SE429405B - Sett att framstella influensavaccin innhallande aterforenade, seruminhibitorresistenta virusstammar - Google Patents

Description

'?l¿~12'!13~8 2 Av kliniska försök förda med vira isolerade från patienter i den förhoppningen att vissa av dessa vira skulle visa sig vara icke- patogena (A.A.Smorodintsev, G.A.Alexandrova, 0.M.Chalkina och A.A.

Selivanov, Applied Virology (1965), lzst Annual Symposium, Boca Raton, Florida, 1964, edit. av M.Saunders och E.H.Lennette, sid.l42 Shehoygan, Wisconsin, Ellis),har man dragit den slutsatsen, att vira resistenta mot hästseruminhibitorer förorsaka färre reaktioner än de, som äro känsliga för hästseruminhibitorer.

Man antager emellertid, att för att eliminera sidoreaktioner vid administrering av ett levande influensavirusvaccin måste omvandlingen till inhibitoreesístens vara fullbordad, när fortlevande av t.o.m. en liten procent inhibitor- känsliga partiklar kunna göra ett virus alltför patogent för människobruk. Olika försök ha gjorts att isolera influensavirusstammar fullständigt resistenta mot hästseruminhibito- rer, och teknik har beskrivits för att förbättra inhibitorresriensen av influensavira, varvid nämnda teknik väsentligen består av genom- gång i serie av influensavirusstammar i ägg i närvaro av serum.

Allantoispassager av blandningar av en given dos av influensa- vira och hästserum ha prövats leda till fullständig hästserumresi- stens av A2/England/501/68 (H2N2) influensavirusstam, medan resultaten icke voro avgörande för A2 Hong-Kong (fl3N2Yl/68-virussfiàm (A.S.Beare och N.L. Bynoe, British Medical Journal 4, 198-201, 1969).

Det är också känt, att allantoispassager av blandningar av en given dos av influensavirus A2 H0ng-Kong (H3N2)/l/68 och marsvins- serum icke ger några positiva resultat före den 17:e passagen (D.Ikic, N.Pasini, N.Rajner, B.Jancikic, M.Juzbasic och M.Hecimovic, Prcc.

Symposium on Acute Respiratory Diseases, 1969, Yoguslav Academy of Sciences and Arts, Zagreb).

Det har också visats, att det är möjligt att fullborda inhibitor- resistensen inom ett begränsat antal passager, när man använder succes- sivt hästserum och marsvinsserum i passagerna, dvs. att det är möj- ligt att erhålla en stabil och immunogen A2Hong-Kong (H3N2) influen- savirusstam fullständigt resistent mot seruminhibitorer, när man underkastar seriepassager i allantoishålrummet i ägg i närvaro av ökande koncentrationer av marsvinsserum en A2 Hong-Kong (H3N2)inf1uen- savirusstam, som förut har bragts gå i serie i allantoishålrummet i ägg i närvaro av ökande koncentrationer av hästserum.

Man har nu upptäckt, att stabila H3N2 influensavirusstammar full- ständigt resistenta mot seruminhibitorer och värdefulla för vaccin- 7412113-s 3 bruk genom intranasal administrering erhålles när en återförenan- de H3N2 influensavirusstam erhålles genom återförening från ett H3§2 influensavirus och ett A/PR8 influensavirus bringas gå i allantois-hålrummet hos outvecklade ägg i närvaro av serum, var- vid äggen företrädesvis är kycklingägg och varvid serum före- trädesvis är marsvinsserum.

Aterförenande H3N2 influensavirusstammar, som erhållas genom återförening från H3N2 influensavira, och A/PR8-influensavirus- stam är kända.

Det blir sedan möjligt att välja från dessa återförenings- medel viruskloner med hög tillväxtkapacitet (E.D.Kilbourne, Bull. Wld. Hlth. Org. ål, 643-645, 1969). Vissa viruskloner, som isoleras från sådana återföreningar, har visats försvagas för människan, icke dess mindre varken in vitro eller in vivo överens- stämma markerarna med minskning, och de försvagade egenskaperna hos de olika virusklonerna måste prövas medelst infektion av människor (A.S.Beare och T.S.Hall. Lancet 1971 II, 1271-1273).

