RU2115660C1 - Peptides showing antistress, anticonvulsant and neuroprotective effect - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry of peptides. SUBSTANCE: product: peptides of the general formula: Trp-X-Gly-Gly-Asp-R where X - residue of hydroxyl-containing amino acid of L- or D-configuration; R - peptide Ala-Ser-Gly-Glu or Ala-Ser-Gly, or Ala-Ser or Ala, and their pharmaceutically acceptable salts also. Synthesis of peptides is carried out by the successive peptide chain splicing using tert.-butylhydroxycarbonyl scheme of solid-phase peptide synthesis. Synthesis is carried out at automatic regime in peptide synthesizer. Synthesized peptides are used in medicine since they show antistress, anticonvulsant and neuroprotective effect. EFFECT: improved method of synthesis, enhanced effectiveness of peptides. 7 tbl

Description

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, конкретно - пептидам общей формулы: Trp-X-Gly-Gly-Asp-R, где X - остаток гидроксилсодержащей аминокислоты L- или D-конфигурации, R-Ala-Ser-Gly-Glu или Ala-Ser-Gly, или Ala-Ser, или Ala; а также их фармацевтически приемлемые соли, обладающие антистрессорным, противосудорожным и нейропротекторным действием. Предлагаемые соединения могут найти применение в медицине. The invention relates to new biologically active compounds, in particular peptides of the general formula: Trp-X-Gly-Gly-Asp-R, where X is the residue of the hydroxyl-containing amino acid of the L- or D-configuration, R-Ala-Ser-Gly-Glu or Ala -Ser-Gly, or Ala-Ser, or Ala; as well as their pharmaceutically acceptable salts having antistress, anticonvulsant and neuroprotective effects. The proposed compounds can be used in medicine.

В процессе жизнедеятельности организм человека подвергается воздействию различных по силе и характеру раздражителей, что приводит к развитию стресс-реакций, которые, по определению Селье, представляют собой совокупность всех неспецифических изменений, возникающих в организме под влиянием любых воздействий (Горизонтов П.Д. Общая характеристика и значение реакции стресса. -Вестник АМН СССР, 1975, N 8, с.30-35; Селье Г. Стресс без дистресса. -М.: Прогресс, 1982. - 128 с. In the process of life, the human body is exposed to various stimuli of different strength and nature, which leads to the development of stress reactions, which, according to Selye, represent the totality of all non-specific changes that occur in the body under the influence of any influences (Horizons P.D. and the significance of the stress reaction. — Bulletin of the USSR Academy of Medical Sciences, 1975, No. 8, pp. 30-35; Selye G. Stress without distress. —M .: Progress, 1982. - 128 p.

В ответе на значительные воздействия неблагоприятных факторов внешней среды в организме человека и животных происходят адаптивные биохимические и физиологические изменения, которые, однако, в случае чрезмерных и продолжительных нагрузок приобретают патологический характер и вызывают или обостряют многие серьезные заболевания. В связи с этим проблема адаптации человека к критическим факторам внешней среды и повышение его устойчивости к их возмущающему воздействию является исключительно актуальной. In response to significant impacts of adverse environmental factors, adaptive biochemical and physiological changes occur in the human and animal body, which, however, in the case of excessive and prolonged stresses become pathological in nature and cause or exacerbate many serious diseases. In this regard, the problem of human adaptation to critical environmental factors and increasing its resistance to their disturbing effects is extremely relevant.

В настоящее время известны эндогенные нейропептиды (вещество P, опидные пептиды), обладающие адаптогенным и антистрессорным действием (Нейрохимия. Под ред. Ашмарина И. П. и Стукалова П.В..- М.: Изд-во института биомедицинской химии РА МН, 1996, с. 207-310). At present, endogenous neuropeptides (substance P, opid peptides) with adaptogenic and antistress effects are known (Neurochemistry. Edited by IP Ashmarin and PV Stukalov ..- M .: Publishing House of the Institute of Biomedical Chemistry RA MN, 1996, p. 207-310).

Но спектр действия этих пептидов достаточно широк, и наряду с антистрессорным они проявляют побочные нежелательные эффекты. But the spectrum of action of these peptides is wide enough, and along with the antistress, they exhibit adverse side effects.

Известен пептид дельта-сна (DSIP), который обладает выраженной способностью нормализовать или ограничивать вызванные стрессом биохимические сдвиги в организме и не обладает при этом побочными эффектами (Khvatova E.M., Rubanova N. A. , Prudchenko I.A., Mikhaleva I.I. (1995), Effects of delta-sleep inducing peptide (DSIP) and some analogues on the activity of monoamine oxidase type A in rat brain under hypoxia stress. FEBS Letters, 368, pp 367 - 369; Менджерицкий А.М., Лысенко А.В., Ускова Н. И. -Биохимия, 1995, т. 60, вып.4, с. 585-592; Менджерицкий А.М., Лысенко А.В., Михалева И.И. Влияние ДСИП на интенсивность протеолитических процессов в мозге крыс при гипокинезии. -Укр. биохим.журн., 1992, 64, с. 47-51. Рихерева Г.Т, Маклецова М. Г. и др. Изменение интенсивности свободнорадикальных реакций в органах крыс при гипокинетическом стрессе и защите дельта-сон индуцирующим пептидом и его тирозинсодержащим аналогом. - Известия РАН, 1993, N 2, с. 243-256). The Delta-Sleep Peptide (DSIP) is known, which has a pronounced ability to normalize or limit stress-induced biochemical changes in the body and does not have side effects (Khvatova EM, Rubanova NA, Prudchenko IA, Mikhaleva II (1995), Effects of delta-sleep inducing peptide (DSIP) and some analogues on the activity of monoamine oxidase type A in rat brain under hypoxia stress. FEBS Letters, 368, pp 367 - 369; Menzheritsky A.M., Lysenko A.V., Uskova N.I. -Biochemistry, 1995, v. 60, issue 4, pp. 585-592; Menzheritsky A.M., Lysenko A.V., Mikhaleva I.I. Effect of DSIP on the intensity of proteolytic processes in the brain of rats with hypokinesia. Dr. Biochemical Journal, 1992, 64, pp. 47-51. Rikhereva G.T., Makletsova M.G. et al. Changes in the intensity of free radical reactions in rat organs under hypokinetic stress and protection of the delta-sleep inducing peptide and its tyrosine-containing analogue - Izvestia RAS, 1993, N 2, pp. 243-256).

