RU2768475C1 - Peptide with neurostimulation activity and restore learning and memory formation, pharmaceutical composition on its basis and method for its application - Google Patents

Abstract

FIELD: pharmacology.

SUBSTANCE: invention relates to pharmacology, namely to drugs containing peptides and compositions based on them, as well as methods for the prevention and/or treatment of disorders of the nervous system. It is proposed to use the peptide γ-glutamyl-alanine of the formula H-Glu(Ala)-OH as a means of stimulating the proliferation of cells of the nervous tissue and differentiation of neurons, having neurostimulating and neuroprotective activity, as well as restoring the ability to learn and form memory. Also proposed is a method for the prevention and/or treatment of the nervous system in neurodegenerative pathologies, which require stimulation of reparative processes in brain tissues and regeneration of neurons, which consists in the introduction of γ-glutamyl-alanine.

EFFECT: drugs improvement.

2 cl, 1 tbl, 9 ex

Description

Группа изобретений относится к фармакологии, а именно к лекарственным средствам, содержащим пептиды и композиции на их основе, а также способам профилактики и/или лечения нарушений нервной системы.SUBSTANCE: group of inventions relates to pharmacology, namely to drugs containing peptides and compositions based on them, as well as methods for preventing and/or treating disorders of the nervous system.

В настоящее время для улучшения работы мозга используют препараты из группы ноотропов – веществ, оказывающих специфическое влияние на высшие интегративные функции мозга, улучшающих память, облегчающих процесс обучения, стимулирующих интеллектуальную деятельность и повышающих устойчивость мозга к повреждающим факторам. К ноотропным препаратам относятся пирацетам, его гомологи и аналоги (анирацетам, оксирацетам, прамирсцетам, нефирацетам, ноотропил, луцетам); ноопепт; биотредин; анвифен (фенибут, ноофен) и другие [Справочник лекарственных средств VIDAL (рег. №: № ФС77-79153 от 15.09.20) http://www.vidal.ru/]. До настоящего времени механизм действия пирацетама, его гомологов, аналогов и других ноотропных средств недостаточно изучен. Currently, to improve brain function, drugs from the group of nootropics are used - substances that have a specific effect on the higher integrative functions of the brain, improve memory, facilitate the learning process, stimulate intellectual activity and increase the brain's resistance to damaging factors. Nootropic drugs include piracetam, its homologues and analogues (aniracetam, oxiracetam, pramiracetam, nefiracetam, nootropil, lucetam); noopept; biotredin; anvifen (fenibut, noofen) and others [VIDAL Drug Reference (Reg. No. FS77-79153 dated 09/15/20) http://www.vidal.ru/]. Until now, the mechanism of action of piracetam, its homologues, analogues and other nootropics has not been sufficiently studied.

Пирацетам (анирацетам, оксирацетам, прамирсцетам, нефирацетам, ноотропил, луцетам) является первым синтезированным ноотропным препаратом, он воздействует на ЦНС и улучшает метаболические процессы мозга. Имеет широкий спектр показаний, среди которых можно выделить: нарушение активности и внимания; проблемы обучаемости (расстройства памяти); синдром алкогольной зависимости; тревожные и депрессивные состояния. Тем не менее, для наступления эффекта препарата требуется длительный прием. Существенный недостаток пирацетама – снижение вязкости крови, поэтому препарат противопоказан при нарушениях системы крови и тяжелых кровотечениях. Может наблюдаться синдром отмены. Запрещен к приему при заболеваниях почек. Piracetam (aniracetam, oxiracetam, pramiracetam, nefiracetam, nootropil, lucetam) is the first synthesized nootropic drug, it affects the central nervous system and improves the metabolic processes of the brain. It has a wide range of indications, among which are: impaired activity and attention; learning problems (memory disorders); alcohol dependence syndrome; anxiety and depression states. However, for the onset of the effect of the drug requires long-term use. A significant drawback of piracetam is a decrease in blood viscosity, so the drug is contraindicated in violations of the blood system and severe bleeding. Withdrawal syndrome may occur. Prohibited for admission with kidney disease.

Биотредин – комплексный препарат, в состав которого входят витамин B6 и аминокислота L-треонин, предшественник глицина. Этот препарат относится к тонизирующим и общеукрепляющим средствам, уменьшает психоэмоциональное напряжение, улучшает память, повышает работоспособность. При приеме препарата могут отмечаться головокружения и аллергические реакции. Противопоказан при одновременном приеме совместно с антидепрессантами и нейролептиками и в состоянии алкогольного опьянения.Biotredin is a complex preparation, which includes vitamin B6 and the amino acid L-threonine, a precursor of glycine. This drug belongs to tonic and restorative drugs, reduces psycho-emotional stress, improves memory, increases efficiency. When taking the drug, dizziness and allergic reactions may occur. Contraindicated when taken simultaneously with antidepressants and antipsychotics and in a state of intoxication.

Анвифен (фенибут, ноофен) – в состав входит аминофенилмасляная кислота, препарат показан для устранения напряженности, беспокойства, тревоги; повышения работоспособности; улучшения внимания, памяти. Анвифен с осторожностью применяется при поражениях ЖКТ и почечной недостаточности. При передозировке наблюдаются тошнота и головокружение. Anvifen (fenibut, noofen) - contains aminophenylbutyric acid, the drug is indicated to eliminate tension, anxiety, anxiety; increase of working capacity; improvement of attention, memory. Anvifen is used with caution in lesions of the gastrointestinal tract and renal failure. In case of an overdose, nausea and dizziness are observed.

Польза ноотропных препаратов заключается в улучшении мозгового кровоснабжения, но данные средства не являются полностью безопасными. У лекарств этой группы есть ряд противопоказаний: гиперчувствительность к компонентам; наличие хронических заболеваний; беременность и период лактации; многие ноотропы противопоказаны при эпилепсии.The benefit of nootropic drugs is to improve cerebral blood supply, but these funds are not completely safe. The drugs of this group have a number of contraindications: hypersensitivity to the components; the presence of chronic diseases; pregnancy and lactation; many nootropics are contraindicated in epilepsy.

При нарушении дозировки, режима приема или при выборе неподходящего препарата могут возникать побочные эффекты, которые ухудшают имеющуюся симптоматику и провоцируют новые расстройства: бессонница, лабильность артериального давления, аллергические реакции, головная боль, возбуждение и чрезмерная нервозность, диспепсия, отдышка. В связи с этим поиск новых эффективных и безопасных средств, обладающих нейростимулирующей активностью и восстанавливающих способность к обучению и формированию памяти обладает актуальностью. If the dosage, the regimen is violated, or the wrong drug is chosen, side effects may occur that worsen the existing symptoms and provoke new disorders: insomnia, blood pressure lability, allergic reactions, headache, agitation and excessive nervousness, dyspepsia, shortness of breath. In this regard, the search for new effective and safe drugs with neurostimulating activity and restoring the ability to learn and form memory is relevant.

Известны ноотропные препараты пептидной природы, в частности, из патента РФ № 2119496 известен этиловый эфир N–фенилацетил – L– пролилглицина, являющийся действующим веществом препарата Ноопепт. Действие препарата Ноопепт заключается в повышении устойчивости мозговой ткани к повреждающим факторам. Показания к применению: улучшение способности к обучению; улучшение памяти; улучшение внимания. При приеме ноопепта возникает меньше побочных эффектов, чем при действии пирацетама. Тем не менее ноопепт противопоказан при дефиците лактазы, выраженных нарушениях функции печени и/или почек, а также в возрасте до 18 лет.Known nootropic drugs of peptide nature, in particular, from the patent of the Russian Federation No. 2119496 known ethyl ester of N-phenylacetyl - L-prolylglycine, which is the active ingredient of the drug Noopept. The effect of Noopept is to increase the resistance of brain tissue to damaging factors. Indications for use: improving the ability to learn; memory improvement; improving attention. When taking noopept, there are fewer side effects than with the action of piracetam. However, noopept is contraindicated in patients with lactase deficiency, severe liver and/or kidney dysfunction, and under the age of 18 years.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи расширения арсенала ноотропных средств, получения средства пептидной природы, обладающего нейростимулирующей и нейропротекторной активностью, а также восстанавливающего способность к обучению и формированию памяти.The claimed invention is aimed at solving the problem of expanding the arsenal of nootropic agents, obtaining a peptide agent with neurostimulating and neuroprotective activity, as well as restoring the ability to learn and form memory.

Задача решена путем применения в качестве средства, обладающего нейростимулирующей и нейропротекторной активностью, а также восстанавливающего способность к обучению и формированию памяти, дипептида формулы Н-Glu(Ala)-OH.The problem was solved by using a dipeptide of the formula H-Glu(Ala)-OH as an agent with neurostimulating and neuroprotective activity, as well as restoring the ability to learn and form memory.

Дипептид получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.The dipeptide is obtained by the classical method of peptide synthesis in solution.

Ранее неизвестное свойство дипептида H-Glu(Ala)-OH стимулировать пролиферацию клеток нервной ткани и дифференцировку нейронов, а также восстанавливать способность к обучению и формированию памяти выявлено при его экспериментальном изучении.The previously unknown property of the dipeptide H-Glu(Ala)-OH to stimulate the proliferation of cells of the nervous tissue and differentiation of neurons, as well as to restore the ability to learn and form memory, was revealed during its experimental study.

Согласно изобретению, предлагается лекарственное средство, способное стимулировать пролиферацию клеток нервной ткани и дифференцировку нейронов, обладающее стимулирующим действием на высшую ассоциативную деятельность и восстанавливающее способность к обучению и формированию памяти, которое содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество дипептида в качестве активного начала, представляющего собой соединение γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH) или его химические модификации (например, в виде солей и других производных).According to the invention, a drug is proposed that is capable of stimulating the proliferation of cells of the nervous tissue and the differentiation of neurons, which has a stimulating effect on higher associative activity and restores the ability to learn and form memory, which contains a pharmaceutically acceptable carrier and an effective amount of a dipeptide as an active principle, which is a compound γ-glutamyl-alanine (H-Glu(Ala)-OH) or its chemical modifications (for example, in the form of salts and other derivatives).

Понятие «лекарственное средство», используемое в данной заявке, подразумевает использование любой лекарственной формы, содержащей различные фармацевтические производные дипептида, которые обладают терапевтическим эффектом, для лечения нейродегенеративных заболеваний и когнитивных нарушений различной этиологии, при которых необходима стимуляция регенерации нервной ткани и активация дифференцировки нейронов.The term "drug" used in this application implies the use of any dosage form containing various pharmaceutical derivatives of the dipeptide, which have a therapeutic effect, for the treatment of neurodegenerative diseases and cognitive disorders of various etiologies, which require stimulation of the regeneration of nervous tissue and activation of neuronal differentiation.

