (578 mg, 420 mg och 40 mg). De tvâ större frak- tionerna kristalliserades separat ur isopropanol. Filtraten kombinerades med den minsta kolonnfraktionen och underkasta- des preparativ tunnskiktskromatografi (Merck 5717) framkallad tre gånger i l0:l kloroformzmetanol. Plattorna eluerades med etylacetat och etylacetat-etanol (l:l) och gav en brun fast substans (45 mgfi. Den fasta substansen underkastades kolonnkromatografi på kisel (2,7 g, Merck 7734) framställd i kloroform och eluerad med kloroform-metanol-trietylamin- blandningar och gav en gummiartad produkt (17 mg). Efter en icke framgångsrik kristallisation ur isopropanol och trä- kolbehandling i metanol, frystorkades en vattenhaltig lösning av det återvunna materialet för bildning av titelföreningen (15 mg). lH NMR (DMSO-ds) 1,62 (lH), 2,63 (lH), 2,89 (lH), 3,45 (2H), 4,73 (lH), 5,48 (lH), 5,91 (lH), 6,14 (lH), 6,50 (za), 7,98 (in), 8,57 (in). Masspektrum, /nn/"L 232.

Exempel 17 Tablettformuleringar A: Den följande formuleringen framställdes genom våtgranule- (f '__. sos 213 36 ring av ingredienserna med en lösning av povidon i vatten, torkning och "screening", följt av tillsats av magnesium- stearat och pressning. mg/tablett (a) Aktiv komponent 250 (b) Laktos, B.P. 210 (c) Povidon, B.P. 15 (d) Natriumstärkelseglykolat 20 (e) Magnesiumstearat 5 500 B. Följande formulering framställdes genom direkt pressning; laktosen är av den typ som kan pressas direkt. mg/tablett Aktiv komponent 250 Laktos 145 Avicel 100 Magnesiumstearat 5 500 C. (Formulering med kontrollerad frigöring). Formuleringen framställdes genom vâtgranulering av komponenterna (nedan) med en lösning av povidon i vatten, torkning och "screening" följt av tillsats av magnesiumstearat och pressning. mg/tablett (a) Aktiv komponent 500 (b) Hydroxipropylmetylcellulosa (Methocel K4M Premium) ll2 (c) Laktos, B.P. 53 (d) Povidon, B.P. 28 (e) Magnesiumstearat 7 700 I .Yuma 37 505 213 I Exempel l8 Kapsel-formulering En kapsel-formulering framställes genom blandning av kompo- nenterna nedan och fyllning i tvådelade hårdgelatinkapslar. mg/kapsel Aktiv komponent l25 Laktos 72,5 Avicel 50 Magnesiumstearat 2,5 250 Exempel 19 Injicerbar formulering Aktiv komponent 0,200 g Natriumhydroxidlösning, 0,lM q.s. till ett pH av ungefär ll.

Sterilt vatten q.s. till l0 ml.

Den aktiva komponenten suspenderas i en del av vattnet (vilket kan vara varmt) och pH justeras till ungefär ll med en lösning av natriumhydroxid. Satsen inställes sedan på volymen och filtreras genom ett steriliserande gradmembran- filter in i en steril l0 ml-glasflaska och förseglas med sterila förslutningar och överförslutningar.

Exempel 20 Suppositorier mg/suppositorium Aktiv komponent (63 um) 250 Hârdfett, BP 1770 2020 En femtedel av hârdfettet smältes i en ångmantlad panna vid 45°C maximum. Den aktiva komponenten siktas genom en 200 um sikt och sättes till den smälta basen medelst blandning, med användning av en högskjuvømrörare tills en dispersion erhålles. Under upprätthållande av blandningen vid 45°C tillsättes det kvarvarande hårda fettet till suspensionen .e _. sus 213 38 och omröres för säkerställande av en homogen blandning. Hela suspensionen får passera genom ett 250,nm sâll av rostfritt stål och får, under fortsatt omröring, kallna till 40oC. 2,02 gnav blandningen fylles i lämpliga 2 ml plast-formar.