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям. The invention relates to new biologically active compounds.

Предлагаемые пептиды общей формулы:
Trp-X-Gly-Gly-Asp-R,
где
X - остаток гидроксилсодержащей аминокислоты L- или D-конфигурации,
R-Ala-Ser-Gly-Glu или Ala-Ser-Gly, или Ala-Ser, Ala,
являются аналогами пептида дельта-сна (DSIP), содержащими 6-9 аминокислотных остатков (табл. 1) и обладают антистрессорным, противосудорожным и нейропротекторным действием.The proposed peptides of the General formula:
Trp-X-Gly-Gly-Asp-R,
Where
X is the remainder of the hydroxyl-containing amino acids of the L- or D-configuration,
R-Ala-Ser-Gly-Glu or Ala-Ser-Gly, or Ala-Ser, Ala,
they are analogues of the delta-sleep peptide (DSIP) containing 6–9 amino acid residues (Table 1) and have antistress, anticonvulsant, and neuroprotective effects.

В отличие от природного пептида DSIP предлагаемые пептиды обладают селективным и значительно более выраженным действием. Эти пептиды получают с помощью твердофазного или классического синтеза в растворе и затем очищают и выделяют в гомогенном состоянии. In contrast to the natural DSIP peptide, the proposed peptides have a selective and significantly more pronounced effect. These peptides are prepared using solid-phase or classical synthesis in solution and then purified and isolated in a homogeneous state.

Пример 1. Получение исследуемых соединений. Example 1. Obtaining the studied compounds.

Синтез пептидов осуществляют методом последовательного наращивания пептидной цепи с использованием трет-бутилоксикарбонильной схемы твердофазного пептидного синтеза. Синтез проводят в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе. Для временной защиты α -аминогруппы аминокислот используют трет-бутилоксикарбонильную группировку. Для защиты боковых функциональных групп аминокислот используют бензиловые эфиры для Glu и Ser, циклогексиловый эфир для Asp. Остаток DTyr вводят без защиты боковой функции. В качестве носителя используют аминометилированный сополимер полистирола и 1% дивинилбензола с 4-гидроксиметилфенилацетамидо-метильной (РАМ) якорной группировкой. Для проведения реакции конденсации используют 3-кратные избытки реагентов: Вос-аминокислоты, диизопропилкарбодиимида и 1-оксибензотриазола. Полноту протекания реакции контролируют с помощью качественного и количественного нингидринового теста. Конечное деблокирование пептидов осуществляют жидким фтористым водородом в присутствии n-крезола и индола (9:0,8:0,2) при 0^oC в течение 1 ч. После удаления из реакционной смеси фтористого водорода остаток промывают сухим диэтиловым эфиром (5х15 мл) на стеклянном фильтре и затем экстрагируют пептид 15% уксусной кислотой (3х10 мл) и лиофилизуют. Для очистки пептидов используют гель-хроматографию на Сефадексе G-15 в 0,1 М уксусной кислоте. Для подтверждения чистоты полученных соединений проводят ВЭЖХ на приборе System Gold (BecKman, США) с использованием колонки Nucleosil 5C18 (4 х 200 мм) фирмы "Macherey-Nagel"(ФРГ). Условия хроматографии: система A - 0,2 % TFA; система B - MeCN : 0,2% TFA; iPrOH (80:25:20). Градиент: 0-1 мин (100% A); 1-21 мин (100% A - 50% A); 21-23 мин (50% A -0% A); 23-26 мин (0% A - 100% A). Скорость 1 мл/мин, детекция при 226 нм. Пептиды охарактеризованы корректными данными аминокислотного анализа ЯМР - масс-спектров. Чистота, выход и физико-химические характеристики полученных пептидов приведены в табл. 2.Peptide synthesis is carried out by the method of sequential peptide chain extension using tert-butyloxycarbonyl scheme of solid-phase peptide synthesis. The synthesis is carried out automatically on a peptide synthesizer. For temporary protection of the α-amino group of amino acids, a tert-butyloxycarbonyl group is used. To protect the lateral functional groups of amino acids, benzyl esters for Glu and Ser, cyclohexyl ether for Asp are used. The remainder of DTyr is administered without protecting the lateral function. An aminomethylated copolymer of polystyrene and 1% divinylbenzene with 4-hydroxymethylphenylacetamide-methyl (PAM) anchor moiety is used as a carrier. To carry out the condensation reaction, 3-fold excesses of reagents are used: Boc-amino acids, diisopropylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole. The completeness of the reaction is controlled using a qualitative and quantitative ninhydrin test. The final release of the peptides is carried out with liquid hydrogen fluoride in the presence of n-cresol and indole (9: 0.8: 0.2) at 0 ^° C. for 1 h. After removal of hydrogen fluoride from the reaction mixture, the residue is washed with dry diethyl ether (5x15 ml) on a glass filter and then the peptide is extracted with 15% acetic acid (3x10 ml) and lyophilized. For peptide purification, Sephadex G-15 gel chromatography in 0.1 M acetic acid was used. To confirm the purity of the obtained compounds, HPLC was carried out on a System Gold instrument (BecKman, USA) using a Macherey-Nagel (Germany) Nucleosil 5C18 column (4 x 200 mm). Chromatography conditions: system A — 0.2% TFA; System B - MeCN: 0.2% TFA; iPrOH (80:25:20). Gradient: 0-1 min (100% A); 1-21 min (100% A - 50% A); 21-23 min (50% A -0% A); 23-26 min (0% A - 100% A). Speed 1 ml / min, detection at 226 nm. Peptides are characterized by the correct data of amino acid analysis of NMR - mass spectra. The purity, yield and physico-chemical characteristics of the obtained peptides are given in table. 2.