Понятие «эффективное количество», используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной препаративной форме.The concept of "effective amount", used in this application, means the use of the amount of active principle, which, in accordance with its quantitative indicators of activity and toxicity, and also based on the knowledge of a specialist, should be effective in a given formulation.

Для получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению, предлагаемый дипептид или его фармацевтически приемлемые производные смешиваются как активный ингредиент с фармацевтическим носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования [см., например, Гаврилов А.С. Фармацевтическая технология. Изготовление лекарственных препаратов / А.С. Гаврилов - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2016. - 760 с.; Краснюк И.И. Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм: учебник / И. И. Краснюк, Г. В. Михайлова, Л. И. Мурадова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2016. - 560 с.; Технология изготовления лекарственных форм: учебник / В. А. Гроссман - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018. - 336 с.0; Фармацевтическая технология. Изготовление лекарственных препаратов [Электронный ресурс]: учеб. пособие / Лойд В. Аллен, А. С. Гаврилов - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 512 с.; Контроль качества лекарственных средств [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Т. В. Плетенёвой - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 560 с.; Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм [Электронный ресурс]: учебник / И. И. Краснюк, Г. В. Михайлова, Л. И. Мурадова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 560 с.].To obtain pharmaceutical compositions of the present invention, the proposed dipeptide or its pharmaceutically acceptable derivatives are mixed as an active ingredient with a pharmaceutical carrier according to the compounding methods adopted in pharmaceuticals [see, for example, Gavrilov A.S. Pharmaceutical technology. Manufacturing of medicines / A.S. Gavrilov - M.: GEOTAR-Media, 2016. - 760 p.; Krasnyuk I.I. Pharmaceutical technology. Technology of dosage forms: textbook / I. I. Krasnyuk, G. V. Mikhailova, L. I. Muradova. - M.: GEOTAR-Media, 2016. - 560 p.; Manufacturing technology of dosage forms: textbook / V. A. Grossman - M.: GEOTAR-Media, 2018. - 336 p.0; Pharmaceutical technology. Manufacturing of medicines [Electronic resource]: textbook. allowance / Loyd W. Allen, A. S. Gavrilov - M.: GEOTAR-Media, 2014. - 512 p.; Quality control of medicines [Electronic resource]: textbook / ed. T. V. Pleteneva - M.: GEOTAR-Media, 2014. - 560 p.; Pharmaceutical technology. Technology of dosage forms [Electronic resource]: textbook / I. I. Krasnyuk, G. V. Mikhailova, L. I. Muradova. - M.: GEOTAR-Media, 2013. - 560 p.].

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм, например, парентерального, интраназального, перорального или местного (например, в виде аппликаций, мази).The carrier may take various forms, which depend on the dosage form of the drug desired for administration to the body, for example, parenteral, intranasal, oral or topical (eg, in the form of applications, ointments).

При изготовлении композиций в предпочтительной дозированной форме для перорального или местного применения могут использоваться любые известные фармацевтические компоненты.In preparing the compositions in the preferred oral or topical dosage form, any known pharmaceutical ingredients may be used.

Для парентерального (интраназального) введения носитель обычно включает стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности или для сохранения стерильности.For parenteral (nasal) administration, the carrier will typically comprise sterile water, although other ingredients to aid stability or to maintain sterility may be included.

Согласно изобретению, дипептид активен при введении его в дозах 0,1-100 мкг/кг массы тела, хотя могут быть использованы и более низкие (высокие) дозы в зависимости от степени тяжести и характера течения заболевания.According to the invention, the dipeptide is active when administered at doses of 0.1-100 μg/kg of body weight, although lower (higher) doses can be used depending on the severity and nature of the course of the disease.

Заявляемое лекарственное средство предлагается для парентерального, интраназального, перорального и местного применения.The claimed drug is proposed for parenteral, intranasal, oral and topical use.

Изобретение включает способ стимуляции процессов пролиферации клеток нервной ткани и активации дифференцировки нейронов у человека или животного, нуждающихся в такой стимуляции, а также охватывает фармацевтические композиции для осуществления этого способа. Согласно изобретению способ стимуляции процессов регенерации нервной ткани путем введения лекарственного средства, содержащего в качестве активного начала дипептид формулы γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH) или его химические модификации в виде солей и других производных, проявляется в активации пролиферации и дифференцировки клеток нервной ткани, нейропротекторном действии, восстановлении условно-рефлекторной деятельности нервной системы, способности к обучению и формированию памяти. Способ включает профилактическое или лечебное введение субъекту, нуждающемуся в этом, заявляемого лекарственного средства в дозах 0,1–10 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день при внутримышечном введении, 1–10 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день при интраназальном введении и 10–100 мкг/кг массы тела по крайней мере два раза в день при пероральном введении в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта – не менее 30 дней, в зависимости от характера течения и тяжести заболевания.The invention includes a method for stimulating the processes of proliferation of cells of the nervous tissue and activating the differentiation of neurons in a human or animal in need of such stimulation, and also covers pharmaceutical compositions for implementing this method. According to the invention, a method for stimulating nervous tissue regeneration processes by administering a drug containing a dipeptide of the formula γ-glutamyl-alanine (H-Glu(Ala)-OH) or its chemical modifications in the form of salts and other derivatives as an active principle manifests itself in the activation of proliferation and differentiation of cells of the nervous tissue, neuroprotective action, restoration of the conditioned reflex activity of the nervous system, the ability to learn and form memory. The method includes prophylactic or therapeutic administration to a subject in need of it of the claimed medicinal product in doses of 0.1–10 μg/kg of body weight at least once a day with intramuscular injection, 1–10 μg/kg of body weight at least once once a day when administered intranasally and 10-100 mcg / kg of body weight at least twice a day when administered orally for a period necessary to achieve a therapeutic effect - at least 30 days, depending on the nature of the course and severity of the disease.

Изобретение предназначено для профилактики и/или лечения когнитивных нарушений, нейродегенеративных заболеваний, послеоперационных осложнений в виде нарушения интеллектуальной функции головного мозга, трофических нарушений в головном мозге, обусловленных ишемическими процессами, различных других патологий нервной системы, при которых необходима стимуляция регенерации нервной ткани посредством активации пролиферативного потенциала клеток нервной ткани и стимуляции процесса их дифференцировки.The invention is intended for the prevention and/or treatment of cognitive impairments, neurodegenerative diseases, postoperative complications in the form of impaired intellectual function of the brain, trophic disorders in the brain caused by ischemic processes, various other pathologies of the nervous system, which require stimulation of the regeneration of the nervous tissue by activating the proliferative potential of cells of the nervous tissue and stimulation of the process of their differentiation.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза дипептида формулы γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH) (пример 1), примером испытания токсичности (пример 2), примерами изучения биологической активности дипептида в условиях in vitro и in vivo (примеры 3, 4, 5, 6, 7, 8), примером изучения эффективности применения фармацевтической композиции на основе дипептида формулы γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH) у пожилых мужчин с нарушением памяти (пример 9).The invention is illustrated by an example of the synthesis of a dipeptide of the formula γ-glutamyl-alanine (H-Glu(Ala)-OH) (example 1), an example of a toxicity test (example 2), examples of studying the biological activity of the dipeptide in vitro and in vivo conditions (examples 3, 4, 5, 6, 7, 8), an example of studying the effectiveness of a pharmaceutical composition based on a dipeptide of the formula γ-glutamyl-alanine (H-Glu(Ala)-OH) in elderly men with memory impairment (example 9).

Пример 1. Синтез дипептида γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH). Example 1 . Synthesis of the dipeptide γ-glutamyl-alanine (H-Glu(Ala)-OH).

1.1. Название: γ-глутамил-аланин 1.1. Name: γ-glutamyl-alanine

1.2. Структурная формула: H-Glu(Ala)-OH1.2. Structural formula: H-Glu(Ala)-OH

1.3. Брутто-формула: C₈H₁₄N₂O₅ 1.3. Molecular formula: C ₈ H ₁₄ N ₂ O ₅

1.4. Молекулярный вес без противоиона: 218,211.4. Molecular weight without counterion: 218.21

1.5. Противоион – ацетат1.5. The counterion is acetate

1.6. Внешний вид: белый порошок без запаха.1.6. Appearance: Odorless white powder.

1.7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме:1.7. Method of synthesis: the peptide was obtained by the classical method of synthesis in solution according to the scheme:

1.8. Характеристика продукта1.8. Product feature

– Растворимость: растворим в воде, изотоническом растворе хлорида натрия 0,9 % для инъекций; нерастворим в спирте 95 %, хлороформе, эфире и других органических растворителях.– Solubility: soluble in water, isotonic sodium chloride solution 0.9% for injection; insoluble in alcohol 95%, chloroform, ether and other organic solvents.

– Прозрачность и цветность раствора: раствор 0,05 г препарата в 10 мл воды прозрачен и бесцветен. - Transparency and color of the solution: a solution of 0.05 g of the drug in 10 ml of water is transparent and colorless.

– рН 0,001 % раствора: 4,0–5,0 (потенциометрически).– pH 0.001% solution: 4.0–5.0 (potentiometrically).

– Содержание влаги: не более 10 %.– Moisture content: no more than 10%.

– Удельное оптическое вращение: [α]_D ²²: от -31 ° до -33 ° (c=1, H₂O).– Specific optical rotation: [α] _D ²² : -31° to -33° (c=1, H ₂ O).

– Содержание основного вещества по ВЭЖХ: не менее 97 %.– The content of the main substance according to HPLC: not less than 97%.

– Тонкослойная хроматография: ТСХ-индивидуален, R_{f =} 0,80 (ацетонитрил-вода 1:3).– Thin layer chromatography: TLC-individual, R _{f =} 0.80 (acetonitrile-water 1:3).

