PL163814B1 - Method of obtaining novel analogous compounds of dideoxy-didehydrocarbocyclic nucleosides - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych analogów nukleozydów didaoksydidehydrokarbocyklicznych, mianowicie analogów 2' ,:3*-dideoks^'^!2’/3*-didahydro-nukleozydu puryny, które nadaję się dc stosowania w lecznictwie, zwłaszcza jako środki przeciwwirusowe·

Z uwagi na podobieństwo funkcji komórkowych wirusów i gospodarza trudno Jest selektywnie zaatakować wirus pozostawiając nienaruszoną komórkę gospodarza· Istnieje stosunkowo niewiele środków, które są skuteczne wobec wirusów per se i trudno jest otrzymać środki przeciMMirusowe charakteryzujące sie dopuszczalnym wskaźnikiem terapeutycznym tj. środki, które mają znaczące działanie przeciwwirusowe w dawce, przy której wykazuję dopuszczalną toksyczność lub. dopuszczalne działanie uboczne.

Grupę wirusów, które ostatnio nabrały ważnego znaczenia, stanowię retrowirusy odpowiedzialne za ludzki zespół nabytego upośledzenia odporności /AIDS/· Takie wirusy dotychczas były określone różnymi nazwami, ale teraz zwykle nazywa się je wirusami ludzkiego upośledzenia odporności /HIV/j takie dwa wirusy, HIV-I i HIV-II, wyizolowano w sposób powtarzalny u pacjentów cierpiących na AIDS i stany pokrewne takie Jak kompleks pokrewny z AIDS /ARC/ i przewlekła limfadenopatia ogólna·

Chociaż uważa się, że szereg nukleozydów nadaje się do leczenia stanów związanych z infekcjami HIV, tylko żydowudyna /AZT, Retrovir/ została dopuszczona do leczenia, jednakże, wiadomo, że żydowudyna ma poważne działanie uboczne i wywołuje supresję szpiku kostnego prowadzącą do spadku liczby białych ciałek krwi i w konsekwencji do wyraźnej anemii. Istnieje zatem zapotrzebowanie na skuteczne środki, które byłyby mniej cytoksyczne.

Sposobem według wynalazku wytwarza się nową klasę analogów nukleozydów, które mają aktywność przaciwwirusową, określonych wzorem 1 przedstawionym na rysunku, w którym X

2 1 oznacza atom wodoru, grupę NRR , SR lub ORj Z oznacza atom wodoru, grupę OR lub NRRj

2 .

R, R i R mogą byc takie same lub różne i są wybrane spośród podstawników obejmujących atom wodoru, grupę C^_₄alkilową i arylową oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne.

Sposób wytwarzania analogów nukleozydów według wynalazku polega na reakcji związku o wzorze 10, w którym X* oznacza atom chlorowca a Z ma wyżej określone znaczenie, ewentualnie w postaci z zabezpieczonymi grupami funkcyjnymi, ze związkiem o wzorze ONRr\ w którym R i r! maję wyżej określone znaczenia, z reagentem dostarczającym jonu RO”, w którym R ma wyżej określone znaczenie, z tiomocznikiem lub ze środkiem redukującym, po czym ewentualnie mieszaninę racemiczną związku o wzorze 1 przeprowadza się w zasadniczo pojedyńczy izomer optyczny tego samego lub innego związku o wzorze 1 przez enzymatyczną konwersję lub związek o wzorze 1, w którym X oznacza grupę SH alkiluje się lub aryluje do związków o wzorze 1, w którym X oznacza grupę SR lub z zabezpieczonej pochodnej związku o wzorze 9, w którym X i Z mają wyżej określone znaczenia a Y oznacza grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową, usuwa się grupę zabezpieczającą i ewentualnie związek o wzorze 1 przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalną pochodną przez reakcje z kwasem, z zasadą, ze środkiem fosforylujęcym lub estryfikującym.

Oczywiste Jest dla znawcy, iż związki o wzorze 1 są związkami cis i że pierścień cyklopentenu w tych związkach zawiera dwa chiralne centra /które wskazano we wzorze la znakiem x/, związki te zatem mogą występować w postaci izomerów optycznych /tj. enancjomerów/ i ich mieszanin, w tym mieszanin racemicznych. Zakres niniejszego wynalazku obejmuje wytwarzanie wszystkich takich izomerów i ich mieszanin, w tym mieszanin racemicznych. Tak więc w związkach o wzorze 1 albo chiralne centrum, z którym jest związana zasada, ma konfiguracje R, a chiralne centrum z którym związana jest grupa CHjOH, ma konfigurację S /izomer 0/, albo chiralne centrum z przyłączoną zasadę ma konfigurację

S, a enntuum, z którym jest związana ruppa CHoOH aa konfiurracee R /lzmear //, Korzystnie związki maję postać mieszaniny racamfclaaC lub zasadniczo czystego izomeru 0. Izomer D można przedstawić wzorem lb, w którym X i Z mają lanaraafn określone dla wzoru 1.

Gdy dalej w opisie mówi się o związkach o wzorze 1, należy rozumieć, iż obejmuje on także związki o Mzorze 1b.

Oczywiste jest także dla znawcy, że niektóre ze związków o wzorze 1 mogę występować

163 814 w kilku postaciach teutomerycznych i wszystkie takie tautomery wchodzę także w zakres wynalazku.

Stosowany w opisie termin “chlorowiec dotyczy fluoru, chloru, bromu i Jodu, przy czym X Jako chlorowiec korzystnie oznacza chlor.

Określenie grupa Ci_₄alkilowa odnosi sie do grupy alkilowej o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu, np. grupy metylowej, etylowej, n-propylowej, 1-propylowej, n-butylowej, sec-butylowej i tert-butylowej. Korzystnie grupa Ci_4alkilowe oznacza grupę metylową.

Aryl dotyczy dowolnej mono- lub policyklicznej grupy aromatycznej i obejmuje niepodstawionę i podstawioną grupę arylowę /takę jak fenylowa, tolilowa, ksylilowa, anizylowa/ i niepodstawioną oraz podstawioną grupę aralkilową zawierajęcę grupą C^^alkilową, taką jak grupa fenylo-Ci_₄alkilowa, np. benzylowa lub fenetylowa.

W związkach o wzorze 1 Z korzystnie oznacza grupę aminową.

Korzystną grupę związków o wzorze 1 stanowią związki, w których X oznacza grupą OR, zwłaszcza OH.

Inne korzystna grupa związków obejmuje związki o wzorze 1, w których X oznacza grupą NRr\ zwłaszcza NH?, lub atom wodoru.

Szczególnie korzystne są te związki o wzorze 1, w których Z oznacza grupą NH2 a X oznacza atom wodoru, grupą NH2 lub, szczególnie, OH. Takie związki mają szczególnie pożądane wskaźniki terapeutyczne Jako środki przeciwwirusowe.

Przez farmaceutycznie dopuszczalne pochodne należy rozumieć farmaceutycznie dopuszczalne sole, estry lub sole takich estrów lub związków o wzorze 1 lub innych związków, które po podaniu pacjentowi są zdolne do dostarczenia aktywnego przeciwwirusowo metabolitu lub jego reszty.

Korzystne estry związków o wzorze 1 obejmują estry kwasów karboksylowych, w których niekarbonylowa grupa estru jest wybrana spośród atomu wodoru, grup alkilowych o prostym lub rozgałązionym łańcuchu /np. grupy metylowej, n-propylowej, tert-butylowej, n-butylowej/, alkoksyalkilowych /np. metoksymetylowej/ aralkilowych /np. benzylowej/, aryloksyalkilowych /np. fenoksyrnetylowej/, arylowych /np. fenylowej, ewentualnie podstawionej atomem chlorowca, grupą C^^alkilową lub Cj_₄alkoksylową/ estry sulfonianowe takie jak alkilo- lub aralkilosulfonylowe /np. metanosulfonylowy/j estry aminokwasów /np. L-walilowe lub L-izoleucylowe/ i estry mono-, di- lub tri-fosforanowe.

Występująca w powyższych estrach grupa alkilowa, jeśli nie zaznaczono inaczej, korzystnie zawiera 1 do 18 atomów wągla, zwłaszcza 1 do z aoornóz węgla. Występująca w tych estrach grupa arylowa korzystnie zawiera grupu feoyylon·

Farmaceutycznie dopuszczalne sole związków o wzorze i obejmują sole z farmaceutycznie dopuszczalnym nieorganicznym 1 rraanicznym wwasern 1 z zasadami. Przykłady odpowiednich kwasów obejmują kwas solny, bromowodorowy, siarkowy, azotowy, nadchlorowy, fumarowy, maleinowy, fosforowy, glikolowy, mlekowy, salicylowy, bursztynowy, tolueno-p-sulfonowy, winowy, octowy, cytrynowy, metannsulfnnnwy, mrówkowy, benzoesowy, malonowy, naftaleno-Z-sufonowy i benzenosulfonowy. Inne kwasy takie jak szczawiowy, chociaż nie są farmaceutycznie dopuszczalne, mogą być przydatne do wytwarzania soli stanowiących półprodukty do otrzymywania związków o wzorze 1 i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasem.

Sole z zasadami obejmują sole metali alkalicznych /np· sodu/, metali ziem alkalicznych /np. megnezu/, sole amonowe i NR4+ /R oznacza grupą ^^alkilową/·

Gdy mówi się o związkach wytwarzanych sposobem według wynalazku, dotyczy to zarówno związków o wzorze i Jak i ich farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych.

Konkretne związki o wzorze 1 obejmują i /I o£ ,4 oC /-4-/6-ch0ozn-9H-puryn-9-ylo/-2-cyklopeπtenylo-oatannl, /i oC ,4 06 /-4-/6-hydroksy-9H-puzyn-9-y0o/-2-cyk0openteny0o-metanol,/l oC ,4 oC/-4-/6-aminn-9H-puzyn-9-y0o/-2-cyklopentany0o-oetanol, /i oC ,4 oC /-4-/6-merkapto-9H-puzyn-9-yln/-2-cyk0opantenylo-metanol, /lo£ ,4 o£ /-4-/2-aoiyn-6-chl.oro-9H-puryn-9-y0n/-2-cyklnpentayy0n-oatano0, /1 oC 14 o£/-4-/2-amino-6-hydroksy-9H-puryn-9-ylo/-2-cyklopentenylo-metanol, /1 cC ,4 0C/-4-/

163 814 /2,6-diamino-9H-puryn-9-ylo/-2-cyklopentenylo-metanol, w postaci mieszaniny racemicznej lub pojedynczego enancjomeru.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku albo same mają aktywność przeciwwirusową i/lub metabolizują do takich związków. Zwłaszcza związki te są skuteczne w hamowaniu replikacji retrowirusów, w tym ludzkich retrowirusów, takich jak wirusy ludzkiego upośledzenia odporności /HIV/, stanowiące środki przyczynowe AIOS.

Niektóre ze związków wytwarzanycc sppsobbe według wynalazku mają aktywność przeciwrakową, zwłaszcza te związki o wyzkzr 1, w których Z oznacza atom wodoru.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku wykazujące aktywność praeciwwipusswą nadają się także do leczenia stanów związanych z AIOS takich jak kompleks związany z AIDS /ARC/, postąpującn ogólna llmfndeyspatia /PGL/, stany neurologiczne związane z AIDS /takie jak demencja lub paraperem tropikalna/, odczyny dodatnie na przeciwciała anty-HIV i odczyny dodatnie na HIV, mięsek Kaposi i plamica krwotoczna.

Ppaeclywlzuρoyz związki wytwarzane sposobem według wynalazku nadają się także do zapobiegania postąpowi klinicznych chorób u osobników, którzy wykazują dodatni odczyn na przeciwciała anty-H^ lub na antygen HIV oraz do profilaktyki po ekspozycji na HIV.