Известно, что стресс-реакция предшествует состоянию устойчивой адаптации и играет важную роль в ее формировании. При этом основные усилия организма направлены на поддержание функций жизненно важных органов и мобилизацию энергетических и структурных ресурсов. В ответ на стрессорные воздействия происходит выброс катехоламинов с последующей активацией симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизарной систем. В условиях длительного воздействия раздражителя происходит истощение компенсаторных возможностей и, вследствие этого, срыв адаптационных механизмов организма. Обусловленная избытком катехоламинов активация липаз, фосфолипаз и перекисного окисления липидов клеточных мембран приводит не к физиологически выгодному изменению состава липидного бислоя, а к повреждению ультраструктуры клеток и различным патологиям. It is known that a stress reaction precedes a state of stable adaptation and plays an important role in its formation. At the same time, the main efforts of the body are aimed at maintaining the functions of vital organs and mobilizing energy and structural resources. In response to stressful effects, catecholamines are released followed by activation of the sympathoadrenal and hypothalamic-pituitary systems. Under conditions of prolonged exposure to the stimulus, depletion of compensatory capabilities occurs and, as a result, the adaptation mechanisms of the body are disrupted. The activation of lipases, phospholipases and lipid peroxidation of cell membranes caused by an excess of catecholamines does not lead to a physiologically beneficial change in the composition of the lipid bilayer, but to damage to the cell ultrastructure and various pathologies.

Пример 2. Изучение антистрессорной активности пептида 1 при гипоксии. Example 2. The study of the antistress activity of peptide 1 during hypoxia.

Эксперименты проводят на белых крысах-самцах весом 180-200 г. Гипоксическую гипоксию создают в барокамере проточного типа при атмосферном давлении 196 мм рт.ст., что соответствует высоте 10 км; время экспозиции 15 мин. Пептид 1 вводят животным внутрибрюшинно в дозе 120 мг/кг за 20 мин до подъема. The experiments are carried out on white male rats weighing 180-200 g. Hypoxic hypoxia is created in a flow-type pressure chamber at atmospheric pressure of 196 mm Hg, which corresponds to an altitude of 10 km; exposure time 15 minutes Peptide 1 is administered to animals intraperitoneally at a dose of 120 mg / kg 20 minutes before lifting.

Митохондриальную фракцию головного мозга получают общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Среда выделения: сахароза - 250 мМ, трис-HCl - 10 мМ, ЭДТА - 1 мМ, pH 7,4. The mitochondrial fraction of the brain is obtained by the conventional method of differential centrifugation. Isolation medium: sucrose - 250 mM, Tris-HCl - 10 mM, EDTA - 1 mM, pH 7.4.

2.1. Определение активности моноаминооксидазы (МАО) типа А. 2.1. Determination of the activity of monoamine oxidase (MAO) type A.

Активность МАО А определяют в митохондриальной фракции. В качестве субстрата используют серотонин в насыщающей концентрации. Определение активности фермента проводят по методу Горкина. Активность МАО А оценивают по освобождению аммиака после изотермической отгонки. Белок определяют по методу Лоури. The activity of MAO A is determined in the mitochondrial fraction. Serotonin in a saturating concentration is used as a substrate. The determination of enzyme activity is carried out according to the Gorkin method. The activity of MAO A is evaluated by the release of ammonia after isothermal distillation. Protein is determined by the Lowry method.

2.2. Исследование дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий мозга. 2.2. The study of respiration and oxidative phosphorylation of brain mitochondria.

