CN107384875A

CN107384875A - 克服雏鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒载体h7活疫苗候选株及其构建方法

Info

Publication number: CN107384875A
Application number: CN201710780038.9A
Authority: CN
Inventors: 刘秀梵; 刘晶晶; 胡顺林; 王晓泉
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-09-01
Filing date: 2017-09-01
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明涉及克服雏鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒载体H7活疫苗候选株及其构建方法，所述新城疫疫苗株，它的保藏号CGMCC No.13798。其构建方法是利用能够在新城疫抗体存在下高效复制的嵌合病毒rAI4‑TFHN的反向遗传操作平台，将禽流感H7N9亚型毒株的HA序列***AI4‑T4FHN株基因组全长转录载体中，得到含有禽流感病毒H7N9亚型HA基因的重组新城疫病毒基因组全长cDNA克隆pNDV/rAI4‑T4FHN‑H7。经转染获得的重组病毒AI4‑T4FHN‑H7在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，连续传代仍能稳定表达HA蛋白，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。

Description

克服雏鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒载体H7活疫苗候选株及其构建方法

技术领域

本发明涉及应用反向遗传技术，拯救一株以嵌合新城疫病毒为载体表达禽流感H7亚型病毒HA蛋白的重组疫苗株rAI4-T4FHN-H7，用于研制疫苗。

背景技术

反向遗传操作技术(Reverse genetics manipulation technique)是指将RNA病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术[Neumann G,Whitt M A,KawaokaY.Adecade after the generation of a negative-sense RNA virus from clonedcDNA–what have we learned？Journal of General Virology,2002,83(11):2635-2662.]，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除(缺失)、基因***、基因置换和基因互补(即构建嵌合病毒)等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防制策略的研究，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路[Huang Z,Elankumaran S,Panda A,et al.RecombinantNewcastle disease virus as a vaccine vector.Poultry Science,2003,82:899-906.]。

新城疫(Newcastle disease，ND)，又称亚洲鸡瘟、伪鸡瘟等。世界动物卫生组织(OIE)将其列为动物法定必报传染病。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是单股、不分节段的负链RNA病毒，属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属成员。基因组长度大约15kb，其结构为3’-leader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrix protein,M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN)和大分子蛋白(Large protein,L)。其中F蛋白具有诱导细胞融合、破坏细胞的作用，是NDV毒力和致病性的主要决定因素[PeetersBP,de Leeuw OS,Koch G,Gielkens AL(1999)Rescue of Newcastle diserse virus fromcloned cDNA:evidence that cleavability of the fusion protein is a majordeterminant for virulence.J Virol 73:5001-5009.]。

一种新型H7N9禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)于2013年2月在华东地区出现。感染H7N9病毒的患者临床表现为呼吸道感染，严重肺炎和呼吸困难甚至死亡。截至2015年4月底，H7N9流感病毒已导致630例实验室确诊的人类感染，死亡率超过30％[Jernigan,D.B.&Cox,N.J.H7N9:preparing for the unexpected in inflenza.Annu RevMed 66,361–37]。对世界范围内分离的H7N9毒株的多个基因片段进行分析，发现新型H7N9病毒可能是由H7N9,H7N3和H9N2这三个亚型的病毒在禽群内循环重组产生的。患者通常通过直接接触禽类比如经常去活禽市场、目睹宰杀禽类等感染病毒。尽管直接的人与人之间的传播非常有限，但H7N9病毒的持续传播仍对人类构成潜在的大流行威胁。由于目前市场上还没有针对H7N9的疫苗，低致病性H7N9病毒持续存在和进化，已经演变成鸡的高致病性病毒，严重影响了家禽产业和公共健康。

因此，疫苗免疫对控制H7N9在家禽中的爆发和人类感染至关重要。NDV被用来迅速研制针对新发高致病性传染病的基因工程疫苗。其具有遗传稳定性好、不存在与细胞基因组整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性强等诸多优点[Bukreyev A,Skiadopoulos M H,Murphy B R,et al.Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectors[J].Journal of Virology,2006,80(21):10293-10306.]。在NDV基因组内***外源基因后的重组病毒，可在动物体内复制并稳定持续地表达外源蛋白，用此重组病毒作为疫苗,可以诱导机体产生针对AI和ND的双重免疫保护力[Veits J,Wiesner D,Fuchs W,etal.Newcastle disease virus expressing H5hemagglutinin gene protects chickensagainst Newcastle disease and avian influenza[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(21):8197-8202.Schroer D,Veits J,Grund C,et al.Vaccination withNewcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highlypathogenic H7avian influenza virus[J].Avian Dis,2009,53(2):190-197.]，Lamb等[Lamb,R.A.,Kolakofsky,D.,et al.(2001).Paramyxoviridae:the viruses and theirreplication,p.1305-1340.In D.M.Knipe and P.M.Howley,Fieldsvirology.Lippincott Williams&Wilkins Philadephia,Pa.]研究发现副粘病毒的转录呈极性效应，越靠近3'端的基因其转录产物越多，越靠近5'端转录产物的量越低。从目前研究来看，外源基因在NP基因或P与M基因之间***时，其表达量较高，这两个位置成为外源基因***的首选。

疫苗接种是中国养禽业预防控制ND的重要手段，接种过ND疫苗的母鸡，其母源抗体能通过卵黄囊传递给雏鸡，而使雏鸡产生被动免疫力，故雏鸡体内含有高滴度的ND抗体。有母源抗体的雏鸡用弱毒疫苗免疫后，ND载体疫苗进入雏鸡体内，很快被其中和。只有当母源抗体降到较低水平(小于3log₂,一般要15-20日龄后)时，对弱毒活疫苗免疫影响才非常小，方可产生较为可靠的免疫力。[Sarfati M D,Lozano D B,Soto P E,Castro P F,Flores C R et al.(2010)Protective dose of a recombinant Newcastle diseaseLaSota-avian influenza virus H5vaccine against H5N2highly pathogenic avianinfluenza virus and velogenic viscerotropic Newcastle disease virus inbroilers with high maternal antibody levels.[J].Avian Dis.54(1Suppl):239-241.]。这极大限制了NDV载体疫苗在商品鸡群中的应用。