Vid uppfinningsförfarandet utföres en återförenande H3N2 influen- savirusstam, som är vald för att ha höga tillväxtegenskaper, resi- stent mot seruminhibitorer. Det s k modifierade influensaviruset med H3N2-antigenkompositionen har bibehållit sin höga tillväxt- kapacitet. Sökanden har sålunda utvecklat ett användbart levande influensavaccin för vilket ingen sortering i människor är nöd- vändig att välja viruskloner med en acceptabel minskningsgrad och som har en stabil in vitro markerare. Detta användbara vac- cin erhålles efter endast en eller två passager av den valda åter- förenaren, H3N2-influensavirus i allantoishàlrummet hos outveck- lade ägg i närvaro av seruminhibitorer såsom angivits ovan.

En H3N2 influensavirusstam fullständigt resistent mot serum- inhibitorer, som erhålles enligt uppfinningsförfarandet, har an- visats "Alicestam"-beteckningen i sökandens samling. Ett prov på Alicestam har utfällts vid the American Type Culture Collec- tion (Rockville, Maryland, USA), där det erhöll ATCC VR 766- beteckningen.

Uppfinningen kännetecknas av att man i allantoishålrum- met i outvecklade ägg inkuberar en seruminhibitorresistent H N 3 2-influensavirusstam, Alice-stammen, under en tidsperiod 7412113-8 tillräcklig att tillåta tillväxt av en stor mängd av nämnda virus, man skördar det erhållna virusmaterialet och, om så önskas; frystorkar nämnda virusmaterial, varvid nämnda serum- inhibitorresistanta H3N2-influensavirusstam, Alice-stammen, erhålles genom att man låter åtminstone en gång i allantois- hålrummet i outvecklade ägg i närvaro av serum passera en âterförenande stam, HRC-2-stammen, som förut erhålles från en H3N2-influensavirusstam,«A/England/42/72-stammen, och A/PR8- influensavirusstammen, Mount Sinai A/PR¿/34-stammen, varvid kulturerna utföres genom användning av olika virusspädningar cvarierande frân“10_1 till-10-7 i normal saltlösning i närvaro av olika serumspädningar varierande från 1/4 till 1/1000 i normal saltlösning och.man isolerar den så erhållna serum- inhibitorresistenta stammen. I * ¥Antingen âterföreningsstammen eller den isolerade resisten- ta stammen eller bådadera kan tydligen kloneras eller underkas- tas flera spädningspassager utan modifiering av uppfinningstan- ken. _ Alice-virusstammen är sålunda den, som erhålles från MRC-2- klonen, som förut underkastas 5 slutspädningspassager, innan den en gång bringas passera vid en 10-5-koncentration i när- varo av 1/16-spädning av marsvinsserum i normal saltlösning och en gång vid 10-7-koncentration i närvaro av en 1/4-spädning av marsvinsserum i normal saltlösning och underkastas ytterliga- re 3 slutspädningspassager i frånvaro av serum + en ytterligare passage i frånvaro av serum för fröandelsframställning. Denna andel motsvarar den 12:e passagen av MRC-2-klonen, varvid den använda stammen från 7:e passagen och vidare är resistent mot seruminhibitorer.

De så-erhållna virusstammarna fullständigt seruminhibitor- resistenta är icke-patogena, immunogena och värdefulla för in- fluensalevande virusvaccinframställning och använder därför varje inom tekniken känt utförande för levande influensafram- ställning och/eller stabilisering.

De så erhållna försvagade influensavirusvaccinerna administ- reras begränsat i nasopharynx.

För vaccinbruk hâlles virus företrädesvis i frystorkad form och vaccinet ombildas provisoriskt genom tillsats av ænfingaxvatuaxav '7412113-8 vilket som helst annat farmaceutiskt utdrygningsmedel eller komposi- tion känd inom tekniken för framställningen av nasalpreparat såsom droppar eller spray.

Följande exempel beskriva uppfinningen men begränsa på intet sätt dess skyddsomfàng.