1.9. Схема синтеза пептида1.9. Scheme of peptide synthesis

1) Z-Glu(OSu)-OH (I), γ-N-оксисукцинимидный эфир N-бензилоксикарбонил(α-бензил)-глутаминовой кислоты1) Z-Glu(OSu)-OH (I), γ-N-oxysuccinimide ester of N-benzyloxycarbonyl(α-benzyl)-glutamic acid

6,2 ммоль мелкоизмельченного порошка N-бензилоксикарбонил(α-бензил)-глутаминовой кислоты растворяют в 50 мл диметилформамида и добавляют 0,71 г (6,2 ммоль) мелкоизмельченного порошка N-оксисукцинимида. 1,27 г (6,2 ммоль) порошка N,N'-дициклогексилкарбодиимида растворяют в 20 мл диметилформамида. Оба раствора охлаждают до температуры –15 °С. Растворы объединяют и перемешивают при охлаждении льдом в течение 24 часов. Полученный раствор активированного эфира используют на следующей стадии.6.2 mmol of finely divided powder of N-benzyloxycarbonyl(α-benzyl)-glutamic acid is dissolved in 50 ml of dimethylformamide and 0.71 g (6.2 mmol) of finely divided powder of N-oxysuccinimide is added. 1.27 g (6.2 mmol) of N,N'-dicyclohexylcarbodiimide powder are dissolved in 20 ml of dimethylformamide. Both solutions are cooled down to -15°C. The solutions are combined and stirred under ice-cooling for 24 hours. The resulting activated ester solution is used in the next step.

2) Z-Glu(Ala-OBzl)-OBzl (II), α-бензиловый эфир N-бензилоксикарбонил-(γ-аланилбензилат)-глутаминовой кислоты.2) Z-Glu(Ala-OBzl)-OBzl (II), N-benzyloxycarbonyl-(γ-alanylbenzilate)-glutamic acid α-benzyl ester.

К раствору активированного эфира Z-Glu(OSu)-OBzl (I), полученного на предыдущей стадии, добавляют 1,34 г (6,2 ммоль) мелкоизмельченного порошка тозилата бензилового эфира аланина и 0,86 мл триэтиламина. Перемешивают реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем в реакционную смесь при перемешивании постепенно вливают 150 мл 2н раствора серной кислоты, продукт выпадает в виде масла, который затем растворяют в 50 мл этилацетата.To a solution of the activated ester Z-Glu(OSu)-OBzl (I) obtained in the previous step, 1.34 g (6.2 mmol) of finely divided powder of alanine benzyl ester tosylate and 0.86 ml of triethylamine are added. Stir the reaction mixture at room temperature for 2 days. Then, 150 ml of a 2N sulfuric acid solution are gradually poured into the reaction mixture with stirring, the product precipitates in the form of an oil, which is then dissolved in 50 ml of ethyl acetate.

Затем содержимое реакционной колбы расслаивают в делительной воронке, нижнюю водную фазу сливают в стакан вместимостью 250 мл, а верхнюю органическую фазу – в стакан вместимостью 500 мл. Процедуру повторяют трижды с новыми порциями этилацетата (по 30 мл), затем все этилацетатные порции объединяют в исходной делительной воронке, в которую добавляют 20 мл 2 н раствора серной кислоты и осуществляют экстракцию, повторяя процедуру дважды. Затем этилацетатный раствор промывают последовательно водой (30 мл), дважды раствором бикарбоната натрия (30 мл), дважды раствором серной кислоты (30 мл) и водой (30 мл). Затем в этилацетатный раствор добавляют около 20 мг безводного сульфата натрия и оставляют на 10–12 часов.Then the contents of the reaction flask are stratified in a separating funnel, the lower aqueous phase is poured into a beaker with a capacity of 250 ml, and the upper organic phase is poured into a beaker with a capacity of 500 ml. The procedure is repeated three times with new portions of ethyl acetate (30 ml each), then all ethyl acetate portions are combined in the original separating funnel, into which 20 ml of 2 N sulfuric acid solution is added and extraction is carried out, repeating the procedure twice. The ethyl acetate solution is then washed successively with water (30 ml), twice with sodium bicarbonate solution (30 ml), twice with sulfuric acid solution (30 ml) and water (30 ml). Then about 20 mg of anhydrous sodium sulfate is added to the ethyl acetate solution and left for 10–12 hours.

Отфильтрованный этилацетатный раствор упаривают в вакууме при температуре не выше 40 °С на вакуумном роторном испарителе (Buchi Rotavapor R-114 или аналогичном) до прекращения отгонки растворителя и образования на дне колбы густого сиропа, который растворяют в 20 мл этилацетата, добавляя к раствору при постоянном перемешивании порциями гексан до появления устойчивой мути (около 20 мл). Колбу с полученной мутной системой оставляют в холодильнике при температуре 4 °С в течение не менее 2 суток для завершения процесса кристаллизации.The filtered ethyl acetate solution is evaporated in vacuum at a temperature not exceeding 40 ° C on a vacuum rotary evaporator (Buchi Rotavapor R-114 or similar) until the distillation of the solvent stops and a thick syrup forms at the bottom of the flask, which is dissolved in 20 ml of ethyl acetate, adding to the solution at constant stirring in portions of hexane until a stable turbidity appears (about 20 ml). The flask with the resulting cloudy system is left in the refrigerator at 4 °C for at least 2 days to complete the crystallization process.

Выпавший кристаллический продукт отфильтровывают под вакуумом через пористый фильтр Шота, 2 раза промывают гексаном (5 мл), далее продукт переносят в чашку Петри без крышки. Окончательно продукт высушивают над пятиокисью фосфора в вакууме при температуре не выше 40 °С до постоянного веса.The precipitated crystalline product is filtered under vacuum through a porous Schott filter, washed 2 times with hexane (5 ml), then the product is transferred to a Petri dish without a lid. Finally, the product is dried over phosphorus pentoxide in vacuum at a temperature not exceeding 40 °C to constant weight.

3) H-Glu(Ala)-OH (III), γ-глутамил-аланин3) H-Glu(Ala)-OH (III), γ-glutamyl-alanine

α-Бензиловый эфир N-бензилоксикарбонил-(γ-аланилбензилат)-глутаминовой кислоты, полученный на предыдущей стадии, растворяют в смеси метанола (60 мл), дистиллированной воды (20 мл) и уксусной кислоты (20 мл) в присутствии 3 мл катализатора палладия на угле (Pd/C). The α-benzyl ester of N-benzyloxycarbonyl-(γ-alanylbenzilate)-glutamic acid obtained in the previous step is dissolved in a mixture of methanol (60 ml), distilled water (20 ml) and acetic acid (20 ml) in the presence of 3 ml of a palladium catalyst on coal (Pd/C).

Контроль за полнотой деблокирования проводят в режиме ТСХ на пластинках Silufol в системе бензол-ацетон (2:1), деблокированный продукт имеет нулевую подвижность, исходный продукт имеет R_f=0,75. Реакция деблокирования считается законченной, если имеются только следовые количества исходного продукта (визуально).Control over the completeness of deblocking is carried out in the TLC mode on Silufol plates in the benzene-acetone system (2:1), the deblocked product has zero mobility, the initial product has R _f =0.75. The release reaction is considered complete if there are only trace amounts of the original product (visually).

Объединенный фильтрат упаривают в вакууме при температуре не выше 40 °С. The combined filtrate is evaporated in vacuo at a temperature not exceeding 40 °C.

Для очистки 315 мг препарата растворяют в 4 мл 0,01 % трифторуксусной кислоты и подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50х250мм Diasorb-130-C16T, 7mkm. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module,168 Diode Array Detector Module. Условия хроматографирования - А: 0,1 % трифторуксусная кислота; В: 50% раствор ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте; градиент В 0→ 5% за 80 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при длине волны 215 нм, сканирование при длинах волн 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин. For purification, 315 mg of the drug is dissolved in 4 ml of 0.01% trifluoroacetic acid and subjected to high performance liquid chromatography on a 50x250mm reversed phase column Diasorb-130-C16T, 7mkm. Beckman System Gold Chromatograph, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Chromatography conditions - A: 0.1% trifluoroacetic acid; B: 50% acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid; gradient B 0 → 5% in 80 min. Sample volume 5 ml, detection at 215 nm, scanning at 190-600 nm, flow rate 10 ml/min.

Отбирают фракции основного пика, свободного от примесей (в примерном интервале 54,0 мин. - 66,0 мин.), объединяют их и упаривают в вакууме до образования сиропа, повторяя упаривание ещё 5 раз каждый раз с новой порцией (10 мл) 10% уксусной кислоты. Остаток в колбе сушат в вакууме при температуре не выше 40 °С над твердым КОН в течение не менее 2 суток. После сушки продукт не должен иметь запаха.Select fractions of the main peak, free from impurities (in the approximate range of 54.0 minutes - 66.0 minutes), combine them and evaporate in vacuum until a syrup is formed, repeating the evaporation 5 more times each time with a new portion (10 ml) 10 % acetic acid. The residue in the flask is dried in vacuum at a temperature not exceeding 40 °C over solid KOH for at least 2 days. After drying, the product should be odorless.

После упаривания и сушки в вакууме остаток растворяют в 20 мл деионизованной воды и лиофилизируют. After evaporation and drying in vacuo, the residue is taken up in 20 ml of deionized water and lyophilized.

4) Анализ готового препарата4) Analysis of the finished product

– Содержание основного вещества определяют методом ВЭЖХ на колонке Phenomenex C 18 LUNA 4,6×150 мм. A: 0,1 % TFA, B: MeCN; градиент B 0-100 % за 10 мин. Скорость потока 1 мл/ мин. Детекция при длине волны 220 нм, сканирование при длинах волн 190-600 нм, проба 20 мкл. Содержание основного вещества не менее 97%.– The content of the main substance is determined by HPLC on a Phenomenex C 18 LUNA 4.6×150 mm column. A: 0.1% TFA, B: MeCN; Gradient B 0-100% in 10 min. Flow rate 1 ml/min. Detection at a wavelength of 220 nm, scanning at wavelengths of 190-600 nm, sample 20 µl. The content of the main substance is not less than 97%.

– ТСХ: на хроматограммах образцов, обработанных раствором нингидрина, допускается наличие только двух пятен (препарата и ГСО) фиолетового цвета с совпадающими R_f; на хроматограммах образцов, обработанных раствором бензидина, допускается наличие только двух пятен (препарата и ГСО) темно-синего цвета с совпадающими R_f (ацетонитрил-вода 2:1, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).– TLC: on the chromatograms of samples treated with a solution of ninhydrin, only two spots (preparation and GSO) of purple color with the same R _f are allowed; on the chromatograms of samples treated with a solution of benzidine, only two spots (preparation and GSO) of dark blue color with matching R _f are allowed (acetonitrile-water 2: 1, plates PTSH-P-V-UV Sorbfil, silica gel STX-1VE 8- 12 µm, chlorine/benzidine development).