本研究的目的是研发一株能够在存在ND母源抗体的鸡群中有效复制并且高效刺激产生针对新发AIV H7N9亚型病毒的抗体的活载体疫苗株，用于商品鸡群的早期免疫，填补当前市场的空白。

发明内容

本发明的目是提供一种以能够克服雏鸡ND母源抗体影响的嵌合NDV为载体表达AIV H7N9毒株HA蛋白的重组疫苗株，用于制造疫苗。

本发明的原理是：通过对本实验室构建的全长克隆载体pNDV/rAI4进行改造，将其囊膜蛋白F和HN蛋白替换为APMV-2对应的蛋白，成功构建了全长克隆载体pNDV/rAI4-TFH，经反向遗传操作获得了能够在有母源抗体存在的鸡群中有效复制的疫苗载体rAI4-TFH，其尿囊液的HA效价为10log2。2014年，扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室在江西某鸡场分离到一株低致病性H7N9禽流感病毒A/chicken/zhejiang/JX148/2014。因此，本发明在上述基础上，以pNDV/rAI4-TFH为骨架，构建可表达低致病性H7N9禽流感病毒A/chicken/zhejiang/JX148/2014HA蛋白的重组嵌合新城疫疫苗株AI4-T4FHN-H7，用于应对当前H7N9禽流感病毒的流行。

本研究提供的一株克服雏鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒载体H7活疫苗候选株,是禽副黏病毒I型(Avian Paramyxovirus type-1)AI4-T4FHN-H7，其保藏号CGMCC No.13798。

本发明还公开所述克服雏鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒载体H活疫苗候选株AI4-T4FHN-H7的构建方法：以能够在新城疫抗体存在下高效复制的嵌合病毒AI4-T4FHN的基因组全长转录载体pNDV/rAI4-T4FHN为骨架，将禽流感H7N9亚型的HA基因序列***转录载体pNDV/rAI4-T4FHN的P、M基因之间，经反向遗传技术获得重组病毒AI4-T4FHN-H7。

本发明的方法具体包括以下步骤：

1.全长克隆pNDV/rAI4-T4FHN-H7的构建

1)禽流感病毒H7N9亚型流行株A/chicken/zhejiang/JX148/2014(GISAID：EPI841962)HA基因的克隆

用裂解法提取JX148株的基因组DNA，根据禽流感H7亚型HA基因序列设计一对引物HA-F和HA-R，以JX148株病毒基因组为模板扩增HA基因编码区(SEQ ID NO.13)，克隆进pCR2.1载体中构建pCR2.1-7HA，其中HA基因片段两端带有Pac I酶切位点。

HA-F:5'-ttAATTAAGAAAAAATACGGGTAGAACGCCACCATGAACACTCAAATCCTGGTATTCGC-3'(SEQ ID NO.11)

HA-R:5'-ttAATTAATTATATACAAATAGTGCACCGCATGTTTC-3'(SEQ ID NO.12)

2)全长克隆pNDV/rAI4-T4FHN-H7的获得

质粒pCR2.1-7HA和pNDV/rAI4-T4FHN同时用Pac I进行酶切，回收目的片段，将pNDV/rAI4-T4FHN酶切产物用去磷酸化试剂盒进行去磷酸化处理后再连接，构建出重组NDV基因组全长克隆pNDV/rAI4-T4FHN-H7，具体的构建方法见图1。

2.重组病毒pNDV/rAI4-T4FHN-H7株的拯救

将全长质粒pNDV/rAI4-T4FHN-H7与pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞，60h后接种9～11日龄SPF鸡胚，盲传一代后获得重组病毒AI4-T4FHN-H7。

本发明中，经转染获得的重组病毒AI4-T4FHN-H7在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，连续传代仍能稳定表达HA蛋白，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。

附图说明

图1重组质粒rAI4-T4FHN-H7构建模式图。

图2重组病毒cDNA RT-PCR鉴定电泳图。

图3重组病毒感染CEF细胞后外源蛋白的间接免疫荧光检测结果。

A为AI4-T4FHN感染组，B-D为AI4-T4FHN-H7感染组。A、C组以APMV-2鸡多抗血清为一抗，B组以AIV H7鸡多抗血清为一抗，D组以SPF鸡阴性血清为一抗进行间接免疫荧光检测。

图4重组质粒感染CEF细胞后外源蛋白的western blot检测结果。

1：为重组病毒感染细胞后的细胞样品，2：为JX148感染细胞后的样品，M：为蛋白marker。

图5重组病毒免疫鸡群抗体水平变化。

H7和APMV-2柱状图标分别免疫后鸡群中针对H7N9病毒和载体病毒的血清抗体水平。

具体实施方式

本发明构建的嵌合新城疫病毒载体H7活疫苗候选株AI4-T4FHN-H7于2017年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为：禽副黏病毒I型，拉丁文名是：AvianParamyxovirus type-1，保藏号CGMCC No.13798。

本发明构建的嵌合新城疫病毒疫苗载体毒株AI4-T4FHN于2016年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；分类命名为：禽副黏病毒I型，拉丁文名是：AvianParamyxovirus type-1其保藏号CGMCC No.12987。

实施例1：重组质粒pNDV/rAI4-T4FHN构建

构建步骤一：新城疫病毒AI4株基因组的修饰

生物材料准备：

NDV AI4株的全长表达载体pNDV/rAI4(Hu Z,Hu S,Meng C,et al.Generation ofa Genotype VII Newcastle Disease Virus Vaccine Candidate with HighYield inEmbryonated Chicken Eggs.Avian Diseases 2011,55(3):1759-1769)由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室构建、保存。

pCR2.1载体：购自Invitrogen公司；AMV反转录酶、High fidelity DNApolymerase、T4DNA连接酶、Agarose Gel DNA ExtractionKit购自Roche公司；转染试剂SuperFect和质粒抽提试剂盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)为QIAGEN公司产品；其余常规试剂均为国产分析纯。