EXEMPEL 1 Förfarande Ett prov av MRC-2-klone, som underkastas 5 slutspädningspassager och visas vara högt känsligt för normala seruminhibitorer, användes som utgångsviralt material. Olika spädningar (dvs. 10-1, 10-5, 10-5 och -7) ur nämnda utgångsvirala material i normala saltlösningar blan- das med olika spädningar (dvs. 1/4, 1/8, 1/16, 1/40, 1/200 och 1/4000) av sterilt normalt marsvinsserum (i normal saltlösning), som förut inställes vid l/4-spädningen och sedan hålles i 15 min. i ett kokan- de vattenbad, som ytterligare spädes, homogeniseras och centrifugeras vid 2000 vaFVmin. i 50 min. Det på ytan flytande användes under det vidare steget, som består av inkubation av virus/serum-blandningarna vid 5700 i lh före inokulation av 0,2 ml alikvota delar av nämnda blandning i allantoishàlrummet i en serie outvecklade kycklingägg, som förut inkuberas under 9-10 dagar vid 5700 och genomlysas (endast de levande äggen inokuleras). Äggen inkuberas sedan ytterligare under en tidsperiod varierande mellan 24 och 96 h.

Vid slutet av denna inkubationsperiod genomlysas äggen och de levande äggen kylas vid 400. Allantoisfluidum av varje serie av levan- de ägg skördas separat och provas för närvaron av influensavirus medelst hemagglutinationsmetoden. Det skördade virus, som alstras genom inokulum av den högsta virusspädningen i närvaro av den högsta serumkonoentrationen, som visar hemagglutinationsaktivitet (dvs. och serumspädning 1/16), användes för en andra passage, som utföres i de samma verksamma betingelserna. Det skördade virus, som åstadkommes genom inokulum av den högsta virusspädningen virusspädning 10- (dvs. 10-7) i närvaro av den högsta serumkoncentrationen (dvs. serum- spädning 1/4) visar hemagglutinationsaktivitet och är fullständigt resistent mot normala seruminhibitorer såsom anges i tabell I. Tre ytterligare passager vid slutspädningar utföres i frånvaro av serum för att klona det erhållna resistenta muteringsmedlet och att kontrol- lera stabiliteten av den resistenta karaktären. Såsom anges i följan- de tabell I är det vid varje passage skördade viruset fullständigt 7412113-8 6 resistent mot inhibitorerna av normalt serum. Viruset vid den Sista .passagenivån användes som inokulum för framställningen av fröandelen av Alicestammen. De skördade allantoisfluida hopsamlas sålunda och sammanslås, sterilitets- och säkerhetstestas, blandas med pepton för att uppnå en slutlig koncentration av 5% av pepton. En volym av 0¿5 ml av den virala suspensionen fördelas i 5 ml flaskor och frys- torkas.

In vitro- och in vivo-karakteristika av det modifierade viruset 1) Inhibitorresistens För provning av resistensen mot inhibitorerna närvarande i nor- malt uppvärmt djurserum (häst-, marsvins- och kalvsera förut upp- hettade vid 7500 i l h) blandades i serie tvåfaldiga spädningar av de upphettade sera med 4 hemagglutinationsenheter av moderstammen och det modifierade viruset. Efter inkubation av l h vid rumstempe- ratur tillsattes kyckling-röda blodceller och resultaten nedtecknas.