Związki pzzeclywlrusowe o wzozzz 1 lub ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne można stosować także do zapobiegania wirusowym zanieczyszczeniom płynów fizjologicznych takich jak krew lub nasienie sn sitro.

Niektóre zz swwązków s wzorze 1 nadają się także jako półprodukty do cwlnzrnynns innych związków o wzorze 1.

Związki o wzopzz 1 nadają się do profilaktyki Jak również leczenia wcstąpującceh już infekcji lub objawów.

Ilość związku stosowanego do leczenia będzie zmieniać się nie tylko w zależności od konkretnego stosowanego związku ale także wraz ze sposobem podawania, charakterem leczonego stanu, wiekiem i stanem pacjenta i powinna być ostatecznie ustalona według uzyaynn prowadzącego lekarza lub weterynarza. Jednakże na ogół odpowiednio dawka Jest w zakresię od około 1 do około 750 mg/kg, np. od około 10 do około 750 mg/kg wagi ciała na dzień, tak jak 3 ds około 120 mg na kilogram wagi ciała biorcy, dziennie, korzystnie w zakresie 6 do 90 mg/kg/dzień, a najkorzystniej w zakresie 15 do 60 mg/kg/drneń.

Żądana ilość może być dogodnie podawana w postaci jednej lub w postaci dawek podzielonych z odpowiednimi przerwami, np. 2, 3, 4 lub wiącej mniejszych dawek dziennie.

Związek dogodnie podaje się w postaci dawek jednostkowych, np, zawierających 10 do 1500 mg, dogodnie 20 do 1OOO mg, a szczególnie 50 do 700 mg substancji czynnej na postać dawki jednostkowej. Idealnie substancja czynna powinna być podawana w takiej ilości, aby uzyskać jej maksymalne steżenia w osoczu w zakresie od około 1 do około 75 ^z^, torzystnie około 2 do 50, a najkorzystniej około 3 ds oksłs 30 jjM · Mozn a t o zcyskać , np . piriiez dożylnią iniekcją 0,1 ds 9% roztworu substancji czynnej, ewentualnie w solance lub przez doustne podanie w postaci dużych pigułek zayizrającyeh skołs 1 ds sksłs 100 mg/kg substancji czynnej. Nizabądny pszism substancji czynnej we krwi można utrzymywać przez ciągłą infuzją, która dostarczy okołs O,Ol ds około 5,0 mg/kg/ godz. lub przez okresowe infuzje zawierające około 0,4 ds około 15 mg/kg substancji czynnej.

V/ celach leczniczych związek wytwarzany sposobem według wynalazku można podawać jako surowy związek, korzystnie Jednak substancja czynna powinna być w postaci środka farmaceutycznego .

Środek farmaceutyczny zawiera związek k wzorae 1 lub Jego farmaceutycznie dopuszczalną pochodną wraz z jednym lub wiecej farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i ewentualnie innymi leczniczymi i/lub profilaktycznymi składnikami. Nośnik lub nośniki muszą być dopuszczalne w tym sensie, iż muszą być kompatybilne z innymi składnikami śzodka i nie mogą działać szkodliwie na biorcą.

Śzodki farmaceutyczna obejmują środki nadające się do podawania doustnego, doodbytniczego, doyssowzgo, dk stosowania umiejscowionego /w tym policzkowe lub podjęaykkwe/, dspochwowego lub pozajelitowego /w tym dkmiąSniowzgo i dsżylniegs/ lub środki w postaci

163 814 odpowiedniej do inhalacji lub wdmuchiwania. środki, w razie potrzeby, mogą mieć postać podzielonych dawek jednostkowych i można je wytwarzać dowolnymi znanymi metodami. Wszystkie metody obejmują etap doprowadzenia do kontaktu związku czynnego z ciekłymi nośnikami lub subtelnie rozdrobnionymi nośnikami stałymi lub z obydwoma rodzajami nośników, i, ewentualnie, ukształtowania produktu do żądanej postaci.

środki farmaceutyczne do podawania doustnego dogodnie mogą mieć postać pojedyńczycn dawek takich jak kapsułki, opłatki lub tabletki, z których każda zawiera określoną ilość substancji czynnej, postać proszku lup granulek, roztworu, zawiesiny lub emulsji. Substancja czynna może być także w postaci dużej pigułki, powidełek lub papki. Tabletki i kapsułki do podawania doustnego mogą zawierać konwencjonalne zaróbki takie jak środki więżące, wypełniacze, środki smarujące, dezintegrujące lub zwilżające. Tabletki mogą być powleczone znanymi w technice sposobami. Ciekłe preparaty doustne mogą być w postaci, np. wodnych lub olejowych zawiesin, roztworów, emulsji, syropów lub eliksirów lub mogą być w postaci suchego produktu przeznaczonego do zestawienia z wodą lub innym odpowiednim nośnikiem przed użyciem. Takie ciekłe środki mogą zawierać konwencjonalne dodatki takie jak środki zawieszające, emulgujące, niewodne nośniki /które mogą obejmować jadalne oleje/ lub środki konserwujące.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą także być formułowane do postaci do podawania pozajelitowego /np. przez iniekcje lub ciągłą infuzją/ i mogą być w postaci dawek jednostkowych w ampułkach, wstąpnie napełnionych strzykawkach lub w wielodawkowych pojemnikach z dodanymi środkami konserwującymi. środki mogą mieć także postać zawiesin, roztworów lub emulsji w olejowych lub wodnych nośnikach i mogą zawierać środki do formułowania takie jak środki zawieszające, stabilizujące i/lub dyspergujące. Alternatywnie, substancja czynne może być w postaci proszku uzyskanego przez aseptyczne wydzielenie jałowego ciała stałego lub przez liofilizacje roztworu, który nadaje się do zestawienia z odpowiednim nośnikiem, np. jałową, wolną od czynników gorączkotwórczych wodą, przed użyciem.

Do stosowania miejscowego na naskórek związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być formułowane w postaci maści, kremów lub lotionów lub w postaci poprzezskórnych plastrów. Maści i kremy mogą, np. być formułowane z wodną lub olejową podstawą z dodatkiem odpowiednich środków zagęszczających l/lub żelujących. Pudry płynne /lotiony/ mogą być formułowane na podstawie wodnej lub olejowej i zwykle zawierają także jeden lub więcej środków emulgujących, stabilizujących, dyspergujących, zawieszających, zagąszczających lub barwiących.

środki nadające się do stosowania miejscowego w ustach obejmują romboidalne pastylki zawierające substancją czynną w zapachowej podstawie, zwykle w sacharozie z gumą arabską lub tragakantem, pastylki zawierające substancją czynną w obojętnej podstawie takiej jak żelatyna i gliceryna lub sacharoza i guma arabska, oraz płyny do płukania ust zawierające substancje czynną w odpowiednim ciekłym nośniku.

środki farmaceutyczne do podawania doodbytniczego, w których stosuje się stały nośnik, najkorzystniej mają postać czopków z dawką Jednostkową. Odpowiednie nośniki obejmują masło kakaowe i inne substancje zwykle stosowane i czopki można wytwarzać przez zmieszanie związku czynnego ze zmiękczonym lub stopionym nośnikiem lub nośnikami, a następnie oziąbnenie i ukształtowanie w formie.

środki nadające się do podawania dopochwowego mogą mieć postać pessariów, tamponów, kremów, żeli, past, pian lub środków do opryskiwania, zawierających obok substancji czynnej nośniki znane w technice farmaceutycznej, odpowiednie w danym zastosowaniu.

Do podawania donosowego związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być w postaci ciekłych środków do rozpylania lub w postaci kropli.

Krople mogą być formułowane z wodną lub niewodną podstawą, zawierającą także jeden lub wiącej środków dyspergujących, roztwarzających lub zawieszających. Ciecze do rozpylania dogodnie dostarcza się z opakowań ciśnieniowych.

Do inhalacji związki wytwarzane sposobem według wynalazku dogodnie podaje się z urzą163 814 dzenia do wdmuchiwania, z rozpylacza lub zbiornika ciśnieniowego lub w inny dogodny sposób, który daje rozpylony aerozol. W opakowaniach ciśnieniowych może znajdować się także odpowiedni propelant taki jak dichlorodifluorometan, trichlorofluorometen , dichlorotetrafluoroetan, dwutlenek węgla lub inny odpowiedni gaz. W przypadku pod ciśnieniem rozpylanych aerozoli dawką jednostkową można określić stosując zawór pozwalający na uzyskanie oznaczonej ilości.

Alternatywnie, do podawania przez inhalacją lub wdmuchiwanie, związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą mieć także postać suchej proszkowej kompozycji, np. proszkowej mieszanki związku i odpowiedniej proszkowej podstawy takiej Jak laktoza lub skrobia. Proszkowa mieszanka może być w postaci jednostkowych dawek np. w kapsułkach lub nabojach, np. żelatynowych lub w opakowaniach pącherzykowych, z których proszek można podawać za pomocą inhalatora lub insuflatora.

W razie potrzeby wyżej opisane formulacje można zaadaptować w celu uzyskania postaci o przedłużonym działaniu.

Środki farmaceutyczne zawierające związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą także zawierać inne substancje czynne, takie jak środki przeciwdrobnoustrojowe lub środki konserwujące.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być także stosowane w kombinacji z innymi środkami leczniczymi, np. innymi środkami przeciwzakaźnyrni. Zwłaszcza związki te mogą być stosowane razem ze znanymi środkami przeciwwirusowymi.

Wymienione wyżej kombinacje dogodnie mogą być stosowane w postaci środka farmaceutycznego, który zawiera taką kombinacją wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Odpowiednie środki lecznicze, które nadają się do użycia w takich kombinacjach, obejmują acykliczne nukleozydy takie jak acyklowir, interferony takie jakά -interferon, inhibitory wydalenia nerkowego takie jak probenecyd, inhibitory transportu nukleozydów takie jak dipirydamol, 2*,3'-dideoksynukleozydy takie Jak 2' ,3'-dideoksycytydyna, 2',3*-dideoksyadenozyna, 2',3'-dideoksyinozyna, 2*,3*-didaoksytymidyna i 2',3'-dideoksy-2',3*-didehydrotymidyna i immunomodulatory takie jak interleukina II /IL2/ i czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów /GM-CSF/, erytropoetyna i ampligen.

Pojedyńcze składniki takich kombinacji można podawać kolejno albo równocześnie, w oddzielnych lub w połączonych środkach farmaceutycznych.

Ceśli związek o wzorze 1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną pochodną stosuje się w kombinacji z innym środkiem leczniczym aktywnym wobec tego samego wirusa, dawka każdego ze związków może różnić się od dawki stosowanej, gdy każdy z tych związków jest użyty sam. Odpowiednie dawki może łatwo ustalić specjalista.

W sposobie według wynalazku może być potrzebne lub dogodne stosowanie związków wyjściowych, które mają zabezpieczone grupy funkcyjne i wówczas odblokowanie tych grup może stanowić przejściowy lub końcowy etap w syntezie żądanego związku.