– Содержание влаги: не более 10% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при температуре 100°C).– Moisture content: no more than 10% (gravimetrically by loss of mass on drying 20 mg at 100°C).

– рН 0,01% раствора: от 4,0 до 5,0 (потенциометрически).– pH of 0.01% solution: from 4.0 to 5.0 (potentiometrically).

– Удельное оптическое вращение: от –31 до –33° в пересчете на сухое вещество (0,1% водный раствор, температура 23°С, D-линия спектра натрия).– Specific optical rotation: from –31 to –33° in terms of dry matter (0.1% aqueous solution, temperature 23°C, D-line of the sodium spectrum).

Пример 2. Изучение токсичности дипептида γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH). Example 2. Study of the toxicity of the dipeptide γ-glutamyl-alanine (H-Glu(Ala)-OH).

Изучение общетоксического действия дипептида H-Glu(Ala)-OH проводилось в соответствии с требованиями «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств», М.: Гриф и К., 2012, 944 с. Цель изучения состояла в определении переносимых токсических доз препарата, оценке степени и характера патологических изменений в различных органах и системах организма и выявлении зависимости токсических эффектов от дозы и длительности применения препарата.The study of the general toxic effect of the dipeptide H-Glu(Ala)-OH was carried out in accordance with the requirements of the "Guidelines for conducting preclinical studies of drugs", M.: Grif and K., 2012, 944 p. The purpose of the study was to determine the tolerated toxic doses of the drug, assess the degree and nature of pathological changes in various organs and systems of the body, and identify the dependence of toxic effects on the dose and duration of the drug.

Исследование острой токсичности дипептида H-Glu(Ala)-OH проведено на 100 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-23 г, содержавшихся на стандартном режиме и получавших стандартное питание в условиях вивария. Животные методом простой рандомизации были разделены на 10 равных групп по 10 мышей в каждой. Препарат вводили животным однократно внутримышечно или внутрижелудочно (через зонд) в объеме 0,25 мл в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг (в несколько тысяч раз превышающих терапевтическую дозу (ТД), рекомендуемую для клинического изучения, которая составляет 0,0014 мг/кг). Животным контрольной группы в том же объеме вводился физиологический раствор.A study of the acute toxicity of the dipeptide H-Glu(Ala)-OH was carried out on 100 white outbred male mice weighing 20-23 g, kept on a standard regimen and receiving standard nutrition under vivarium conditions. Animals were divided by simple randomization into 10 equal groups of 10 mice each. The drug was administered to animals once intramuscularly or intragastrically (through a tube) in a volume of 0.25 ml at doses of 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg (several thousand times higher than the therapeutic dose (TD) recommended for clinical study, which is 0.0014 mg/kg). Animals of the control group received saline in the same volume.

В течение 72 часов и далее через 14 суток ни в одной группе животных гибели мышей не обнаружено. Не отмечено каких-либо изменений общего состояния, поведения, двигательной активности, волосяного и кожного покрова, физиологических отправлений животных.Within 72 hours and then after 14 days, no death of mice was detected in any group of animals. There were no changes in the general condition, behavior, physical activity, hair and skin, physiological functions of animals.

Таким образом, дипептид H-Glu(Ala)-OH в дозах, превышающих терапевтическую, рекомендуемую для клинических испытаний, в несколько тысяч раз, не вызывает острых токсических реакций при внутримышечном или внутрижелудочном введении, что указывает на большую терапевтическую широту препарата.Thus, the dipeptide H-Glu(Ala)-OH at doses exceeding the therapeutic recommended for clinical trials by several thousand times does not cause acute toxic reactions when administered intramuscularly or intragastrically, which indicates a greater therapeutic breadth of the drug.

Хроническую токсичность дипептида H-Glu(Ala)-OH, полученного заявляемым способом, изучали при длительном введении его крысам с массой тела 150-250 мг. Животным ежедневно вводили внутримышечно или внутрижелудочно (через зонд) препарат в дозах 0,1 мг/кг (70 ТД), 1,0 мг/кг (700 ТД), 3 мг/кг (2000 ТД) в 0,5 мл физиологического раствора в течение 30 дней. Наблюдение за животными вели в течение 60 дней после начала эксперимента. Отмечали поведение животных, потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек. Взвешивание животных проводилось еженедельно. В начале и при завершении эксперимента проводили гематологические и биохимические исследования. Оценивали функции сердечно-сосудистой системы, печени, поджелудочной железы, почек и надпочечников. После окончания введения препарата животных подвергали патоморфологическому исследованию с целью оценки состояния различных отделов головного и спинного мозга, сердца, аорты, легких, печени, почек, органов эндокринной и иммунной систем.The chronic toxicity of the dipeptide H-Glu(Ala)-OH, obtained by the claimed method, was studied during its long-term administration to rats weighing 150-250 mg. Animals were injected daily intramuscularly or intragastrically (through a tube) with the drug at doses of 0.1 mg/kg (70 TD), 1.0 mg/kg (700 TD), 3 mg/kg (2000 TD) in 0.5 ml of saline within 30 days. Animals were observed for 60 days after the start of the experiment. Animal behavior, food and water consumption, the condition of the hairline and mucous membranes were noted. Animals were weighed weekly. At the beginning and at the end of the experiment, hematological and biochemical studies were performed. The functions of the cardiovascular system, liver, pancreas, kidneys and adrenal glands were evaluated. After the end of the administration of the drug, the animals were subjected to pathomorphological examination in order to assess the state of various parts of the brain and spinal cord, heart, aorta, lungs, liver, kidneys, organs of the endocrine and immune systems.

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.When assessing the general condition of animals, morphological and biochemical parameters of peripheral blood, the morphological state of internal organs, the state of the cardiovascular and respiratory systems, liver and kidney function, no pathological changes were found in the body.

Изучение подострой и хронической токсичности дипептида H-Glu(Ala)-OH свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата внутримышечно или внутрижелудочно в дозах, превышающих терапевтическую в 70-2000 раз.The study of subacute and chronic toxicity of the dipeptide H-Glu(Ala)-OH indicates the absence of side effects with prolonged use of the drug intramuscularly or intragastrically at doses exceeding the therapeutic dose by 70-2000 times.

Пример 3. Влияние пептида H-Glu(Ala)-OH на развитие эксплантатов подкорковых структур головного мозга крыс. Example 3 . Effect of the H-Glu(Ala)-OH peptide on the development of explants of subcortical structures of the rat brain.

Органотипическое культивирование ткани подкорковых структур самцов крыс линии Wistаr в возрасте 3 месяцев проводилось по описанной ранее методике [Хавинсон и др., 2012]. В экспериментах использовано 300 фрагментов подкорковых структур, содержащих таламус. Отпрепарированные фрагменты ткани разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм³, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Organotypic cultivation of tissue of subcortical structures of male Wistar rats at the age of 3 months was carried out according to the previously described method [Khavinson et al., 2012]. The experiments used 300 fragments of subcortical structures containing the thalamus. The prepared tissue fragments were divided into smaller parts about 1 mm ³ in size, which were placed in Petri dishes with a collagen coating of the bottom.

В исследовании использовалась среда с pH 7,2 из расчёта на 100 мл: раствор Хенкса 38 мл, среда Игла 36 мл, фетальная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40% - 1,0 мл, гентамицин 100 Ед/мл. Эксплантаты помещались в чашку Петри с коллагеновым покрытием и культивировались в 3 мл питательной среды указанного состава. Пептид H-Glu(Ala)-OH добавляли в культуры в концентрации 0,05 нг/мл. Эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объёмах питательной среды. Продолжительность культивирования составляла трое суток, такой временной интервал является необходимым и достаточным для формирования полноценной зоны роста [Чалисова Н.И. и др., 2005].The study used a medium with a pH of 7.2 per 100 ml: Hank's solution 38 ml, Eagle's medium 36 ml, fetal bovine serum 25 ml, glucose 40% - 1.0 ml, gentamicin 100 U / ml. The explants were placed in a collagen-coated Petri dish and cultured in 3 ml of the nutrient medium of the specified composition. Peptide H-Glu(Ala)-OH was added to cultures at a concentration of 0.05 ng/ml. The explants of the experimental and control groups developed in the same volumes of the nutrient medium. The duration of cultivation was three days, such a time interval is necessary and sufficient for the formation of a full-fledged growth zone [Chalisova N.I. et al., 2005].

В процессе культивирования вокруг эксплантатов образовывалась зона роста, состоящая из мигрирующих нейроцитов и пролиферирующих глиальных клеток. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в процентах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади центральной зоны эксплантата. Для расчета ИП эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась в программе Statistica 6.0. Были использованы статистические критерии Шапиро-Уилка, Крускала–Уоллиса и Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05.During cultivation, a growth zone formed around the explants, consisting of migrating neurocytes and proliferating glial cells. The area index (AI) was determined, which was calculated as a percentage as the ratio of the area of the entire explant (together with the zone of vacant cells) to the area of the central zone of the explant. PhotoM 1.2 software was used to calculate the SI of explants. Statistical processing of experimental data was carried out using the Statistica 6.0 program. Shapiro-Wilk, Kruskal-Wallis and Mann-Whitney statistical tests were used. The critical level of statistical significance of the null hypothesis (no differences) was taken equal to 0.05.

Установлено, что в органотипических культурах подкорковых структур головного мозга крыс введение в питательную среду для культивирования пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению зоны роста эксплантатов на 60 % по сравнению с контролем. It was found that in organotypic cultures of the subcortical structures of the rat brain, the introduction of the H-Glu(Ala)-OH peptide into the nutrient medium for cultivation led to a statistically significant increase in the growth zone of the explants by 60% compared with the control.

Полученные результаты свидетельствуют о стимулирующем действии пептида H-Glu(Ala)-OH в отношении процесса пролиферации клеток подкорковых структур головного мозга.The results obtained indicate the stimulating effect of the H-Glu(Ala)-OH peptide on the process of cell proliferation of subcortical structures of the brain.

Пример 4. Влияние пептида H-Glu(Ala)-OH на экспрессию транскрипционных факторов в органотипической культуре ткани подкорковых структур головного мозга крыс. Example 4 . The effect of the H-Glu(Ala)-OH peptide on the expression of transcription factors in the organotypic tissue culture of the subcortical structures of the rat brain.