Dessa resultat visas i följande tabell I: TABELL I Moderstammar Modifierat virus Serum Ag/Eng/ MRC-2 à å å g å) m m m o s 4&W2 mä må šäms s s 0 mzm mzm -U s m m m 2 ~s§~ssomHvH+= v f-i N fifdmmwm ma: wçq Tim Tan w w zw 1 1 H mh wnßmmn ma ma ÖIDUIOÜIIIQDLOOG OG) OG) am pm pwwsw-»saw mm>mm>msmHnfasHs mmmmmmmmn Häst >l0,000 >l0,000 <2O <2O (20 0420 (20 (20 flarsvin >l0,000 )l0,000 (20 <2O (20 <2O (20 (20 šalv 1,000 1,000 <2O (20 <2O (20 <2O <2O Data visa en fullständig resistens för fröandelen och tvâ på varandra följande försöksandelar alstrade från denna fröandel. 2) Stabilitet hos den inhibítor~resistenta karaktären ben resistenta karaktären hos Alice-stammen bekräftades i ägg och i laboratoriedjur (vesslor eller illrar) - i ägg, Alice-stammen underkastades 5 ytterligare passager i out- vecklade kycklingägg utan ändring av sin resistenta kraktär - i vesslor eller illrar, viruset, som isoleras 5 dagar efter intra- nasal inokulation (107 EID5o) befanns också fullständigt resistent motfseruminhibitorer. 7412113-8 7 _ ) Antigenicitet och frånvaro av sidoeffekter En första grupp av 4 vesslor eller illrar inokulerades intra- nasalt med 107 EID5O av Alice-stammen. Djurens temperatur togs dag- ligen under 5 dagar p.i. Ingen betydelsefull temperaturhöjning regi- strerades (maximumtemperatur 59,8°C). En andra grupp av 2 vesslor eller illrar inokulerades intranasalt med 107 EID5O av A2/Eng/4272- moderstammen. Två dagar efter inokulationen visade de två djuren temperaturer av 40,800 och 41,200 respektive. En tredje grupp av 2 vesslor eller illrar inokulerades intranasalt med 107 EID O av en stam isolerad i Australien år l972 (A2/Victoria/101/72). Båda vess- lorna eller illrarna visade ett positivt svar på 2:a dagen efter inokulationen (temperaturer högre än 40,500). Hemagglutination- inhibiteringsproven visade, att inhibitorresistensen icke ändrar antigenioiteten av viruset i vesslor eller illrar: 14 dagar efter den intranasala'inokulationen voro serumantikropptitrarna mycket höga bland de inokulerade djuren (titer l/1024 i motsats till kon- trollgruppen titer > l/8).

EXEMPEL 2 Man utgår från det frystorkade materialet, som erhålles i exem- pel 1 (dvs. Alice-stammen), såsom fröandel för vaccinproduktion i stor skala, varvid en ytterligare passage utföres i allantoisfluidet av en annan sats av outveoklade kycklingägg, som inkuberas vid 56°G i 5 dagar.

Allantoisfluida skördas, sammanslâs, sterilitet- och säkerhets- testas, blandas med pepton för att uppnå en slutlig koncentration av % av pepton och fördelas i 5 ml glasflaskor för att uppnå en dose- ringsenhet (dvs. minst 107 EID5O) virus. Produkten frystorkas sedan och flaskorna tillslutas eller säkert tillstoppas.

Denna passagenivå användes som vaccinsats. För vaccinadministre- ring ombildas innehållen hos en glasflaska genom tillsats av 0,5 ml vatten eller saltlösning eller en 5% sukroslösning och administreras som droppar i näsborrarna.

Allantoisfluidpeptonframställningen fördelas alternativt i större glasflaskor för att erhålla enheter av doseringsenhetsmängden av virus för att bilda motsvarande flerdosvaccinframställningar.

EXEMPEL å Vaccinering med det försvagade influensavaccinet, Alice-stam Material och metod lO försökspersoner, ålder mellan 18 och 44 år (medelålder 28 år) och med en H.I.-antikropptiter §{§2, valdes för försöken. Dessa tio för- 7 4 12113'8 8 sökspersoner mottog med ett 14-dagarsintervall två administreringar av det provisoriskt ombildade vaccinet, Alice-stammen. För varje admi- nistrering mottogo alla försökspersonerna det i exempel 2 erhållna vaccinet (5 droppar per näsborre). dNasala tvättningar och blodprov för antikroppbestämning (A/England/42/72-stam) togs på dag 14 efter den första administre- ringen (dvs. den andra inokulationens dag) och 5-4 veckor efter den andra administreringen.

Resultat I. Kliniskt Temperaturen registrerades under 5 dagar följande varje admini- strering. Såsom anges i följande tabell II visade endast en.försöks- person (Nr E) en mindre höjning av temperaturen (57,2°C på dag 1).

Sju försökspersoner visade vissa milda kliniska manifestationer: sex av dem hade en vattenblandad rhinitis eller nasal kongestation i l-2 dagar och en försöksperson klagade över mild huvudvärk med pharyngeal hypersekretion.

II. Virusisolering Nasala och halsprovsuddar hopsamlades på dag 2 för åtta försöks- personer (Nr 5,5,6,9,l2,l4,22 och 27). Alla prov förblevo negativa efter två blindpassager i outvecklade ägg.

III. Serologa resultat I a) Hemagglutinationsinhibitations(H.I.)antikroppstiter l4 dagar efter den första administreringen observerades sero- omvandling i sex utav tio försökspersoner.