Suppositorierna får kallna vid rumstemperatur. \“ ,'* 'nl 39 sus 213 I Exempel 21 - Antiviral aktivitet (A) Anti-HIV-analys Föreningar med formeln (I) screenades med avseende på anti- HIV-aktivitet vid the National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility, Frederick, Maryland (FCRF). Nedan anges de aktuella screening-förfarandena (screening mode ope- rational procedures) använda vid FCRF. Protokollet består av tre områden, (I) framställning av infekterade celler och dis- tribution till testplattorna, (II) preparationer av läkemedels- utspädningsplattor och distribution till testplattorna, och (III) XTT-analysförfarande. Jämför D.A. Scudiero et al., "A New Simplified Tetrazolium Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture", Cancer Res., gå, 4827, (1988).

I. Infektion och distribution av ATH8-celler till mikrotiter- skålar Celler som skall infekteras (en normal lymfoblastoidcellinje som uttrycker CD4) placeras i koniska 50 ml centrifugrör och behandlas i en timme med l-Zlug/ml polybren vid 37°C. Cellerna pelleteras därefter i 8 minuter vid 1200 varv/minut. HIV- virus, utspätt 1:10 i media (RMPI-1640, 10 % humanserum eller % fetalt kalvserum (FCS), med IL-2 och antibiotika), till- sättes för att ge ett MOI av 0,001. Enbart medium sättes till virusfria kontrollceller. Under antagande av en infektiös virustiter av 10-4 representerar ett MOI av 0,001 8 infek- tiösa viruspartiklar per 10.000 celler. Ungefär 500.000 celler/ rör utsättes för 400 pl av virusutspädningen. Den erhållna blandningen inkuberas i en timme vid 37°C i luft-C02, De in- fekterade eller icke-infekterade cellerna spädes och ger 1 x -4 (med ett humanserum eller 2 x 10-4 celler/100 /ul . (med fetalt kalvserum) Infekterade eller icke-infekterade celler (l00,u1) distribue- ras till ändamålsenliga brunnar av en 96-brunn, U-botten mikro- titerplatta. Varje utspädd förening testas två gånger med infekterade celler. Icke-infekterade celler undersökes med avseende på läkemedelskänslighet i en enkel brunn för varje utspädning av föreningen. Läkemedelsfria kontrollceller, in- sos 213 40 f' 'dn- fekterade och icke-infekterade körs i triplikat. Brunnarna B2 till G2 tjänar som reagenskontroll och fick endast medium.

Plattorna inkuberas vid 37oC i luft-C02 tills läkemedel till- sättes.

II. Läkemedelsutspädning och tillsats Utspädningsplattor (platt botten 96 brunnar, mikrotiter- plattor) behandlas över natten med fosfatbuffrad saltlake (PBS) eller media innehållande minst 1 % FCS eller l % human- serum (beroende på mediumet använt i testet) med början vid analysdagen. Detta "blocking"-förfarande användes för att begränsa adsorptionen av läkemedlet till mikrotiterskâlarna under utspädningsförfarandet. Brunnarna fylles komplett med blockeringslösningen och får stå vid rumstemperatur i en fuktad kammare under en huv.

Utspädningsförfarandet började genom att testföreningen först utspäddes 1:20. Blockerade utspädningsplattor framställes genom att blockinglösningen stänktes ut (flicking out) och torkades torr på steril gasvävnad. Alla brunnar i varje platta fylles därefter med 225¿ul av det ändamålsenliga mediumet med användning av ett Cetus-vätskehandlingssystem. 25 mikro- liter (25 pl) av varje 1:20-utspädd förening tillsättes därefter manuellt till rad A av en blockerad och fylld utspädningsplatta. Fyra föreningar, tillräckligt för att tillhandahålla tvâ testplattor, tillsättes per utspädnings- platta. De fyra föreningarna utspädes därefter i serie 10 gånger från rad A till rad H med användning av Cetus vätske- hanteringssystem. Startutspädningen av varje förening i rad A är vid denna punkt l:200. Utspädningsplattorna hålles på is tills de behövs.

Med användning av en multikanalpipett med 6 mikrotoppar över- föres l0O¿pl av varje läkemedelsutspädning till testplattor- na som redan innehåller l0O,nl medium plus celler. Slutspäd- ningen i testplattan börjar vid l:400 (brunnar B4 till G4).

Denna utspädning (till 0,25 % DMSO) hindrar DMSO-vehikeln att interferera med celltillväxten. Läkemedelsfria, infekte- L 41k us 213 rade eller icke-infekterade celler (brunnarna B3 till G3) och reagenskontrollerna (B2 till G2) får enbart medium. De två slutföreningarna överföres därefter frân brunnarna H7 till H12 till en andra testplatta med användning av samma förfarande. Testplattorna inkuberas vid 37°C i luft-C02 i 7-14 dagar eller tills viruskontroller är lyserade vilket fastställes makroskopiskt.