Wprowadzanie grup zabezpieczających i ich usuwanie można przeprowadzić konwencjonalnymi metodami. Tak wiec np. grupy aminowe można zabezpieczyć grupą wybraną spośród grup aralkilowych /np. benzylową/, acylowych lub arylowych /np. 2,4-dinitrofenylową/, a w razie potrzeby można usunąć te grupy zabezpieczające przez hydrolizą lub hydrogenolize w standardowych warunkach. Grupy hydroksylowe można zabezpieczyć stosując konwencjonalne grupy zabezpieczające do grup hydroksylowych, np. takie Jak opisane w Protective Groups in Organic CheιlasSΓy, Ed. 0. F. W. McOmie /Plenum Press, 1973/ lub w “Protective Groups in Organic Synthesis Theodora W. Greene /Oohn Wiley and Sons, 1981/. Osko przykłady grup zabezpieczających grupy hydroksylowe można wymienić grupy wybrane spośród grup alkilowych /np. metylowa, tert-butylowa lub metoksymetylowa/, aralkilowych /np. benzylowa, difenylometylowa lub trifenylometylowa/, grup heterocyklicznych takich jak tetrahydropiranylowa, acylowych /np. acetylowa lub benzoilowa/ i sililowych takich jak trialkilosililowa /np. tert-butylodimetylosililowa/. Grupy zabezpieczające grupy hydroksylowe można usunąć konwencjonalnymi sposobami. Tak wiąc np. grupy alkilowe, sililowe, acylowe 1 grupy heterocykliczne można usunąć przez solwolizą, np. przez hydrolizą w warunkach kwaśnych lub zasaB

163 814 dowych. Grupy aralkilowe takie jak trifenylometylowa można podobnie usunąć przez solwolizą, np. przez hydrolizą w warunkach kwaśnych. Grupy aralkilowe takie jak benzylowa można odszcze pić przez hydrogenolize w obecności metalu szlachetnego jako katalizatora takiego jak pallad na węglu drzewnym. Grupy sililowe można także dogodnie usunąć wykorzystując źródło Jonów fluorkowych takie Jak fluorek tetra-n-butyloamoniowy.

Związki wyjściowe do wytwarzania związku o wzorze 1 określonym powyżej i ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne można wytwarzać przez reakcje związku o wzorze 2, w którym X oznacza chlorowiec, Z ma znaczenie takie jak określone dla wzoru 1 a Y oznacza grupą OH, ewentualnie zabezpieczoną, z kwasem mrówkowym lub jego reaktywną pochodną i następnie, w razie potrzeby, usuniecie niepożądanych grup wprowadzanych przez kwas mrówkowy lub jego pochodną i/lub usuniecie grup zabezpieczających.

Przykłady odpowiednich pochodnych kwasu mrówkowego,-które można stosować w powyższym sposobie obejmują ortomrówczany /np. ortomrówczan trietylu/, octany dialkoksymetylu /np. octan dietoksymetylu/, kwas ditiomrówkowy, formamid, octan s-triazyny lub formamidyny.

Niepożądane grupy wprowadzone przez kwas mrówkowy lub jego reaktywną pochodną można w sposób typowy usunąć przez łagodną hydrolizą, np. stosując kwas nieorganiczny taki jak wodny roztwór kwasu solnego.

Gdy stosuje sie ortomrówczan trialkilowy taki Jak ortomrówczan trietylu, stanowi on wówczas także rozpuszczalnik. Inne rozpuszczalniki, które można stosować, obejmują amidy /np. dimetyloformamid lub dimetyloacetarnid/, chlorowane węglowodory /np. dichlorometan/, etery /np. tetrahydrofuran/ lub nitryle /np. acetonitryl/.

W niektórych przypadkach /np. gdy stosuje się ortomrówczan trialkilowy taki Jak ortomrówczan trietylu/ reakcje można korzystnie prowadzić w obecności katalizatora takiego jak mocny kwas /np. stężony kwas solny, azotowy lub siarkowy/. Reakcją można prowadzić w temperaturze w zakresie -25° do +15O°C, np. 0° do 1OO°C, a dogodnie w temperaturze pokojowej.

W sposobie według wynalazku związek o wzorze 10, w którym x* oznacza atom chlorowca ewentualnie w postaci z zabezpieczonymi grupami funkcyjnymi zastępuje się innymi podstawnikami, po czym w razie potrzeby usuwa się grupy zabezpieczające.

Sposobem według wynalazku związki o wzorze 1, w którym X oznacza grupą NRR*, w której R i r1 są określone powyżej wytwarza się przez aminowanie odpowiedniego związku o wzorze 10, w którym X· oznacza atom chlorowca /np. chloru/. Aminowanie można przeprowadzić na drodze reakcji z odczynnikiem HNRR*, w którym R i R* są określone powyżej, korzystnie w rozpuszczalniku takim jak alkohol /np. metanol/. Reakcje można prowadzić w dowolnej odpowiedniej temperaturze, korzystnie w temperaturze podwyższonej takiej jak temperatura wrzenia lub, gdy stosuje się ciekły amoniak, w zamkniętej rurze w temperaturze około 50 do 8O°C. Odpowiednie warunki dla konwersji halogenków do drugo- i trzeciorządowych amin są opisane przez 1.1 .Harrisona i m. w Compendium of Organie Synthetic tiethods, Wiley-Interaciewcience. Nowy Jork /1971/ str. 250-252.

Według wynalazku związki o wzorze 1, w którym X oznacza grupą OR /R jest określone powyżej/ wytwarza się przez zastąpienie chlorowca odpowiednim anionen RO~. Gdy R oznacza atom wodoru reakcje zastąpienia można przeprowadzić przez hydrolizą w wodzie lub w mieszaninie wody z rozpuszczalnikiem mieszającym się z wodą takim jak alkohol /np. metanol lub etanol/, eter /np. dioksan lub tetrahydrofuran/, keton /np. aceton/, amid /np. dimetyloformamid/ lub sulfotlenek /np. dimetylosulfotlenek/, korzystnie w obecności kwasu lub zasady. Odpowiednie kwasy obejmują kwasy organiczne takie jak kwas p-toluenosulfonowy i kwasy nieorganiczne takie jak kwas solny, azotowy lub siarkowy. Odpowiednie zasady obejmują zasady nieorganiczne takie jak wodorotlenki metali alkalicznych lub wąglany /np. wodorotlenek sodu lub potasu lub wąglem/. Jako rozpuszczalniki reakcji można także stosować wodne roztwory kwasów lub zasad. Hydrolizą korzystnie można prowadzić w temperaturze w zakresie -10° do +15O°C, np. w temperaturze wrzenia. Gdy R oznacza grupą Cj^alkilową lub grupą arylową, anion RO~ korzystnie tworzy się z odpowiedniego alkoholu ROH stosując zasadą nieorganiczną taką Jak metal alkaliczny /sód metaliczny/ lub wodorek metalu alkalicznego /np. wodorek sodu/. Reakcją z in situ utworzonym anionem korzystnie prowadzi się w temperaturze otoczenia.

163 814

W przypadku wytwarzania związków o wzorze 1, w którym X oznacza grupę SH związek o wzoru 10, w którym X' oznacza chlorowiec poddaje się reakcji z tiomocznikiem w odpowiednim rozpuszczalniku takim jak alkohol /np. n-propanol/ w podwyższonej temperaturze /np. w temperaturze wrzenia/, a następnie alkalicznej hydrolizie. Odpowiednie zasady, które można stosować, obejmują wodorotlenki metali alkalicznych /np. wodorotlenek sodu/. Reakcją korzystnie można prowadzić sposobem opisanym przez G .G. Urguarta i in. w Org.Syn.Coli. Vol. 3, 363 /1953/, np, przez ogrzewanie do wrzenia półproduktu z wodnym roztworem NaOH przez około 0,25 do około 5 godzin.

W przypadku wytwarzania związków o wzoru 1, w którym X oznacza zsou wodoru, związek 0 wzorM 10, w którym X' oznacza chlorowiec poddaje się redukcji, stosując układ redukujący, który nie działa na resztą aląetaczki. Odpowiednie środki redukująca, które można stosować w celu przeprowadzenia pożądanej reakcji odchlorowaowαaia, obejmują cynk metaliczny i wodą, zgodnie z metodą opisaną przez 3.R. Marshalla i in., 3 .Chem.Soc., 1004 /1951/. Alternatywnie, reakcją możne prowadzić przez ^^Ι^ι w odpowiednim rozpuszczalniku takim jak tetrahydóonuran. zawfataClcrm 102. krfekrloamfnr i korzystnie w fokochamfaznyy raakkorla Ra^neta /25374 zgodnie z metodą V.Nair i in., □.Org .01-1601., 52, 1344 /1987/.

Związki o wlotla 1, w którym X oznacza grupą SR, w której R Olaαczα grupą C^_4alkflową lub arylową, wytwarza się z odpowiednich tioli standardowymi metodami alkilowania lub arykwania, np. opisanymi w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4 383 114.

O wielu z o pi sanych pow yzej rja krji don oszono w k on tekncie syn nuklnozydów pur ynowych, np. w Nucleoside Analkgs-Chemfskry. Biology and Nadical Applfcatfons. R .T. Walker 1 in., wyd. Planum Plass, Nowy Oork /1979/ sSó. 193-223.

Farmaceutycznie dopuszczalne sole związków wytwarzanych sposobem według wynalazku można wytwarzać sposobem opisanym w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4 383 114. Tak wiąc w celu wytworzenia soli addycyjnej z kwasem produkt któregokolwiek z powyżej opisanych sposobów w postaci wolnej zasady poddaje się reakcji z odpowiednim kwasem konwencjonalnymi metodami. Reakcją tą można prowadzić w obecności odpowiedniego rozpuszczalnika takiego jak aster /np. octan etylu/ lub alkohol /np. metanol, etanol lub llkZtopanol/. Sola z zasadą nieorganiczną można wytworzyć przez reakcją wolnej zasady z odpowiednią zasadą taką jak alkoholan /np. metano^n sodu/ ewentualnie w obecności rozpuszczalnika takiego jak alkohol /np. mJkankl/· Farmaceutycznie dopuszczalna sola można także wytworzyć z innych soli, w tym z innych farmaceutycznie dopuszczalnych soli, związków o wloóze 1, stosując konwencjonalne metody.

Związek o wzorze 1 można przeprowadzić w farmaceutycznie dopuszczalny fosforan lub inny ester przez reakcja za środkiem fosfory^jącym, takim jak POCl^ lub z odpowiednim środkiem estryfikującym, takim jak halogenek kwasowy lub bezwodnik, odzkwiednik· Ester lub sól związku o wzkóze 1 można przeprowadzić w związek macierzysty np. przez hrdtklflą.

Związki o wzoru 2, w którym z oznacza αkku wodoru lub grupą hydroksylową, a Y olnaala grupą OH, można wytwarzać bezpośrednio za związku o wzorze 3 przez reakcją z nadmiarem pirymidyny o wzoru 4, w którym Y klnacza atom chlorowca, np. chloru, a Z oznacza atom wodoru lub grupą hydroksylową, w obecności zasady amfakMJj takiej jak trfekyloayfna 1 w rozzuezt cza^iku alkoholowym, np. n-butanolu, korzystnie w kJmzetαtorze wrzenia.

Związki o wzoru 2, w których Z ozazcza grupą NO2, a Y olnaala grupą OH, można wytwarzać ze związków o wzorze 3 przez reakcją z nadmiarem pirymidyny o wzoru 5, w którym Y ma zazazeafa takie jak określone dla wloro 4 powyżej, w warunkach podobnych do opisanych powyżej w sposobie wytwarzania związków o wzorze 2, w którym Z oznacza atom wodoru lub grupą hydroksylową i dozowania wytworzonego związku o wzorze 6, za pomocą soli dfαzonikwjC ArN₂ ⁺F , w której Ar omacm grupą aromatyczną, np. z-ahlkronenylkwą, a F~ kzazaza anion, np. halogenkowy taki Jak chlorkowy, w rozpuszczalniku takim Jak woda, kwas organiczny taki Jak kwas octowy lub ich mieszanina, korzystnie w temperaturze okoczenia, do wytworzenia związku o wloru 7, w którym Ar Jest określona powyżej, który można przeprowadzić w żądany związek o wzorze 2 póuz redukcją, stosując np, metal redukujący taki jak

163 814 cynk w obecności kwasu, np. octowego. Oczywiście wybór środka redukującego bądzie zależał od charakteru grupy X.