设计突变引物Age I F/M R和M F/BstZ17I R，在AI4全长质粒3250nt处突变碱基，添加Pac I酶切位点，引物序列如下：

Age I F：5’-GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTCA-3’(SEQ ID NO.1)

M R：5’-ATTAATAATGCTGCTGGATTGGTTG-3’(SEQ ID NO.2)

M F：5’-ACCAATCCAGCAGCATTATTAATTAA-3’(SEQ ID NO.3)

BstZ17I R：5’-ACCCTGTCTGAGACGAGGTGTAT-3’(SEQ ID NO.4)

突变碱基以斜体标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR反应：以全长表达载体pNDV/AI4为模板配制如下PCR反应体系：

PCR反应循环参数：94℃预变性5min，94℃50s，60℃1min15s，72℃延伸，延伸时间为1min/kb，15个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

Overlap PCR反应体系及条件：

PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，2个循环之后再94℃40s，64℃退火1min，72℃延伸2min，15个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

回收目的片段与pCR2.1载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，阳性质粒命名为pCR2.1-Pac I。利用酶切位点Age I/BstZ17I将酶切位点Pac I导入全长表达载体pNDV/AI4，获得新的表达载体pNDV/AI4-Pac I。

步骤二：以rAPMV-2-Yuc株的F和HN胞外区替换AI4基因组相应部分

生物材料准备：

pCR2.1载体：购自Invitrogen公司；AMV反转录酶、High fidelity DNApolymerase、T4DNA连接酶、Agarose Gel DNA ExtractionKit购自Roche公司；质粒抽提试剂盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)为QIAGEN公司产品；其余常规试剂均为国产分析纯。

1、表达嵌合囊膜蛋白基因的质粒pUC-T4F/Pac I和pUC-T4HN/FspA I的合成

根据GenBank中发表的1株APMV-2毒株rAPMV-2-Yuc(GenBank:LC187305.1)的全长序列，利用胞外区在线预测网站(http://minnou.cchmc.org)预测rAPMV-2-Yuc的F和HN基因的胞外区,。用SnapGene基因编辑软件将rAPMV-2-Yuc F基因胞外区(1-1440nt)和AI4F基因胞内区(1513-1662nt)基因序列拼接到一起，人为创建一个嵌合基因F，具体序列见SEQID NO.5(其中1-1440bp为rAPMV-2-Yuc F基因胞外区；1441-1590bp为AI4F蛋白的胞内区)。用同样的方法将rAPMV-2-Yuc HN基因胞外区(145-1743nt)和AI4HN基因胞内区(1-165nt)基因序列拼接，创建嵌合HN基因，具体序列见SEQ ID NO.6(其中1-165bp为AI4HN基因胞内区；166-1764bp为rAPMV-2-Yuc HN基因胞外区)。

设计并合成SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

SEQ ID NO.7中，PacI酶切位点为1-6bp和2967-2972bp；7-1304bp和2895-2966bp为酶切位点到F基因之间的AI4序列；1305-2894bp为SEQ ID NO.5。

SEQ ID NO.8中，1-6bp、3300-3305bp为酶切位点PacI，16-21bp为酶切位点AflII；22-149bp和1914-3300bp为酶切位点到HN基因之间的AI4序列；150-1913bp为SEQ ID NO.6。

将合成的序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8分别克隆进商品质粒pUC17，获得中间质粒pUC-T4F/Pac I和pUC-T4HN/FspA I，其中pUC-T4F/Pac I中合成的序列SEQ ID NO.7由AI4基因组中Pac I酶切位点到F基因之前的序列以及嵌合F基因组成；pUC-T4HN/FspA I中合成的序列由SEQ ID NO.8含有以及AI4基因组中HN基因之后到FspA I酶切位点的序列和嵌合HN基因pUC-T4HN/FspA I合成的基因在5‘端添加了酶切位点Pac I，AflII为F和HN基因之间的酶切位点。用Pac I和AflII酶切这两个质粒，将pUC-T4F/Pac I合成的基因与pUC-T4HN/FspA I合成的基因相连，构建中间质粒pUC-T4FHN。

2、囊膜糖蛋白基因的替换：

pUC-T4HN/FspA I合成的基因在5‘端添加了酶切位点Pac I，AflII为F和HN基因之间的酶切位点。用Pac I和AflII酶切这两个质粒，将pUC-T4F/Pac I合成的基因与pUC-THN/FspA I合成的基因相连，构建中间质粒pUC-T4FHN。利用酶切位点Pac I和FspA，将嵌合的APMV-2F(SEQ ID NO.5)和HN(SEQ ID NO.6)基因从pUC-T4FHN导入到全长转录载体pNDV/rAI4-Pac I中，获得新的转录载体pNDV/rAI4-T4FHN。

3、重组质粒pNDV/rAI4-T4FHN的酶切鉴定：

由于分离株T4基因组中HN基因序列中不含有Hind III酶切位点，而pNDV/AI4上HN基因序列上却含此位点，但NDV AI4株全长cDNA14056nt和转录载体的292nt处也存在此酶切位点，因此，HN基因被成功替换的阳性质粒，经Hind III酶切后会出现10.8kb、6.0kb和1.4kb大小的3条目的片段。

步骤三：重组病毒AI4-T4FHN株的拯救

生物材料准备:

可稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。

真核表达质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L(胡顺林，张艳梅，孙庆，刘玉良等.鹅源新城疫病毒拯救体系的建立[J].微生物学通报.2007，34(3))：由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。其中，表达NP和P基因的真核表达质粒pCI-NP、pCI-P还公开于(刘玉良.(2005).从cDNA克隆产生感染性ZJ1株鹅源新城疫)；表达L基因的真核表达质粒pCI-L还公开于(胡顺林.(2007).鹅源新城疫病毒反向遗传技术平台的建立及其应用)。