III. Kvantifiàning av viral cytopatogenicitet och läkemedels- aktivitet A. Material l. En lösning av 2,3-bis/2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl/-5- /(fenylamino)karbonyl/-2H-tetrazolium-hydroxid. (XTT) - l mg/ ml lösning i media utan FCS. Lagring vid 4°C. Framställning varje vecka. 2. Fenazinmetosulfonat (PMS)-stamlösning - Denna kan fram- ställas och hållas frusen vid -20°C tills den erfordras. Detta bör göras i PBS till en koncentration av 15,3 mg/ml.

B. Mikrokultur-tetrazolium-analys (MTA) 1. Preparation av XTT-PMS-lösning - XTT-PMS framställes omedel- bart innan dess tillsats till brunnarna av odlingsskâlen.

Stam-PMS-lösningen spädes l:l00 (0,l53 mg/ml). Utspädd PMS tillsättes till varje ml XTT som erfordras för att ge en slut- lig PMS-koncentration av 0,02 mM. Ett 50 pl-prov av XTT-PMS- blandningen sättes till var och en av de ändamålsenliga brun- narna och plattan inkuberas i 4 timmar vid 37°C. Plattför- slutningarna avlägsnas och ersättes med adhesiva plattför- seglingsanordningar (Dynatech cat 001-010-3501). De förseg- lade plattorna skakas på en mikrokulturplattblandare och absorbansen fastställes vid 450 nm.

IV. Resultat De erhållna uppgifterna uppfördes som procent testceller jäm- fört med icke-infekterade celler (%) för både infekterade och icke-infekterade celler som en funktion av den ökande koncen- trationen av testföreningen. f sus 2013 42 De angivna uppgifterna möjliggör beräkning av en effektiv koncentration (EC50) med avseende på infekterade celler, en inhiberande koncentation (IC50) med avseende på normala celler och ett terapeutiskt index (TI50).

De inhiberande koncentrationerna mot HIV fastställda såsom beskrivits ovan för föreningarna enligt exemplen 7, 9, 10, ll och l4(b) visas i tabell l.

Tabell l Förening Exempel Cellinje ED50 ID50 TI50 9a 7 MT-2 2,3 50 21,4 l3a 9 MT-2 0,41 6,97 17,3 l4a 10 MT-2 0,15 100 667 l5a ll MT-2 2,9 )l25 )42,7 (-) l4a l4(b) CEM 0,66 189 284 Föreningarna enligt exemplen 5 och 8 visade alltså antiviral aktivitet i detta test.

En tidigare analys genomförd vid Southern Research Institute gav ett TI50 av ungefär 200 när MT-2-celler odlades med H9/ HILV-IIIB.

(B) Aktivitet mot Feline Leukemia-virus Antiviralt test med avseende på aktivitet mot FeLV-FAIDS genom- fördes i 96-brunnplattor (Corning) med användning av 8lC- indikatorceller i Iscove's Modified Dulbecco's medium supple- menterat med l0%+igt värmeinaktiverat fetalt bovinserum (FBS). timmar innan analysen ympades plattorna med 8lC-celler vid 5 x 103 celler/brunn. Pâ dagen för analysen förbehandlades cellerna i 30 minuter vid 37°C med DEAE-dextran (25¿ug/ml) i 0,1 ml Hanks balanserade saltlösning. Denna avlägsnades och därefter tillsattes 0,1 ml tillväxtmedium innehållande 32 TCID50 av FeLV-FAIDS, eller 0,1 ml tillväxtmedium enbart, 43 0505 213 till varje brunn. Viruset fick adsorbera i en timme, därefter tillsattes 0,1 ml test- eller positiv kontroll-förening (2',3'- dideoxicytidin; ddC) eller tillväxtmedium. Plattorna inkube- rades vid 37oC. Cellerna matades med färskt tillväxtmedium innehållande föreningen dag 4 efter infektionen. Odlings- mediumet förändrades fullständigt och ersattes med färskt medium innehållande föreningen på dag 7 efter infektion. På dag 10 efter infektion fixerades cellerna med formalin, fläckades med 0,1 % Coomassie Brilliant Blue R-250 och ob- serverades mikroskopiskt med avseende på CPE och läkemedels- cytotoxicitet.