Потребление кислорода митохондриальной суспензией регистрируют полярографическим методом с использованием открытого платинового катода. Среда инкубации: сахароза - 250 мМ, трис-HCl(OH) - 10 мМ, KCl - 15 мМ, KH₂PO₄ - 20 мМ, ЭДТА - 0,5 мМ, pH 7,4. В качестве субстрата дыхания применяют 15 мМ раствор глутамата. Установлено, что под действием гипоксического стресса изменяется активность мембраносвязанных ферментов мозга животных (Рихерева Г.Т., Маклецова М. Г. и др. Изменение интенсивности свободнорадикальных реакций в органах крыс при гипокинетическом стрессе и защите дельта-сон индуцирующим пептидом и его тирозинсодержащим аналогом. - Известия РАН, 1993, N 2, с. 243-256). Например, активность митохондриальной моноаминооксидазы типа А (МАО А) из мозга крыс, подвергнутых гипоксии, снижается в среднем на 52%. Под действием предложенного пептида 1 (внутрибрюшинное введение крысам в дозе 120 мг/кг) активность фермента у животных в условиях стресса снижается только на 14% по сравнению с интактными животными. Данный результат говорит о том, что в значительной степени сохраняется способность ферментов мозга к ассоциации с митохондриальной мембраной и стабилизации тем самым энзиматических характеристик мембран митохондрий в условиях гипоксии.The oxygen consumption of the mitochondrial suspension is recorded by the polarographic method using an open platinum cathode. Incubation medium: sucrose - 250 mM, Tris-HCl (OH) - 10 mM, KCl - 15 mM, KH ₂ PO ₄ - 20 mM, EDTA - 0.5 mM, pH 7.4. A 15 mM glutamate solution is used as a respiration substrate. It was established that under the influence of hypoxic stress, the activity of membrane-bound enzymes of the animal brain changes (Rikhereva G.T., Makletsova M.G. et al. Change in the intensity of free radical reactions in rat organs under hypokinetic stress and protection of the delta-sleep inducing peptide and its tyrosine-containing analogue. - Proceedings of the Russian Academy of Sciences, 1993, N 2, pp. 243-256). For example, the activity of mitochondrial monoamine oxidase type A (MAO A) from the brain of rats subjected to hypoxia is reduced by an average of 52%. Under the action of the proposed peptide 1 (intraperitoneal administration to rats at a dose of 120 mg / kg), the enzyme activity in animals under stress is reduced by only 14% compared with intact animals. This result suggests that, to a large extent, the ability of brain enzymes to associate with the mitochondrial membrane and thereby stabilize the enzymatic characteristics of mitochondrial membranes under conditions of hypoxia is largely preserved.

Гипоксия приводит к нарушению энергетизации ткани мозга, что выражается, в частности, в снижении скорости синтеза АТР и уменьшении величины дыхательного контроля. Так, происходит снижение скорости фосфорилирования АДР при концентрации этого метаболита 50 и 75 мкМ (табл. 3). Предварительное введение пептида 1 приводит к повышению данных показателей практически до уровня интактных животных. Величина дыхательного контроля также повышается (5,67±0,86 отн. ед. ) и даже несколько превосходит значение для контрольных животных (4,01±0,14 отн.ед). Hypoxia leads to a violation of the energy of brain tissue, which is expressed, in particular, in a decrease in the rate of ATP synthesis and a decrease in the amount of respiratory control. So, there is a decrease in the rate of phosphorylation of ADRs at a concentration of this metabolite of 50 and 75 μM (Table 3). The preliminary introduction of peptide 1 leads to an increase in these indicators almost to the level of intact animals. The value of the respiratory control also increases (5.67 ± 0.86 rel. Units) and even slightly exceeds the value for control animals (4.01 ± 0.14 rel. Units).

Пример 3. Исследование противосудорожной активности пептидов. Example 3. The study of the anticonvulsant activity of peptides.

Опыты выполняют в условиях острого эксперимента на мышах линии BALB/C массой 18-22 г. Генерализованную судорожную активность вызывают введением коразола (60 мг/кг, внутрибрюшинно) в объеме 0,2-0,3 мл. Введение пептида в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг (внутрибрюшинно) осуществляют в объеме 0,2-0,3 мл физиологического раствора за 30 мин до применения коразола. В течение 30 мин после применения конвульсанта наблюдают судорожные реакции в прозрачных индивидуальных камерах (40 х 30 х 20 см). Учитывают латентный период возникновения первых и клоникотонических судорог, а также тяжесть судорожных проявлений, которые оценивают по принятой шкале. (Крыжановский Г.Н., Шандра А.А., Макулькин Р. Ф. , Годлевский Л.С. Бюллетень эксперим. биологии и медицины, 1985, т. 99, N 5, с. 527-532). The experiments are performed under the conditions of an acute experiment on mice of the BALB / C line weighing 18-22 g. Generalized convulsive activity is caused by the administration of corazole (60 mg / kg, intraperitoneally) in a volume of 0.2-0.3 ml. The introduction of the peptide in doses of 0.1 and 1.0 mg / kg (intraperitoneally) is carried out in a volume of 0.2-0.3 ml of physiological saline 30 minutes before the use of corazole. Convulsive reactions in transparent individual chambers (40 x 30 x 20 cm) are observed within 30 minutes after application of the convulsant. The latent period of the onset of the first and clonicotonic convulsions, as well as the severity of convulsive manifestations, which are evaluated according to the accepted scale, are taken into account. (Kryzhanovsky G.N., Shandra A.A., Makulkin R.F., Godlevsky L.S. Bulletin of experimental biology and medicine, 1985, vol. 99, No. 5, p. 527-532).

Пептиды 1-3 обладают ярко выраженным противосудорожным эффектом. Введение этих пептидов в дозах 0,1 м 1,0 мг/кг (внутрибрюшинно) приводит к значительному увеличению времени возникновения первых и клонико-тонических судорог, а также уменьшению тяжести судорог по сравнению с контрольными животными (табл. 4). Из приведенных данных видно, что заявляемые пептиды 1-3 проявляют более выраженное противосудорожное действие, чем DSIP. Peptides 1-3 have a pronounced anticonvulsant effect. The introduction of these peptides in doses of 0.1 m 1.0 mg / kg (intraperitoneally) leads to a significant increase in the time of occurrence of the first and clonic-tonic seizures, as well as a decrease in the severity of seizures compared to control animals (Table 4). From the above data it is seen that the claimed peptides 1-3 exhibit a more pronounced anticonvulsant effect than DSIP.