SPF种蛋购自北京梅里亚公司，在扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室孵化。

1、重组病毒的拯救

转染时所用质粒(pNDV/rAI4-T4FHN、pCI-NP、pCI-P和pCI-L)均采用QIAprepSpinMiniPrepKit抽提。将pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个辅助质粒与重组NDV基因组全长cDNA克隆pNDV/rAI4-T4FH共转染BSR-T7/5细胞，18-24h后加入终浓度为10％SPF胚尿囊液，60h后将转染样品冻融1次后，收获并接种9～11日龄SPF鸡胚，收集鸡胚尿囊液，按OIE标准测定血凝效价，所测HA效价为10log₂，血凝特性能被针对APMV-2的多克隆抗体抑制。

2、RT-PCR验证获救病毒AI4-T4FHN

红细胞凝集试验(hemagglutination,HA)和红细胞凝集抑制实验(hemagglutination inhibition,HI)检测均为阳性的尿囊液，在SPF鸡胚上传4代后，收集尿囊液抽提病毒的总RNA，用6nt随机引物反转录成cDNA后用于RT-PCR反应。

用引物2-F和2-R扩增嵌合基因，长度约为3200bp，回收目的片段进行测序鉴定，扩增片段的测序结果显示rAPMV-2-Yuc株的囊膜蛋白***成功。

2-F：5’-CATTCAGGACACAGCATGATACCCGTGTTAATTGCCAGC-3’(SEQ ID NO.9)

2-R：5’-TCAATTGGGGAGTTCCTTCCG-3’(SEQ ID NO.10)。

实施例2：

重组质粒pNDV/rAI4-T4FHN-H7构建模式图如图1。

构建步骤一：以嵌合新城疫病毒AI4-T4FHN为载体表达禽流感H7N9亚型毒株HA蛋白的全长表达克隆的构建

生物材料准备：

禽流感病毒H9N2亚型流行株A/Chicken/Jiangsu/JX148/2014(JX148)由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离、保存。GISAID数据库序列号为EPI841962

pCR2.1载体：购自Invitrogen公司；Dephospharylation(BAP)Kit：购自宝生物工程(大连)有限公司；AMV反转录酶、High fidelity DNA polymerase、T4DNA连接酶、AgaroseGel DNA ExtractionKit购自Roche公司；转染试剂SuperFect和质粒抽提试剂盒(QIAprepSpin MiniPrep Kit)为QIAGEN公司产品；其余常规试剂均为国产分析纯。

1、禽流感H7N9亚型毒株HA基因的克隆

裂解法提取禽流感病毒H7N9亚型流行株JX148的全基因组cDNA。根据genbank上传的H7亚型HA基因序列设计引物HA-F和HA-R，用于扩增HA基因的编码区。引物序列如下：

HA-R:5'-ttAATTAATTATATACAAATAGTGCACCGCATGTTTC-3'(SEQ ID NO.12)

SEQ ID NO.11中1-8bp为PacI酶切位点；6-15bp为NDV基因终止序列；17-26bp为NDV基因终止序列；28-37bp为Kozak序列，用于提高外源蛋白表达效率。SEQ ID NO.12中1-8bp为PacI酶切位点。

以上引物由上海生物工程有限公司合成。

对HA-F和HA-R这对引物扩增的片段进行测序，获得JX148株HA蛋白的基因序列，即SEQ ID NO.13所示序列：

PCR反应：以JX148株DNA为模板配制如下PCR反应体系：

回收目的片段与pCR2.1载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，阳性质粒命名为pCR2.1-7HA。

2、全长克隆pNDV/rAI4-T4FHN-H7的获得

质粒pCR2.1-7HA和pNDV/rAI4-T4FHN同时用Pac I进行酶切，回收目的片段，将pNDV/rAI4-T4FHN酶切产物用去磷酸化试剂盒进行去磷酸化处理后再连接并连接，构建出重组NDV基因组全长克隆pNDV/rAI4-T4FHN-H7。

步骤二：重组病毒AI4-T4FHN-H7株的拯救

生物材料准备

可稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。CEF细胞由实验室按常规方法自行制备。

1、重组病毒AI4-T4FHN-H7的拯救

转染时所用质粒(pNDV/AI4-gB、pCI-NP、pCI-P和pCI-L)均采用QIAprepSpinMiniPrepKit抽提。将pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个辅助质粒与重组NDV基因组全长cDNA克隆pNDV/rAI4-T4FHN-H7共转染BSR-T7/5细胞，18-24h后加入终浓度为10％SPF胚尿囊液，60h后将转染样品冻融1次后，收获并接种9～11日龄SPF鸡胚，收集鸡胚尿囊液，按OIE标准测定血凝效价，获得表达禽流感病毒H7N9亚型HA蛋白的重组疫苗株AI4-T4FHN-H7。

在鸡胚上传代5次后，所测HA效价为9log₂，与母本毒株AI4-T4FHN相比下降了1个滴度，血凝特性能被针对禽副黏病毒血清2型的多克隆抗体抑制。

2、RT-PCR验证获救病毒rAI4-T4FHN-H7

用引物HA-F和HA-R扩增HA基因，长度约为1700bp(见图2)，回收目的片段进行测序鉴定，扩增片段的测序结果显示禽流感病毒H7N9亚型HA基因成功***。

步骤三：重组病毒的生物学特性鉴定

1、MDT与ICPI的测定

鸡胚平均致死时间(mean death time,MDT)测定：用灭菌生理盐水将重组病毒rAI4-T4FHN-H7分别作10倍(10^-6、10^-7……10^-10)梯度稀释，每个稀释度接种5枚9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，同时设置5枚接种生理盐水的鸡胚作为对照。37℃孵育，弃去24h内死亡的鸡胚，之后每隔12h观察一次直至120h，按OIE标准方法计算病毒的MDT。结果：病毒5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有死亡，该毒株的MDT值大于120h。

雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)测定：取HA滴度大于4log2的新鲜病毒尿囊液经无菌检验后以不含抗生素灭菌的生理盐水重做10倍稀释，经脑内接种10只1日龄的SPF鸡，每只脑内接种0.05mL，同时设置10只注射生理盐水的SPF鸡作为对照。按OIE标准方法对鸡进行打分，计算病毒的ICPI。尿囊液经脑内接种1日龄SPF鸡后均未发病或死亡，ICPI为0，表明获救病毒的毒力完全符合弱毒的标准。