Föreningen enligt exempel 10 hade ett ED50 av l,9¿ug/ml.

(C) Aktivitet mot murin AIDS Falcon 6-brunnvävnadskulturplattor ympades med 1,75 x 105 celler per brunn i en total volym av 2,5 ml EMEM innehållande % värmeinaktiverat FBS. 24 timmar efter det att cellerna ympats dekanterades mediumet och 2,5 ml DEAE-dextran (25,ng/ ml i fosfatbuffrad saltlake) tillsattes till varje brunn.

Kulturerna inkuberades vid 37oC i en timme, varefter DEAE- dextran-lösningen dekanterades och cellskikten sköljdes en gång med 2,5 ml PBS. Normala cellkontroller återmatades med enbart 2,5 ml medium (inget virus eller läkemedel). Läkemedels- kontrollkulturer fick 2,5 ml medium innehållande läkemedel men inget virus. Virus-infekterade kontrollkulturer fick 0,5 ml av den ändamålsenliga utspädningen av stam CAS-BR-M för fram- ställning av räkningsbara plack plus 2,0 ml medium. Testpro- ven fick 0,5 ml av den ändamålsenliga virusutspädningen plus 2,0 ml medium av läkemedelsutspädningen. Sex koncentrationer av testföreningen utspädd i halv-loglo-utspädningar i serie testa- des. Tre koncentrationer av det positiva kontrolläkemedlet, ddC, testades. Triplikatbrunnar för varje koncentration av testförening och 6 virus och 6 cellkontrollkulturer inkludera- des i varje analys. På dag 3 fastställdes post-virusinokula- tionstoxicitet av läkemedlet för SC-1-cellerna genom mikro- skopisk examination av fläckade duplikatceller och läkemedels- kontrollkulturer. De kvarvarande test- och kontrollkulturerna 505 2013 44 bestrålades med en ultraviolett lampa i 20 sekunder och XC- celler sattes till varje kultur (5 x 105 celler/brunn i 2,5 ml EMEM innehållande 10 % värmeinaktiverat FBS). Pâ dag 3 efter UV-bestrålning fixerades kulturerna med formalin och fläckades med kristallviolett. Plackerna räknades med hjälp av ett dissektionsmikroskop.

Antiviral aktivitet i CAS-BR-M-plackreduktion uttrycktes som reduktion i medelantalet plack räknade i läkemedelsbehandlade virusinfekterade kulturer jämfört med medelantalet plack be- räknade i de obehandlade virusinfekterade kontrollkulturerna (% kontroll). Föreningen enligt exempel 10 hade ett ED50 av l,l /ug/ml .

(D) Aktivitet mot Simian retrovirus SAIDS (SRV-2) Antiviral screening mot SAIDS-virus (D/Washington) genomför- des med en syncytia-inhiberingsanalys på Raji-celler. Läke- medlet utspäddes i fullständigt Iscove's medium och därefter tillsattes 100 pl av varje utspädning till de ändamålsenliga brunnarna i en 96-brunnplatta. Aktivt växande Raji-celler, x 103 celler i 50lp1 komplett Iscove's medium, sattes där- efter till varje brunn. Detta följdes genom tillsats av 50/ul klarad supernatant från en SRV-2/Raji-cell-samkultur.

DDC inkluderades i denna analys som positivt kontrolläkemedel.

Plattorna inkuberades vid 3700 i fuktad atmosfär innehållande % C02. Syncytia räknades på dag 7 efter infektion. Läke- medelstoxicitet faställdes genom jämförelse av levande cell- räkning av det icke-infekterade läkemedelsbehandlade provet med livsdugligheten hos den icke-infekterade obehandlade kon- trollen. Föreningen enligt exempel 10 hade ett ED50 av 2,8 pg/ml.

(E) Aktivitet mot Visna Maedi-virus Den antivirala aktiviteten mot Visna Maedi-virus (VMV) stammen WLC-l, fastställdes genom mätning av reduktion av virus-speci- fik immunohistokemisk fläckning. Monoskikt av fårchoroid ple- xus-celler infekterades med VMV och överlades med serieutspäd- ningar av testföreningarna. Efter inkubation i 5 dagar inku- -_ '__ 45 5505 213 berades monoskikten ytterligare med virusspecifika antisera konjugerade till pepparrotsperoxidas (HRP). Efterföljande in- kubation av monoskikten med ett kromagent substrat av HRP, stamomraden av virusreplikation. Dessa diskreta foci räknades och koncentrationen av testföreningen som erfordrades för att reducera antalet foci till 50 % för den av läkemedelsobehand- lade kontroller beräknades.