При стрессорном воздействии избыток катехоламинов приводит к активизации перекисного окисления липидов (ПОЛ) и накоплению в тканях продуктов этой реакции, в частности малонового диальдегида (МДА). Это является одной из причин повреждения клеточных мембран, изменения активности мембраносвязанных ферментов и нарушения процессов внутриклеточного метаболизма (Шидловская Т. Е. Интенсивность перекисного окисления липидов в тканях крыс при гипокеназии. - Косм. биология и авиакосм. медицина, 1985, т. 34, вып. 1, с. 19-22). В связи с этим интенсивность ПОЛ является одним из критериев, характеризующих стресс-реакцию в организме млекопитающих) (Гальдман А.В. и Александровский Ю. А. Психофармакотерапия невротических расстройств. -М.: Медицина, 1987, с.287). Under stress exposure, an excess of catecholamines leads to the activation of lipid peroxidation (POL) and the accumulation in the tissues of the products of this reaction, in particular malondialdehyde (MDA). This is one of the causes of damage to cell membranes, changes in the activity of membrane-bound enzymes and impaired processes of intracellular metabolism (Shidlovskaya T.E. Intensity of lipid peroxidation in rat tissues during hypokenasia. - Cosm. Biology and Aerospace Medicine, 1985, v. 34, issue . 1, p. 19-22). In this regard, the intensity of lipid peroxidation is one of the criteria characterizing the stress response in mammals) (Galdman A.V. and Aleksandrovsky Yu.A. Psychopharmacotherapy of neurotic disorders. -M .: Medicine, 1987, p. 287).

Пример 4. Исследование перекисного окисления липидов и уровня ГАМК при стрессе. Example 4. The study of lipid peroxidation and GABA levels under stress.

Эксперименты проводят на беспородных белых крысах обоего пола весом 170-250 г. The experiments are carried out on outbred white rats of both sexes weighing 170-250 g.

4.1. Гипокинетический стресс. 4.1. Hypokinetic stress.

Животных помещают в специальные камеры, резко ограничивающие их подвижность сроком на 1 ч и на 6 ч (Белова Т.И., Петрова Н.В., Юнсон Ю. Lows Geruleus: регуляция и функции гематоэнцефалического барьера в норме и в условиях эмоционального стресса. - Бюллетень эксперим. биол. и мед., 1986, т. 101, N 4, с. 395-397). В качестве контрольных животных используют крыс, которые содержатся в виварии. Введение пептида 1 осуществляют внутрибрюшинно в дозе 150 мкг/кг за 60 мин до стрессового воздействия. Животных декапитируют, извлекают мозг и определяют уровень малонового диальдегида (Стальная И.Д., Горшивили Т.Г. Метод определения МДА с помощью ТБК. Современные методы в биологии. -М.: Медицина, 1977, с.66). Animals are placed in special chambers, sharply restricting their mobility for 1 h and 6 h (Belova T.I., Petrova N.V., Yunson Yu. Lows Geruleus: regulation and functions of the blood-brain barrier under normal conditions and under emotional stress. - Bulletin of experimental biol. And honey., 1986, v. 101, No. 4, pp. 395-397). As control animals use rats that are kept in the vivarium. The introduction of peptide 1 is carried out intraperitoneally at a dose of 150 μg / kg 60 minutes before stress exposure. The animals are decapitated, the brain is removed and the level of malondialdehyde is determined (Steel I.D., Gorshivili T.G. Method for the determination of MDA using TBA. Modern methods in biology. -M .: Medicine, 1977, p.66).

4.2. Гипербарическая оксигенация (ГБО). 4.2. Hyperbaric oxygenation (HBO).

Животных помещают в специальные камеры и подвергают действию 0,3 мПа кислорода в течение 2 ч. В качестве контрольных животных используют крыс, которые содержатся в виварии. Введение пептида 1 осуществляют внутрибрюшинно в дозе 150 мкг/кг за 60 мин до стрессового воздействия. Животных декапитируют, извлекают мозг и определяют уровень малонового диальдегида (там же). Animals are placed in special chambers and exposed to 0.3 mPa of oxygen for 2 hours. Rats kept in the vivarium are used as control animals. The introduction of peptide 1 is carried out intraperitoneally at a dose of 150 μg / kg 60 minutes before stress exposure. The animals are decapitated, the brain is removed and the level of malondialdehyde is determined (ibid.).

4.3. Определение содержания ГАМК в мозге животных. 4.3. Determination of GABA in the brain of animals.

Навеску ткани мозга (1 г) гомогенизируют в 10 мл 0,4 перхлорной кислоты и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Из полученной надосадочной жидкости отбирают 2 мл и выпаривают досуха на водяной бане. Остаток растворяют в 0,1 мл воды и по 0,03 мл наносят на полоски хроматографической бумаги марки "С" размером 2 х 28 см. Линия старта отстоит от катода на 14 см. Электрофорез проводят в 0,2 N натрий-ацетатном буфере (pH 4,6) при напряжении 200 В и силе тока 12 мА в течение 2 ч. Полоски высушивают и окрашивают 1% раствором нингидрина в ацетоне при температуре 90^oC. Пятна на фореграммах, соответствующие ГАМК, вырезают, измельчают и элюируют в 4 мл 50% этанола. Анализируют на спектрофотометре при длине волны 557 нм. В качестве стандарта используют синтетическую ГАМК (Sigma, США).A portion of brain tissue (1 g) is homogenized in 10 ml of 0.4 perchloric acid and centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. From the obtained supernatant, 2 ml was collected and evaporated to dryness in a water bath. The residue is dissolved in 0.1 ml of water and 0.03 ml each is applied to strips of chromatographic paper brand "C" measuring 2 x 28 cm. The start line is 14 cm from the cathode. Electrophoresis is carried out in 0.2 N sodium acetate buffer ( pH 4.6) at a voltage of 200 V and a current strength of 12 mA for 2 hours. The strips are dried and stained with a 1% solution of ninhydrin in acetone at a temperature of 90 ^o C. The spots on phoreograms corresponding to GABA are cut, ground and eluted in 4 ml 50% ethanol. Analyzed on a spectrophotometer at a wavelength of 557 nm. Synthetic GABA (Sigma, USA) is used as a standard.