Efter den andra administreringen ha sju försökspersoner utav tio seroomvandlats. I b) Serumneutralisations(S.N.)antikroppstiter 14 dagar efter den första administreringen noterades en betydel- sefull antikroppstiterhöjning hos sex utav tio försökspersoner och efter den andra administreringen hos nio försökspersoner utav tio.

.Endast en försöksperson (Nr 6) seroomvandlade icke-efter två administreringar, när man betraktar H.I.- och S.N.-titer utav tio frivilliga.

IV. Lokala antikroppar Lokala N-antikroppstiter för alla tio försökspersonerna angivas i tabell III.

En betydelsefull antikroppstiterhöjning observerades hos sju för- sökspersoner utav nio l4 dagar efter den första administreringen och hos åtta utav tio 21-28 dagar efter den andra inokulationen. 7læ12113-8 e>wwfiH HH I mmHøB|mßaHWHoUumH cow wHHsHmWm BmsHwmmnmdHo5mw _ _ m.H. wuawwflowwwß m.2. mßdHWHowwmH %w%mmwm|.Nmb wmHm H? mmfl ml? » ZH HHN muw Huw mnw w mmä. Nma. maa. wmä. m m Hm m: m: Hm mmm mmm mfimøm små såå woummmmmou vw mmm 4 vw Qmm 4 cow mwm m m 3 Am Am Hm mm mm Hmm Hämmfi | m M Hm mm mm Hm Hm mm VHßmwß Hmmm Ufl4ø@4mHW vw mmm O ^W4WHHv. EHHQ wUmH%5mmNH Uwwmflmmwl Hmdwoß. w N m m Hm Hm Hm mê Hämmb | Hm E m Hm Hm .m Hm mm Hßmob I HF 3 m mm m# Am m# m# Hbmmb HUH5HdHm | mmm P ooä m mm S mm Hmm Hmm mm WmHm WmHm Hbmmu HWHbHfiHm I mmm H.m oow . m mm z Hm Hmm mmm mm mmm mmm .Hsmmw wwïümmm .. mmm m 0% m mm 3 Hm Hmm Hmm Hm mmm mmm .Hfimob HUHöHdHm I www O W mfl _2 m mm mm Hm mF mF UH5mmD flUH5HdHw I Qwm m 27412113-:8 TABELL III - Lokala N-antikroppar FörSöks_ Nasal-tvättningar (X) I person före 1% dagar efter 5-4 veckor Nr vaccinering 1:a adm. efter 2:a adm. 'í 2 16 52 < 2 2 LI- 6 < 2 4 4 9 < 2 16 ¿ 2 12 (2 <2 2 14 (2 16 16 22 ( 2 A 16 2 64- 2§ ( 2 NT 8 26 < 2 64 128 27 < 2 s 4 (x) Nasal-tvättningar efter standardisering för immunoglobulin A (IgA) = ca 200 pgr/ml;

Claims (3)

7412113-8 11 PATENTKRAV:

1. Förfarande för framställning av ett försvagat influensavirus- vaccin, k ä n n e t e c k n a t därav, att man i allantoishâlrum- met i outvecklade ägg inkuberar en seruminhibitorresistent H3N2- influensavirusstam, Alice-stammen, under en tidsperiod tillräcklig att tillåta tillväxt av en stor mängd av nämnda virus, man skördar det erhållna virusmaterialet och, om så önskas, frystorkar nämnda virusmaterial, varvid nämnda seruminhibitorresistenta H3N2-influensa- virusstam, Alice-stammen, erhålles genom att man låter åtminstone en gång i allantoishålrummet i outvecklade ägg i närvaro av serum passe- ra en âterförenande stam, MRC-2-stammen, som förut erhålles från en H3N2-influensavirusstam, A/England/42/72~stammen, och A/PR8-influensa- virusstammen, Mount Sinai A/PR8/34-stammen, varvid kulturerna ut- föres genom användning av olika virusspädningar varierande från m” till 1o"7 ningar varierande från 1/4 till 1/1000 i normal saltlösning och man i normal saltlösning i närvaro av olika serumspäd- isolerar den så erhållna seruminhibitorresistenta stammen.

2. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att de outvecklade äggen är outvecklade kycklingägg.

3. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att serumet är marsvinsserum.