Związek o wzorze 3 można wytworzyć z uniwersalnego prekursora, 1 -acetyloamino-3 O- acetoksy-metylocyklopent-2-enu o wzorze 8, przez hydrolizą w obecności łagodnej zasady, takiej jak wodorotlenek metalu ziem alkalicznych.

Szczególnie korzystna synteza związku o wzorze 1 przez 6-chlorozwiązek o wzorze 2 jest przedstawiona na rysunku na schemacie. Związek o wzorze 8 jest znanym związkiem opisanym w opisie patentowym Stanów Zjeon. Ameryki nr 4 138 562. Związek o wzorze 1 w postaci pojedynczego izomeru można otrzymać albo przez rozszczepienie produktu końcowego lub przez stereospecyflczną syntezą z izomerycznie czystego związku wyjściowego lub dowolnego dogodnego półproduktu.

Rozszczepienie produktu końcowego lub uzyskanie odpowiedniego półproduktu lub związku wyjściowego można przeprowadzić dowolną odpowiednią metodą znaną w technice, patrz np. Stereocnemistry of Carbon Compounds E.I. Eliel /McGraw Hill, 1962/ i Tables of Resolving Agent's S.H. Wilan.

Jedną z dogodnych metod wytworzenia chiralnie czystych związków o wzorze 1 jest enzymatyczna konwersja mieszaniny racemicznej związku lub jego prekursora. Taką metodą można uzyskać zarówno związki /+/ jak i /-/ w optycznie czystej postaci. Odpowiednie enzymy obejmują deaminazy takie jak deaminaza adenozyny. Poniżej przedstawiono badania potwierdzające aktywność przeciwwirusową związków wytwarzanych sposobem według wynalazku.

Aktywność przeciwwirusowa /A/ Próba na aktywność przeciw-HIy

Związki o wzorze 1 przeszukiwano na aktywność przeciw-HIV w National Cancer Institut, Frederick Cancer Research Facility, Frederick, Maryland /FCRF/. W FCRF wykorzystano następujące powszechnie przyjęte praktyczne procedury skriningu. Próba obejmuje 3 etapy: /I/ przygotowanie zakażonych komórek i ich rozprowadzenie na płytkach do testów, /II/ przygotowanie płytek z rozcneńczaniamn leku i rozprowadzenie na płytkach do testów i /III/ procedurą próby XTT, patrz D.A. Scudiero i in. “A New Simplnfiad Tetrazolium Assay for Cell Growth and Drug Sensntnvity in Culture Cancer Res., 48, 4827 /1988/.

I Zakażenie i rozprowadzenie komórek ATH8 na tackach do mikromianowania

Komórki, które mają być zakażone /normalna linia komórek limfoblastoidelnych, w których zachodzi ekspresja CD4/ umieszcza się w 50 ml stożkowych probówkach do wirówki i w ciągu

I godziny traktuje się 1-2 ^g/ml polibrenu w 37°C. Nastąpnie zbiera się komórki przez min przy 1200 obrotach/minutą. Dodaje się wirus HIV rozcieńczony w stosunku 1:10 w podłożu /RMPl-1640, 10% surowica ludzka lub 15% płodowa surowica cieląca /FCS/ z IL-2 i antybiotykami/ dostarczając 0,001 MOI. Do komórek kontrolnych wolnych od wirusa dodaje się samo medium. Przy założeniu, ze miano zakażającego wirusa wynosi 1O-a, MOI 0,001 oznacza 8 cząstek zakazających wirusa na 10 OOO komórek. Około 500 OOO komórek/probówką poddaje się ekspozycji na 400 ja 1 a wirusa. Wytworzoaą mieszanin ę inkubuj e się w ciągu 1 godz. w 37°C w atmosferze powietrze-COg. Zakażone i niezakażone komórki rozcieńcza się i otrzymuje się 1 x 10~⁴ /₂ surowicą ludzką/ lub 2xlO~4 /z płodową surowicą cielącą/ komórek/lOO ,ul.

Zakażone lub niezakażone komórki /1OO jl/ rozprowadza się w odpowiednich dołkach w 96-dołkowej płytce do mikromianowαnna z dnem w kształcie U. Każde rozcieńczenie związku jest badane dwukrotnie z komórkami zakażonymi. Niezakażone komórki bada się na możliwość na lek w jednym dołku dla każdego rozcieńczenia związku. Dla komórek kontrolnych bez leku, komórek zakażonych i niezakażonych prowadzi się badania trzykrotne. Dołki od B2 do G2 służyły Jako kontrolne i zawierały tylko podłoże. Płytki inkubuje się w 37°C w atmosferze powietrze-COg aż do dodania leku.

II Rozcieńczenie leku i dodawanie

Płytki do rozcieńczeń /96-dołkowe płytki do mnkrolianowania z płaskim dnem/ traktuje

163 814 się przez noc solą fizjologiczną buforowaną fosforanem lub podłożem zawierającym co najmniej lSo FCS lub 1% surowicy ludzkiej /w zależności od stosowanego w teście podłoża/, zaczynając w dzień przed próbą. Taką procedurą “blokowania stosuje się, aby ograniczyć adsorpcją leku przez tackę do mikromianowania podczas procesu rozcieńczania. Dołki wypełnia się całkowicie roztworem blokującym i pozostawia się do odstania w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej pod wyciągiem.

Proces rozcieńczania zaczyna się od pierwszego rozcieńczenia badanego związku w stosunku 1:20. Blokowane płytki do rozcieńczeń Drzygotowuje się przez usunięcie roztworu blokującego i wysuszenie bloku na jałowej gazie. Następnie wszystkie dołki w każdej płytce wypełnia się 225 /ul odpowiedniego medium wykorzystując układ do manipulacji i wypełnionej płytki do rozcieńczeń dodaje ręcznie 25 /u1 każdego związku w rozcieńczeniu 1-20. Cztery związki wystarczające dla dwóch płytek do testu, dodaje się na Jedną płytką do rozcieńczeń. Następnie cztery związki rozcieńcza się kolejno 10 razy od rządu A do rządu H stosując układ do manipulacji cieczami Cetus. Rozcieńczenie wyjściowe każdego związku w rządzie wynosi w tym momencie 1:200. Płytki do rozcieńczeń aż do momentu użycia, utrzymuje się na lodzie. Stosując wielokanałowe urządzenie do napełniania pipety z 6 mikrokońcówkami 100 yjl każdego rozcieńczenia leku przenosi się na płytką do testów, która Już zawiera 100 ^il medium + komórki. Końcowe rozcieńczenie, na płytce do testów zaczyna się od 1:400 /dołki B4 do G4/. Rozcieńczenie to /do 0,25% OMSO/ zapobiega zakłócaniu przez OMSO stanowiący nośnik, wzrostu komórek komórki wolne od leku zakażone lub niezakazone /dołki B3 do G3/ i kontrolnn /BB do G2/ otrzzmują ssam maeiuu. Nassęppie kooccwe związki ppzzenss osi z ddłków H7 do Hl2 na drugą płytką do testów, stosując taką sarną procedurą. Płytki do testów m^huje się w 37°C w atmosferze poeιatzka-CO2 przez 7-14 Iii lub aż do lizy lwltrnlnych wirusów, olza8lolaj makzosOnDnwo.

III. Ilościowe oznaczenie ^^patogeniczności wirusowej i aktywności leku

A. Materiały

1. Roztwór wodozotlenku /,3-bιs[/-meto0ay-4-nltzo-5-aulfnfanmnw7-5-/^-(fenmloauιloBkarbonmlo7“2H-tatzazonlowego. /XTTB-rwktwór 1 mg/ml w medium bez FCS. Przechowywany w 4°C. Przygotowywany co tydzień.

2. Roztwór podstawowy metosulfnlianu fenakynm /PMS/. Można go przygotować i utrzymywać w stanie zamrożonym aż do użycia, w -2O°C. Powinien być przygotowany w PBS i mieć stężenie 15,3 mg/ml.

B. Próba tatraznllnea z mikrokulturą /MTA/

1. Wytwarzanie roztworu XTT-PMS. Przygotowuje się go bezpośrednio przed dodawaniem go do dołków w naczyniu do hodowli. Roztwór podstawowy PMS rozcieńcza się 1:100 /0,153 mg/ml/. Rozcieńczony PMS dodaje się do każdego .ιΙΙΙιϊ^ XTT potrzebnego aby uzyskać koCcoee stążenie PMS 0,02 mM. Próbką 50 μl mieszaniny XTT-PMS dodaje się do każdego z ndDowlaOllch dołków i i^ubuje się płytką przez 4 godziny w 37°C. Zdejmuje się pokrywki z płytek i zastąDuąa się przylepną płytką zamykającą BDmnatech cat 001-010-3501/. Zamkniętą płytką wytrząsa się w mikserze do płytek do mikrokultur i oznacza się abaorbancąz przy 450 nm.

IV. Wyniki

Otrzymane dane wykreśla się jako procent badanych komórek przeliczonych na komórki nlezaOażola zarówno dla komórek zakażonych Jak i meazakażonych w funkcje wzrastającego atążalla badanego związku. Takie wykresy pozwalają na obliczenie skutecznego stążenia /ECg/ dla komórek llezaOażonych, stążenia hamującego /ICgg/ dla komórek z0zwwmch i wskaźnika terapeutycznego /Tlgg/·

Stążenia hamujące w μgBml wobec HIV określone Jak opisano powyżej dla związków z przykładów VII, IX, X, XI i XIVBbB są przedstawione w tabeli 1.

163 814

Tabela 1
	Związek		Przykład	I 1 1 1 1	Linia komórkowa [	ED50	1 1 1 1	IDS0	i TI5O I
	9a		VII	1 !	MT-2 '	2,3	i !	50	! 21,4
	13a		IX	1 l |	MT-2 1	0,41	1 |	6,97	'1 17,3
	l4a	1	X	1 I	MT-2 j	0,15	1 1	100	[ 667
	15a	1 !	XI	t !	MT-2 !	2,9	1 !	> 125	' > 42,7	•
	/-/ 148	!	XIV/b/	1 1 1	CEM J >	0,66	1 1 1	189	J 284 1

Związki z przykładów V i VIII także wykazywały aktywność przeciwwiruaową w tym skrmingu .

We wcześniejszej próbie przeprowadzonej ze związkiem z przykładu X w Southern Research Institute otrzymano wartość TI50 około 200, gdy komórki MT-2 hodowano z H9/HILV-IIIB.

/B/ Aktywność wobec wirusa kociej białaczki

Przeciwwirusową selekcję na aktywność wobec FeLV-FAIDS przeprowadzono na 96-dołkowych płytkach /Corning/ stosując komórki wskaźnikowe 81C w podłożu Dulbecco modyfikowanym

Iscove, wzbogaconym 10% daaktywowaną ciepłem płodową surowicą bydlęcą /FBS/. Na 24 godziny 3 przed próbą na płytki wysiano komórki 81C w ilości 5x10 komórek/dołek. W dniu próby komórki traktowano wstąpnie przez 30 minut w 37°C DEAE-dekstranem /25 /ug/ml/ w 0,1 ml roztworu soli zrównoważonej roztworem Hanka. Usuniąto go i do każdego dołka dodano nastąpnie 0,1 ml podłoża do wzrostu zawierającego 32/TCIDg₀ FelV-FAIOS lub 0,1 ml samego medium. Pozostawiono na 1 godziną w celu zaadsorbowania wirusa, po czym dodano 0,1 ml związku badanego lub dodatniego związku kontrolnego /2’,3*-dxdeoksycytydyny, ddc/ lub podłoża wzrostowego. Płytki inkubowano w 37°C. Komórkom dostarczono świeżego podłoża wzrostowego zawierającego związek, 4-go dnia po zakażeniu 7-go dnia po zakażeniu zmieniono całkowicie podłoże do hodowli i zastąpiono je świeżym^10-go dnia po zakażeniu komórki utrwalono w formalinie, wybarwiono 0,1% błękitem brylantowym Coomassię R-25O i obserwowano makroskopowo na CPE i cytotoksyczność leku.