Органотипическое культивирование ткани подкорковых структур головного мозга молодых (3 мес.) и старых (24 мес.) крыс линии Wistаr проводилось по описанной методике [Хавинсон и др., 2012].Organotypic cultivation of tissue of subcortical structures of the brain of young (3 months) and old (24 months) Wista rats was carried out according to the described method (Khavinson et al., 2012).

В исследовании использовалась среда с pH 7,2 из расчёта на 100 мл: раствор Хенкса 38 мл, среда Игла 36 мл, фетальная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40% - 1,0 мл, гентамицин 100 Ед/мл. Эксплантаты помещались в чашку Петри с коллагеновым покрытием дна и культивировались в 3 мл питательной среды указанного состава. Пептид H-Glu(Ala)-OH добавляли в культуры в концентрации 0,05 нг/мл. Эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объёмах питательной среды. Продолжительность культивирования составляла трое суток, такой временной интервал является необходимым и достаточным для формирования полноценной зоны роста [Чалисова Н.И. и др., 2005].The study used a medium with a pH of 7.2 per 100 ml: Hank's solution 38 ml, Eagle's medium 36 ml, fetal bovine serum 25 ml, glucose 40% - 1.0 ml, gentamicin 100 U / ml. The explants were placed in a Petri dish with a collagen coating of the bottom and cultivated in 3 ml of the nutrient medium of the specified composition. Peptide H-Glu(Ala)-OH was added to cultures at a concentration of 0.05 ng/ml. The explants of the experimental and control groups developed in the same volumes of the nutrient medium. The duration of cultivation was three days, such a time interval is necessary and sufficient for the formation of a full-fledged growth zone [Chalisova N.I. et al., 2005].

Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела: Pax6 (1:50, Dako), CXCL12 (1:50, Dako). Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование. Относительную площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, и выражали в процентах. Указанный параметр отражает интенсивность синтеза или накопления исследуемых сигнальных молекул. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась в программе Statistica 6.0. Были использованы статистические критерии Шапиро-Уилка, Крускала–Уоллиса и Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05.Primary monoclonal antibodies were used for immunocytochemical studies: Pax6 (1:50, Dako), CXCL12 (1:50, Dako). To evaluate the results of immunocytochemical staining, a morphometric study was performed. The relative area of expression was calculated as the ratio of the area occupied by immunopositive cells to the total area of cells in the field of view, and expressed as a percentage. This parameter reflects the intensity of synthesis or accumulation of the studied signal molecules. Statistical processing of experimental data was carried out using the Statistica 6.0 program. Shapiro-Wilk, Kruskal-Wallis and Mann-Whitney statistical tests were used. The critical level of statistical significance of the null hypothesis (no differences) was taken equal to 0.05.

Установлено, что в органотипических культурах тканей подкорковых структур головного мозга молодой и старой крыс введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению площади экспрессии CXCL12 в 1,3 и 4,1 раза по сравнению с соответствующим контролем. Кроме того, в органотипических культурах тканей подкорковых структур головного мозга старой крысы введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению площади экспрессии Pax6 в 1,6 раза по сравнению с контролем.It was found that in organotypic tissue cultures of the subcortical structures of the brain of young and old rats, the introduction of the H-Glu(Ala)-OH peptide led to a statistically significant increase in the area of expression of CXCL12 by 1.3 and 4.1 times compared with the corresponding control. In addition, in organotypic tissue cultures of subcortical structures of the brain of an old rat, the introduction of the H-Glu(Ala)-OH peptide led to a statistically significant increase in the Pax6 expression area by 1.6 times compared with the control.

Полученные результаты свидетельствуют о стимулирующем действии пептида H-Glu(Ala)-OH в отношении процессов дифференцировки и пролиферации нейрональных клеток эпифиза.The results obtained indicate the stimulating effect of the H-Glu(Ala)-OH peptide on the processes of differentiation and proliferation of pineal neuronal cells.

Пример 5. Влияние пептида H-Glu(Ala)-OH на дифференцировку, пролиферацию и апоптоз клеток в органотипических культурах ткани сетчатки крыс и цыплят. Example 5 . Effect of H-Glu(Ala)-OH peptide on differentiation, proliferation and apoptosis of cells in organotypic cultures of rat and chicken retinal tissue.

Органотипическое культивирование ткани сетчатки 10-дневных цыплят и крыс линии Wistаr проводилось по описанной методике [Хавинсон и др., 2012].Organotypic cultivation of the retinal tissue of 10-day-old chickens and Wistar rats was carried out according to the described method (Khavinson et al., 2012).

В исследовании использовалась среда с pH 7,2 из расчёта на 100 мл: раствор Хенкса 38 мл, среда Игла 36 мл, фетальная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40% - 1,0 мл, гентамицин 100 Ед/мл. Эксплантаты помещались в чашку Петри с коллагеновым покрытием дна и культивировались в 3 мл питательной среды указанного состава. Пептид H-Glu(Ala)-OH добавляли в культуры в концентрации 0,05 нг/мл. Эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объёмах питательной среды. Продолжительность культивирования составляла трое суток, такой временной интервал является необходимым и достаточным для формирования полноценной зоны роста [Чалисова Н.И. и др., 2005].The study used a medium with a pH of 7.2 per 100 ml: Hank's solution 38 ml, Eagle's medium 36 ml, fetal bovine serum 25 ml, glucose 40% - 1.0 ml, gentamicin 100 U / ml. The explants were placed in a Petri dish with a collagen coating of the bottom and cultivated in 3 ml of the nutrient medium of the specified composition. Peptide H-Glu(Ala)-OH was added to cultures at a concentration of 0.05 ng/ml. The explants of the experimental and control groups developed in the same volumes of the nutrient medium. The duration of cultivation was three days, such a time interval is necessary and sufficient for the formation of a full-fledged growth zone [Chalisova N.I. et al., 2005].

Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела: Brn3 (1:50, Dako), Marth5 (1:50, Dako), Pax6 (1:50, Dako), Math1 (1:50, Dako), Prox1 (1:50, Dako), TTR (1:50, Dako), Ki67 (1:50, Dako). Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование. Относительную площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, и выражали в процентах. Указанный параметр отражает интенсивность синтеза или накопления исследуемых сигнальных молекул. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась в программе Statistica 6.0. Были использованы статистические критерии Шапиро-Уилка, Крускала–Уоллиса и Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05.Primary monoclonal antibodies were used for immunocytochemical studies: Brn3 (1:50, Dako), Marth5 (1:50, Dako), Pax6 (1:50, Dako), Math1 (1:50, Dako), Prox1 (1:50, Dako), TTR (1:50, Dako), Ki67 (1:50, Dako). To evaluate the results of immunocytochemical staining, a morphometric study was performed. The relative area of expression was calculated as the ratio of the area occupied by immunopositive cells to the total area of cells in the field of view, and expressed as a percentage. This parameter reflects the intensity of synthesis or accumulation of the studied signal molecules. Statistical processing of experimental data was carried out using the Statistica 6.0 program. Shapiro-Wilk, Kruskal-Wallis and Mann-Whitney statistical tests were used. The critical level of statistical significance of the null hypothesis (no differences) was taken equal to 0.05.

Установлено, что в органотипических культурах ткани сетчатки цыплят введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению площади экспрессии Brn3 в 2,5 раза, Рах6 – в 1,2 раза, Math1– в 3,6 раза, TTR – в 1,7 раза, Prox1 – в 1,8 раза. Кроме того, в органотипических культурах ткани сетчатки цыплят введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению площади экспрессии маркера пролиферации Ki67 в 2,6 раза по сравнению с контролем. It was found that in organotypic tissue cultures of chicken retina, the introduction of the H-Glu(Ala)-OH peptide led to a statistically significant increase in the expression area of Brn3 by 2.5 times, Pax6 by 1.2 times, Math1– by 3.6 times, TTR - 1.7 times, Prox1 - 1.8 times. In addition, in organotypic tissue cultures of the chicken retina, the introduction of the H-Glu(Ala)-OH peptide led to a statistically significant increase in the expression area of the Ki67 proliferation marker by 2.6 times compared with the control.

Введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому снижению площади экспрессии маркера апоптоза p53 в органотипических культурах ткани сетчатки крыс в 1,5 раза по сравнению с контролем. Кроме того, в органотипических культурах ткани сетчатки крыс введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению площади экспрессии маркера опосредованной пролиферации CXCL12 в 1,9 раза по сравнению с контролем.The introduction of the H-Glu(Ala)-OH peptide led to a statistically significant decrease in the area of expression of the apoptosis marker p53 in organotypic cultures of rat retinal tissue by 1.5 times compared with the control. In addition, in organotypic cultures of rat retinal tissue, the introduction of the H-Glu(Ala)-OH peptide led to a statistically significant increase in the area of expression of the marker of mediated proliferation CXCL12 by 1.9 times compared with the control.

Таким образом, пептид H-Glu(Ala)-OH стимулирует экспрессию ключевых белков, участвующих в дифференцировке нейрональных клеток сетчатки. Установлено, что пептид H-Glu(Ala)-OH стимулирует дифференцировку тканей сетчатки в направлении ганглиозных нейронов (повышение экспрессии маркеров Brn3, Prox1), амакринных клеток (повышение экспрессии маркеров Math1, Prox1) и клеток пигментного эпителия (повышение экспрессии белка ТТR), а так же усиливает экспрессию маркера ранней дифференцировки клеток сетчатки Pax6. Кроме того, пептид H-Glu(Ala)-OH способствует активации процессов пролиферации и снижению апоптоза клеток сетчатки in vitro.Thus, the H-Glu(Ala)-OH peptide stimulates the expression of key proteins involved in the differentiation of retinal neuronal cells. It has been established that the H-Glu(Ala)-OH peptide stimulates the differentiation of retinal tissues in the direction of ganglion neurons (increased expression of Brn3, Prox1 markers), amacrine cells (increased expression of Math1, Prox1 markers) and pigment epithelial cells (increased expression of TTR protein), and also enhances the expression of the marker of early differentiation of retinal cells Pax6. In addition, the H-Glu(Ala)-OH peptide promotes the activation of proliferation processes and the reduction of retinal cell apoptosis in vitro .

Пример 6. Цитопротекторное влияние пептида H-Glu(Ala)-OH в органотипических культурах тканей подкорковых структур головного мозга крыс при действии цитостатика циклофосфана. Example 6 . Cytoprotective effect of the H-Glu(Ala)-OH peptide in organotypic tissue cultures of the subcortical structures of the rat brain under the action of the cytostatic cyclophosphamide.