При гипоксинетическом стрессе происходит значительное нарастание уровня МДА - на 51% через 1 ч стрессорного воздействия и на 103% через 6 ч. Подобный эффект наблюдается и на другом типе стрессорного воздействия - гипербарической оксигенации (ГБО). Установлено, что введение пептида 1 в дозах 100-150 мг/кг (внутрибрюшинно) приводит к заметному снижению уровня МДА (табл. 5). With hypoxinetic stress, a significant increase in the level of MDA occurs - by 51% after 1 h of stress exposure and 103% after 6 hours. A similar effect is observed on another type of stress exposure - hyperbaric oxygenation (HBO). It was found that the introduction of peptide 1 in doses of 100-150 mg / kg (intraperitoneally) leads to a noticeable decrease in the level of MDA (Table 5).

Стресс-реакция сопряжена с активацией ГАМК-ергической системы мозга млекопитающих и прежде всего с адаптивным увеличением интенсивности биосинтеза ГАМК (Гальдман А.В. и Александровский Ю.А. Психофармакотерапия невротических расстройств. -М. : Медицина, 1987, с.287). Однако в дальнейшем при развитии стресс-реакции происходит истощение биосинтетических возможностей и резкое уменьшение уровня ГАМК в мозге животных (табл. 6), приводящее к неблагоприятному нарушению баланса тормозных и возбуждающих нейромедиаторных аминокислот, что в свою очередь вызывает нарушения в регуляции основных функций организма. Как видно из приведенных данных, пептид 1 не только предотвращает стадию истощения ГАМК у животных в условиях 6-часового стрессорного воздействия, но и поддерживает состояние срочной адаптации, возникающее при 1-часовом стрессорном воздействии, повышая тем самым устойчивость животных к действию стрессирующего фактора. The stress reaction is associated with activation of the GABAergic system of the mammalian brain and, first of all, with an adaptive increase in the intensity of GABA biosynthesis (A. Galdman and Yu.A. Aleksandrovsky, Psychopharmacotherapy of neurotic disorders. -M.: Medicine, 1987, p. 287). However, in the future, with the development of a stress reaction, depletion of biosynthetic capabilities and a sharp decrease in the level of GABA in the brain of animals occurs (Table 6), leading to an unfavorable imbalance in the inhibitory and stimulating neurotransmitter amino acids, which in turn causes disturbances in the regulation of the basic functions of the body. As can be seen from the above data, peptide 1 not only prevents the stage of GABA depletion in animals under the conditions of a 6-hour stress exposure, but also supports the state of urgent adaptation that occurs during a 1-hour stress exposure, thereby increasing the resistance of animals to the stress factor.

В целом предложенный пептид 1 обладает нейропротекторным действием при стрессорных воздействиях за счет эффекта позитивной регуляции основных энергетических процессов в мозге и восстановления уровня энергизации мозговой ткани. Одновременно этот пептид снижает активность процесса перекисного окисления липидов, чем увеличивает стабильность мембран и регулирует их функциональное состояние. In general, the proposed peptide 1 has a neuroprotective effect during stressful effects due to the effect of positive regulation of the main energy processes in the brain and restoration of the energy level of brain tissue. At the same time, this peptide reduces the activity of lipid peroxidation, which increases the stability of the membranes and regulates their functional state.

Согласно современным представлениям о роли стресса в патогенезе заболеваний нервной системы, стрессорные воздействия рассматриваются как этиопатогенетический фактор постстрессорной нейросенсибилизации и последующего развития нейроиммунного конфликта. (Степаненко Е.М., Вилков Г.А., Крыжановский Г.Н. Бюллетень эксперим. биол. и мед. 1984, т. 98, N 9, с.36-338; Вилков Г. А. , Степаненко Е.М., Крыжановский Г.Н. Бюллетень эксперим. биол. и мед. 1987, N 9, с. 288-290). According to modern ideas about the role of stress in the pathogenesis of diseases of the nervous system, stressful effects are considered as an etiopathogenetic factor of post-stress neurosensitization and the subsequent development of neuroimmune conflict. (Stepanenko E.M., Vilkov G.A., Kryzhanovsky G.N. Bulletin of the experimental biol. And medical. 1984, v. 98, No. 9, p. 36-338; Vilkov G.A., Stepanenko E. M., Kryzhanovsky G.N. Bulletin of experimental biol. And medical. 1987, N 9, p. 288-290).