Związek z przykładu X miał wartość ED^g 1,9 μς/ml /C/ Aktywność wobec mysiego AIDS

Na 6-dołkowe płytki Falcona do hodowli tkanek wysiano 1,75χ1ϋ5 komórek na dołek w całkowitej objętości 2,5 ml EMEN zawierających 5% deaktywowane ciepłem FBS. Po 24 godzinach od zaszczepienia komórek podłoże zdekantowano i do każdego dołka dodano 2,5 ml DEAE-dekstranu /25 /ug/ml w soli buforowanej fosforanem/. Hodowle inkubowano w 37°C przez 1 godziną po czym roztwór DEAE-dekstren zdekantowano i warstwy komórek przepłukano jeden raz 2,5 ml PBS. Do normalnych komórek kontrolnych dodano 2,5 ml samego podłoża /bez wirusa i bez leku/. Hodowle kontrolne na lek otrzymały 2,5 ml podłoża zawierającego lek lecz bez wirusa. Hodowle kontrolne zakażone wirusem otrzymały 0,5 ml odpowiedniego rozcieńczenia podstawowego roztworu CAS-BR-M w celu wyprodukowania policzalnych łysinek oraz 2,0 ml podłoża. Badane próbki otrzymały 0,5 ml odpowiedniego rozcieńczenia wirusa oraz 2,0 ml podłoża z rozcieńczeniem leku. Badano 6 stężeń badanego związku rozcieńczonego w serii pół-log^g rozcieńczeń. Badano trzy stążenia dodatniego leku kontrolnego, ddC. W każdej próbie stosowano po 3 dołki dla każdego stążenia badanego związku i 6 wirusów i 6 hodowli komórek kontrolnych. Na 3-ci dzień po inokulacji wirusem określano toksyczność leku wobec komórek 5C-1 przez mikroskopowe dwukrotne badanie barwiących komórek i hodowli kontrolnych na lek.

Pozostałe kontrolne hodowla i testowane hodowle naświetlano lampą z nadfioletem przez 20 c sekund i do każdej hodowli dodano komórki XC /5xlO komórek/dołek w 2,5 ml EMEM zawierających 10% reaktywowanej ciepłem FBS/. 3-go dnia po naświetleniu UV hodowle utrwalano w formalinie i wybarwiono fioletem krystalicznym. Zliczono łysinki za pomocą mikroskopu do preparatów.

163 814

Aktywność przeciwMi^^wą objawiającą się zmniejszeniem liczby łysinek CAS-BR-M wyrażono Jako średnią liczbą łysinek policzoną w hodowlach zakażonych wirusem traktowanych lekiem, w porównaniu ze średnią liczbą łysinek policzonych w nietraktowanych hodowlach zakażonych wirusem /% kontrolny/.

Związek z przykładu X miał wartość ED50 = 1,1 jg/ml.

/D/ Aktywność wobec retrowirusa Simiana SA10S /SRV-2/

Przeciwwirusowe badania wobec wirusa SAIOS /D-Waszyngton/ przeprowadzono w próbie zespólnia-hamowanie na komórkach Raji. Lek rozcieńczono w kompletnym podłożu Iscoye^, po czym do odpowiednich dołków 96-dołkowaj płytki dodano 100 jl każdego rozcieńczenia. Następnie dodano 50 jl klawnwneas sepnanatauau aw wspólneh Oowiilk mornerek V-V/2/bnji, W ó-óbie tej stosowano DDC jako dodatni lek kontrolny. Płytki nnkuPowana w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Zespólnie solnczoπa 7-go dnia po zakażeniu. Tolsycunaść leku oceniano przez porównanie liczby żywych komórek w próbce lauzakażoπej potraktowanej lekiem z żywotnością próbki kontrolnej rnezakażonej neetTaktowanej. Związek z przykładu X miał wartość ED50 o 2,8 ^ml.

/E/ Aktywność wobec wirusa wisny naeOi owiec

Pruecnwwnrusową aktywność wobec wirusa wisny maedi owiec /VMV/, szczep WCL-1, oznaczono przez pomiar zmniejszenia wybarwierna inmunahnsnacnemicunega swoistego dla wirusa. Manawaprtwy owczych komórek splotu naczyniówki zakażono VMV i pokryto je serią rozciańczeń badanych związków. Po inkubacji przez 5 dni manowαprnwy nnkupowana dalej z surowicami odpornościowymi swoistymi wobec wirusa, sprążonymi z seraksydazą chrzanową /HRP/. Następna inkubacja monowarrnw z cnpoιlogenlcznyn podłożem HRP zniekształca obszary replikacji wirusa. Zliczono te odosobnione ognisko i obliczono stążenie badanego związku, które Jest potrzebne do unnnajruaniα liczby ognisk do 50% ich liczby w próbach kontrolnych naetraktowanych lakiem.

Związek z przykładu XIII miał wartość ED= 0,2 jig/ml

Następujące przykłady ilustrują sposób według wynalazku. Przedstawioną w przykładzie analizą elementarną przeprowadzono w M-H-W Laboratories, Pnoennx, AZ. Tamserknury topnienia określono w aparacie Mel-Temp i podano wartości skorygowane. Widma rezonansu magnetycznego Jądrowego otrzymano w spektrometrach Jsol FX 90QFT lub Nicol^t NT3OO i oznaczano je w OMSO-Dg· Przesunięcia chemiczne wyrażone są w ppm wzglądem Me^Si. Widma w podczerwieni uzyskano badając tabletki z KBr za pamacą spektrometru N^ollat 5OXC FT-IR, a widma w nadfiolecie określano przy użyciu spektrofotometru Beckmanna DU-b. Widmo masowe otrzymywano za sanocą spektrometru mas AFI kcnettnfnc Apsαrαtur Lnnitad MS-3O. Chromatografią cienkowarstwowe prowadzono na 0,25 mm warstwach zelu krzemionkowego Merck /23O-4OO ιο^/. Wszystkie stosowane związki i rozpuszczalniki są odczynnikami czystymi do analizy, jeśli me zaznaczono inaczej. Przez termin substancja czynne stosowany w przykładach należy rozumieć związek o wzorza 1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną pochodną.

Przykład I. /+/-/1 O , 4 oC/^-//b-amno-6-cnlarO4Snpymn0ynylaαnnno _/ 2-cyklapetnetylometanol /wzór 2a/. .

Mieszaniną 3,0 g /15 mmoli/ 1 06 -acety^ami-no^- oC -acetokry-metylacyklapent-2-enu /wzór 8/ i 0,5 N wodnego roztworu wodorotlenku baru /3OO mi/ ogrzewano do wrzenia przez noc. Po oziębieniu suchym lodem mieszaniną zobojętniono. Wytrącony osad odsączono, a wodny roztwór zatążono do sucha. Pozostałość ekstrahowano absolutnym etanolem i ponownie zatężona uzyskując związek o wzorze 3 w postaci bezbarwnego syropu w ilości 1,6 g /14 mmoln/·

Do tego syropu dodano 4,59 g /28 mmoli/ 5-amita-4,6-0ichloPosirynndyπy, 4,2 g /42 mole/ tpienyloamnny i 50 ml n-butanolu i ogrzewano mieszaniną do wrzenia przez 24 godziny. Usunięto lotne rozpuszczalniki, a pozostałość zaabsorbowano na 7 g żelu krzemionkowego w kolumnie do szybkiej chromatografii /4,O x 12 cm/ i eluowano układem CHC^-MeCH /2Osl/ i uzyskano 2,69 g /74%/ związku o wzorze 2a o temperaturze topmenia 13O-l32°C. Próbką analityczną otrzymano przez rekrystalizacją z octanu etylu /EtOAc/, temperatura topniania

163 814

134-135°C, MS /3O ev, 2OO°C/j m/e 240 i 242 /M⁺ l M⁺ +2/, 209 /M* 31/, 144 /B⁺/l

IR: 36OO-26OO /OH/, 1620, 1580 /C-C, C=a/j Analiza /C_wHj^ClN₄0/ C, H, N.

Przykład II. /+/-/1 oC, 4 oC B-4-/”/2-auino-6-chloro-4-plzmuidynylo/-amlno J -2-cyOloDaltanmlouatanol /wzór 6a/

Oo 14 14ζ.. ni sowzoe gwSkeią o /odekl z z SkzyrkmO- d ZoZaoo ^/4 7 /2/.2 ,ι8ζ../ l-/mino-4,6-dlchlozoplrymldyny, 15 ml trietyloaminy i 75 ml n-butanolu i ogrzewano mieszaniną do wrzenia przez 48 godzin. Usunięto lotne rozpuszczalniki, pozostałość potraktowano metanolem w celu ndOklelanιa llarnkDuskcznlego Drnduktu ubocznego /podwójny nullenkmO pirymidyny/. Roztwór metanolowy zaabsorbowano na zelu krzemionkowym /8 g/ w kolumnie /4,O x 14 cm/ i enuwealo uk-adeu CHCL^-MeOH /40:1/ uzyskując 1,52 g surowego związku o wzorze 6a /42%/. Produkt zekrmstallznwalo z octanu etylu i uzyskano związek o wzorze 6a o temperaturze topnienia 132-134°^ MS /3O ev, 2OO°CB^ m/e 240 1-242 /M+ i M+ +2/, 209 /M+-31/,

144 /B+/1 IR: 36OO-3OOO /NH^ OH/, 1620, 1580 /C“C, C=Nj Analiza /Cχc^h 13^4/ C, H, N.

Przykład III. /—/-/l OĆ, 4oB/4-/aU/l-amino-Wzlhl-r4-5-/Ozohelrnfθnylo/-azo J -4-pιryuι0ynylo-amιno/-2-cyklopθntθnylouetanol /wzór 7a/

Z 1,47 g /ll.5 mmoli/ p-chlorwallllly w 3N HCl /25 ml/ i 870 mg /12,5 mmoli/ azotynu sodu w 10 ml woOy przygotowano zimny roztwór soli diazoniowej. Roztwór ten dodano do mieawalllm 2,40 g /10 mmoli/ związku o wzorze 6a, 50 ml kwasu octowego, 50 ml wody i 20 g trójwwdzιanu octanu sodu. Mieszaniną reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Odsączono żółty wytrącony osad i przemywano zimną wodą aż do zobojąΠ^ιιβ, po czym wysuszono na powietrzu pod wyciągiem uzyskując 3,60 g /94 %/ związku o wwwzza 7a o temperaturze topnienia z zwwOładam 229°C. Próbką analityczną otrzymano z układu acetnn-matanol /1:2/, temperatura topnienia 241-243^ BzwzkładB. MS /3O ev, 26O°C/j m/e 378 i 380 /^M+ i

M+ ♦ 2/, 282 /B+/t IR: 36OO-3OOO /NH^ OH/, 1620, 1580 /C=C, C=N/ł Analiza /C₁₆Hj^CI2NgO/

C, Η, N.