Органотипическое культивирование тканей подкорковых структур головного мозга самцов крыс линии Wistаr в возрасте 3 месяцев проводилось по описанной методике [Хавинсон и др., 2012]. Отпрепарированные фрагменты ткани разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм³, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Organotypic cultivation of tissues of subcortical structures of the brain of male Wistar rats at the age of 3 months was carried out according to the described method [Khavinson et al., 2012]. The prepared tissue fragments were divided into smaller parts about 1 mm ³ in size, which were placed in Petri dishes with a collagen coating of the bottom.

В исследовании использовалась среда с pH 7,2 из расчёта на 100 мл: раствор Хенкса 38 мл, среда Игла 36 мл, фетальная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40% - 1,0 мл, гентамицин 100 Ед/мл. Эксплантаты помещались в чашку Петри с коллагеновым покрытием дна и культивировались в 3 мл питательной среды указанного состава. 1 группа являлась контрольной, в культуры 2 группы добавляли циклофосфан в концентрации 2 мг/мл, в культуры 3 группы добавляли одновременно циклофосфан в концентрации 2 мг/мл и пептид H-Glu(Ala)-OH в концентрации 0,05 нг/мл. Эксплантаты экспериментальных и контрольной групп развивались в одинаковых объёмах питательной среды. Продолжительность культивирования составляла трое суток, такой временной интервал является необходимым и достаточным для формирования полноценной зоны роста [Чалисова Н.И. и др., 2005].The study used a medium with a pH of 7.2 per 100 ml: Hank's solution 38 ml, Eagle's medium 36 ml, fetal bovine serum 25 ml, glucose 40% - 1.0 ml, gentamicin 100 U / ml. The explants were placed in a Petri dish with a collagen coating of the bottom and cultivated in 3 ml of the nutrient medium of the specified composition. Group 1 was the control group, cyclophosphamide at a concentration of 2 mg/ml was added to cultures of group 2, and cyclophosphamide at a concentration of 2 mg/ml and H-Glu(Ala)-OH peptide at a concentration of 0.05 ng/ml were added simultaneously to cultures of group 3. The explants of the experimental and control groups developed in the same volumes of the nutrient medium. The duration of cultivation was three days, such a time interval is necessary and sufficient for the formation of a full-fledged growth zone [Chalisova N.I. et al., 2005].

В процессе культивирования вокруг эксплантатов образовывалась зона роста, состоящая из мигрирующих нейроцитов и пролиферирующих глиальных клеток. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в процентах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади центральной зоны эксплантата. Для расчета ИП эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась в программе Statistica 6.0. Были использованы статистические критерии Шапиро-Уилка, Крускала–Уоллиса и Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05.During cultivation, a growth zone formed around the explants, consisting of migrating neurocytes and proliferating glial cells. The area index (AI) was determined, which was calculated as a percentage as the ratio of the area of the entire explant (together with the zone of vacant cells) to the area of the central zone of the explant. PhotoM 1.2 software was used to calculate the SI of explants. Statistical processing of experimental data was carried out using the Statistica 6.0 program. Shapiro-Wilk, Kruskal-Wallis and Mann-Whitney statistical tests were used. The critical level of statistical significance of the null hypothesis (no differences) was taken equal to 0.05.

Установлено, что в органотипических культурах тканей подкорковых структур головного мозга крыс введение цитостатика циклофосфана приводило к статистически значимому снижению зоны роста эксплантатов в 0,85 раза по сравнению с контролем, при одновременном введении цитостатика циклофосфана с пептидом H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению зоны роста эксплантатов в 1,3 раза по сравнению с контролем.It was found that in organotypic tissue cultures of the subcortical structures of the rat brain, the introduction of the cytostatic cyclophosphamide led to a statistically significant decrease in the growth zone of explants by 0.85 times compared with the control, while the simultaneous administration of the cytostatic cyclophosphamide with the peptide H-Glu(Ala)-OH led to a statistically significant increase in the growth zone of explants by 1.3 times compared with the control.

Таким образом угнетающее влияние цитостатика циклофосфана на ткань подкорковых структур головного мозга крыс нивелировалось при одновременном добавлении пептида H-Glu(Ala)-OH, из чего следует, пептид H-Glu(Ala)-OH обладает цитопротекторным действием в отношении клеток подкорковых структур головного мозга.Thus, the inhibitory effect of the cytostatic cyclophosphamide on the tissue of the subcortical structures of the brain of rats was leveled with the simultaneous addition of the peptide H-Glu(Ala)-OH, which implies that the peptide H-Glu(Ala)-OH has a cytoprotective effect on the cells of the subcortical structures of the brain .

Пример 7. Влияние пептида H-Glu(Ala)-OH на условно-рефлекторную деятельность пчел Apis mellifera carnica Pollm. Example 7 . The effect of the H-Glu(Ala)-OH peptide on the conditioned reflex activity of Apis mellifera carnica Pollm bees.

В поведенческих опытах с насекомыми объектом исследования служила медоносная пчела краинской расы Apis mellifera carnica Pollm в возрасте 10-40 дней [Лопатина и др., 2002, 2010]. Для изучения условно-рефлекторной деятельности пчел оценивали образование пищевого условного рефлекса вытягивания хоботка на обонятельный раздражитель (PER). У фиксированных за крылья пчел вырабатывали условный рефлекс вытягивания хоботка путем однократного сочетания запаха гвоздики и пищевого подкрепления – 50% раствора сахарозы. Через 1 мин (КП - кратковременная память) и 180 мин (ДП - долговременная память) по окончании процедуры обучения у пчел проверяли наличие условной реакции на запах. До обучения у пчел оценивали сенсорную возбудимость – наличие спонтанной реакции вытягивания хоботка на еще неподкрепленный запах (при наличии таковой пчел выбраковывали) и пищевую возбудимость – вытягивание хоботка в ответ на соприкосновение раствора сахарозы с антеннами (вкусовая рецепция) (в отсутствие таковой пчел выбраковывали). За 3 ч до процедуры обучения пчел изолировали, лишая их пищи и контакта с семьей, для повышения пищевой мотивации. Фоновой условно-рефлекторный уровень определяли, как количество пчел, сохраняющих в памяти условную реакцию в контрольной группе (инъекции физиологического раствора), и выражали в процентах. За 30 мин до обучения пчелам дорзально в торакс делали инъекции 2 мкл раствора пептида H-Glu(Ala)-OH в концентрациях 10^-7М и 10^-6М (опыт) или 2 мкл физиологического раствора (контроль). В каждой серии экспериментов использовали 60 пчел. Число пчел, ответивших условной реакцией, оценивали в процентах по отношению к контрольному уровню (принятому за 100%).In behavioral experiments with insects, the honey bee of the Krajina race Apis mellifera carnica Pollm at the age of 10–40 days served as the object of study (Lopatina et al., 2002, 2010). To study the conditioned reflex activity of bees, the formation of a food conditioned proboscis extension reflex to an olfactory stimulus (PER) was evaluated. In bees fixed by the wings, a conditioned proboscis extension reflex was developed by a single combination of the smell of cloves and food reinforcement - 50% sucrose solution. After 1 min (KP - short-term memory) and 180 min (LT - long-term memory) after the end of the training procedure, the presence of a conditioned reaction to the smell was checked in the bees. Before training, the bees were assessed for sensory excitability, i.e., the presence of a spontaneous reaction of extending the proboscis to a still unreinforced smell (if there was such, the bees were culled) and food excitability, i.e., extending the proboscis in response to the contact of the sucrose solution with the antennae (taste reception) (in the absence of such, the bees were culled). 3 hours before the training procedure, the bees were isolated, depriving them of food and contact with the colony, to increase food motivation. The background conditioned reflex level was determined as the number of bees that retained the conditioned response in the control group (injections of saline) and expressed as a percentage. 30 min before training, the bees were injected dorsally into the thorax with 2 µl of a solution of the H-Glu(Ala)-OH peptide at concentrations of 10 ^-7 M and 10 ^-6 M (experiment) or 2 µl of physiological saline (control). In each series of experiments, 60 bees were used. The number of bees that responded with a conditioned response was estimated as a percentage relative to the control level (taken as 100%).

Установлено, что пептид H-Glu(Ala)-OH в концентрации 10^-6М повышал КП на 47% по сравнению с контролем. Кроме того, пептид H-Glu(Ala)-OH в концентрации 10^-7М повышал ДП на 35% по сравнению с контролем. Более чувствительной к действию дипептида оказалась ДП, так как эффект достигался при введении меньшей концентрации.It was found that the peptide H-Glu(Ala)-OH at a concentration of 10 ^-6 M increased the CP by 47% compared with the control. In addition, the peptide H-Glu(Ala)-OH at a concentration of 10 ^-7 M increased the DP by 35% compared with the control. DP turned out to be more sensitive to the action of the dipeptide, since the effect was achieved with the introduction of a lower concentration.

Таким образом пептид H-Glu(Ala)-OH обладает стимулирующим действием на высшую ассоциативную деятельность насекомых.Thus, the H-Glu(Ala)-OH peptide has a stimulating effect on the higher associative activity of insects.

Пример 8. Влияние пептида H-Glu(Ala)-OH на обучение и формирование памяти у дрозофил agnts3 (модель болезни Паркинсона). Example 8 . The effect of the H-Glu(Ala)-OH peptide on learning and memory formation in Drosophila agnts3 (a model of Parkinson's disease) .

В работе использовали линии Drosophila melanogaster: canton-S (CS) - линия дикого типа (контрольные нормальные организмы) и мутантная линия agn ^ts3 . Локус agnostic был обнаружен при целенаправленном скрининге мутаций, индуцированных этилметансульфонатом в линии CS, несет температурочувствительную (ts) мутацию по гену limk1, который кодирует ключевой фермент ремоделирования актина LIMK1. Мух выращивали в стаканчиках объемом 160 мл на стандартной изюмно-дрожжевой среде при температуре +25^оС±0,5°С, 60% влажности и свето-темновом цикле 12:12 ч. Тестирование пептида проводили через 15 сут у 5-суточных имаго. Развитие дрозофилы от стадии яйца до стадии окукливания происходило на питательной среде с пептидом H-Glu(Ala)-OH. Пептид применяли в концентрации 0,05 мкг/мл. Вылетающих на 10 сут развития из куколки мух содержали до тестирования в течение 5 сут на среде без пептида H-Glu(Ala)-OH.The lines of Drosophila melanogaster were used in the work: canton-S (CS) - a wild-type line (control normal organisms) and a mutant line agn ^ts3 . The agnostic locus was found by targeted screening for ethylmethanesulfonate-induced mutations in the CS lineage to carry a temperature-sensitive (ts) mutation in the limk1 gene, which encodes the key actin remodeling enzyme LIMK1. Flies were grown in 160 ml cups on a standard raisin-yeast medium at a temperature ^of +25°C ± 0.5°C, 60% humidity and a light-dark cycle of 12:12 h. The peptide was tested after 15 days in 5-day-old adults . Drosophila developed from the egg stage to the pupation stage on a nutrient medium with the H-Glu(Ala)-OH peptide. The peptide was used at a concentration of 0.05 μg/ml. Flies emerging on the 10th day of development from the pupa were kept for 5 days on a medium without the H-Glu(Ala)-OH peptide until testing.