Установлено, что одним из реальных механизмов индукции иммунных реакций на нейроантигены при стрессе является активация свободнорадикальных процессов, приводящая к нарушению структуры клеточных мембран и увеличению проницаемости гематоэнцефалитического барьера, что приводит к повышению риска контакта специфических белков мозга и клеток иммунной системы. Степень постстрессорной нейросенсибилизации прямо связана с реакцией антиоксидантных систем на стресс и различной выраженностью прооксидантных систем организма. Так, у морских свинок на модели экспериментального энцефаломиелита (ЭАЭ) легко развивается нейросенсибилизация после стресса, в то время как у белых беспородных крыс она развивается лишь после истощения естественного антиоксидантного потенциала животных путем использования месячной липидной диеты (там же). При искусственном истощении антиоксидантного потенциала у крыс резко ослаблялась их естественная толерантность к ЭАЭ, и введение им энцефалитогенной сыворотки вызывало 100%-ную заболеваемость и гибель животных. В то же время предварительное введение животным антиоксидантных средств, в том числе и антиоксиданта непрямого действия - пептида дельта-сна, существенно снижало долю заболевших животных и тяжесть заболевания. It has been established that one of the real mechanisms of inducing immune responses to neuroantigens under stress is the activation of free radical processes leading to disruption of the structure of cell membranes and an increase in the permeability of the blood-brain barrier, which leads to an increased risk of contact of specific brain proteins and cells of the immune system. The degree of post-stress neurosensitization is directly related to the response of antioxidant systems to stress and the varying severity of the body's prooxidant systems. So, in guinea pigs, the model of experimental encephalomyelitis (EAE) easily develops neurosensitization after stress, while in white outbred rats it develops only after depletion of the natural antioxidant potential of animals by using a monthly lipid diet (ibid.). Artificial depletion of the antioxidant potential in rats sharply weakened their natural tolerance to EAE, and the introduction of encephalitogenic serum caused 100% morbidity and death of animals. At the same time, preliminary administration of antioxidant agents to animals, including an indirect antioxidant, the delta-sleep peptide, significantly reduced the proportion of sick animals and the severity of the disease.

Нейропротекторное действие пептида 1 было показано на крысах, находящихся на липидной диете, с истощенной антиоксидантной системой и подвергнутых эмоционально-болевому стрессу. В эксперименте оценивали следующие показатели: содержание кортикостерона как маркера стресса, степень активации процессов ПОЛ и антиоксидантных систем в мозге и крови хемилюминесцентным методом, а также уровень витаминов A и E в крови, содержание холестерина, диеновых конъюгатов и шиффовых оснований в мозге. Оценивалось также состояние нефромедиаторной регуляции, а именно содержание норадреналина, дофамина, серотонина и гистамина в отдельных районах мозга. The neuroprotective effect of peptide 1 was shown in rats on a lipid diet with a depleted antioxidant system and subjected to emotional pain pain. The following indicators were evaluated in the experiment: corticosterone content as a marker of stress, degree of activation of lipid peroxidation processes and antioxidant systems in the brain and blood by the chemiluminescent method, as well as the level of vitamins A and E in the blood, cholesterol, diene conjugates and Schiff bases in the brain. The state of nephromediation regulation, namely, the content of norepinephrine, dopamine, serotonin, and histamine in certain areas of the brain, was also evaluated.

Пример 5. Исследование состояния анти- и прооксидантных процессов в мозге и крови у крыс, подвергнутых липидной диете и стрессорному воздействию. Example 5. The study of the state of anti- and prooxidant processes in the brain and blood of rats subjected to a lipid diet and stress exposure.

Эксперименты проводят на беспородных белых крысах-самцах весом 170-250 г. Липидную диету (старое сало с небольшим количеством зерна) поддерживают в течение месяца. Крыс подвергают эмоционально-болевому стрессу в течение 4 ч (Стальная И.Д., Горшивили Т.Г. Метод определения МДА с помощью ТБК. Современные методы в биологии. - М.: Медицина, 1977, с.66). Пептиды вводят за 1 ч до стресса внутрибрюшинно в дозе 120 мкг/кг. Через сутки животных декапитируют и исследуют степень активации процессов ПОЛ и антиоксидантных систем хемилюминесцентным методом, а также уровень витаминов A и E в сыворотке крови (Вилков Г.А., Смирнова О.Б., Межова Л.И. Бюллетень эксперим. биол. и мед. , 1993, N 10, с. 364-366). The experiments are carried out on outbred white male rats weighing 170-250 g. The lipid diet (old fat with a small amount of grain) is maintained for a month. Rats are subjected to emotional pain stress for 4 hours (Steel I.D., Gorshivili T.G. Method for the determination of MDA using TBC. Modern methods in biology. - M .: Medicine, 1977, p.66). Peptides are administered 1 hour before stress intraperitoneally at a dose of 120 mcg / kg. After a day, the animals are decapitated and investigated the degree of activation of the LPO and antioxidant systems by the chemiluminescent method, as well as the level of vitamins A and E in the blood serum (Vilkov G.A., Smirnova O.B., Mezhova L.I. Bulletin of the experimental biol. And honey., 1993, N 10, S. 364-366).

Оценивают также содержание гистамина в различных структурах мозга - гипоталамусе, таламусе и гиппокампе колориметрическим методом (Коробова Л.Н., Ходакова А. А. , Френкель М.Л. Лаб. дело, 1982, N 4, с. 7-10). В качестве стандарта используют гистамин фирмы "Fluka" (Швейцария). The histamine content in various brain structures — the hypothalamus, thalamus, and hippocampus — is also estimated using the colorimetric method (Korobova L.N., Khodakova A.A., Frenkel M.L. Lab. Delo, 1982, N 4, pp. 7-10). As a standard, histamine from Fluka (Switzerland) is used.