Przykład IV. d oU|n0-6”/2,0zW-4mlιrmmιomlmlOB--plrymldynyio/-amlno_7-2-cmOInpentelmloueralol /wzór 2b/

Mieszaniną 379 mg związku o wzorze 7a /I uuoI/, 0,65 g /1O ..oIi/ pyłu cynkowego,

0,32 ml kwasu octowego, 15 ml wody i 15 ml etanolu ogrzewano do wrzanιa pod azotem przez 3 godziny. Cynk usauięęo, a rropuszczalniki odparowano· Pozoetazaabsorbowano na 2 g żelu krkamlonOwwago w kolumnie /2,O x 18 cm/ i e^mam ul-aOem CHC^-MeOH /15:1/. Otrzymano różowy syrop. Po dalszym oczyszczaniu z układu matanol-atar otrzymano związek o wzorze 2b w postaci różowych kryształów w ilości 170 mg /66%/, o temperaturze topnienia 168-170°C, MS /3O ev, /2O°C/,· m/e 255 i 257 /M+ i M+ + 2/, 224 /M+ “31/, 159 /B+/I IR: 36OO-3OOO /NH2, OH/ 1620, 1580 /C=C, C=N/i Analiza /CjoH^ClNg/ C, H, N.

Przykład V. /-/-/I oC , 4 w£/-4-B6-chloro-9H-DJZyn-9-mln/-/-cyklnDaltenmlnuatanol

Mieszaniną 1,30 g /5,4 mmoli/ związku o ekozza 2a, 30 ml ortomróeczanu metylu l 0,50 ml 12 N kwasu solnego mieszano przez noc w temperaturze DoloJnweą. Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią w temperaturze 35°C. Oo pnkosra-oścl dodano 30 ml 0,5 N eodnegn roztworu kwasu solnego i mieszam przez 1 godziną, po czym kobojztnlnno do pH7-8 IN ewOnrwtlenkiem sodu i zaabsorbowano na 8 g żelu lzkemιollneago w kolumnie /4,O x 8 cm/, nastąpnie aluoealw Jk-aOem CHClg-MeOH //OιlB uzyskując 1,12 g /82%/ białych kryształów związku tytu-owagw. Surowy produkt skrystalizowano z octanu etylu uzyskując czysty związek o temperaturze topnienia 108-110°C, MS /3O ev, MO^/l m/e 250 i 252 /M+ i M+ + 2/, 219 /M+ ”31/, 154 /B+/i IR» 3600-2800 /OH/, 1600 /C=C, C°N/| Anallza/CllHą₁ClN₄0/ C, H, N.

Przyk ład VI. /-/-/I oC ,4 «C B-4-B6-hy0rwkay-9H-Durmn-9-yloB-2“Cy0lwDentalmlwuetanwl

Mieszaniną 251 mg /1 mmol/ związku z prkmk-aOu V 1 10 ml 0,2 N woOlago roztworu wndozotlelOu sodu ogrzewano do wrzenia przez 3 godziny. Po ozląblenlu mieszaniną Owpzoeadkwrn do pH 5-6 kwasem wctwwym. Mieszaniną reakcyjną zaabsorbowano na 2 g żelu OrwaulolOowago w kolumnie /2,0 x 11 cm/ i e^mam JkłaOau CHClg-MeOH /10:1/ uzyskując 105 mg /4S/ związku tytułoeegn. Surowy biały produkt skrystalizowano z układu woda-uatalwlB3:1B 1 uzyskano

163 814 związek tytułowy o temperaturze topnienia z rozkładem 248-25O°C, MS /3O ev, 3OO°C/j ,m/e 232 /M*/, 214 /M*18/, 136 /B*/j IR: 36OO-26OO /OH/, 1680, 1600 /C»O, C=C, C-N/j Analiza: /c₁₁h₁₂n₄°₂/ C* _H* N.

Przyk ład VII. /—/-/! oC .4 oć /-4t/6-amfnot90tZurrat9-ylo/-2-crklkpankanylomat anol

Przez bombą lαwiJtαcąaą roztwór 250 mg /l uuoIz/ związku tytułowego z przykładu V w 5 ml metanolu w -8O°C przepuszczano ciekły zmoniαk· Bombą zamknięto i ogrzewano w 6O°C przez 24 godziny. Amoniak i metanol odparowano, a zklketałość skrystaiizowano z wody i uzyskano białe mętna kryształy związku tytułowego o kampJrnkurla 198-2OO°C, w ilości 187 mg /81%/,

MS /3O av, 21O°C/j m/a 231 /M*/. 213 /M* “18/, 135 /B*/j IR: 36OO-26OO /NH₂, OH/, 1700, 1600 /C=C, C=N/j Analiza /CnH^N^/ C, H, N.

Przykład VIII. /-/-/1 zC ,4 o//-4-/b-merkBpt/-OH-ptιryn-9-ylo/-2-cyklopenten yioyekαnol

Mieszaniną 125 mg /O,5 uuoIz/ związku tytułowego z przykładu V, 40 mg /O,64 mmola/ siomkclaika i 5 ml n-propanolu ogrzewano do wrzenia przez 2 godziny. Po kzfąbienfu oddzielono wytrącony osad przez odsączenie, przemyto n-propanolem i rozpuszczono w 5 ml IN wodorotlenku sodu. Roztwór doprowadzono do pH 5 kwasem octowym. Surowy związek tytułowy w ilości 90 mg /73%/ ponownie wyizolowano /temperatura topnienia 26O-262°C z rozkładam/ i przekrretalflo/ wano z N,N/dfmatrlknkrmαmfdu uzyskując związek o temperaturze topnienia 263-265°C z rozkładam. MS /3O ev, 29O°C/j u/j 248 /M*/, 230 /M* l8/, 152 /B*/j IR: 36OO-32OO /OH/, 3100,

2400 /SH/, 16OO /C=C, C=N/j Analiza /C^C^I^OS/ C, H, N.

Przykład IX. /”/-/1 cCC.4 oC //4-/2/amino-6-aalkrk/9H/zurrn-ylk//2-cyklkpantJ/ aylomasankl

Mfaelαafnę związku tytułowego z przykładu IV w ilości 1,41 H /5,5 ιι^ι/, 30 ml krsk/ mrówczanu i 1,40 ml 12N kwasu solnego mieszano przez noc. Zawiesiną wysuszono pod próżnią. Dodano 40 ml 0,5 N rozcieńczonego kwasu solnego i zkzkstawfoak mieszaniną do ZtlarJzgkwαnfα w temperaturze pokojowej przez 1 godziną. Mieszaniną zobkjątaiono do pH 8 1 N wodorotlenkiem sodu i zaabsorbowano na 7,5 g żelu krzemionkowego w kolumnie /4,0 x x 10 cm/, po czym eluowano układem CHClg-MeDH /2O:1/ i otrzymano brudnobiała kryształy związku tytułowego w ilości 1,18 g /SO%/. Surowy produkt skrystalizowano z etanolu i uzyskano związek o temperaturze topnienia 145-147°C. MS /3O ev, 22O°C/j m/e 265 i 267 /M* i M*^/, 235 /M* 30/, 169 /B*/; IR: 36OO-26OO /NH₂, OH/, 1620-1580 /C=C, C=N/j Analiza /C^O^I^OC^^ H2O/ C, H, N.

Przykład X. /-/-/I oR ,4 C //4-/2/αmino/6-hrdtkksr-9H/purrn-9-rlo/-2-cykloper: tany lornet ano 1

Mieszaniną 266 mg /I mmol/ związku tytułowego z przykładu IX i 0,33 N wodny roztwór wodorotlenku sodu ogrzewano do wrzenia przez 5 godzin, po czym zaabsorbowano na 2 g żelu krzemionkowego w kolumnie /2,O x 7,5 cm/ i alukMano układem CHClH”MaOH /5:1/. Surowy produkt skrystalizowano z układu meϊanol-wodα /1:4/ i uzyskano 152 mg /61%/ białych kryształów związku tytułowego o temperaturze topnienm 254-256°C /rozkład/. MS /3O ev, 2OO°C/) m/j 247 /M*/. 217 /M* ^_30/, 151 /B*/i IR: 36OO-26OO /NH2» OH/, 1700, 16OO, /C=O, C=C, C=N/; Analiza /CuH N.3/4 HgO/ C, H, N.

Przykład XI. /-/-/i C,4C //4-/2.6-dizmfno-9H/puryn-9-rlk/-2/crklopenseny/ lomeSanol

Do roztworu 265 mg /I mmol/ związku tytułowego z przykładu IX w 10 ml metanolu w -8O°C w bombie wprowadzono ciekły amoniak. Bombą zamknięto i ogrzewano w 75°C przez 48 godzin. Amoniak i metanol odparowano. Pozostałość zaabsorbowano na 2 g żelu krzemionkowego w kolumnie /2,O x 10 cm/ i eluowzak CHClH”MaOH /15:1/. Surowy produkt rekrresalflowano z etanolu i uzyskano 196 mg /80%/ związku tytułowego o temzerasurle topnienia 152”155°C. MS /3O ev, 2OO°C/s m/e 246 /M*/, 229 /M* ~17/, 216 /M* ~3O/, 150 /B*/t IR: 36OO-3OOO /NH₂, OH/, 1700, 1650, 1600 /C=O, C=C, C=N/| Analiza /C^H^NgO/ C, H, N.

Przykład XII. /1S,4R/-4//2.6/dfαyino-9H-zuryn“9-ylo//2/cyklkZentenylo/ metanol lb3 814 [~/1S,4R/-4-/2,6-diamino-9H-puryn-9-ylo/-2-cyklopentenometanol_7 /a/ Półprodukt 1j /1H,2S,3R,5R/-3--“6-amino-9H-puryn-9-yio_7-5--/1,l-dimetyloetylo/-dimetylosililoksy/metylo 7-1,2-cyklopantanodiol

12,505 g /-/aristeromycyny /Journal ot the American Chemical Society 1983, vol. 105, 4049-4055/, 7,8 g chlorku tert-butylodemttyloaililowtgo i 12,96 o imidazolu w 85 ml suchego dimetyloformamidu mieszano przez 2,5 godziny w temperaturze otoczenia. Wytworzony roztwór rozcieńczono 5OO ml octanu etylu, po czym przemyto 3 x 100 ml wodą i 50 ml solanki. Wykrystalizowane białe kryształy zebrano przez odsączenie, przemyto je octanem etylu, nastąpnie wysuszono pod próżnią i uzyskano 3,92 g związku tytułowego; *H NMR /DMSO-dg/ 8,15 /1H/,

8,09 /1H/. 7,19 /2H/, 5,00 /1H/, 4,72 /1H/, 4,69 /lH/, 4,36 /1H/, 3,85 /lH/, 3,67 /2HH.

2,23 /1H/, 2,09 1,79 /lH/, 0,89 /9H/. O0D7 /6HH.

/b/ Półprodukt 2: /4R,3aS,6R,6aR/-4--~6-amino-9H-puryn-9-ylo_7-6--/1,l-dimetyloetylo/-dimetylosililok9y/metylo_7-3a ,5,6,6a-tet rahydro-4H-cyklopenta-l,3-dioksolo-2-tion

Oo zawlzsny i,A, , P^łprodurtu lw 15 ml suchsuo eimβtelttormamldu i°uczos zissziesz dodano 3,3 g 2I,C*-teokarbonylodllmldazmCu i uzyskano żółty roztwór. Po 15,5 godzinach utrzymywania w temperaturze otoczenia wytworzony roztwór połączono z roztworem z poprzedniego doświadczenia /S wagi/ i usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie. Pozostały olej rozcieńczono 100 ml octanu etylu, po czym przemyto 2 x 20 ml wodą i 2 x 20 ml solanką, wysuszono nad MgSO4 i odparowano do żółtego ciała stałego. Przemyto je 25 ml eteru deytyCmwygo, po czym mdaęczono;Ua1θj przemyto 25 ml eteru, wysuszono pod próżnią i uzyskano 3,61 g związku tytułowego w postaci bladmkrtzmwygm ciała stałego.