При анализе когнитивного поведения дрозофилы использовали метод условно–рефлекторного подавления ухаживания [Kamyshev et al., 1999]. Отбирали самцов исследуемых линий и содержали их индивидуально. В качестве объектов ухаживания для самцов использовали оплодотворенных за сутки до опыта самок линии CS в возрасте 5 сут. Обучение и тестирование проводили в возрасте 5 сут в специальных экспериментальных камерах.The cognitive behavior of Drosophila was analyzed using the method of conditioned reflex suppression of courtship [Kamyshev et al., 1999]. The males of the studied lines were selected and kept individually. Females of the CS line at the age of 5 days, fertilized the day before the experiment, were used as objects of courtship for males. Training and testing were carried out at the age of 5 days in special experimental chambers.

Для выработки условно-рефлекторного подавления ухаживания (тренировки) 5-суточного самца, не имеющего опыта полового поведения, помещали в экспериментальную камеру вместе с оплодотворённой 5-суточной самкой CS и оставляли на 30 мин (тренировка).To develop a conditioned reflex suppression of courtship (training), a 5-day-old male with no experience of sexual behavior was placed in an experimental chamber together with a fertilized 5-day-old CS female and left for 30 min (training).

Оценку способности к обучению и формированию памяти проводили в специальной модели. Обучение тестировали сразу после тренировки, а среднесрочную память – через 3 ч (180 мин) после тренировки, используя новых оплодотворенных самок CS в возрасте 5 сут. В качестве контроля использовали самцов, не имеющих опыта полового поведения.The ability to learn and form memory was assessed in a special model. Learning was tested immediately after training, and medium-term memory was tested 3 h (180 min) after training, using new fertilized CS females at the age of 5 days. Males with no experience of sexual behavior were used as controls.

Этограмму поведения самца регистрировали в течение 300 с, фиксируя время начала отдельных элементов ухаживания (ориентация и преследование, вибрация, лизание, попытка копуляции), а также время исполнения элементов, не связанных с ухаживанием (активность-побежка, прининг, покой). Регистрацию начинали через 45 с после помещения мухи в камеру. В каждой группе тестировали 20 мух. Для расшифровки и анализа данных использовали специально разработанные компьютерные программы.An ethogram of male behavior was recorded for 300 s, fixing the time of the beginning of individual elements of courtship (orientation and pursuit, vibration, licking, copulation attempt), as well as the time of performing elements not associated with courtship (activity-running, pringing, rest). Registration was started 45 s after the fly was placed in the chamber. 20 flies were tested in each group. Specially developed computer programs were used to decipher and analyze the data.

Для каждого самца вычисляли индекс ухаживания (ИУ), т.е. время ухаживания самца за самкой, выраженное в процентах от общего времени наблюдения. Для количественной оценки результатов обучения вычисляли индекс обучения (ИО) по следующей формуле:For each male, the courtship index (CI) was calculated, i.e. male courtship time for a female, expressed as a percentage of the total observation time. To quantify learning outcomes, a learning index (LE) was calculated using the following formula:

ИО = [(ИУн - ИУт) / ИУн] x 100% = (1 - ИУт / ИУн) x 100%,IE = [(Iv - Iv) / Iv] x 100% = (1 - Iv / Iv) x 100%,

где ИУн - средний индекс ухаживания для независимых выборок самцов, не имеющих опыта полового поведения, ИУт - средний индекс ухаживания для независимых выборок самцов, прошедших тренировку [Kamyshev et al., 1999].where Iv is the average courtship index for independent samples of males with no experience of sexual behavior, Iv is the average courtship index for independent samples of males that have been trained [Kamyshev et al., 1999].

При изучении способности к обучению было установлено, что у линии дикого типа CS ИО был равен 95,4±23,6 %, что свидетельствует о нормальном протекании процессов обучения. У мутанта agnts3 (модель болезни Паркинсона) ИО был снижен в 4,75 раз и составил 20,1±5,2 %. При добавлении пептида H-Glu(Ala)-OH в среду, на которой происходило развитие мутанта agnts3, ИО увеличивался в 3,39 раза и составил 68,1±15,3%, что статистически значимо не отличалось от ИО в норме (p<0,05).When studying the ability to learn, it was found that in the wild-type CS line, the AI was 95.4 ± 23.6%, which indicates the normal course of learning processes. In the agnts3 mutant (a model of Parkinson's disease), IR was reduced by 4.75 times and amounted to 20.1±5.2%. When the H-Glu(Ala)-OH peptide was added to the medium on which the agnts3 mutant developed, the AI increased by 3.39 times and amounted to 68.1±15.3%, which did not statistically significantly differ from the AI in the norm (p <0.05).

При изучении формирования среднесрочной памяти установлено, что у линии дикого типа CS ИО был равен 86,8±21,7 %. У мутанта agnts3 (модель болезни Паркинсона) ИО составил 14,7±3,8 %. При добавлении пептида H-Glu(Ala)-OH в среду, на которой происходило развитие мутанта agnts3, ИО увеличивался в 3,97 раза и составил 58,4±14,5 %, что статистически значимо не отличалось от ИО в норме (p<0,05).When studying the formation of medium-term memory, it was found that in the wild-type CS line, the AI was 86.8±21.7%. In the agnts3 mutant (a model of Parkinson's disease), the AI was 14.7±3.8%. When the H-Glu(Ala)-OH peptide was added to the medium on which the agnts3 mutant developed, the AI increased by 3.97 times and amounted to 58.4±14.5%, which did not differ statistically significantly from the normal AI (p <0.05).

Таким образом, пептид H-Glu(Ala)-OH восстанавливает способность к обучению и формированию памяти у мутантной линии Drosophila melanogaster agnts3 (модель болезни Паркинсона), устраняя дефекты на различных стадиях формирования памяти.Thus, the H-Glu(Ala)-OH peptide restores the ability to learn and form memory in the mutant line Drosophila melanogaster agnts3 (a model of Parkinson's disease), eliminating defects at various stages of memory formation.

Пример 9 . Влияние фармацевтической композиции на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH на функции памяти у мужчин пожилого возраста Example 9 . Influence of a pharmaceutical composition based on dipeptide H-Glu(Ala)-OH on memory functions in elderly men

Фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH применяли у 199 мужчин в возрасте 60-74 года (средний возраст 66,1±0,2 года), которые жаловались на снижение памяти. Критерием исключения являлось наличие у обследуемых избыточного веса, никотиновой и/или алкогольной зависимости, а также заболеваний мозга и ЦНС. Мужчины методом простой рандомизации были разделены на четыре группы – три основных и контрольную. A pharmaceutical composition based on the dipeptide H-Glu(Ala)-OH was used in 199 men aged 60-74 years (mean age 66.1±0.2 years) who complained of memory loss. The exclusion criterion was the presence of excess weight, nicotine and/or alcohol addiction, as well as diseases of the brain and central nervous system in the subjects. Men were divided into four groups by simple randomization - three main groups and a control group.

Первую основную группу (ОГ-1) составили 56 человек (средний возраст 68,2±0,4 года), применявших фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH в дозах 10,0 мкг/кг массы тела (ОГ-1/1, n=22) или 100,0 мкг пептида на 1 кг массы тела (ОГ-1/2, n=34) перорально по 1 капсуле 2 раза в день ежедневно в течение 30 дней. Во вторую основную группу (ОГ-2) вошло 59 человек (средний возраст 67,4±0,4 года), которые получали фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH в виде раствора интраназально по 5 капель в каждый носовой ход в дозах 1,0 мкг/кг массы тела (ОГ-2/1, n=17) или 10,0 мкг/кг массы тела (ОГ-2/2, n=42) в день в течение 30 дней. В третью основную группу (ОГ-3) вошло 56 человек (средний возраст 65,8±0,3 года), которые получали фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH в виде раствора для внутримышечного применения по 1 мл в дозах 0,1 мкг/кг массы тела (ОГ-3/1, n=36) или 10,0 мкг/кг массы тела (ОГ-3/2, n=20) в день в течение 30 дней. Контрольная группа (КГ) состояла из 28 человек (средний возраст 67,1±0,2 года), которые получали в качестве препарата сравнения поливитамины Декамевит^®, предназначенные для лиц пожилого возраста. The first main group (MG-1) consisted of 56 people (mean age 68.2±0.4 years) who used a pharmaceutical composition based on the dipeptide H-Glu(Ala)-OH at doses of 10.0 μg/kg of body weight (MG -1/1, n=22) or 100.0 μg of the peptide per 1 kg of body weight (OG-1/2, n=34) orally 1 capsule 2 times a day daily for 30 days. The second main group (MG-2) included 59 people (mean age 67.4±0.4 years), who received a pharmaceutical composition based on the dipeptide H-Glu(Ala)-OH in the form of a solution intranasally, 5 drops in each nasal course at doses of 1.0 µg/kg of body weight (OG-2/1, n=17) or 10.0 µg/kg of body weight (OG-2/2, n=42) per day for 30 days. The third main group (MG-3) included 56 people (mean age 65.8±0.3 years) who received a pharmaceutical composition based on the dipeptide H-Glu(Ala)-OH in the form of a solution for intramuscular use, 1 ml per day. doses of 0.1 µg/kg body weight (OG-3/1, n=36) or 10.0 µg/kg body weight (OG-3/2, n=20) per day for 30 days. The control group (CG) consisted of 28 people (mean age 67.1±0.2 years) who received Decamevit ^® multivitamins intended for the elderly as a reference drug.

Результаты исследования функции памяти у лиц пожилого возраста посредством тестов «Кратковременная зрительная память на числа», «Оперативная память» и «Долговременная память» выявили сходные по выраженности положительные изменения функций памяти в трех основных группах. The results of the study of memory function in the elderly using the tests "Short-term visual memory for numbers", "Working memory" and "Long-term memory" revealed positive changes in memory functions similar in severity in the three main groups.