Föreningen enligt exempel 13 hade ett EDSO av 0,2¿pg/ml.

Exempel 22 Cytotoxisk aktivitet Föreningarna enligt exemplen 5, 7 och 8 visade cytotoxisk aktivitet när de testades mot P388-mössleukemi-cellkultur- analysen såsom beskrivits av R.G. Alonquist och R. Vince, J. Med. Chem., 16, 1396 (1973). Erhållna ED50 (mg/ml) var: exempel 5 12 exempel 7 40 exempel 8 3

Claims (18)

1. 505 213 m, PATENTKRAV l. En förening med formeln (I) 0 O /\\N/ \ (1) vari X är väte, NRRI, SR, OR eller halogen; Z är väte, OR2 eller NRRl; R, Rl och R2 kan vara lika eller olika och väljes bland väte, C l-4 och farmaceutiskt godtagbara derivat därav. alkyl och aryl;

2. En förening med formeln (I) enligt patentkravet l och farmaceutiskt godtagbara salter därav.

3. En förening enligt patentkravet l eller 2, varvid i före- ningen med formeln (I) Z är H, OH eller NH2.

4. En förening enligt något av patentkraven l-3, vari Z är NH2.

5. En förening enligt något av patentkraven l-4, vari X är väte, klor, NH2, SH eller OH.

6. En förening enlßfiznågot av patentkraven l-5, vari X är OH.

7. En förening enligt något av patentkraven l-5, vari X är H eller NH2. -_ .__ a» _ 505 213

8. En förening vald bland: (1d,4ß)-4-(6-klor-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-karbinol; (lu,4N)-4-(6-hydroxi-9H~purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-karbinol; (l&,4&)f4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-cyklopenteyl-karbinol; (lu,4K)-4-(6-merkapto-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-karbinol; (ld,4(J-4-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-2-cyklopentenyl-karbi- nol; (lM,4fiJ-4-(2-amino-6-klor-9H-purin-9-yl)-2-cyklopenteyl-karbi- nol; och (l«,4NJ-4-(2-amino-9H-purin-9-yl)-2-cyklopenteyl-karbinol.

9. (lu,4«)-4-(2-amino-6-hydroxi-9H-purin-9-yl)-2-cyklopente- nyl-karbinol.

10. lO. En förening enligt något av patentkraven l-9 huvudsakligen i form av en racemisk blandning.

11. ll. En förening enligt något av patentkraven 1-9 huvudsakligen bestående av en optisk isomer.

12. En förening enligt något av patentkraven l-9 huvudsakligen betående av D-isomeren.

13. En förening med formeln (I) såsom definierats i något av patentkraven l-12 eller ett farmaceutiskt godtagbart derivat därav för användning som ett aktivt terapeutiskt medel.

14. En förening med formeln (I) såsom definierats i något av patentkraven l-12 eller ett farmaceutiskt godtagbart derivat därav för användning vid framställning av ett läkemedel för behandling av en viral infektion.

15. En farmaceutisk beredning innefattande en förening med formeln (I) såsom definierats i något av patentkraven l-12 eller ett farmaceutiskt godtagbart derivat därav tillsammans med en farmaceutiskt godtagbar bärare därför. sus 213 4*

16. En farmaceutisk beredning innefattande en förening med formeln (I) såsom definierats i något av patentkraven l-12 eller ett farmaceutiskt godtagbart salt därav tillsammans med en farmaceutiskt godtagbar bärare därför.

17. En farmaceutisk beredning enligt patentkravet 14, vilken dessutom innehåller ett ytterligare terapeutiskt medel.

18. En förening med formeln (II) vari X är väte, NRRl, SR, OR, halogen eller skyddade former därav; Y är OH eller en skyddad form därav; Z är väte, OR2, NRRl eller skyddade former därav; R, Rl och R2 kan vara lika eller olika och väljes bland väte, Cl_4alkyl och aryl och farmaceutiskt godtagbara derivat därav.