Из полученных данных следует, что показатель хемилюминесценции - индуцированное свечение, отражающее уровень гидроперекисей, и показатель уровня антиоксидантов в системе (табл. 7) значительно ниже в группе с предварительным введением пептида 1 по сравнению с контрольной группой. При этом заявляемый пептид 1 проявляет большую эффективность действия, чем природный пептид дельта-сна. В то же время пептид 1 значительно уменьшал содержание шиффовых оснований (на 40%) и диеновых конъюгатов (на 30%) в коре больших полушарий крыс, подвергнутых липидной диете и эмоционально-болевому стрессу, что демонстрирует более низкий уровень прооксидантных процессов у животных, защищенных пептидом 1. Эти результаты согласуются и с более высоким содержанием витамина E в крови экспериментальных животных (на 30%) и с более низким уровнем кортикостерона, что также свидетельствует о снижении выраженности прооксидантных процессов и об антистрессорном действии пептида 1. Кроме того, пептид 1 проявляет способность отчетливо снижать содержание гистамина по всем исследованным структурам мозга - гипоталамусе, таламусе и гиппокампе на 76,43 и 38% соответственно при сравнении контрольных стрессированных животных и экспериментальных животных, получивших однократную дозу пептида 1 за 1 ч до стрессорного воздействия. From the data obtained, it follows that the chemiluminescence index is the induced glow reflecting the level of hydroperoxides, and the indicator of the level of antioxidants in the system (Table 7) is significantly lower in the group with the preliminary introduction of peptide 1 compared to the control group. At the same time, the claimed peptide 1 exhibits greater effectiveness than the natural peptide of delta sleep. At the same time, peptide 1 significantly reduced the content of Schiff bases (by 40%) and diene conjugates (by 30%) in the cortex of rat cerebral hemispheres, subjected to lipid diet and emotional pain stress, which demonstrates a lower level of prooxidant processes in animals protected peptide 1. These results are consistent with a higher content of vitamin E in the blood of experimental animals (by 30%) and with a lower level of corticosterone, which also indicates a decrease in the severity of prooxidant processes and antistress peptide 1. In addition, peptide 1 is able to clearly reduce the histamine content in all studied brain structures — the hypothalamus, thalamus, and hippocampus by 76.43 and 38%, respectively, when comparing control stressed animals and experimental animals that received a single dose of peptide 1 per 1 h before stress exposure.

Полученные свидетельства четко выраженной антиоксидантной и антистрессорной активности пептида 1 позволяют прогнозировать его эффективность для лечения и профилактики ряда нейроиммунных заболеваний (энцефалиты, шизофрения, рассеянный склероз и др.). The evidence obtained clearly expressed antioxidant and antistress activity of peptide 1 allows us to predict its effectiveness for the treatment and prevention of a number of neuroimmune diseases (encephalitis, schizophrenia, multiple sclerosis, etc.).

Пример 6. Исследование токсичности пептида 1 (в соответствии с ГФ XI). Example 6. The study of the toxicity of peptide 1 (in accordance with GF XI).

Эксперименты проводят на 10 беспородных белых мышах обоих полов массой 20-22 г. Пептиды вводят внутрибрюшинно в дозе 3 г/кг (в объеме 0,5 мл стерильного физиологического раствора). Наблюдение проводят в течение 72 ч после инъекции, при этом мыши содержатся раздельно на полноценном кормовом рационе (Государственная фармакопея СССР.-М.: Медицина, 1987, вып. XI, т.2). The experiments were carried out on 10 outbred white mice of both sexes weighing 20-22 g. The peptides were administered intraperitoneally at a dose of 3 g / kg (in a volume of 0.5 ml of sterile physiological saline). The observation is carried out for 72 hours after the injection, while the mice are kept separately on a complete feed ration (State Pharmacopoeia of the USSR.-M .: Medicine, 1987, issue XI, v.2).

В экспериментах по изучению токсичности пептида 1 было показано, что внутрибрюшинное введение пептида 1 в дозе 3 г/кг мышам не вызывало каких-либо отклонений в поведении животных и через 72 ч после инъекции пептида 1 гибели животных не зафиксировано. In experiments on the study of the toxicity of peptide 1, it was shown that intraperitoneal administration of peptide 1 at a dose of 3 g / kg to mice did not cause any abnormalities in the behavior of animals and 72 hours after the injection of peptide 1, no deaths were recorded.

Таким образом, вышеизложенные данные убедительно свидетельствуют о выраженности у заявляемых пептидов - аналогов пептида дельта-сна, противосудорожной, антистрессорной и нейропротекторной активности, что, принимая во внимание их нетоксичность для организма животных, позволяет рекомендовать их в качестве потенциальных нейропротекторных лекарственных средств для лечения и предупреждения различных форм энцефалопатий. Thus, the above data convincingly indicate the severity of the claimed peptides - analogues of the delta-sleep peptide, anticonvulsant, antistress and neuroprotective activity, which, taking into account their non-toxicity to animals, allows us to recommend them as potential neuroprotective drugs for treatment and prevention various forms of encephalopathy.

Claims (1)

Пептиды общей формулы
Trp-X-Gly-Gly-Asp-R,
где X - остаток гидроксилсодержащей аминокислоты L- или D-конфигурации;
R - Ala-Ser-Gly-Glu, или Ala-Ser-Gly, или Ala-Ser, или Ala;
а также их фармацевтически приемлемые соли, обладающие антистрессорным, противосудорожным и нейропротекторным действием.Peptides of the General Formula
Trp-X-Gly-Gly-Asp-R,
where X is the residue of a hydroxyl-containing amino acid of the L- or D-configuration;
R is Ala-Ser-Gly-Glu, or Ala-Ser-Gly, or Ala-Ser, or Ala;
as well as their pharmaceutically acceptable salts having antistress, anticonvulsant and neuroprotective effects.

Images