λ max /etanol/ 240,0 nm /eH ⁴59/ί ^{1r NM}^ /DtOO-d^/ 8,27 /1 /1, , ,1, / CH/. Ρ,3, /CH/,

5,81 ^H/, 5,37 /lH/, 5,28 /1//, 3,78 /2H/, ,.6, /lH/, 2,28 /iZ/, 0,90 /9H/ , 0,09 /6H/.

/c/ Półprodukt 3: /1*R,4*S/-9-/”4-///1,l,-dimetyloatylo/dimetylosililoksy/metylo/-2-cyklopenten-l-ylo _7-9H-puryno-6-ami.na

Roztwór 3,57 g Półproduktu 2 w 25 mi suchego tetrahydrofuranu zmieszano z roztworem

4.94 g C,3-UeuetyCo-H-fenyCo-e,3,H-deazofoafoCedyny w 10 ml suchego tetrahydrofuranu, po czym mieszano w temperaturze otoczenia przez 8 3/4 godziny. Usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie. Pozostały olej połączono z uzyskanym z poprzedniego doświadczenia /4O% wagi/, po czym poddano ohr(^ιu¢^tt^5[afll kolumnowej na krzemionce /2OO g, Merck 7734/, eCumwanm chloroformem, nastąpnie mieszaniną chloroform-etanol i uzyskano białe ciało stałe. Przemyto je 25 ml eteru UeetyCmwego, nastąpnie zebrano przez odsączenie. Dalej przemyto je mi eteru, następnie wysuszono pod próżnią i uzyskano 1,47 g związku tytułowego;

/etanol/ 2bl,4 nm /Εχ ,,,, 443/; H NMR /DMSO-dg/ 8,14 21/2, 8,00 2HH/, 7,20 jTH/f b,12 /1H/,

5.95 6, ,/ H^J^H/, 66 H/,/ 2 26 96 ΛΗ/, 1, H1H/, 04 7/ H/H/, 02 H/H/.

/d/ Półprodukt 4: 2l*R»4*S/-2-/~4-222e,C-UimetyCoetyeo/UimetyCmaelilokay/metyCm2-2-cykCm^nten^-ylo 0-9H-purynm-b-yuenej l-tlenek

Roztwór 1,37 g Półproduktu 3 w 30 uC chloroformu zadano 10-9l0ι; kwasem m-chlormnaUbenzoesowym /1,29 g/, po czym mieszano w temperaturze otoczenia przez 3 godziny. Rozpuszczalnik usunięto przez odparowanie, a pozostał? żywicą rozpuszczono w 10 ml octanu etylu. Wykrystalizowano białe ciało stałe, które razem z substancją uzyskaną przez odparowanie przesączu rozpuszczono w 100 ml chloroformu, po czym przemyto 3 x 10 ml nasyconego wodnego roztworu woUmrowągCanu sodu i 2 x 10 uC solanki. Wodne popłuczyny wyekstrahowano 50 ml chloroformu , Połączone roztwory organiczne wysuszono nad MgSO^, po czym odparowano do ciała stałego. Ciało stałe przemyto 25 ml eteru Ueetylmwegm, nastąpnie odsączono. Białe ciało stałe jeszcze przemyto 10 ml eteru, po czym wysuszono pod próżnią i uzyskano 1,lH g związku tytułowego: λ max /etanol/ 235,4 nm /eH, 1324/, 263,2 nm /Eg,, 248/, 300,2 nm /eUc 75/;

1h NMR /CDCI₃/ 8,72 /1H2, 8,02 /1H/, 7,16 22//, 6,21 /W, 5,87 /1H/, 5,72 21H/, 3.68 /HH/, 3,04 21H/, 2,82 2lH/, 1,74 /lH/, 0,89 29H2. O,06 /HH/.

/e/ Półprodukt 5: Brmmowodmrek /1*R,4'S/-0--”-2//c0,ldelyttcmyttcl2/dlmθtylo8ililoksyZmetylo/-2-cyklopyntyn-C-ylm _7-2-emeno-1.2-d1/ydro-₍^,2,4_7okaadiazolm[/.2,-e_7-2H-pwryny

Chłodzoną lodem zawiesiną 1,08 g Półproduktu 4 w 20 ml metanolu, podczas mieszania za163 814 dano roztworem 0,34 g bromku cyjanu w 20 ml metanolu, który wprowadzano przez 5 minut. Po 15 minutach pozostawienia zawiesiny do ogrzania się do temperatury otoczenia uzyskano roztwór. Po 9O minutach usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie. Pozostałość przemyto 25 ml eteru dietylowego, po czym zebrano przez przesączenie. Zebrane ciało stałe przemyto jeszcze 25 oZ eerTu, oz czmz wysusonoz odZ różniąz i uzykknoz 1,7Z z wią^zuz ^ułowNego : λ /etanol/ 228,2 nm /E1%J_m 530/, 285,2 nm /Ε^ 445/i H NMR /CDClg/ 10,20 /1H/, 10,02 /1H/, 8,37 /1H/, 6,25 /1H/, 6,01 /lH/, 3,69 /2H/, 3,05 /lH/, 2,86 /lH/, 1,73 /lH/, 0,86 /9H/, O,03 /6H/ /f/ Półprodukt 6: /l’R,4'S/-9-[”4-///l,l-dimetyloetylo/dimetylosililoksy/metylo/-2-cyklopenten-l-ylo _/-5-cyjαnolmino-l,6-dlhydzo-0-matoksy-9H-pszyyα

Roztwór Półproduktu 5 /1,36 g/ w 10 ol dimetyloformamidu mieszano w temperaturze otoczenia, po czym zadano 1,2 ol tr^tylo^^y. Po 40 minutach dodano 0,54 ol jodnmetays i uzyskano żółty roztwór. Po 3 3/4 godziny usuniąto rozpuszczalnik przez odparowanie. Pozostałość podzielono pomiądzy 100 ol octanu etylu i 20 ol wody. Roztwór organiczny przemyto dalej 2 x 20 ml wody i 20 ml solanki, wysuszono nad MgSO₄ i odperoowano do ciała stałego. Ciało stałe przemyto 25 ml eteru dietylowego i odsączono. Przemyto je dalej 10 ol eteru, po czym wysuszono pod próżnią i uzyskano 0,865 g związku tytułowego: -A maw/etanol/ 227,2 nm ,c' 10/ 1 max /E1co⁴⁴9/, ²⁸7,0 nm /^Ε1£ο⁵⁴⁴/ί H NMR 8,23 /1H/, 7,96 /1H/, 6,24 /1H/, 5,85 /1H/, 5,65 /1H/, 4,21 /3H/, 3,66 /2H/, 3,04 /1H/, 2,77 /lH/, 1,68 /1H/, 0,88 /9H/, 0,05 /6H/.

/g/ Półprodukt 7: /l’R,4'S/-9-^~4-///l,l-diinetyloetylo/dimetylosililok8y/metylo/-2-cyklopenten-l-ylo _7-6-metoksyamino-9H-puryno-2-amina

Roztwór 802 mg Półproduktu 6 i 0,45 ml l,8-diazabicyklo-/5,4,O /undec^-enu w 80 ml etanolu mieszano i ogrzewano do wrzenia. Po 9 godzinacn zaprzestano ogrzewania i pozostawiono roztwór przez noc w temperaturze otoczenia. Usuniąto rozpuszczalnik przez odparowanie. Pozostały olej połączono z uzyskanym w poprzednim doświadczeniu /4% wagi/, po czym poddano chromatografii kolumnowej na 40 g krzemionki /Merck 9385/, eluowano chloroformem, nastąpnie mieszaniną chloroformu z etanolem i otrzymano pianą. Pianą roztarto z 10 ol eteru dietylowego, a wytworzone ciało stałe zebrano przez odsączenie. Przemyto je 5 ml eteru, nastąpnie wysuszono pod próżnią i uzyskano 594 mc związku tytułowego: naw/etanol/ 282,2 nm /^E1(1c 4°9/ » NMR /DMSO-dg/ 9,76 /1H/, 7,32 /1H/, 6,53 /2H/, 6,08 /1H/, 5,88 /1H/,

5,26 /1H/, 3,72 /3H/, 3,61 /2H/, 2,90 /1H/, 2,50 /1H/, 1,52 /1H/, 0,83 /9H/, 0,02 / 6H/.

/h/ Półprodukt a: /lS,4R/-4-[”2-amino-6-metoksyamino-9H-pszyn-9-yln _/-2-cyklopentenometanol

Roztwór 356 mg półproduktu 7 w 35 ml tetzahydznfurays mieszano w temperaturze pokojowej, po czyo zadano 1,4 ol 1,0 M roztworu fluorku tetrabstyloamnniowago w tetrαhydrnfsrαnie. Po 90 minutach reakcją nagle zakończono dodając 1 ml wody, po czym usunięto rozpuszczalniki przez odparowanie. Pozostały olej poddano chznmatogrzfos kolumnowej na 20 g krzemionki /Merck 7734/, eluowano chloroformem, nastąpnie mieszaniną chloroformu z etanolem i tytułoowy w postaci ciała stałego w ilości 243 mg j JA oax /pH 6 bufor/ «•C/ τ n»ex

280,2 nm /Ej^³⁴/; NMR /DMSO-dg/ S,75 /1H/, 7,39 /1H/, 6,52 /2H/, 6,10 /1H/, 5,84 /1H/, 5,27 /1H/, 4,73 /1H/, 3,40 /2H/, 2,83 /1H/, 2,55 /1H/, 1,52 /1H/.

/1S-4R/ -4-^”2,6-diemino-9H-puryn-9-ylo _/-2-cyklopentenometanol

Do chłodzonego lodem roztworu 210 og półproduktu a w 10 ml wody i 50 ml tetzahydrofszanu podczas mieszania dodawano małymi kawałkami przez 15 minut amalgamatu glinowego /z 237 og glinu i 0,5% wodnego roztworu chlorku rtąci/. Po 40 minutach miaucayiną mieszaną pozostawiono do ogrzania się do temperatury otoczenia. Po 15 godzinach wytworzoną mieszaniną przesączono przez ziemią okrzemkową w celu usuniącia substancji nierozpuszczalnych. Przemyto Je mieszaniną woda: tetzahydroOuran /1:5, 60 ol/. Połączone przesącze odparowano. Pozostałość poddano chromatografii kolumnowej na krzemionce /1O g, Merck 9385/, eluowano mieszaninami chloroform-etanol i uzyskano związek tytułowy w postaci piany w ilości 159 mgi

-81° /cO,04, metanol/j /L oax ^/pH 6 bufor/ 255,9 nm /ε|*_η 302/, 280,8 nm, /eOco 381/. *H NMR ^DMSO-dg/ 7,61 /1H/, 6,66 /2H/, 6,10 /1H/, 5,87 /1H/, 5,76 /2H/, 5,38 /1H/, 4,76 /1H/, 3,45 /2H/, 2,87 /1H/, 2,60 /1H/, 1,60 /1H/.

lb

163 814

Przykład XIII. /IS ,4R/-4-/2-amino-6-hydsksy-9H-pupyn-9-ylo/-2-cyklopenWenęlometanol /1 ’R , 4 ^,S/-2-amino-S,9-dlHydrs-9-/^_4-hcdrsksymewyls-2-eyklspenten-l-ylo_7-6H-pu ryn-6-on

Mątny roztwór 144 mg związku tytułowego z przykładu XII w 10 ml 0,1 M bufowu o pH 6 /z 28,4 g orwsfosforanu disodoyzgo w 2 litrach wody, naswawionpgs kwasem ortofosforowym/ zadano 0,5 ml roztworu dβaminarc adenozyny /778 jednostek/ w mieszaninie 5O% gliceryna - O,Ol M fosforan potasu, pH 6,0, po czym mieszano i ogrzewano ds 37°C. Ps 18,5 godzinach yypyopzsną znwiepnyę zamrozono. Zsbrαyz ciało stałe skrystalizowano z wody i uzyskano związek tytułowy w postaci białego ciała stałego w ilości 86 mg, / ο£_/θ-49° /£ 0,5, dimetylksulfktlzyek7ί Λ max /^pH 6 bufor/ 252,6 nm /Ecm 531/, ^XH NMR /DMSO-dg/ 10,60 /1H/,

7,60 /1H/, 6,47 /2^, 6,10 /1H/, 5,86 /1H/, 5,33 /1H/, 4,72 /1H/, 3,45 /2H/, 2,59 /1H/,

1,58 /1H/.