2、细胞感染试验

将重组病毒AI4-T4FHN-H7和母本病毒AI4-T4FHN稀释后接种鸡胚成纤维细胞，感染48h后分别以APMV-2鸡血清多抗或H7鸡血清多抗为一抗，FITC标记的兔抗鸡IgG为二抗进行间接免疫荧光试验(immufluorescence assay,IFA)。

结果：重组病毒感染细胞孔内均能观察到针对H7亚型和APMV-2的特异性荧光信号；母本病毒感染细胞孔用APMV-2血清多抗作为一抗能检测到荧光，其他则不能检测到荧光。重组病毒和母本病毒感染细胞以健康SPF鸡阴性血清为一抗的荧光检测结果均为阴性(见图3)。

3、Westernblot试验

将重组病毒AI4-T4FHN-H7稀释后以0.1MOI的量接种鸡胚成纤维细胞，感染48h后裂解细胞收集胞浆蛋白同时裂解未感染病毒的鸡胚成纤维细胞作为空白对照。处理后的样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转印到0.22um孔径PVDF膜上，5％脱脂乳封闭，以H7鸡多抗血清作为一抗，HRP标记的兔抗鸡IgG为二抗进行抗原抗体结合反应。用ECL发光法显色，用凝胶成像***采集信号。

结果：重组病毒感染的细胞内有HA蛋白表达并且同对照组JX148一样能够正常裂解成HA0和HA1蛋白。(见图4)。

步骤六：疫苗载体株的免疫效力试验

将1日龄商品鸡和SPF鸡随机分组，10只/组，进行隔离饲养，经滴鼻点眼分别接种载体疫苗AI4-T4FHN-H7，100ul 10⁶EID₅₀/只，同时设PBS接种组作为对照。每只试验鸡免疫后每周采集静脉血，免疫后3周以100ul 10⁶EID₅₀/只的剂量经滴鼻点眼进行加强免疫，加免后连续两周采血，检测针对H7亚型HA蛋白的血清转化水平。免疫鸡群未表现出任何临床症状，说明AI4-T4FHN-H7载体疫苗株对鸡不致病，可以安全使用。AI4-T4FHN-H7载体疫苗株在SPF和商品鸡中都能够良好地复制，并且有效地刺激产生相应抗体产生(见图5)。

经试验表明：AI4-T4FHN-H7能够在含有高水平ND母源抗体的商品鸡群中复制并且有效地刺激免疫***，显示了广阔的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 克服雏鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒载体H7活疫苗候选株及其构

建方法

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggtgaaatg acgctcaata aactctca 28

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attaataatg ctgctggatt ggttg 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accaatccag cagcattatt aattaa 26

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accctgtctg agacgaggtg tat 23

<210> 5

<211> 1590

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaatcaag cactcgtgat tttgttggta tctttccagc tcggcgttgc cttagataac 60

tcagtgttgg ctccaatagg agtagctagc gcacaggagt ggcaactggc ggcatataca 120

acgaccctca cagggaccat cgcagtgaga tttatcccgg tcctgcctgg gaacctatca 180

acatgtgcac aggagacgct gcaggaatat aatagaactg tgactaatat cttaggcccg 240

ttgagagaga acttggatgc tctcctatct gacttcgata aacctgcatc gaggttcgtg 300

ggcgccatca ttgggtcggt ggccttgggg gtagcaacag ctgcacaaat cacagccgcc 360

gtggctctca atcaagcaca agagaatgcc cggaatatat ggcgtctcaa ggaatcgata 420

aagaaaacca atgcggctgt gttggaattg aaggatggac ttgcaacgac tgctatagct 480

ttggacaaag tgcaaaagtt tatcaatgat gatattatac cacagattaa ggacattgac 540

tgccaggtag ttgcaaataa attaggcgtc tacctctcct tatacttaac agagcttaca 600

actgtatttg gttctcagat cactaatcct gcattatcaa cgctctctta ccaggcgctg 660

tacagcttat gtggagggga tatgggaaag ctaactgagc tgatcggtgt caatgcaaag 720

gatgtgggat ccctctacga ggctaacctc ataaccggcc aaatcgttgg atatgaccct 780

gaactacaga taatcctcat acaagtatct tacccaagtg tgtctgaagt gacaggagtc 840

cgggctactg agttagtcac tgtcagtgtc actacaccaa aaggagaagg gcaggcaatt 900

gttccgagat atgtggcaca gagtagagtg ctgacagagg agttggatgt ctcgacttgt 960

aggtttagca aaacaactct ttattgtagg tcgattctca cacggcccct accaactttg 1020

atcgccagct gcctgtcagg gaagtacgac gattgtcagt acacaacaga gataggagcg 1080

ctatcttcga gattcatcac agtcaatggt ggagtccttg caaactgcag agcaattgtg 1140

tgtaagtgtg tctcaccccc gcatataata ccacaaaacg acattggctc cgtaacagtt 1200

attgactcaa gtatatgcaa ggaagttgtc ttagagagtg tgcagcttag gttagaagga 1260

aagctgtcat cccaatactt ctccaacgtg acaattgacc tttcccaaat cacaacgtca 1320

gggtcgctgg atataagcag tgaaattggt agcattaaca acacagttaa tcgggtcgac 1380

gagttaatca aggaatccaa cgagtggctg aacgctgtga acccccgcct tgtgaacaat 1440

attgttctaa ctgtcatttc cctaattttc ggtgcactta gtctggtttt agcgtgttac 1500

ctgatgtaca aacagaaggt acaacagaag accttgctat ggcttgggaa taataccctc 1560

gatcagatga gagccaccac aagagcatga 1590

<210> 6

<211> 1764

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggaccgcg cggttaacag agtcgtgctg gagaatgagg aaagagaagc aaagaacaca 60