Так, после применения фармацевтической композиции на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH кратковременная зрительная память достоверно улучшилась у лиц ОГ-1, ОГ-2 и ОГ-3 по сравнению с показателями в контрольной группе в 1,7, 1,8 и 1,9 раза соответственно во всех трех подгруппах каждой основной группы (р<0,05). Аналогичная тенденция отмечалась и по показателям оперативной памяти: в трех основных группах (и двух подгруппах в каждой группе) показатель улучшился в 1,6, 1,5 и 1,7 раза соответственно по сравнению с показателем после коррекции в контрольной группе (р<0,05). Показатель долговременной памяти имел тенденцию к улучшению, однако отличия в основных группах по сравнению с контрольной группой не были достоверными (р>0,05). Данные представлены в таблице.Thus, after the use of a pharmaceutical composition based on the dipeptide H-Glu(Ala)-OH, short-term visual memory significantly improved in persons OG-1, OG-2 and OG-3 compared with the values in the control group of 1.7, 1.8 and 1.9 times, respectively, in all three subgroups of each main group (p<0.05). A similar trend was noted in terms of working memory: in the three main groups (and two subgroups in each group), the indicator improved by 1.6, 1.5 and 1.7 times, respectively, compared with the indicator after correction in the control group (p<0 .05). The indicator of long-term memory tended to improve, however, the differences in the main groups compared to the control group were not significant (p>0.05). The data are presented in the table.

Источники информацииSources of information

Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Проняева В.Е., Чалисова Н.И., Концевая Е.А., Полякова В.О., Кветная Т.В., Кветной И.М., Яковлев Г.М. Методика создания монослоя клеток на базе органотипической культуры для тестирования физиологически активных веществ // Бюл. эксп. биол. мед. – 2012. - №2. – С. 759-763.Khavinson V.Kh., Linkova N.S., Pronyaeva V.E., Chalisova N.I., Kontsevaya E.A., Polyakova V.O., Kvetnaya T.V., Kvetnoy I.M., Yakovlev G .M. A technique for creating a cell monolayer based on an organotypic culture for testing physiologically active substances // Bul. exp. biol. honey. - 2012. - No. 2. - S. 759-763.

Чалисова Н.И., Князькин И.В., Кветной И.М. Нейроиммуноэндокринные механизмы действия пептидов и аминокислот в тканевых культура. Научная серия Молекулярная нейроиммуноэндокринология. - Санкт-Петербург: ДЕАН, 2005. - 125 с.Chalisova N.I., Knyazkin I.V., Kvetnoy I.M. Neuroimmunoendocrine mechanisms of action of peptides and amino acids in tissue culture. Scientific series Molecular neuroimmunoendocrinology. - St. Petersburg: DEAN, 2005. - 125 p.

Лопатина Н.Г., Зачепило Т.Г., Чеснокова Е.Г., Савватеева-Попова Е.В. Поведенческие и молекулярные аспекты дефицита эндогенных кинуренинов у медоносной пчелы Apis mellifera L // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. - 2010. - Т. 60, N 2. - С. 229-235. Lopatina N.G., Zachepilo T.G., Chesnokova E.G., Savvateeva-Popova E.V. Behavioral and molecular aspects of endogenous kynurenine deficiency in the honey bee Apis mellifera L. Journal of Higher Nervous Activity. I.P. Pavlova. - 2010. - T. 60, N 2. - S. 229-235.

Лопатина Н.Г., Рыжова И.В., Чеснокова Е.Г., Зачепило Т.Г., Войке Е. Центральные не-NMDA рецепторы медоносной пчелы в условиях наследственно обусловленного дефицита кинуренинов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2002. - Т. 135, № 4. - С. 458-460.Lopatina N.G., Ryzhova I.V., Chesnokova E.G., Zachepilo T.G., Voike E. Central non-NMDA receptors of the honey bee under conditions of hereditary deficiency of kynurenins // Bulletin of experimental biology and medicine. 2002. - T. 135, No. 4. - S. 458-460.

Kamyshev N. G., Iliadi K. G., Bragina J. V. Drosophila conditioned courtship: Two ways of testing memory // Learning and Memory. 1999. Vol. 6. № 1. P. 1-20.Kamyshev N. G., Iliadi K. G., Bragina J. V. Drosophila conditioned courtship: Two of testing memory // Learning and Memory. 1999 Vol. 6. No. 1. P. 1-20.

Таблица – Влияние фармацевтической композиции на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH на показатели функции памяти у мужчин пожилого возрастаTable - The effect of a pharmaceutical composition based on the dipeptide H-Glu(Ala)-OH on memory function in elderly men

ПоказательIndicator КГKG ОГ-1OG-1 ОГ-2OG-2 ОГ-3OG-3 Исходное состояниеThe initial state После коррекцииAfter correction Исходное состояниеThe initial state После коррекцииAfter correction Исходное состояниеThe initial state После коррекцииAfter correction Исходное состояниеThe initial state После коррекцииAfter correction Кратковременная зрительная память на числа, баллыShort-term visual memory for numbers, points 2,0±0,42.0±0.4 2,1±0,42.1±0.4 ОГ-1/1OG-1/1
2,1±0,32.1±0.3
ОГ-1/2OG-1/2
2,0±0,12.0±0.1 ОГ-1/1OG-1/1
3,6±0,5*#3.6±0.5*#
ОГ-1/2OG-1/2
3,9±0,2*#3.9±0.2*# ОГ-1/1OG-1/1
2,0±0,32.0±0.3
ОГ-1/2OG-1/2
1,8±0,31.8±0.3 ОГ-2/1OG-2/1
3,8±0,4*#3.8±0.4*#
ОГ-2/2OG-2/2
4,1±0,1*#4.1±0.1*# ОГ-1/1OG-1/1
2,1±0,092.1±0.09
ОГ-1/2OG-1/2
1,8±0,41.8±0.4 ОГ-3/1OG-3/1
4,1±0,2*#4.1±0.2*#
ОГ-3/2OG-3/2
4,3±0,1*#4.3±0.1*# Оперативная
память, баллыOperational
memory, points 10,4±1,110.4±1.1 12,8±1,312.8±1.3 ОГ-1/1OG-1/1
10,1±1,010.1±1.0
ОГ-1/2OG-1/2
9,8±0,89.8±0.8 ОГ-1/1OG-1/1
20,4±1,1*#20.4±1.1*#
ОГ-1/2OG-1/2
21,6±0,8*#21.6±0.8*# ОГ-1/1OG-1/1
10,2±1,410.2±1.4
ОГ-1/2OG-1/2
9,7±1,19.7±1.1 ОГ-2/1OG-2/1
19,6±0,9*#19.6±0.9*#
ОГ-2/2OG-2/2
22,5±0,7*#22.5±0.7*# ОГ-1/1OG-1/1
10,3±1,010.3±1.0
ОГ-1/2OG-1/2
10,0±0,710.0±0.7 ОГ-3/1OG-3/1
21,7±1,2*#21.7±1.2*#
ОГ-3/2OG-3/2
23,4±1,3*#23.4±1.3*# Долговременная
память, баллыlong-term
memory, points 13,2±1,113.2±1.1 13,9±1,313.9±1.3 ОГ-1/1OG-1/1
13,4±1,113.4±1.1
ОГ-1/2OG-1/2
13,0±1,013.0±1.0 ОГ-1/1OG-1/1
15,8±1,315.8±1.3
ОГ-1/2OG-1/2
17,2±1,1*#17.2±1.1*# ОГ-1/1OG-1/1
13,0±1,313.0±1.3
ОГ-1/2OG-1/2
13,2±1,113.2±1.1 ОГ-2/1OG-2/1
16,1±1,016.1±1.0
ОГ-2/2OG-2/2
17,8±0,9*#17.8±0.9*# ОГ-1/1OG-1/1
13,3±1,113.3±1.1
ОГ-1/2OG-1/2
13,1±0,913.1±0.9 ОГ-3/1OG-3/1
15,8±1,215.8±1.2
ОГ-3/2OG-3/2
18,1±1,0*#18.1±1.0*#

* - р<0,05 по сравнению с исходным показателем в данной группе;* - p<0.05 compared with the baseline in this group;

# - р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе# - p<0.05 compared with the corresponding indicator in the control group

Claims (2)

1. Применение пептида γ-глутамил-аланина формулы H-Glu(Ala)-OH в качестве средства, стимулирующего пролиферацию клеток нервной ткани и дифференцировку нейронов, обладающего нейростимулирующей и нейропротекторной активностью, а также восстанавливающего способность к обучению и формированию памяти.1. The use of the γ-glutamyl-alanine peptide of the formula H-Glu(Ala)-OH as a means of stimulating the proliferation of cells of the nervous tissue and differentiation of neurons, which has neurostimulating and neuroprotective activity, as well as restoring the ability to learn and form memory. 2. Способ профилактики и/или лечения нарушений нервной системы при нейродегенеративных патологиях, при которых необходима стимуляция репаративных процессов в тканях головного мозга и регенерации нейронов, заключающийся в парентеральном, интраназальном или пероральном введении пептида γ-глутамил-аланина формулы H-Glu(Ala)-OH в качестве лекарственного средства, стимулирующего пролиферацию клеток нервной ткани и дифференцировку нейронов, обладающего нейростимулирующей и нейропротекторной активностью, а также восстанавливающего способность к обучению и формированию памяти, при этом при парентеральном введении доза лекарственного средства составляет от 0,1 до 10 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день, при интраназальном – от 1 до 10 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день, при пероральном – от 10 до 100 мкг/кг массы тела по крайней мере два раза в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.2. A method for the prevention and/or treatment of disorders of the nervous system in neurodegenerative pathologies, which require stimulation of reparative processes in brain tissues and regeneration of neurons, which consists in parenteral, intranasal or oral administration of the γ-glutamyl-alanine peptide of the formula H-Glu(Ala) -OH as a drug that stimulates the proliferation of cells of the nervous tissue and differentiation of neurons, has neurostimulating and neuroprotective activity, as well as restoring the ability to learn and form memory, while parenteral administration of the dose of the drug is from 0.1 to 10 μg / kg body weight at least once a day, by intranasal - from 1 to 10 mcg/kg of body weight at least once a day, by oral - from 10 to 100 mcg/kg of body weight at least twice a day in during the period necessary to achieve a therapeutic effect.