Przykład XIV. Wytwαraanie enαnejsmzróy /I oG ,4 oC/-4-/2-amino-6-hydroksy-9Hpuzyn^-ylo/-2 -ecklspθntenyOwnetanolu /a/ /1S ,4R/-4-/2-8mlno-6-hydroksy-9H-pιJryn-9-clo7-2-ccklopznWzny lornet ans 1

100 mg dominowego analogu /przykład XI/ rozpuszczono w 3 ml buforu ^POi 0,05 M /pH 7,4/ ogrzewając w 50,C. Roztwór oziąbiono do temperatury pokojowej i dodano 40 jednostek deαminarc adenozyny /Sigma, Typ VI, cieląca śluzówka jelitowa/· Ps 3 dniach inkubacji w temperaturze pokojowej wytrącił się osad, któwy usuniąto przez odsączenie i uzyskano 18,2 mg. Przesącz zatążono ds 1,5 ml i zamrozono na 2 dni. Przez przesączenie uzyskano jeszcze 26,8 mg ciała stałego. Obie stałe frakcje skrystalizowano z wody i uzyskano czysty związek tytułowy o temperaturze topnienia 269-272°C, “62,1 /c 0,3 MeOH/.

/b/ /IR , 4S7-4-/2-amino-6-hydroksy-9H-pupyy-9-clo/-2-ccklopzywzyy lornet ano 1

Przesącze uzyskane podczas wytwarzania izomeru 1S,4R /przykład XIVa połączono i odparowano ds sucha. Niezmieniony dominowy związek wejściowy oddzielono na żelu krzemionkowym w kolumnie do szybkiej ch roma t og sa n stosując 10% metanol/chlorofowm. Związek dominowy rozpuszczono w 15 ml 0,05 M buforu l^PO^ i dodano 800 jednostek deamiyαrc adenozyny. Roztwór inkubowano przez 96 godzin w 37,C. TLC wykazała pozostałość nieprzereagowanego związku. Roztwór ogrzano w gorącej wodzie w ciągu 3 minut i przesączono, aby usunąć zdeyαturowαne białko. Dodano jeszcze 800 jednostek dzaπlyaay adenozynę i proces powtórzono. Odbiałczony roztwór odparowano do sucha, a pwodukw ppzekpystaliaoyano z wodę. Po odsączeniu z wody zebrano związek tytułowy w postaci białego ciała stałego o temperaturze topnienia 265-27O°C. Cc=jqA + 61,1 /c 0.3 MzOH/.

Przykład XV. /i/ /I oC ,4 cC /-4-72-amlyo-6-hedrskse-9H-puryy-9-ylo7-2-cyklspzntenyloacztoksymetayol

Do zawiesiny 130 mg /O,50 mmola/ produktu z przekładu X i 5 mg /O,O4 mmola/ 4-dimzweloaminspirydeny w mieszaninie 6 ml aeetsniwpelu i O,09 ml /0,66 mmola/ w metyloaminy dodano 0,06 ml /O,6 mmola/ bezwodnika octowego. Mieszaniną mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. W celu szybkiego przerwania reakcji dodano 1 ml etanolu. Roztwór zatążono i zaabsorbowano na 1,5 g żelu krzemionkowego w kolumnie /2,O x 12 cm/, eluowano mieszaniną CHClg-MeOH 72O^l7. Zebrano frakcje z produktem i otyzono Je uzyskując białe ciało stałe. Stały pwodukw przemyto MeOH-AcOEW, uzyskano 123 mg produktu 785%7. Po dalszym oczyszczaniu z metanolu uzyskano związek wytułowy w postaci kryształów o kształcie igieł o temperaturze topnienia 237-239°C. Analiza /^ci3^Hi5^N5⁰;j/ C, H, N.

Przykład XVI. 7lS,4R7-4-”’-αalys--9Hppwcyn9-ey0o772-ecyk0ρpnwzycy0mmenaso1

Do chłodzonego lodem roztworu 1,202 g 7lS,4R/-4-/~2-αmino-6-mewokseamins-9H-purey-9els_7-2-ceklopznwzyomztanolu /półprodukt 8 z przykładu XII/ w 250 ml wewrahydrofuranu i 50 ml wody dodano podczas mieszania amalgamat glinowy /z 1,761 g glinu i 0,5% wodnego roztworu chlorku ztąci/ w małych kawałkach w ciągu 1 godzinę i 47 minut. Po 35 minutach mieszenia mieszaniną pozostawiono do ogrzania się do temperatury otoczenia. Po 16 godzinach i 50 minutach dodawano Jeszcze przez 14 minut amalgamat glinowy /z 235 mg glinu/. Po dalszych 4 godzinach i 10 minutach wytworzoną mieszaniną przesączono przez ziemią okrzemkową

163 814 w calu usuniącia substancji nierozpuszczalnych, które przemyto mieszaniną netpahydrofuran: woda /5:1, 300 ml/. Połączone przesącze odparowano do żółtej piany, którą poddano chromatografii kolumnowej na 33,8 g krzemionki /Merck 7734/ w chloroformie i eluowano mneszaninann chloroform-etanol uzyskując kilka frakcji /578 mg, 420 mg i 40 mg/. Dwie wią^ze frakcje SPzekpystαlnuawαto oddzielnie z izaspopanolu· Przesącze połączono z najmniejszą frakcją z kolumny i poddano sresapanywtab chromatografiu cienkowarstwowej /Merck 5717/ rozwijając trzy razy w układzie 10:1 cnlapafopn:matanal· Płytki ePuowαta octanem atylu i mieszaniną octanu etylu i etanolu /1:1/ i uzyskano 45 mg bryzowego ciała stałego. Poddano je chromatografii kolumnowej na 2,7 g krzemionki /Merck 7734/ przygotowanej w chloroformie i eluowano mieszaninami chloroform-nenanolnrnenylokmnna uzyskując 17 mg substancji żywicowatej. Po nnezadkwalająceb krystalizacji z iuospopanolu i obróbce węglem drzewnym w metanolu, wodny roztwór odzyskanej substancji odparowano ze stanu zamrożenia i uzyskano 15 mg związku tytułowego. ^XH NMR /OMSO-On/ 1,62 /1H/, 2,63 /1H/, 2,89 /1H/, 3,45 /2H/, 4,73 /1H/, 5,48 /1H/, 5,91 /1H/, 6,14 /1H/, 6,50 /2H/, 7,98 /1H/, 8,57 /1H/j Widmo masowe /MH/+ 232.

163 814

WZÓR 1b

163 814

Λ/² ϊ i •ν · /¼/\

Z Ν ΝΗ

YCH₂ \_/

ΝΗ·

WZOR 2

ΗΟ~Ί/\ • β u

WZÓR 3 /\/ ^Ν il νη₂ /\/\ Ζ Ν Υ

WZÓR Α

163 814

X

/\/\ η₂ν ν υ

WZÓR 5 //\ /^/\ Η₂Ν Ν ΝΗ

HO-CH₂ ί Ν^Ν-Αγ //\/

Ν Γι

WZÓR 6

Η₂Ν Ν ΝΗ ho-ch₂ .1

Yj

WZÓR 7

163 614

NHAc ^Ac°-pl

U

WZÓR 8

NH-.

^ηοίλ tt <

* 1=

WZÓR 3 . ___ ^Ci J^^h2

N yN=N-«N

Cl

I

A<\ ł^N Ν NH

Ϊ 3 /^/\

Cł

I //\/

N .1 tt o /W/

O \

Ν NH

HO

LJ

WZdR 2a i

/ΛΑ ΐ fi /w\/

H₂N Ν NH—ψΖ Ν N ^ηοίλ • ·

LI

WZÓR 7q

HO

Τ'

L

Cl //\

Ϊ -_x

H2N N NH

WZÓR 2b

HO_nA tt <

u

WZÓR 1 ^Η0Ί/\

WZÓR 6a

SCHEMAT

163 Θ14

wzóR g

X’

A N

Aa

A Λ /

Z Ν N ho-ch₂ I \->

«—e'

WZOR 10

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. SDosób wytwarzania nowych analogów nukleozydów dideoksydidahydrokarbocyklicznych o wzorze 1, w którym X oznacza atom wodoru, grupę NRR^, SR lub OR) Z oznacza atom wodoru, grupę OR‘ lub NRR ) R, R i R mogę byc takie same lub różne i są wybrane spośród podstawników obejmujących atom wodoru, grupy C alkilowe i grupy arylowe i ich farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych, znamienny tym, ze związek o wzorze 10, w którym X* oznacza atom chlorowca, a Z ma wyżej określone znaczenie, ewentualnie w postaci z zabezpieczonymi grupami funkcyjnymi, poddaje sie reakcji ze związkiem o wzorze HNRr\ w którym R i R^ maję wyżej określone znaczenia, z reagentem dostarczającym Jonu RO-, w którym R ma wyżej określone znaczenie, z tiomocznikiem lub ze środkiem redukującym, lub związek o wzorze l, w którym X oznacza grupę SH alkiluje się lub aryluje do związków o wzorze 1, w którym X oznacza grupę SR, po czym ewentualnie związek o wzorze 1 przeprowadza sie w farmaceutycznie dopuszczalną pochodną przez reakcją z kwasem, z zasadą, ze środkiem fosforylującym lub estryfikującym.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako związek wyjściowy stosuje sie związek o wzorze 10, w którym X' oznacza atom chlorowca, a Z oznacza H, OH lub NHg.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako związek wyjściowy stosuje sie związek o wzorze 10, w którym X* oznacza atom chlorowca, a Z oznacza grupę NHg.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związek o wzorze 10, w którym X* oznacza atom chlorowca poddaje się reakcji ze środkiem redukującym, z NHg, OH~ lub tiomocznikiem.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, ze związek o wzorze 10, w którym X* oznacza atom chlorowca, a Z ma wyżej określone znaczenie, poddaje się reakcji z OH.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, ze związek o wzorze 10, w którym X* oznacza atom chlorowca poddaje sie reakcji ze środkiem redukującym lub NHg.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania /I cC , 4 oć/-44/22-ainno---ydroksy-9H-puryn-9-ylo/-2-cyklopentenylometanolu /leć, AcC/^-^-amino-S-chloro^H-puryn^-ylo/^-cyklopentanylometanol poddaje sie reakcji z reagentem OH-.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substrat stosuje się związek o wzorze 10 w postaci zasadniczo mieszaniny racemicznej.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje się związek o wzorze 10, który jest zasadniczo izomerem optycznym.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że związek wyjściowy o wzorze 10 jest zasadniczo O-izomerem.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę racemiczną związku o wzorze i przeprowadza się w zasadniczo pojedynczy izomer optyczny tego samego lub innego związku o wzorze 1 przez enzymatyczną konwersje.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze z zabezpieczonej pochodnej związku o wzorze 9, w którym X i Z mają wyżej określone znaczenia, a Y oznacza grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową, usuwa się grupą zabezpieczającą.

    163 814