tggcgcctag tattccggat cgcagtctta cttttaatgg taatgactct agctatctcc 120

gcggctgccc tggcacacag catgggggcc agtacgccgc acgacctgga taacatggct 180

tcgaacacat ggacaacaac tgaggctgac cgtgtgatat ctagcatcac gactccgctc 240

aaagtccctg tcaaccagat taatgacatg tttcggattg tagcgcttga cctacctctg 300

cagatgacat cattacagaa agaaataaca tcccaagtcg ggttcttggc tgaaagtatc 360

aacaatgttt tatccaagaa tggatctgca ggcctggttc ttgttaatga ccctgaatat 420

gcagggggga tcgctgtcag cttgtaccaa ggagatgcat ctgcaggcct aaatttccag 480

cccatttctt taatagaaca tccaagtttt gtccctggtc ctactactgc taagggctgt 540

ataaggatcc cgaccttcca tatgggccct tcacattggt gttactcaca taacatcatt 600

gcatcaggtt gccaggatgc gagccactcc agtatgtata tctctctggg ggtgctgaaa 660

gcatcgcaga ccgggtcgcc tatcttcttg acaacggcca gccatctcgt ggatgacaac 720

atcaaccgga agtcatgcag catcgtagcc tcaaaatacg gttgtgatat cctatgcagt 780

attgtgattg aaacagagaa tgaggattat aggtctgatc cggctactag catgattata 840

ggtaggctgt tcttcaacgg gtcatacaca gagagcaaga ttaacacagg gtccatcttc 900

agtctattct ctgctaacta ccctgcggtg gggtcgggta ttgtagtcgg ggatgaagcc 960

gcattcccaa tatatggtgg ggtcaagcag aacacatggt tgttcaacca gctcaaggat 1020

tttggttact tcacccataa tgatgtgtac aagtgcaatc ggactgatat acagcaaact 1080

atcctggatg catacaggcc acctaaaatc tcaggaaggt tatgggtaca aggcatccta 1140

ttgtgcccag tttcactgag acctgatcct ggctgtcgct taaaggtgtt caataccagc 1200

aatgtgatga tgggggcaga agcgaggttg atccaagtag gctcaaccgt gtatctatac 1260

caacgctcat cctcatggtg ggtggtagga ctgacttaca aattagatgt gtcagaaata 1320

acttcacaga caggtaacac actcaaccat gtagacccca ttgcccatac aaagttccca 1380

agaccatctt tcaggcgaga tgcgtgtgcg aggccaaaca tatgccctgc tgtctgtgtc 1440

tccggagttt atcaggacat ttggccgatc agtacagcca ccaataacag caacattgtg 1500

tgggttggac agtacttaga agcattctat tccaggaaag acccaagaat agggatagca 1560

acccagtatg agtggaaagt caccaaccag ctgttcaatt cgaatactga gggagggtac 1620

tcaaccacaa catgcttccg gaacaccaaa cgggacaagg catattgtgt agtgatatca 1680

gagtacgctg atggggtgtt cggatcatac aggatcgttc ctcagcttat agagattaga 1740

acaaccaccg gtaaatctga gtga 1764

<210> 7

<211> 2972

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttaattaaga aaaaatacgg gtagaatcaa agtgcctcga ttgcaccaaa atggactcat 60

ccaggacaat cgggctgtac tttgattctg ccctcccttc cagcagccta ttagcatttc 120

cgattatctt acaagacaca ggagacggga agaaacaaat caccccacaa tacaggatcc 180

agcgtcttga ttcgtggaca gacagtaagg aagactcggt atttatcacc acctacgggt 240

tcatctttca agttgggaat gaagaagcca ccgtcggtgt gatcaatgac aatcccaggc 300

acgagctact ctcttccgca atgctctgct tagggagtgt cccgaacaac ggagatcttg 360

ttgagctggc gagagcctgc ctcaccatgg tggtaacctg caagaagagt gcaactaaca 420

ctgagagaat agtcttctca gtagtgcagg cacctcgggt gctgcaaaat tgtatggttg 480

tgtcgaatag gtactcatca gtgaatgcag tgaagcatgt gaaggcgccc gaaatgatcc 540

ctgggagcgg agccctagag tatgaagtga tatttgtctc tttgactgtg gtgccgagaa 600

gggatgtcta caggatccca actgcagtat tgaaagtgtc tggctcaagc ctgtacaatc 660

ttgcgctcaa tgtcactatt gatgtggacg tggatccgaa gagcccgcta gtcaaatccc 720

tttctaagtc tgatagcgga tactatgcga atctttttct gcatatcggg cttatgtcca 780

ctgtagataa gagaggaaag aaagtgacat ttgacaagat agaggaaaag ataaggagac 840

tcaatctatc tgttgggctc agtgatgtgc tcggaccctc tgtgcttgtg aaggcgagag 900

gtgcacggac taagctactt gctcctttct tctctagcag tgggacagcc tgctatccta 960

tagcaaatgc ctctccccag gttgccaaga tactctggag ccagaccgcg cacctgcgga 1020

gcgtgaaagt catcattcaa gccggcactc agcgtgctgt cgcagtgacc gctgatcatg 1080

aggtaacctc cactaagata gagaggaggc acgccattgc taaatacaat cctttcagga 1140

aataagttgc atccctaaga ctgcagttca cctgctttcc tgaatcacca tgacaccaga 1200

taatgatcca tctcgactgc ttatagttag ttcacctgtc tagcaaatta gaaaaaacac 1260

gggtagaaga gtctggatcc cgaccggcac attcaggaca cagcatgaat caagcactcg 1320

tgattttgtt ggtatctttc cagctcggcg ttgccttaga taactcagtg ttggctccaa 1380

taggagtagc tagcgcacag gagtggcaac tggcggcata tacaacgacc ctcacaggga 1440

ccatcgcagt gagatttatc ccggtcctgc ctgggaacct atcaacatgt gcacaggaga 1500

cgctgcagga atataataga actgtgacta atatcttagg cccgttgaga gagaacttgg 1560

atgctctcct atctgacttc gataaacctg catcgaggtt cgtgggcgcc atcattgggt 1620

cggtggcctt gggggtagca acagctgcac aaatcacagc cgccgtggct ctcaatcaag 1680

cacaagagaa tgcccggaat atatggcgtc tcaaggaatc gataaagaaa accaatgcgg 1740

ctgtgttgga attgaaggat ggacttgcaa cgactgctat agctttggac aaagtgcaaa 1800

agtttatcaa tgatgatatt ataccacaga ttaaggacat tgactgccag gtagttgcaa 1860

ataaattagg cgtctacctc tccttatact taacagagct tacaactgta tttggttctc 1920

agatcactaa tcctgcatta tcaacgctct cttaccaggc gctgtacagc ttatgtggag 1980

gggatatggg aaagctaact gagctgatcg gtgtcaatgc aaaggatgtg ggatccctct 2040

acgaggctaa cctcataacc ggccaaatcg ttggatatga ccctgaacta cagataatcc 2100

tcatacaagt atcttaccca agtgtgtctg aagtgacagg agtccgggct actgagttag 2160

tcactgtcag tgtcactaca ccaaaaggag aagggcaggc aattgttccg agatatgtgg 2220

cacagagtag agtgctgaca gaggagttgg atgtctcgac ttgtaggttt agcaaaacaa 2280

ctctttattg taggtcgatt ctcacacggc ccctaccaac tttgatcgcc agctgcctgt 2340

cagggaagta cgacgattgt cagtacacaa cagagatagg agcgctatct tcgagattca 2400

tcacagtcaa tggtggagtc cttgcaaact gcagagcaat tgtgtgtaag tgtgtctcac 2460

ccccgcatat aataccacaa aacgacattg gctccgtaac agttattgac tcaagtatat 2520

gcaaggaagt tgtcttagag agtgtgcagc ttaggttaga aggaaagctg tcatcccaat 2580

acttctccaa cgtgacaatt gacctttccc aaatcacaac gtcagggtcg ctggatataa 2640

gcagtgaaat tggtagcatt aacaacacag ttaatcgggt cgacgagtta atcaaggaat 2700

ccaacgagtg gctgaacgct gtgaaccccc gccttgtgaa caatattgtt ctaactgtca 2760

tttccctaat tttcggtgca cttagtctgg ttttagcgtg ttacctgatg tacaaacaga 2820

aggtacaaca gaagaccttg ctatggcttg ggaataatac cctcgatcag atgagagcca 2880

ccacaagagc atgaatgcag ataagaggtg gacagatacc caacagcagc ctgtgtgtca 2940

attccgataa cctgtcaagt agaagactta ag 2972

<210> 8

<211> 3305

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttaattagta gaagacttaa gaaaaaatta ctgggaacaa gcaaccaaag agcaatgcac 60

gggtagaacg gtcagaggag ccacccttca atcgaaaatt aggcttcaca acattcgttc 120

taccacatca ccaacaacaa gagtcaatca tggaccgcgc ggttaacaga gtcgtgctgg 180

agaatgagga aagagaagca aagaacacat ggcgcctagt attccggatc gcagtcttac 240

ttttaatggt aatgactcta gctatctccg cggctgccct ggcacacagc atgggggcca 300

gtacgccgca cgacctggat aacatggctt cgaacacatg gacaacaact gaggctgacc 360

gtgtgatatc tagcatcacg actccgctca aagtccctgt caaccagatt aatgacatgt 420

ttcggattgt agcgcttgac ctacctctgc agatgacatc attacagaaa gaaataacat 480

cccaagtcgg gttcttggct gaaagtatca acaatgtttt atccaagaat ggatctgcag 540

gcctggttct tgttaatgac cctgaatatg caggggggat cgctgtcagc ttgtaccaag 600

gagatgcatc tgcaggccta aatttccagc ccatttcttt aatagaacat ccaagttttg 660

tccctggtcc tactactgct aagggctgta taaggatccc gaccttccat atgggccctt 720

cacattggtg ttactcacat aacatcattg catcaggttg ccaggatgcg agccactcca 780

gtatgtatat ctctctgggg gtgctgaaag catcgcagac cgggtcgcct atcttcttga 840

caacggccag ccatctcgtg gatgacaaca tcaaccggaa gtcatgcagc atcgtagcct 900

caaaatacgg ttgtgatatc ctatgcagta ttgtgattga aacagagaat gaggattata 960

ggtctgatcc ggctactagc atgattatag gtaggctgtt cttcaacggg tcatacacag 1020

agagcaagat taacacaggg tccatcttca gtctattctc tgctaactac cctgcggtgg 1080

ggtcgggtat tgtagtcggg gatgaagccg cattcccaat atatggtggg gtcaagcaga 1140

acacatggtt gttcaaccag ctcaaggatt ttggttactt cacccataat gatgtgtaca 1200

agtgcaatcg gactgatata cagcaaacta tcctggatgc atacaggcca cctaaaatct 1260

caggaaggtt atgggtacaa ggcatcctat tgtgcccagt ttcactgaga cctgatcctg 1320

gctgtcgctt aaaggtgttc aataccagca atgtgatgat gggggcagaa gcgaggttga 1380

tccaagtagg ctcaaccgtg tatctatacc aacgctcatc ctcatggtgg gtggtaggac 1440

tgacttacaa attagatgtg tcagaaataa cttcacagac aggtaacaca ctcaaccatg 1500

tagaccccat tgcccataca aagttcccaa gaccatcttt caggcgagat gcgtgtgcga 1560

ggccaaacat atgccctgct gtctgtgtct ccggagttta tcaggacatt tggccgatca 1620

gtacagccac caataacagc aacattgtgt gggttggaca gtacttagaa gcattctatt 1680

ccaggaaaga cccaagaata gggatagcaa cccagtatga gtggaaagtc accaaccagc 1740

tgttcaattc gaatactgag ggagggtact caaccacaac atgcttccgg aacaccaaac 1800

gggacaaggc atattgtgta gtgatatcag agtacgctga tggggtgttc ggatcataca 1860

ggatcgttcc tcagcttata gagattagaa caaccaccgg taaatctgag tgagaagcta 1920

gacgtggccg attgagccaa tcataggatg gttaggaaga cgacaccgcg ccaatcatct 1980

cccataatgc ttagagtcaa gctgaatatt aacataagcc aggatcccgt gttgtcgggc 2040

aaccacaatc tgacaatgct gatatgatta ttctgagtct cgcccactgt cactttatta 2100

agaaaaaaca caagaagcat tgacatataa gggaaaacaa ccaacaaggg agaacacggg 2160

taggacatgg cgggctccgg tcccgaaagg gcagagcacc agatcatcct accagagtca 2220

catctatcct ctccattggt caagcacaaa ttgctatact actggaaatt gaccgggcta 2280

ccgcttcctg atgaatgcga ctttgatcat ctcattatca gcaggcaatg gaagagaata 2340

ctggagtcgg ccactcctga cacagagaga atgataaaac tcgggcgggc agtgcaccag 2400

actctcaacc acaattccaa gataaccgga gtgctccatc ccaggtgttt aggagaactg 2460

gctagtattg aggtccctga ttcaactaac aaattccgga agattaaaaa gaagatccag 2520

attcacaaca caaggtatgg agacctgttc acaaagctgt gcacgcaagt tgagaagaaa 2580

ttgctaggat catctcggtc taataatgtc ccacgatcag aggaattcag cagcatccgt 2640

acagatccgg cattctggtt tcactcaaaa tggtccagag ccaagttcgc gtggctccat 2700

ataaaacaag tccaaaggca tctgattgta gcagcaagga caaggtctgc agtcaacaag 2760

ttagtaacat taagtcataa gataggccac gtctttgtta ctcctgagct tgtcattgtg 2820

acacatacag atgagaacaa gttcacatgc ctcacccagg aacttgtatt gatgtatgcg 2880

gatatgatgg aaggcaggga catggtcaat ataatatctt ctacagcagc acatctcagg 2940

aacctatccg agaaaattga tgatatcctg cggttagtag atgctctggc aaaggactta 3000

ggtaatcaag tctatgatgt tgtagcatta atggagggat tcgcatacag tgccgttcag 3060

ctgcttgaac catcaggtac atttgcagga gatttcttcg catttaacct acaggagctc 3120

aaaaacacgt taatcgaact tctcccaaat aatatagcgg aagcagtaac tcacgctatt 3180

gccactgtat tctccggctt agaacagaat caagcagctg agatgttgtg cttgctgcgt 3240

ttgtggggtc atccattgct tgagtctcgt agtgcagcaa gagcagtcag gagccagatg 3300

tgcgc 3305

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cattcaggac acagcatgat acccgtgtta attgccagc 39

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcaattgggg agttccttcc g 21

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttaattaaga aaaaatacgg gtagaacgcc accatgaaca ctcaaatcct ggtattcgc 59

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttaattaatt atatacaaat agtgcaccgc atgtttc 37

<210> 13

<211> 1683

<212> DNA

<213> 禽流感病毒H9N2亚型流行株A/chicken/jiangsu/WJ57/2012

<400> 13

atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60

atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaga 120

ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacatccc caggatctgc 180

tcaaaaggga aaaagacagt tgacctcggt caatgtggac tactggggac aatcactgga 240

ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcagccgatt taattattga gaggcgagaa 300

ggaagtgatg tctgttatcc tggaaaattc gtgaatgaag aagctctgag gcaaattctc 360

agagaatcag gcggaattga caaggaagca atgggattca catacagtgg aataagaact 420

aatggagcaa ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg 480

ctcctgtcaa acacagataa tgctgcattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca 540

agaaaaagcc cagctctaat agtatggggg atccatcatt ccgtatcaac tgcagagcaa 600

accaagctat atgggagtgg aaacaaactg gtgacagttg ggagttctaa ttatcaacaa 660

tcttttgtac cgagcccagg ggcgagacca caagttaatg gtctatctgg aagaattgac 720

tttcattggc taatgctaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780

atagctccag accgtgcaag cttcctgaga ggaaaatcta tgggaatcca gagtggagta 840

caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatagtg gaggaacaat aataagtaac 900

ttgccatttc agaacataga tagcagggca gttggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 960

aagagtctgc tgctagcaac agggatgaag aatgttcctg agattcccaa gggaagaggc 1020

ctatttggtg ctatagcggg tttcattgaa aatggatggg aaggcctaat tgatggttgg 1080

tatggtttca gacaccagaa tgcacaggga gagggaactg ctgcagatta caaaagcact 1140

caatcggcaa ttgatcaaat aacaggaaaa ttaaaccggc ttatagaaaa aaccaaccaa 1200

caatttgagt tgatagacaa tgaattcaat gaggtagaga agcaaatcgg taatgtgata 1260

aattggacca gagattctat aacagaattg tggtcataca atgctgaact cttggtagca 1320

atggagaacc agcatacaat tgatctggct gattcagaaa tggacaaact gtacgaacga 1380

gtgaaaagac agctgagaga gaatgctgaa gaagatggca ctggttgctt tgaaatattt 1440

cacaagtgtg atgatgactg tatggccagt attagaaata acacctatga tcacagcaag 1500

tacagggaag aggcaatgca aaatagaata cagattgacc cagtcaaact aagcagcggc 1560

tacaaagatg tgatactttg gtttagcttc ggggcatcat gtttcatact tctagccatt 1620

gtaatgggcc ttgtcttcat atgtgtaaag aatggaaaca tgcggtgcac tatttgtata 1680

taa 1683

Claims

1.克服雏鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒载体H7活疫苗候选株,是禽副黏病毒I型(Avian Paramyxovirus type-1)AI4-T4FHN-H7，其特征在于：其保藏号CGMCCNo.13798。

2.权利要求1所述克服雏鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒载体H7活疫苗候选株的构建方法，其特征在于：以嵌合病毒AI4-T4FHN的基因组全长转录载体pNDV/rAI4-T4FHN为骨架，将禽流感H7N9亚型毒株的HA基因***转录载体pNDV/rAI4-T4FHN的P、M基因之间，经反向遗传技术获得重组病毒AI4-T4FHN-H7；所述嵌合病毒AI4-T4FHN是禽副黏病毒I型(Avian Paramyxovirus type-1)AI4-T4FHN，其保藏号CGMCC No.12987。